KR101892291B1

KR101892291B1 - 쇠미역 추출물을 포함하는 Th2-면역 매개 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101892291B1
Application number: KR1020160050786A
Authority: KR
Inventors: 전우진; 김수일; 이정민; 유양희; 박정진; 노호석; 김응필; 김옥경
Original assignee: 전남대학교산학협력단; 재단법인 전남생물산업진흥원
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2018-08-28
Also published as: KR20170122327A

Abstract

본 발명은 쇠미역(Costaria costata) 추출물의 유효량; 및 (b) 담체를 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 알레르기 질환을 개선, 예방 또는 치료 할 수 있는 천연소재인 쇠미역 추출물을 유효성분으로 포함하여, 경제적인 생산비용과 사용의 편이성을 제공한다.

Description

쇠미역 추출물을 포함하는 Th2-면역 매개 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Improving, Preventing or Treating for Th2-immune mediated Disease comprising Extracts from Costaria costata}

본 발명은 쇠미역 추출물을 포함하는 Th2-면역 매개 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(피부과민반응)은 전형적인 피부병변을 동반하는 질환으로 발병 원인은 아직 명확히 밝혀지지 않았으나, 유전적인 요소와 면역 기능의 불균형 및 환경적인 요인이 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 아토피 피부염 환자의 골수 이식 시 아토피 피부염이 전이 될 수 있다는 것을 보면 아토피 피부염이 골수에서 파생되는 면역세포의 불균형에 따른 것으로 보인다.

아토피 피부염의 면역학 기전에는 Th1/Th2 세포간의 불균형, 사이토카인 체계 이상 등이 제시 되고 있다. 특히, 아토피 피부염은 Th1 및 Th2 중 Th2 반응에 치우친 면역 반응으로 Th2에서 발현되는 사이토카인인 IL-4 및 IL-10의 생성이 높아지고, 이에 따라 Th1에서 발현되는 사이토카인인 IL-2 및 INF-γ의 생성이 적어지면서 나타나는 인체 내 면역학적 불균형으로 나타난다. Th2 세포들은 케모카인(chemokine) 및 사이토카인(cytokine) 같은 인자들을 생성하여 아토피 피부염 진행을 유도하는 것으로 알려져 있다. 생성된 Th2 사이토카인은 B 림프구의 생성과 분화를 유도하고 호산구의 과민반응을 유도한다. IgE 발현의 증가는 Th2 사이토카인에 의해 B림프구의 아이소타입 스위칭(isotype switching) 유도에 의해 나타나며, IgE는 대부분의 아토피 피부염 환자에서 발현되는 면역글로불린(immunoglobulin)으로써 호산구과 호중구의 탈과립화를 유발하여 히스타민과 같은 염증성 물질의 분비를 매개한다. 이러한 면역학적 기전을 바탕으로 현재까지 알려진 치료방법은 외용 보습제, 항히스타민제의 도포나 복용, 면역억제제가 사용되고 있으나 증상 완화에 있어서는 매우 효과적인 결과를 나타나지만 장기간 사용 시 부작용의 위험성이 있으며 근본적인 치료를 기대하기는 어렵다. 따라서 안전하고 효과적인 새로운 아토피 치료법이 요구되고 있으며 아토피 피부염에 대한 개선 효능이 있는 물질을 천연물에서 찾고 하는 연구가 활발히 진행 중이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물 유래의 아토피 피부염 면역 조절 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 쇠미역(Costaria costata) 추출물이 Th2형 사이토카인의 증가를 억제시키고, B 세포의 증식을 억제시켜 IgE 생성에 따른 비만세포의 활성화 및 히스타민 과생성의 알레르기 유발 과정의 억제효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Th2-매개 면역 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Th2-매개 면역 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 쇠미역(Costaria costata) 추출물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, (a) 쇠미역 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연물 유래의 아토피 피부염 면역 조절 소재를 찾고자 노력하였다. 그 결과, 쇠미역 추출물(Costaria costata)이 Th2형 사이토카인의 증가를 억제시키고, B 세포의 증식을 억제시켜 IgE 생성에 따른 비만세포의 활성화 및 히스타민 과생성의 알레르기 유발 과정의 억제효과를 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 쇠미역 추출물은 제염된(desalinized; 또는 탈염된) 쇠미역 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 쇠미역 추출물은 쇠미역에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 쇠미역 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 쇠미역에 처리하여 수득한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쇠미역 추출물은 쇠미역의 물, 탄소수 1-4 개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3-부틸렌 글리콜의 용매 추출물이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 쇠미역 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 쇠미역 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 쇠미역 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 쇠미역 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 쇠미역으로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 쇠미역 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 Th2-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 개선, 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “Th2-매개 면역 질환”은 알레르겐-특이 Th2 세포의 생성 및 활성에 의한 IgE 및 비만세포가 관여하는 질환을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “Th2 세포”는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th2 세포는 체액성 면역반응에 관여한다.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th2-매개 면역 질환은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 알레르기 질환에 적용된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염(atopy dermatitis), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 천식(bronchial asthma), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 알레르기성 결막염(allergic conjuntivitis), 두드러기(urticaria), 혈관부종(vascular edema), 식품 알레르기, 물리적 알레르기, 과민성 폐장염, 직업성 알레르기 질환 또는 약물 알레르기이다.

본 발명의 조성물은 Th2-매개 면역 반응을 감소시키는 효과를 갖는다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 (ⅰ) B 세포의 증식 억제; (ⅱ) Th1/Th2 사이토카인 불균형 개선; (ⅲ) IgE 생성 감소; 및 (ⅳ) 히스타민 생성 억제의 효과를 갖는다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 쇠미역 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 쇠미역 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 비투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다. 본 발명의 쇠미역 추출물을 유효성분 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 쇠미역 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 쇠미역 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 쇠미역 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 건강기능식품으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 Th2-매개 면역 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 식품 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명은 알레르기 질환을 개선, 예방 또는 치료 할 수 있는 천연소재인 쇠미역 추출물을 유효성분으로 포함하여, 경제적인 생산비용과 사용의 편이성을 제공한다.

도 1은 비장세포(splenocyte)에서 쇠미역(Costaria costata) 추출물의 B 세포 및 T 세포 증식에 대한 영향을 나타낸다.
도 2는 비장세포에서 쇠미역 추출물의 Th1 사이토카인 생성인 IL-2 및 IFN-γ 생성에 대한 영향을 나타낸다.
도 3은 비장세포에서 쇠미역 추출물의 Th2 사이토카인 생성인 IL-10 및 IL-4 생성에 대한 영향을 나타낸다.
도 4는 비장세포에서 쇠미역 추출물의 IgE 생성에 대한 영향을 나타낸다.
도 5는 비만 세포(mast cell)에서 쇠미역 추출물의 히스타민 생성에 대한 영향을 나타낸다.
도 6은 켈틴 생성세포(keratinocyte)에서 쇠미역 추출물의 케모카인(EOTAXIN 및 TARC)의 mRNA 발현에 대한 영향을 나타낸다.
도 7은 켈틴 생성세포에서 쇠미역 추출물의 사이토카인(TNF-α 및 IL-6)의 mRNA 발현에 대한 영향을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 시료의 제조

쇠미역(Costaria costata) 추출물 제조에 사용된 쇠미역은 완도에서 구입하였고, 제염 과정을 거쳐 제조하였다. 쇠미역 물추추물과 쇠미역 10%에탄올추출물의 환류추출(추출온도 90℃ 및 시간 4시간)한 후 추출액을 왓맨(Whatman) No.4 필터페이퍼(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하여, 감압농축기(100 kg, (주)대명이엔지)를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조하여 얻어진 24 g 분말 형태(이하 CCW, CCE10%이라 함)를 다시 멸균한 3차 증류수에 녹여서 실험에 사용하였다.

실험예 1: 비장세포에서 T 세포 및 B 세포 증식능 측정 측정 시험

동물(NC/Nga mouse, 6 주령, 수컷)에서 분리한 비장세포(splenocyte)를 PBS로 세척한 후 0.45 ㎛ 세포 스트레이너(cell strainer)를 사용하여 단일 세포 부유액을 제조하였다. 단일 세포 부유액을 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 2 mmol/L-글루타민(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA), 100 ㎎/L 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)을 첨가한 RPMI-1640(Hyclone Laboratories, Logan, Utah, USA)으로 세척 후 적혈구 세포 용해 완충액(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 적혈구를 용혈시켜 비장세포 부유액을 만들어 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×10 cells/웰을 200 ㎕씩 분주하였다. T 세포 증식능 측정을 위하여 콘카나발린 A(concanavalin A; Con A, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 ㎍/㎖를 처리하였고, B 세포 증식능 측정을 위하여 LPS(lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 5 ㎍/㎖를 처리한 후 샘플을 함께 처리하여 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 48시간 후, EZ-Cytox(Deilab INC, Korea)를 20 ㎕씩 분주하고 4시간 동안 37℃에서 배양시킨 뒤 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

아토피 대조군은 정상군과 비교하여 T 세포의 증식능은 유의적으로 감소하였고, B 세포의 증식능은 유의적으로 증가하였다. T 세포 증식능은 쇠미역 추출물 처리한 모든 군에서 아토피대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다. 또한 B 세포의 증식능에서도 쇠미역 추출물 처리한 모든 군에서 아토피 대조군과 유의적인 차이를 보였다(도 1). 본 연구에서 아토피에 의하여 T 세포의 증식능을 감소한 것으로 확인함으로서 T 세포의 정상적인 기능이 상실되었음을 예측할 수 있었으며, B 세포의 증가로 면역글로불린의 과생성에 의하여 IgE의 증가로 비만 세포(mast cell)이 활성화되어 히스타민(histamine) 생성을 촉진시켜 가려움을 유발하고 염증을 유발시킨 것으로 보인다. 쇠미역 추출물은 이러한 T 세포와 B 세포의 비정상적인 증식능을 억제시켜 아토피 피부염을 약화시킨 것으로 사료된다.

실험예 2. 비장세포에서 Th1/Th2 사이토카인 생성 변화 측정 시험

비장세포를 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×10 cells/웰을 100 ㎕씩 분주한 후, 샘플처리와 함께 Con A 5 ㎍/㎖를 처리하여 IL-2, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 생성을 자극시켰다. IL-2, IL-4 및 IL-10은 24시간 배양 후에, IFN-γ은 72시간 배양 후에 상층액을 수집하였다. 상층액의 사이토카인의 양은 DuoSet 샌드위치 ELISA 마우스 키트(R&D System, McKinley Place NE, MN, USA)를 이용하여 측정하였다. ELISA용 96-웰 플레이트에 각 사이토카인 측정에 특성화 된 1차 항체를 PBS에 희석 후 100 ㎕씩 분주해 하루 동안 처리한 후, 그 다음날, 세척 완충액(PBST, 0.05% Tween 20 in PBS)로 1차 항체를 씻어낸 뒤, 항체가 결합하지 않은 플레이트의 다른 공간을 메워주기 위해 분석 완충액(IL-4 및 IL-10 검출용 키트는 1% BSA in PBS, IL-2 및 IFN-γ 검출용 키트는 0.1% BSA in TBST)를 넣어 2시간 동안 처리한 뒤 세척 완충액으로 씻어냈다. 표준 곡선을 위한 용액과 위에서 씨딩(seeding)한 비장세포의 배양액을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 반응이 끝난 뒤 세척 완충액으로 씻어내고 분석 완충액에 2차 항체를 희석시켜 준비한 뒤 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 처리하였다. 이 과정이 끝나면 세척 완충액을 이용해 플레이트를 씻어내고 발색을 도와주는 기질 시약을 100 ㎕씩 넣어 반응 시킨 뒤 570 ㎚에서 흡광도를 측정하고 표준 곡선을 이용해 세포에서 생성된 사이토카인의 양을 계산하였다.

CD4+ Th 세포에는 Th1형 사이토카인을 생성하는 Th1 세포와 Th2형 사이토카인을 생성하는 Th2 세포가 있다. Th1형 사이토카인은 주로 대식세포의 활성을 증가시켜 탐식작용을 자극하며, Th2형 사이토카인은 B 세포의 활성을 자극시켜 항체생산을 증가시키는 역할을 한다. 이러한 Th1/Th2형 사이토카인의 상호보완적인 조절에 의하여 면역 균형을 유지시키는데 아토피 상태에서는 Th1형 사이토카인이 감소되고, Th2형 사이토카인이 증가된다고 보고되고 있다. 이러한 사이토카인 불균형은 면역 조절 능력을 떨어뜨리게 되어 아토피 현상을 만성으로 발전시키게 된다.

본 연구 결과, 쇠미역 추출물의 처리는 Th1형 사이토카인인 IL-2 및 IFN-γ의 생성을 모든 군에서 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다(도 2). 반면 Th2형 사이토카인 IL-4 및 IL-10의 생성은 모든 군에서 유의적으로 감소되었음을 확인하였다(도 3). 이러한 효능은 쇠미역 10% 추출물에서 가장 효능이 뛰어났다. 따라서 쇠미역 추출물의 처리는 Th1/Th2형 사이토카인의 불균형을 억제시켜 면역 조절 능력을 확인하였다.

실험예 3: 비장세포에서 면역 글로불린 측정 시험

비장세포를 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×10 cells/웰을 100 ㎕씩 분주한 후, IL-4(50 ng/㎖) 및 LPS(10 ㎍/㎖)로 면역글로불린 E(IgE)의 생성을 자극시키고, 샘플을 처리하여 일주일 배양 후 상층액을 수집하였다. ELISA용 96-웰 플레이트에 각 사이토카인 측정에 특성화 된 1차 항체를 PBS에 희석 후 100 ㎕씩 분주해 하룻밤 동안 처리한 후, 그 다음날, 세척 완충액(PBST, 0.05% Tween 20 in PBS)로 1차 항체를 씻어낸 뒤, 항체가 결합하지 않은 플레이트의 다른 공간을 메워주기 위해 분석 완충액(1% BSA in PBS)을 넣어 1시간 동안 처리한 뒤 세척 완충액로 3번 세척하였다. 표준 곡선을 위한 용액과 위에서 씨딩한 비장세포의 배양액을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 반응이 끝난 뒤 세척 완충액으로 5번 씻어내고 분석 완충액에 2차 항체와 SAv-HRP를 희석시켜 준비한 뒤 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고 30분 동안 처리하였다. 이 과정이 끝나면 세척 완충액을 이용해 플레이트를 7번 씻어내고 발색을 도와주는 기질 시약을 100 ㎕씩 넣어 반응 시킨 뒤 650 ㎚에서 흡광도를 측정하고, 표준 곡선을 이용해 세포에서 생성된 사이토카인의 양을 계산하였다.

IgE의 생성은 아토피대조군에서 정상대조군에 비교하여 유의적으로 증가하였고, 모든 쇠미역 추출물 처리군에서 유의적으로 감소하였다(도 4).

실험예 4: MC/9 세포(비만 세포)에서 히스타민 측정 시험

히스타민은 비만 세포 안에 저장되어 있다가 비만 세포가 자극되어 손상되면 방출되어 혈관의 이완과 투과성의 증가시켜 혈구와 여러 혈장단백질들이 세균이 침입한 부위로 빨리 이동할 수 있도록 하여 염증반응을 일으키게 된다. 과도한 면역반응으로 인한 히스타민의 과다 분비는 알러지 반응과 아나필락시스를 일으키기도 한다. B 세포에서 생성된 과다한 IgE가 비만 세포를 자극시켜 히스타민의 방출을 증가시키게 되므로, IgE와 함께 알레르기 증상을 평가하는 중요한 지표이다.

MC/9 세포는 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×10 cells/세포를 100 ㎕씩 분주 후, A23187 1 μM 및 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 50 nM로 히스타민의 생성을 자극 시킨 후, 샘플 처리하여 24시간 동안 배양하여 상층액을 수집하여 마우스 히스타민 ELISA 키트(LDN, Nordhorn, Germany)를 이용하여 측정하였다. 반응 플레이트에 표준, 대조군 및 시료을 25 ㎕씩 분주하고, 아실레이션(acylation) 완충액 및 아실레이션 시약을 각각 25 ㎕씩 1시간 동안 처리하였다. 증류수 200 ㎕을 30분 동안 처리 하여, 20 ㎕을 수집한 뒤, 히스타민 멀티타이터 스트립에 옮겼다. 100 ㎕의 히스타민 항혈청을 각 웰에 처리하고 호일을 부착하여 15-20시간 2-8℃에 배양하였다. 세척 완충액(PBST, 0.05% Tween 20 in PBS)로 씻어낸 후, 효소 컨쥬게이트(enzyme conjugate)를 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하여 호일을 부착하여 1시간 처리한 뒤 세척 완충액로 씻어냈다. 기질을 각 웰 당 100 ㎕씩 20-30분 동안 처리한 뒤 650 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 5회의 측정으로 그에 대한 평균값과 표준 오차를 구하였다.

MC/9 세포에 PMA 및 A23187로 자극시킴으로서 히스타민이 방출되어 정상대조군과 비교하여 아토피대조군은 유의적으로 히스타민 농도가 증가되었다. 쇠미역 추출물 처리 모든 실험군은 아토피 대조군과 비교하여 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 5). 특히 쇠미역 10% 알코올 추출물이 유의적으로 가장 낮아 아토피 피부염에 가장 긍정적인 효능을 미칠 것으로 사료된다.

실험예 5: 켈틴생성세포(HaCaT 세포)에서 케모카인 및 전염증성(Proinflammatory) 사이토카인 발현 측정 시험

켈틴생성세포(keratinocyte, HaCaT 세포)는 6웰 플레이트에 각 웰 당 1×10 cells/웰을 2 ㎖씩 분주 후 TNF-α 20 ng/㎖ 및 IFN-γ 20 ng/㎖로 과민성 피부로 자극시킨 후, 샘플을 처리하여 24시간 후, 세포를 수집하여 RNeasy 추출 키트(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 프로토콜에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR 그린(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Bio-Rad Laboratories Inc.)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 실시간 PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR 프라이머의 염기서열은 표 1에 나타냈다. 실시간 PCR 반응은 총 20 ㎕ 내에 cDNA 2 ㎕ 및 2× SYBR 믹스 10 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 100 pmol/㎕를 1 ㎕씩 첨가하였고, 나머지는 H₂O로 채워주었다. PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 사이클은 40 사이클을 실시하였다. 핫 스타트(Hot start)를 위해 95℃에서 8분, 증폭 단계의 변성을 95℃에서 15초, 어닐링(annealing)을 TARC(Thymus and Activation-regulated Chemokine)와 이오탁신(Eotaxin)은 55℃에서, TNF-α 및 IL-6은 56℃에서 1분30초, 신장을 72℃에서 1분 동안 반복하며, 각 사이클의 신장 후에 값이 기록되었다. 모든 사이클이 완료된 후 프라이머의 특이성을 확인하기 위해 멜팅(melting) 곡선 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 원스템 시스템 소프트웨어 v2.1로 분석하였다.

유전자	프라이머 서열	서열목록
GAPDH(H)	F 5’-ATGGAAATCCCATCACCATCTT-3’	제1서열
GAPDH(H)	R 5’-CGCCCCACTTGATTTTGG-3’	제2서열
TARC(H)	F 5‘-GAAGACGTGGTACCAGACATCTGA-3’	제3서열
TARC(H)	R 5‘-CCCTGCACAGTTACAAAAACGA-3’	제4서열
이오탁신(H)	F 5‘-GCGACTAGAGAGCTACAGGAGAATC-3’	제5서열
이오탁신(H)	R 5‘-GGTCTTGAAGATCACAGCTTTCTG-3’	제6서열
IL-6(H)	F 5‘-AGGGCTCTTCGGCAAATGTA-3’	제7서열
IL-6(H)	R 5‘-GAAGGAATGCCCATTAACAACAA-3’	제8서열
TNF-α(H)	F 5‘-CCACTTCGAAACCTGGGATTC-3’	제9서열
TNF-α(H)	R 5’-TTAGTGGTTGCCAGCACTTCA-3’	제10서열

쇠미역 추출출을 처리한 TARC 및 이오탁신의 mRNA 생성은 아토피피부염 대조군과 비교하여 모두 유의적으로 감소하였다. 특히 이오탁신의 경우는 CCW 1000 ㎍/㎖, CCE10% 200 ㎍/㎖, CCE10% 1000 ㎍/㎖에서 정상군 수준으로 감소하였고, TARC의 경우는 CCE10% 1000 ㎍/㎖에서 정상군 수준으로 감소하는 경향을 보였다(도 6).

사이토카인을 자극한 케틴생성세포는 TNF-α을 증가시켰으나 쇠미역 추출물 처리 모든 실험군에서 유의적으로 감소되었고, 특히 CCE 10% 1000에서 정상군만큼 감소하였다. 또한 증가된 IL-6의 mRNA 발현은 쇠미역 추출물 처리한 모든 실험군에서 유의적으로 감소되었고, 특히 CCW 1000, CCE 10% 1000 및 CCE 70% 200에서 정상군만큼 감소하였음을 확인하였다(도 7).

따라서 본 연구의 결과에서는 쇠미역 추출물에서 아토피 피부염 억제효능이 나타났음을 확인하였으며 특히 10% 주정 추출물에서 히스타민 분비를 가장 억제시킴으로서 효능이 좋았음을 확인하였다. 이러한 결과는 쇠미역 추출물이 아토피 피부염 억제 효능을 지닌 국내 기능성 소재로서의 활용을 기대할 수 있도록 하였다.

상기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

CCE10%---------------------------------------------- 20 ㎎

유당 -------------------------------------------- 100 ㎎

탈크 --------------------------------------------- 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

CCE10%-------------------------------------------- 10 ㎎

옥수수전분 -------------------------------------- 100 ㎎

유당 -------------------------------------------- 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 ------------------------------- 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

CCE10% ------------------------------------------- 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 --------------------------------- 3 ㎎

락토오스 --------------------------------------- 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 --------------------------- 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

CCE10% ------------------------------------------- 10 ㎎

만니톨 ------------------------------------------ 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 ----------------------------- 2974 ㎎

Na₂HPO₄12H₂O ------------------------------------ 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

CCE10% ------------------------------------- 20 ㎎

이성화당 ------------------------------------------ 10 g

만니톨 --------------------------------------------- 5 g

정제수 -------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강 식품의 제조

CCE10%------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ------------------------------ 70 ㎍

비타민 E ---------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B₁--------------------------------------- 0.13 ㎎

비타민 B₂--------------------------------------- 0.15 ㎎

비타민 B₆----------------------------------------0.5 ㎎

비타민 B₁₂--------------------------------------- 0.2 ㎍

비타민 C ----------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 ---------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 --------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 ----------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ------------------------------------- 적량

황산제1철 -------------------------------------- 1.75 ㎎

산화아연 --------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 ----------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 -------------------------------------- 15 ㎎

제2인산칼슘 -------------------------------------- 55 ㎎

구연산칼륨 --------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 ---------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ----------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강 음료의 제조

CCE10%---------------------------------------- 1000 ㎎

구연산 ---------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 --------------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 ----------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Comositions for Improving, Preventing or Treating for Th2-immune mediated Disease comprising Extracts from Ecklonia stolonifera <130> PN160106 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> GAPDH(H) forward primer <400> 1 atggaaatcc catcaccatc tt 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> GAPDH(H) reverse primer <400> 2 cgccccactt gattttgg 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> TARC(H) forward primer <400> 3 gaagacgtgg taccagacat ctga 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> TARC(H) reverse primer <400> 4 ccctgcacag ttacaaaaac ga 22 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Eotaxin(H) forward primer <400> 5 gcgactagag agctacagga gaatc 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Eotaxin(H) reverse primer <400> 6 ggtcttgaag atcacagctt tctg 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> IL-6(H) forward primer <400> 7 agggctcttc ggcaaatgta 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> IL-6(H) reverse primer <400> 8 gaaggaatgc ccattaacaa caa 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> TNF-a(H) forward primer <400> 9 ccacttcgaa acctgggatt c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> TNF-a(H) reverse primer <400> 10 ttagtggttg ccagcacttc a 21

Claims

(a) 쇠미역(Costaria costata) 추출물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 쇠미역 추출물은 제염된(desalinized) 쇠미역 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 쇠미역 추출물은 쇠미역의 물, 탄소수 1-4 개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 또는 1,3-부틸렌 글리콜의 용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
쇠미역(Costaria costata) 추출물을 유효성분으로 포함하는 Th2 면역반응 과잉의 Th1/Th2 면역반응 불균형 개선용 식품 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 아토피성 피부염(atopy dermatitis), 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 기관지 천식(bronchial asthma), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 알레르기성 결막염(allergic conjuntivitis), 두드러기(urticaria), 혈관부종(vascular edema), 식품 알레르기, 물리적 알레르기, 과민성 폐장염, 직업성 알레르기 질환 또는 약물 알레르기인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 쇠미역(Costaria costata) 추출물의 식품학적 유효량; 및 (b) 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알레르기 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.