상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 멜라닌 생성 억제제 및 피부 보습 외용제는 유효성분으로 대나무수액 및 전처리된 대나무수액을 함유하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 대나무수액은 대나무재배과정에서 성장을 도와주기 위해 주기적으로 잘라주는 가운데 부산물로 생성되는 것으로 보통 재배되는 지역이나 대나무의 수종, 채취시기 등의 환경적 요인에 의해 함유성분 조성비가 달라지지만, 단백질(0.08~0.7%), 칼슘(422㎎/ℓ), 당(1.6~2.7g/ℓ) 및 아미노산(7.6~30㎎/ℓ) 등을 함유하고 있으며, pH는 약 4.5정도를 나타내는 것으로 알려져 있다.
한편, 전처리 방법은 채취 직후의 대나무수액을 0.001~0.45㎛의 공극 크기(pore size), 바람직하게는 0.2㎛의 공극 크기를 갖는 여과막으로 여과시킨 후, 여액에 무수 에탄올을 7.0중량% 이상의 양으로, 바람직하게는 7.0∼50중량%의양으로 첨가하는 것이다. 이때, 여과막의 크기를 0.001~0.45㎛로 제한하는 것은 여과막의 크기가 0.001㎛미만일 경우에는 여과에 걸리는 시간이 오래 걸리게 되고, 0.45㎛ 초과에서는 여과 효율이 떨어져 효과적이지 못하는 문제점이 있기 때문이다. 본 발명에서는 이 대나무수액을 멜라닌 생성 억제제 및 피부 보습 외용제의 유효성분으로 직접 사용하거나, 사용전 보관상 변색 및 변취되지 않도록 전처리를 먼저 하고 유효성분으로 사용할 수 있다.
즉, 여과막으로 여과하는 것에 의해 대나무수액에 존재하는 균, 미생물 및 미생물의 영양분으로 이용되거나 장기 보존시 침전, 변성의 가능성이 있는 분자량이 큰 단백질을 제거한 다음, 무수 에탄올을 부가하여 효소의 활성을 억제하여 변색 및 변취를 방지한다.
전처리된 대나무수액은 질소 분위기하에서 바로 밀봉하여, 외부의 균이나 미생물의 침입을 방지하도록 한 후, 실제 사용시 개봉하여 사용한다.
상기한 방법으로 전처리된 대나무수액은 피부자극이 없고, 티로시아나제 활성 및 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있으며, 아울러, 피부에 보습효과를 부여할 수 있다.
따라서, 전처리된 대나무수액을 화장료, 연고 등의 피부 외용기제에 유효성분으로 배합되어 멜라닌의 생성을 억제할 수 있으며, 피부보습효과를 부여할 수 있다.
대나무수액의 외용기제에의 함유량은 제형에 따라 적의하게 선정될 수 있으며, 조성물 총 중량에 대해 0.01~99.5중량%, 바람직하게는 1.0~90.0중량%의 범위내에서 선정될 수 있다.
본 발명의 전처리된 대나무수액이 함유되는 피부 외용기제로는 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션 등의 제형을 갖는 화장료, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누 등의 세정료, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 제형등이 있다.
본 발명의 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 좀더 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
<시험예 1> 전처리방법
5년 이상 성장한 대나무의 뿌리로부터 첫 번째 혹은 두 번째 마디 부위를 잘라내고, 잘라낸 부위에 밀착된 연결관을 사용하여 뿌리로부터 올려지는 대나무수액을 채취하였다. 채취 직후의 대나무수액을 0.2㎛의 공극 크기를 갖는 여과막을 통과시킨 후, 하기 표 1의 방법으로 처리하였다. 그중, DM 및 DP는 에탄올내 DM 및 DP의 함량이 10.0중량%이 되도록 용해시키고, 3g을 평량하여 100g이 되도록 대나무수액을 채취한 후, 실온, 45℃ 및 냉장보관(4℃)을 하고 시간경과에 따라 방부효과를 확인하였다. 그 결과를 하기 표1에 나타내었다.
처리방법 |
함량(중량%) |
1일경과 |
7일경과 |
30일경과 |
냉장 |
실온 |
45℃ |
냉장 |
실온 |
45℃ |
냉장 |
실온 |
45℃ |
Imidazolidinyl urea |
0.3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
X |
X |
X |
X |
DM (in 10% EtOH soln) |
0.3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
X |
X |
X |
X |
DP (in 10% EtOH soln) |
0.3 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
X |
X |
X |
DM/DP(in 10% EtOH soln) |
0.2/0.1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
X |
X |
X |
무수 에탄올 |
2.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
X |
X |
X |
무수 에탄올 |
5.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
X |
무수 에탄올 |
7.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
무수 에탄올 |
10.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
무수 에탄올 |
25.0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
주: 0 방부 유지, X 방부 효과가 없어서 균류 증식. |
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 무수 에탄올을 7.0중량% 를 함유한 경우 30일까지 방부 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 대나무수액을 7.0 중량% 이상의 무수 에탄올로 처리하면 변색 및 변취되는 것이 방지되어, 화장료 등의 원료로서 효과적으로 사용될 수 있다.
<시험예 2> 대나무수액의 피부자극도 실험
건강한 남녀 실험자 20명의 팔 하박부에 각 실시예 처방으로 제조된 시료를 폐쇄 첩포 시험 방법에 따라, 1일 1회씩 도포 후 외부와의 차단을 위해 플라스틱 캡을 씌운 다음 1일 후, 3일 후, 7일 후에 하기 판정기준으로 자극 정도를 관찰하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
0 : 자극 없음
1 : 최소한의 자극
2 : 약간의 자극(홍반)
3 : 심한 자극(홍반, 부종)
4 : 극심한 자극(홍반, 부종)
<실시예 1> 유연화장수
성분 |
함량(중량%) |
베타인 |
3.0 |
낫토검 |
0.08 |
셀룰로오스검 |
5.0 |
에탄올 |
0.5 |
폴리옥시에틸렌경화피마자유 |
0.2 |
초산토코페롤 |
5.0 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 2> 영양화장수
성분 |
함량(중량%) |
세칠에칠헥사노에이트 |
5.0 |
세토스테아릴알콜 |
1.0 |
친유형모노스테아린산 스테아레이트 |
0.8 |
스쿠알란 |
2.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
0.5 |
글리세린 |
8.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
카르복시비닐폴리머 |
0.2 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
향 |
미량 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 3> 영양크림
성분 |
함량(중량%) |
밀납 |
1.0 |
글리세릴스테아레이트 |
2.0 |
세토스테아레이트 |
2.5 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
0.5 |
세칠에칠헥사노에이트 |
5.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
유동파라핀 |
8.0 |
글리세린 |
8.0 |
프로필렌글리콜 |
4.0 |
식물추출물 |
5.0 |
방부제 |
미량 |
색소 |
미량 |
향 |
미량 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 4> 에센스
성분 |
함량(중량%) |
글리세린 |
15.0 |
프로필렌글리콜 |
5.0 |
셀룰로오스검 |
0.05 |
낫토검 |
5.0 |
히아루론산추출물 |
5.0 |
아미노프로판술포니액시드 |
2.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.5 |
에탄올 |
5.0 |
폴리옥시에칠렌경화마자유 |
0.5 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
방부제 |
미량 |
향 |
미량 |
색소 |
미량 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 5> 로션
성분 |
함량(중량%) |
글리세릴스테아레이트 |
1.5 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
0.5 |
세칠에칠헥사노에이트 |
3.0 |
스쿠알란 |
3.0 |
라놀린 |
2.0 |
글리세린 |
8.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.5 |
가수분해콜라겐 |
1.0 |
트리에탄올아민 |
0.5 |
방부제 |
미량 |
향료 |
미량 |
색소 |
미량 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 6> 연고
성분 |
함량(중량%) |
카프린/카프릴 트리글리세리드 |
10.0 |
액상 파라핀 |
10.0 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
6.0 |
옥틸도데세스-25 |
9.0 |
세칠에칠헥사노에이트 |
10.0 |
스쿠알란 |
1.0 |
살리실산 |
1.0 |
글리세린 |
15.0 |
솔비톨 |
1.0 |
전치리한 대나무수액 |
to 100 |
<실시예 7> 분무제
성분 |
함량(중량%) |
트리에탄올아민 |
0.2 |
폴리비닐롤리돈/비닐아세테이트 |
3.0 |
글리세린 |
5.0 |
폴리아크릴레이트 |
0.2 |
전처리한 대나무수액 |
to 100 |
상기 처방을 펌프용기에 담아 사용한다.
시료 |
피부 자극도(%) |
1일 후 |
3일 후 |
7일 후 |
실시예 1 |
0.3 |
0.3 |
0.4 |
실시예 2 |
0.2 |
0.3 |
0.5 |
실시예 3 |
0.5 |
0.6 |
0.8 |
실시예 4 |
0.3 |
0.4 |
0.6 |
실시예 5 |
0.5 |
0.5 |
0.8 |
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1~5의 전 시료에 있어서 피부 자극이 없음을 알 수 있었다.
<시험예 3> 티로시나제 활성억제 효과 실험
대나무수액은 그대로 사용할 수 있으나, 알코올의 영향을 제거하여 티로시나제의 활성억제실험을 하기 위하여 대나무수액 2ℓ를 채취 직후 여과하고 바로 동결건조처리하여 대나무수액 건조물 1.57g을 얻었다. 상기의 건조된 대나무수액 추출물과 알부틴에 대해서 티로시나제 저해효과를 측정하였다. 티로시나제는 버섯류에서 추출한 시그마(Sigma)사의 것을 사용하였다.
[실험방법]
기질인 티로신을 인산나트륨 완충용액(0.1M, pH 6.8)에 용해시켜 0.3㎎/㎖의 농도를 만들어, 이 용액 334㎕를 취하여 시험관에 넣고, 여기에 인산나트륨 완충용액(0.1M, pH 6.8)을 576㎕를 첨가하였다. 상기 대나무수액 건조물을 메탄올에 용해시켜 10㎎/㎖를 만든 후, 메탄올을 사용하여 5.0, 1.5, 1.0㎎/㎖, 500, 150 및 100㎍/㎖로 희석하여 실험군으로 사용하였다. 이와 같이 희석된 건조물 시료들을 각각70㎕씩 취하여 티로신이 든 시험관에 가하고, 37℃ 항온조에서 10분간 반응시키고, 대나무수액 건조물 대신에 메탄올 70㎕를 첨가하여 대조군으로 사용하였다.
실험군 및 대조군의 실험관 안에 1,700unit/㎖의 티로시나제 용액을 20㎕씩 넣어 전체 부피가 1,000㎕가 되도록 증류수를 넣고, 37℃ 항온조에서 30분간 반응시켰다. 30분 경과 후, 반응시킨 시험관을 얼음물에 넣어서 티로시나제의 활성을 중지시킨 후, 분광분석계를 사용하여 470㎚ 단파장의 흡광도를 측정하였다.
알부틴에 의한 티로시나제의 활성억제효과를 확인하기 위하여 알부틴을 인산나트륨 완충용액에 용해시켜 농도 5.0, 1.5, 1.0㎎/㎖, 500, 150, 100㎍/㎖로 희석하여 실험군으로, 알부틴용액 대신에 인산나트륨완충용액을 넣은 것을 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타내었다.
시료 |
흡광도(대나무수액 건조물) |
흡광도(알부틴) |
대조군 |
0.96 |
0.96 |
100㎍/㎖ |
0.92 |
0.93 |
150㎍/㎖ |
0.85 |
0.88 |
500㎍/㎖ |
0.73 |
0.84 |
1.0㎎/㎖ |
0.61 |
0.78 |
1.5㎎/㎖ |
0.54 |
0.73 |
5.0㎎/㎖ |
0.32 |
0.61 |
시료 |
IC 50(㎍/㎖) : 티로시나제 활성을 50% 억제하는 시료의 농도 |
대나무수액 건조물 |
375.33 ±87.75 |
알부틴 |
735.22 ±285.55 |
상기 표 3 및 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 대나무수액 건조물은 알부틴보다 약 2배정도의 티로시나제 활성억제효과가 있음을 알 수 있다.
<실험예 4> 멜라닌 생성저해 효과실험
상기 실험예 3에서 처리한 방법과 동일하게 대나무수액 건조물을 제조하였으며, 실험을 위하여 B-16세포(ATCC사, 미국)의 세포주를 사용하였다.
[실험방법]
흑색종 세포를 10% 우태아 혈청, 1% 항생제 및 10-7M의 α-MSH(멜라닌세포 자극호르몬, Sigma 사)이 들어 있는 RPM1(Gibco사)의 세포배양 배지에 공급하여 약 1/3정도의 집합(confluence)으로 성장시켰다. 대나무수액 건조물, 코지산, 알부틴 및 아스코르빈산 등의 각각의 시료를 50㎍/㎖의 농도로 배양배지에 용해시키고, 시료가 들어 용액을 흑색종 세포에 지속적으로 가하면서 2일간 배양하였다. 대조군으로는 아무런 시료가 들어 있지 않은 배양배지를 사용하여 배양하였다. 배양 후 세포들을 트립신-EDTA (Gibco사)로 처리하여 시험관에 모은 후, 세포들의 수를 세고, 4,000,000세포당 1㎖의 1N 수산화용액을 첨가하여 멜라닌을 녹여낸 후, 470㎚ 단파장에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
시료 |
멜라닌양(㎍/㎖/4,000,000 cell) |
대조군에 대한멜라닌 생성량(%) |
대조군 |
98.25 ±15.65 |
- |
대나무수액 건조물 |
42.65 ±12.24 |
43.40% |
알부틴 |
53.24 ±13.04 |
54.19% |
코지산 |
51.42 ±12.95 |
52.33% |
아스코르빈산 |
102.12 ±35.67 |
- |
상기의 결과와 같이 대나무수액 건조물은 대조군에 비해서 B-16 흑색종세포의 멜라닌양을 억제할 수 있으며, 같은 양의 알부틴이나 코지산을 사용하는 경우보다 생성된 멜라닌의 양이 적음을 확인하였다. 아스코르빈산은 대조군과 거의 유사한 값을 나타냈다.
<시험예 5>
인간으로부터 직접 채취하거나 혹은 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피 세포에 대나무수액과 증류수를 각각 포화 흡수시키고, 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부세포 단위 질량당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡수된 물의 양을 비교하기 위한 방법으로, 실제 사람의 피부에 있어서도 보습효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.
[실험방법]
먼저, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위 질량당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 Kaiser 수분측정기를 사용하여 측정하였다(초기 건조상태의 수분 함량). 물의 함량이 측정된 표피세포를 대나무수액(A), 정제수(B)에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켰다. 세포내의 물이 포화 흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 Kaiser 수분측정기로 함유되어 있는 단위 질량당 수분의 양을 측정하였다(포화상태의 수분 함량). 이후 다시 48시간 건조시켜 무게를 달고, 일부를 채취하여 Kaiser 수분측정기로 함유되어 있는 단위 질량당 수분의 양을 측정하였으며(재건조후의 수분함량), 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
표피세포에 대한 수분공급능력(수분 ㎎/표피세포 질량 g)
|
초기 건조상태의수분 함량 |
포화상태의 수분 함량 |
재건조후의 수분 함량 |
대나무수액 |
450 |
850 |
550 |
정제수 |
450 |
840 |
450 |
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 대나무수액으로 포화 흡수시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화 흡수된 표피세포의 재건조과정에 있어서, 정제수보다 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 대나무수액의 우수한 피부 보습성을 확인할 수 있었다.