KR101741367B1

KR101741367B1 - 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101741367B1
Application number: KR1020160121708A
Authority: KR
Inventors: 김영미
Original assignee: 덕성여자대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2017-06-01

Abstract

본 발명은 알레르기 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 낙지다리(Penthorum chinense Pursh) 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제용 약제학적 조성물 및 알레르기 반응 억제 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 낙지다리 추출물은 비만세포 억제 효과 및 알레르기 유발 동물모델에서의 알레르기 억제 효과가 뛰어나므로, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 알레르기 질환의 예방 또는 치료에 적합한 의약품 뿐만 아니라 알레르기 증상을 개선시키기 위한 건강기능식품 등으로 활용할 수 있다.

Description

낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제용 조성물{Composition for protecting allergic response comprising the extract of Penthorun chinense Pursh}

본 발명은 알레르기 억제용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 반응 억제용 약제학적 조성물 및 알레르기 반응 억제 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

현대 사회는 기후 변화에 따른 생태계 변화, 대기오염, 황사, 실내주거환경, 서구화된 식습관 등에 의하여 천식, 알레르기 비염, 아토피, 만성 폐쇄성폐질환 등 알레르기 질환이 증가 추세를 보이고 있다(선행문헌 1).

질병관리본부가 실시한「천식 및 알레르기질환 조사」 결과에 따르면, 최근 15년간(`95년 - `10년) 알레르기 비염은 어린이 1.3배, 청소년은 1.4배 증가했고, 알레르기결막염은 어린이 1.9배, 청소년 1.9배 증가했다고 발표했다. 이와 같이 알레르기 발병률은 어린아이로부터 성인까지 계속해서 증가하는 추세이다(선행문헌 10). 특히, 알레르기 질환의 대상이 어린아이까지 확대되면서 사회적 이슈가 되고 있으며 다양한 알레르기 질환 치료제들이 개발되고 있는 상황이다. 현재 알레르기 치료제로는 알레르기를 일으키는 알레르겐(allergen)으로부터 보호하는 물리적 방법, 항히스타민제, 류코트리엔 수용체 길항제 등이 있는데, 이 중 가장 널리 쓰이는 항히스타민제는 알레르기 반응 시, 체내에 과다하게 분비되는 히스타민을 억제함으로 알레르기 반응을 감소시키는 효과를 가지고 있지만, 과량으로 사용할 경우 중추신경계 억제 및 녹내장, 전립선 비대 등 다양한 부작용을 동반하고 있다(선행문헌 11). 이와같이 현재 시판 되고 있는 약물 중 알레르기를 근본적으로 치료할 수 있는 치료법은 미비한 상태이다. 따라서 알레르기 질환을 치료할 근본적인 연구가 필요하다.

외부 알레르겐(allergen)이 우리 몸속으로 침입하면, B 림프구는 침입한 알레르겐을 인식하고, 형질세포로 분화한다. 이때 분화된 형질세포는 항원을 특이적으로 인식하는 IgE (Immunoglobulin E)를 분비하게 된다. 이러한 조건에 의하여 항원 특이 IgE 항체가 비정상적으로 증가하게 되며 증가한 IgE는 비만세포 표면의 IgE 고 친화성 수용체(FcεRI, high-affinity receptor for IgE)에 결합하여 외부로부터 알레르겐(allergen)이 다시 들어오면 항원-항체 반응이 진행되면서 비만세포를 활성화시킨다(선행문헌 2).

비만세포는 세포 내에 과립들을 가지고 있는데, 비만세포가 활성화되면 세포 내의 과립에 저장되어 있던 히스타민, 헤파린 및 단백분해효소 등이 세포 밖으로 분비되고 류코트리엔, 프로스타글란딘 등의 화학매개체들을 만들어 낸다. 이러한 화학매개체들은 짧은 시간 내에 혈관을 확장시켜 투과성을 증가시키고 우리 몸의 평활근 수축 및 분비선의 기능을 증가시켜 알레르기 증상을 유도한다(선행문헌 3).

비만세포 표면에 존재하는 FcεRI는 α, β, γ-서브유닛으로 구성되어있다(선행문헌 4). 이 중 β, γ-서브유닛은 세포 내 신호전달에 관여한다. 알레르겐이 IgE와 교차결합하면 β-서브유닛에 결합되어있던 Src-키나아제에 의해 수용체가 인산화 되면서 세포 내 신호전달이 시작된다. 또한 β, γ-서브유닛은 수용체에 결합되어있던 Lyn 키나아제에 의해 ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation mitif)이 인산화 된다(선행문헌 5). 인산화된 ITAM은 세포 활성화에 중요한 역할을 하는 Syk 키나아제의 결합부위를 제공하여 Syk 키나아제를 활성화 시키고 그 후 아래의 하위 신호전달물질의 활성화를 유도한다(선행문헌 6).

항원에 의한 비만세포 활성화 과정 초기에 가장 중요한 신호전달 단백질인 Syk가 활성화되면서 하위 신호전달 LAT (Linker for activation of T cells), PL(phospholipase)-Cγ, PKC (protein kinase C) 등 다양한 신호전달 물질이 활성화되고, 결과적으로 비만세포가 활성화되면서 히스타민, 프로스타글라딘, 루코트리엔 및 과민증 인자 등을 분비하여 면역체계를 활성화시켜 염증 및 알레르기를 발생시킨다(선행문헌 7). 이와 같이 세포내 신호전달 기전에 대한 연구는 알레르기 질환 연구에서 중요한 부분을 차지한다.

한편, 낙지다리(Penthorum chinense Pursh)는 돌나물과(Crassulaceae)의 다년생 초본으로 근경이나 종자로 번식한다. 전국적으로 분포하며 강가나 풀밭의 습기가 많은 곳에 분포한다. 높이는 60 - 90cm이며 잎은 어긋나고 잎자루가 거의 없다. 초여름에 누르스름한 작은 꽃이 이삭 모양으로 줄기 끝에 피고 열매는 삭과(朔果)로 익으면 갈라진다. 어린싹은 식용한다. 들의 습지에서 자라는데 한국, 중국, 일본 등지에 분포한다.

이러한 낙지다리 추출물은 간과 신경세포 보호의 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(선행문헌 8). 하지만 알레르기 질환에 대한 낙지다리의 대한 보고는 존재하지 않는다.

이에, 본 발명자들은 천연 식물 추출물의 알레르기 반응 억제 효과를 확인하기 위해 알레르기 반응에 의해 활성화되는 비만세포 억제 효과 및 알레르기 유발 동물모델에서의 알레르기 억제 실험을 수행한 결과, 낙지다리 추출물의 비만세포 억제 효과 및 알레르기 유발 동물모델에서 알레르기 억제 효과가 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 천연 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 천연 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 억제 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 낙지다리 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립, 사이토카인 분비 및 동물모델에서 알레르기 반응을 세포내 Syk/LAT 신호전달경로를 억제함으로써 알레르기 반응 억제 효과가 뛰어나다.

도 1은 낙지다리 추출물의 처리 농도별 비만세포 탈과립 억제 효과를 확인한 β-헥소스아미니다이제 분비 억제 정도를 %로 나타낸 그래프이다.
도 2는 낙지다리 추출물의 처리 농도별 비만세포 탈과립 억제 효과 가역성을 확인한 β-헥소스아미니다이제 분비 억제 정도를 %로 나타낸 그래프이다.
도 3은 낙지다리 추출물의 처리 농도별 비만세포에서의 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 TNF-α 및 IL-4의 mRNA 발현 정도로 확인한 RT-PCR 결과이다. Ag로 표시한 그래프가 항원을 처리한 것을 나타낸다.
도 4는 낙지다리 추출물의 처리 농도별 비만세포에서의 칼슘 농도 증가에 따른 탈과립 억제 효과를 확인한 β-헥소스아미니다이제 분비 억제 정도를 %로 나타낸 그래프이다. 도면에서, Ion은 이오노마이신, Tg는 탭시가긴이다.
도 5는 낙지다리 추출물의 처리 농도별 비만세포(상단은 RBL-2H3 세포, 하단은 BMMC 세포)에서의 Syk 키나아제 및 LAT 키나아제 인산화 억제 효과를 확인한 면역분석 결과이다.
도 6은 낙지다리 추출물의 처리 농도별 국소피부자극 알레르기 반응 억제 효과를 확인한 에반스블루 흡광도 측정 결과이다. 도면에서 CZ는 대조군인 세티리진이다.
도 1 내지 도 6에서 공통적으로, PCE는 낙지다리 추출물이다.

본 발명은 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, `예방`이란 조성물의 투여에 의해 알레르기 반응을 억제시키거나 알레르기 반응에 의한 질환의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, `치료`란 조성물의 투여에 의해 알레르기 반응에 의한 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 `낙지다리(Penthorum chinense Pursh)`는 돌나물과(Crassulaceae)의 다년생 초본으로 근경이나 종자로 번식한다. 전국적으로 분포하며 강가나 풀밭의 습기가 많은 곳에 분포한다. 높이는 60 - 90cm이며 잎은 어긋나고 잎자루가 거의 없다. 초여름에 누르스름한 작은 꽃이 이삭 모양으로 줄기 끝에 피고 열매는 삭과(朔果)로 익으면 갈라진다. 어린싹은 식용한다. 들의 습지에서 자라는데 한국, 중국, 일본 등지에 분포한다.

낙지다리 추출물은 간과 신경세포의 보호 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(선행문헌 8). 하지만 알레르기 질환에 대한 낙지다리의 대한 보고는 존재하지 않는다. 본 발명에서는 낙지다리 추출물의 비만세포 억제 효과 및 알레르기 유발 동물모델에서 알레르기 억제 효과 등을 규명하기 위해 수행하였다.

본 발명에 따른 낙지다리 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 낙지다리 추출물은 낙지다리의 전초를 사용하여 적절한 용매를 이용하여 추출한 것이다.

본 발명의 낙지다리 추출물은 다양한 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 프로탄올, 이소프로판올, 부탄올 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름,메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것이며, 가장 바람직하게는 메탄올로 추출한 것이다.

본 발명의 낙지다리 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출방법에 의해 추출할 수 있으며, 바람직하게는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법 및 용출법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법으로 추출하며, 가장 바람직하게는 초음파추출법으로 추출한 것이다.

본 발명의 일실시예에 따른 낙지다리 추출물을 제조하는 방법을 조금 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

먼저, 낙지다리 전초에 메탄올 용매를 가하여 초음파 추출기를 이용하여 추출하는 단계; 및 상기 추출 여액을 여과한 후 농축시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서, 낙지다리 추출물은 조성물에 10 내지 1000 mg/㎕의 농도로 포함될 수 있으며, 약제학적 조성물을 인체에 투여하는 경우 10 내지 1000 mg/kg 농도로 투여되는 것이 바람직하며, 100 내지 700 mg/kg 농도로 투여되는 것이 보다 바람직하며, 200 내지 500 mg/kg 농도로 투여되는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 질환으로는, 알레르기에 의해 유발되는 천식, 알레르기 비염, 아토피, 만성 폐쇄성폐질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

또한, 본 발명의 낙지다리 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여가 좋다.

본 발명은 또한, 낙지다리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 반응 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에서 `건강기능식품`은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 식품의 형태로서 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 건강기능식품은 유효성분인 낙지다리 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 낙지다리 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능성식품에 함유된 유효성분인 낙지다리 추출물은 천연물질로부터 유래되어 독성 및 부작용은 거의 없으므로 알레르기 억제 또는 개선의 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 알레르기 반응 억제용 약제학적 조성물 및 알레르기 반응 억제 및 개선용 건강기능성식품에 포함되는 유효성분인 본 발명의 낙지다리 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 탈과립, 사이토카인 분비 및 동물모델에서 알레르기 반응을 세포내 Syk/LAT 신호전달경로를 억제함으로써 알레르기 반응 억제 효과가 뛰어나다.

알레르기 질환에서 증상 발현에 중요한 역할을 하는 비만세포(mast cell)의 활성의 조절은 알레르기 질환 치료제 개발에서 많은 연구의 대상이 되고 있다. 호염기구와 비만세포에는 알레르기반응을 유도하는 화학매개체들이 포함된 과립들이 세포질 내에 존재한다. 알레르겐이 외부로부터 항원에 의해 자극되어지면 알레르기 반응을 일으키는 물질을 생산, 분비한다(선행문헌 12). 이러한 화학매개체들은 과립안에 이미 생성되어 저장되어있던 물질(preformed mediators)과, 자극 후 새로 생성되는 물질(newly synthesized mediators)로 구성된다. 비만세포 활성화시 분비되는 물질로는 히스타민과 세로토닌이 있으며, 그 외에도 IL-4, IL-13, TNF-α 등의 사이토카인을 분비하여 알레르기성 염증 및 림프구의 증식과 이동을 유도한다(선행문헌 13).

이러한 과정은 알레르겐과 비만세포 표면의 고친화성 IgE 수용체(FcεRI)가 결합한 후 신호전달체계가 활성화 되는 Fyn-Gab2-PI3K 경로와 Lyn-Syk-LAT 경로에 따라 진행된다(선행문헌 14). 알레르겐과 FcεRI 간의 집합이 이루어지면 수용체의 β, γ-서브유닛의 ITAM이 Src-키나아제에 의해 인산화되고 Syk 키나아제와 인산화 된 ITAM이 결합하여 Syk의 구조가 변형되면서 신호가 활성화된다. 그 후 하위 신호전달분자 및 어댑터 단백질이 순차적으로 활성되어 비만세포에서 알레르기 유도물질을 분비하고 알레르기 반응을 유도하게 된다(선행문헌 15).

본 발명의 낙지다리 추출물은 세포독성이 없는 0-100 ㎍/㎖ 농도에서 비만세포 초기 활성신호전달경로인 Syk/LAT의 신호전달경로 활성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하였다(도 5).

이러한 신호전달을 바탕으로 활성화된 비만세포는 세포질 내 칼슘 농도가 증가되는데 이러한 증가는 비만세포 내의 과립의 탈 과립을 유도한다. 낙지다리 추출물이 비만세포 탈과립 억제의 효과가 있음을 확인하였다(도 1).

새로운 의약품이 개발될 때 그 물질의 체내 가역성은 매우 중요하다. 일반적으로 비가역적인 물질은 체내 투여시 체내 단백질에 결합하여 그 단백질이 제거 될 때까지 약효를 진속하게 되어 부작용 가능성을 증가 시킨다(선행문헌 16). 이러한 비가역성에 의한 부작용 가능성을 관찰하기 위해 본 발명자는 낙지다리 추출물의 가역성 실험을 진행하였다. 실험 결과 낙지다리 추출물은 비만세포 활성 억제효과가 가역적임을 관찰하였다(도 2). 이러한 가역성은 낙지다리 추출물의 부작용 가능성을 다소 낮추어 준 것으로 평가되었다.

최근에 비만세포억제를 통한 알레르기 반응 억제 효능이 있는 식물 추출물에 대한 보고가 다양하게 진행 되어지고 있다. 그 중에서 갈매나무 잎 추출물은 항원 자극에 의한 비만세포의 Fyn 키나아제 활성화 억제를 통해 알레르기 반응을 억제하는 것으로 보고되었다(선행문헌 17). 꾸지뽕나무 추출물은 항원에 의한 비만세포의 Lyn/Syk 경로의 활성화 억제를 통해 알레르기 반응억제 효능을 가지는 것으로 보고되어 갈매나무 추출물의 억제 기전과는 다소 차이가 있음을 알 수 있었다(선행문헌 18). 이러한 식물 추출물의 마우스에서의 알레르기 반응 억제 ED₅₀은 대부분 200-500 mg/kg 이며 본 발명의 낙지다리 추출물의 경우에도 유사한 ED₅₀를 보였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 재료 및 실험 동물

DNP(Dinitrophenol)-특이적 IgE와 DNP-우혈청 알부민 항원(DNP-bovine serum albumin, DNP-BSA)는 시그마 알드리치사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 PP2는 칼바이오켐사(La Jolla, CA, USA)에서 구입하였다. RPMI-1640 및 MEM (Minimal Essential Medium) 배지, 배양액에 첨가되는 글루타민과 그 외 세포배양 시약은 GIBCO 테크놀로지 사(Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 웨스턴 블로팅에 사용되는 인산화-Syk 및 인산화-LAT 항체는 셀 시그날링 테크놀로지사 (Danvers, MA, USA)에서 구입하였으며 그 외에 액틴을 검출하기 위한 항체는 밀리포어사 (Billerica, MA, USA)에서 구입하였다. 기타 모든 시약은 시중 제품 중 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

실험에 사용한 동물은, (주)오리엔탈바이오(성남)에서 생후 5 주령 수컷 Balb/c 마우스를 구입하여 사용하였다. 물과 사료는 자유롭게 먹도록 하였으며, 사육환경은 온도 22 ± 1℃, 습도 55 ± 10%로 유지하였고, 낮과 밤의 주기는 각각 12 시간으로 하였다. 모든 실험동물은 1 주일동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물실험은 덕성여자대학교 동물실험윤리 회의 승인을 받아, 동 규정에 따라 실험을 진행하였다.

< 실시예 1> 낙지다리 추출물의 제조

본 발명의 실험에 사용한 낙지다리 추출물은 한국식물추출물 은행으로부터 분양(분양번호 007-019) 받아 실험을 진행하였다. 건조된 낙지다리 전초 100 g을 50℃ 메탄올 1000 ml에서 초음파 추출기를 이용하여 추출하였으며 스피드백을 이용하여 40℃에서 24시간 건조과정을 거쳤다. 이러한 과정으로 추출한 낙지다리 추출물의 최종 회수율은 약 15%였다. 비만세포 억제 실험에 사용하기 위해서 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 100 mg/ml 농도로 제조한 후, 최종 처리 농도로 희석하여 실험에 적용하였다.

< 실시예 2> 낙지다리 추출물의 비만세포 탈과립 (β- hexosaminidase ) 측정

IgE 감작된 비만세포는 항원으로부터 자극을 받으면 비만세포 과립 안에 있던 히스타민, β-헥소스아미니다아제, 다양한 프로테아제 등을 세포 밖으로 방출하여 알레르기 반응을 유도한다. 본 실험에서는 탈과립의 지표로서 탈과립에 의해 세포 밖으로 분비된 β-헥소스아미니다아제를 측정하여 낙지다리 추출물의 억제효과를 확인하였다(선행문헌 9).

비만세포로서 RBL-2H3 (Rat Basophil Leukemia)은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 15% FBS가 포함된 MEM (페니실린 /스트렙토마이신 및 L-glutamine 포함)을 배양액으로 하여 5% CO₂ 배양기에서, 2-3일 간격으로 계대 배양하였다.

RBL-2H3 세포를 24-플라스크에 1.8 × 10⁵/웰 농도로 분주하고 20 ng/ml DNP-특이 IgE를 포함한 배지에서 12시간 이상 감작하여 비만세포의 FcεRI를 부위에 IgE가 결합하도록 하였다. 탈과립 정도를 측정하기 위해 β-헥소스아미니다아제(hexosaminidase)의 양을 측정하였다. 측정은 타이로드 완충용액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM HEPES, 5.6 mM 글루코스, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 우혈청으로부터 분리한 지방산 제거된 0.5% 분획, pH 7.4)과 PIPES 완충용액 (25 mM PIPES, 159 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5.6 mM 글루코스, 우혈청으로부터 분리한 지방산 제거된 0.5% 분획, pH 7.4)을 이용하여 실험을 진행하였다. 우선 37℃ 완충용액으로 각각의 세포를 2번 세척 후 상기 실시예 1에서 제조한 낙지다리 추출물을 웰당 0, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 완충용액에 희석해 첨가하여 30분 동안 전처리를 하였다. 그 후 20 ng/ml의 DNP-특이 IgE 항원을 각 웰에 첨가하여 10분 동안 세포자극을 진행하였다. 10분 배양 후 약 7분간 얼음 위에서 자극을 정지시켰다. 그 후 각 웰의 상층액과 Triton X-100으로 세포를 파쇄하여 얻은 파쇄액을 각각의 96 웰 플레이트에 30 ㎕씩 분주하고 1 mM p-니트로페닐-N-아세틸-β-d-글루코사미나이드를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후 250 ul의 0.1 M 카보네이트 완충액을 넣어 반응을 종료한 뒤 405 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 그리고, 대조군으로는 Src-패밀리 키나아제 억제제인 PP2를 10 μM 농도로 처리하였다.

그 결과, 항원자극에 의한 비만세포에서의 β-헥소스아미니다아제 분비가 낙지다리 추출물의 처리 농도 의존적으로 억제되었으며, 처리농도 100 ㎍/㎖에서 비만세포의 탈과립 현상이 약 80% 정도가 억제되는 우수한 효능이 관찰되었다(도 1). 이러한 억제효과는 대조군으로서 사용된 Src-패밀리 키나아제 억제제인 PP2의 억제효과와 유사하게 나타났다.

< 실시예 3> 낙지다리 추출물의 비만세포 탈과립 억제 효과의 가역성

RBL-2H3 세포에 한 그룹은 낙지다리 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 30분 동안 전처리를 진행하였고 다른 한 그룹은 낙지다리 추출물을 동일한 농도로 30분 전처리한 후 PIPES 완충용액으로 5회 세척하여 탈과립의 현상이 회복되는 것을 관찰하였다.

그 결과, 낙지다리 추출물을 100 ㎍/㎖ 농도로 전처리한 군에서 β-헥소스아미니다아제 분비는 대조군과 비교하여 70% 이상 억제되었으나 PIPES 완충용액으로 5회 세척해 준 군은 대조군의 약 90%까지 회복되었다(도 2). 이러한 결과로부터, 낙지다리 추출물의 비만세포 탈과립 억제효과는 가역성을 가짐을 알 수 있었다.

< 실시예 4> 낙지다리 추출물의 비만세포에서 염증성 사이토카인 분비 억제 효과

낙지다리 추출물 전처리에 의한 비만세포에서의 염증성 사이토카인 생산 억제 효과를 RT-PCR 기법으로 측정하였다. 낙지다리 추출물 처리 실험은 상기 실시예 2의 β-헥소스아미니다아제 분비 측정 실험과 동일하게 실시하였으며, 실험 완료후 세포로부터 총 RNA를 분리한 다음 당업계에 알려진 RT-PCR 방법으로 수행하여, 분비된 염증성 사이토카인으로서 TNF-α 와 IL-4의 mRNA 발현 정도를 측정하였다. 단백질의 양을 정량하기 위해 GAPDH의 mRNA 발현으로 정량하였다.

그 결과, 낙지다리 추출물은 처리 농도 의존적으로 TNF-α 와 IL-4의 mRNA 발현을 현저히 억제하였다(도 3A). IL-4의 mRNA 발현은 낙지다리 추출물의 처리 농도 30 ㎍/㎖ 농도에서부터 대조군과 비교하여 유의적으로 억제되었으며(p < 0.05), TNF-α의 mRNA 발현은 낙지다리 추출물의 처리 농도 100 ㎍/㎖ 농도에서 대조군과 비교하여 유의적으로 억제되었다(p < 0.05), PCE 100 μg/ml에서는 대조약물로 사용된 PP2와 유사한 정도의 억제 효과가 관찰되었다(도 3B).

< 실시예 5> 낙지다리 추출물의 세포내 칼슘 농도 증가에 따른 탈과립의 억제 효과

낙지다리 추출물의 비만세포 탈과립 억제효과의 기전을 연구하기 위해 우선 이 억제효과가 칼슘이온 증가의 상위 신호전달물질인지 하위 신호경로를 억제하는 것인지를 알아보기 위해 본 실험을 진행하였다.

RBL-2H3 세포에 낙지다리 추출물을 웰당 0, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 전처리한 다음, 1 μM 이오노마이신과 300 nM 탭시가긴(thapsigargin)을 처리하였으며, 세포내 칼슘 농도 증가에 따른 탈과립 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 2와 동일한 실험을 수행한후 β-헥소스아미니다아제 분비 정도를 확인하였다.

그 결과, 비만세포에 이오노마이신과 탭시가긴을 처리 시 비만세포에서 탈과립이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 이러한 물질을 처리하기 전 낙지다리 추출물을 전처리하였을 때 PP2와는 달리 낙지다리 추출물의 전처리에 의해서 탈과립의 억제 효과는 보이지 않았다(도 4). 이러한 결과는 낙지다리 추출물에 의한 비만세포에서의 탈과립 억제효과는 칼슘에 의한 신호전달경로 상위에서 일어나는 것으로 추정되었다.

< 실시예 6> 낙지다리 추출물의 비만세포에서의 Syk 및 LAT의 인산화 억제 효과

낙지다리 추출물의 비만세포에서의 Syk 및 LAT 인산화 억제 효과를 확인하기 위해 비만세포로서 RBL-2H3 및 BMMC 두종류를 사용하였다.

생쥐의 골수에서 유래한 비만세포(BMMCs, Bone marrowderived mast cells)는 5주령의 수컷 Balb/c 마우스의 골수로부터 채취하였다. 마우스로부터 분리한 골수의 세포는 RPMI 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 0.1 mM 비-필수 아미노산 및 2 mM L-글루타민 포함)에 IL-3(10 ng/ml)이 포함된 배양액을 사용하여 4주 이상 배양 후 BMMC로의 분화가 98%이상 되었음을 FACS분석을 통해 확인한 후 실험에 사용하였다.

IgE로 감작된 BMMC 및 RBL-2H3 세포에 PIPES 완충액(또는 타이로드 완충액)으로 희석한 낙지다리 추출물을 웰당 0, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 다음, 25 ng/ml의 항원(DNP-BSA)을 넣어 7분 동안 자극하고 얼음위에서 반응을 정지시켰다. 항원에 의해 자극된 세포는 약 4℃ PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 세포파쇄용액 (20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% nonidet P-40, 60 mM octyl β-glucoside, 10% glycerol, 10 mM NaF, 1 mM phenylmethyl-sulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na₃VO₄, 2.5 mM nitrophenyl-phosphate, 0.7 mg/ml pepstatin, proteaseinhibior cocktail tablet)으로 10분간 세포를 파쇄 후 15,000rpm, 10분간 4℃에서 원심분리기한 다음 상등액을 얻었다. 이 상등액을 이용하여 단백질 정량 후 100℃에서 3x Laenmmli 완충액으로 약 5분간 끓였다. 정량된 단백질은 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리 후 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겨 5% BSA를 포함한 TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) 완충액으로 1시간 동안 블로킹을 시켰다. 이후 분석하고자 하는 단백질(TNF-α, IL-4, 단백질 컨트롤로서 액틴(Actin)에 대한 1차 항체를 1000배로 희석하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후 TBS-T로 세척한 뒤 2000배로 희석한 HRP-결합된 2차 항체로 1시간 상온에서 반응시켰다. 이후 10분씩 5번 TBS-T 완충액으로 세척하고 화학발광(chemiluminescence) 분석기로 단백질 밴드를 확인하였다.

그 결과, 낙지다리 추출물은 처리 농도 의존적으로 Syk 키나아제의 인산화를 억제하여 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 5). 또한, Syk 키나아제의 인산화 활성이 억제됨으로 LAT 인산화 활성역시 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 낙지다리 추출물은 Syk 키나아제의 인산화를 억제함으로서 항원에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 RBL-2H3 세포 뿐만 아니라 골수유래의 세포에서 분화시킨 비만세포(BMMC)에서도 항원 자극에 의한 Syk/LAT 신호전달경로가 유사한 정도로 억제된다는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

< 실시예 7> 낙지다리 추출물의 국소피부자극 알레르기 반응의 억제 효과

알레르기 동물모델에서 낙지다리 추출물의 알레르기 반응 억제효과를 측정하였다. DNP (dinitrophenol)-특이적 IgE에 의한 국소 알레르기 피부 반응(passive cutaneous anaphylaxis, PCA)을 유도하기 위해 마우스(BALB/c, 5주령 수컷)의 오른쪽 귀에 DNP 특이적 IgE를 피내로 0.5 ㎍을 주사하였다. 다음 날 5% 아라비아검 용액에 녹인 낙지다리 추출물을 40 mg/kg, 200 mg/kg 및 1000 mg/kg 농도로 각각 경구 투여하였다. 1 시간 후 항원(DNP-BSA, 1 mg/ml)을 에반스 블루 용액을 이용하여 5 mg/ml 농도로 제조하여 250 ㎕를 꼬리로 정맥 투여하였다. 1 시간 후 마우스를 안락사 시키고 귀를 적출하여 700 ㎕의 포름아마이드로 63℃에서 12 시간 동안 에반스블루를 추출후 상등액을 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 에반스 블루의 정량은 표준 정량곡선을 이용하여 측정하였다. 낙지다리 추출물의 대조군으로서 세트리진을 20 mg/kg 농도로 동일하게 경구투여하였다.

그 결과, 항원 자극에 의한 알레르기 반응은 잘 유도 되었으며 낙지다리 추출물의 처리에 의해 억제되었다(도 6A). 이러한 억제 결과는 낙지다리 추출물 처리 농도 0-1000 mg/kg 농도 범위 내에서 농도 의존적으로 억제되었으며 최고농도인 1000 mg/kg 투여군에서는 대조약물로 사용된 세트리진과 동일한 효과를 보였다.

Claims

낙지다리(Penthorum chinense Pursh) 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 질환 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 낙지다리 추출물은 메탄올, 에탄올, 프로탄올, 이소프로판올, 부탄올 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름,메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출된 것을 특징으로 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 낙지다리 추출물은 메탄올을 추출 용매로 하여 추출된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 낙지다리 추출물은 낙지다리 전초에 메탄올 용매를 가하여 초음파 추출기를 사용하여 추출하는 단계;
상기 단계의 추출 여액을 여과한 후 건조하여 농축하는 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 낙지다리 추출물은 조성물에 10 내지 1000 mg/㎕의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 낙지다리 추출물은 조성물을 인체에 투여시 10 내지 1000 mg/kg의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 알레르기에 의해 유발되는 천식, 알레르기 비염, 아토피, 만성 폐쇄성폐질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
낙지다리(Penthorum chinense Pursh) 추출물을 유효성분으로 함유하는 알레르기 반응 개선용 건강기능식품.
제 8 항에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.