KR102386995B1

KR102386995B1 - 천연 공융용매로 추출한 사철쑥 추출물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102386995B1
Application number: KR1020210144918A
Authority: KR
Inventors: 김다애; 이대우; 김남주
Original assignee: (주)더마랩
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-04-15

Abstract

본 발명은 천연 공융용매로 추출한 사철쑥 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 사철쑥을 초고압 전처리 후 천연 공융 용매를 이용하여 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하여 제조되는 사철쑥 추출물을 함유하여 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 활성을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

천연 공융용매로 추출한 사철쑥 추출물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Artemisia Capillaris extracts prepared by a method based on natural deep eutectic solvents}

본 발명은 천연 공융용매로 추출한 사철쑥 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 사철쑥을 초고압 전처리 후, 천연 공융용매를 이용하여 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하여 제조되는 사철쑥 추출물을 함유하여 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 활성을 나타내는 화장료 조성물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이며, 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum, horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다. 이와 같은 피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다.

표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질로서 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능이라고 할 수 있다.

피부는 외부의 세균 침입 및 손상으로부터 보호하는 방어역할을 함과 동시에 내부로부터의 열과 수분 손실을 방지 하는 것 인데 표피에서 재생 능력을 보이는 것으로 알려진 것에는 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포 keratinocyte stem cell)가 있으며 피부 표면에 존재하는 표피 세포들은 바깥 표피 쪽으로 분화되어 나가면서 지질을 생산하고 분비하여 단백질로 각질화된(cornified) 원형질막에 이중층으로 된 조직을 형성한다. 외피 세포는 끊임없이 벗겨지고 다시 자라나는 이 과정이 반복된다. 외부로부터 피부 손상이 일어났을 경우 상처 치유 과정이 일어나는데 표피와 진피의 손상으로 기저막에 노출되어 있으면서 표피가 손실된 상처는 상처 표면에 선홍색을 띤다. 새로운 결체 조직을 형성하는 것으로 새로운 혈관 생성과 콜라겐 합성 과정이 있다. 섬유아세포는 콜라겐 합성 및 기타 결체 조직 형성에서 가장 중요한 세포 이므로 상처 복구 과정에서도 중요한 역할을 한다. 섬유아세포는 혈소판 대식 세포 등에 의해 염증기에 생성된 산물과 성장인자 등에 반응하여 움직이고 증식하며 염증기 후반부의 상처에 나타나기 시작한다. 노화가 진행되면서 피부 손상을 회복시키는 섬유아세포의 증식이 줄어들게 되고 콜라겐 등의 합성능이 떨어지면서 재생 능력이 낮아져 이로 인해 상처 부위의 회복이 느려지게 된다. 따라서 활성 생성 억제, 이로 인해 발생하는 염증 반응 억제 및 상처로부터 피부 재생을 촉진시켜 피부를 보호하여야 한다.

피부 노화의 원인에는 내적 원인과 외적 원인이 있다. 피부는 외부 환경에 노출되어 있어서 외적인 인자의 영향으로 노화가 진행되는 경우가 많으며, 이 들 중에는 자외선에 의한 손상, 외부 유해 환경 성분, 각종 스트레스로 인한 내부 요인이 포함된다. 외인성 노화는 주로 태양광선에 의해 영향을 받으며, 특히 자외선은 광노화(photo-aging)를 일으키는 것으로 잘 알려져 있다. 반면, 적외선은 체내에 열을 상승시켜 이로운 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 연구 결과에 의하면 적외선은 인체에서 완전히 무해하다고 간주하기 어려우며, 자외선과 같이 photo-aging 및 photo-carcinogenesis에 관여한다고 알려져 사람의 피부에 장시간 노출하게 되면 열에 의한 피부 노화를 발생시킨다고 보고되었다.

최근 노화의 원인으로 밝혀진 활성산소종은 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화현상을 촉진한다. 그리고 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다. 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며, MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다. MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-acroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며, 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다.

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있으며, 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다.

오래 전부터 일반적으로 액상 추출에는 유기용매가 사용되었다. 유기용매는 값이 싸고 추출효율이 좋은 장점을 가지고 있으나 실험자의 건강에 유해하고 환경오염 문제를 야기시킬 수 있는 단점이 있다. 최근 이러한 유기용매의 단점을 극복하고자 여러 가지 청정용매(green solvents)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이에 따라 유기용매의 대안으로 이온성 액체나 공융 용매(Deep Eutectic Solvents)의 사용이 제시되어 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

이온성 액체(ionic liquids)는 거대 헤테로 고리 양이온과 다양한 무기 음이온의 결합으로 이루어진 염으로, 낮은 융점을 가져 상온에서 액체로 존재한다. 이온성 액체는 끓는점이 낮고, 낮은 증기압, 비휘발성, 낮은 융해점, 높은 이온 전도성 등을 갖기 때문에 추출과 분리 분야에 적용되어 왔다. 그러나 한편으로는 이러한 이온성 액체가 인체에 유해한 독성을 갖고 있으며 생분해성이 낮고 미량의 불순물에 의해서도 이온성 액체의 물리적 특성이 영향을 받을 수 있으며, 이온성 액체 합성 시 음이온의 완전한 교환을 위해 많은 염과 용매를 사용하기 때문에 환경친화적인 용매에 부적합하며 가격이 높다는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해 공융용매(Deep Eutectic solvent, DES)가 개발되었다. 이러한 DES는 가격이 싸며, 독성이 없어 인체에 무해하고 밀도, 점도, 이온 전도도 등 많은 물리화학적 특성이 이온성 액체와 유사하기 때문에 새로운 청정용매로 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명자들은 상기 공융용매 중에서도 천연 화합물에 의해 이루어지는 공융용매인 천연 공융용매(Natural Deep Eutectic Solvents, NADES)를 이용하는 천연물 추출에 관하여 연구하여 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 화장료를 개발하고자 하였으며, 상기 용매를 사용하여 특정한 방법으로 사철쑥 추출물을 제조하는 경우 그 활성이 증대되어 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 효능을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001)대한민국 공개특허 제10-2014-0068831호 (2014.06.09.) (0002)대한민국 공개특허 제10-2015-0092611호 (2015.08.13.)

본 발명은 천연 공융용매를 사용하여 추출된 사철쑥 추출물을 유효성분으로 함유하여 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 사철쑥을 초고압 전처리 후, 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융용매로 추출하고, 다시 아임계 추출하여 피부개선활성이 증대되는 사철쑥 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 사철쑥을 초고압 전처리 후, 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융용매로 추출하고, 다시 아임계 추출하여 제조되는 사철쑥 추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

이 때, 상기 초고압 전처리는 사철쑥을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 50~100MPa 조건의 물로 120~180분 동안 가압 처리하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 천연 공융용매는 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)를 1:1의 중량비율로 혼합하여 제조되는 것임이 바람직하다.

상기 아임계 추출은 추출용매를 가하여 아임계 조건인 120~200℃, 압력 0.1~15MPa에서 10~30분간 추출하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 피부 보습용, 피부 진정용, 피부 재생용 또는 피부 주름개선용인 것을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)사철쑥의 잎, 줄기 또는 전초를 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 50~100MPa 조건의 물로 120~180분 동안 가압 처리하는 초고압 전처리 단계; (B)전처리된 사철쑥을 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융용매와 물을 용매로 하여 추출하는 단계; (C)상기 (B)단계에서 제조된 추출물에 추출용매를 가한 후 아임계 조건인 120~200℃, 압력 0.1~15MPa에서 10~30분간 추출하는 아임계 추출 단계; 및 (D)여과 후 농축하는 단계를 포함하는 사철쑥 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 (B)단계에서 용매는 비테인(Betaine) 5중량%, 사카로즈(Saccharose) 5중량% 및 물 90중량%의 비율로 혼합되어 이루어지는 것임이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따라 제조되는 사철쑥 추출물은 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부개선효과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명 화장료 조성물에 함유되는 추출물 원료인 사철쑥(Artemisia Capillaris)은 국내 각지에서 자생한다. 그 어린 줄기와 잎을 말린 것을 인진호(茵陳蒿)라하며, 이담작용, 천식억제, 구충작용, 이뇨작용 등이 알려져 있다. 그 성분으로서 스코파론(Scoparone), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카필린(Capillin) 등이 알려져 있다(정 보섭 및 신 민교, 향약대사전, pp1016-1017, 영림사, 1998).

본 발명에서 사철쑥 추출물의 제조에는 사철쑥의 잎, 줄기 또는 전초가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 사철쑥은 오프라인 및 온라인에서 구입이 가능하다.

본 발명에 따르면 사철쑥을 초고압 전처리 후, 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)로 이루어지는 천연 공융용매로 추출하고, 다시 아임계 추출하여 제조되는 사철쑥 추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 초고압 전처리는 사철쑥을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 50~100MPa 조건의 물로 120~180분 동안 가압 처리하는 것으로 이루어진다.

이 후, 천연 공융용매를 사용하여 추출한다. 공융용매(DES, Deep Eutectic Solvents)는 염과 HBD가 수소결합으로 공융되어 있는 상태이며, 염과 HBD(hydrogen bond donors, 수소결합 주개)를 일정한 비율로 혼합하여 제조된다. 특정 생리활성 강화 추출물의 제조에 있어서, DES 종류의 선택은 매우 중요하다. 확산, 용해도, 점도, 표면장력, 극성, 고상과 액상 사이에서 일어나는 물리화학적 상호작용은 추출 수율에 많은 영향을 주기 때문이다.

본 발명에서는 염으로서 비테인(Betaine)을 사용하였다. 비테인(Trimethylglycine)은 천연 화합물로 Glycine의 N원자에 3개의 메틸기가 부착되어 있는 quarternary ammonium compound이다. 또한 HBD(수소결합주개)로는 사카로즈(Saccharose)를 사용하였다. 사카로즈(C₁₂H₂₂O₁₁)는 수크로스(sucrose) 또는 자당(蔗糖)으로도 불리며, 사탕수수나 사탕무 등에서 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 비테인과 사카로즈는 1:1의 중량비율로 혼합되어 제조되는 경우에 추출효율이 높고 추출물의 활성이 높으므로 더욱 바람직하다. 공융 용매를 직접 추출용매로 사용할 수 있지만, 점도가 높으므로 추출 효율을 높이기 위해 다른 용매와 혼합하여 사용한다. 본 발명에서 바람직하게는 물과 혼합하여 용매로 사용한다. 비테인과 사카로즈로 이루어지는 공융용매에 5~15배 중량의 물을 가하여 추출용매로 사용한다. 본 발명에 있어서, 비테인(Betaine) 5중량%, 사카로즈(Saccharose) 5중량% 및 물 90중량%의 비율로 혼합 사용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면 상기 전처리된 사철쑥을 물 90중량%, Betaine 5중량%, Saccharose 5중량%로 이루어진 혼합용매에 넣어 40~45℃에서 3~4시간동안 추출한다.

이어서, 유효성분을 더욱 효율적으로 추출하기 위하여 아임계 추출한다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 상기 사철쑥 공융용매 추출물에 추출용매를 가하여 아임계 추출 조건인 120~200℃, 압력 0.1~15 MPa에서 15~30분간 추출한 후 여과하고 감압농축기로 농축하여 사철쑥 추출물을 제조한다.

상기 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 디메치콘, 미네랄오일, 사이클로메치콘, 옥틸도데칸올, 세틸에칠헥사노에이트, 트리레칠헥사노인, 이소프로필미리스테이트 및 식물성 오일로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용된다. 상기 식물성 오일이란 식물의 씨나 과육 등을 압착 등의 방법으로 추출한 오일을 의미하는 것으로, 올리브오일, 해바라기씨오일, 야자오일, 아보카도오일 등이 사용될 수 있다.

초고압 전처리하는 단계, 천연 공융용매를 이용하여 추출하는 단계 및 이를 다시 아임계 추출하는 단계로 이루어지는 다단계의 공정을 통하여 제조되는 사철쑥 추출물은 통상의 추출방법에 의해 제조된 사철쑥 추출물이나 일부 공정을 거치지 않은 사철쑥 추출물들에 비하여 활성성분 중의 하나인 클로로제닉산(Chlorogenic acid)의 함량이 매우 높았으며, 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 및 주름개선 효능을 나타내었다.

구체적으로는 피부유래 세포주의 생존률에 영향을 미치지 않으면서(시험예 1), 우수한 피부 보습 효과(시험예 2), 피부진정효과(시험예 3,4), 우수한 피부장벽 강화 효과(시험예 5), 피부재생효과(시험예 6) 및 피부 주름 개선효과(시험예 7)를 나타내었다.

그러므로 상기 사철쑥 추출물은 우수한 피부 보습, 진정, 피부 재생 또는 주름개선용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 사철쑥 추출물은 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~10 중량% 함유될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조 될 수 있으며, 그 예로는 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스 등을 들 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

제조예 1: 사철쑥 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g에 추출용매로서 정제수를 5배 중량으로 가하고 냉각 콘덴서가 달린 추출기(Cosmos-660, 경서기계)에서 100℃로 가열하여 2 시간씩 총 3회 추출하였다.

위의 방법으로 추출한 뒤 3일간 실온에서 방치하여 침전물을 300메쉬 여과지로 여과하고, 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 그리고 감압 농축기(Coolace CCA-1100, EYELA)를 이용하여 40℃~50℃의 온도에서 농축한 후 스프레이 드라이어(B-290, BUCHI사)를 이용하여 인렛(Inlet) 온도 180℃, 흡입기(Aspirator) 효율 100%(35㎤/시간), 펌프(Pump) 효율 25%(7.5㎖/분), 노즐클리너 4(Nozzle Cleaner 4) 및 유량계(Rotameter):30㎜(357리터/시간)의 조건으로 건조시켜 표제의 추출분말을 얻었다.

제조예 2: 사철쑥 공융용매 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g에 10배 중량의 추출용매로써 NADES 공법으로 추출하기 위해 물 90 중량%, Betain 5 중량% 및 Saccharose 5 중량% 용매로 45℃에서 3시간동안 중탕 추출하였다.

제조예 3: 사철쑥 아임계 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고 아임계수 조건인 121℃, 압력 1 MPa에서 15분간 추출하였다.

제조예 4: 사철쑥 초고압 전처리 및 공융용매 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 50℃, 100MPa의 물로 120분 동안 초고압 처리를 하였다(TFS-10L, Toyo Koatsu Co. LTD). 이후 비닐 파우치를 제거한 후 상기 제조예 2와 동일한 방법으로 추출하여 사철쑥 추출물을 얻었다.

제조예 5: 사철쑥 초고압 전처리 및 아임계 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 50℃, 100MPa의 물로 120분 동안 초고압 처리를 하였다(TFS-10L, Toyo Koatsu Co. LTD). 이후 비닐 파우치를 제거한 후 제조예 3과 동일한 방법으로 추출하여 사철쑥 추출물을 얻었다.

실시예 1: 사철쑥 추출물의 제조

건조된 사철쑥 전초 100g을 상기 제조예 4와 동일한 방법으로 추출하여 얻은 추출물에 추출용매로서 정제수를 10배 중량을 넣고, 아임계수 조건인 150℃, 압력 1 MPa 조건에서 15분간 추출하였다.

시험예 1: 세포 독성 여부 확인

MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 유전자 발현을 확인하기 위해 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO₂,37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 흡광도/대조군의흡광도×100

구분	세포 생존율(%)
구분	0.1%	0.5 %	1 %
제조예 1	100	101	100
제조예 2	100	101	100
제조예 3	100	100	100
제조예 4	101	100	100
제조예 5	100	100	101
실시예 1	100	101	100

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 제조예 및 실시예의 추출물들을 적용한 시료 모두 높은 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2: 보습관련인자 발현 증가효과 확인

CD-986Sk 세포를 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 Hyaluronan Synthase-3(HAS-3)의 발현 증가율을 확인하였다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다. 대조를 위해 히알루론산(Hyaluronic Acid)을 사용하였다.

HAS-3 발현증가율(%) = (시료 HAS-3 발현양/ 대조군 HAS-3 발현양) × 100

시료명	처리농도(w/v%)	HAS-3 증가율(%)
제조예 1	0.1	60.2
제조예 2	0.1	64.3
제조예 3	0.1	70.2
제조예 4	0.1	75.6
제조예 5	0.1	80.2
실시예 1	0.1	87.6
Hyaluronic Acid	0.1	86.7

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 초고압 전처리 후 공융용매로 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하는 공정에 의하여 제조되는 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 사철쑥 추출물에 비하여 Hyaluronan Synthase-3의 유전자 발현 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

시험예 3: 염증 매개 인자 IL-1α 발현 억제효과 확인

각질형성세포 (HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5 × 10⁵cells/well로 조절한 후, 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction)을 통해 IL-1α의 발현 증가율을 확인하였다. IL-1α 발현 억제율은 하기식에 의해 산출 되었고 그 결과는 하기 표 4에 나타 내었다. 대조군은 덱사메타손dexamethasone)을 사용하였다.

IL-1α의 억제율(%) = 시료 IL-1a 발현양/대조군 IL-1α발현양 × 100

IL-1α 억제율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
IL-1α 억제율(%)	100	500	1000
제조예 1	17.63	25.14	37.14
제조예 2	19.54	28.44	39.85
제조예 3	18.52	27.33	38.11
제조예 4	21.63	30.78	66.10
제조예 5	18.10	27.04	37.89
실시예 1	57.87	69.72	75.60
Dexamethason	60.28	72.56	75.62

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 사철쑥 추출물과 비교해 볼 때, IL-1α 억제율이 매우 높은 것으로 확인되었다.

시험예 4: 염증매개인자 TNF-α 발현 억제효과 확인

RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 5×10⁵ cell/well로 조절한 후, 12 well plate에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 배양한 뒤 12시간 동안 기아상태를 유지시킨 후, LPS 10ng/mL와 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에서 RNA를 추출하여 Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 TNF-α의 발현 억제율을 확인하였다. TNF-α 발현 억제율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

TNF-α 발현억제율(%)=[(대조군 TNF-α발현양 - 시료 TNF-α발현양)/대조군 TNF-α 발현양] × 100

구분	TNF-α 발현억제율(%)
구분	0.1%	0.5 %	1 %
제조예 1	44.0	46.5	48.5
제조예 2	41.2	43.2	49.6
제조예 3	42.3	44.5	50.2
제조예 4	39.6	45.2	51.2
제조예 5	50.2	55.2	68.5
실시예 1	63.7	69.6	78.6
Dexamethason	68.6	75.7	81.3

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 초고압 전처리 후 공융용매로 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하는 공정에 의하여 제조되는 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 각각의 사철쑥 추출물에 비하여 우수한 TNF-α 억제 효과를 나타내었다.

상기 시험예 3, 4의 결과를 통하여 본 발명 사철쑥 추출물의 피부진정효과를 확인할 수 있다.

시험예 5: 피부장벽 강화 시험

Transglutaminase-1의 유전자 발현 효과

제조예, 실시예 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Transglutaminase-1의 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH를 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 10분 변성 후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 70℃ 15분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100 pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
GAPDH	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
Tgase-1	Forward : TGATCGCATCACCCTTGAGT
Tgase-1	Reverse : GTAGATCTCATTGCGGGGGT

TGase-1 발현증가율(%)=(시료 TGase-1 발현양/대조군 TGase-1 발현양)×100

구분	TGase-1 발현증가율(%)
구분	0.1%	0.5 %	1 %
제조예 1	29	33	45
제조예 2	30	42	50
제조예 3	31	36	47
제조예 4	33	39	46
제조예 5	35	48	53
실시예 1	50	69	78
Control	100	100	100

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 상기 표 6에서 확인되는 바와 같이 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 각각의 사철쑥 추출물에 비하여 큰 Transglutaminase-1의 유전자 발현량을 나타내어 피부장벽강화 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

시험예 6: 상처 치유 효과 확인

피부 상처 치유 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성 세포(HaCaT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 cell culture dish에 세포를 배양한다. 6 well plate에 5 × 10⁵cells/well의 세포를 분주 후, 상기 제조예, 실시예 추출물 시료를 처리하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 18시간 배양하였다. 세포 재생율을 아래 식에 의하여 산출하였고 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

피부세포 재생율(%)= 시료 세포재생율/ 대조군 세포재생율 × 100

시료명	처리농도 (㎍/㎖)	피부세포 재생율(%)
제조예 1	1000	62.14
제조예 2	1000	75.21
제조예 3	1000	74.69
제조예 4	1000	72.63
제조예 5	1000	79.52
실시예 1	1000	85.71
덱사메타손	500	86.30

상기 표 7의 결과에서 확인되는 바와 같이, 초고압 전처리 후 공융용매로 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하는 공정에 의하여 제조되는 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 각각의 사철쑥 추출물에 비하여 우수한 피부세포재생율을 나타내어 피부재생 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

시험예 7: 콜라겐 생합성 촉진효과시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 제조예, 실시예의 추출물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래 식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다. 결과는 하기의 표 8에 나타내었다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100(%)

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 량

procollagen 발현율(%)	시료 농도(㎍/㎖)
procollagen 발현율(%)	0	50	100	500	1000
제조예 1	2.78	32.44	42.77	69.14	128.94
제조예 2	2.78	42.12	52.16	78.65	137.81
제조예 3	2.78	45.63	55.47	81.14	141.25
제조예 4	2.78	40.36	51.39	74.41	135.10
제조예 5	2.78	41.28	50.28	72.50	138.55
실시예 1	2.78	60.87	80.47	110.67	170.36

상기 표 8에서 확인되는 바와 같이, 초고압 전처리 후 공융용매로 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하는 공정에 의하여 제조되는 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물은 제조예 1 내지 5의 각각의 사철쑥 추출물에 비교해 볼 때, 매우 높은 프로콜라겐 발현율을 나타내었다.

시험예 8: 클로로제닉산(Chlorogenic acid) 함량 비교

사철쑥의 유효성분인 클로로제닉산(Chlorogenic acid)의 함량을 분석하기 위하여 HPLC(LC-20A Prominence Series, Shimadzu)로 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

분석 조건

* Mobile phase : A : (0.05% phosphoric acid in Water) 90%

B : Acetonitrile 10%

* Detector : PDA 254nm

* Injection Volume : 10㎕

* Standard(Chlorogenic acid) : 12.5ppm, 25ppm, 50ppm

시료명	클로로제닉산(㎍/㎖)
제조예 1	5
제조예 2	8
제조예 3	11
제조예 4	13
제조예 5	15
실시예 1	40

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, 초고압 전처리 후 공융용매로 추출하고, 이를 다시 아임계 추출하는 공정에 의하여 제조되는 상기 실시예 1의 사철쑥 추출물에서 가장 높은 클로로제닉산 함량을 나타내었다.

실시예 2: 세럼의 제조

상기 실시예 1의 사철쑥 추출물을 함유한 세럼을 하기의 표 10의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
사철쑥 추출물(실시예 1)	1.0
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
미네랄 오일	10.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

실시예 3: 크림의 제조

상기 실시예 1의 사철쑥 추출물을 함유한 크림을 하기 표 11의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량(중량%)
사철쑥 추출물(실시예 1)	1.0
시어버터	2.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
미네랄 오일	10.0
디메치콘	3.0
소르비탄 스테아레이트	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.0
세테아릴알코올	2.0
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시폴리머	0.25
트리에탄올아민	0.25
페녹시에탄올	적량
정제수	To 100

시험예 9: 제형안정도 확인

상기 실시예 2, 3의 제형에 대하여 실온(25℃), 냉장(4℃) 및 항온(50℃)으로 일정하게 유지되는 실내, 냉장고 및 인큐베이터에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관 및 관찰(변색, 변취 및 분리)하며, 안정성을 확인하였다. 또한 온도 순환조건 (-5 ~ 45℃)에서도 안정성을 확인하였다. 결과는 표 12에 나타내었다.

온도조건	안정성 확인(변색, 변취 및 분리)
온도조건	실시예 2	실시예 3
실온(25℃)	0	0
냉장(4℃)	0	0
항온(50℃)	0	0
순환 (-5 ~ 45 ℃)	0	0

< 제형 안정 등급 >

0: 변화 없음 1: 미세한 변화 2: 변화 3: 극심한 변화

상기 표 12에서 확인되는 바와 같이 실시예 2, 3 제형 모두 25℃, 4℃ 및 50℃ 온도 조건하에서 변색, 변취 및 분리현상이 나타나지 않고 안정함이 확인되었다.

Claims

사철쑥을 비닐 파우치에 넣어 밀봉하고 40~50℃, 50~100MPa 조건의 물로 120~180분 동안 가압 처리하는 것으로 이루어지는 사철쑥 초고압 전처리 후, 비테인(Betaine)과 사카로즈(Saccharose)가 1:1의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 천연 공융용매로 추출하고, 다시 추출용매를 가하여 아임계 조건인 120~200℃, 압력 0.1~15MPa에서 10~30분간 추출하는 아임계 추출하여 제조되는 사철쑥 추출물을 유효성분으로서 조성물 전체 중량에 대하여 0.1~10 중량% 함유하는 피부재생용 화장료 조성물.
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