KR102357077B1 - 분리된 신장 세포 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세뇨관 및 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 신장 세포 집단을 함유하는 분리된 신장 세포, 및 이를 분리 및 배양시키는 방법, 및 이 세포 집단으로 치료를 요하는 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

분리된 신장 세포 및 이의 용도{ISOLATED RENAL CELLS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 U.S. 가출원. 61/114,025(2008년 11월 12일자 출원됨), 61/114,030(2008년 11월 12일자 출원됨), 61/201,056(2008년 12월 5일자 출원됨), 61/201,305(2008년 12월 8일자 출원됨), 및 61/121,311(2008년 12월 10일자 출원됨)을 우선권으로 주장하며, 온전한 그대로 참고문헌에 통합된다. 본 발명의 주제는 2009년 11월 12일자 제출된 U.S. 가출원 No. 61/260,833과 관련되며, 온전한 그대로 참고문헌에 통합된다.
본 발명은 세뇨관 및 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 신장 세포 집단을 포함하는 분리된 신장 세포, 및 이를 분리하고, 배양하는 방법, 및 이 세포 집단을 사용하여 필요로 하는 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
미국에서 1,900 백만 명이 만성 신장 질환을 앓고 있으며, 이 질환은 흔히 비만, 당뇨병, 및 고혈압을 포함하는 대사 질환의 결과다. 대사질환 데이터 검사에 따르면, 이런 증가율은 세계적으로 증가세에 있는 두 질환 즉, 고혈압 및 비-인슐린 의존적 진성 당뇨병(NIDDM)에 부차적으로 신부전이 발생하기 때문이다(United States Renal Datasystem: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of diabetes and Digestive and Renal Diseases, 2007 pp 223-238). 비만, 고혈압, 및 불충분한 혈당 조절 모두 신장 손상의 개별적인 위험 인자로 알려져 있고, 사구체 및 세뇨관 병소의 원인이 되며, 단백뇨 및 신장 여과 기능에서 다른 전신적으로-탐지가능한 변화를 일으킨다(Aboushwareb, et al, World J Urol, 26: 295-300, 2008; Amann, K. et al, Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998). 1-3의 진행 단계에 있는 CKD 환자들은 근원적인 질병 상태를 조절하기 위하여 생활 양식의 변화 및 약리학적 중재를 받고 있으며, 단계 4-5의 환자들은 일반적으로 투석, 및 항고혈압제, 적혈구생성 자극 물질 (ESAs), 철 및 비타민 D 보충제를 포함하는 약물 요법을 받는다. United States Renal Data Service (USRDS)에 따르면, 말기 신부전 (ESRD) 환자들은 주사용 적혈구생성-자극 물질 (ESAs), 비타민 D 보충제, 및 철 보충제에 평균매달 600$ 이상 사용한다(United States Renal Datasystem: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of diabetes and Digestive and Renal Diseases, 2007 pp 223-238). 매년 평균 투석 비용 ($65,405)과 합치면, 환자 일인당 연간 의료 비용은 $72,000 이상으로 상승되며(United States Renal Datasystem: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of diabetes and Digestive and Renal Diseases, 2007 pp 223-238) - 이 비용은 표준 시술 비용만을 반영한 것이며, 다른 합병증, 응급 치료 또는 투석을 하기 위한 도관 이식편의 배치와 같은 부수적인 시설의 치료 등은 포함하지 않았다. 2005년 CKD 및 ESRD의 복합 의료 비용은 총 $620억불에 다다르며, 이는 그해 총 의료 비용의 19%에 해당된다(United States Renal Datasytem: Costs of CKD and ESRD. ed. Bethesda, MD, National Institutes of Health, National Institute of diabetes and Digestive and Renal Diseases, 2007 pp 223-238). 투석을 회피하기 위하여, 또는 질병 상태를 관리하는데 더 이상 투석만으로 충분하지 않을 때, 신장 이식은 선재수단으로서 단계 4-5의 환자들의 효율적인 선택이 되지만, 미국에서 전체 신장 이식으로 인하여 이익을 얻게 될 단계 5의 CKD 환자 수(>400,000)는 임의의 한 해에 이용가능한 적합한 신장 공여자의 수(~16,000)를 초과한다(Powe, NR et al, Am J Kidney Dis, 53: S37-45, 2009). 따라서, 투석을 지연시키거나 또는 투석 의존도를 감소시키는, 및 신장 공여자의 부족으로 인한 공백을 채울 새로운 치료 패러다임이 요구된다.
초기 질환 손상(가령, 고혈압)과 이 손상에 대한 신장 부적응 반응의 복합 으로 인하여 진행성 신장 질환이 초래된다. 이와 같은 반응은 사전-염증성 및 사전-섬유화 사이토킨 및 성장 인자들의 생성을 포함한다. 따라서, CKD 진행을 지연시키는 한 가지 방법은 염증 및 섬유화 반응을 개선시키고, 신장 조직의 복구 및/또는 재생을 통하여 신장 퇴화를 완화시키거나 또는 역전시키는 것이다.
인간 및 일부 가축에서 만성 신부전은 흔하다. 신부전을 경험한 환자는 신장 기능의 상실(요독증), 및 적혈구생성을 통하여 골수가 충분한 양의 적혈구 세포(RBCs)를 생산하는 능력이 없기 때문에 빈혈증이 생긴다. 적혈구 항상성(Erythroid homeostasis)은 신장에 있는 특화된 간질 섬유모세포에 의한 에리트로포에틴 (EPO)의 생산과 골수에서 표적화된 적혈구 조상세포(progenitors)의 EPO에 반응하는 능력 및 더 많은 RBCs를 제조하는 능력에 따라 달라진다. 신부전 빈혈증은 신장에서 EPO의 감소된 생산과 골수에서 EPO 작용에 대해 요독증 인자의 음성적 효과 때문이다.
지금까지, 만성 신부전을 치료하기 위한 임상적 방법은 투석과 여과 및 소변 생산을 복원시키기 위한 신장 이식, 및 적혈구 중량을 복원시키기 위하여 재조합 EPO 또는 EPO 유사체의 전신 전달을 포함한다. 투석은 중기 내지 말기 단계의 신부전 환자에게 생명을 제공하지만, 심각한 삶의 질 문제를 일으킨다. 신장 이식은 신부전 후기 단계의 환자에게 정말 희망하는 선택(그리고 유일한 선택)이지만, 신부전 환자군의 수요에 비해 양질의 신장 공여자의 공급이 따르지 못한다. 빈혈증 치료를 위하여 재조합 EPO의 볼루스 주입(Bolus dosing)은 심각한 하류 건강 위험과 연관되어 있으며, 해당 약물에 대한 FDA의 블랙박스 경고가 있으며, 이 집단에서 적혈구 항상성을 복원시키기 위한 대체 요법의 추가 연구가 필요하다. 유전자 치료 접근법을 통하여 생성된 EPO를 생산하는 세포의 생체내 효과 및 안전성에 대하여 전임상 조사가 검토되었다. 이들 연구는 EPO를 생산하는 세포를 생체내로의 전달에 의해 적혈구생성 및 RBC 수를 일시적으로 자극시키는 것이 가능하다는 것을 보여주었다. 그러나, 현재까지, 이들 방법중 제어된 적혈구 항상성 또는 장기적인 생체내 기능을 제공하는 것은 없었다. 결과적으로, HCT 및 RBC 수는 종종 정상치 이상으로 증가되어, 진성적혈구증가증(polycythemia vera) 및 다른 합병증으로 이어졌다. 치료와 관련된 및 재조합 EPO 전달 보다 더 나은 효과를 제공하는 EPO를 생산하는 세포의 전달은 HCT를 증가시켜야 하고, 고유의 양성적 및 음성적 조절 기전을 가진 적혈구 항상성을 복원시켜야만 한다. 신장 질환 환자에서 흔한 EPO 결핍 빈혈증은 심부전, 다장기부전증 및 다른 만성 질환들을 포함하는 다른 질환 상태으로 발전될 수 있다.
신장은 상이한 많은(>10) 특화된 세포 유형으로 구성된 독특한 기관이며, 이들 세포 유형 모두는 중기 중배엽으로부터 발생적으로 기인되지만 성숙시에 형태학적으로 및 기능적으로 별개의 기능 및 해부학적 단위로 형성되고, 이들 세포 유형들은 함께 작용하여 혈액의 여과, 소변의 생성, 산-염기 조절 및 전해질 균형, 및 에리트로포에틴 (Epo), 비타민 D, 레닌, 및 앙지오텐신과 같은 조절된 엔도크린 기능을 제공한다. 신장의 세포 격실은 항상성 기능을 위하여 상당히 서로 의존하고 있는데, 다음의 예들에 의해 눈에 띄게 되었다. 구심성 소동맥(afferent arterioles)의 세포는 사구체를 통한 혈류를 조절하기 위하여 Henle (Macula Densa) 루프의 굵은 상행각(thick ascending limb)의 특화된 세뇨관 세포와 함께 작용한다(Castrop, H. Acta Physiol (Oxf), 189: 3-14, 2007). 신장에서 처리되는 단백질은 수용체 매개된 세포내이입과 특화된 전단 세뇨관 세포에 의한 사구체 여과물로부터 단백질의 재흡수와 짝을 이룬 유창형(fenestrated) 내피세포, 발세포(podocytes) 및 사구체의 기저막에 의해 조정된다(Jarad, G & Miner, JH. Curr Opin Nephrol Hypertens, 18: 226-32, 2009). 세뇨관 세포에 의한 활성 비타민 D의 생산은 세포외 매트릭스 침착, 간질 세포의 골섬유모세포로의 전환, 및 상피-중간엽 형질전환을 조절하는 직간접 기전을 통하여 간질 세포의 항상성을 조절한다(Tan, X, et al. J Steroid Biochem Mol Biol, 103: 491-6, 2007). 특정 예와 관계없이, 신장에서의 모든 세포-세포 상호작용은 최소한 부분적으로 공간적 및 구성적 상관관계에 따라 달라진다. 세포 수준에서, CKD의 진행은 세포의 불충분성 또는 세포-세포간 상호작용의 항상성 상실로 인하여 특정 세포 유형의 상실 또는 하나 이상의 세포 유형의 기능 상실과 연관될 수 있다. 따라서, CKD 치료에 대한 성공적인 재생적 접근법은 세포 조직화 및 세포간 소통의 복원을 통하여 부분적으로 항상성을 재확립해야 한다.
EPO의 세뇨관 운반 또는 생산과 같은 특정한 신장 기능의 증대는 CKD 진행과 연관한 발병률 및 치사률을 감소시키는 의도와 함께 고려되어 왔다. 신장 질환에 대한 세포 기반을 둔 치료 접근법의 대부분은 줄기 또는 조상 세포 유형을 이용한 급성 신부전(ARF)의 치료요법적 중재에 집중되었다(Hopkins, C, et al. J Pathol, 217: 265-81, 2009). MSCs(Humphreys BD & Bonventre JV, Annu Rev Med 2008, 59:311-325), 내피 조상세포(EPCs) (Chade AR, et al, Circulation 2009, 119:547-557, Patschan D, et al, Curr Opin Pharmacol 2006, 6:176-183), 및 태아 세포 또는 조직 기반(Hammerman MR, Curr Opin Nephrol Hypertens 2001, 10:13-17; Kim SS, et al, Stem Cell 2007, 25:1393-1401; Marshall D, et al, Exp Physiol 2007, 92:263-271; Yokoo T, et al, J Am Soc Nephrol 2006, 17:1026-1034)의 신장내 또는 전신 전달을 포함한 다양한 세포 유형의 ARF 유도 직전 또는 직후 전달을 포함한 많은 전임상적 연구가 있었다. 인간의 ARF 치료를 위하여 통상적인 투석에 보조물로써 신장 세뇨관 세포를 함유하는 체외 공동-섬유 여과 장치를 시험하였다(Ding, F & Humes, HD. Nephron Exp Nephrol, 109: e118-22, 2008, Humes, HD, et al. Kidney Int, 66: 1578-88, 2004, Humes, HD, et al. Nat Biotechnol, 17: 451-5, 1999). 심혈관 수술에 부차적인 ARF 에피소드의 고위험군 환자에서 신장 동맥을 통한 간엽 줄기 세포의 이식도 시험중이다(Westenfelder, C. Experimental Biology. New Orleans, LA, 2009). CKD의 세포-기반을 둔 치료 중재를 다루기 위한 제한된 전임상적 연구가 실행되었다 (Chade, AR, et al. Circulation, 119: 547-57, 2009, Eliopoulos, N, et al.. J Am Soc Nephrol, 17: 1576-84, 2006, Kucic, T, et al.. Am J Physiol Kidney Physiol, 295: F488-96, 2008). 설치류에서 태아 신장 조직 기관 +/- 간엽 줄기 세포의 조합을 조사하였는데(Yokoo, T, et al.. Transplantation, 85: 1654-8, 2008, Yokoo, T, et al. J Am Soc Nephrol, 17: 1026-34, 2006), 장막과 같은 적절한 환경으로 이식된 태아 전체 신장 조직은 제한된 기능을 하는 신장 구조로 발달될 수 있음이 명백하다. 그러나, 태아 조직 기관의 성분으로서 MSC의 치료 역할이 불분명하며, 치료 목적으로 인간의 태아 신장 조직을 원천으로 사용하는 것은 많은 작업상의 및 도덕덕인 문제를 내포한다. 다른 연구에서, 건강한 골수 공여자로부터 유도된 세포를 방사능조사된 COL4A3 (-/-) 마우스(사구체신염, 단백질 상실 및 섬유증을 가진 Alport 증후군의 모델)에게 이식하였는데, 모델에서 기능을 못하는(leaky) 사구체 발세포를 콜라겐 유전자 돌연변이가 없는 건강한 세포로 대체시켜 진행이 부분적으로 느려졌다(Prodromidi, EI, et al.. Stem Cell, 24: 2448-55, 2006, Sugimoto, H, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 103: 7321-6, 2006). 세포 이식으로 sCREAT, BUN, 및 나트륨 수준의 안정화를 얻지만, studies 24에서 치료안된/신장이 손상된 대조군은 비교용으로 제시하지 않았다. Chade et al은 손상후 6주시점에서 신장으로 전달된 자가 조직 EPCs의 효과를 검사하기 위하여, 일측면 신장 동맥 협착증이 있는 돼지 모델을 이용하였다(Chade AR, et al, Circulation 2009, 119:547-557). EPCs는 세뇨관-간질 섬유증을 다소 개선시켰고, 사구체경화증을 상당히 개선시켰으며, 신장 혈행을 개선시켰지만, 치료에 의한 혈압의 변화는 관찰되지 않았다(Chade AR, et al, Circulation 2009, 119:547-557). 현재까지, CKD에 대한 세포-기반을 둔 치료법의 생체내 효과를 검사한 연구는 일시적 및/또는 부분적인 효과를 얻었으며, 기능의 전신적 및 조직적인 증거를 규합한 연구는 거의 없었다. CKD의 진행 모델에서 중재이후 임상적으로 연관된 효과들의 증거를 제공하는 제한된 수의 연구는 신장 기능을 완벽하게 복원시키기 위한 세포-기반의 치료법의 잠재력에 대해 의문을 제기한다. 그러나, 신장 기능을 안정화시키고, 진행을 지연시키는 재생 치료법은 이들 환자 집단의 채워지지 않은 의학적 요구를 해결할 수 있다.
진행성 CKD의 생체내 재생성은 모델 후보 치료법의 치료 잠재력의 평가에 필수적이다. ARF 모델은 그 수가 많고, 다양한 화학적 또는 허혈/재관류에 의해 유도된 세뇨관 손상을 포함하지만, 유의적인 중재없는 진행성, 말기 CKD 모델은 더 적다. 반복적으로 말기 진행성 신부전 상태의 랫트에서 2단계 5/6 신장적출 시술은 고혈압, 사구체 여과률 감소(GFR), 상승된 혈청 크레아티닌 (sCREAT) 및 BUN, 사구체 및 및 세뇨관-간질 섬유화, 고지혈증, 고인산혈증, 및 빈혈증을 포함하는 몇 가지 CKD의 주요 특징을 갖춘 전신적, 조직학적으로 탐지가능한 질환을 초래한다 (Kaufman, JM, et al.. Kidney Int, 6: 10-7, 197422, Platt, R, et al. Clin Sci (Lond), 11: 217-31, 1952, Ormrod, D & Miller, T. Nephron, 26: 249-54, 1980, Brenner, BM. Am J Physiol, 249: F324-37, 1985). 기술적인 재생성 및 상업적인 이용성과 복합하여, 임상적으로 관련된 특징들의 존재는 여기에서 기술된 연구용으로 이 모델을 선택하게된 기반을 제공하였다.
따라서, 신장 기능의 실질적으로 지속적인 증대, 이러한 환자 집단에서 진행을 느리게 하고, 삶의 질을 개선시키고, 건강관리 시스템에 매년 비용 부담을 감소시키는 새로운 치료 패러다임이 요구된다. 재생적 의약 기술은 CKD에 대한 차-세대 치료 선택권을 제공할 수 있다.
발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 제 1 세포 집단, B2, 및 제 2 세포 집단을 함유하는 인간 신장 세포 혼합물을 제공하는데, 이때 B2는 분리된, 풍부한 세뇨관 세포 집단을 함유하며, 제 2 세포 집단은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 세포, 사구체 세포 및 도관(vascular) 세포를 함유한다. 일부 구체예에서, 혼합물은 제 3 세포 집단을 추가로 포함한다. 한 구체예에서, B2 세포 집단은 집합(collecting) 도관 상피 세포를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, B2 세포 집단은 저산소-저항성이다. 한 구체예에서, B2 세포 집단은 HAS-2 (히알루론 합성효소-2)의 발현을 통하여 시험관 및 생체 모두에서 고분자량의 히알루론산(HA) 종을 생산 및/또는 생산을 자극할 수 있다. 또 다른 구체예에서, B2 세포 집단은 요오딕사놀(iodixanol)-저항성이다. 특정 구체예에서, B2 세포 집단은 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.052 g/㎖ 사이의 밀도를 가진다. 추가 구체예에서, 제 2 세포 집단은 B4 세포 집단이다. 한 구체예에서, B4 세포 집단은 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 밀도를 가진다. 특정한 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 B3 세포 집단이다. 한 구체예에서, B3 세포 집단은 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이의 밀도를 가진다. 추가 구체예에서, 혼합물은 B2 및 B3 세포 집단 모두를 포함한다.
추가 구체예에서, 혼합물은 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들이 결핍된다. 한 구체예에서, 혼합물은 B1 세포 집단을 포함하지 않거나 결핍된다. 한 구체예에서, B1 세포 집단은 ~1.045 g/㎖ 미만의 밀도를 가진 집합 도관 및 세뇨관계의 큰 과립 세포들을 포함한다. 특정한 다른 구체예에서, 혼합물은 B5 세포 집단을 포함하지 않거나 또는 결핍된다. 한 구체예에서, 혼합물은 ~1.091 g/㎖ 초과의 밀도를 가지는 저입도와 생존력의 작은 세포 집단 및 잔해를 함유하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 세포의 혼합물은 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공한다. 한 구체예에서, 혼합물은 수용체 매개된 알부민을 흡수할 수 있다. 다른 구체예들에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포에틴 (EPO)를 발현할 수 있다. 추가 다른 구체예들에서, 혼합물은 시험관 및 생체내에서 모두 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생산 및/또는 생산을 자극할 수 있는 HAS-2를 발현시키는 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 혼합물은 생체내로 전달시 재생적 자극을 제공할 수 있다. 다른 구체예들에서, 혼합물은 생체내로 전달시 사구체 여과 감퇴의 감소, 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생산, 및/또는 엔도크린 기능을 안정화 또는 개선시킬 수 있다.
모든 구체예에서, 제 1 및 제 2 세포 집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로 부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, B2는 메갈린, 쿠비린(cubilin), 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린(Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 포함하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8)으로 구성된 군으로부터 선택된 세뇨관 표식의 발현을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, B2는 또한 집합 도관 표식 아쿠아포린-4 (Aqp4) 표식의 발현을 추가 특징으로 한다.
모든 구체예에서, B4는 PECAM, VEGF, KDR, HIF1a로 구성된 군으로부터 선택된 도관 표식의 발현을 특징으로 할 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, B4는 사구체 표식 포도신(Podocin; Podn) 또는 네트린(Nephrin; Neph)의 발현을 특징으로 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, B4는 분취화안된(UNFX), B2 및 B3 세포 집단과 비교하였을 때, 산소-조정가능한 EPO 풍부한 집단으로 특징화될 수 있다. 또 다른 구체예에서, B4는 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도테린 수용체 타입 B (Ednrb), 콜라겐, 타입 V, 알파 2 (Col5a2), 캐드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성물질, 조직 (Plat), 앙지오포에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비된 단백질, 산성, 시스테인-풍부한 (오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 (Timp3), Wilms 종양 1 (Wt1), 날개없는-타입 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 신호생성 4 (Rgs4)의 조절물질, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam), 및 에리트로포에틴 (Epo)으로 구성된 군으로부터 선택된 표식의 발현을 특징으로 할 수 있다.
모든 구체예에서, B3는 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인을 포함하는 이온 운반 조절물질 2 (Fxyd2), 용질 운반체 패밀리 17 (인산나트륨), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 운반체 패밀리 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 냅신 A 아스파르트 펩티다제 (Napsa), 용질 운반체 패밀리 2 (조장된 포도당 운반물질), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (막) 아미노펩티다제 (Anpep), 막통과 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 합성효소 중간-쇄 패밀리 멤버 2 (Acsm2), 글루타티온페록시다제 3 (Gpx3), 푸럭토즈-1,6-바이포스포타제 1 (Fbp1), 및 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소 2 (Agxt2)으로 구성된 군으로부터 선택된 표식의 발현을 특징으로 할 수 있다. 특정한 다른 구체예에서, B3는 도관 발현 표식 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 표식 포도신 (Podn)을 특징으로 할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 제 1 세포 집단, B2, 및 제 2 세포 집단을 함유하는 인간 신장 세포 혼합물을 제공하는데, 이때 B2는 분리된, 풍부한 세뇨관 세포 집단을 함유하며, 제 2 세포 집단은 도관 발현 표식 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 표식 포도신 (Podn)을 발현하는 하나 이상의 세포 집단을 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 B2 세포 집단을 함유하는 분리된, 풍부한 인간 신장 세포 집단을 제공하는데, 여기서 B2는 분리된, 풍부한 세뇨관 세포 집단을 함유한다. 한 구체예에서, B2 세포 집단은 HAS-2 (히알루론 합성효소-2)의 발현을 통하여, 시험관 및 생체내에서 모두 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생산하거나 및/또는 생산을 자극할 수 있다. 특정 구체예에서, B2 세포 집단은 ~1.045 g/㎖ 미만의 밀도를 가지는 집합 도관 및 세뇨관계의 큰 과립 세포를 함유하는 B1 세포 집단을 포함하지는 않는다. 또 다른 구체예에서, B2 세포 집단은 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이의 밀도를 가지는 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 세포, 사구체 세포 및 도관 세포를 함유하는 B3 세포 집단을 포함하지 않는다. 추가적인 또 다른 구체예에서, B2 세포 집단은 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 밀도를 가지는 B4 세포 집단을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, B2 세포 집단은 ~1.091 g/㎖ 초과의 밀도를 가지는 저입도와 생존력의 작은 세포 집단 및 잔해를 함유하는 B5 세포 집단을 포함하지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간의 B2 세포 집단을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 비풍부한(non-enriched), 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 저산소(hypoxic) 배양 조건에 노출시키고; 및 b) B2 세포 집단을 함유하는 제 1 세포 분취물을 추출하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 B2 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 세뇨관 세포를 함유하고, 더 적은 비율의 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포 및 도관 세포를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 단계 a)와 단계 b) 사이에, 하나 이상의 세포 분취물을 분리하기 위하여 밀도 구배(gradient)에 세포 현탁액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제 1 세포 분취물은 원심분리한 후 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.052 g/㎖ 사이의 상대 밀도(specific density)의 구배에 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간의 B4 세포 집단을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 비풍부한, 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 저산소 배양 조건에 노출시키고; 및 b) B4 세포 집단을 함유하는 제 1 세포 분취물을 추출하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 B4 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 EPO를 생산하는 세포, 도관 세포 및 사구체 세포를 함유하고, 더 적은 비율의 EPO를 생산하지 않는 세포, 비-사구체 세포 및 비-도관 세포를 함유한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 단계 a)와 단계 b) 사이에, 하나 이상의 세포 분취물을 분리하기 위하여 밀도 구배에 세포 현탁액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제 1 세포 분취물은 원심분리후 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 상대 밀도의 구배에 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간의 B3 세포 집단을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 비풍부한, 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 저산소 배양 조건에 노출시키고; 및 b) B3 세포 집단을 함유하는 제 1 세포 분취물을 추출하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 단계 a)와 단계 b) 사이에, 하나 이상의 세포 분취물을 분리하기 위하여 밀도 그라디어트에 세포 현탁액을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 제 1 세포 분취물은 원심분리후 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이 상대 밀도의 구배에 존재한다.
또 다른 측면에서 본 발명은 인간의 B2 세포 집단을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 비풍부한, 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 저산소 배양 조건에 노출시키고; 및 b) 세포 집단내 하나 이상의 개별 세포에서 전방 산란(forward scatter)과 측면 산란(side scatter)을 동시에 측정할 수 있는 유세포분석기(flow cytometric)에 세포 현탁액을 넣고; c) 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 선택하고; d) 세포 집단으로부터 세포 하위집단을 분류하고; 및 e) 세포 집단으로부터 B2 세포 하위집단을 분리시키는 것을 포함하며, 여기서 B2 세포 하위집단은 집단의 대다수에 비해 높은 전방 산란 및 높은 측면 산란을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간의 B4 세포 집단을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 a) 비풍부한, 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 저산소 배양 조건에 노출시키고; 및 b) 세포 집단내에 하나 이상의 개별 세포에서 전방 산란과 측면 산란을 동시에 측정할 수 있는 유세포분석기에 세포 현탁액을 넣고; c) 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 선택하고; d) 세포 집단으로부터 세포 하위집단을 분류하고; 및 e) 세포 집단으로부터 B4 세포 하위집단을 분리시키는 것을 포함하며, 여기서 B4 세포 하위집단은 집단의 대다수에 비해 낮은 전방 산란 및 낮은 측면 산란으로 특징화된다. 모든 구체예에서, 전방 산란은 세포 크기에 상응한다. 모든 구체예에서, 측면 산란은 세포 입도에 상응한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안정화된 신장 기능 및/또는 개선된 신장 기능을 필요로 하는 피험자에게 제공하기 위한 이식가능한 구조체를 제공하는데, 이 구조체는 a) 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 생체적합물질; 및 b) 제 1 세포 집단, B2, 및 제 2 세포 집단을 함유하는 포유류 신장 세포 혼합물을 함유하는데, 여기서 제 2 세포 집단은 생체적합물질로 피복되고, 생체적합물질에 침착되고 또는 생체적합물질에 포집되고, 생체적합물질에 현탁되고, 생체적합물질에 임베드된 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된다. 한 구체예에서, 생체적합물질로 피복된, 생체적합물질에 침착된 또는 생체적합물질에 포집된, 생체적합물질에 현탁된, 생체적합물질에 임베드된 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된 제 2 세포 집단은 B4다. 또 다른 구체예에서, 생체적합물질로 피복된, 생체적합물질에 침착된 또는 생체적합물질에 포집된, 생체적합물질에 현탁된, 생체적합물질에 임베드된 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된 제 2 세포 집단은 B3다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 생체적합물질로 피복된, 생체적합물질에 침착된 또는 생체적합물질에 포집된, 생체적합물질에 현탁된, 생체적합물질에 임베드된 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된 혼합물은 제 3 세포 집단을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 생체적합물질로 피복된, 생체적합물질에 침착된 또는 생체적합물질에 포집된, 생체적합물질에 현탁된, 생체적합물질에 임베드된 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된 혼합물은 B3 및 B4를 모두 포함한다. 모든 구체예에서, 혼합물은 포유류 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유도될 수 있다. 한 구체예에서, 구조체는 혼합물의 포집 및/또는 부착에 적합한 3차원적(3-D) 다공성 생체적합물질로 형성된 생체적합물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조체는 포유류 세포를 임베딩, 부착, 현탁 또는 피복시키는데 적합한 액체 또는 반-액체 겔로 형성된 생체적합물질을 포함한다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 구조체는 하이드로겔 형태의 고분자량 히알루론산 (HA)종으로 주로 구성되고, 형성된 생체적합물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조체는 다공성 포말 형태의 고분자량 히알루론산 (HA)종 히알루론산으로 주로 구성된 생체적합물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조체는 크기가 5.1 kDA 부터 2×106 kDa 초과 범위의 HA 분자로 구성된 생체적합물질을 포함한다(>2×106 kDa 범위는 무한대를 말하므로 > 대신 <표시가 되어야 할 것으로 보임) 추가적인 또 다른 구체예에서, 구조체는 약 50 미크론 내지 약 300 미크론 사이의 포어를 가지는 폴리-락트산 기반의 포말로 구성된 생체적합물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조체는 자가 신장 시료로부터 유도된 하나 이상의 세포 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 신장 시료는 신장 생검이다. 추가 구체예에서, 구조체는 비-자가 신장 시료로부터 유도된 하나 이상의 세포 집단을 포함한다. 한 구체예에서, 구조체는 적혈구 항상성을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 질환의 치료를 요하는 피험자에서 신장 질환 치료 방법을 제공하는데, a) 제 1 세포 집단, B2, 및 제 2 세포 집단을 함유하는 포유류 신장 세포의 혼합물을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하고; 및 b) 피험자에서 취한 시험 시료에서 신장 기능 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한지를 결정하는 것을 포함하고, 여기서 지표 수준의 차이는 피험자에서 하나 이상의 신장 기능 감퇴의 감소, 안정화 또는 개선을 나타낸다. 특정 구체예에서, 이 방법은 제 3 세포 집단을 함유하는 세포의 혼합물을 포함한다. 한 구체예에서, 제 2 세포 집단은 B4 또는 B3이다. 또 다른 구체예에서, 제 3 세포 집단은 B4 또는 B3이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 치료될 신장 질환은 에리트로포에틴 (EPO) 결핍을 수반한다. 특정 구체예에서, EPO 결핍은 빈혈증이다. 일부 구체예에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 피험자에서 신부전에 부차적으로 발생된다. 일부 다른 구체예들에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염, 또는 다장기부전증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 부차적으로 발생한다. 특정 구체예에서, 이 방법에 이용되는 조성물은 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 및/또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 생체적합물질을 추가로 포함하며, 여기서 혼합물은 생체적합물질로 피복되거나, 생체적합물질에 침착되거나 또는 생체적합물질에 포집되거나, 생체적합물질에 현탁되거나, 생체적합물질에 임베드되거나 및/또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에서 이와 같은 치료에 유용한 약물의 제조를 위하여 본 발명의 세포 제제, 이의 혼합물 또는 이식가능한 구조체의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 약 1% 내지 약 5% 산소 수준에 약 12 내지 약 24 시간 노출된 후 밀도 구배를 통하여 원심분리에 의해 분리가능한 선택된 신장 세포 집단을 제공하는데, 이때 구배는 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.052 g/㎖의 밀도를 가진 부분을 포함하며, 여기서 세포 집단은 (i) 원심분리후, 구배에서 1.045 g/㎖ 내지 약 1.052 g/㎖ 사이의 밀도에 유지되며, (ii) 최소한 하나의 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 하는 신장 세뇨관 세포 집단을 함유하며, (iii) 수용체 매개된 알부민을 운반할 수 있는 신장 세뇨관 세포의 하위집단을 함유하며, (iv) 신장 질환을 가진 또는 위험에 처한 피험자로 전달될 때 하나 이상의 신장 기능을 조절할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약 1% 내지 약 5% 산소 수준에 약 12 내지 약 24 시간 노출된 후 밀도 구배를 통하여 원심분리에 의해 분리가능한 선택된 신장 세포 집단을 제공하는데, 이때 구배는 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖의 밀도를 가진 부분을 포함하며, 여기서 세포 집단은 (i) 원심분리후, 구배에서 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 밀도에 유지되며, (ii) 산소-조정가능한 에리트로포에틴(EPO)을 발현시키는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포를 함유하며, (iii) 신장 질환을 가진 또는 위험에 처한 피험자로 제공될 경우 하나 이상의 신장 기능을 조절할 수 있고; 및 (iv) 공동 투여시에 청구항 65의 신장 세포 집단에 의한 하나 이상의 신장 기능의 조절을 강화시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 세포의 집단을 제공하는데, 여기서 세포는 i) 고-포도당 DMEM 및 5% 태아 소 혈청으로 완전히 보충된 KSFM의 1:1 혼합물로 구성된 배지에서, 37℃, 21% 산소에서 24-72시간 동안, 25,000개 세포/㎠의 초기 밀도로 표준 조직 배양 처리된 플라스틱 배양접시에서 흡착 배양되었으며; ii) 50-100% 배지를 동일한 배지로 교체하고, 18-24 시간 동안 37℃, 2% 산소에서 배양되었으며; iii) 트립신 처리를 통하여 수거되고, 무혈청 KSFM 배지 또는 PBS에 재현탁되고, 세척되었으며; iv) 제조된 밀도 구배에 로딩되었으며, 이때 구배는 1.045 g/㎖ 내지 약 1.052 g/㎖의 한정된 밀도 층을 포함하고, 최소한 하나의 더 큰 밀도층과, 최소한 하나의 더 적은 밀도 층을 포함하며, 이에 따라 구배는 15㎖의 원뿔형 튜브안에 총 액체 용적이 5㎖ 이상 및 최대 14㎖ 미만으로 준비되었고, 구배에 로딩된 세포의 수는 최소한 5000만 그러나, 10,000 만을 초과하지 않으며; v) 브레이크없이 20-30분간 800×G에서 원심분리에 의해 구배를 통하여 밀려나가게 되며; 1.045 g/㎖ 내지 1.052 g/㎖ 사이의 밀도에서 분리되며; 및/또는 메갈린, 쿠비린, 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린 (Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 칼파인-8 (Capn8), 및 아쿠아포린-4 (Aqp4) 표식으로 구성된 군으로부터 선택된 표식을 특징으로 하고; 및/또는 신장 질환을 가진 면역절충된 피험자에서 하나 이상의 신장 기능을 안정화, 기능 감퇴의 감소, 또는 개선시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 세포의 집단을 제공하는데, 여기서 세포는 i) 고-포도당 DMEM 및 5% 태아 소 혈청으로 완전히 보충된 KSFM의 1:1 혼합물로 구성된 배지에서, 37℃, 21% 산소에서 24-72시간 동안, 25,000개 세포/㎠의 초기 밀도로 표준 조직 배양 처리된 플라스틱 배양접시에서 흡착 배양되었으며; ii) 50-100% 배지를 동일한 배지로 교체하고, 18-24 시간 동안 37℃, 2% 산소에서 배양되었으며; iii) 트립신 처리를 통하여 수거되고, 무혈청 KSFM 배지 또는 PBS에 재현탁되고, 세척되었으며; iv) 제조된 밀도 구배에 로딩되었으며, 이때 구배는 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖의 한정된 밀도 층을 포함하고, 최소한 하나의 더 큰 밀도층과, 최소한 하나의 더 적은 밀도 층을 포함하며, 이에 따라 구배는 15㎖의 원뿔형 튜브안에 총 액체 용적이 5㎖ 이상 및 최대 14㎖ 미만으로 준비되었고, 구배에 로딩된 세포의 수는 최소한 5000만 그러나, 10,000 만을 초과하지 않으며; v) 브레이크없이 20-30분간 800×G에서 원심분리에 의해 구배를 통하여 밀려나가게 되며; 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 밀도에서 분리되며; 및/또는 VEGF, KDR, HIF1a, 포도신 (Podn) 또는 네프린(Neph), 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도테린 수용체 타입 B (Ednrb), 콜라겐, 타입 V, 알파 2 (Col5a2), 캐드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성물질, 조직 (Plat), 앙지오포에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비된 단백질, 산성, 시스테인 풍부한(오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 (Timp3), Wilms 종양 1 (Wt1), 날개없는-타입 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 신호생성 4 (Rgs4)의 조절물질, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam), 및 에리트로포에틴 (Epo)으로 구성된 군으로부터 선택된 표식을 특징으로 하고; 및/또는 신장 질환을 가진 면역절충된 피험자에서 하나 이상의 신장 기능을 안정화, 기능 감퇴의 감소, 또는 개선시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 신장 세포의 분리된 집단을 제공한다. 한 구체예에서, 집단은 EPO를 생산하는 포유류 세포의 분리된, 풍부한 집단이다. 또 다른 구체예에서, 집단은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 포유류 세포를 함유하는 비풍부한 집단보다 더 큰 비율의 EPO를 생산하는 세포를 함유하는 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 포유류 세포의 분리된, 풍부한 집단이다.
이 집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유도될 수 있다. 이 집단은 피험자로부터 수득한 신장 시료로부터 유도될 수 있다. 시료는 피험자로부터 수득된 신장 시료에서 유도된 신장 조직 또는 배양된 신장 세포가 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 세포 집단은 EPO를 생산하는 포유류 세포 비풍부한 집단보다 더 큰 비율의 EPO를 생산하는 세포를 함유한다. 한 가지 다른 구체예에서, 세포 집단은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 포유류 세포를 함유하는 비풍부한 집단보다 더 적은 비율의 신장 세뇨관 세포를 포함한다.
모든 구체예에서, 이 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축될 수 있다. 모든 구체예에서, 이 세포 집단은 비-EPO 생산 세포에 대해 농축될 수 있다. 모든 구체예에서, 이 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 농축될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 특정 배양 조건하에 생체-반응성인 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 세포의 집단을 제공한다. 한 가지 다른 구체예에서, 생체-반응성은 저산소가 아닌 조건하에 배양된 세포 집단과 비교하여, 저산소 조건에서 이 세포 집단이 배양되었을 때 EPO 발현이 유도된다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 이 세포 집단의 생체-반응성은 저산소가 아닌 조건하에 배양된 세포 집단과 비교하여, 저산소 조건에서 배양되었을 때 EPO 발현이 증가된다. 일부 구체예에서, 저산소 배양 조건은 산소 수준이 감소안된 조건에서 배양된 세포 집단과 비교하여, 배양 시스템에서 세포 집단이 이용할 수 있는 산소 수준을 감소시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 가지 다른 구체예에서, 이용할 수 있는 산소 수준의 감소는 약 5% 미만이며, 산소 수준이 감소안된 조건은 대기중의 산소 수준 (약 21%)이다. 또 다른 구체예에서, 산소 수준이 21% 이상에서 시험된 배양물과 비교하였을 때 대기중 산소 수준(21%)보다 낮은 산소 수준에서 EPO의 발현 증가가 관찰될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 저산소 배양 조건과 같이 약 5% 미만의 산소에서 세포를 배양하였을 때, 및 대기중 산소 수준 (약 21%), 즉, 저산소가 아닌 배양 조건에서 배양된 세포에서의 유도 수준 및/또는 증가된 발현 수준과 비교하였을 때 EPO 발현의 유도 및/또는 증가가 관찰될 수 있다. 한 구체예에서, 저산소 조건에서 생체-반응성이 되는 EPO 발현은 저산소 유도성 인자 HIF에 조절된다. 또 다른 구체예에서, 저산소 조건에 생체-반응성인 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 저산소 조건에 생체-반응성인 EPO 발현은 저산소 유도성 인자 HIF2α에 의해 조절된다.
한 구체예에서, 관주(perfusion)를 통하여 배양되지 않은 세포 집단과 비교하였을 때, 관주를 통하여 세포 집단이 배양되면 생체-반응성은 EPO 발현의 유도 다. 또 다른 구체예에서, 생체-반응성은 관주를 통하여 배양되지 않은 세포 집단과 비교하였을 때 생체-반응성은 EPO 발현의 증가이다. 일부 구체예에서, 관주 조건은 액체의 흐름을 통하여 세포로 동력이 전달되는 유체의 일시적, 간헐적 또는 연속적 순환 또는 교반을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 관주 배양 조건은 3차원적 구조의 형성을 허용하는 틀구조 및/또는 공간을 제공하는 물질내 또는 물질위에서 세포 집단을 배양하여 실행된다.
한 가지 다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 세포 집단을 함유하는 신장 세포의 혼합물 또는 조합을 제공한다. 한 구체예에서, 세포 혼합물은 EPO를 생산하는 세포를 농축시킨 제 1 세포 집단 및 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축안된 제 2 세포 집단을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장으로부터 유도된 하나 이상의 타입의 세포를 포함할 수 있는데, 이 세포는 다음중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 세뇨관으로부터 유도된 세포, 사구체로부터 유도된 세포, 간질(interstitium)으로 부터 유도된 세포, 집합 도관으로부터 유도된 세포, 결합 조직으로부터 유도된 세포, 혈액으로부터 유도된 세포, 또는 혈관으로부터 유도된 세포. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한다.
모든 구체예에서, 여기에서 설명된 신장 세뇨관 세포는 다음중 하나 이상의의 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 할 수 있다: 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), CYP2D25 (비타민 D3 25-수산화효소), 메갈린, 쿠비린, N-캐드헤린, E-캐드헤린, 아쿠아포린-1, 아쿠아포린-2, RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인(Calpain)-8 (Capn8)
한 측면에서, 본 발명은 분리, 풍부한 포유류 신장 세뇨관 세포 집단을 제공한다. 한 구체예에서, 분리된 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 농축되며, 최소한 어느 정도의 EPO를 생산하는 포유류 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 세포 집단은 세뇨관 세포를 포함하는 비풍부한 집단보다 더 큰 비율의 세뇨관 세포를 가진다. 한 가지 다른 구체예에서, 포유류 신장 세뇨관 세포의 분리, 풍부한 집단은 세뇨관 세포 및 최소한 어느 정도의 EPO를 생산하는 포유류 세포를 함유하는 비풍부한 집단보다 더 큰 비율의 세뇨관 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 포유류 신장 세뇨관 세포 집단은 비-분취된, 이질성 혼합물과 비교하였을 때, 또는 EPO를 생산하는 세포의 풍부한 집단과 비교하였을 때, 상대적으로 EPO를 생산하는 세포가 고갈되어 있다.
모든 구체예에서, 여기에서 기술된 신장 세포 집단 또는 이의 혼합물이 유도된 원천 유형은 자가 또는 동종이계(allogeneic), 친연성(syngeneic)(자가(autogeneic) 또는 동계(isogeneic)), 및 임의의 이의 조합이 될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 세포의 혼합물은 (i) 자가 원천으로부터 유도된 제 1 세포 집단과 자가 원천으로부터 유도된 제 2 세포 집단; 또는 (ii) 자가 원천으로부터 유도된 제 1 세포 집단과 동종이계로부터 유도된 제 2 세포 집단을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 세포 집단을 만드는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 a) 기계적으로 해리된 또는 효소로 절단된 포유류 신장 조직으로부터 비풍부한, 이질성 설치류 신장 세포 집단을 가진 세포 현탁액을 준비하는 단계; b) 세포 현탁액을 밀도 구배와 접촉시켜, 부력 밀도에 기초한 하나 이상의 세포 분취물을 분리시키고; c) b) 단계의 세포 현탁액을 원심분리시켜, 하나 이상의 세포 분취물들을 특징화시키고; 및 d) 풍부한 세포 집단을 포함하는 제 1 세포 분취물을 추출하는 단계를 포함하고, 여기서 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, EPO를 생산하는 세포의 비율은 더 크고, EPO를 생산하지 않는 세포의 비율은 더 작다. 한 가지 다른 구체예에서, 밀도 구배는 약 1.025 g/㎖ 내지 약 1.035 g/㎖ 사이, 또는 약 1.045 g/㎖ 미만의 상대 밀도를 가진 층을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 단계 d)의 제 1 세포 분취물은 원심분리후 약 1.025g/㎖ 내지 약 1.035 g/㎖ 사이의, 또는 약 1.045 g/㎖ 미만의 상대 밀도의 구배에 존재한다. 한 가지 다른 구체예에서, 원심분리 단계 (c)는 풍부한 EPO를 생산하는 세포 집단에 대해 농축안된 최소한 한 가지 추가 세포 분취물을 더 생성시킨다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 최소한 하나의 추가 세포 분취물을 추출하는 단계 e)를 추가로 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 밀도 구배는 약 1.062 g/㎖ 내지 약 1.088 g/㎖의 상대 밀도를 가진 층을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가 세포 분취물은 원심분리후 약 1.062 g/㎖ 내지 약 1.088 g/㎖의 상대 밀도의 구배에 존재한다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 a) EPO를 발현 또는 발현시킬 수 있는 최소한 일부 세포를 함유하는 배양된, 비풍부한 이질성 포유류 세포 집단으로부터 세포 현탁액을 준비하는 단계; b) 세포 현탁액을 밀도 구배에 접촉시켜 부력 밀도에 기초하여 하나 이상의 세포 분취물을 분리시키는 단계; c) 단계 b)의 세포 현탁액을 원심분리시켜 하나 이상의 세포 분취물을 특징화시키는 단계; 및 d) 풍부한 세포 집단을 함유하는 제 1 세포 분취물을 추출하는 단계를 포함하고, 여기서 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, EPO를 생산하는 세포의 비율은 더 크고, EPO를 생산하지 않는 세포의 비율은 더 적다. 한 구체예에서, 단계 a)의 세포 현탁액은 배양된, 비풍부한 이질성 설치류 세포 집단으로부터 수득된 것이다. 이와 같은 구체예에서, 밀도 구배는 약 1.073 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이의 상대 밀도를 가진 층을 포함한다. 한 구체예에서, 단계 d)의 제 1 세포 분취물은 원심분리후 약 1.073 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖의 상대 밀도의 구배에 존재한다. 한 가지 다른 구체예에서, 원심분리 단계 (c)는 풍부한 EPO를 생산하는 세포 집단에 대해 농축안된 최소한 하나의 추가 세포 분취물을 더 생성시킨다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 최소한 하나의 추가 세포 분취물을 추출하는 단계 e)를 추가로 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 밀도 구배는 약 1.041 g/㎖ 내지 약 1.062 g/㎖ 사이의 상대 밀도의 층을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가 세포 분취물은 원심분리후 약 1.041 g/㎖ 내지 약 1.062 g/㎖ 사이의 상대 밀도의 구배에 존재한다.
일부 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축되며, EPO를 생산하지 않는 세포는 고갈되어 있다. 다른 구체예들에서, 풍부한 세포 집단은 간질 섬유모세포에 대해 농축되며, 세뇨관 세포 및 집합 도관 세포는 고갈되어 있다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 원심분리 단계 (c)는 풍부한 세포 집단에 대해 농축안된 최소한 하나의 추가 세포 분취물을 추가로 만든다. 일부 구체예에서, 추가 세포 분취물은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, EPO를 생산하지 않는 세포의 비율은 더 크고, EPO를 생산하는 세포의 비율은 더 적다. 한 구체예에서, 최소한 하나의 추가 세포 분취물은 제 1 세포 분취물과 비교하였을 때, EPO를 생산하는 세포의 비율은 더 적다. 또 다른 구체예에서, 추가 세포 분취물은 제 1 세포 분취물과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 신장 세뇨관 세포를 포함한다.
일부 구체예에서, EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 세포 집단을 만드는 방법에 이용된 밀도 구배는 요오딕사놀 밀도 구배다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유세포분석(flow cytometry) 기술을 이용하여 에리트로포에틴 EPO를 생산하는 세포의 풍부한 집단을 만드는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 a) 기계적으로-해리된 또는 효소로 절단된 포유류 신장 조직으로부터 비풍부한, 이질성 신장 세포 집단을 함유하는 세포 현탁액을 제조하는 단계; b) 이 세포 집단에 있는 하나 이상의 개별 세포에서 전방 산란 및 측면 산란을 동시에 측정할 수 있는 유세포분석 장치에 세포 현탁액을 제공하는 단계; c) 이 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 선택하는 단계, d) 이 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 분류하는 단계, 및 e) 이 세포 집단으로부터 세포 하위집단을 분리시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포 하위집단은 전체 집단에 비교하여 낮은 전방 산란 및 낮은 측면 산란을 특징으로 한다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 EPO를 발현 또는 발현시킬 수 있는 최소한 일부 세포를 함유하는 배양된 포유류 세포 집단으로부터 세포 현탁액을 준비하는 단계; b) 이 세포 집단에 있는 하나 이상의 개별 세포에서 전방 산란 및 측면 산란을 동시에 측정할 수 있는 유세포분석 장치에 세포 현탁액을 제공하는 단계; c) 이 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 선택하는 단계, d) 이 세포 집단으로부터 세포 하위 집단을 분류하는 단계, 및 e) 이 세포 집단으로부터 세포 하위집단을 분리시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포 하위집단은 전체 집단에 비교하여 낮은 전방 산란 및 낮은 측면 산란을 특징으로 한다.
추가적인 또 다른 구체예에서, 전방 산란은 세포 크기에 해당된다. 한 구체예에서, 측면 산란은 세포 입도에 해단된다. 본 발명의 다른 구체예들은 i) EPO를 생산하는 세포에 대해 농축되고, EPO를 생산하지 않는 세포는 고갈된, 또는 ii) EPO를 생산하는 특화된 간질 피질 섬유모세포에 대해 농축되며 및 상피 세포는 고갈된 풍부한 세포 분취물을 제공한다. 한 가지 다른 구체예에서, 선택 단계 c)는 상기 세포 집단에 대해 농축안된 최소한 하나의 추가 분취물을 생성시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 추가 분취물 또는 분취물들은 EPO 풍부한 분취물과 비교하였을 때, EPO를 생산하는 세포의 비율을 더 적게 포함한다.
본 발명의 추가 측면에서, 이 방법은 시험관 배양의 추가 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 분리후 시험관 배양된다. 또 다른 구체예에서, 배양 단계는 포유류 세포 배양물에 적합한 유리 또는 플라스틱 표면에서 상기 세포 집단의 성장 및/또는 유지를 지원하는데 적합한 배지로 2차원적 단층 배양의 이용을 포함한다. 다른 구체예들에서, 배양 단계는 3차원적 비계상에서 세포의 성장 및/또는 유지에 적합한 배지로 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 비계(scaffolding)는 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비계는 포유류 세포의 트랩 또는 부착에 적합한 다공성 비계로 형성된다. 다른 구체예들에서, 비계는 포유류 세포의 임베딩, 부착 또는 피복에 적합한 겔로 형성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 관주 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 관주 조건은 액체의 흐름을 통하여 세포로 동력이 전달되도록 유체의 일시적, 간헐적 또는 연속적 순환 또는 교반을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 관주 배양 조건은 3차원적 구조의 형성을 허용하는 틀구조 및/또는 공간을 제공하는 물질내 또는 물질 위에서 세포 집단을 배양하여 실행된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 저산소 상태에서 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 저산소 배양 조건은 산소 수준이 감소되지 않은 상태에서 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 배양 시스템에서 세포 집단이 이용할 수 있는 산소 수준을 감소시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 가지 다른 구체예에서, 이용할 수 있는 산소 수준의 감소는 약 5% 미만이며, 의 산소 수준이 감소되지 않은 상태는 대기중 산소 수준 (약 21%)이다. 또 다른 구체예에서, 감소된 산소 상태는 산소 수준 21% 미만 (대기중)이다.
본 발명의 한 가지 추가 측면은 해당 세포 집단에서 EPO 발현을 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 모든 구체예에서, EPO 발현은 EPO mRNA 발현이다. 모든 구체예에서, EPO 발현은 탐지가능하며 및/또는 탐지된다. 또 다른 구체예에서, EPO 발현은 관주를 통하여 배양되지 않은 세포 집단과 비교하였을 때, 관주를 통하여 배양된 세포 집단에서 유도된다. 다른 구체예들에서, 저산소 상태가 아닌 조건에서 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 저산소 상태에서 배양된 세포 집단에서 EPO 발현이 유도된다. 또 다른 구체예에서, 관주를 통하여 배양되지 않은 세포 집단과 비교하였을 때, 관주를 통하여 배양된 세포 집단에서 EPO 발현이 더 크다. 추가 구체예에서, 저산소 상태가 아닌 조건에서 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 저산소 상태에서 배양된 세포 집단에서 탐지가능한 EPO 발현이 더 크다. 한 가지 다른 구체예에서, 약 5% 산소 미만의, 가령, 저산소 배양 조건에 있는 배양 세포에서 EPO 발현의 유도 및/또는 증가된 EPO 발현이 관찰될 수 있으며, 저산소 배양 조건이 아닌 대기중 산소 수준(약 21%)에서 배양된 세포의 발현 유도 및/또는 증가된 발현을 비교한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 하나 이상의 세포 집단을 함유하는 이식가능한 구조체를 제공한다. 한 구체예에서, 본 발명은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 세포 집단을 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하기 위한 이식가능한 구조체를 제공하는데, 여기서 구조체는 a) 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 비계; 및 b) 비계위 또는 표면에 배치된 EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 에리트로포에틴 EPO를 생산하는 세포 집단을 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하기 위한 이식가능한 구조체를 제공하고, 이때 구조체는 a) 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 다공성 비계; 및 b) i) EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단, 및 ii) EPO를 생산하지 않는 세포에 대해 풍부한 제 2 세포집단을 함유하는 세포의 혼합물을 포함하며, 이때 세포 혼합물은 비계의 포어내에 또는 표면에 침착된다. 일부 구체예에서, 제 2 세포 집단에 비교하여, 제 1 세포 집단에서 EPO 발현이 더 크다. 한 가지 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장으로부터 유도된 하나 이상의 세포 유형을 함유하는데, 이때 세포 유형은 세뇨관으로부터 유도된 세포, 사구체로부터 유도된 세포, 간질로부터 유도된 세포, 결합 조직으로부터 유도된 세포, 집합 도관으로부터 유도된 세포, 혈액으로부터 유도된 세포, 또는 혈관으로부터 유도된 세포을 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한다. 본 발명의 일부 구체예들은 메갈린, 쿠비린, N-캐드헤린, E-캐드헤린, 아쿠아포린-1, 및 아쿠아포린-2 중 하나 이상을 포함하는 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 하는 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한 집단을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 신장 세포의 혼합물은 여기에서 설명된 신장 조직 원천 유형으로부터 유도된 세포 집단을 포함할 수 있다. 다른 구체예들에서, 제 1 세포 집단과 제 2 세포 집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 포유류 세포를 함유하는 비풍부한 집단보다 더 큰 비율의 EPO를 생산하는 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포에 추가하여, 사구체 세포 및 도관 세포를 포함한다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 제 2 세포 집단 보다 EPO를 생산하는 세포를 더 큰 비율로 포함한다. 본 발명의 추가 구체예는 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 포유류 세포의 비풍부한 집단보다 신장 세뇨관 세포를 더 작은 비율로 함유하는 제 1 세포 집단을 포함한다. 다른 구체예들에서, 제 1 세포 집단은 제 2 세포 집단 보다 신장 세뇨관 세포를 더 작은 비율로 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 생체적합물질과 쌍을 이룬다. 한 구체예에서, 비계 또는 생체적합물질은 3차원적(3-D) 다공성 비계 형태로 되어 있다. 또 다른 구체예에서, 3-D 다공성 비계는 포유류 세포의 트랩 또는 부착에 적합하다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 비계 또는 생체적합물질은 포유류 세포의 임베딩, 부착 또는 피복에 적합한 액체 또는 반-액체 겔로 형성된다. 한 구체예에서, 본 발명의 구조체에 사용하기에 적합한 세포 집단은 자가 또는 비-자가 신장 시료로부터 유도된다. 한 가지 다른 구체예에서, 시료는 신장 생검이다.
한 가지 다른 측면에서, 본 발명은 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 세포를 필요로 하는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 환자의 에리트로포에틴 (EPO) 결핍을 치료하기 위한 것으로, 방법은 EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단을 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한다. 한 구체예에서, EPO 결핍은 빈혈증이다. 또 다른 구체예에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 피험자에서 신부전에 부차적으로 발생된다. 한 가지 다른 구체예에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염, 또는 다장기부전증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 부차적으로 발생된다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 신장 질환을 요하는 피험자에서 이 질환을 치료하기 위한 것으로, EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한다.
일부 구체예에서, 피험자로 투여되는 조성물은 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축안된 제 2 신장 세포 집단을 추가로 포함한다. 다른 구체예들에서, 조성물은 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 및/또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 다공성 비계를 추가로 포함하며, 여기서 제 1 세포 집단은 비계의 표면 또는 포어내에 침착된다. 추가 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 및/또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 다공성 비계를 추가로 포함하며, 여기서 제 1 세포 집단 및 제 2 세포 집단은 비계의 표면 또는 포어내에 침착된다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단 및/또는 제 2 세포 집단은 포유류 신장 조직 또는 배양된 포유류 신장 세포로부터 유도된다. 다른 구체예들에서, 제 1 세포 집단 및/또는 제 2 세포 집단은 자가 또는 비-자가 신장 시료로부터 유도된다. 한 구체예에서, 시료는 신장 생검이다.
한 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 신장 세뇨관 세포는 메갈린, 쿠비린, N-캐드헤린, E-캐드헤린, 아쿠아포린-1, 및 아쿠아포린-2을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 한다.
모든 구체예에서, 제 2 세포 집단은 세뇨관으로부터 유도된 세포, 사구체로부터 유도된 세포, 간질로부터 유도된 세포, 집합 도관으로부터 유도된 세포, 결합 조직으로부터 유도된 세포, 혈액으로부터 유도된 세포, 또는 혈관으로부터 유도된 세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 신장으로부터 유도된 세포 유형을 포함한다. 모든 구체예에서, 제 2 세포 집단은 이질성 비-분취된 집단 또는 제 1 세포 집단과 비교하였을 때, 사구체 세포, 도관 세포, 및 산소-반응성 EPO를 생산하는 세포가 상대적으로 고갈되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적혈구 항상성을 필요로 하는 피험자에게 적혈구 항상성을 제공하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 이 방법은 a) EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 b) 피험자의 시험 시료에서 적혈구생성 기능 지표의 수준이 대조군의 지표 수준에 비해 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 지표 수준의 차이는 피험자에서 적혈구 항상성을 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 a) EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단과 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축안된 제 2 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 b) 피험자의 시험 시료에서 적혈구생성 기능 지표의 수준이 대조군의 지표 수준에 비해 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 지표 수준의 차이는 피험자에서 적혈구 항상성을 나타낸다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 기능 개선을 요하는 피험자에서 신장 기능을 개선시키는 방법을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 이 방법은 a) EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 b) 피험자의 시험 시료에서 신장 기능 지표의 수준이 대조군의 지표 수준에 비해 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 지표 수준의 차이는 피험자에서 신장 기능 개선을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 및/또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 다공성 비계를 추가로 포함하며, 여기서 제 1 세포 집단은 비계의 표면 및/또는 포어에 침착된다.
또 다른 구체예에서, 이 방법은 a) EPO를 생산하는 포유류 세포에 대해 풍부한 제 1 세포 집단과 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축안된 제 2 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 b) 피험자의 시험 시료에서 신장 기능 지표의 수준이 대조군의 지표 수준에 비해 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 지표 수준의 차이는 피험자에서 신장 기능 개선을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 생체적합성 합성 폴리머 및/또는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 펩티드를 함유하는 다공성 비계를 추가로 포함하며, 여기서 제 1 세포 집단 및 제 2 세포 집단은 비계의 표면 및/또는 포어에 침착된다.
다른 구체예들에서, 제 1 세포 집단 및/또는 제 2 세포 집단은 포유류 신장 조직 또는 배양된 포유류 신장 세포로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단 및/또는 제 2 세포 집단은 자가 또는 비-자가 신장 시료로부터 유도된다. 한 가지 다른 구체예에서, 시료는 신장 생검이다.
한 구체예에서, 제 1 세포 집단은 저산소-반응성 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 저산소-반응성 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한다.
한 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 신장 세뇨관 세포는 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), CYP2D25 (비타민 D3 25-수산화효소), 메갈린, 쿠비린, N-캐드헤린, E-캐드헤린, 아쿠아포린-1, 아쿠아포린-2 및 아쿠아포린-4을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 한다. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 농축되며, 집합 도관의 상피 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 세뇨관 세포에 대해 상대적으로 농축되며, 집합 도관 상피 세포를 포함하고, 저산소-반응성 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포는 상대적으로 고갈되어 있다.
도 1은 정상적인 신장 조직과 비교하였을 때 질병이 있는 신장 조직에서 섬유증을 돋보이게 나타내는 Gomori의 Trichrome 착색을 보여준다.
도 2는 만성 신장 질환을 가진 돼지의 세포에서 산소에 의해 조절된 에리트로포에틴 유전자의 발현을 설명한다.
도 3은 번식된 배양물에서 세관 유사 구조를 묘사한다.
도 4는 배양된 기능을 하는 세뇨관 세포에 의한 수용체 매개된 알부민의 흡수를 묘사한다.
도 5는 초기 인간 신장 조직 보다 분리된 후에 EPO 발현이 상대적으로 더 크다는 것을 보여준다.
도 6은 인간 신장으로부터 배양된 세포에서 EPO 유전자 발현 보류를 설명한다.
도 7은 대기중 산소 수준 (21%)에서 3D에서 동적 배양된 (+) EPO 발현 결과를 나타낸다.
도 8은 낮은 산소 수준 (2%)에서 3D에서 동적 배양된(+) EPO 발현을 나타낸다.
도 9는 장기화된 배양물에서 동적 배양된 (+) 세뇨관 유전자 발현을 나타낸다.
도 10은 정상 산소 농도 배양에 대한 저산소 배양에서 EPO 발현을 나타낸다.
도 11은 시험관에서 동적 3D 배양에 의한 EPO 발현의 자극을 나타낸다.
도 12는 2D 및 3D 배양물에서 수거한 세포 용해물 (상부 패널)과 조건화 배지 (하부 패널)에서 정량화된 표적 단백질의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 13은 H&E 착색되고, 접종된 OPLA 및 Col1 비계 정치(static) 또는 관주 배양 7일 후 착색된)를 나타내고, 이들 비계는 표준 기술을 이용하여 10% 완충된 포르말린에 고정되고, 파라핀-임베드되었다. 세포 존재 및 형태 검사를 위해 H&E 착색이 실행되었다. 정치 비계에 비교하여 관주된 비계에서 세포질(cellularity)이 더 크고, 특히 OPLA 비계와 비교하였을 때, Col1 비계에서 두드러졌다. 정치 Col1 비계와 비교하였을 때, 관주된 Col1 비계에 존재하는 세포 조직이 더 현저하였다.
도 14는 배양(정치 및 관주) 7일 후, OPLA 및 Col1 비계의 SEM을 나타낸다. 정치 배양에 비하여 관주된 배양에서 더 큰 세포질을 나타내고, 정치 배양에 비교하여 Col1 관주 배양에서 우수한 세포 조직 및 연결망을 볼 수 있다.
도 15는 용해 완충액 (Qiagen)의 첨가에 의해 비계 또는 2D 배양물로부터 분리된 mRNA의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 3D 비계의 경우, 전기적 균질화(폴리트론)를 이용하여 완전한 용해 및 RNA를 유리시켰다. 정제된 mRNA는 관심의 표적 유전자에 특이적인 인트론-연결된(spanning) 프라미어로 RT-PCR을 받는다. (라인 1-7: 다양한 3D 형태(관주된)/5 일 배양; 라인 8-10: 다양한 2D 형태/5 일 배양; 라인 11-17: 다양한 초기 세포 집단 (접종 전); 라인 18-19: 2D 배양/4 일 배양; 라인 21: 거대 절단된 새로운 조직).
도 16은 세 가지 상이하게 접종된 비계에서 대사 활성을 나타낸다.
도 17은 1차 신장 세포의 관주된 및 정치 3D 배양물에 의한 포도당 및 글루타민의 소비를 나타낸다.
도 18은 치료 이후 설치류의 평균 생존 일수를 나타낸다.
도 19는 연구동안 설치류 체중을 나타낸다.
도 20은 치료 전부터 죽임을 당했을 때까지 체중 증가를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 매주 평균 혈청 BUN 농도를 나타낸다.
도 22는 매주 평균 혈청 크레아티닌 농도를 나타낸다.
도 23은 중간점/개별 랫트 데이터에서 상대적인 BUN을 나타낸다.
도 24는 중간점/개별 랫트 데이터에서 상대적인 혈청 크레아티닌을 나타낸다. (도면에는 크레아티닌이 아닌 BUN을 나타내고 있음-오류)
도 25는 중간점(개별 랫트 데이터)에서 매주 평균 HCT 상대적 HCT를 보여준다.
도 26a는 중간점(개별 랫트 데이터)에서 상대적인 HCT를 나타낸다.
도 26b는 신적출후 혈청 크레아티닌 (A) 및 헤마토크릿 (B)을 나타낸다.
위의 (B)는 26c를 나타내는 것으로 보임
도 27은 매주 평균 RBC#을 나타낸다.
도 28은 중간점/개별 랫트 데이터에서 상대적인 RBC#를 나타낸다.
도 29는 말기 혈청 전해물 농도를 나타낸다.
도 30은 개별 랫트 데이터에서 상대적인 혈청 인(최종)을 나타낸다.
도 31은 말기 혈청 단백질 농도를 나타낸다.
도 32는 개별 랫트 데이터에서 상대적인 혈청 알부민 및 전체 단백질 (최종)을 나타낸다.
도 33은 말기 혈청 간 기능을 나타낸다.
도 34는 말기 혈청 콜레스테롤, 트리글리세리드, 및 포도당을 나타낸다.
도 35는 개별 랫트 데이터에서 상대적인 혈청 콜레스테롤, 트리글리세리드, 포도당 (최종)을 나타낸다.
도 36은 말기 Hb, MCH, 및 MCHC를 나타낸다.
도 37은 개별 랫트 데이터에서 말기 상대적인 [Hb]를 나타낸다.
도 38은 말기 WBC 카운트를 나타낸다.
도 39은 말기 WBC 조성물을 나타낸다.
도 40은 말기 망상 적혈구를 나타낸다.
도 41은 말기 혈소판 데이터를 나타낸다.
도 42는 수영 시험 결과를 보여준다.
도 43은 각 시험군의 골수의 대표적인 H&E-착색된 조직학적 절단면을 나타낸다. 상부 패널은 대조군과 비교하였을 때, NX + 세포 주입 골수 세포질과 적혈구에 대한 골수의 비율이 동등한 것을 보여준다. 대조적으로, NX + 구조체 및 치료안된 동물의 골수는 차례로 중간 정도의 및 두드러진 골수 세포질을 보여주었다(확대 200x). 하부 패널은 상부 패널에서 상자 안을 고해상도로 나타낸 것이다(확대 배수 알려지지 않음).
도 44는 각 시험군으로부터 비장의 대표적인 H&E-착색된 조직학적 절단면을 나타낸다. 상부 패널은 대조군 및 NX + 세포 주입군 사이에 주요한 조직학적 차이 또는 변화가 관찰되지 않음을 보여준다. 대조적으로, NX + 구조체 및 치료안된 동물에서 캡슐아래 붉은 펄프 공간에서는 성숙 적혈구세포 (RBC) 및 RBC 전구물질에서 차례로 중간정도의 및 두드러진 감소가 나타났다(확대 200x). 하부 패널은 상부 패널에서 상자안을 고해상도로 나타낸 것이다(확대 배수 알려지지 않음).
도 45는 각 시험군의 간의 대표적인 H&E-착색된 조직학적 절단면을 나타낸다. 대조군과 비교하였을 때, NX + 구조체 또는 치료안된 NX 동물의 간문맥 또는 간 실질조직에서는 인지할 수준의 변화가 관찰되지 않았다. 대조적으로, NX + 세포 주입 군에서 유동 조혈(원)의 초점 부위가 주목되었다(확대 200x). 하부 패널은 상부 패널에서 상자안을 고해상도로 나타낸 것이다(확대 배수 알려지지 않음).
도 46은 각 시험군의 신장의 대표적인 H&E-착색된 조직학적 절단면을 나타낸다(확대 1x). 상부 패널은 대조군과 비교하였을 때, 다른 세 집단의 신장 절단면은 모든 집단에서 헤모시드린 색소가 적은 것을 특징으로 하는 구조 상실과 함께 진행성 사구체 및 세뇨관 퇴행과 다초점(multifocal) 세뇨관 재생 (확대 200x)을 보여준다. 구조체 치료 부위는 화살표로 표시함. 하부 패널은 상부 패널에서 상자안을 고해상도로 나타낸 것이다(확대 배수 알려지지 않음).
도 47은 개별 랫트 데이터에서/ HCT% vs. 혈청 크레아티닌을 나타낸다. 제5군 = ●; 제6군 = "3"을 에워쌈; 제4군 = "1"을 에워쌈; 제1군 = "4"를 에워쌈; 제2군 = "2"를 에워쌈. 도면과 일치되는 것 같지 않음..
도 48는 다층 계단 구배 기술(좌측 패널) 또는 단일 층 혼합 구배 기술을 이용하여 새로 해리된 신장 조직의 EPO를 생산하는 세포 분취물 농축을 보여준다. 이 두 방법 모두 1.025 g/㎖ 내지 1.035 g/㎖ 사이에 나타난 epo 밴드로부터 EPO를 생산하지 않는 세포 성분들(주로 세뇨관 세포)의 부분적 고갈을 초래하였다.
도 49a는 E-캐드헤린 발현을 확인하는 정량적 실시간 PCR (QRTPCR) 결과를 보여준다.
도 49b는 밀도 층 구배를 이용하여 Epo 농축을 확인하는 정량적 실시간 PCR (QRTPCR) 결과를 보여준다. .
도 50은 분리 시점에서 및 배양물에서 층 구배 분석의 상대적 유전자 발현을 그래프로 나타낸다. 패널(a) 및 (b)는 조직 해리 직후 밀도 구배 분취를 당한 1차 신장 세포의 두 가지 별개 배취를 나타낸다. 두 배취 모두에서 에리트로포에틴 (Epo) mRNA 발현은 층 구배의 밴드 1에서 반복적으로 풍부한다. 모든 시료에서 Epo의 발현은 새로 치료된 이질성 신장 세포 집단에 대해 표준화되었다. 패널 (c)는 epo 발현에 대해 풍부한 것에 추가하여, 밴드 1은 세뇨관 표식, N-캐드헤린, E-캐드헤린, 아쿠아포린 1 및 2의 낮은 발현으로 설명되는 바와 같이, 세뇨관 세포가 상대적으로 고갈되어 있다는 것을 분명하게 보여준다. 대조적으로, 세뇨관 표식은 밴드 2와 3에 농축되었는데, 세뇨관 세포 분취물의 층-구배 수반된 농축의 추가 특징을 강조한다.
도 51은 아쿠아포린-1, 세뇨관 세포 표식의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 도 2, 패널(d)에서 설명된 바와 같이, 분취물 2 및 3의 세뇨관 세포 농축의 추가 증거에서, 이 웨스턴 블롯은 밴드 2와 3에서 아쿠아포린 1 단백질의 명백하고 특이적인 농축을 보여준다. 도 2에는 패널(d)가 없음
도 52는 치료후 16주 시점에서 헤마토크릿 수준을 나타낸다.
도 53은 치료후 16주 시점에서 헤모글로빈 수준을 나타낸다.
도 54는 5/6 신장적출된 랫트를 두 가지 상이한 투여량의 rEPO로 치료하고, 대조군과 미치료군과 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 헤마토크릿 수준을 보여준다.
도 55는 5/6 신장적출된 랫트를 고투여량 및 저투여량의 EPO 풍부한 세포로 치료한 후, 세뇨관 풍부한 세포와 rEPO를 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 헤마토크릿 수준을 보여준다.
도 56a 및 56b는 치료 16주 시점에서 혈청 크레아티닌 농도와 치료 전부터 치료후 16주까지 크레아티닌 조절 비율을 보여준다.
도 57은 치료후 12주 시점에 수영 지구력 결과를 보여준다.
도 58은 치료후 16주 시점에서 초기 체중의 비율로 체중 증가를 나타낸다.
도 59는 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 건강한 대조군에 대한 비율로 혈청 크레아티닌을 나타낸다.
도 60은 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 알부민/글로불린 비율을 나타낸다.
도 61은 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 인: 칼슘 비율을 나타낸다.
도 62는 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 치료후 12주 시점에서 혈청 트리글리세리드 수준을 나타낸다.
도 63은 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 혈청 콜레스테롤 수준을 나타낸다.
도 64는 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 혈청 헤모글로빈 수준을 나타낸다.
도 65는 치료후 12주 시점에서 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 고투여량의 EPO 풍부한 세포 (프로토타입 #2) 또는 세뇨관 풍부한 세포 (프로토타입 #4)로 치료된 요독증 랫트에서 헤마토크릿 수준을 나타낸다.
도면에는 14주 시점으로 표시되어 있음
도 66은 설치류의 기능을 하는 신장 세뇨관 세포에 의한 로다민-콘쥬게이트된 알부민의 흡수를 나타낸다.
도 67은 치료받지 않은 요독증 랫트와 비교하였을 때, 신생-신장 세포(이질성 EPO를 생산하는 세포)으로 치료를 받은 요독증 랫트에서 신장 기능 지표인 혈청 크레아티닌이 정상적인 수준에 더 근접하게 유지된다는 것을 보여준다.
도 68은 정상적인 인간 신장으로부터 분리되고, 증식된 세뇨관 및 사구체 세포의 표현형 속성 유지를 설명한다.
도 69는 3D 동적 배양에서 배양된 세뇨관 고갈된 배양과 비교하였을 때, 세뇨관 풍부한 집단에서 세뇨관 표식, 캐드헤린의 증가된 발현을 나타낸다.
도 70은 유세포분석을 통하여 EPO를 생산하는 세포의 분리를 보여준다.
도 71은 별도로 수거하고 및 동일한 층 구배를 나란하게 배열한"정상 산소"(21% 산소) 및 "저산소"(2% 산소) 설치류 배양물의 층 구배를 보여준다.
도 72는 별도로 수거하고 및 동일한 층 구배를 나란하게 배열한"정상 산소"(21% 산소) 및 "저산소"(2% 산소) 개과 동물 배양물의 층 구배를 보여준다.
도 73은 B4에서 유전자 발현에 저산소 배양 결과를 나타낸다.
도 74는 B2 및 B4 하위분취물의 조성 분석 결과를 나타낸다. 정량적 실시간 PCR (qRTPCR)를 이용하여 B2 및 B4 하위분취물에서 신장 세포-타입 특이적 유전자의 발현을 평가하였다. (a, b) 하위분취물 B2는 B4 및 다른 모든 하위분취물과 비교하였을 때, 비타민 D 수산화효소 (CYP2R1) 및 쿠비린의 상대적 발현에 근거하여 전단 세뇨관 세포에 대해 농축되었다. (c) B4와 비교하여, 하위분취물 B2에서 말단 세뇨관 표식, E-캐드헤린 또한 농축되었다. (e,f) 사구체 표식, 네프린 및 포도신은 하위분취물 B4에서 농축되었고, 도관 표식, kdr (d)에 대해 농축되었다. (g, h) 산소-조절된 간질 표식, Hif2α 및 Epo는 또한 B4에서 농축되었다. (i) 결과는 B2 및 B4에 대해 정량적으로 나타낸다. (j) B2에 의한 전단(N-캐드헤린/녹색) 및 말단(E-캐드헤린/적색) 세뇨관 표식의 강력한 발현은 하위분취후(j) 배양된 세포에서 면역세포화학을 통하여 확인되었다. 대조적으로, E-캐드헤린- 또는 N-캐드헤린-양성 세포는 B4 배양물에서 흔하지 않았다.
도 75는 B2 및 B4 하위분취물의 기능적 속성을 나타낸다. (a) B2 및 B4 세포는 계대배양되었고, 쿠비린 발현 및 수용체 매개된 알부민 흡수에 대해 평가되었다. 패널들은 다음을 나타낸다: i. 쿠비린에 대한 이소타입-일치된 IgG 대조군 항체로 착색된 세포; ii. 경쟁적 억제제, RAP로 사전 치료되고, 15분간 로다민-콘쥬게이트된 인간 혈청 알부민 (HSA-로다민)(10 ㎍/㎖)으로 펄스된 B2 세포; iii. 15분간 HSA-로다민(10 ㎍/㎖)(적색)로 펄스되고, 항-쿠비린 항체 (녹색)로 라벨된 B2 세포; iv. HSA-로다민 (적색) 흡수를 하는 쿠비린+ 세포의 공동-국소화를 보여주는 (iii)의 적층화된 영상; v. (iii/iv)와 동일하지만, B4 세포를 나타내며, 쿠비린+ 세포 (녹색)은 매우 적고, 알부민 흡수 (적색)는 거의 없거나 없는 것을 보여준다. 모든 조건에서, 핵은 Hoechst (블루)로 대비착색되었다. (b) 대기중 산소(21%) 또는 저산소(2%) 분압(tension)(모두 37℃)에 24시간 노출된 각 분취물(B1-B4)에서 Epo의 발현이 검사되었다. 산소 분압의 감소에 반응하여 Epo를 상향 조절할 수 있는 EPO를 생산하는 세포의 상대적인 비율은 하위분취물 B4에서 최대였다. B2 및 B4의 Epo의 상대적 발현은 도 1(i)에서 설명된 결과와 일치한다.
도 1에는 (i)가 없음-오류
도 76은 요독증/빈혈 랫트에서 생존, 체중 및 심장 중량에 있어서 B2 및 B4의 생체내 이식의 결과을 보여준다. (a) 연구 기간 동안(신장적출후 30주, 치료후 6개월) 각 대조군 및 치료군에 생존률을 제시한다. 치료군 중에서, B2-치료를 받은 랫트만 건강한 대조군과 동등하게 100% 생존하였다. (b) 각 개별 랫트에서 시간에 따른 체중 변화 %를 나타내었다: ((죽임을 당할 때 체중)-(연구 시작시 체중))/(연구 시작시 체중). B2로 치료된 동물의 체중이 14.3% 증가되었다는 것은 Nx 대조군 동물의 체중 5% 감소와 비교하였을 때, 상당히 유의적인 것으로 간주된다(P 값<0.0001). B4 (P 값 = 0.0239) 및 운반체(P 값 = 0.0125) 또한 Nx 동물보다는 상당한 체중 증가를 보였다. (c) 부검시에 상대적인 심장의 중량을 신체 중량의 %로 계산하였다. 치료를 받지 않은 Nx 랫트는 부검시 심장이 상당히 확대되었다(건강한 대조군의 150%). B2는 Nx 동물과 비교하였을 때(P 값 < 0.0001), 치료후 6개월에 상대적인 심장 중량이 단지 25%만 증가됨을 보여주었다(도 3c). 도 3c는 없음 B4 (P 값 = 0.0002) 및 운반체 (P 값 < 0.0001) 또한 Nx 대조군보다는 통계학적으로 유의적이었다.
도 77은 여과 및 적혈구생성에 대한 치료의 결과를 일시적 및 통계학적으로 평가한 것을 나타낸다. JMP version 7.0 (SAS Institute Inc (Cary, NC))을 이용하여 10 내지 20주의 모든 데이터의 혈청 화학 결과에 Variance 일원 분석(ANOVA)을 실시하였다. (a,b,c) 적혈구생성에서 유의적인 차이는 치료군에서 관찰되었는데(HCT, p = 0.0005; RBC, p= 0.0029), B2- 및 B4-치료된 랫트는 치료를 받지 않은 랫트 Nx, UNFX-치료된, 및 rEPO-치료된 랫트에 비교하여 최대 개선을 보였다. (d,e,f) 여과 기능에서 유의적인 차이는 치료군에서 관찰되었는데(sCREAT, p<0.0001); BUN, p<0.0001), B2 치료 효과가 가장 유의적이었으며, 그 다음이 B4 치료다.
도 78은 연구 중간(12-14주)의 임상적 평가 결과를 보여준다. 임상적 화학 및 건강한 대조군과 Nx, 또는 Nx 와 비교하여 B2-, B4-, 또는 UNFX-치료된 군 사이에 차이를 돋보여주는, 패널 (a)에 나타낸 매개변수를 측정하기 위하여 채혈하였다. B2 치료에 독특한 두 가지 중요한 결과는 (b) Nx에 비교하여 (p < 0.001) B2 에서 혈청 알부민 (sALB)과 알부민/글로불린 (A/G) 비율의 증가로 설명되는 바와 같이, 단백질 체류가 강화된 것과, 및 (c) Nx 에 비교하여 (p < 0.001) B2에서 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤의 감소였다.
도 79는 신장 종괴가 신장 기능과 상관있다는 것을 보여준다. (우측) 신장의 중량은 부검시에 측정되었다. (a) B2-치료된 신장에서 한 쪽 신장중량(renal mass)은 건강한 대조군에 동등하였다. 부검시에 수거된 혈청에서 sCREAT의 검사에서 신장 종괴와 sCREAT 사이에 명백한 반비례가 나타났다 (패널 a, 제2 축). (b) 연구의 모든 랫트에서 신장 종괴와 선형 회귀 분석에서 sCREAT 신장 종괴와 신장 기능 사이에 명백한 역비례가 확인되었다(r2 = .38; p 값 < 0.001).
도 80은 SRY에 대한 프로브로 PCR-기반 DNA 분석을 나타낸다.
도 81은 신장 및 골수의 조직병리학적 분석을 나타낸다. (a) 허위 대조군 및 남아있는 신장 (트리크롬 및 PAS 착색)의 대표적인 광현미경 사진. 허위 (대조군) 신장은 잘 구별되는 피질-수질 접합 및 세뇨관 또는 사구체 손상이 없는 것을 특징으로 하는 정상적인 실질(유조직) 구조를 가진다. Nx 치료를 받지 않은 동물은 중간 내지 두드러진 세뇨관-간질 섬유화 및 사구체 경화 (Masson의 트리크롬에 의한 블루 착색), 루미날 원주(luminal cast)를 가진 세뇨관 비대(PAS에 의한 호산구 착색), 및 감소된 골수 세포질(적혈구에 대한 골수 비율)로 구성된 진행성 사구체 및 세뇨관 퇴행을 보였다. Nx 동물과는 대조적으로, B2로 치료된 랫트는 건강한 대조군에 동등한 골수-적혈구 비율을 가진 거의 정상에 가까운 골수 세포질을 특징으로 하는 치료 효과에 대한 증거를 보였다. (b) H&E 착색된 골수는 치료를 받지 않은 Nx 랫트에서 두드러진 파골세포 및 골 부식과 소와 (lacunae) 골수 형성과 함께, 골 재흡수에 대한 충분한 증거를 보여준다. 건강한 대조군과 유사하게, B2로 치료된 랫트의 골내(endosteal) 표면은 매끄럽고, 파골세포, 소와 또는 골 부식의 증가를 보이지 않았다. (c) 말단 혈청 인(㎎/dl), 및 칼슘 (㎎/dl, 전체 단백질 [Ca] - 0.4[TP] + 3.3에 대해 보정됨)은 모델에서 골 재흡수의 조직학적 관찰 및 B2 치료에서 재흡수 개선에 대한 조직적 뒷받침을 제공한다.
도 82a는 치료후 12주 동안의 생존을 나타낸다.
도 82b는 치료후 25주 동안의 생존을 나타낸다.
도 83a는 초기 체중부터 죽임을 당할 때까지의 전체 체중을 나타낸다.
도 83b는 전달계의 세포 집단으로 치료를 받은 설치류에서 초기 체중부터 죽임을 당할 때 까지의 전체 체중의 변화율을 나타낸다.
도 84는 모든 치료군에서 12주간 혈청 크레아티닌 수준을 나타낸다.
도 85는 B2 및 B4 치료군과 NX, 건강한 대조군, 및 허위 Nx에 대하여 12주간 혈청 크레아티닌 수준을 나타낸다.
도 86은 모든 시간대에 혈청 크레아티닌에 대한 ANOVE 일원 분석을 나타낸다.
도 87은 혈액 요소(urea) 질소 (BUN) 수준을 나타낸다.
도 88은 모든 치료군에서 12주에 걸쳐 HCT 비율을 나타낸다.
도 89는 NX, 건강한 대조군, 및 허위 Nx와 함께 B2 및 B4 치료군에 대하여 12주에 걸쳐 HCT 비율을 나타낸다.
도 90은 모든 시간대에 HCT 비율에 대한 ANOVE 일원 분석을 나타낸다.
도 91은 전체 체중에 대해 심장 중량의 비율을 나타낸다.
도 92는 연구 종료 시점에서 전체 혈청 단백질 수준을 나타낸다.
도 93은 3개월 시점에서 조직학적 평가를 보여준다.
도 94는 치료 12주에서 생존 데이터를 보여준다.
도 95는 치료 전부터 치료후 12주 동안 체중의 변화율을 나타낸다.
도 96는 12주 시점에 혈청 크레아티닌 수준을 나타낸다.
도 97은 12주 시점에 혈청 BUN 수준을 나타낸다.
도 98은 건강한 대조군에 비교하여 발현된 뇨 단백질 수준을 나타낸다.
도 99는 치료 후 6주 시점에서 혈청 A/G 비율을 나타낸다.
도 100은 12주 시점에서 HCT 비율을 나타낸다.
도 101은 12주 시점에서 RBC 수를 나타낸다.
도 102는 치료후 6주 및 12주 시점에서 전신성 혈압을 나타낸다.
도 103은 3-5개월 시점에서 조직학적 평가를 나타낸다.
도 104는 혈청 크레아티닌 수준에서 활동 프로토타입 효과를 보여준다.
도 105는 혈청 크레아티닌 수준에서 비-활동 프로토타입 효과를 보여준다.
도 106은 혈청 크레아티닌 수준에서 B3 및 B2/B4의 효과를 나타낸다.
도 107은 뇨 단백질 수준에서 B2, B2/B4 및 B2/B3의 효과를 나타낸다.
도 108은 혈압에서 B2/B4, B2/B3 및 B3/B4의 효과를 나타낸다.
도 109는 기저수준과 연구 종료시점에서의 크레아티닌 수준 차이를 보여준다.
도 110은 기저수준과 연구 종료시점에서의 BUN 수준 차이를 보여준다.
도 111은 기저수준과 연구 종료시점에서의 ALB 수준 차이를 보여준다.
도 112는 기저수준과 연구 종료시점에서의 TPRO 수준 차이를 보여준다.
도 113은 기저수준과 연구 종료시점에서의 PHOS 수준 차이를 보여준다.
도 114는 기저수준과 연구 종료시점에서의 전체 단백질에 대해 보정된 칼슘차이를 보여준다.
도 115는 갯과 동물(canine)의 신장 세포 성장을 나타낸다.
도 116은 돼지의 신장 세포 성장을 나타낸다.
도 117은 인간의 신장 세포 성장을 나타낸다.
도 118은 인간 생검으로부터 세포 확장 결과를 나타낸다.
도 119는 세포에서 면역세포화학 결과를 나타낸다.
도 120은 랫트 배양물에 포함된 EPO를 발현시키는 세포는 전단 및 말단 세뇨관 세포와는 별개라는 것을 설명하는 유세포분석 결과를 보여준다(도 120 a, b). 배양물에서 쿠비린-양성 전단 세뇨관 세포의 기능은 형광-콘쥬게이트된 알부민의 흡수를 통하여 평가되었고, 경쟁적 억제제, RAP를 추가함으로써 흡수의 특이성이 확인되었다(도 120 c-f).
도 121은 여과 기능을 월 단위로 모니터한 것을 나타낸다((a)에서 sCREAT을 나타내고; (b)에서는 HCT를 나타내고; (c)에는 비교되는 임상 화학 결과를 나타낸다).
도 122는 신장 및 골수 모두에서 조직-수준 결과를 확인하기 위하여 실시된 조직학적 분석을 설명한다.
도 123은 돼지와 인간의 비-CDK 신장 견본의 조직학적 특징과 대조되는 CKD 견본의 조직병리학적 특징을 보여준다.
도 124는 (a) CKD- 및 비-CKD으로부터 유도된 배양물 사이에 확장 능력을 보여준다; (b-d) 세뇨관 세포 기능은 확립된 배양에서 쿠비린 양성 세포 일부분에서 알부민의 수용체 매개된 흡수의 관찰에 의해 확인되었다.
도 125 (a)는 비-CKD 조직 견본에 비해 CKD 견본에서 EPO mRNA 발현을 나타내고; (b) 이들 시료의 등전점 포커싱 및 웨스턴 블롯 분석으로 유전자 발현 패턴이 단백질 수준에서 반복되었다는 것이 확인되었고; (c) CKD 및 비-CKD 신장 견본으로부터 확립된 EPO를 발현시키는 세포 배양물은 저산소 자극 24시간 이내에 유전자 전사를 다양한 수준으로 상향 조절하여 반응하였다.
도 126은 성인기 설치류 층 구배의 세포 밴드를 나타낸다.
도 127은 성인기 설치류 세포 준비물에서 에리트로포에틴, 네프린, 포도신, 쿠비린, 및 Cyp의 유전자 발현을 나타낸다.
도 128은 질환이 있는 성인기 설치류 신장으로부터 분리된 세포 준비물 (5X)을 나타낸다.
도 129는 말기 신부전이 있는 성인기 설치류로부터 분리된 B4-특이적 유전자의 발현을 보여준다.
도 130은 청년기 및 성인기 B2 세포 준비물의 크레아티닌 값의 직접적 비교를 나타낸다.
도 131은 청년기 및 성인기 B2 세포 준비물의 혈청 BUN 값의 직접적 비교를 나타낸다.
도 132는 B2 및 B4 세포 준비물에서 HAS-2 발현을 보여준다.
도 133은 HAS mRNA (qRTPCR, 아래 그래프) 및 단백질 (위 도면, 웨스턴 블롯)의 생체 발현을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 세뇨관 및 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 신장 세포를 포함하는 분리된 신장 세포 및 이를 분리하고 배양하는 방법, 및 풍부한 세뇨관 및 EPO를 생산하는 세포 집단을 포함하는 생체 활성 신장 세포를 이용하여 치료를 요하는 피험자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
정의
다른 정의가 없는 한, 여기에서 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. Principles of Tissue Engineering , 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007 은 본 발명에 이용되는 많은 용어들에 대해 전반적인 지침을 당업자에게 제공한다. 당업자는 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있는 여기에서 설명된 것과 유사한 또는 등가의 많은 방법 및 물질들을 인지할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 여기에서 설명된 방법 및 재료에 어떠한 방식으로든 한정되지 않는다.
여기에서 사용된 용어 "세포 집단"은 적절한 조직 원천, 통상 인간으로부터 바로 분리시켜 수득된 다수의 세포를 말한다. 분리된 세포 집단은 후속적으로 시험관에서 배양될 수 있다. 당업자는 본 발명에서 이용될 수 있는 세포 집단을 분리시키고, 배양시키는 다양한 방법과, 본 발명에서 이용하기에 적합한 다양한 여러 세포를 인지할 것이다. 세포 집단은 신장으로부터 유도된 비-분취된, 이질성 세포 집단이 될 수 있다. 예를 들면, 이질성 세포 집단은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 분리된 것일 수 있다. 대안으로, 이질성 세포 집단은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유류 세포의 시험관 배양으로부터 유도될 수 있다. 비-분취된 이질성 세포 집단을 또한 비풍부한 세포 집단이라고 할 수도 있다.
여기에서 사용된 용어 "혼합물"은 비-분취된, 이질성 세포 집단으로부터 유도된 두 개 이상의 분리, 풍부한 세포 집단의 조합을 말한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명의 이 세포 집단은 신장 세포 집단이다.
"풍부한(enriched)" 세포 집단 또는 준비물은 초기 신장 세포 집단 (가령, 비-분취된, 이질성 세포 집단)으로부터 유도된 세포 집단이며, 특정 세포 유형이 초기 집단에 있는 비율보다 더 큰 비율로 존재하는 것을 말한다. 예를 들면, 초기 신장 세포 집단은 관심 대상의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 등의 세포 집단에 대해 농축될 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "세포 집단", "세포 준비물" 및 "세포 프로토타입(Prototype)"은 호환된다.
한 측면에서, 여기에서 사용된 용어 "풍부한" 세포 집단은 초기 신장 세포 집단으로부터 유도된 세포 집단(가령, 신장 생검 또는 배양된 포유류 신장 세포의 세포 현탁액)이며, 초기 집단에서 EPO를 생산할 수 있는 세포 비율보다 더 큰 비율의 EPO를 생산하는 세포를 포함하는 것을 말한다. 예를 들면, "B4"는 초기 신장 세포 집단으로부터 유도된 세포 집단이며, 초기 집단과 비교하였을 때, EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포를 더 큰 비율로 포함한다. 본 발명의 세포 집단은 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축되며, 하나 이상의 다른 세포 유형은 고갈될 수 있다. 예를 들면, 풍부한 EPO를 생산하는 세포 집단은 풍부한 세포 집단이 유도된 초기 세포 집단에 있는 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포에 대해 상대적으로 간질 섬유모세포에 대해서는 농축되어 있으며, 세뇨관 세포 및 집합 도관 상피 세포는 고갈될 수 있다. EPO 풍부한 또는 "B4" 집단을 언급하는 모든 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 내생성 고유 EPO 유전자로부터 산소-조정가능한 EPO 발현으로 설명된 바와 같이, 산소-조절된 방식으로 EPO를 생산할 수 있는 세포를 함유하는 이질성 세포 집단이다.
또 다른 측면에서, 풍부한 세포 집단은 초기 신장 세포 집단으로부터 유도된 세포 집단이며, 초기 집단에서 하나 이상의 세뇨관 세포 표식을 발현시키는 세포의 비율보다 더 큰 비율의 하나 이상의 세뇨관 세포 표식을 발현시키는 세포 비율을 포함하는 세포 집단을 말한다. 예를 들면, "B2"는 초기 집단과 비교하였을 때, 더 큰 비율의 세뇨관 세포를 함유하는, 초기 신장 세포 집단으로부터 유도된 세포 집단을 지칭한다. 또한, 하나 이상의 세뇨관 세포 표식을 발현시키는 세포(또는 "B2")에 대해 풍부한 세포 집단은 집합 도관 시스템의 일부 상피 세포를 포함할 수 있다. 비록 하나 이상의 세뇨관 세포 표식를 발현시키는 세포(또는 "B2")에 대해 풍부한 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포가 상대적으로 고갈되어 있지만, 풍부한 집단은 초기 집단과 비교하였을 때, 더 적은 비율의 이들 세포 (EPO를 생산하는, 사구체, 및 도관)를 함유할 수 있다. 일반적으로, 이질성 세포 집단은 하나 이상의 세포 유형이 고갈되어 있는데, 이와 같이 고갈된 세포 집단은 고갈되기 전 이질성 세포 집단에 포함된 해당 세포 유형의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 세포 유형을 포함한다. 고갈된 세포 유형은 임의의 신장 세포 유형이 될 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 고갈된 세포 유형은 ~1.045 g/㎖ 미만의 밀도를 가진 집합 도관 및 세뇨관계의 큰 과립 세포("B1"이라고 칭함)들을 포함한다. 특정한 다른 구체예에서, 고갈된 세포 유형은 ~1.091 g/㎖ 초과의 밀도를 가지는 저입도와 생존력의 작은 세포 집단 및 잔해를 함유하는 B5 세포 집단("B5"이라고 칭함)을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 세뇨관 세포에 대해 풍부한 세포 집단은 "B1", "B5", 산소-조정가능한 EPO를 발현시키는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포 모두가 상대적으로 고갈되어 있다.
여기에서 사용된 용어 "저산소(hypoxic)" 배양 조건은 대기중 산소 수준 (약 21%)에서 세포를 배양하는 표준 배양 조건과 비교하여, 배양 시스템에서 세포가 이용할 수 있는 산소 수준을 감소시킨 배양 조건을 지칭한다. 비-저산소 상태는 정상적인 또는 정상 산소 농도 배양 조건을 지칭한다.
여기에서 사용된 용어 "산소-조정가능한"은 세포가 이용할 수 있는 산소량에 근거하여 유전자 발현을 조절(상향 또는 하향)하는 세포의 능력을 말한다. "저산소-유도성"이란 산소 분압의 감소에 반응하여(사전 감소 또는 초기 산소 분압과 무관하게) 유전자 발현을 상향조절하는 것을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "생체적합물질"은 살아있는 조직으로 이입시키기에 적합한 천연 또는 합성 생체적합성 물질을 말한다. 천연 생체적합물질은 생물계에 의해 만들어진 물질이다. 합성 생체적합물질은 생물계에 의해 만들어지지 않는 물질이다. 여기에서 설명된 생체적합물질은 천연 생체적합성 물질과 합성 생체적합성 물질의 조합이 될 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 생체적합물질은 예를 들면, 폴리머 매트릭스 및 비계를 포함한다. 생체적합물질은 다양한 형태, 예를 들면, 액체 하이드로겔 현탁액, 다공성 포말로 형성될 수 있으며, 하나 이상의 천연 또는 합성 생체적합성 물질을 포함할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 수 있다.
여기에서 사용된 용어"빈혈증"은 피험자에서 EPO를 생산하는 세포에 의해 기능을 하는 EPO 단백질의 부적절한 생산, 및/또는 EPO 단백질이 전신 순환계로 부적절하게 방출되거나, 및/또는 EPO 단백질에 반응하여 골수에서 적아세포의 무능력으로 인하여 적혈구 세포의 수 및/또는 헤모글로빈 수준이 부족한 것을 말한다. 빈혈증이 있는 피험자는 적혈구 항상성을 유지시킬 수 없다. 일반적으로, 빈혈증은 신장 기능의 감퇴 또는 상실 (가령, 만성 신부전), 상대적인 EPO 결핍과 연관된 빈혈증, 충혈성 심부전과 연관된 빈혈증, 화학요법 또는 항-바이러스 요법 (가령, AZT)과 같은 골수-억제성 요법과 연관된 빈혈증, 비-골수성 암과 연관된 빈혈증, HIV와 같은 바이러스 감염과 연관된 빈혈증, 및 자가면역 질환들 (가령, 류마티스 관절염), 간질환, 및 다장기부전과 같은 만성 질환들의 빈혈증으로 발생될 수 있다.
용어"EPO-결핍"은 에리트로포에틴 수용체 항진제 (가령, 재조합 EPO 또는 EPO 유사체)로 치료가능한, 빈혈증을 함유하는 임의의 건강 이상 또는 장애을 말한다
여기에서 사용된 용어"신장 질환"은 여기에서 사용된 바와 같이, 혈액 여과 기능 및 과량의 유체, 전해물, 폐기물을 혈액으로부터 제거하는 신장의 기능이 상실되는 결과를 초래하는 급성 또는 만성 신부전의 임의의 단계 또는 수준과 연관된 장애를 말한다. 신장 질환은 또한 빈혈증과 같은 엔도크린 기능이상 (에리트로포에틴-결핍), 및 미네랄 불균형(비타민 D 결핍)을 포함한다. 신장 질환은 신장에서 기인되거나 또는 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환, 또는 간질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 질환에 부차적으로 기인될 수 있다.
용어"치료"는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 또는 사구체 여과 결핍의 치료, 예방 또는 방지 수단 모두를 말하는데, 여기서 목적은 표적 질환을 역전, 방지 또는 지연(경감)시키는 것이다. 이와 같은 치료를 요하는 사람들은 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 또는 사구체 여과 결핍을 이미 가지고 있는 사람, 및 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 또는 사구체 여과 결핍을 가질 경향이 있거나 또는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 또는 사구체 여과 결핍을 예방해야 할 사람들을 포함한다. "치료"는 여기에서 사용된 바와 같이, 신장 기능의 안정화 및/또는 개선을 포함한다.
용어"구조체"는 하나 이상의 합성 또는 자연적으로 생성되는 생체적합성 물질로 구성된 비계 또는 매트릭스의 표면에 침착된 하나 이상의 세포 집단을 지칭한다. 하나 이상의 세포 집단은 하나 이상의 합성 또는 자연적으로 생성되는 생체적합성 폴리머, 단백질, 또는 펩티드로 만들어진 생체적합물질로 피복, 침착, 임베딩, 부착 또는 포집될 수 있다. 하나 이상의 세포 집단은 시험관 또는 생체내에서 생체적합성 물질 또는 비계 또는 매트릭스와 복합될 수 있다. 일반적으로, 비계/생체적합물질을 만드는데 이용되는 하나 이상의 생체적합성 물질은 그 위에 침착되는 최소한 하나의 세포 집단의 다세포적, 3차원적, 조직화 형성을 지시, 실행 또는 허용하는 것으로 선택된다. 구조체를 만드는데 이용된 하나 이상의 생체적합성 물질은 구조체 또는 구조체의 세포 성분들이 숙주의 내생성 조직에 분산 및/또는 숙주의 내생성 조직과 통합을 지시, 실행 또는 허용하거나, 또는 구조체 또는 구조체의 세포 성분들의 생존, 접목, 내성 또는 기능적 실행을 지시, 실행 또는 허용하는 것으로 선택될 수도 있다.
용어"피험자"는 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍 신호, 증상 또는 다른 지표를 겪거나 겪은 경험이 있는 치료받을 수 있는 환자를 포함한 임의의 한 사람을 의미한다. 이와 같은 피험자는 원인에 관계없이, 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍으로 새로 진단받은 또는 이미 진단받은, 및 재발을 경험한 또는 이들 질환에 걸릴 위험에 처한 피험자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피험자는 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍에 대해 이미 치료를 받았거나, 치료를 받지 않았을 수도 있다.
용어"환자"는 치료를 바라는 임의의 단일 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물( 예를 들면, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 인간이 아닌 영장류를 포함한 인간이 아닌 동물)다. 가장 바람직하게는, 여기에서 환자는 인간이다.
용어"시료" 또는 "환자 시료" 또는 "생물학적 시료"는 피험자 또는 환자 체액, 체조직, 세포주, 조직 배양물, 또는 다른 원천으로부터 수득한 임의의 생물학적 시료를 일반적으로 의미한다. 이 용어는 예를 들면, 신장 생검과 같은 조직 생검을 포함한다. 이 용어는 예를 들면, 배양된 포유류 신장 세포와 같은 배양된 세포를 포함한다. 포유류의 조직 생검 및 배양된 세포를 수득하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. "시료"가 단독으로 이용되면, "시료"는 "생물학적 시료" 또는 "환자 시료"(이들 용어는 호환됨)를 의미한다.
용어"시험 시료"는 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 피험자로부터 얻은 시료를 지칭한다. 시험 시료는 혈액, 정액, 혈청, 소변, 골수, 점막, 조직, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유류 피험자의 다양한 원천으로부터 기인될 수 있다.
용어"대조군" 또는 "대조 시료"는 시험 시료에서 음성적 또는 양성적 결과와 연관시키는데 도움이 되는 것으로 기대되는 음성 또는 양성 대조군을 말한다. 본 발명에 적합한 대조군은 정상적인 적혈구 항상성의 지표 특징을 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈증의 지표적 특징을 나타내는 것으로 알려진 시료, 빈혈이 아닌 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료, 및 빈혈인 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추가 대조군은 적혈구생성을 조절하는 것으로 알려진 약리학적 물질(가령, 재조합 EPO 또는 EPO 유사체)로 치료를 받은 피험자로부터 유도된 시료를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 대조군은 본 발명의 방법에 의해 치료를 받기 전 피험자로부터 수득된 시료가 될 수 있다. 추가적인 적합한 대조군은 임의의 유형 또는 단계의 신장 질환을 가지는 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시험 시료, 및 임의의 유형 또는 단계의 신장 질환을 가지지 않는 것으로 알려진 피험자로부터 수득된 시험 시료가 될 수 있다. 대조군은 정상적으로 건강한 비교되는 대조군일 수도 있다. 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 대조군을 평가할 것이다.
세포 집단
본 발명은 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공하는 바와 같이 신장 질환 치료용으로 특정 생체활성 성분들 또는 세포 유형에 대해 풍부한 및/또는 특정 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들 또는 세포 유형은 고갈된 분리된, 이질성 신장 세포 집단 또는 이의 혼합물을 제공한다.
생체활성 세포 집단
한 측면에서, 본 발명은 생체활성 성분들은 농축되고, 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들은 고갈된, 이질성 신장 세포 집단의 특정 하위 분취물이 초기 집단 보다 우수한 치료 및 재생적 결과를 제공한다는 놀라운 발견에 근거한다. 예를 들면, 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들, 가령, B1 및 B5는 고갈되고, 본 발명의 생체활성 성분들, 가령, B2, B4, 및 B3가 단독으로 또는 혼합되었을 때, 신장 기능의 예상치못한 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 생체활성 세포 집단은 B2다. 특정 구체예에서, B2 세포 집단은 B4와 혼합되어 있다. 다른 구체예들에서, B2 세포 집단은 B3와 혼합되어 있다.
B2 세포 집단은 메갈린, 쿠비린, 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린 (Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8), 및 집합 도관 표식 아쿠아포린-4 (Aqp4)중 하나 이상으로 구성된 군으로부터 선택된 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 하며, B3 및/또는 B4보다 더 크고 더 많이 과립화되어, 따라서 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이 (설치류), 약 1.045 g/㎖ 및 1.052 g/㎖ 사이 (인간), 및 약 1.045 g/㎖ 내지 약 1.058 g/㎖ 사이(갯과 동물)의 부력 밀도를 가지는 것을 특징으로 한다.
B3 세포 집단은 B2 및 B4와 비교하였을 때, 중간 정도의 크기 및 입도를 가지고, 따라서 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.073 g/㎖ 사이 (설치류), 약 1.052 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이 (인간), 및 약 1.058 g/㎖ 내지 약 1.063 g/㎖ 사이 (갯과 동물)의 부력 밀도를 가지는 일부 EPO를 생산하는 세포와, 도관, 사구체 및 전단 세뇨관 표식의 발현을 특징으로 한다. B3은 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 2 (Fxyd2), 용질 운반체 패밀리 17 (인산나트륨), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 운반체 패밀리 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 냅신 A 아스파르트 펩티다제 (Napsa), 용질 운반체 패밀리 2 (조장된 포도당 운반물질), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (막) 아미노펩티다제 (Anpep), 막통과 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 합성효소 중쇄 패밀리 멤버 2 (Acsm2), 글루타티온페록시다제 3 (Gpx3), 푸럭토즈-1,6-바이포스파타제 1 (Fbp1), 및 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소 2 (Agxt2)중 하나 이상으로 구성된 군으로부터 선택된 표식의 발현을 특징으로 한다. B3는 또한 도관 발현 표식 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 표식 포도신 (Podn)을 특징으로 한다.
B4 세포 집단은 PECAM, VEGF, KDR, HIF1a중 하나이상을 함유하는 도관 표식 세트의 발현; 포도신 (Podn), 및 네프린 (Neph)중 하나 이상을 함유하는 사구체 표식 세트의 발현; 및 비-분취된 (UNFX), B2 및 B3와 비교하였을 때 산소-조정가능한 EPO 풍부한 집단에 의해 특징화된다. B4는 또한 케모킨 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도테린 수용체 타입 B (Ednrb), 콜라겐, 타입 V, 알파 2 (Col5a2), 캐드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성물질, 조직 (Plat), 앙지오포에틴 2 (Angpt2), 키나제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비된 단백질, 산성, 시스테인-풍부한 오스테오넥틴(Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 (Timp3), Wilms 종양 1 (Wt1), 날개없는-타입 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 신호생성 4 (Rgs4)의 조절 물질, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam), 및 에리트로포에틴 (Epo)중 하나 이상으로 구성된 군으로부터 선택된 표식의 발현을 특징으로 한다. B4는 또한 B2 또는 B3와 비교하였을 때, 약 1.073 g/㎖ 내지 약 1.091g/㎖ 사이 (설치류), 약 1.063 g/㎖ 내지 약 1.091 g/㎖ 사이 (인간 및 갯과 동물)의 부력 밀도를 가진 더 작고, 입도가 더 적은 세포를 특징으로 한다.
B2 및 B4에 의한 히알루론산 생산
히알루로난(Hyaluronan) (또한, 히알루론산 또는 히알루로네이트라고 지칭함)은 글리코사미노글리칸 (GAG)이며, 황산화 안된 디사카라이드 단위, 특히, N-아세틸글루코사민 및 글루쿠론산의 규칙적인 반복 연속으로 구성된다. 이의 분자량은 400 달톤 (디사카라이드)에서 백만 달톤 범위가 될 수 있다. 피부, 연골, 눈과 같은 모든 조직, 및 성인기 동물의 모든 유체는 아니지만 대부분의 유체에서 다양한 양으로 발견된다. 초기 배아에 특히 풍부하다. 히알루로난에 의해, 실제로 GAG에 의해 일반적으로 발생되는 공간은 세포 이동, 세포 부착, 상처 치료 동안, 기관형성, 면역 세포 흡착, 세포내 신호생성의 활성화, 및 종양 전이에 역할을 허용한다. 이와 같은 역할들은 히알루로난에 결합되는 특정 단백질 및 프로테오글리칸에 의해 중재된다. 세포 운동성 및 면역 세포 흡착은 세포 표면 수용체 RHAMM (히알루로난 매개된 운동성의 수용체; Hardwick et al, 1992) 및 CD44 (Jalkenan et al, 1987; Miyake et al, 1990)에 의해 중재된다. 히알루로난은 세포 표면의 내부 막에서 바로 합성되는데, 합성될 때 막을 통하여 세포 외부로 돌출된 폴리머는 커진다. 합성은 단일 단백질 효소, 히알루로난 합성효소 (HAS)에 의해 중재되는데, 이의 유전자 패밀리는 최소한 3개 멤버로 구성된다.
히알루론산은 CD44와 상호작용하며, 이와 같은 상호작용은 다른 작용중에서도 손상된 신장 조직으로 비-거주 세포(가령, 간엽 줄기 세포 (MSCs))를 모집하고, 신장 재생을 강화시킬 수 있는 것으로 최근 설명되었다(Kidney International (2007) 72, 430-441).
예상밖으로, B2 및 B4 세포 집단은 히알루론산 합성효소-2 (HAS-2)(특히 B2세포 집단에 풍부한 표식)의 작용을 통하여 더 큰 분자량의 히알루론산(HA) 종을 시험관 및 생체 모두에서 발현시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 5/6 Nx 모델을 B2로 치료하면 섬유증이 감소되었고, 동시에 생체내에서 HAS-2의 강력한 발현과, 치료된 조직내에 고분자량의 HA의 예상된 생산이 수반되었다. 특히, 치료를 하지 않고 방치한 5/6 Nx 모델에서는 HAS-2의 제한적인 탐지와 함께 섬유증이 초래되고, 고분자량의 HA가 거의 생산되지 않았다. 이론에 결부하지 않고, B2 (그리고 B4에 의해 어느 정도)에 의해 주로 생산되는 항-염증성 고분자량 HA는 신장 섬유증 감소 및 신장 재생을 돕는데 세포 준비물과 상승적 작용을 하는 것으로 가정한다. 따라서, 본 발명은 히알루론산을 함유하는 생체적합성 물질에 본 발명의 세포 프로토타입의 전달을 포함한다. 이식된 세포에 의한 직접 생산 또는 생산의 자극을 통한 생체적합성 물질 성분의 재생적 자극의 제공 또한 본 발명에서 고려된다.
한 측면에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증 및/또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에서 이를 치료하는데 이용하기 위한 EPO를 생산하는 분리된 이질성 신장 세포 집단을 제공한다. 한 구체예에서, 이 세포 집단은 신장 생검으로부터 유도된다. 또 다른 구체예에서, 이 세포 집단은 전체 신장 조직으로부터 유도된다. 한 가지 다른 구체예에서, 이 세포 집단은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유류 신장 세포의 시험관 배양물로부터 유도된다. 모든 구체예에서, 이들 집단은 비-분취된 세포 집단이 되며, 여기에서 비풍부한 세포 집단이라고도 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 에리트로포에틴 (EPO)을 생산하는 신장 세포의 분리된 집단을 제공하며, 이 집단은 추가 농축되어, 풍부한 하위집단에 있는 EPO를 생산하는 세포의 비율은 초기 또는 초기 세포 집단에서 EPO를 생산하는 세포의 비율보다 더 큰 집단을 제공한다. 한 구체예에서, 풍부한 EPO를 생산하는 세포 분취물은 비풍부한 초기 집단에 포함된 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포과 비교하여 더 큰 비율의 간질 섬유모세포와 더 적은 비율의 세뇨관 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 풍부한 EPO를 생산하는 세포 분취물은 비풍부한 초기 집단에 포함된 사구체 세포, 도관 세포 및 집합 도관 세포와 비교하여 더 큰 비율의 사구체 세포 및 도관 세포와, 더 적은 비율의 집합 도관 세포를 포함한다. 이와 같은 구체예에서, 이들 집단은 여기에서 "B4" 세포 집단이라고 한다. which 이하 문장이 없음
또 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 추가 신장 세포 집단과 혼합된 EPO를 생산하는 신장 세포 집단을 제공한다. 한 구체예에서, EPO를 생산하는 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 가령, B4에 대해 풍부한 제 1 세포 집단이다. 또 다른 구체예에서, EPO를 생산하는 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 가령, B2에 대해 비풍부한 제 1 세포 집단이다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 제 2 신장 세포 집단과 혼합된다. 일부 구체예에서, 제 2 세포 집단은 세뇨관 세포에 대해 농축되는데, 이것은 세뇨관 세포 표현형의 존재로 설명될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나의 세뇨관 세포 표식의 존재로 나타날 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나 이상의 세뇨관 세포 표식의 존재로 나타날 수 있다. 세뇨관 세포 표식은 메갈린, 쿠비린, 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린 (Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 간질로부터 유도된 세포, 세뇨관 세포, 집합 도관으로부터 유도된 세포, 사구체로부터 유도된 세포, 및/또는 혈액 또는 맥관구조로부터 유도된 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 몇 가지 신장 세포 유형중 최소한 하나와 혼합된다.
한 측면에서, 본 발명의 EPO를 생산하는 신장 세포 집단은 EPO 발현 및 산소에 대한 생체반응성을 특징으로 하여, 배양 시스템에서 산소 분압의 감소로 EPO 발현이 유도된다. 한 구체예에서, EPO를 생산하는 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한다. 한 구체예에서, 정상적인 대기 수준의 산소(~21%) 수준에서 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 배양 시스템에서 세포에 의해 이용될 수 있는 산소 수준이 감소된 조건에서 세포가 배양되었을 때 EPO의 발현이 유도된다. 한 구체예에서, 더 낮은 산소 조건에서 배양된 EPO를 생산하는 세포는 정상적인 산소 조건에서 배양된 EPO를 생산하는 세포와 비교하여, 더 큰 수준의 EPO를 발현시킨다. 일반적으로, 이용할 수 있는 산소 수준의 감소 상태(저산소 배양 조건이라고 함)에서 세포를 배양한다는 것은 이용할 수 있는 산소의 수준이 대기 수준(정상적인 또는 정상 산소 농도 배양 조건이라고 부르기도 함)에서 세포를 배양한 것과 비교하여 산소 수준이 감소되었다는 것을 의미한다. 한 구체예에서, 저산소 세포 배양 조건은 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소, 또는 약 5% 미만의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 정상적인 또는 정상 산소 농도의 배양 조건은 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소, 또는 약 21% 산소에서 세포 배양을 포함한다.
한 가지 다른 구체예에서, EPO의 유도된 또는 증가된 발현이 수득되며, 약 5%의 이용할 수 있는 산소에서 세포를 배양하고, 대기중 (약 21%) 산소에서 배양된 세포와 EPO 수준을 비교하여 EPO의 유도 또는 증가된 발현이 관찰될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포를 대기중 산소 (약 21%)에서 일정 시간 동안 배양하는 제 1 배양 상, 및 이용할 수 있는 산소 수준을 감소시키고, 약 5% 미만의 이용할 수 있는 산소에서 동일한 세포를 배양하는 제 2 배양상을 포함하는 방법에 의해 EPO를 발현시킬 수 있는 세포를 배양하여 EPO 가 유도된다. 또 다른 구체예에서, 저산소 상태에 반응성이 있는 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 여기에서 설명된 세포에 당업계에 공지된 다른 산소 조절 배양 조건을 이용할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
한 측면에서, EPO를 생산하는 포유류 세포의 풍부한 집단은 관주 조건에 생체-반응성 (가령, EPO 발현)을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 관주 조건은 일시적, 간헐적, 또는 연속적 유체 흐름 (관주)을 포함한다. 한 구체예에서, 세포를 배양하는 배지를 간헐적으로 또는 연속적으로 순환시키거나 또는 교반시켜, 유체를 통하여 동력이 세포로 전달될 때 EPO 발현이 기계적으로 유도된다. 한 구체예에서, 세포는 3차원 구조로 존재하거나 이와 같은 3차원 구조를 형성하기 위한 틀구조 및/또는 공간을 제공하는 물질에 존재하는 방식으로, 세포는 일시적, 간헐적, 또는 연속적 유체 흐름을 겪도록 배양된다. 한 구체예에서, 세포는 다공성 비드에서 배양되어, 흔들리는 플랫폼, 궤도를 선회하는 플랫폼 또는 스피너 플라스크를 통하여 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 받게 된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 3차원 비계에서 배양되고, 비계는 고정되고, 비계를 통하여 또는 가로질러 유체가 직접 흐르도록 이루어진 장치에 둔다. 여기에서 설명된 세포를 위한 당업계에 공지된 다른 관주 배양 조건이 이용될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
비활성 세포 집단
여기에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 생체활성 성분들에 대해 농축되고, 비활성 또는 바람직하지 못한 성분들은 고갈된, 이질성 신장 세포 집단의 특정 하위분취물은 초기 집단 보다 우수한 치료 및 재생적 결과를 제공한다는 놀라운 발견에 일부 근거한다. 바람직한 구체예들에서, 본 발명의 세포 집단은 B1 및/또는 B5 세포 집단이 고갈되어 있다.
B1 세포 집단은 ~1.045 g/㎖ 미만의 밀도를 가진 집합 도관 및 세뇨관계의 큰 과립 세포들을 포함한다. B5 세포 집단은 ~1.091 g/㎖ 초과의 밀도를 가지는 저입도와 생존력의 작은 세포 집단 및 잔해를 함유한다.
세포 집단의 분리 및 배양 방법
본 발명은, 한 측면에서, 가령, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 및 사구체 여과 결핍의 치료를 포함하는 치료목적으로 신장 세포 성분들, 가령, 풍부한 세포 집단을 구별(separating) 및 분리(isolating)하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 세포 집단은 새로 절단된, 가령, 기계적으로 또는 효소로 절단된, 신장 조직 또는 포유류 신장 세포의 이질성 시험관 배양으로부터 분리된다.
밀도 구배에서 분리하기 전, 저산소 배양 조건에서 이질성 신장 세포 혼합물을 배양하면 B4 및 B2 분취물 모두에서 세포 분포 및 조성이 강화된다는 예상치 못한 발견을 하였다. 질환이 있는 신장 및 질환이 없는 신장으로부터 분리된 신장 세포에서 B2로부터 B4내에 산소-의존적 세포의 농축이 관찰되었다. 이론에 구속되지 않고, 이것은 다음중 하나의 현상 때문일 것이다: 1) 저산소 배양 기간 동안 특정 세포 성분들의 선택적 생존, 사멸 또는 증식; 2) 저산소 배양에 반응하여 세포 입도 및/또는 크기의 변화, 이에 의해 부력 밀도에 변화 및 후속적으로 밀도 구배 분리 동안 국소화에 영향을 줌; 및 3) 저산소 배양 기간에 반응하여 세포 유전자/단백질 발현의 변화, 이에 의해 임의의 주어진 분취물 구배 내에서 세포의 차등적 특징을 초래한다. 따라서, 한 구체예에서, 세뇨관 세포에 대해 풍부한 세포 집단, 가령, B2는 저산소-저항성이다.
본 발명의 세포 집단을 구별 및 분리시키는 예시적인 기술은 관심 집단에 포함된 상이한 세포 유형의 차등적인 상대 밀도에 근거한 밀도 구배를 포함한다. 임의의 주어진 세포 유형의 상대 밀도는 세포내 입도, 세포내 물의 용적 및 기타 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 인간, 갯과 동물, 및 설치류를 포함하나 이에 한정되지 않는 다수 종에 걸쳐 본 발명의 세포 준비물, 가령, B2 및 B4의 분리를 위한 최적의 구배 조건을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포 집단으로부터 유도된 세뇨관 세포 분취물의 새로운 풍부한 집단, 가령 B2 세포 집단을 수득한다. 한 구체예에서, 밀도 구배를 이용하여 이질성 신장 세포 집단으로부터 EPO를 생산하는 새로운 풍부한 집단, 가령 B4 세포 집단을 수득한다. 다른 구체예들에서, 밀도 구배를 이용하여 신장의 세뇨관 세포, 사구체 세포, 및 내피 세포의 풍부한 하위집단을 수득한다. 한 구체예에서, EPO를 생산하는 세포 및 세뇨관 세포는 모두 적혈구세포 및 세포의 잔해로부터 분리되었다. 한 구체예에서, EPO를 생산하는 세포, 사구체, 및 도관 세포는 다른 세포 유형, 및 적혈구세포 및 세포의 잔해로부터 분리되며, 세뇨관 세포 및 집합 도관 세포의 하위집단은 다른 세포 유형 및 적혈구세포 및 세포의 잔해으로부터 동시에 분리된다.
본 발명은 물에 60% 비이온성 요오드 처리된 화합물 요오딕사놀을 함유하는, OPTIPREP®(Axis-Shield) 밀도 구배 매질을 부분적으로 이용하여, 하기에서 설명되는 주요 특정 성질에 근거하여 새로운 세포 집단을 만들었다. 그러나, 본 발명의 세포 집단을 분리하는데 필수적인 성질을 포함하는, 또는 본 기술분야에 공지된 세포 표면 표식을 이용한 임의의 밀도 구배 또는 면역학적 분리와 같은 다른 수단이 본 발명에 따라 이용될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 또한, 밀도 구배를 통하여 세포의 하위 집단을 분리시키는데 기여하는 동일한 세포의 특징 (크기 및 입도)을 이용하여 유세포분석을 통하여 세포의 하위집단을 분리시킬 수 있다는 것 또한 인지해야 한다(전방 산란 = 유세포분석을 통한 크기의 반영, 및 측면 산란 = 입도의 반영). 중요한 것은, 밀도 구배 매질은 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 한다. 밀도 구배 매질은 특정 관심 세포에 대해 독성이 낮아야 하고, 본 발명은 관심 세포의 선택 과정에서 역할을 하는 구배 매질의 이용을 고려한다. 이론에 구속되지 않고, 요오딕사놀을 함유하는 구배에 의해 회수되는 본 발명의 세포 집단은 요오딕사놀-저항성으로 보이며, 로딩과 회수 단계 사이에서 상당한 세포 손상이 있기 때문에, 구배 조건하에 요오딕사놀에 노출은 특정 세포의 제거로 이루어진다. 요오딕사놀 구배 후에 특정 밴드에 나타나는 세포는 요오딕사놀 및/또는 밀도 구배 노출의 임의의 부적당한 효과에 저항성이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 세포 집단의 분리 및/또는 구별에서 약하거나 중간정도의 신독물질인 추가 대비 배지의 이용도 고려한다. 또한, 밀도 구배 매질은 인간 혈장에 있는 단백질에 결합하지 않아야 하며, 또는 관심 세포의 주요 기능에 역효과를 주지 않아야 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 세포 집단의 3차원 배양 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 연속적 관주를 통하여 이 세포 집단을 배양하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 3차원 배양 및 연속 관주를 통하여 배양된 세포 집단은 정적으로 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 더 큰 세포질 및 연결성을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 3차원 배양 및 연속 관주를 통하여 배양된 세포 집단은 이와 같은 세포 집단의 정치 배양과 비교하였을 때, 더 큰 EPO 발현과 e-캐드헤린과 같은 신장 세뇨관-연합된 유전자의 강화된 발현을 나타낸다.
추가적인 또 다른 구체예에서, 연속적 관주를 통하여 배양된 세포 집단은 정적으로 배양된 세포 집단과 비교하였을 때, 더 큰 수준의 포도당 및 글루타민 소비를 나타낸다.
당업계에 공지된 기타 구별 및 배양 방법을 여기에서 설명된 세포에 이용할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
생체적합물질 (폴리머 매트릭스 또는 비계)
Bertram et al.,의 U.S. 공개된 공개된 출원 20070276507 (참고문헌에 전문이 통합된다)에서 설명하고 있는 바와 같이, 폴리머 매트릭스 또는 비계는 많은 전반적인 시스템, 기하학 또는 공간 제약을 만족시키기 위하여 많은 바람직한 형태로 만들어질 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 매트릭스 또는 비계는 기관 또는 조직 구조의 크기 및 모양에 합치되는 3차원 모양이 될 수 있다. 예를 들면, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 운반 결핍, 또는 사구체 여과 결핍 치료용 폴리머 비계를 이용할 때, 3차원 (3-D) 매트릭스가 이용될 수 있다. 상이한 형태의 다양한 3-D 비계가 이용될 수 있다. 자연적으로, 폴리머 매트릭스는 상이한 체격의 환자에 합치되도록 상이한 크기 및 형태로 만들어질 수 있다. 폴리머 매트릭스는 환자의 특별 요구를 수용하도록 다른 방법으로 모양을 갖출 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리머 매트릭스 또는 비계는 생체적합성, 다공성 폴리머 비계가 될 수 있다. 비계는 자연적으로 생성되는 물질로부터 형성될 수 있는데, 개방-셀 폴리젖산 (OPLA®), 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 불소첨가된 폴리에틸렌, 페놀, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조옥사졸, 폴리카르보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카르보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오르올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 산화물, 폴리페닐렌 황화물, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리황화물, 폴리술폰, 폴리테트라플루오르에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 불화물, 재생된 셀룰로오스, 실리콘, 요소-포름알데히드, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 실크, 엘라스틴, 알긴산, 히알루론산, 아가로즈, 또는 코폴리머 또는 이의 물리적 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 비계 형태는 액체 하이드로겔 현탁액에서 부드러운 다공성 비계, 딱딱한 모양을 가진 다공성 비계까지 다양하다.
하이드로겔은 다양한 폴리머 물질로부터 형성될 수 있고, 다양한 생의학적 용도에 유용하다. 하이드로겔은 친수성 폴리머의 3차원적 네트워크로서 물리적으로 설명될 수 있다. 하이드로겔 타입에 따라, 비록 물에 용해되지는 않지만, 다양한 비율의 물을 포함한다. 높은 수분 함량에도 불구하고, 하이드로겔은 친수성 잔기의 존재로 인하여 추가적으로 큰 용적의 액체가 결합할 수 있다. 하이드로겔은 이들의 젤라틴성 구조의 변화없이 상당히 팽창된다. 하이드로겔의 기본적인 물리적 특징은 이용되는 폴리머의 성질에 따라 및 산물의 추가적인 특정 장비에 따라 특이적으로 변형될 수 있다.
바람직하게는, 하이드로겔은 폴리머, 생물학적으로 유도된 물질, 합성에 의해 유도된 물질 또는 이의 조합으로 만들어지며, 생물학적 비활성이고, 포유류 조직과 생리학적으로 양립가능하다. 하이드로겔 물질은 바람직하게는 염증 반응을 유도하지 않는다. 하이드로겔을 만드는데 이용될 수 있는 다른 물질의 예는 (a) 변형된 알긴산, (b) 단가 양이온에 노출되어 겔화되는 폴리사카라이드 (가령. 겔란 검 및 카라지난), (c) 매우 점성이 큰 용액 또는 요변성이며, 구조의 느린 발달에 의해 시간을 두고 겔을 형성하는 폴리사카라이드 (가령, 히알루론산) 및 (d) 폴리머 하이드로겔 전구물질 (가령, 폴리에틸렌 산화물-폴리프로필렌 글리콜 블록 코폴리머 및 단백질)을 포함한다. U.S. 특허 6,224,893 B1는 본 발명에 따른 하이드로겔을 만드는데 적합한 다양한 폴리머 및 이와 같은 폴리머의 성질에 대한 상세한 설명을 제공한다.
비계 또는 생체적합물질 특징은 비계 또는 생체적합물질 물질에 세포가 부착되어 이와 상호작용할 수 있으며,/또는 세포가 포집될 수 있는 다공성 공간을 제공할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 다공성 비계 또는 생체적합물질은 다공성 비계의 형태로 된 생체적합성 물질에 하나 이상의 세포 집단 또는 혼합물의 처가 또는 침착 (가령, 세포의 부착에 의해)을 허용하거나 및/또는 비계의 포어내에 생체적합물질 상에 하나 이상의 세포 또는 세포 혼합물의 추가 또는 침착(가령, 세포의 포집에 의해)을 허용한다. 또 다른 구체예에서, 비계 또는 생체적합물질은 여기에서 설명된 바와 같이, 구조체를 형성하기 위하여 비계내에서 세포:세포 및/또는 세포:생체적합물질 상호작용을 허용하거나 촉진시킨다.
한 구체예에서, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 생체적합물질은 하이드로겔 형태의 5.1 kDA 내지 2 x 106 kDa 미만 크기 범위의 HA 분자를 포함한 히알루론산 (HA)으로 구성된다(>2×106 kDa 범위는 말이 안됨 > 대신 <가 되어야 함). 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 생체적합물질은 다공성 포말 형태의 5.1 kDA 내지 2 x 106 kDa 초과 크기 범위의 HA 분자를 포함한 히알루론산 (HA)으로 구성된다(>2 x 106 kDa 크기 범위에서 > 대신 <가 되어야 함). 추가적인 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 생체적합물질은 약 50 미크론 내지 약 300 미크론의 포어 크기와 개방-셀 구조를 가지는 폴리-젖산 (PLA)-기반 포말로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 특정 세포 집단, 바람직하게는 B2 및 B4는 신장내 이식 후, 히알루론산 합성효소-2 (HAS-2)를 통하여, 고분자량의 히알루론산을 직접 합성하거나 및/또는 합성을 촉진한다.
당업자는 당업계에 공지된 다른 타입의 합성 또는 자연적으로 생성되는 물질이 여기에서 설명된 것과 같은 비계를 형성하는데 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 비계 또는 생체적합물질로부터 만들어진 여기에서 설명된 것과 같은 구조체를 제공한다.
구조체
한 측면에서, 본 발명은 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자의 치료를 위하여 여기에서 설명된 하나 이상의 세포 집단을 가지는 이식가능한 구조체를 제공한다. 한 구체예에서, 구조체는 생체적합성 물질 또는 생체적합물질, 또는 자연적으로 생성되는 생체적합성 물질로 구성된 비계 또는 매트릭스에 부착 및/또는 포집에 의해 비계 표면에 침착된 또는 임베드된 하나 이상의 세포 집단 또는 세포 혼합물로 구성된다. 특정 구체예에서, 구조체는 생체적합물질과 생체적합물질 성분으로 피복된, 침착된, 부착된, 포집된, 임베드된 또는 복합된 하나 이상의 세포 집단 또는 세포 혼합물로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 구조체에 침착된 세포 집단 또는 구조체의 세포 성분은 산소에 의해 조정가능한 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 제 1 신장 세포 집단이다. 또 다른 구체예에서, 제 1 신장 세포 집단은 산소에 의해 조정가능한 EPO를 생산하는 세포에 추가하여, 사구체 및 도관 세포를 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 구조체의 침착된 세포 집단 또는 구조체의 세포 성분은 제 1 풍부한 신장 세포 집단 및 제 2 신장 세포 집단 모두를 포함한다. 일부 구체예에서, 제 2 세포 집단은 산소-조정가능한 EPO를 생산하는 세포에 대해 농축되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 제 2 세포 집단은 신장 세뇨관 세포에 대해 농축되며, 집합 도관 상피 세포를 포함한다. 다른 구체예들에서, 신장 세뇨관 세포는 메갈린, 쿠비린, 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린 (Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 표식의 발현을 특징으로 한다.
한 구체예에서, 본 발명의 구조체를 형성을 위한 생체적합물질 또는 비계 상에 침착된 또는 이와 복합된 세포 집단은 자가, 동종이계, 또는 동계(자가생성되는 또는 동종 유전자형의) 원천와 같은 다양한 원천으로부터 유도된다.
당업자는 구조체를 만들기 위하여 세포집단을 생체적합물질에 침착시키는 또는 복합시키는 몇 가지 적합한 방법들이 있다는 것을 인지할 것이다.
한 측면에서, 본 발명의 구조체는 여기에서 설명된 이용 방법에 사용하기에 적합하다. 한 구체예에서, 구조체는 임의 병인 관계의 신장 질환, 임의 병인 관계의 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 환자에게 투여용으로 적합하다. 다른 구체예들에서, 구조체는 적혈구 항상성의 개선 또는 복구를 요하는 피험자에게 투여용으로 적합하다. 또 다른 구체예에서, 구조체는 신장 기능을 개선시킬 필요가 있는 피험자에게 투여용으로 적합하다.
이용 방법
한 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물로 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 제 1 신장 세포 집단을 함유하는 조성물을 피험자에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제 1 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 추가 신장 세포 집단을 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 추가 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포에 대해 비풍부한 제 2 세포 집단이다. 또 다른 구체예에서, 추가 세포 집단은 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 또는 도관 세포에 대해 비풍부한 제 2 세포 집단이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 여기에서 설명된 질환 또는 장애 치료용 이식가능한 구조체를 형성하기 위하여 생체적합성 물질내에 침착된, 생체적합성 물질상에 침착된, 임베드된, 피복된 또는 포집된 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 또한 포함한다. 한 구체예에서, 이 세포 집단은 단독으로 이용되거나, 또는 급성 또는 만성 질환 상태에서 재생을 촉진시키기 위하여 다른 세포 또는 생체적합물질, 가령, 하이드로겔, 다공성 비계, 또는 고유 또는 합성 펩티드 또는 단백질과 복합하여 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 피험자에서 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 효과적인 치료는 적혈구생성 및/또는 신장 기능의 다양한 지표들을 통하여 관찰할 수 있다. 한 구체예에서, 적혈구 항상성의 지표는 헤마토크릿 (HCT), 헤모글로빈 (HB), 평균 미립자 헤모글로빈 (MCH), 적혈구세포 카운트 (RBC), 망상 적혈구 수, 망상 적혈구 %, 평균 미립자 용적 (MCV), 및 적혈구세포 분포 폭 (RDW)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 가지 다른 구체예에서, 신장 기능의 지표는 혈청 알부민, 알부민/글로불린 비율 (A/G 비율), 혈청 인, 혈청 나트륨, 신장 크기 (초음파에 의해 측정가능), 혈청 칼슘, 인:칼슘 비율, 혈청 칼륨, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 혈청 크레아티닌, 혈액 질소 요소 (BUN), 콜레스테롤 수준, 트리글리세리드 수준 및 사구체 여과 속도 (GFR)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 더욱이, 전반적인 건강 및 행복에 대한 몇 가지 지표는 체중 증감, 생존, 혈압(평균 전신 혈압, 확장기 혈압, 또는 수축기 혈압), 및 신체 지구 능력을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 효율적인 치료는 하나 이상의 신장 기능 지표의 안정화로 증명된다. 신장 기능의 안정화는 본 발명의 방법으로 치료를 받지 않은 피험자에서의 동일한 지표와 비교하였을 때, 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 피험자의 지표들의 변화의 관찰로 설명된다. 대안으로, 신장 기능의 안정화는 치료를 받기 전 피험자에서 동일한 지표와 비교하였을 때, 본 발명의 방법에 의해 치료를 받은 동일 피험자의 동일 지표들의 변화의 관찰로 설명될 수 있다. 제 1 지표의 변화는 값의 증가 또는 감소가 될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 치료는 피험자에서 혈액 요소 질소 (BUN) 수준의 안정화, 여기서 피험자에서 관찰된 BUN 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 더 낮다. 한 가지 다른 구체예에서, 치료는 피험자에서 혈청 크레아티닌 수준의 안정화를 포함하는데, 여기서 피험자에서 혈청 크레아티닌 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 더 낮다. 또 다른 구체예에서, 치료는 피험자에서 헤마토크릿 (HCT) 수준의 안정화를 포함하는데, 여기서 피험자에서 관찰된 헤마토크릿 (HCT) 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 더 높다. 또 다른 구체예에서, 치료는 피험자에서 적혈구세포 (RBC) 수준의 안정화를 포함하는데, 여기서 피험자에서 관찰된 RBC 수준은 본 발명에 의한 방법으로 치료를 받지 않은 유사한 질환 상태를 가진 피험자에 비해 더 높다. 피험자에서 신장 질환의 효과적인 치료를 결정하기 위하여, 당업계에 공지된 또는 여기에서 설명된 하나 이상의 추가 지표들을 측정할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 적혈구 항상성을 요하는 피험자에게 적혈구 항성성을 제공하는 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 이 방법은 (a) 신장 세포 집단, 가령, 여기에서 설명된, B2 또는 B4, 또는 신장 세포의 혼합물, 가령, B2/B4 및/또는 B2/B3을 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 (a) 여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계; 및 (b) 피험자의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 (a) 생체적합물질 또는 생체적합성 폴리머 비계를 제공하는 단계; (b) 본 발명의 신장 세포 집단 또는 혼합물을 여기에서 설명하는 방법으로 생체적합물질 또는 비계 위에 또는 안에 침착시켜 이식가능한 구조체를 만드는 단계; (c) 피험자에게 구조체를 이식하는 단계; 및 (d) 피험자의 생물학적 시료에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조군의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 피험자가 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내거나, 또는 (ii) 피험자에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 신장 기능의 안정화 및 적혈구 항상성의 복원을 요하는 피험자에게 이를 제공하는 방법에 관한 것으로, 여기서 피험자는 신장 기능의 결핍 및 빈혈증 및/또는 EPO-결핍을 모두 가지고 있다. 한 구체예에서, 이 방법은 여기에서 설명된 세뇨관으로부터 유도된 세포, 사구체로부터 유도된 세포, 간질으로부터 유도된 세포, 집합 도관으로부터 유도된 세포, 간엽 조직으로부터 유도된 세포, 또는 맥관구조로부터 유도된 세포중 최소한 하나를 함유하는 신장 세포 집단 또는 신장 세포의 혼합물을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 집단은 또는 혼합물은 EPO를 생산하는 세포 및 세뇨관 상피 세포를 모두 함유하는데, 여기서 세뇨관 세포는 다음중 최소한 하나의 표식에 의해 확인된다: 메갈린, 쿠비린, 히알루론산 합성효소 2 (HAS2), 비타민 D3 25-수산화효소 (CYP2D25), N-캐드헤린 (Ncad), E-캐드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인을 함유하는 이온 운반 조절물질 4 (Fxyd4), 용질 운반체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데히드 탈수소효소 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데히드 탈수소효소 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8). 본 구체예에서, 피험자의 치료는 치료를 받지 않은 피험자 또는 피험자의 치료전 지표들과 비교하였을 때, 적혈구 생성의 최소한 하나의 지표의 개선에 수반되는 신장 기능의 최소한 하나의 지표 개선으로 증명될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 여기에서 설명된 바와 같이, EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 신장 세포 집단 또는 EPO를 생산하는 세포에 대해 풍부한 세포 집단을 함유하는 신장 세포 혼합물을 투여함으로써, (i) 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 복구, 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법을 제공하는데, 투여의 유익한 효과는 EPO를 생산하는 세포에 대해 비풍부한 세포 집단을 투여할 때의 효과보다 더 크다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 혈청 혈액 요소 질소 (BUN)의 개선된 수준을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 혈청에서 개선된 단백질 체류를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 혈청 콜레스테롤 및/또는 트리글리세리드의 개선된 수준을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 개선된 수준의 비타민 D를 제공한다. 한 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 인:칼슘 비율을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 혈청 크레아티닌을 제공한다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 헤마토크릿을 제공한다. 추가 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 적혈구세포 수 (RBC#)를 제공한다. 한 구체예에서, 헤마토크릿의 개선된 수준은 정상적인 건강한 수준의 95%로 복귀하는 것이다. 추가 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 망상 적혈구 수를 제공한다. 다른 구체예들에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 망상 적혈구 비율을 제공한다. 추가 다른 구체예들에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 적혈구세포 용적 분포 폭 (RDW)을 제공한다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 비풍부한 세포 집단과 비교하였을 때, 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가적인 또 다른 구체예에서, 풍부한 세포 집단은 골수에서 조혈 반응을 제공하는데, 골수 세포질은 거의-정상이며, 골수:적혈구 비율도 거의 정상적이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 풍부한 세포 집단을 투여함으로써, (i) 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 복구, 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법을 제공하는데, 여기서, 여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 신장 세포 집단 혼합물의 투여의 유익한 효과는 재조합 EPO(rEPO)를 투여하여 제공되는 유익한 효과들과 비교하였을 때, 개선된 적혈구 항상성을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 집단 또는 혼합물을 필요한 피험자로 투여하였을 때 재조합 EPO 단백질을 투여하였을 때와 비교하여, 개선된 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈, 또는 RBC#에 의해 결정되었을 때)을 제공한다. 한 구체예에서, 투여되었을 때, 집단 또는 혼합물은 재조합 EPO와 비교하였을 때 개선된 수준의 헤마토크릿, RBC, 또는 헤모글로빈을 제공하며, 헤마토크릿은 대조군보다 약 10% 정도 더 낮거나 또는 더 높다. 추가 구체예에서, 집단 또는 혼합물이 단일 투여량 또는 운반되었을 때, 재조합 EPO 단백질의 단일 투여량 또는 전달이 적혈구 항상성의 개선을 제공하는 기간을 상당히 초과한 기간 동안 치료된 피험자에서 적혈구 항성성(헤마토크릿, 헤모글로빈, 또는 RBC#의 증가로 결정됨)의 개선을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 여기에서 설명된 투여량으로 투여되었을 때 집단 또는 혼합물은 필적하는 건강한 대조군에서 정상 수준의 약 110% 이상으로 헤마토크릿, 헤모글로빈, 또는 RBC#을 초래하지 않는다. 추가 구체예에서, 여기에서 설명된 투여량으로 투여되었을 때, 집단 또는 혼합물은 여기에서 설명된 투여량으로 운반된 재조합 EPO 단백질과 비교하였을 때, 더 우수한 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈, 또는 RBC#에 의해 결정됨)을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 EPO는 약 100 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 300 IU/kg, 약 400 IU/kg, 또는 약 500 IU/kg의 투여량으로 전달된다. 당업계에서 공지된 재조합 EPO의 다른 투여량이 적합할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료를 요하는 피험자에게 유용한 약물의 제공, 필요한 피험자에게 적혈구 항상성의 제공 또는 필요한 피험자에게 신장 기능 개선을 제공하기 위하여 여기에서 설명된 최소한 하나의 세포 집단, 여기에서 설명된 이식가능한 구조체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 특별히 증명된 치료 속성에 기초하여 특정 세포 하위 집단의 선별에 근거한, 특정 병인학적 신장 질환의 치료용으로 특정 풍부한 세포 집단(여기에서 설명된)의 용도에 관한 것이다.
투여 방법 및 경로
본 발명의 세포 제조물은 단독으로 또는 다른 생체활성 성분들과 복합되어 투여될 수 있다.
여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 신장 세포 집단 혼합물의 치료 유효량은 피험자에 의해 안정적으로 수용되는 세포의 최대 수 범위부터 가령, 안정화, 감퇴의 감소된 속도, 또는 하나 이상의 신장 기능의 개선과 같은 신장 질환의 치료에 필수적인 세포의 최소 수 범위가 된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 신장 세포 집단 혼합물을 약 10,000개의 세포/kg, 약 20,000개의 세포/kg, 약 30,000개의 세포/kg, 약 40,000개의 세포/kg, 약 50,000개의 세포/kg, 약 100,000개의 세포/kg, 약 200,000개의 세포/kg, 약 300,000개의 세포/kg, 약 400,000개의 세포/kg, 약 500,000개의 세포/kg, 약 600,000개의 세포/kg, 약 700,000개의 세포/kg, 약 800,000개의 세포/kg, 약 900,000개의 세포/kg, 약 1.1×106 개의 세포/kg, 약 1.2×106개의 세포/kg, 약 1.3×106개의 세포/kg, 약 1.4×106개의 세포/kg, 약 1.5×106개의 세포/kg, 약 1.6×106개의 세포/kg, 약 1.7×106개의 세포/kg, 약 1.8×106개의 세포/kg, 약 1.9×106개의 세포/kg, 약 2.1×106개의 세포/kg, 약 2.1×106개의 세포/kg, 약 1.2×106개의 세포/kg, 약 2.3×106개의 세포/kg, 약 2.4×106개의 세포/kg, 약 2.5×106개의 세포/kg, 약 2.6×106개의 세포/kg, 약 2.7×106개의 세포/kg, 약 2.8×106개의 세포/kg, 약 2.9×106개의 세포/kg, 약 3×106개의 세포/kg, 약 3.1×106개의 세포/kg, 약 3.2×106개의 세포/kg, 약 3.3×106개의 세포/kg, 약 3.4×106개의 세포/kg, 약 3.5×106개의 세포/kg, 약 3.6×106개의 세포/kg, 약 3.7×106개의 세포/kg, 약 3.8×106개의 세포/kg, 약 3.9×106개의 세포/kg, 약 4×106개의 세포/kg, 약 4.1×106개의 세포/kg, 약 4.2×106개의 세포/kg, 약 4.3×106개의 세포/kg, 약 4.4×106개의 세포/kg, 약 4.5×106개의 세포/kg, 약 4.6×106개의 세포/kg, 약 4.7×106개의 세포/kg, 약 4.8×106개의 세포/kg, 약 4.9×106개의 세포/kg, 또는 약 5×106개의 세포/kg의 투여량으로 투여하는 것을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 피험자에게 투여되는 세포의 투여량은 단일 투여량 또는 단일투여량에 추가 투여량을 더한 것이 될 수 있다. 다른 구체예들에서, 투여량은 여기에서 설명된 구조체에 의해 제공될 수 있다. 다른 구체예들에서, 피험자에게 투여되는 세포의 투여량은 예상되는 신장의 중량 또는 기능을 하는 신장의 중량에 기초하여 계산될 수 있다.
여기에서 설명된 신장 세포 집단 또는 이의 혼합물의 치료 유효량은 약제학적으로 수용가능한 운반체 또는 부형제에 현탁될 수 있다. 이와 같은 운반체는 기초 배양 배지 + 1% 혈청 알부민, 염, 완충된 염, 덱스트로즈, 물, 콜라겐, 알긴산, 히알루론산, 피브린 글루, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이의 복합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 제제는 투여 방식에 맞아야 한다. 따라서, 본 발명은 피험자에서 신장 질환 치료를 위한 약물 조제용으로 예를 들면, B2 세포 집단 단독 또는 B3 및/또는 B4 세포 집단과의 혼합물과 같은 신장 세포 집단 또는 이의 혼합물의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 이 약물은 재조합 폴리펩티드, 가령, 성장 인자, 케모킨 또는 사이토킨을 더 함유한다. 추가 구체예에서, 약물은 인간 신장으로부터 유도된 세포 집단을 함유한다. 약물 제조에 이용되는 세포는 여기에서 설명된 방법에 의해 제공되는 임의의 변이를 이용하여 분리되거나, 유도되거나 또는 농축될 수 있다.
신장 세포 제제, 또는 이의 혼합물, 또는 조성물은 통상적 절차에 따라 인간에 투여하는데 적합한 약제 조성물로 조제된다. 전형적으로 정맥 투여, 동맥내 투여 또는 신장 캡슐내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수용성 완충액의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에 임의의 통증을 개선시키기 위하여 국부 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로 공급되거나 또는 활성 물질의 양을 표시하는 앰플과 같은 밀봉된 용기에 저온보관된 농축물과 같이 단일 투여 형과 함께 혼합되어 제공된다. 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 멸균된 약제 등급의 물 또는 염을 함유하는 수액 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 때, 주입용 멸균수 또는 염의 앰플은 투여전에 혼합될 수 있도록 제공된다.
약제학적으로 수용가능한 운반체는 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 약제 조성물에 적합한 광범위한 다양한 제제가 있다(가령, Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed, Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, 참고, 이는 온전한 그대로 참고문헌에 통합된다). 약제 조성물은 일반적으로 실질적으로 멸균 등장성으로 조제되며, U.S. Food and Drug Administration의 Good Manufacturing Practice (GMP) 규정 모두에 적합하다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 신장 세포 준비물, 예를 들면, B2 세포 준비물 단독, 또는 B3 및/또는 B4 세포 준비물과 복합된 신장 세포 준비물과, 약제학적으로 수용가능한 운반체를 함유하는 약제 제제를 더 제공한다. 일부 구체예에서, 제제는 104 내지 109개 포유류 신장으로부터 유도된 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 혼합물을 포함한 하나 이상의 세포 집단을 이를 필요로 하는 피험자에게 제공하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 세포 집단의 원천은 자가, 동종이계, 또는 동계(자가생성되는 또는 동종유전자형의) 원천 및 이의 임의의 조합이 될 수 있다. 자가 원천이 아닌 경우, 방법은 면역억제 물질의 투여를 포함할 수 있다. 적합한 면역억 제약물은 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 미조르빈, 시클로스포린, 타크로리무스 하이드레이트, 클로람부칠, 로벤자리트 이나트륨, 아우라노핀, 알프로스타딜, 구스페리무스 하이드로클로라이드, 바이오신소르브, 무로모나브, 알레파세프트, 펜토스타틴, 다클리주마브, 시로리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 레플로노미드, 바시리시마브, 도르나제 α, 빈다리드, 클라드리빈, 피메크로리무스, 이로데카킨, 쎄데리주마브, 에파리주마브, 에레로리무스, 아니스페리무스, 가비리모마브, 파라리모마브, 클로파라빈, 라파마이신, 시플리주마브, 사이레이토, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F-106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A-86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP-1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, LJP-920, L-732531, ABX-RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER-49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, LJP-1082, TMC-95A, TV-4710, PTR-262-MG, 및 AGI-1096 (U.S. 특허 No. 7,563,822 참고)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 당업자는 다른 적합한 면역억제약물을 인지할 것이다.
본 발명의 치료 방법은 분리된 신장 세포 집단 또는 이의 혼합물을 피험자로 전달하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 의도된 부위로 세포를 직접 투여하는 것이 바람직하다. 한 구체예에서, 본 발명의 세포 준비물, 또는 이의 혼합물은 전달 운반체로 피험자에게 전달된다.
본 출원에서 피험자에게 세포를 투여하는 다양한 수단은 당업자에게 명백할 것이다. 이와 같은 방법은 피험자의 표적 부위에 세포를 주사하는 것을 포함한다. 세포는 운반 장치 또는 운반체로 삽입되고, 피험자에 주입 또는 이식에 의해 세포내로 이입된다. 특정 구체예에서, 전달 운반체은 천연 물질을 포함한다. 특정한 다른 구체예에서, 전달 운반체은 합성 물질을 포함한다. 한 구체예에서, 전달 운반체은 기관의 구조와 유사한 또는 적절하게 맞는 구조를 제공한다. 다른 구체예들에서, 운반 운반체은 자연상태에서 유체와 유사하다. 이와 같은 운반 장치는 튜브, 가령, 수용 피험자의 체내로 세포 및 유체 주입용 카테테르를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 튜브는 추가로 바늘을 가지며, 가령 주사기를 통하여 피험자의 원하는 위치에 본 발명의 세포가 이입된다. 일부 구체예에서, 포유류 신장으로부터 유도된 세포 집단은 카테테르를 통하여 혈관으로 투여되도록 조제된다(여기서, "카테테르"는 혈관으로 물질 운반용 다양한 튜브형 시스템을 함유하는 의도의 용어다). 대안으로, 세포는 피륙, 니트, 꼰끈, 그물코와 같은 직물, 및 비-편직, 천공된 필름, 스폰지 및 포말, 고체 또는 다공성 비드, 미소입자, 나노입자, 및 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 생체적합물질 또는 비계내 또는 상에 삽입될 수 있다. 다양한 상이한 형태로 세포를 전달되도록 제조할 수 있다. 예를 들면, 세포를 용액 또는 겔에 현탁시킬 수 있다. 세포를 약제학적으로 수용가능한 운반체 또는 희석액과 혼합시킬 수 있고, 여기서 세포는 여전히 살아있다. 약제학적으로 수용가능한 운반체 및 희석제는 염, 수용성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 배지를 포함한다. 이와 같은 운반체 및 희석제의 이용은 당업계에 공지된 것이다. 용액은 바람직하게는 멸균되고, 유체이며, 종종 등장액이 될 수 있다. 바람직하게 용액은 제조 및 보관 조건하에 안정적이며, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로잘 및 이와 유사한 것의 사용을 통하여 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염으로부터 보호된다. 본 발명의 세포 집단 및 이의 혼합물의 전달에 이용되는 전달 운반체은 상기 언급된 특징들의 조합을 포함할 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
분리된 신장 세포 집단, 예를 들면, B2 세포 집단 단독 또는 B4 및/또는 B3와 혼합된 집단의 투여 방식은 전신, 신장 내(가령, 실질), 정맥 또는 동맥내 주사, 및 의도된 활성 부위의 조직에 직접 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 이용될 수 있는 추가 투여 방식은 직접적인 개복을 통하여, 직접적인 복강경을 통하여, 복막을 통하여 또는 피하를 통하여 단일 또는 다중 주사를 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 추가 투여 방식은 예를 들면, 역행 및 요관 주입(retrograde and ureteropelvic infusion)을 포함한다. 투여용 외과적 수단은 부분적인 신적출 및 구조체 이식, 부분적인 신적출, 부분적인 신우제거( pyelectomy), 장막 ± 복막과의 도관화, 다초점 생검 바늘 트랙, 콘 또는 피라미드형 내지 실린더 및 신장 막대형 교체를 포함하나 이에 한정되지 않는 일-단계 시술뿐만 아니라 예를 들면, 재이식을 위한 기관을 닮은 내부 바이오리액터를 포함한 2-단계 시술도 포함한다. 한 구체예에서, 세포 혼합물은 동일한 시간에 동일한 경로를 통하여 운반되나. 조절된 혼합물을 함유하는 각 세포 조성물은 특정 위치로 별도 전달되거나, 또는 특정 방법을 통하여 동시에 또는 여기에서 설명된 하나 이상의 방법에 의해 일시적으로 조절된 방식으로 운반될 수 있다.
인간에게 적합한 세포 이식 적량은 EPO 생산과 같은 세포의 활성에 대한 기존 정보로 부터 결정하거나 또는 선임상 연구에서 실행된 적량 연구로부터 외삽하여 결정할 수 있다. 시험관 배양 및 생체내에서 동물 실험으로부터 세포의 양을 정량화할 수 있고, 이식 물질의 적량의 계산에 이용될 수 있다. 추가적으로, 추가 이식을 하여야 하는지 또는 이식된 물질을 줄여야 하는지를 결정하기 위하여 환자를 모니터할 수 있다.
선택된 세포의 매트릭스 성분들, 가령, 당업계에 공지된 하나 이상의 콜라겐 또는 히알루론산의 타입, 및/또는 성장 인자, 혈소판-풍부한 혈장 및 약물을 포함하나 이상의 다른 성분들이 본 발명의 세포 집단 또는 이의 혼합물에 추가될 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 문헌들은 온전한 그대로 참고문헌에 통합된다.
다음의 실시예들은 설명을 목적으로 하여 제공되며, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한시키기 위한 의도는 없다.
실시예
실시예 1 - 신부전이 있는 성인기 돼지로부터 생체반응성 신장 세포의 분리 및 특징화
성인기 수컷 돼지 (Sus scrofa)의 빈혈과 특발성 진행성 만성 신장 질환 (CKD)은 세포 조성물의 평가 및 나이가 일치되는 정상 돼지 신장 조직과 직접적인 비교와 함께 특징화를 위하여 질환이 있는 새로운 신장 조직을 제공한다.
수거시 신장 세포의 조직학적 검사로 심각한 미만성 간질 섬유증 및 다초점 섬유증을 가진 반월상 사구체신염을 특징으로 하는 신장 질환을 확인하였다. 임상 화학으로 질소혈(혈액 요소 질소 및 혈청 크레아티닌의 상승), 및 약한 빈혈증 (헤마토크릿의 약한 감소 및 헤모글로빈 감소된 수준)을 확인하였다. 질환이 있는 신장 조직과 정상적인 신장 조직으로부터 세포를 분리시키고, 확장시키고, 특징을 조사하였다.
도 1은 정상적인 신장 조직과 비교하였을 때 질병이 있는 신장 조직에서 섬유증을 나타내는 Gomori의 Trichrome 착색(화살표로 나타낸 블루 착색)을 보여준다. 질환이 있는 신장 조직과 정상적인 신장 조직으로부터 쿠불린:메갈린을 발현시키고, 수용체 매개된 알부민을 운반할 수 있는 기능을 하는 세뇨관 세포를 증식시켰다. 에리트로포에틴 (EPO)을 발현시키는 세포는 또한 배양물에 존재하였으며, 다중 계대 및 해동/냉동 사이클을 통하여 유지되었다. 더욱이, 분자 분석에서, 정상 조직과 질환이 있는 조직의 EPO를 생산하는 세포는 EPO 및 vEGF를 함유하는 다른 저산소-조절된 유전자 표적의 HIF1α구동된 유도로 저산소 조건에 반응하였음이 확인되었다.
콜라게나제 + 디스파제를 이용한 효소적 절단을 통하여 돼지의 신장 조직으로부터 세포를 분리시키고, 간단한 기계적인 침지 및 외식편 배양을 실시하여 별도 실험으로부터 분리시켰다. 계대 2에서, epo를 발현시키는 세포를 함유하는 외식편으로부터 유도된 세포 배양물은 대기중 산소(21%) 및 변화되는 저산소 (<5%) 배양 조건을 겪게하고, 저산소에 노출에 의해 EPO 유전자 발현이 상향 조절되는 지를 판단하였다. 설치류 배양에서 주목된 바와 같이(실시예 3 참고), 정상 돼지는 산소-의존적 발현 및 EPO 유전자의 조절을 나타낸다. 놀라운 것은, CKD 돼지(헤마토크릿 <34, 크레아티닌 >9.0)의 요독증/빈혈 상태에도 불구하고, EPO를 발현시키는 세포는 조직으로부터 용이하게 분리되고, 증식되며, 도 2에 나타난 바와 같이 EPO 유전자의 발현은 여전히 저산소에 의해 조절되었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 증식된 배양물에 있는 세포는 튜브형 구조로 자가-조직화하는 능력을 보였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 배양물(계대 3에서)에서 배양된 세포에 의한 수용체 매개된 FITC-콘쥬게이트된 알부민의 흡수가 관찰됨으로써 배양물내에 기능을 하는 세뇨관 세포 존재가 확인되었다. 녹색 점들(가는 흰색 화살표로 표시됨)은 세뇨관 세포-특정 수용체, 메갈린 및 쿠비린에 의해 중재된 세포내이입된 플로오레신-콘쥬게이트된 알부민을 나타내고, 이것은 기능을 하는 세뇨관 세포에 의한 단백질의 재흡수를 나타낸다. 블루 착색 (굵은 흰색 화살표로 표시됨)은 Hoescht-착색된 핵이다.
이와 함께, 이들 데이터들은 비록 신장 조직이 CKD로 인하여 제대로 발휘하지 못하지만, 기능을 하는 세뇨관 및 엔도크린 세포는 돼지의 신장 조직으로부터 분리 및 증식될 수 있다는 것을 암시한다. 더욱이, 이와 같은 발견은 CKD 치료를 위하여 자가 세포-기반을 둔 치료제의 발달을 지지한다.
실시예 2 - 인간 신장으로부터 생체반응성 EPO 세포의 분리
정상적인 성인의 신장으로부터 EPO를 생산하는 세포를 효소로 분리하였다(실시예 1에서 설명된 바와 같이). 도 5에 나타난 바와 같이, 초기 조직과 비교하였을 때, 분리 시술은 분리후 상대적으로 더 많은 EPO 발현을 초래하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, EPO 유전자 발현을 유지하는 배양물에서 인간 EPO를 생산하는 세포를 유지시키는 것이 가능하다. 인간 세포는 간단한 조직-배양 처리된 플라스틱 또는 피브로넥틴 또는 콜라겐과 같은 일부 세포외 매트릭스로 피복된 플라스틱상에서 배양/증식되었고, 모두 시간이 지나면서 EPO 발현을 지원하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3 - 설치류 신장으로부터 EPO를 생산하는 생체 반응성 세뇨관 세포의 배양
본 연구에서는 Lewis 랫트로부터 분리된 1차 신장 세포를 이용하여 시험관에서 저산소 및 전단력(shear force)에 반응하여 EPO 발현 및 세뇨관 표식 발현을 분석하였다.
Lewis 랫트로부터 마우스에 맞게 개조된 표준 방법을 이용하여 1차 신장 세포를 분리하였고(Aboushwareb et al, 2008. World J. Urol. Aug;26(4):295-300), 저산소 대 고산소, 또는 정치 배양 또는 3D 동적 배양으로 증식시켰다.
대기중 "정상 산소 농도" 배양 조건 (21% O2, 5% CO2로 균등화시킨 37℃ 배양기)하에 세포를 배양하고, 그 다음 저산소-의존성 Epo 전사를 활성화시키기 위하여, 산소-분압을 저산소 배양 (2% O2, 5% CO2로 균등화시킨 37℃ 배양기)으로 낮추어 세포를 배양함으로써 Epo를 생산하는 세포의 산소 의존성을 판단하였다. 정상 산소 농도 조건으로 다시 최종 전환시키면, 저산소 상태에서 발생된 유전자 전사를 억제할 수 있다. 1차 신장 세포를 세포가 흡착될 수 있도록(일반적으로 48시간), 정상 산소 농도 조건하에서 2D 평판 및 3D (Cultisphere, 하기 실시예 참고) 구조체에서 배양시켰다. 부착된 세포를 그 다음 저산소 배양기로 이동시켜, 48시간 동안 배양시켰다. 최종 48시간 저산소 배양 이후, 세포를 다시 정상 산소 농도 배양으로 이동시켰다. 세 개 평판 복제체로부터 초기 정상 산소 농도 배양된 세포를 각 특정 시점에서 수거하고, 그 다음 저산소 배양의 특정 시점 및 다시 정상 산소 농도 배양로 되돌린 조건의 특정 시점에서 세포를 수거하였다. 수거된 시료를 액화 질소에서 순간-냉동시키고, 분석전까지 -80℃에 보관하였다. 각 복제체로부터 전체 mRNA를 분석하고, 전체 mRNA로부터 cDNA 합성으로 유전자 발현 분석을 실시하였고, 실시간 정량적 PCR(qrtpcr)을 이용하여 상대적인 유전자 발현을 결정하였다. 또한 3개 평판 복제체에 추가하여, 각 배양 조건의 시점에 대해 총 6개 복제체를 제공하기 위하여 QRT PCR를 이용하여 2개의 기술적 복제체를 분석하였다.
Cultisphere-S 젤라틴 미세담체 비드
표준 방법을 이용하여 청년기 랫트로부터 1차 신장 세포를 분리하였다. 저부착 6개-웰 평판상에 멸균된 Cultisphere-S (Sigma-Aldrich cat # M9043) 젤라틴 거대다공성 미세담체 비드 (130-380 μm)의 50%(v/v) 슬러리 200㎕를 포함하는 배양물에 대략 200,000개의 세포를 두었다. 정치 조건(세포를 함유하는 평판은 실험이 진행되는 동안 움직임을 받지 않았다) 또는 동적(일정한 움직임) 조건 하에 2% 또는 21% 산소 챔버에 세포를 두었다. 연구 일정(7일)을 통하여 주기적으로 각 조건으로부터 시료를 수거하였다. 매일 각 조건으로부터 3개 시료를 수거하였다. 모든 시료에서 유전자 발현은 초기 분리된 1차 세포의 비-분취된 세포 현탁액의 출발물질에 대해 표준화되었다. QRTPCR를 실시하여 세뇨관 및 엔도크린 세포 표식, E-캐드헤린 및 EPO의 발현을 각각 검사하였다.
결과: 배양된 엔도크린 세포에서 EPO 발현은 정치 배양, 및/또는 저산소와 반대로 동적 배양에 의해 상향 조절되었다. 대기의 산소 수준(21%)의 3D에서 동적 배양된 (+) EPO 발현 결과를 도 7에 나타낸다. 도 8은 낮은 산소 수준(2%)의 3D에서 동적 배양된 (+) EPO 발현 결과를 나타낸다. 도 9는 연장된 배양에서 동적 배양 (+) 세뇨관 유전자 발현을 나타낸다. 고산소 및 정치 배양과 비교하여, 저산소 및 동적 3D 배양 모두에서 EPO 발현이 상당히 증가되었다(p < 0.05). 도 10은 정상 산소 농도 배양에 비해 저산소 배양에서 EPO 발현을 나타낸다. 도 11은 시험관에서 동적 3D 배양에 의한 EPO 발현 자극을 보여준다. EPO의 증가된 발현은 이의 조절물질, HIF1α, 및 다른 HIF1α 표적 유전자, 가령 VEGF의 발현 증가와 항상 수반된다. 따라서, 배양된 신생-신장 세포에서 EPO 발현은 HIF1α를 통한 산소 수준에 의해 조절되었다는 것이 명백하다. 위 결과로부터 산소 및 기계적으로-전환에 의한 EPO 발현을 유지하는 생체 반응성 1차 설치류 신장 세포는 시험관에서 분리 및 증식될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4 - 3D 구조체 및 비교 배양
세포, 비계 및 배지를 함유하는 새로운 조직/새로운 기관 형태의 치료 잠재력과 같은 생체내 기능이 시험관에서 가장 잘 나타내는 것을 결정하기 위하여, 몇 가지 3차원 배양 형태가 기획되었다. 새로운-조직/새로운-기관 형태는 다음과 같이 기획되었다: 1차 신장 세포 배양물 (EPO를 생산하는 세포 및 신장 세뇨관 세포 모두를 함유하는)을 5mm의 직경 및 5 mm의 높이로 된 다공성 실린더형 비계상에 접종하였다. 세포를 500K 내지 백만개의 세포/비계의 밀도로 접종하였고, 실험을 통하여 한 방향으로 유체의 연속적 흐름을 제공하는 프로토타입 멀티웰 관주 시스템 (MPS, BD Technologies)에서 배양하였다. 배지는 DMEM + 10% FBS (배지 A)로 구성되거나, 또는 DMEM + 10% FBS 및 KSFM 배지의 혼합물로 구성된다(배지 B). 이 실험에서 평가되는 비계는 개방-셀 폴리젖산 (OPLA) 및 콜라겐 1 비계 (모두 BD Technologies), 및 표적 방법에 의해 만들어진 폴리-글리콜산-기반 비계 (PGA)를 포함한다.
특징: 세포-비계 조성물을 통하여 유체가 흐를 수 있도록 충분한 포어 크기 및 구조; 세포-비계 및 세포-세포 상호작용을 허용하는 미세환경을 제공하는 비계 구조 및 조성물; 신장 재생 및/또는 항상성에 관련된 운반 단백질 및/또는 분자의 발현 및/또는 생산 및/또는 운반, 또는 발현, 생산 및/또는 운반 시키는 능력을 보유한 세포의 존재를 포함한다.
예를 들면, 개방-셀 폴리젖산 (OPLA)으로 구성된 바람직한 3D 비계에 포유류 신장 세포를 접종시키고, 비계를 통하여 배양 배지를 연속적으로 관주시킬 수 있는 바이오리액터 장치에서 시험관 배양되었다. 시험관에서 조절된 비계+세포 조성물은 다음에 의해 특징화된다: 살아있는, 대사적으로 활성 세포; 세포-세포 및 세포-물질 상호작용; 메갈린, 감마-글루타밀-트란스펩티다제 (GGT), E-캐드헤린, 및 N-캐드헤린을 포함하나 이에 한정되지 않는 신장 세뇨관 표식의 발현; 및 에리트로포에틴을 포함하나 이에 한정되지 않는 신장 엔도크린 표식의 발현.
결과: 조건화 배지 및 전체 단백질 용해물을 나타낸 바와 같이, 2D 및 3D 배양물로부터 수거하였다. ELISA 분석을 실행하여 세포 용해물 (도 12의 상부 패널) 및 조건화 배지 (도 12의 하부 패널) 모두에서 표적 단백질을 정량화하였다.
관주 또는 정치 배양 7일후, 접종된 OPLA 및 Col1 비계는 표준 기술을 이용하여 10% 완충된 포르말린에 고정되고, 파라핀-임베드되었다. 헤마토실린 및 에오신(H&E) 착색을 실시하여 세포의 존재 및 형태를 검사하였다. 세포질은 정치 비계보다는 관주 비계에서 더 크고, 비계를 통한 세포 분포는 Col1 비계 보다는 OPLA 비계에서 더 두드러졌다(도 13 참고).
도 14에서는 배양 7일후(정치 및 관주 배양) OPLA 및 Col1 비계의 주사 전자현미경(SEM)의 이미지 결과를 나타낸 것이다. 정치 배양과 비교하였을 때, 관주된 배양물에서 더 큰 세포성 및 세포 조직화를 나타내었다.
용해 완충액 (Qiagen)을 첨가시켜 비계 또는 2D 배양으로부터 mRNA를 분리시키고, 용해 완충액에서 전기적 균질화(폴리트론)에 의해 3D로부터 mRNA를 분리시켰다. 관심 대상의 표적 유전자에 특이적인 인트론-스패닝 프라어미를 이용하여 RT-PCR 분석을 받은 정제된 mRNA에서 검사된 3D 형태의 3/7은 배양 5일 경과후 표적 유전자의 발현을 나타내었다는 것을 볼 수 있었다.
대조적으로, 2D 형태 (도 15의 라인 8-10)는 5 일 시점에서 탐지가능한 표적 유전자의 mRNA가 없었다. 도 15의 라인 1은 3D 형태가 표적 유전자를 발현시키는 것으로 알려진 거대절개된 새로운 조직에서 볼 수 있는 수준(레인 21)에 근접한 발현 수준을 5일 배양물에서 수득된다는 것을 나타낸다.
도 16은 비계에서 대사적 활성을 평가하는데 이용되었던 CellTiter Blue™ (Resazurin 대사)의 결과를 나타낸다. 비계 형태 C가 관주 및 정치 조건에서 최고의 대사 반응을 나타내었고, 그 다음 차례로 비계 B 및 비계 A이다. 모든 비계 형태에서, 관주된 배양은 Resazurin 대사에 있어서 정치 배양을 능가하였다.
1차 신장 세포의 관주 및 정치 3D 배양에 의한 포도당 및 글루타민 소비를 검사하기 위하여, 조건화 배지를 수거하여, Nova BioProfile®400에서 분석하였다. 포도당의 소비는 정치 조건보다는 관주 조건에서 상당히 증가되었다. 글루타민은 모든 3D 조건에서 어느 정도 소비되었는데, 정치 배양보다는 관주 배양에서 약간 더 소비되었다. 글루타민 대사의 부산물인 글루타메이트의 생산은 시험된 모든 비계에서 정치 조건보다는 관주 조건에서 더 크고, 이것은 포도당 대사의 부산물인 락테이트 생산과 동일하다 (도 17 참고).
실시예 5 - 신장 세포의 비-분취된 혼합물의 이질성 집단 분리(시험 대상물 #1)
주로 세뇨관 세포로 구성되지만, 집합 도관, 사구체, 엔도크린, 도관, 및 다른 세포 유형의 더 작은 하위집단도 함유하는 신장 세포의 비-분취된 혼합물(UNFX)의 풍부한 집단은 다음과 같이 전체 신장으로부터 분리되었다:
세포 공여자: 2주령의 Lewis 수컷 랫트 20마리를 희생시키고, 이들의 신장을 수거하였다. 새로 잘라낸 신장을 차가운(4℃) Hypothermasol (Biolife Solutions, Inc. Bothell, WA) 50 mL이 담겨있는, 얼음위에 둔 50 mL 원뿔 튜브(튜브당 10개 신장)에 넣었다. 다음 날, 신장이 포함된 튜브를 70% 에탄올로 헹구고, 프로세싱을 위하여 Biological Safety Cabinet (BSC)에 넣었다.
신장 세포 분리 프로세스: 50㎍/㎖ 젠타미아신(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 1×PBS(Gibco, Grand Island, NY)로 세척시키고, 신배(calyx) 및 결합 조직을 핀셋과 외과용 메스를 이용하여 손으로 떼어내었다. 멸균 핀셋 및 외과용 메스를 이용하여 신장을 손으로 다져서 세포/조직 슬러리로 만들었다.
흔들리는 플랫폼에서 디스파제(4U/mL) (#07193 Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) + 5mM CaCl2 + 콜라게나제 타입 IV (300 U/mL) (Worthington, Newark, NJ)를 함유하는 Kreb 완충액내에서 30분간, 37℃에서 세포/조직 준비물을 효소로 처리하였다. 생성된 세포 현탁액을 70 포어 (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)를 가지는 세포 거르는 기구를 통하여 여과시켜, 50:50 신장 세포 성장 배지 (1:1 고포도당 DMEM : KSFM)를 함유하는 50mL의 멸균된 원뿔형 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 그 다음 현탁액을 300×g에서 5분간 원심분리시키고, 10㎖의 50:50 신장 세포 성장 배지에 재현탁시켰다.
10 mL의 세포 현탁액을 두 개의 15 원뿔형 튜브(각 튜브당 5㎖씩)에 나눴다. 5㎖의 30% w/v Optiprep (Sigma, St. Louis, MO)를 각 튜브에 첨가하였고, 6회 아래위로 뒤집었다. 혼합 후, 각 현탁액의 상부에 1㎖의 1×PBS의 층을 조심스럽게 형성시켰다. 튜브를 15분간 브레이크 없이 800×g에서 원심분리시켰다(실온). 세포 밴드(살아있는 신생-신장 세포 프로토타입#1을 함유하는)는 멸균된 10㎖ 피펫을 이용하여 제거하고, 50:50 신장 세포 성장 배지 (저-포도당 DMEM으로 만듬)로 5×희석시키고, 300×g에서 5분간 원심분리시켰다. 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠렛은 10㎖의 50:50 (저포도당) 신장 세포 성장 배지에 재현탁시키고, 헤아렸다. 유전자 발현 시험을 위하여 500K 세포를 샘플로 취하였다. 살아있는 세포의 전체 수율은 230×106 (94% 생존률)이었다.
총 46.8×106 세포를 (40) p100 조직-배양 처리된 폴리스티렌 평판(BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)의 50:50 (저포도당) 배지에 도말하였고(평판당 1.17×106 세포), 및 표준 CO2 배양기(21% O2)에 두었다. 48 시간 후, 배양물에 50:50 (저포도당) 배지를 이용하여 100% 배지 교환을 제공하고, 2% O2 환경, 37℃에 두었다. 2% O2에서 24시간 후, 이식을 위하여 세포를 수거하였다. 각 평판를 멸균 PBS로 1×세척하고, 이어서, 5.0 mL 의 따뜻한 0.25% 트립신 w/ EDTA (Sigma)을 첨가하고, 다시 5-7분간 37℃로 복귀시켰다. 각 평판에 성장 배지(5.0 mL)를 첨가하였고, 세포 현탁액을 제거하여, 50 mL 멸균 원뿔 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 세포를 5분간 300×g에서 원심분리를 통하여 펠렛화시키고, 멸균 PBS로 2×세척하고, 냉각(4℃) PBS로 재현탁시키고, 혈구계산기를 이용하여 카운트하였다. 멸균 냉각 PBS 100㎕당 10×106 세포로 몇방울 제조하였다. 살아있는 세포의 배양후 수율은 91×106 (90% 생존률)이었다. 확장 배수(Fold Expansion) (도말에서부터 수거까지)은 3.91×였다.
실시예 6 - 신장 세포 및 비계-접종의 비-분취된 혼합물의 이질성 집단의 분리 (시험 대상물 #2)
세포 공여자: 2 주령의 Lewis 수컷 랫트 10마리를 희생시키고, 이들의 신장을 수거하였다. 새로 잘라낸 신장을 차가운(4℃) Hypothermasol (Biolife Solutions, Inc. Bothell, WA) 50 mL이 담겨있는, 얼음위에 둔 50 mL 원뿔 튜브(튜브당 10개 신장)에 넣었다. 다음 날, 신장이 포함된 튜브를 70% 에탄올로 헹구고, 프로세싱을 위하여 Biological Safety Cabinet (BSC)에 넣었다.
신장 세포 분리 프로세스: 50㎍/㎖ 젠타미아신(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 1×PBS(Gibco, Grand Island, NY)로 세척시키고, 결합 조직을 핀셋과 외과용 메스를 이용하여 손으로 떼어내었다. 멸균 핀셋 및 외과용 메스를 이용하여 신장을 손으로 다져서 세포/조직 슬러리로 만들었다.
흔들리는 플랫폼에서 디스파제(4U/mL) (#07193 Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) + 5mM CaCl2 + 콜라게나제 타입 IV (300 U/mL) (Worthington, Newark, NJ)를 함유하는 Kreb 완충액내에서 30분간, 37℃에서 세포/조직 준비물을 효소로 처리하였다. 생성된 세포 현탁액을 70 포어 (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)를 가지는 세포 거르는 기구를 통하여 여과시켜, 50:50 신장 세포 성장 배지 (1:1 고포도당 DMEM : KSFM)를 함유하는 50mL의 멸균된 원뿔형 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 그 다음 현탁액을 300×g에서 5분간 원심분리시키고, 10㎖의 50:50 신장 세포 성장 배지에 재현탁시켰다.
10 mL의 세포 현탁액을 두 개의 15 원뿔형 튜브(각 튜브당 5㎖씩)에 나눴다. 5㎖의 30% w/v Optiprep (Sigma, St. Louis, MO)를 각 뷰트에 첨가하였고, 6회 아래위로 뒤집었다. 혼합 후, 각 현탁액의 상부에 1㎖의 1×PBS의 층을 조심스럽게 형성시켰다. 튜브를 15분간 브레이크 없이 800×g에서 원심분리시켰다(실온). 세포 밴드(살아있는 신생-신장 세포 프로토타입 #1을 함유하는)는 멸균된 10㎖ 피펫을 이용하여 제거하고, 50:50 신장 세포 성장 배지 (저-포도당 DMEM으로 만듬)로 5×희석시키고, 300×g에서 5분간 원심분리시켰다. 원심분리 후, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 세포 펠렛은 10㎖의 50:50 (저포도당) 신장 세포 성장 배지에 재현탁시키고, 헤아렸다. 유전자 발현 시험을 위하여 500K 세포를 샘플로 취하였다. 살아있는 세포의 전체 수율은 71×106 (97% 생존률)이었다.
24개의 멸균 포장된 개방-셀 폴리젖산 (OPLA®) 비계 (BD Biosciences, Franklin Lakes NJ)를 50:50 (저포도당) 배지로 미리 적시고, 각 비계에 1×106 RK42 신생-신장 세포 프로토타입 #1/50 의 50:50 (저포도당) 배지로 접종하였다. 비계를 2시간 동안 37℃/21% O2, 환경에 두고 적응시킨 후 하전된 MPS (Multiwell 관주 시스템) 단위(BD Technologies, RTP NC)로 이동시킨후 5일간 50:50 (저포도당) 배지의 연속 흐름속에 유지시켰다. 배지를 2일에 한번씩 교체하였다(50% 용적 교환). 5일 시점에서, MPS로부터 비계를 조심스럽게 제거하고, 멸균 PBS로 세척시키고, 비계는 이식 준비로 운반되는 대략 2시간 동안 실온에 유지된다.
실시예 7 - 신부전 및 빈혈증이 있는 랫트 모델로 비-분취된 신장 세포의 혼합물의 이식
상기에서 설명된 바와 같이, EPO를 생산하는 간질 섬유모세포, 전단 및 말단 세뇨관 상피 세포, 사구체 세포, 및 랫트 신장에서 분리된 내피 세포를 함유하는 이질성 혼합물을 함유하는 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (UNFX)의 치료 잠재력 및 안정성을 평가하기 위하여, 신부전 및/또는 빈혈증을 지연 또는 역전시키는 신생-신장 세포 프로토타입 #1 의 능력을 외과적으로 신장적출된 설치류에서 평가하였다. 연구 안은 표 1에 나타낸다. 비-제한적인 성공 인자들은 다음을 포함한다:
1) HCT 및/또는 RBC 수에서 유의적인 명확한 효과
2) 혈청 BUN 및/또는 크레아티닌의 상당한 감소
3) 적혈구 자극의 조직학적 증거
4) 신장 재생의 조직학적 증거
5) 유기체 수준의 개선 (체중 증가, 생존)
연구 계획에 따르면, Charles River Laboratories (Wilmington, MA)로부터 성인기 Lewis 암컷 랫트(8-10주령) 24마리를 구입하였고, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이 연구의 수용자로 할당하였다. 매일 건강 평가 및 매주 혈액 및 혈청 시험을 통하여 질병 상태의 개시에 대해 각 군의 부분집합을 모니터하였다. 모든 수용 동물은 신생-신장 프로토타입으로 치료되기 전 빈혈증/요독증 질병을 얻었다. 연구 시작 전, 신장적출된 랫트에서 2주 연속 상승된 혈청 크레아티닌 (2×대조군 수준)이 요구되었다. 신장적출된 랫트는 4개 군중 하나에 할당되었다(아래 표 1 참고). 제1군 랫트에게는 멸균 PBS에 현탁되고, 신장의 피질수질 부분에 직접 주입하여 전달된 천만개 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (시험 대상물 1)을 제공하였다. 제2군 랫트에게는 남아있는 신장의 말단 극에 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (1×106 신생-신장 프로토타입 #1 세포가 OPLA 비계에 접종되고, 4일간 배양됨)을 부착시켰다. 제3군 랫트에게는 남아있는 신장의 말단 극에 빈 OPLA 비계를 부착시켰다. 제4군 랫트는 아무런 치료를 받지 않았다. 조정을 받지 않고, 나이가 일치되는 대조군 랫트를 제5군로 지정하였고, 허위 신장적출을 받고, 나이가 일치되고, 다른 치료를 받지 않은 랫트를 제6군으로 지정하였다.
신장 기능 평가 (크레아티닌 및 BUN) 및 적혈구생성 (HCT, RBC, 및 핵이 있는 RBC (nRBC))의 평가를 위하여, 꼬리 정맥을 통하여 모든 동물로부터 매주 채혈(500㎕)하였다. 연구가 진행되는 동안 매주 건강 관찰 및 체중을 측정하였다. 연구 종료시(84 일) 살아있는 랫트는 수영 지구력 시험을 받았다. 부검 할 때, 대퇴골, 신장, 간, 비장, 심장 및 폐를 수거하였고, 중량을 측정하였고, 포르말린-고정 및 파라핀 임베딩(FFPE)에 의해 조직학적 분석을 위하여 프로세스되었다. 신장의 일부를 냉동된 OCT 배지에 임베드시키고, 냉동절편을 통하여 프로세스시켰다. FFPE 조직을 프로세스시키고, H&E 착색시켰다.
[표 1]
Figure 112018083309028-pat00001
시간대
제0일, 첫 번째 신적출 (50%)
제7일, 두 번째 부분적 신적출 (제거되고 남아있는 신장의 2/3)
제43일, 첫 번째 출혈/혈청학/혈액학 날짜
제83-91일, 치료 날짜
제170일, 죽임 날짜/연구 종료
시험 대상물:
시험 대상물 #1 - 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (UNFX) - 실시예 3에서 설명된 바와 같이 분리된, EPO를 생산하는 세포의 하위집단을 함유하는 배양된 신장 세포의 이질성 혼합물로 구성.
시험 대상물 #2 - 신생-신장 구조체 프로토타입 #1-실시예 4에서 설명된 바와 같이 분리된, EPO를 생산하는 세포의 하위집단을 함유하는 배양된 신장 세포의 이질성 혼합물이 접종된 OPLA®비계로 구성.
시험 대상물 #3 - OPLA®비계
수용자 5/6 신장적출된 Lewis 암컷 랫트: Lewis 암컷 랫트(8-10 주령) 13마리는 이미 설명된 바와 같이, Charles Rivers Laboratories (Wilmington, PA)에서 2-단계 5/6 외과적 신장적출을 받았다.
간단하게 설명하면, 1 단계 시술 동안, 배의 복부 중앙을 절개하고, 멸균된 천을 덮었다. 내장을 옆으로 밀쳐 동물의 우측 신장이 노출되도록 하였다. 신장에 주변 조직이 없도록 하였다. 봉합사는 신장의 각 극 주변 1/3 위치에 두었다. 신장 주변으로 봉합사를 부드럽게 결찰시켰다. 봉합사 바로 위 각 말단의 1/3 신장을 잘라내었다. 복부 절개는 봉합사 및 상처 클립으로 닫았다. 2 단계 시술 동안, 및 1 단계 후 1주일에, 동물을 마취시키고, 이미 설명된 바와 같이 준비하였다. 등의 요추 부위의 털을 면도하였다. 흉곽 뒤 바로 두개 말단과 척추에 좌측면상에 두개-꼬리(cranial-caudal) 피부를 절개하였다. 복강으로 들어갔다. 신장 주변 조직을 없애고, 신장을 절개부분 밖으로 조심스레 끌어냈다. 신장의 전방 극에 결합조직 및 지방에 의해 느슨하게 부착된 부신은 부착부분을 부드럽게 찢어내어 자유롭게 하였고, 복강의 뒤쪽에 두었다. 신장 혈관 및 수뇨관을 소작시켰다(cauterize). 그 다음, 소작된 지점의 말단에 있는 혈관과 수뇨관을 가로 절개하여 신장을 제거하였다. 절개는 봉합사와 상처 클립으로 닫았다.
대조군으로서, 나이가 일치하는 6 마리의 대조군에서 허위 신적출(외과적으로 마취, 모든 시술을 위해 개방 후 닫음)을 실행하였다. 또한, 나이가 일치하는, 조작되지 않은 5 마리의 대조군을 얻었다. 회복시, 모든 랫트를 5일간 격리시켰다. 각 랫트를 군에 할당하여 식별 번호를 우리의 카드에 붙여두었다(카드에는 연구 횟수, 벤더, 연구 감독에 대한 정보도 있다). 우리에 랫트를 가두고(1), Purina Certified Regular 설치류 Chow, # 5002를 공급하였다. 물을 임의로 제공하였다.
살아있는 동안 임상 매개변수의 평가: 눈금이 조정된 분석용 저울을 이용하여 체중을 매주 관찰하고 기록하였다.
혈액학/임상 화학: 43일에 시작하여, 혈액 및 혈청을 매주 Antech에 수거하여, 헤마토크릿 (HCT), 적혈구세포 수 (RBC), 핵을 가진 적혈구세포 수 (nRBC), 크레아티닌 (CRE), 및 혈액 요소 질소 (BUN)를 결정하였다. 꼬리 또는 복재정맥으로부터 혈액을 무균적으로 빼내어, 혈액 또는 혈청 수거 튜브 (BD, Franklin Lakes, NJ)에 넣었다. 주야 변동을 억제하기 위하여 오전 8:00와 오후 12:00 사이에 채혈하였다.
외과적 치료 시술:
마취/진정/무통: 26 게이지 바늘(IP)이 고정된 주사기로 0.05 cc (0.3 ㎎/㎖)의 부프레노르핀(Buprenex)를 우선 제공하여 외과 제조전에 랫트를 진정시켰다. 그 다음 4-5%의 이소플루란 챔버에 우선 넣고, 이소플루란 흡입 마취제를 통하여 마취시키고, 시술 내내 동안 노즈-콘을 통하여 이소플루란(3%)를 흡입시켜 마취를 유지시켰다. 각 랫트에게 외과술 후 2차 용량의 Buprenex을 제공하고 다음날 3차 용량을 제공하였다.
외과적 준비: 충분한 수준의 마취를 얻은 후(발가락-핀치에 의해 평가됨) 동물의 배를 깔고 드러눕히고, 우측 복부 측면은 칼리퍼 5로 면도를 하고, 베타딘(3 회) 및 에탄올 (4 회)로 중심 원을 그리면서 발랐다. 호흡을 정확하게 모니터할 수 있도록 멸균된 투명한 접착성 드레이프를 이용하여 무균 외과술을 위한 부위를 준비하였다.
신생-신장 세포 프로토타입 #1 (시험 대상물 #1, 또는 UNFX)의 직접 주입: 복강이 노출되도록 우측 복부 측면을 길이로 절개하였다. 남아있는 우측 신장을 분리시키고, 멸균 거즈 및 무딘 외과용 핀셋을 이용하여 복막으로부터 부분적으로 뽑아내었다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (prep RK40, 시험 대상물 1)을 부드럽게 현탁시키고, 23G 바늘이 부착되어 있는 단일 멸균 1cc 주사기에 넣었다(BD, Franklin Lakes, NJ). 100㎕의 세포 현탁액 (1000만개 세포)은 피질수질 졍션 부위를 표적으로 하여 바늘을 통하여 신장 유조직으로 서서히 전달되었다. 각 동물에 새로운 23G 멸균 바늘을 이용하였다. 바늘을 뺄 때 느린 출혈이 있기 때문에 주입 부위에 콜라겐 디스크 (GelFoam, 2mm x 2mm)를 두었다. 신장을 다시 복강에 넣었고, 수화를 위하여 1㎖의 따뜻한 멸균 염을 첨가하였다. 근육 벽은 4.0 Vicryl 봉합사를 이용하여 닫았고, 피부는 상처 클립으로 닫았다(Ethicon Inc, Somerville, NJ ). 외과술 후 산소를 투여하였고(흡입/노즈 콘을 통하여), 깨어나 의식이 있을 때까지 동물을 모니터하였다.
비계-기반의 시험 대상물의 외과적 전달 (#2 및 #3): 복강이 노출되도록 우측 복부 측면을 길이로 절개하였다. 남아있는 우측 신장을 분리시키고, 멸균 거즈 및 무딘 외과용 핀셋을 이용하여 복막으로부터 부분적으로 뽑아내었다. 남아있는 신장의 말단 극 부분을 위치시키고, 무딘 외과용 핀셋 또는 기술을 이용하여 심부 신장의 붉은 조직이 관찰될 때까지 들러붙어 있는 복부 지방을 부위로부터 잘라내었다. Sklar #10 외과용 매스(Sklar Scientific, West Chester, PA)를 이용하여 신장을 노출시켰고, 신장 유조직의 ~4×4 mm 부위가 노출되어 약간의 출혈이 있을 때까지 외과용 매스로 제거하였다. 단일 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (시험 대상물 #2) 또는 비계(시험 대상물 #3) 단독으로 양분하여(노출된 신장 유조직과 접촉하는 큰, 편평한 지점을 제공하기 위하여), 피브린 글루 (Ethicon Inc. Somervile, NJ)를 이용하여 제거된 부위에 부착시켰다(제거된 부위상에 절단 표면). 비계위로 복부 지방을 폴딩시키고, 신장 표면에 지방을 추가 피브린 글루로 밀봉시켜 부착된 비계에 추가 혈액 공급을 제공하였다. 출혈 증거를 위하여 ~1분간 신장을 관찰하였고; 임의의 출혈은 피브린 글루로 지혈시켰고, 부착된 비계가 있는 남아있는 신장을 다시 복강의 중앙 위치로 되돌렸다. 1.0 ml의 따뜻한 멸균 염을 IP 강에 첨가하여 수화를 도왔다. 근육 벽은 4.0 Vicryl 봉합사를 이용하여 닫았고, 피부는 상처 클립으로 닫았다(Ethicon Inc, Somerville, NJ ). 외과술 후 산소를 투여하였고(흡입/노즈 콘을 통하여), 의식이 돌아올 때까지 동물을 모니터하였다.
외과적 회복: 외과 수술후 모든 동물은 히팅 패드에 위치된 흡수성 패드(헐거운 배딩은 아님)가 있는 외과적 회복실에서 회복되었다. 일단 랫트가 움직이고 의식이 깨어나면 이들의 각 우리로 되돌려보내고, 그날 남은 시간 동안 및 다음날 맨 먼저 관찰하였다.
부검전 처치:
수영 지구력 시험: 큰 원형 금속 튜브 하나(140cm 직경×45 cm 깊이)에 물을 채우고, 32℃를 유지시켰다. 랫트를 탱크 아래로 향하도록 물에 서서히 넣고, 놓았다(한 번에 한 마리). 랫트를 놓아준 시점과 랫트가 수영을 멈추고, 물위에서 견딜 수 없게 되는 시간을 스톱워치로 측정하고 기록하였다. 면 타올을 이용하고 랫트를 닦고, 우리로 되돌려보내기 전에 가열 패드에서 회복하도록 두었다. 각 동물 시험 사이에 수조를 청소하여 배설물을 치우고, 온도를 점검하고 기록하였다.
최종 체중: 동물을 부검실로 이동시켰다. 분석용 저울을 이용하여 최종 체중을 측정하고 g 단위로 기록하였다.
안락사: 랫트를 CO2 챔버에 넣었다. 심한 통증 반사 없음과 안구 시험을 통하여 죽음을 확인하였다.
부검 시술:
심장천자/혈액 수거: 안락사시킨 랫트를 부검 테이블위에 두고, 혈청 및 혈액 수거 튜브로 혈액을 수거하였다. 혈청 시료를 회전시켰고, 전체 혈청 화학 패널을 위하여 혈청을 수거하였다. 전체 혈액학 패널을 위해 혈액 시료를 수거하였다.
조직 수확: 남아있는 신장(또는, 대조군 및 허위군은 전체 우측 신장에 대해)을 조심스럽게 제거하고, 무게를 측정하고, 길이로 양분하였다. 한쪽 절반을 10% 완충된 포르말린에 두고, 파라핀 임베딩 및 H&E 착색을 위해 프로세스시켰다. 다른 절반을 드라이아이스 상에서 미리-냉각된 틀의 OCT 임베딩 배지상에 두고 냉동하였다. 냉동된 신장 절반을 드라이아이스상에 유지시켰고, Y 염색체 분석을 위해 냉동된 절단면이 준비될 때까지 -80℃에 저장하였다. 부검시, 비장, 간, 심장, 폐를 제거하였고, 무게를 측정하였고, 각 조직의 작은 조각을 파라핀-임베딩 및 H&E 착색을 위해 10% 완충된 포르말린에 두었다. 끝으로, 대퇴부를 떼어내고, 연합된 간질조직을 제거하였다. 전단 관절구는 외과용 매스날로 면도하여 골수가 노출되도록 하였고, 전체 대퇴부를 파라핀 임베딩 및 H&E 착색 처치 전에 10% 완충된 포르말린에 두었다.
결과
생존: 신장적출된 랫트의 대부분은 연구 종료 후까지 생존하지 못하였다. 제1군, 5, 및 6는 84일 죽임을 당할 때 까지 생존하였다. 신장적출된 후 치료를 받지 않은 제4군의 랫트의 평균 생존 시간(일수)은 48.25±29.8일 이었다. 신장적출된 랫트가 비계만을 수용한 경우(제3군) 치료후 25일을 생존하였다. 신생-신장 구조체 프로토타입 #1를 제공받은 랫트(제2군)은 평균 57.5±14.3 일을 생존하거나, 또는 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트보다 9.25일을 더 생존하였다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1을 치료받은 제1군의 랫트는 연구 동안 생존하였고, 제5군 및 6 와 함께 84일(화살표)에 희생되었다(도 18).
체중: 연구 시작(Day 14)일부터 희생시점(Day 170)까지 매주 체중을 측정하였다. 각 군에 대한 체중 데이터(g)는 도 19에 나타낸다. 제5군 (대조군)의 랫트는 연구 동안 평균 56% (±5.5%) 증가가 있었고, 제6군 (허위)의 랫트는 평균 30.3% (±5.3%) 증가가 있었다. 신장적출된 모든 랫트(제1군-4)들의 연구 동안 체중 증가률은 상당히 낮았고, 제1군 (신생-신장 세포 프로토타입 #1)은 평균 13.5%의 증가, 제2군 (신생-신장 구조체 프로토타입 #1)는 평균 13.3% 증가, 제3군 (비어있는 비계)는 7.8% 증가, 및 제4군 (치료없음)는 13.7% 증가되었다. 치료 시점과, 희생 또는 죽음 시점 사이에 체중 증가를 검사할 때, 군간의 차이가 분명하였다(도 20). 제5군 및 6의 랫트는 치료 기간 (Day 83 - Day 170) 동안 각 11.9% 및 8.8%의 체중 증가가 있었고, 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트(제4군)는 평균 4.8%의 체중이 감소되었다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1, 구조체, 또는 비계 만을 제공받은 랫트(제1, 2, 및 3군) 또한 치료 기간 동안 체중 감소가 있었지만, 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트 만큼 감소된 것은 아니었다.
신장 기능 (BUN 및 크레아티닌)의 주간 평가: 4주부터 희생되는 170일 까지 연구하는 동안 매주 혈청으로부터 BUN 및 크레아티닌 측정을 하였다. 표 2와 3에는 각 랫트의 평균 데이터를 제공한다. 도 21 및 22은 차례로 군간에 시간에 따른 매주 평균으로 BUN 및 크레아티닌 측정을 나타낸다. 대조군과 허위군[BUN]은 연구동안 평균 19.1±1.9 이었다. 이식 시점(그래프에서 7주와 8주, 화살표)에서, 신장 적출된 모든 랫트에서 혈청 BUN이 상승되었고, 신장적출된 랫트의 평균 [BUN]은 53.3±19.9이었다. 연구 일정 동안, 제4군의 신장적출된 후, 치료를 받지 않은 랫트는 죽기 전까지 [BUN] 값이 계속 상승되어, 100을 넘었다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1로 치료한 후, 제1군 랫트는 14주까지 혈청 [BUN]이 안정화되었으며, 이 시점부터 희생되는 시점인 19주까지 [BUN]가 증가되었다. 신생-신장 구조체 프로토타입#1를 제공받은 제2군 랫트는 제4군보다 더 낮은 혈청 [BUN]을 가졌지만, 제1군과 같은 동일한 안정도를 보이지는 않았다. 비계만을 제공받은 제3군 랫트는 급격하게 상승된 [BUN]와 10주의 사망으로 설명되는 바와 같이, 시술 후에 급격하게 감소되었다.
각 군에서 혈청 크레아티닌 결과는 [BUN]에 대해 나타난 것과 동일한 치료 경향을 보인다(도 22). 연구 동안(7주-19주), 제5군의 대조군과 제6군의 허위 동물의 혈청 [크레아티닌]은 0.4±0.5에서 안정적이다. 대조적으로, 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 제4군의 랫트는 7주 연구 시작에 평균 [크레아티닌]이 1.38±0.75이었고, 사망시 최대 2.7까지 이르렀으며, 평균 2.6±0.15이었다. 사망시 접종된 비계 동물에서 평균 [크레아티닌]은 2.3 (std. 0.92)으로, 제4군보다 약간 개선된 것을 나타낸다. 흥미로운 것은 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (제1군)을 제공받은 신장적출된 랫트는 이식 시점(7주)의 [크레아티닌] 수준이 0.8±0.0에서 15주에 1.0±0.0으로 안정적이었고, 연구 종반(16-19주)을 향하여, 평균 1.3±0.18으로 약간 상승하였다.
연구 중간 시점(12주 및 13주)에서 BUN 및 크레아티닌 값의 검사와 (대조군 + 허위군 - 제5군 및 6)의 비율%로 나타낸 각 개별 랫트의 데이터는 각 군간에 다양성을 검사하는 수단이 된다(도 23 및 24). 12주 및 13 주에서, 신생-신장 ㄱ그ㄱ구조체 프로토타입 #1로 치료된 제2군의 랫트의 3/5는 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트보다 상당히 낮은 BUN 및 크레아티닌값을 가졌다. (2/2) 신생-신장 세포 -치료된 제1군(2/2)의 랫트는 제2군 또는 제4군보다 상당히 낮은 BUN 및 크레아티닌 값을 가졌다.
[표 2]
Figure 112018083309028-pat00002
[표 3]
Figure 112018083309028-pat00003
적혈구생성 (HCT, RBC, nRBC)의 주간 평가: 모든 데이터는 아래 표 4와 5에 제시한다. 7 주(치료 시점)부터 19주(연구 종료 시점)까지, 제5군의 대조군과 제6군의 허위군에 대한 평균 HCT는 차례로 46.9±0.8 및 46.2±1.2이었다. 대조적으로, 제4군의 치료를 받지 않은, 신장적출된 동물은 7주에 평균 HCT가 40±2.6이었고, 발병으로 인하여 희생될 때까지 급속히 감소하여, 희생될 때 평균 HCT는 35.6±1.8이었다. 제2군의 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 치료를 받은 동물에서 이들의 사망시점에 평균 HCT는 38.4±4.3이었으며, 이는 제4군보다는 개선되었지만, 제5군의 대조군에는 근접하지 못하였다. 흥미로운 것은, 신생-신장 세포 프로토타입 #1을 제공받은 제1군의 동물은 이식 전 평균(7주) 42.8±0.2에서 14주에는 제5군 및 6에 등가가 되는 HCT 값(48.9±0.4)이 개선되었다. 제1군의 HCT 값은 15 - 19주부터 점진적으로 감소되어, 희생될 때 평균 36.8±7.1이었다. 매주 평균 데이터를 도 25에 나타낸다. 개별 치료군에서 랫트 사이에 다양성이 어느 정도 높기 때문에, 개별 랫트 데이터를 이해하기 위하여 추가 포맷으로 HCT 데이터를 검토하는 것이 유용하다. 도 26a은 12주 및 13주에 대조군 %(대조군 % = 당해 날짜에 모든 대조군 및 허위군 동물로부터 얻은 평균값)으로 표시된 데이터로서, 모든 치료군으로부터 얻은 데이터를 제공한다.
RBC 및 핵이 있는 RBC (nRBC)를 또한 매주 측정하였다. 핵이 있는 RBC는 연구 동안 탐지되지 않았고, 그래프로 나타내지 않았다. 아래 표 5에 평균 데이터를 나타낸다. 7주(치료 시점)부터 19주(연구 종료)까지, 제5군의 대조군 및 제6군의 허위군에서 평균 RBC #는 8.32±0.2이었다. 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트는 7주 시점에서 평균 RBC #는 7.58 ±0.58이었고, 죽을 때까지 급격히 감소되어, 죽는 시점에서 평균 RBC #는 6.5±0.5이었다. 제2군의 신생-신장 구조체 프로토타입 #1으로 치료된 동물은 죽는 시점에서 6.94±0.7의 평균 RBC #을 가졌다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1을 제공받은 제1군의 동물은 8주에 RBC #가 6.71±2.53이었고, 18주에 8.03±0.32으로 일정하고 일관되게 개선되었다. 19주(연구 종료)에 평균 RBC #가 급격히 감소되었다(6.6±1.15). 일반적으로, 매주 평균 RBC 수를 HCT와 함께 추적하였다(도 27). 유사하게, 다양한 치료군에서 동물간에 다양성은 중간지점 그래프의 추가를 유용하게 하였고, 개별 동물에서 RBC # (12-13주)는대조군 % 로 나타낸다(도 28).
[표 4]
Figure 112018083309028-pat00004
[표 5]
Figure 112018083309028-pat00005
희생시에 혈액학 및 임상 화학
전해물 균형: 희생시점에서 칼슘, 칼륨, 염화물 및 인산염의 혈청 수준을 측정하였다(죽은 것으로 발견된 동물은 제외, 이들로부터 혈액을 수거하지 않음) 표 7a - 7c에 모든 데이터를 제공한다. 결과를 도 29에 요약하였다. 측정된 각 매개변수의 정상 범위는 그래프상에 두 개의 점선으로 나타내었다(정상 기준 범위는 Gad (ed.), Animal Models in Toxicology,2nd edition, (2008), Informa Healthcare USA, New York, NY)에서 취하였다). 신부전에서 일반적으로 칼륨, 나트륨, 및 인은 상승되며, 칼슘 및 염화물의 수준은 감소된다. 제4군의 신장적출된 랫트를 대조군과 비교하였을 때, 나트륨 및 인산염(그러나, 칼륨은 아님)은 상승되고 염화물 수준은 더 낮았다. 신장적출된 랫트에서 가장 일관된 전해질 균형은 염화물의 감소와 인 수준의 상승이었다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (제1군)으로 치료하면, 제4군와 비교하였을 때 인과 칼슘이 감소되었고, 염화물이 약간 상승되었다(도 30).
분석된 랫트에서 혈청 인 수준이 개별적인 것으로 간주되면, BUN, 크레아티닌, HCT, 및 RBC 값과 같이, 제2군 랫트는 반응에서 이질적이었는데, 2/4 랫트는 제5군 및 6의 대조군 및 허위군, 및 제1군의 신생-신장 세포 -치료된 랫트와 같은 낮은 인 수준을 나타내었다.
혈청 단백질: 희생시점에서 모든 랫트의 전체 혈청 단백질, 혈청 알부민, 및 혈청 글로불린 수준을 측정하였고, 단 채혈하지 않은, 죽은 것으로 발견된 랫트는 제외되었다. 제5군 및 6의 대조군 및 허위군의 랫트에서 혈청 알부민 및 글로불린은 정상 범위에 있었다. 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트는 대조군 및 허위 군과 비교하였을 때, 혈청 알부민 및 전체 단백질이 상당히 감소되었다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (제1군)에 의한 치료는 혈청 알부민 및 전체 혈청 단백질을 약하게 회복시켰다. (도 31). 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (제2군)로 치료해도 전체 혈청 단백질의 약한 회복을 초래하였다. 혈청 알부민 및 전체 단백질에 대한 개별 랫트 데이터는 도 32에서 대조군 %로 나타낸다.
간 기능: 비리루빈, AST, ALT, GGT, 및 ALP을 측정함으로써 간 기능이 평가되었다. 이들 시험의 모든 데이터는 표 7a - 7c에 나타낸다. 평균 혈청 AST는 제6 허위군 및 제1군 Nx + 신생-신장 세포 프로토타입 #1-치료를 받은 랫트에서는 보고된 정상 범위 이상이었다.(도 33). 제5군의 대조군은 제4군와 2와 같이 정상 범위에 있었지만, 다변성이 상당히 높았다. 제2군 (신생-신장 구조체 프로토타입 #1)를 제외한 모든 군은 랫트에 대해 보고된 정상 범위보다 더 높은 평균 혈청 ALT 및 ALP를 가졌다. 비리루빈 수준은 보고된 정상 범위내에 있었고, 치료군간에 차이는 없었다.
지질 및 당: 희생 시점에 동물로부터 채혈하여 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 포도당 또한 측정하였다. 부록 F에 표 형식으로 모든 데이터를 나타낸다. 치료와 관계없이 신장적출된 군 (1, 2, 및 4)에서 평균 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준 모두 상당히 상승되었다. 제1군 신생-신장 세포 프로토타입 #1-치료를 받은 랫트에서 트리글리세리드 평균은 대조군 및 허위군(제5군 및 6) 보다 상당히 높았고, 또한 제4군 및 2 (도 34)보다 더 높았다. 평균 혈청 포도당 수준은 모든 군에서 보고된 정상 범위보다 더 높았다. 제1군 신생-신장 세포 -치료를 받은 랫트는 대조군 및 허위군과 동등한 혈청 [포도당] 수준을 가졌고, 제4군 및 제2군은 약간 더 낮은 혈청 [포도당] 수준을 가졌다. 대조군+허위군 %로 나타낸 개별 랫트 데이터는 도 35에 나타내는데, 각 군간에서 동물 간에 가변성을 인지할 수 있을 것이다.
[표 7a]
Figure 112018083309028-pat00006
[표 7b]
Figure 112018083309028-pat00007
[표 7c]
Figure 112018083309028-pat00008
희생 시점에서 혈액학
헤모글로빈: 희생 시점에서, 수거한 혈액을 이용하여 헤모글로빈 (Hb), 평균 미립자 헤모글로빈 (MCH), 및 평균 미립자 헤모글로빈 농도 (MCHC)을 측정하였다. 표 7a - 7c에 모든 데이터를 제공한다. 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트는 대조군 및 허위군 비교하였을 때, 상당히 낮은 [hb](도 36)를 가지는데, 제4군에서 HCT 및 RBC # 모두 감소될 것으로 예상되었다. 제1군 과 제2군의 평균 [Hb]는 더 높았고, 많은 랫트는 정상 범위로 복귀되었다(도 37에 개별 데이터 참고). 모든 랫트에서 MCH는 상대적으로 동등하였고, 이것은 치료간에 RBC당 헤모글로빈의 농도는 유사하였다는 것을 나타낸다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1 또는 신생-신장 구조체 프로토타입 #1으로 치료된 제1군 및 제2군에서 증가된 [Hb]는 이들 랫트에서 RBC # 및 헤마토크릿의 증가와 일치한다. 이와 함께, 이들 데이터는 치료를 받은 랫트에서 적혈구생성 및 산소-운반 능력의 자극이 있음을 암시한다.
WBC 및 RBC 카운트 및 조성물: 희생 시점에서 모든 랫트의 백혈구 세포 카운트 (WBC) 및 적혈구세포 카운트 (RBC)를 하였고, 죽은 것으로 발견되어 채혈할 수 없는 랫트는 제외되었다. 표 7a - 7c에 모든 혈액학 데이터를 제공한다. 또한, 각 랫트의 전체 WBC 집단으로부터 림프구, 단핵세포, 호염기성세포, 호중성세포, 호산구, 및 거대 착색안된 세포 (LUCs)의 상대적 비율을 평가하였다. 도 38에서 나타난 바와 같이, 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트를 제외한 모든 군에서 평균 WBC는 정상 범위에 속했고, 제4군의 WBC는 감소되었다. 도 39는 군간에 WBC 조성물의 차이를 강조한다. 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트와 신생-신장 구조체 프로토타입 #1을 제공받은 제2군의 신장적출된 랫트 모두에서 상대적으로 낮은 림프구 %와 상대적으로 높은 호중구 %가 주목된다.
적혈구 집단에 대하여, 최종 채혈에서 망상 적혈구 수 및 비율을 측정하였다(도 40). RBC 및 HCT는 이미 보고되었다(도 26-29). 망상 적혈구 수 및 비율은 제5군 및 6의 대조군 및 허위군과 비교하였을 때, 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트에서 감소되었다. 치료군 (1 및 2)은 제4군와 비교하였을 때, 약간 개선되었지만, 차이는 통계학적으로 유의하지 않다. RDW(RBC 폭의 가변성을 측정) 및 MCV (평균 미립자 용적)도 평가되었지만, 군간에 유의적인 차이는 없었다(데이터 제시하지 않음). 모든 혈액학 데이터는 표 7a - 7c에 제공한다.
혈소판: 희생될 때 채혈한 혈액에서 혈소판 카운트 및 평균 혈소판 용적 (MPV)을 측정하였다. 혈소판 카운트는 모든 군에서 보고된 정상 범위보다 약간 높았다. 치료군간에 혈소판 카운트 또는 MPV의 유의적인 차이는 없었다 (도 41).
수영 지구력: 연구 종료시, 84일 희생 직전, 남아있는 랫트는 방법 부분에서 설명된 바와 같이 수영 지구력 시험을 받았다. 수영 시험은 제1군의 신생-신장 세포 -치료를 받은 랫트와 대조군 및 허위군(제5군 및 6) 사이에서 실시되었다. 도 42에서 나타난 바와 같이, 건강한 랫트는 평균 2분 12초 수영하였고, 랫트간에 적당한 다양성은 있었다(±33 초). 이 시험은 제1군의 신생-신장 세포 치료를 받은 랫트의 수준이 대조군과 동등하다는 것을 확인하였다.
조직병리학
각 검사된 조직으로부터 대표적인 도면을 도 43-46에서 볼 수 있다. 다음은 군간 각 조직에 대한 발견을 요약한 것이다.
간: 제5군 및 6의 대조군 및 허위군과 비교하였을 때, 제4군 (Nx) 또는 제2군 (Nx + 신생-신장 구조체)에서 간 유조직 및/또는 문맥삼조에서 감지할 수준의 변화는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 파형 조혈(sinusoidal hematopoiesis)의 초점 지역이 제1군 (Nx + 신생-신장 세포) 랫트에서 기록되었다.
신장: 제5군 및 6과 비교하였을 때, 모든 다른 시험군은 신장의 진행성 사구체 및 세뇨관 퇴행과, 구조의 상실을 나타내었고, 피질과 수질의 경계가 불충분하며, 담낭 공간, 사구체-주변 섬유화, 사구체 다발이 무혈성 유리질 물질로 대체, 헤모시드린 색소, 및 다초점 세뇨관 재생을 특징으로 한다.
비장: 제5군 및 6의 대조군 및 허위군과 제1군 (Nx + 신생-신장 세포 주입) 사이에 주요한 조직학적 차이 또는 변화가 관찰되지는 않았다. 제2군 및 4 동물의 후낭하 적색수질 공간(subcapsular red pulp space)의 검사에서 성인기 적혈구세포 (RBC) 및 RBC 전구물질은 차례로 중간 정도의 감소 및 급격한 감소를 보였다.
골수: 제5군 및 6의 대조군 및 허위군과 비교하였을 때, 제1군 랫트의 골수 세포질 및 적혈구에 대한 골수의 비율은 동등한 것으로 나타났다. 대조적으로, 제2군 및 제4군 동물의 골수는 차례로 골수 세포질이 중간정도의 감소 및 급격한 감소를 특징으로 하였다. 도 26에 나타난 바와 같이, 요독증/빈혈 랫트에게 신생-신장 세포를 생체로 제공하면 골수에 자극 효과가 있었고, 특히 적혈구 집단에 자극 효과가 있었다. 도 26에서는 또한 요독증/빈혈 랫트에게 신생-신장 세포 을 생체로 제공하면 전반적인 세포질의 증가를 촉진시켰고, 전달후 최소 3개월은 지속되었다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (UNFX) 단독으로 제공되거나 또는 3D 비계에서 제공되면, 5/6 외과적 신적출 모델에서 적혈구 생성 및 적혈구 항상성에 복원 효과를 가졌다(RBC # 및 HCT의 일시적 분석에 의해 결정되며, 다른 매개변수들(Hb, MHC, 망상 적혈구)에 의한 말단 혈액검사로 확인되었다 효과는 동물간에 다소 가변성이 있었고, 특히 제5군의 신생-신장 구조체 프로토타입 #1-치료를 받은 랫트에서 가변성이 있었고, 신장에 의한 비계의 유지에 가변성 또는 신장 유조직내 비계 붕괴의 미확인된 복잡성으로 인한 것일 수 있다. 중요한 것은, 임의의 한 마리 랫트에서, HCT 또는 크레아티닌의 개선은 RBC # 및 BUN에 대한 개선된 값으로도 해석될 수 있고, 이는 치료가 전반적으로 긍정적 효과를 가진다는 관찰에 추가적인 힘을 실어 준다. 도 47은 각 랫트에서 혈청 [크레아티닌]에 대해 HCT 데이터를 플롯한 것이다. 모든 제5군 및 6의 대조군 및 허위군은 더 높은 HCT와 더 낮은 크레아티닌에 해당 되는 상부 우측 사분면에 밀집해있다. 제1군과 제2군 랫트의 2/2 및 2/5는 제5군 및 제6군과 함께 우측 상부 사분면으로 분리된다. 제2군 치료를 받은 랫트의 1/3은 제4군와 비교하였을 때, 개선된 크레아티닌을 보이지만, HCT는 개선되지 않았고, 따라서 상부 좌측 사분면에 나타난다. 제2군의 남아있는 랫트(2)는 이들중 어느 매개변수에서도 개선이 거의 없거나 또는 개선이 없었고, 따라서, 제4군의 랫트와 함께 하부 좌측 사분면(높은 크레아티닌, 낮은 HCT)에 밀집해있다.
결론적으로, 상기 결과는 신생-신장 세포 이식물(제1군)은 신장적출된 랫트 5/6의 생존을 개선시켰다. 제1군의 랫트 2/2는 치료후 3개월 시점에 도달하여 84일에 대조군 및 허위군과 함께 희생되었다. 신생-신장 세포 이식물(제1군)은 대략 12주간 이 모델에서 빈혈증을 역전시켰고, 이것은 HCT 및 RBC값이 정상 범위로 복귀되어 증명되었다. 추가적으로, 도 47은 요독증/빈혈 랫트에게 생체내에서 신생-신장 세포 프로토타입 #1를 제공하면, 헤마토크릿이 정상적인 수준으로 복귀되며, 치료를 받지 않은 요독증/빈혈 랫트보다 생존이 촉진되었다. 또한, 상기에서 볼 수 있는 바와 같이, 12주 기간 동안 신생-신장 세포 이식물은 적혈구 항상성을 조절하였고, 이것은 빈혈증의 과잉수정을 위한 치료의 실패 및 진성적혈구증가증을 초래된 것으로 증명된다. 흥미로운 것은, 신생-신장 세포 이식물은 신장 기능을 안정화 시켰는데, 이것은 치료 시점부터 12주간 혈청 BUN 및 CREA의 안정화로 증명된다. 연구 중간 시점에서 신생-신장 구조체 프로토타입 #1는 2/5 랫트의 HCT 및 신장 기능 안정화를 모두 개선시켰다. 병으로 인한 랫트의 사망 시점에서, 신장 기능 및 적혈구 기능은 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트의 병으로 인한 사망시점에서 비교하였을 때, 더 우수한 것으로 나타났다. 이들 실험에 이용된 배양된 신생-신장 세포 의 관찰된 이질성 성질과 이식후 치료 효과의 명백한 관찰은 집단내에서 치료 효과의 전달을 담당하는 특정 세포의 성분을 확인하는데 원동력을 제공하였다.
상기 결과는 또한 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (2/2) 및 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (3/5)의 운반시 HCT 및 RBC 수에 대해 명백하고, 유의적인 긍정적 효과가 관찰되었음을 보여준다. 신생-신장 세포 프로토타입 #1의 긍정적 효과는 신속하며(치료후 1주일 이내) 및 치료후 3개월까지 지속적되었다. 본 연구에서 또한 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (2/2) 및 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (3/5)은 신장적출된 후, 치료를 받지 않고 남겨둔 랫트와 비교하였을 때, 질환의 진행을 더 느리게 하고, 신장 기능을 안정화시켰다는 것을 보여주었다. 추가로, 신생-신장 세포 프로토타입 #1 (2/2)은 골수에서 적아구(erythroblasts)를 자극하여 희생 시점(치료후 3개월)에서 정상적인 세포질 및 M:E 비율을 초래하였다는 명백한 조직학적 증거를 제시한다. 더욱이, 신생-신장 구조체 프로토타입 #1 (제2군) 랫트는 희생 시점에서 정상적인 골수 조직을 제공하지 못하였지만, 세포질 및 적혈구 계통 세포의 존재는 제4군의 신장적출되고, 치료를 받지 않은 랫트보다 우수하였다. 본 연구에서 수득한 조직학적 증거는 또한, 제2군의 신생-신장 세포가 신장의 일부 측면에서 약한 조직학적 개선을 자극하였고, 이는 이식 부위 부근의 세뇨관 재생의 작은 포켓에 의해 판단되었다. 그러나, 이와 같은 변화는 미약하고, 신장 전체로 확산되지 않았다. 이론에 결부되지 않고, 신장 기능에서 전신적으로 볼 수 있는 임의의 개선은 제2군 랫트에서 개별 세포 수준의 효과 때문이며, 조직의 조직학적 수준에서 충분히 감지되지 않을 수도 있다. 끝으로, 상기 연구는 신생-신장 세포 프로토타입 #1 및 신생-신장 구조체 프로토타입 #1가 수명을 연장시키고, 신생-신장 세포 프로토타입 #1-치료를 받은 랫트는 연구 동안(3개월) 살아있었다는 것을 보여준다. 신장적출된 랫트의 모든 군이 연구 동안 치료 일과 희생 일 사이에 체중 증가는 실패했지만, 신생-신장 세포 프로토타입 #1으로 치료된 군은 체중 감소가 더 적었다.
실시예 8 - 신장 세포 분리 및 이질성 세포 집단으로부터 특정 생체활성 신장 세포의 농축
신장 세포 분리: 간략하게 설명하면, 2-주령의 Lweis 수컷 신장 10개 배취를 상업적 공급업자(Hilltop Lab Animals Inc.)로부터 구하여 4℃ 온도에서 Viaspan 보존 배지를 이용하여 하룻밤동안 운반하였다. 여기에서 설명된 모든 단계는 무균을 유지하기 위하여 생물학적 안정성 캐비넷(BSC)에서 실시되었다. 신장을 Hank 균형된 염 용액(HBSS)으로 3차례 세척하여 Viaspan 보존 배지를 씻어낸다. 세 번째 세척후, 남아있는 신장 캡슐 및 남아있는 간질조직도 제거된다. 마이크로 절단 기술을 이용하여 주요 신배(calyx) 또한 제거하였다. 그다음 신장을 멸균 외과용 메스를 이용하여 잘게 다져서 슬러리로 만들었다. 그 다음 슬러리를 50ml 원뿔 원심분리 튜브로 옮기고, 중량을 측정하였다. RNA용으로 작은 시료를 수거하였고, RNAse 없는 멸균된 1.5㎖ 마이크로-원심분리 튜브에 두고 액화 질소로 순간 냉동시켰다. 일단 냉동되면, 분석시까지 -80℃ 냉동기로 이동시켰다. 10마리의 젊은 랫트의 신장의 조직 중량은 대략 1g이었다. 배치(batch) 중량에 기초하여, 조직 1g당 분해 배지 20㎖가 전달되도록 분해 배지를 조절하였다. 이 시술의 분해 완충액은 4U의 Dispase 1(Stem Cell Tech)/HBSS, 300U/ml의 콜라게나제 타입 IV (Worthington) 및 5mM CaCl2 (Sigma)을 포함한다.
튜브에 사전-데워진 분해 용액의 적정 용적을 첨가하였고, 그 다음 밀봉하고, 20분간 37℃ 배양기내 록커(rocker)에 두었다. 제1 분해 단계는 많은 적혈구 세포를 제거하고, 남아있는 조직의 분해를 강화시킨다. 20분 후, 튜브를 빼내고, BSC에 두었다. 조직이 튜브의 바닥으로 가라앉도록 둔 후, 상청액을 제거하였다. 그 다음 나머지 조직에 조직 용적과 동일한 새로운 분해 완충액을 보충하였다. 튜브를 다시 추가 30분간 37℃ 배양기내 록커에 두었다.
30분후, 분해 혼합물은 70㎛ 세포 스트레너(strainer: BD Falcon)를 이용하여 동량의 중화 완충액 (DMEM w/ 10% FBS)으로 피펫하여 분해 작용을 중단시켰다. 세포 현탁액을 그 다음 5분간 300×g에서 원심분리에 의해 세척하였다. 원심분리후, 펠렛을 20㎖ KSFM 배지에 다시-현탁시키고, 세포 카운팅과 트립판 블루 배제법을 이용하여 생존 평가를 위한 시료를 확보하였다. 세포 카운트가 계산되면, RNA용으로 백만개 세포를 수거하고, PBS로 세척하고 액화 질소에서 순간 냉동시켰다. 남아있는 세포 현탁액을 KSFM 배지과 함께 50㎖로 만든 후 300×g에서 5분간 원심분리하여 다시 세척하였다. 세척 후, 세포 펠렛을 KSFM ㎖당 1,500만개 세포의 농도로 재현탁시켰다.
신장 세포 현탁액 5㎖를 다시 15㎖ 원뿔 원심분리 튜브(BD Falcon)안에 30% (w/v) Optiprep® 5㎖에 첨가하였고, 6회 위아래로 흔들어 혼합시켰다. 이로써 15% (w/v)의 Optiprep®의 최종 혼합물이 형성되었다. 튜브의 역위 후, 튜브위에 1㎖ PBS를 조심해서 적층시켰다. 튜브를 브레이크없이 15분간 800×g에서 원심분리시켰다. 원심분리후, 튜브를 제거하고, 혼합 구배 상부에 세포 밴드가 형성되었다. 또한 적혈구세포, 죽은 세포, 및 약간의 작은 저 입도 세포, 약간의 EPO를 생산하는 세포, 약간의 세뇨관 세포, 및 약간의 내피 세포를 함유하는 살아있는 소집단 세포를 함유하는 펠렛도 있었다. 피펫을 이용하여 밴드를 조심스럽게 빼내고, 또 다른 15㎖ 원뿔 튜브로 옮겼다. 흡인을 이용하여 구배 배지를 제거하고, 펠렛을 수거하여 1 ㎖ KSFM에 다시 현탁시켰다. 밴드 세포와 펠렛 세포를 복합시켜, KSFM를 이용하여 수거된 밴드 용적의 최소한 3 희석도로 재현탁시키고, 5분간 300×g에서 원심분리를 통하여 세척하였다. 세척 후, 세포를 20㎖의 KSFM에 재현탁시켰고, 세포 카운팅을 위하여 시료를 수거하였다. 트립판 블루 배제법을 이용하여 세포 카운트가 계산되면, RNA 시료용으로 백만개 세포를 수거하여, PBS로 세척하고 액화 질소에서 순간 냉동시켰다.
밀도 구배 분리를 이용하여 특정 생체활성 신장 세포의 생존능 및 배양 능력을 강화시키기 위한 배양전 "클린-업": 배양을 위하여 깨끗한 살아있는 세포 집단을 얻기 위하여, 우선 "신장 세포 분리"에서 설명한 바와 같이 세포 현탁액을 만들었다. 선택 단계로 및 초기 준비물의 청소 수단으로, 멸균 등장성 완충액에 현탁된 최대 1억개의 전체세포를 실온에서 60% (w/v) 요오딕사놀 원료로부터 제조된 동량의 30% Optiprep®으로 1:1 혼합하고(따라서 최종 15% w/v Optiprep 용액이 수득된다), 6회 역위(위아래 뒤집어)시켜 완전하게 혼합시켰다. 혼합후, 1㎖ PBS 완충액을 혼합된 세포 현탁액의 상부에 조심스럽게 적층시켰다. 그 다음 구배 튜브를 신중하게 원심분리기에 넣고, 균형을 맞추었다. 구배 튜브를 브레이크 없이 25℃에서 800×g에서 원심분리시켰다. 청소된 세포 집단 (살아있는 및 기능을 하는 집합 도관, 세뇨관, 엔도크린, 사구체, 및 도관 세포을 함유하는)은 6% 및 8% (w/v) 사이의 Optiprep®(1.025 - 1.045 g/㎖ 내지 밀도에 상응함)에서 분리되었다. 다른 세포 및 잔해는 뷰트의 바닥에 펠렛화되었다.
신장 세포 배양: 조직 배양 처리된 삼중 플라스크 (Nunc T500) 또는 이의 등가물상에 항생제/항진균제와 함께 5% (v/v)FBS, 2.5㎍EGF, 25㎎ BPE, 1×ITS (인슐린/트란스페린/아셀렌산나트륨 배지 보충제)를 함유하는 DMEM(고포도당)/KSFM 50:50 혼합물 150㎖에 ㎠당 30,000개의 세포 농도로 복합된 세포 밴드 및 펠렛을 도말하였다. 세포에게 21% 대기중 산소 수준을 제공하는, 가습된 5% CO2 배양기에서 2-3일간 세포를 배양시켰다. 이틀 후, 배지를 교체하였고, CO2/질소 다중 가스 가습된 배양기(Sanyo)에 의해 제공되는 2% 산소 수준 환경하에 배양물을 24 시간 두었다. 24시간 배양 후, 60㎖의 1×PBS 로 세포를 세척하고, 40㎖ 0.25% (w/v) 트립신/EDTA (Gibco)을 이용하여 제거하였다. 제거시, 세포 현탁액을 10% FBS를 함유하는 KSFM의 동량의 용적으로 중화시켰다. 그 다음 세포를 10분간 300×g에서 원심분리시켜 세척하였다. 세척 후, 세포를 20㎖의 KSFM에 재현탁시켰고, 50㎖ 원뿔형 튜브로 옮기고, 세포 카운팅을 위하여 시료를 수거하였다. 트립판 블루 배제법을 이용하여 살아있는 세포 카운트가 계산되면, RNA 시료용으로 백만개 세포를 수거하였고, PBS로 세척하고 액화 질소에서 순간 냉동시켰다. 세포를 다시 PBS에서 세척하였고, 5분간 300×g에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세척된 세포 펠렛은 3,750만 세포/ml의 농도로 KSFM에 재현탁시켰다.
밀도 층 구배 분리를 이용한 특정 생체활성 신장 세포의 농축:
주로 신장 세뇨관 세포를 포함하나, 다른 세포 유형(집합 도관, 사구체, 도관, 및 엔도크린)의 작은 하위 집단도 함유하는 배양된 신장 세포를 요오딕사놀 (Optiprep)의 다중 농도 w/v로 만든 밀도 층 구배를 이용하여 이들의 구성 하위 집단으로 분리하였다. 배양물을 수거하기 전 최대 24시간 동안 저산소 환경에 두었고, 구배에 적용시켰다. 멸균 15㎖ 원뿔 튜브에 서로의 상부에 4가지 상이한 밀도 배지를 적층시켜, 바닥은 최대 밀도의 용액이 있고, 최저 밀도 용액은 상부에 있는, 층이 형성된 구배가 만들어졌다. 층 구배의 상부에 세포를 제공하고, 원심분리시키면 이 집단은 크기 및 입도에 기초하여 다중 밴드로 분리되었다.
간단하게 설명하면, 희석제로 KFSM 배지를 이용하여 7%, 11%, 13%, 및 16% Optiprep®(60% w/v 요오딕사놀)의 밀도를 만들었다. 예를 들면, 7%(w/v) Optiprep® 50㎖의 경우, 5.83㎖의 60% (w/v) 요오딕사놀 원액을 44.17㎖의 KSFM 배지에 첨가하고 역위에 의해 잘 혼합시켰다. 멸균 모세관 튜브에 연결된 멸균 L/S 16 Tygon 튜브가 장착된 튜브연동 펌프(Master Flex L/S)는 분당 2㎖의 유속으로 설정해두고, 16% 용액을 시작으로, 13% 용액, 11% 용액 및 7% 용액 순으로 네 가지 각 용액 2㎖을 멸균된 15 mL 원뿔 튜브에 로딩시켰다. 끝으로, 7500만의 배양된 설치류 신장 세포를 함유하는 2㎖ 세포 현탁액을 층 구배의 상부에 로딩하였다(신장 세포 배양에서 설명된 바와 같이 현탁액이 만들어졌다). 중요한 것은 펌프가 튜브로 구배 용액을 전달하기 시작할 때, 구배의 각 층사이에 경계면이 형성되도록, 유체가 45°각으로 튜브의 측면으로 서서히 흘러가도록 하였다. 세포가 로딩된 층 구배를 그 다음 브레이크없이 20분간 800×g에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 각 경계면이 교란되지 않도록 튜브를 조심스럽게 제거하였다. 다섯 개의 별도 세포 분취물을 얻었다(4개 밴드 및 펠렛) (B1 - B4, + 펠렛) (도 48, 좌측 원뿔 튜브). 멸균된 일회용 벌브형 피펫 또는 5㎖ 피펫을 이용하여 각 분취물을 수거하였고, 표현형 및 기능에 따라 특징화하였다(실시예 10 참고). 설치류 신장 세포 현탁액을 분리직후 층-구배 분취하면, 세뇨관 세포에 대해 풍부한 분취물(집합 도관으로부터 일부 세포를 함유하는)은 1.062 - 1.088 g/㎖ 사이 밀도에서 분리된다. 대조적으로, 밀도 구배 분리가 생체외 배양 후에 실행되면, 세뇨관 세포에 대해 풍부한 분취물(집합 도관으로부터 일부 세포를 함유하는)은 1.051 - 1.062 g/㎖ 사이 밀도에서 분리된다. 유사하게, 설치류 신장 세포 현탁액을 분리후 층-구배 분취하면, EPO를 생산하는 세포, 사구체 발세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한 분취물("B4")은 1.025 - 1.035 g/㎖ 사이 밀도에서 분리된다. 대조적으로, 밀도 구배 분리가 생체외 배양 후에 실행되면, EPO를 생산하는 세포, 사구체 발세포, 및 도관 세포에 대해 풍부한 분취물("B4")은 1.073 - 1.091 g/㎖ 사이 밀도에서 분리된다. 중요한 것은, 수거 및 층-구배 과정 이전에 저산소 배양 조건(저산소 조건은 21%(대기중 산소 수준)미만으로 정의됨)에 배양물을 노출(약 1시간 내지 약 24시간 동안)시키면, 배양 후 ‘B2’ 및 "B4" 분취물로의 분배가 강화되었다(밴드 분포에 있어서 저산소 효과에 대한 추가 상세한 내용은 실시예 9에 제공된다).
각 밴드를 KSFM의 용적 3배로 희석시켜 세척하였고, 잘 혼합하고, 300×g에서 5분간 원심분리시켰다. 펠렛을 2㎖의 KSFM에서 재현탁시키고, 트립판 블루 배제법 및 혈구계산기를 이용하여 살아있는 세포를 카운트하였다. RNA 시료용으로 백만개 세포를 수거하였고, PBS로 세척하고 액화 질소에서 순간 냉동시켰다. B2 및 B4의 세포를 Charles River Laboratories에서 2단계 5/6 신적출 시술을 이용하여 생성된 요독증 및 빈혈이 있는 암컷 랫트로의 이식 연구에 이용하였다. 에리트로포에틴 및 vEGF의 산소에 의해 조절된 발현, 사구체 표식(네프린, 포도신)의 발현, 및 도관 표식(PECAM)의 발현을 포함한 B4의 특징은 정량적 실시간 PCR에 의해 확인되었다. ‘B2’ 분취물의 표현형은 E-캐드헤린, N-캐드헤린, 및 아쿠아포린-2의 발현을 통하여 확인되었다. 도 49a 및 49b 참고.
따라서, 층 구배 방법을 이용하면, EPO를 생산하는 세포(B4)의 흔치 않은 집단에 대한 농축을 허용하고, 기능을 하는 세뇨관 세포 (B2)의 상대적으로 풍부한 분취물도 만든다(도 50 및 51 참고). 층 구배 방법은 또한 적혈구세포, 세포의 잔해, 및 다른 잠재적으로 바람직하지 않은 세포 유형, 가령, 거대 세포 응집체 및 특정 타입의 면역세포로부터 EPO를 생산하는 세포 및 세뇨관 세포를 분리할 수 있다.
층 구배 시술은 세포의 성분들의 양호한 구별을 위하여 이용되는 특정 밀도에 대해 조율을 요구할 수 있다. 구배를 조율하기 위한 바람직한 방법은 1) 바닥은 고밀도 구배(예를 들면, 16-21% Optiprep)이고, 구배 상부쪽으로 갈수록 상대적으로 낮은 밀도의 구배 (예를 들면, 5-10%)가 되는 연속적 밀도 구배로 이어지게 하는 것을 포함한다. 연속 구배는 표준 방법(Axis Shield)에 따라 임의의 표준 밀도 구배 용액 (Ficoll, Percoll, 슈크로즈, 요오딕사놀)으로 만들 수 있다. 관심 세포를 연속 구배에 로딩시키고, 브레이크 없이 20분간 800×g에서 원심분리시켰다. 유사한 크기 및 입도의 세포들은 구배에서 함께 분리되는 경향이 있고, 구배에서 상대적 위치를 측정할 수 있으며, 그 위치에서 용액의 상대 밀도를 측정할 수 있다. 따라서, 결과적으로, 특정 조건하에 밀도 구배를 횡단하는 세포의 능력에 근거하여 특정 세포 집단을 분리시키는 특정된 층 구배가 유도될 수 있다. 건강하지 않는 조직과 건강한 조직으로부터 세포를 분리할 때, 또는 상이한 종으로부터 특정 세포를 분리시킬 때 이와 같은 최적화를 이용할 필요가 있을 것이다. 예를 들면, 랫트에서 확인된 특정 B2 및 B4 하위집단을 다른 종으로부터 분리가능하도록 갯과 동물과 인간 신장 세포 배양에서 최적화가 실행되었다. 설치류 B2 및 B4 하위집단의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 11%, 13%, 및 16%(w/v) Optiprep으로 구성된다. 갯과 동물 B2 및 B4 하위집단의 분리를 위한 최적 구배는 7%, 10%, 11%, 및 16%(w/v) Optiprep으로 구성된다. 인간 B2 및 B4 하위집단 분리를 위한 최적 구배는 7%, 9%, 11%, 16%(w/v)으로 구성된다. 따라서, 배양된 설치류, 갯과 동물, 및 인간 신장 세포로부터 B2 및 B4의 국소화용 밀도 범위는 표 8에서 제공된다.
[표 8]
종 밀도 범위
Figure 112018083309028-pat00009
실시예 9 - 구배 전에 저-산소 배양은 밴드 분포, 조성물 및 유전자 발현에 영향을 준다.
프로토타입 B2 및 B4의 분포 및 조성물에 산소 조건의 효과를 판단하기 위하여, 상이한 종으로부터 제조된 신생-신장 세포 준비물을 구배 단계 이전에 상이한 산소 조건에 노출시켰다.
상기에서 설명된 바와 같이 랫트 세포 분리 및 배양 개시를 위한 표준 시술을 이용하여 설치류 신생-신장 증대(NKA) 세포 제제(RK069)를 조제하였다. 모든 플라스크를 21% (대기중) 산소 조건에서 2-3일을 배양시켰다. 배지를 교체하였고, 플라스크의 절반은 2% 산소로 설정된 산소-조절된 배양기에 다시 두었고, 나머지 절반은 21% 산소 조건에서 추가 24시간 동안 유지시켰다. 그 다음 상기에서 설명된 효소에 의한 표준 수확 시술을 이용하여 각 설정 조건으로부터 세포를 수거하였다. 표준 시술에 따라 층 구배를 준비하였고, "정상 산소 농도" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 배양물을 별도로 수거하여, 동일한 층 구배에 나란하게 제공하였다 (도 71). 두 조건 모두에서 4개 밴드와 펠렛이 생성되었지만, 21% 및 2% 산소-배양된 배취에서 구배에서의 세포 분포는 상이하였다(표 1). 특히, 저산소에서 B2의 수율은 증가되었고, 동시에 B3는 감소되었다. 더욱이, B4-특정 유전자 (에리트로포에틴과 같은)의 발현은 저산소-배양된 세포로부터 생성된 구배에서 강화되었다(도 73).
상기에서 설명한 바와 같이, 갯과 동물 세포 분리 및 배양 개시를 위한 표준 시술을 이용하여 갯과 NKA 세포 준비물 (DK008)을 제조하였다. 모든 플라스크를 21% (대기중) 산소 조건에서 4일을 배양시켰고, 일부분의 플라스크를 24시간 동안 저산소(2%)로 이동시켰고, 일부분의 플라스크는 21% 산소 조건에 유지시켰다. 후속적으로 각 플라스크 세트를 수거하였고, 동일한 층 구배에 적용시켰다. 랫트의 결과와 유사하게(실시예 1), 저산소-배양된 개의 세포는 대기중 산소에서 배양된 개 세포와는 상이하게 구배에 분포되었다(표 9). 다시, 동시에 B2 수율은 구배 전에 저산소에 노출되어 증가되었으며, B3로의 분포는 감소되었다.
[표 9]
Figure 112018083309028-pat00010
상기 데이터는 구배 전에 저산소에 노출시키면, B2의 조성물을 강화시킬 뿐만 아니라 특화된 세포 (에리트로포에틴을 생산하는 세포, 도관 세포, 및 사구체 세포)의 B4로의 분포도 강화된다는 것을 보여준다. 따라서, 상기에서 설명된 바와 같이, 저산소 배양과 이어서 밀도-구배 분리는 종간에 ‘B2’ 및 ‘B4’ 세포 집단을 생성시키는데 효율적인 방법이다.
실시예 10 - 신부전 및 빈혈증의 랫트 모델로 신생-신장 프로토타입을 이식
마우스 신장 세포의 1차 배양물이 Epo mRNA 및 단백질을 발현시키는 것을 보여준 2008년에 고유 조직으로부터 Epo를 생산하는 세포의 분리 및 증식이 처음으로 설명되었다(Aboushwareb, T, et al. World J Urol, 26: 295-300, 2008). 결과적으로, 유사한 세포 분리 및 배양법을 랫트, 돼지, 인간 신장 조직에 적용시켰으며, 검사된 모든 종의 배양물은 Aboushwareb et al에서 설명하는 세뇨관 세포를 주로 포함하지만, 사구체 세포, 집합 도관 세포, 및 도관 세포의 집단도 포함되는 EPO를 발현시키는 작은 하위 집단을 함유하는 다양한 세포 유형으로 구성된다는 것이 밝혀졌다. 예비 실험에서, 요독증/빈혈 랫트에게 생체내에서 이질성 세포 배양물을 이식시키면 신장 여과의 안정화, 적혈구 항상성의 회복 및 전반적인 생존이 개선되었다. 이들 데이터는 집합적으로 생체활성 세포의 성분이 이질성 1차 신장 배양물 내에 있으며, 유의한 치료 효과를 전달할 수 있다는 것을 나타내었다.
본 연구의 목적은 시험관에서의 특화된 기능적 특징 및 생체내에서 번역 증거에 기초하여 이질성 신장 세포 배양물 내에 포함된 생체활성 세포의 성분들을 확인하는 것이다. 세뇨관 풍부한 하위분취물 (B2)과 산소에 의해 조절된 EPO를 생산하는 세포, 사구체 세포, 및 도관 세포를 함유하는 하위 분취물(B4)은 모두 여과, 적혈구생성, 및 유기체-수준의 기능을 평가하는 임상 매개변수 범위에 걸쳐 이질성 혼합물(UNFX)보다는 더 효과적이며 더 내구성이 있다는 것이 밝혀졌다. 여기에서 각 하위분취물의 특이적인 시험관 특징 및 생체내에서 실행능을 제시한다.
신생-신장 세포의 이질성 집단의 특정 성분들의 특정 효과를 판단하기 위하여, B4 (EPO를 생산하는 세포, 사구체, 및 도관 세포에 대해 풍부한) 및 B2 (세뇨관 세포에 대해 농축되었으며, EPO를 생산하는 세포, 사구체, 및 도관 세포는 고갈된) 분취물을 만들었고, 신부전 및 빈혈증 랫트 모델로 이식하였다. 하기 표 10에 연구 계획이 나와있다.
조직 획득 및 1차 세포 배양
Hilltop Labs에서 구입한 Lewis 수컷 제공 랫트로부터 1차 신장 세포 배양물을 얻었다. Hypothermasol (BioLife Solutions)에서 4℃로 견본을 운반하였고, 수거후 24시간 이내에 수령하였다. 이미 공개된 방법에 따라(Aboushwareb, T, et al. World J Urol, 26: 295-300, 2008), 1차 신장 세포를 분리시켰고, 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플라스크 또는 배양접시에 항생제/항진균제(Invitrogen)와 함께 5% (v/v)FBS, 2.5㎍ EGF, 25㎎ BPE를 함유하는 DMEM(고포도당)와 1×ITS (인슐린/트란스페린/아셀렌산나트륨 배지 보충제)를 함유하는 KSFM 50:50 혼합물에 ㎠당 30,000개 세포 농도로 21% 대기중 산소 수준을 제공하는 5% CO2 배양기에서 배양시켰다. 저산소에 노출시키는 실험을 위하여, 분석을 위해 세포를 수거하기 전 24시간 동안 37℃, 저산소(2%) 조건으로 배양물을 이동시켰다. 수거 또는 연속 계대를 위하여, 배양된 세포를 0.25% 트립신 EDTA를 이용하여 분리시켰다. 유전자 발현 분석을 위하여 수거된 시료를 액화 질소에서 순간 냉동시키고, RNA 분리전 -80℃에 보관하였다. 배양후 세포의 분취(12, 28, 36)에 맞게 표준 밀도 구배 기술을 개조하여, 세뇨관, 도관, 집합 도관, 사구체, 및 산소에 의해 조절된 Epo를 생산하는 세포를 함유하는 특정 신장 세포 유형에 대해 풍부한 하위분취물을 만들었다. 간단하게 설명하면, 멸균된 등장성 완충액에서 7-16%(v/v) 범위 농도의 요오딕사놀 (OptiprepTM)을 사용하여 다층 구배를 준비하였다. 저산소에 노출된 세포를 층 구배의 상부에 적층시키고, 브레이크 없이 25℃에서 20분간 800×g로 원심분리시켰다. 상부(B1)로부터 하부 (B4)까지 세포 분취물(원심분리후 구배에 밴드로 나타남)을 연속 수거하였다. 트립판 블루 배제법을 통하여 생존능력을 평가하였고, 혈구계산기를 이용하여 수작업으로 수를 헤아렸다.
시험 대상물: 아래에 신장으로 전달되는 세포의 프로토타입이 명시되어 있다. 하위집단 B2 및 B4의 투여량은 상기 실시예 7에서 시험되는 이질성 세포 혼합물에 이들의 상대적인 정량적 분포에 근거하여 선택되었다.
UNFX는 신장 조직의 분리 및 시험관 배양을 통하여 생성된, 비-분취된, 신장 세포의 이질성 혼합물로 구성된다. 분리 및 배양 조건은 주로 세뇨관 세포를 포함하거나, 집합 도관, 사구체, 엔도크린, 도관, 및 다른 세포 유형의 더 작은 하위 집단도 함유하는 세포 균주의 확립에 선호적이다.
B2는 UNFX의 상대적으로 풍부한 하위집단이며, 시험관에서 강력한 알부민-흡수를 할 수 있는 전단 세뇨관 세포, 일부 말단 세관 및 집합 도관 상피 세포를 포함하고, 소량의 다른 세포 유형을 포함한다.
B4는 UNFX의 흔치 않은 하위집단이며, 저산소-반응성 EPO를 발현시키는 세포, 및 사구체 발세포, 특화된 도관 세포, 및 B2 또는 UNFX와 비교하였을 때 전방 및 측면 산란(크기 및 입도)이 적은 것을 특징으로 하는 세포 집단에 대해 풍부한다.
면역세포화학
B2 및 B4의 세포를 구배후 계대배양되고, 면역세포화학을 이용한 전단 및 말단 세뇨관 표식의 발현에 의해 특징화 된다. 96-웰 조직 배양 처리된 평판(BD Falcon 353219)에서 웰당 10,000개 세포의 밀도로 접종시키고, 85% 합류되도록 배양시켰고, 얼음 냉각된 아세톤/메탄올 1:1 혼합물에서 실온, 10분간 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS (Gibco)로 2회 세척시키고, 0.5% BSA (Sigma)를 함유하는 PBS에서 10분간 차단시켰다. 차단된 세포에 N-캐드헤린 IgG1 (BD Biosciences 610921)에 대한 1차 마우스 단클론 항체와 E-캐드헤린 IgG2a (BD Biosciences 610182)으로 3㎍/㎖/4℃/하룻밤동안 동시에 공동 라벨시켰다. 이소타입-일치된 대조군 (마우스 골수종 IgG1 (Zymed 02-6100) 및 마우스 골수종 IgG2a (Zymed 02-6200)) 또한 3㎍/㎖/4℃/하룻밤동안 제공되었다. 1차-라벨된 세포를 PBS로 3회 세척하였고, 빛을 차단시킨 실온에서 30분간, 2차 항체: 염소 항-마우스 IgG1 Alexa488 (Molecular Probes A21121) 및 염소 항-마우스 IgG2a Alexa 647 (Molecular Probes A21241)를 이용하여 모두 1㎍/㎖의 농도로 라벨시켰다. PBS로 세포를 3차례 세척하고, BD Pathway 855 BioImager (Becton Dickinson)를 이용하여 영상화하였다.
유전자 발현
ABI의 목록에 있는 Taqman 프로브 및 프라이머 세트와 ABI-Prism 7300 Real Tim PCR System (Applied Biosystems; Foster City, Ca)을 이용한 정량적 실시간 PCR(qRT PCR)을 통하여 표적 유전자의 발현 수준을 검사하였다. 풍부하게 발현된 유전자에 대한 내생성 대조군으로 18s rRNA를 이용하였고, 펩티딜프로일 이소메라제 B (PPIB)를 이용하여 존재도가 낮은 전사체를 표준화시켰다. 다중 칼리브레이터를 이용하여 전체 신장 조직 및 OriGene Technologies (Rockville, MD)에서 구입한 Origene 신장 cDNA를 포함하는, 표적 전사체의 상대적인 양을 비교하였다. 다음의 Taqman 프라이머 및 프로브 세트는 ABI (Foster City, Ca)로부터 구입하였다. 에리트로포에틴, Rn01481376_m1; 저산소 유도성 인자 2 알파 (HIF2α) Rn00576515_m1; Kdr, Rn00564986_m1; E-캐드헤린, Rn00580109_m1; 쿠비린, Rn00584200_m1; CYP2R1, Rn01423150_m1; 네프린, Rn00575235_m1; 포도신, Rn00709834_m1; Custom SRY: 포워드 프라이머 AAGCGCCCCATGAATGC: 리버스 프라이머 AGCCAACTTGCGCCTCTCT: 프로브 TTTATGGTGTGGTCCCGTG-MGB.
외과적 시술 및 생체내에서 분석
2-단계 5/6 신적출 (5/6 Nx)을 받은 Lewis 암컷 랫트를 Charles River Laboratories (CRL)로부터 구입하였고 및 Research Triangle Institute, International (RTI)으로 운반하여, 랫트를 가두고, 모니터하고, 다양한 치료 시술을 받게 했다(치료군 및 상세한 내용에 대해서 표 10 참고). 외과적 시술에 따라, 매주 혈청학 분석을 통하여 치료전 요독증을 확인하였다. 동물의 안녕은 해당 Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) of CRL and RTI에 의해 감시되고, 보호된다. 랫트는 마취전에 이소플루란 챔버(4-5%)에서 안정시키고, 외과적 시술에서는 노즈-콘을 통하여 투여되는 이소플루란 흡입(3%)하에 유지시켰다. 우측 복부 측면 절개를 통하여 남아있는 신장으로 세포를 바로 전달하였다. 23G 바늘(Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ)이 장착된 멸균된 1cc 주사기를 통하여 100㎕의 멸균된 염으로 실질조직에 세포(5×106 UNFX 또는 B2; 1×106 B4)를 이식시켰고(Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) 및 이식후 최대 6개월 동안 연구하였다. 세포 전달 후, 1㎖의 따뜻한 멸균된 염을 수화를 위하여 복강에 첨가하였고, 근육층은 4.0 Vicryl 봉합사를 이용하여 닫았고, 피부는 상처 클립을 이용하여 닫았다(두 가지 모두 Ethicon Inc, Somerville, NJ). 외과술후 산소를 투여하였고(흡입/노즈 콘을 통하여), 눈을 뜨고, 의식이 있을 때까지 동물을 모니터하였다. 외과술 후 랫트에게 바로 복막을 통하여 0.5cc의 (0.3 ㎎/㎖) 부프레노르핀(Buprenex)을 제공하였다. 다음 날, 랫트의 통증 조절을 위하여 0.6 ㎖ (1㎎/㎖)의 Tramadol(경구 위관영양을 통하여)를 투여하였다. 재조합 인간 Epo (R&D Systemss)을 제공받은 랫트에게 복막 주입을 통하여 100 IU/kg 또는 500 IU/kg으로 매주 2차례 투여하였다. 연구 동안 혈액 및 혈청 분석을 위하여 꼬리 정맥 또는 오비탈 출혈을 통하여 채혈하였다. BUN, sCREAT, HCT, 및 RBC #를 매주 추적하였고, 완전한 혈청 및 혈액학 패널은 기준 시점(치료전), 연구 중간 시점(12-14주) 및 부검시에 실시되었다. 부검시, 신장, 심장, 간, 및 비장의 무게를 측정하였고, 냉동 및 포르말린-고정된/파라핀-임베드된 절단면에 이용하였다. 조직병리학적 분석을 위하여 대퇴골 및 흉골을 수거하였고, 고정 전에 골수가 노출되도록 주의하였다. 체중은 매주 점검하였다.
다음의 랫트 번호를 가진 제1군 RK 68 마리 랫트에서 외과술/채혈이 실시되었다: 66, 36, 59, 46, 63, 34, 32, 79, 54, 43, 67, 52, 76, 51, 78, 44, 62, 48, 69, 71, 74, 33, 77, 81, 82, 83, 86 및 87. 다음의 랫트 번호를 가진 제2군 RK 69 마리 랫트에서 외과술/채혈이 실시되었다: 68, 38, 70*, 37, 31, 65, 45, 41, 64, 42, 50, 35, 58, 80, 56, 57, 72, 75, 49, 61, 39, 55, 84, 85, 88, 89 및 90. 다음의 랫트 번호에서 RK 70 외과술이 실시되었다: 70 및 65.
신장 및 뼈의 조직병리학적 평가
부검 후, 남아있는 신장의 중량을 측정하였고, 길이방향으로 이분하였다. 절반은 냉동 절단 준비물, DNA 및 RNA 분리를 위하여 이용하였고, 남아있는 절반은 24시간 동안 10% 완충된 포르말린에 두고, 그 다음 조직병리학 실험실(Premier Laboratories, Colorado)로 운반하기 위하여 70% 에탄올로 이동시켰다. 조직을 탈수시키고, 파라핀에 임베드시키고, 5 미크론 절단면으로 자르고, 헤마토실린 및 에오신(H&E), Masson 트리크롬, Periodic Acid Schiff(PAS)로 착색시키고, 이들 모두 표준 실험실 시술에 따랐다. 좌측 대퇴골을 수거하였고, 상기에서 설명된 시술을 이용하여 조직학 분석을 위해 사용하고, H&E 착색시켰다. 사구체 손상은 간세포기질(mesangial matrix)에서 분절성 사구체 경화의 증가 및/또는 토리뭉치(glomeruluar tuft)의 흡착 및/또는 Bowman 캡슐의 농화와 함께 유리질 침착(hyalinosis)을 특징으로 한다. 세뇨관 손상은 세뇨관 위축, 팽창, 림프구의 축적, 관내 단백질 원주(casts)의 축적, 세뇨관 괴저 및 간질 섬유증을 특징으로 한다. 대퇴부 절단면의 현미경 평가는 H&E 착색을 이용하여 실시하였다. 골수 세포질에서 임의의 증가/감소 및 적혈구에 대한 골수 비율의 임의의 증가/감소에 대해 절단면을 원본의 200×및 400×원본 확대로 검사하였다.
측정: 동물의 체중을 매주 측정하였다. 2주마다 한번씩 혈청 및 혈액 분석으로 이식 전후 살아있을 때 신장 기능 (BUN 및 CREAT) 및 적혈구생성 (HCT 및 RBC)을 평가하였다. 완전한 혈청 및 혈액학 패널을 기준 시점, 6주, 12주 및 부검 전에 실시하였다. 부검 시, 기관(신장, 간, 비장, 심장, 폐)의 무게를 측정하였고, 조직학을 위하여 수거하였다. 조직학 및 골수 도말 분석을 위하여 대퇴 골수를 수거하였다.
[표 10]
연구안
Figure 112018083309028-pat00011
결과
후보 생체활성 세포 집단 (B2 및 B4)의 생성 및 구분된 특징
생체 준비 조사에서 신장 기능을 강화시킬 수 있는 생체활성 세포는 배양된 신장 세포의 이질성 집단(UNFX)내에 포함되어 있다는 것이 분명하다(실시예 7 참고). 기존 연구에서 UNFX 집단의 전달에 영향을 받은 임상적인 매개변수에 기초하여, 신장 항상성에 영향을 주는 국소 후보 세포 집단은 기능을 하는 세뇨관 세포 (크레아티닌 배출 및 단백질 보류의 개선에 근거하여), 사구체 세포 (단백질 보류의 개선에 근거하여), 및 피질수질 정션의 매우 특화된 산소-반응성 Epo를 생산하는 세포(적혈구생성 복원에 근거하여)였다 (Maxwell, PH, et al. Kidney Int, 52: 715-24, 1997, Obara, N, et al. Blood, 111: 5223-32, 2008). 세뇨관, 사구체, 및 Epo를 생산하는 세포의 존재는 랫트 및 다른 종에서 만들어지고 증식된 신장 배양물에서 확인되었다. 밀도 구배 방법(Qi, W, et al. Nephrology (Carlton), 12: 155-9, 2007, Gesek, FA, et al.. Am J Physiol, 253: F358-65, 1987, McLaren, J, et al. Hum Exp Toxicol, 14: 916-22, 1995)을 UNFX 이질성 세포 집단의 확립된 배양으로부터 별도 세포 하위분취물의 반복 생성이 가능하도록 개조 및 최적화시켰다. 하위분취물은 서로 구별되며, 이들의 기능, 분자 및 표현형 특징에 근거하여 UNFX와도 구별되며, 두 개의 하위분취물 (B2 및 B4)은 추가 시험관 및 생체 연구를 위한 생체 활성 후보로 선택되었다.
하위분취물 B2는 UNFX 혼합물의 주요 성분(약 20% 내지 약 50%)이며, UNFX의 확립된 및 확장 배양물에서 주요 세포 유형이 되는 세뇨관 세포에 대해 상대적 농축에 근거하여 선택되었다. 표적화된 유전자 발현 분석을 실시하여 하위분취물 B2 및 B4에 대한 주요 세포 격실의 상대적인 분포를 평가하였다. 하위분취물 B2은 도관 세포 (kdr+), 사구체 세포 (nephrin+, podocin+), 및 Epo를 생산하는 세포가 상대적으로 고갈되어 있었다(도 74d-h). 임상적으로-관련된 세뇨관 세포 기능과 연관된 두 개의 전단 세뇨관 표식, 비타민 D 수산화효소 (CYP21R) (4.3×농축) 및 쿠비린(3.0×농축)은 B2에 상당히 농축되어 있었다. 말단 세뇨관 세포 (E-캐드헤린+) 및 집합 도관 세포 (D. biflorus agglutinin+, Aquaporin-2+)의 대부분(75%초과)은 하위분취물 B1에 국소화되어 있었지만, 알부민-운반 쿠비린+ 세포의 상대적 부재와 다른 바람직하지 못한 특징으로 인하여 본 연구의 추가 평가에서는 선택되지 않았다. 그러나, B4와 비교하였을 때, 말단 세뇨관 표식, E-캐드헤린은 B2에 상대적으로 농축되어 있었다(1.6×)(도 74c).
정량적 차등적 유전자 발현 데이터는 표 형태로 제시된다(도 74i). B2 및 B4의 전단 및 말단 세포의 성분들의 상대적 분포는 N-캐드헤린 (전단) 및 E-캐드헤린 (말단)에 대한 면역형광 착색을 통하여 단백질 수준에서 정량적으로 확인되었다(도 74j, k). 전단 세뇨관 세포와 연관된 주요 기능은 사구체 여과물로부터 알부민의 수용체 매개된 재흡수이며, 이에 따라 단백뇨의 감소 및 혈청 단백질 항상성에 기여한다(7). 쿠비린/메갈린 매개된 알부민 흡수(45)를 포착하기 위한 기능적 분석을 개조하여 B2 하위분취물의 쿠비린을 발현시키는 세포에서 강력한 단백질 운반 활성을 확인하였다(도 75a). 대조적으로, 쿠비린 단백질 발현 및 알부민 흡수는 B4 하위분취물에서 드물게 탐지되었고(도 75a), 이는 유전자 발현 수준에서 관찰된 B2와 B4가 차등적인 세포 조성물임을 나타낸다. 세뇨관 세포에서 수용체 매개된 운반은 활성 운반의 저온 억제(hypothermic inhibition)에 의해 상당히 감소되었으며(데이터를 나타내지 않음), 및 경쟁적 억제제, 수용체 연합된 단백질 (RAP)(30)의 쿠비린/메갈린 매개된 세포내이입을 차단시켜 흡수 특이성을 확인하였다(도 75a).
B4 하위분취물은 비-분취된 (UNFX) 세포 집단의 희귀 성분 (10%미만)을 나타내며, 몇 가지 특화된 세포 유형으로 구성되었으며, 이들 모두 시험관 특징에 근거하여 명백한 이론적 치료 가치를 가졌다. B4 하위분취물은 저산소-반응성 Epo를 생산하는 세포, 사구체 발세포 및 도관 기원 세포가 상대적으로 풍부한 것에 기초하여 선택되었다(도 74-76). UNFX 집단의 유동세포분석에 따르면 Epo를 발현시키는 세포는 UNFX 집단에서 세뇨관 세포와 구별되며, 작은 세포 (낮은 전방 산란)와 낮은 입도 (낮은 측면 산란)로 추가 특징화되었다(34). B4 하위분취물은 저산소 자극에 반응하여 Epo 발현을 상당히 상향조절하는 작은, 저입도 세포에 대해 ~15×농축되었다(도 74g, h, i, 도 75b). B4 하위분취물은 또한 사구체 발세포 (네프린 및 포도신)에 대해 ~200×농축되었고, 도관 세포 (Kdr)에 대해 ~15×농축되었다 (도 74i).
진행성 신부전이 있는 랫트에서 B2 및 B4의 생체 기능 비교.
생존 및 체중 증가
UNFX 세포의 신장내 이식과 관련된 예비 조사에서 UNFX 집단은 정위형(orthotopic) 이식후 3개월 동안 여과/소변 생산을 안정화시키고, 적혈구 항성성을 복귀시킬 수 있는 생체활성 세포를 포함한다고 제안되었다. B2 (알부민 흡수) 및 B4 (산소에 의해 조절된 Epo 생산)의 세포 조성물 및 기능적 속성은 생체내에서 관찰된 각 개선된 여과 및 강화된 적혈구 생성을 잠재적으로 담당하는 UNFX 집단의 생체활성 성분들의 추가 연구용 하위분취물 후보가 되었다. 2-단계 5/6 신적출을 통하여 요독증/빈혈이 있는 암컷 랫트를 만들었고, 손상후 5-6주 시점에서 진행성 질환 상태가 확립된 후, 공동유전적 수컷 세포를 정위적으로 전달하였고, 이 시점에서 신장적출된 랫트의 혈청 크레아티닌 수준은 이미 건강한 대조군의 >250% (0.76 ± 0.02 vs. 0.3 ± 0.00) 및 헤마토크릿은 8% 감소되었다(41.8 ± 0.67 vs. 45.6 ± 0.70). UNFX 세포는 기존 연구와 마찬가지로 전달되었고, B2 및 B4 하위분취물은 UNFX 집단에 이들의 상대적인 분포에 근접한 용량으로 운반되었다; B2는 랫트 한마리당 5×106, 및 B4는 랫트 한마리당 1×106. 추가 대조군은 운반 운반체만(PBS)을 포함하며, 재조합 인간 Epo 단백질 (rEpo)은 100 IU/kg 및 500 IU/kg의 용량으로 매주 2회 투여되었다. 조작되지 않은 건강한 대조군 및 허위 Nx 랫트는 연구 동안 살아있었다(신적출 후 30 주). 기존 연구에 의해 예상된 바와 같이, 치료를 받지 않은 Nx 랫트의 100%는 신적출 시술의 22주 이내에 죽었다(도 76a); 치료군 중에서, B2-치료를 받은 랫트의 100%가 치료후 6개월 생존하였고; B4-치료된 및 UNFX-치료된 군의 6개월 생존은 각각 20% 및 0% 였다. 100 IU/kg rEpo로 치료된 랫트는 치료후 6개월 생존율이 25% 였고, 이것은 B4(Epo를 생산하는 세포 분취물)로 치료된 경우와 유사하다. 대조적으로, 500 IU/kg rEPO로 치료하면, 죽음이 가속화되었고; 치료를 받은 랫트의 100%는 투약 요법 시작 14주 이내에 죽었고, 대부분은 죽을 때 심각한 빈혈증을 가지고 있었다. 특히, 고용량(500 IU/kg) rEPO은 1개월 동안 건강한 대조군의 >125% 수준으로 HCT 및 RBC를 상승시켰고, 이어서 심각한 빈혈증 및 사망으로 이어졌지만, 저용량(100 IU/kg) rEPO는 1개월 동안 HCT 및 RBC를 높은 정상 범위내에 유지시켰고, 3개월 까지 랫트의 75%는 빈혈증이 있었다(도 53 - 55 참고). 재조합 EPO를 4주 이상의 반복 투여하여도 6/8 랫트에서 적혈구 생성을 지원하지 못하였다. rEpo 치료후 생존이 낮은 것은 rEpo에 대항하는 항체의 발생 및 골수 고갈의 복합 때문인 것으로 보이며, 이것은 인간 Epo에 대항한 면역에서 이미 설명된 것과 일치한다(Campeau, PM, et al. Mol Ther, 17: 369-72, 2009).
도 52에 나타난 바와 같이, EPO 풍부한 (B4) 세포는 두 가지 상이한 용량(높은(1M) 및 낮은(0.1M))에서 실행되었고 및 16주에 재조합 EPO 부분을 능가하였다. 특히, 아래 표 11에 나타난 바와 같이, 헤마토크릿은 EPO 풍부한 세포에 의해 정상적인 건강한 수준의 95%로 회복되었다. 더욱이, 재조합 EPO 단백질과 비교하여, EPO 풍부한 세포가 전달되었을 때, 결과의 다양성은 훨씬 적었다.
치료 후 16주에 측정된 체중 증가는 비-EPO 풍부한 치료군보다 EPO 풍부한 치료군에서 또한 개선되었다(도 58 참고). 건강한 대조군 및 허위군 Nx 랫트는 전체 연구 진행 과정에서 체중이 평균 30% 증가되었지만, 치료안된 Nx 랫트는 사망시 이들의 초기 체중보다 평균 5% 감소되었다(도 76b). 대조적으로, B2-치료를 받은 랫트는 치료후 6개월 동안 평균 14.3% 체중이 증가되었고(p < 0.0001) (도 76b), 이것은 음식물 섭취 및 전반적인 행복에 있어서 유기체 수준의 상당한 개선이 있었다는 것을 나타낸다. B4 및 운반체 또한 Nx 동물보다는 상당히 높은 체중 증가를 보였다 (B4: p = 0.0239; 운반체: p = 0.0125). 만성 고혈압은 CKD의 원인 및 결과가 될 수 있다; 병인과 무관하게 장기간 전신 고혈압은 심장에 과도한 부담을 주고, 실질적인 좌심실 비대(LVH)로 인하여 상대적인 심장비대를 초래한다(Foley, RN, et al. Kidney Int, 47: 186-92, 1995). 신적출의 설치류 모델에서 고혈압 및 LVH가 확인되었다 (Amann, K, et al. Nephrol Dial Transplant, 13: 1958-66, 1998). 본 연구에서, 부검시에 심장 중량 및 체중 데이터를 수집하여, 심장비대/LVH가 Lewis 랫트에서 2-단계 5/6 신적출-유도된 신부전의 특징인지, 및 어떤 치료가 이와 같은 비대성 반응을 감소 또는 경감시킬 수 있는 지를 판단하였다. 정상적인 동물과 비교하여, Nx 랫트의 심장 중량은 50% 증가되었지만, B2 치료된 랫트는 치료 후 6개월시점에 상대적인 심장 중량이 겨우 25% 증가되었다(P < 0.0001) (도 76c). B2의 치료 효과로 명백하지는 않지만, B4 및 운반체 치료는 모두 치료를 받지 않은 Nx 대조군 보다는 상당히 적은 심장 중량을 얻었다. 이와 같은 데이터들은 집합적으로 신장에 의해 조절된 심혈관 기능의 치료-의존적 강화를 뒷받침한다.
요독증 및 빈혈증의 진행
상기에서 설명된 바와 같이, 2-단계 5/6 신적출을 받은 랫트는 신적출 후 5-6주 시점에 요독증 및 빈혈이 있었고, 다양한 치료물이 전달되었다. 기저수준(이식전) 및 연구 동안 매주, 요독증은 sCREAT 및 BUN을 통하여 평가되었으며, 적혈구생성은 HCT 및 RBC #를 통하여 평가되었다.
군간에 성과의 통계학적 평가는 치료 후 10-20주에, 확실한 비교가 가능하도록 각 군에서 살아있는 랫트의 수가 충분할 때, 모든 데이터를 이용하여 실시하였다. JMP version 7.0(SAS Institute Inc, Cary, NC)을 이용하여 10 주 내지 20주 시료의 혈청 화학 결과를 Variance의 일원 분석하였다. 이 시간 범위에서 치료군 사이에 유의적인 차이가 관찰되었다: 상부 패널, BUN (p<0.0001); (도 77d), 크레아티닌 (p<0.0001) (도 77e). BUN 및 CREAT 수준의 10-20주 측정치의 ANOVA분석에서 B2 및 B4 세포로 치료된 Nx 랫트는 Nx 단독 및 Nx + Unfx 세포와 비교하였을 때, 신장 여과의 안정화 및 BUN 및 CREAT 수준이 더 낮았고, 이것은 치료가 전반적으로 신보호(renoprotective) 효과가 있음을 나타낸다. B2 및 B4 프로토타입으로 치료된 Nx 랫트의 혈액학적 매개변수들도 개선되었다. 이 시간 범위에서 치료군 사이에 유의적인 차이가 관찰되었다: RBC (p<0.0029) (도 77a); HCT (p=0.0005) (도 77b). 데이터에서는 B2-치료를 받은 랫트를 Nx 및 UNFX와 비교하였을 때, 더 높은 평균 HCT 및 RBC 수(도 77a-c) 및 더 낮은 평균 CREAT 및 BUN 수준을 가졌으며(도 77d-f), 이것은 B2가 UNFX의 강력한 생체활성 성분이며, B2 하위분취물 (UNFX의 다른 성분들 없이)의 전달로 치료 반응의 규모 및 내구성이 연장되었다는 것을 명백히 보여주었다. 이와 같은 유기체의 관찰은 B2 치료를 받은 동물의 사구체, 세뇨관 세포 및 네프론 구조가 고유의 것들과 유사하다는 조직학적 증거에 의해 뒷받침되며, 이러한 것들은 다른 군에서는 관찰되지 않았다. B4는 여과 기능에 유의적으로 영향을 주지 않았지만, RBC # 및 HCT의 상당한 강화로 예시된 바와 같이(도 77a-c), B4 치료에 의해 적혈구 생성이 자극되었다. 재조합 Epo를 규칙적으로 투여하면 단기간 적혈구생성 자극을 초래하였고, 초기 적혈구가 증가되었고, 이어서 심각한 빈혈증이 있었으며, 결국 약물을 제공받은 랫트의 대부분(7/8)이 죽음에 이르게 되었다. 본 연구의 전반적인 나쁜 성과는 아마도 면역-적격 랫트에서 인간 EPO 단백질에 대한 항체의 발생 때문일 것이다.
도 57에서 나타난 바와 같이, 치료 후 12주 시점에 수영 지구력 시험을 받게 하였을 때, 신장적출된 (NX) 랫트는 건강한 랫트보다 더 짧은 시간 동안 수영하였다. 비풍부한 신생-신장 세포로 치료된 랫트는 NX 랫트보다 평균 더 오래 수영하였지만 상당한 가변성이 있었다. 대조적으로, 고용량의 B4 세포로 치료된 랫트는 대조군과 거의 같은 시간 동안 수영하였고, 치료군 간에 최소한의 다양성을 가졌다. 치료된 군의 모든 랫트는 신장적출된 후, 치료를 받지 않은 랫트보다 더 오래 생존하였다.
[표 11]
치료후 12-14주에서 건강한 대조군 %로서의 임상 값.
Figure 112018083309028-pat00012
Figure 112018083309028-pat00013
치료를 받지 않은 요독증 랫트에 비하여 치료를 받은 랫트에서 향상된 세뇨관-연관 기능
단백질 처리 및 지질 대사
대부분의 랫트가 여전히 살아있고, 시료 수거에 이용될 수 있는 시점에서 치료군 간에 추가 비교를 하기 위하여, 연구 중간 시점(치료 후 12-14주)에서 포괄적인 임상 화학 분석을 완료하였다(도 78a). 도 78에 나타난 바와 같이, B2 치료는 진행성 신부전의 5/6 Nx 모델에서 신장에 의한 단백질 처리를 강화시켰고, 이상지질혈증을 개선시켰다. 허위 NX, NX, NX+VEH, NX+UNFX, NX+B2, 및 NX+B4는 건강한 대조군에 대해 표준화시켜, 12-14주 시점에서 비교하였다(위 표 11 참고). 혈청 알부민 및 알부민/글로불린 (A/G) 비율은 건강한 대조군과 비교하여 치료를 받지 않은 Nx 랫트에서 차례로 30% 및 34% 감소되었으며, 심각한 단백질 상실은 CKD의 5/6 Nx 모델의 특징이라는 것이 설명된다(도 78). B2로 치료하면, 혈청 알부민 수준이 상당히 증가되었는데(p < 0.05), 이것은 사구체 여과 기전의 개선된 보전 및/또는 세뇨관 상피에 의한 알부민의 강화된 재흡수를 암시한다(도 78a, b). 이와 같은 관찰은 Nx 동물과 비교하여 B2로 치료된 동물의 혈청 A/G 비율이 상당히 증가된 것으로 추가 확인되었다(p < 0.001)(도 78a, b). 흥미로운 것은, B2 치료와 연합된 생체내 관찰은 B2의 주요 시험관 특징, 즉, 단백질 운반 수용체 (쿠비린/메갈린)의 강력한 발현 및 강력한 수용체 매개된 알부민 흡수와 일치한다(도 75a에서 설명됨).
고지혈증은 인간 CKD의 잘-정리된 특징이며 (23) 및 CKD의 랫트 5/6 신적출 모델(Kasiske, BL, et al. Circ Res, 62: 367-74, 1988)에 있다(도 78a, c). 중간 시점 임상 화학에서 B2 치료는 혈청 트리글리세리드의 Nx-유도된 상승을 개선시켜, 정상 수준으로 되돌렸다(도 78a, c). B2-치료를 받은 랫트에서 혈청 콜레스테롤 또한 감소되어, Nx 군에서 건강한 대조군의 >250% 인 것과 비교하였을 때, 건강한 대조군의 150% 수준으로 감소되었다(도 78a, c). 혈청 콜레스테롤의 개선은 아마도 B2 치료에 의한 신장 여과 기능의 개선을 통하여 더 많은 콜레스테롤이 제거되는 간접적 원인때문일 수 있다. 중간 시점 임상 분석은 소변 생산과 관련된 매개변수들(sCREAT, BUN, 혈청 알부민, A:G 비율), 적혈구생성 (HCT, RBC #), 미네랄 균형(칼슘:인), 및 지질 대사(트리글리세리드, 콜레스테롤)를 포함하는 광범위한 관련 임상 매개 변수를 통하여 신장 기능의 개선에 있어서 생체 활성이 있다는 관찰을 뒷받침한다.
도 59-61는 또한 연구 중간 시점에서, 세포 프로토타입 #4 (B2) (세뇨관 풍부한 세포)로 치료된 요독증 랫트는 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 비교하였을 때, 시간 경과에 따른 개선된 혈청 크레아티닌, 안정화된 혈청 알부민 및 거의 정상에 가까운 인:칼슘 비율을 나타내었다. 도 61은 세포 프로토타입 #2 (1M 용량의 EPO 풍부한 세포)로 치료된 요독증 랫트는 또한 거의 정상적인 인:칼슘 비율을 가진다는 것을 보여준다. 도 62-63은 치료를 받지 않은 랫트와 비교하여 치료를 받은 랫트에서 지질 대사가 개선되었음을 보여준다. 도 11은 세포 프로토타입 #2 (B4 HIGH) 및 #4 (B2)로 치료를 받은 요독증 랫트는 더 낮은 혈청 콜레스테롤 수준 및 더 낮은 혈청 트리글리세리드 수준을 가진 것을 보여준다(도 62-63 참고). 도 64 및 65는 세포 프로토타입 #2 (B4 HIGH) 및 #4 (B2)으로 치료를 받은 요독증 랫트에서 정상 랫트의 95% 이상으로 증가된 헤모글로빈 수준 및 헤마토크릿 수준을 보여주는데, 이것은 적혈구 자극의 전신적 증가를 보여주는 것이다.
신장 종괴(renal mass)는 신장 기능과 상관있다.
신장에서 B2 세포 전반의 장기적 효과는 치료 후 6개월 간 전신 및 조직학적 분석에 의해 명백해지는데(도 76-79), 이들 세포가 직간접적으로 복구 및/또는 재생을 제공하여, 기능을 하는 신장 종괴의 보존 및/또는 신형성을 초래한다는 것이다. Y 염색체에 국소화된 유전자인 SRY용 프로브와 PCR-기반 DNA 분석을 이용하여, 수거 시(치료 후 6개월) 암컷 신장 조직에서 수컷 B2 제공 세포가 유지되어 있는지를 확인하였고, 이 시점에서 본 발명의 방법에 의해 평가된 숙주 신장에서 수컷 세포 분포는 상대적으로 낮았다(~1%) (도 80 참고). 남아있는 신장(Nx, B2, B4, 및 UNFX) 또는 고유한 (건강한 대조군 및 허위군 Nx) 우측 신장으로부터 사후 신장 종괴를 측정하였다. 치료를 받지 않은 Nx의 남아있는 신장은 허위 대조군과 비교하였을 때, 신장량이 평균 43% 감소되었지만, 정위적으로(orthotopically) B2 세포를 제공받은 남아있는 신장에는 허위 대조군에 상당하는 평균 신장 종괴가 있었다(도 79a). 흥미로운 것은, 각 군에서 평균 신장 종괴는 해당 군의 평균 혈청 크레아티닌 값에 역 비례하였다(도 79a). 신장 종괴와 혈청 크레아티닌 사이의 상호 관계는 선형 회귀 분석에 의해 추가 실증되었는데, 각 랫트에서 두 개 매개변수 사이에 유의적인(R2 = 0.38) 역관계가 설명된다(도 79b). 이와 같은 데이터는 신장 종괴와 신장 기능 간의 직접적인 상관 관계를 설명하며, B4 및 UNFX보다는 B2가 뚜렷한 치료 효과을 가진다는 것을 강조한다.
조직학적 평가.
설치류의 5/6 신적출 시술에 의해 적출되고 남은 신장이 있으며, 새로운 네프론을 형성하기 보다는 기존 네프론의 보상적 확대를 통하여 부분적으로 신장 종괴를 복원시키는 비대성 반응을 겪는다(Brenner, BM. Am J Physiol, 249: F324-37, 1985, Kaufman, JM, et al. Kidney Int, 6: 10-7, 1974). 초기 비대성 반응에도 불구하고, 신장 종괴의 상실과 연합된 신장 혈류 역동학의 변화는 궁극적으로 고혈압, 요독증, 빈혈증, 및 만성 신장 조직 구조의 만성적 형태학적 파괴를 초래하였다. 표준 조직학적 기술 및 착색(H&E, PAS 및 Masson의 트리크롬)을 이용하여 B2 치료를 받은 랫트의 신장, 골수 및 뼈안 표면상에 특정 점을 허위 Nx, Nx 및 B2 치료군과 비교하였다(도 81a,b,c). 치료를 받지 않은 5/6 Nx 랫트 신장에서 관찰된 조직병리학적 변화는 중간 내지 심각한 사구체-세뇨관 손상을 포함하는데, 일부분은 구형의 사구체 경화와 함께 사구체 비대로 확산되는 다소성으로 구성되며, 사구체 매트릭스가 균질성 호산구 물질 (단백질)로 대체되며 및 중간정도의 메산지움 부위 증식(mesangial proliferation)을 특징으로 한다. Nx 동물과 관련된 다소성 사구체 토리뭉치 흡착 및 병소 사구체 위축이 있었다. 더욱이, Nx 랫트 신장은 다소성 염증과 함께 약한 내지 중간정도의 세뇨관-간질 섬유증을 가지고 있었다. 다소성 세뇨관 비대 및 과형성이 주로 전단 세뇨관에서 관찰되었고, 전단 및 말단 세뇨관에 영향을 주는 세뇨관 팽창으로 확산된다. 가장 팽창된 세뇨관은 약화된 상피와 두꺼워진 기저막을 보였으며, 많은 세뇨관은 관내 단백질 축적을 나타내는 유리질 원주를 함유한다.
외과적 모델에서 관찰된 전체적인 형태학적 파괴에 비하여, B2-치료를 받은 신장에서 비교되는 미세해부학적 특징은 건강한 대조군 신장과 형태학적으로 더 일치하였다. 특징적으로, B2 치료를 받은 신장은 비율적으로 더욱 건강한 사구체, 세뇨관, 및 네프론 구조를 가졌으며, 세뇨관 팽창의 감소, 세뇨관 유리질 원주의 감소, 세뇨관-간질 섬유증의 감소, 및 최저수준의 사구체 경화가 있었다(도 81a). B2 치료를 받은 동물이 실질조직내에 명백하게 손상된 신장 조직 병소를 가끔 가지고 있지만, 대부분의 형태는 건강한 대조군의 것과 일치하였다. 역으로, B4 치료를 받은 신장은 Nx 동물보다는 비례적으로 좀더 건강한 사구체 및 사구체 경화가 적었지만, 팽창 및 세뇨관 원주를 포함하는 세뇨관 병리는 치료를 받지 않은 Nx 대조군과 유사하였다. 더욱이, B4 치료를 받은 신장은 치료를 받지 않은 Nx 랫트와 비교하였을 때 손상을 받은 주요 부위가 약간 개선되었지만, 건강한 대조군에 근접하지는 못하였다.
건강한 허위 Nx 랫트의 대퇴부 뼈 및 골수는 정상이며, 유의적인 조직학적 변화는 없는 것으로 보였다. 치료를 받지 않은 Nx 랫트의 골수와 뼈에는 두 가지 조직학적 특징이 있었다: 1) 적혈구세포 부족 및 증가된 골수:적혈구 비율과 함께 골수의 전반적인 세포질이 감소되었고(도 81b); 및 2) 우세한 파골세포 및 소와(lacunae) 형성과 함께 뼈안의 표면의 변형(scalloping)을 특징으로 하는 중간정도의 뼈 재흡수(도 81b). Nx 동물에서, 피질과 소주골(trabecular bone)이 얇아졌는데 이것은 골감소를 나타낸다. Nx 군의 골수와 비교하였을 때, B2 치료를 받은 동물의 골수는 자유 적혈구세포가 더 많고, 조혈성 골수:적혈구 비율이 더 크고, 뼈 재흡수의 조직학적 증거가 없다(B2). B2 치료에 대한 골수 반응 정도는 치료군들에서 가장 우세하였고, 건강한 대조군에 근접한 골수 조성 및 형태를 가졌다.
B2-치료를 받은 랫트에서의 이와 같은 현상이 실질적으로 부족한 점과 함께, Nx 랫트에서 뼈 부식의 조직학적 관찰로 인하여, 혈청 칼슘 및 인 수준을 추가 평가하였다. 말기 신장질환의 설명된 신성골이영양증과 일치되는 (37), 고인산혈증 및 저칼슘혈이 Nx 동물에서 관찰되었다(도 81c). 뼈 안 표면의 조직병리학적 관찰에 의해 예측된 바와 같이, B2 치료를 받은 동물은 건강한 대조군에 등가의 인 및 칼슘 수준을 가졌고, 이것은 이들 미네랄의 전신적 및 항상성 조절을 암시한다 (도 81c). 집합적으로, 조직학적 관찰을 통하여 진행성 신부전의 설치류 모델에서 B2는 신장 여과 기능을 강화시키고, 적혈구 항상성을 복원시킨다는 전체적인 지표를 확인하였다.
고찰
시험관에서 특정 기능적 속성을 가진 선택된, 신장으로부터 유도된 세포의 정위 이식에 의해 개시되는 재생적 자극은 치사율을 감소시키고, CKD의 설치류 모델에서 치사율을 감소시키고, 기능을 보강하고, 생체내에서 질환 진행을 지연시켰다. 여기에서 제시된 데이터는 이질성 신장 세포 집단의 특정 세포 하위 분취물이 더 광범위한 임상적으로 관련된 효과를 제공하며, 특정 임상 매개변수에 대해 더 효과적이며, 비-분취된 이질성 혼합물과 비교하였을 때, 임상 효과의 영속성을 최소한 50% 연장시킨다는 전신적 및 조직학적 증거를 제공한다. 이들 연구에서 비교 시험된 두 가지 세포 하위분취물 (B2 및 B4)은 시험관 번식후 분취에 의해 생성되었으며, 여과 (B2) 및 적혈구생성 (B4)과 관련된 독특한 조성적 및 기능성 속성을 보유하는 것으로 나타났다. 전단 및 말단 신장 세뇨관 세포 (~90%)와 일부 집합 도관 세포 (~10%)로 구성된 하위분취물 B2은 알부민의 수용체 매개된 강력한 세포내이입을 할 수 있는 특화된 쿠비린+/메갈린+ 전단 세뇨관 세포에 대해 농축되었다. 주어진 B2의 세포 조성물 및 기능적 속성이라면, 혈청 크레아티닌 및 BUN의 안정화, 단백질의 재흡수, 및 전해물 균형과 같은 효과를 통하여 네프린에 걸쳐 있는 기능을 보강하였다는 관찰은 놀라운 것이 아니다. B2의 신장 항상성 효과는 연장된 생존, 개선된 체중 증가, 정상적인 혈액 지질 프로파일, 뼈 이화작용의 감소와 같은 전체 유기체 수준의 효과와 수반되었다. 이와 함께, 여기에서 제시된 생리학적 데이터는 B2 세포 하위분취물의 이식을 통하여, CKD 말기 모델에서 신장 기능의 광범위한 및 관련된 안정화를 반영한다.
안정화된 신장 기능의 생리학적 증거는 6 개월 시점에서 B2로 치료를 받은 랫트의 남아있는 신장에서 고유한 세뇨관 및 사구체에 가까운 형태를 보인 조직병리학적 분석에 의해 직접적으로 뒷받침되었다. B2 치료에 의한 신장 종괴의 복원(도 79)은 치료를 받지 않은 Nx 신장과 비교하여 B2 치료를 받은 신장에서 사구체경화증, 세뇨관-간질 섬유화, 및 관내 단백질 침착이 약화되었고, 골수에서 조혈 반응은 건강한 대조군과 유사한(도 81) 조직학적 증거를 수반하였다. 다소 덜 명확하지만, B4 치료는 사구체경화증의 감소, 골수에서 적혈구 항상성의 복원을 포함하는 일부 명백한 조직-수준 개선을 제공하였다. 공통유전자(syngeneic) 수컷 공여자/암컷 수용자 방법은 희생 시점에서 수용자 암컷 신장의 게놈 DNA에서 수컷 세포(SRY)를 탐지하여 조직 키메라 현상을 평가할 수 있다. 이 방법에 의해 이식 후 6개월 시점에서 암컷 신장에서 대략 1% 빈도로 수컷 세포를 여전히 탐지가능하였다. 조직 g에 대략 1억 세포가 존재하는 조직학적 예측을 이용하여, 및 이식 시점에서 남아있는 신장이 ~0.8 grams 중량이라는 것을 이용하여, 신장으로 전달되는 B2 세포의 용량 (5 백만)은 남아있는 신장의 ~6.25%로 나타났다. B2 세포 하위분취물은 현재까지 장기 접합 줄기 또는 조상세포로 특징화되지 않은 기능적으로 성숙된 세포로 주로 구성되기 때문에, 신장에서 중간 정도의 세포 턴오버 속도로 추정하면, 이식물된 세포의 100%가 생체내에서 6개월 동안 유지된다고 예측할 수 없다. B2 세포의 질환을 약화시키는 효과는 기능적 세포 (구출)를 가진 네프론의 재군집화(repopulation), 숙주 세포상에 이식된 세포의 세포보호성 또는 재생적 효과(조절), 이식물된 제공 세포 및 모집된 숙주 세포의 복합 작용을 통한 새로운 네프론의 재생(네프론형성), 또는 이들 기전의 하나 이상의 복합 때문일 수 있다. B2의 미확인 성분이 관찰된 치료 효과에 기여하는 것 또한 가능하다. 예를 들면, 면역-조절 세포, 가령 조직-특이적 대식세포의 존재 또는 부재는 신장에서 병인을 조절할 수 있는데, 그 이유는 이들이 섬유증 및 조직 리모겔링과 연관되어 있기 때문이다. 더욱이, 신장-특정 줄기 또는 조상 세포는 상기에서 고려된 네프론 형성과 같은 재생적 기전을 실행할 수 있을 것이다. B2 및 B4의 작용 기전의 철저한 이해를 위하여 치료를 받은 신장 조직의 분자 및 세포 성분들의 잘 조절된 임시 연구가 필요하다.
본 연구의 1차 측정 성과는 생존이었다. B2 세포는 치료후 대략 6개월까지(신적출후 30주) 생존을 연장시키거나 치료를 받지 않은 Nx 랫트의 평균 생존보다 3개월 더 연장시켰고, 이들 모두 신적출 후 22주에 신부전으로 죽었다. B2 치료로 관찰된 생존 기간은 신부전에 대해 공개된 다른 세포-기반 요법에서 관찰된 치료 보다 더 길었다(Kim, SS, et al, Imporvement of kidney failure with fetal kidney precursor cell transplantation. Transplantation, 83: 1249-58, 2007, Choi, S, et al. Stem Cell Dev, 18: 521-9, 2009, Zeisberg, M, et al. Am J Physiol Kidney Physiol, 285: F1060-7, 2003, Eliopoulos, N, et al. J Am Soc Nephrol, 17: 1576-84, 2006). B2 치료 부분에서 연장된 생존은 아마도 이식된 세포에 의해 유도된 또는 전달된 신장 기능상의 긍정적 효과; 여과(sCrea, BUN), 세뇨관 재흡수 (단백질), 전해물 균형 (칼슘, 인), 및 엔도크린 (Vit D, Epo)에 의한 것일 것이다. B2 세포가 신장에서 다중 세포의 구별된 기능에 상당한 영향을 주었다는 가설은 신장 중량에서 관찰된 증가, B2 치료를 받은 신장의 중량은 조작을 받지 않은-나이가 일치되는 대조군 랫트의 한 개 신장의 등가 수준에 도달하고(도 79); 및 2) B2 치료를 받은 신장에서 질환 진행이 더 느려진다는 명백한 조직학적 증거에 의해 뒷받침되는데, 이 증거는 감소된 세뇨관-간질 섬유화, 감소된 사구체 경화, 및 세뇨관 루멘에서 단백질 축적의 감소와 함께 세뇨관 재생의 중심적 증거(도 81), 이것은 개선된 단백질 재흡수의 전신적 증거를 확증하며(도 78), 및 B2 세포에서 강력한 단백질 흡수 기능의 시험관적 증거와 짝을 이룬다 (도 75a). 따라서, B2에 의한 신장 기능의 안정화는 5/6 신적출 모델과 연관된 요독증과 소모를 감소시키고, 치료를 받은 동물은 영양물 (체중에서 유의적인 증가로 예시화됨, 도 76b), 정상적인 혈액 산소생성(적혈구생성; 도 77a-c, 도 78a), 및 노폐물의 제거(기능을 하는 네프론; 도 77d-f, 도 78)에 대한 대사적 생리학적 반응을 통하여 생존하고 생장한다.
5/6 신적출 모델에서 CKD는 사구체 및 세뇨관-간질 공간에서 경화성 병소의 진행을 더 악화시키는 다중 복합증을 수반한다. 요독증의 개시와 함께, 순환하는 호르몬의 생산 및 조절에 관계하는 기관 시스템은 흔히 기능이상이 된다. 신장에서, 요독증은 신장의 정상적인 엔도크린 기능, 가령, 비타민 D 활성화 및 골수에서 Epo의 생산 및 운반을 파괴한다. 혈청 및 뼈의 정상적인 미네랄화는 부갑상선 호르몬 피드백과 함께 균형된 신장-조절된 비타민 D 활성화를 요구한다. Nx 랫트에서 관찰되는 뼈 부식(도 81b), 고인산혈증 (도 81c) 및 저칼슘혈증(도 81c)은 말기 신장 질환의 골형성이상증과 부차적인 부갑상선기능항진증과 일치한다(Ritz, E. J Nephrol, 18: 221-8, 2005). 본 연구에서 B2 치료에 의해 제공되는 다수의 효과와 일관되게, 정상적인 혈청 칼슘/인 균형이 확립되었고, 치료 후 온전히 6개월 이전에 건강한 대조군에 등가이며, B2의 장기적 안정적인 치료 효과를 강조한다. 빈혈증은 인간 CKD 및 5/6 신적출 모델에서 진행과 관련된 엔도크린 이상기능이다. 유전자 발현 프로파일링 및 시험관 기능 특징에 근거하여, B4가 빈혈증에 최대 효과를 가지는 것으로 기대되지만(도 74, 75), B4 및 B2는 모두 신장의 Epo-의존적 엔도크린 기능에 바람직한 영향을 주었다(도 77, 78, 81). 흥미롭게는, 연구 결과를 전체적으로 고려하였을 때, B2 치료는 B4보다 적혈구 생성을 더 안정적이고 오래동안 뒷받침한다. B2가 적혈구생성에 영향을 주는 기전은 아직 충분히 이해되지 않았지만, 심각한 CKD가 있는 인간의 신장에서 국소화된 Epo 생산이 명백하다는 우리의 기존 관찰과 이와 같은 결과를 함께 고려할 때, B2 치료된 신장에서 관찰된 항상성 조직 구조의 재확립은 피층 섬유모세포로부터 혈류로 Epo의 효율적인 방출에 요구되는 미소환경적 요소들을 제공하는 보조적인 효과를 가진다고 볼 수 있다.
문헌에서 보고되고, 본 연구에서 관찰된 바와 같이, 5/6 신적출 시술을 겪은 랫트는 지질이상이 된다(Kasiske, BL, et al. Circ Res, 62: 367-74, 1988). 뜻밖에, B2치료를 받은 동물에서 정상적인 혈청 지질 프로파일 (콜레스테롤 및 트리글리세리드)이 관찰되었다. B2에 의한 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준이 개선되는 세포 기전은 아직 모르지만, 개선된 식이 단백질 취급(도 80)은 네프론이 식이 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 자유 지방산을 방출하는 능력에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 이와 같은 데이터는 조직 항상성을 복원시키는 B2 또는 다른 세포-기반 치료요법은 CKD 환자 집단에서 기질 조절에 대한 약리학적 중재의 필요를 잠재적으로 감소 또는 제거시킬 수 있다는 것을 암시한다(Kasiske, BL, et al. Circ Res, 62: 367-74, 1988).
원발성 또는 본태성 고혈압의 병인은 흔히 신장 질환과 연관된다(Brenner, BM, et al. Am J Hypertens, 1: 335-47, 1988, Hoy, WE, et al. J Am Soc Nephrol, 16: 2557-64, 2005, Silberberg, JS, et al. Kidney Int, 36: 286-90, 1989). 5/6 신적출 모델에서 신장 절제 후 곧이어 오는 고혈압의 진행형은 높은 보상적 사구체 모세관 압력(Kaufman, JM, et al. Kidney Int, 6: 10-7, 1974) 및 레닌-앙지오텐신 II-알도스테론 축 붕괴(Greene, EL, et al. J Clin Invest, 98: 1063-8, 1996)와 관련된다. 만성 고혈압 환자의 신장은 정상 혈압 대조군보다 사구체가 적은 것으로 나타났다 (Keller, G, et al. N Engl J Med, 348: 101-8, 2003). 5/6 남아있는 신장에서 네프론 감소는 사구체 여과 속도의 증가 (Kaufman, JM, et al. Kidney Int, 6: 10-7, 1974) 및 사구체 및 세뇨관 비대 (Brenner, BM. Am J Physiol, 249: F324-37, 1985)를 포함하는 신장 혈역학적 변화와 연관된다. CKD 및 이어서 오는 고혈압은 LVH로 이어지는데(Zolty, R, et al. Am J Transplantation, 8: 2219-24, 2008), 이 형태는 궁극적으로 충혈성 심부전으로 진행될 수 있다. CKD의 심장 여병은 증가된 말초 도관 저항성 또는 고혈압을 극복하기 위하여 요구되는 보상적 좌심실 압력에 의한 것이다. B2에 의한 신장 기능 보강은 치료를 받지 않은 신장적출된 대조군 및 비-분취된 세포로 치료를 받은 군들과 비교하였을 때, 심장 비대 발생을 상당히 약화시켰다(도 76c). 이와 같은 데이터들은 이 경우 혈압을 조절하기 위하여 약리학적 중재(가령, ACE 억제제 또는 ARBs)의 의존성이 선택적 세포 기반의 재생적 요법에 의해 잠재적으로 감소될 수 있다는 또 다른 실시예를 제공한다.
이 모델에서 기능적 결과는 진행성 신장 질환의 방지를 반영하고, 네프론에서 해부학적 개선과 결합될 때 B2 분취물은 정상적인 신장 격실(가령, 사구체 및 세뇨관)의 재생을 촉진시킨다는 것을 암시한다. 이와 같은 연구들은 B2 프로토타입이 신장의 주요 격실(가령. 세뇨관, 사구체 및 간질 격실)과 관련된 정상적인 세포 및 조직 기능을 보호하고 및 복원시키는 능력을 가진다는 것을 설명하였다. B2 세포가 재생적 결과를 촉진시키는 잠재적인 분자 및 세포 기전은 현재 연구중이다. 집합적으로, 이와 같은 데이터는 시험관에서 기능적 속성을 가진 특정 신장 세포가 말기, 진행성 CKD에서 진행을 예방 또는 지연시키기 위하여 항상성 조직 구조 및 세포 환경을 복원시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구에 의해 고려되는 세포-기반 재생적 의약적 방법은 명백한 진행성 질환 상태가 확립된 후 그러나 신부전이 투석 또는 전체 기관 이식을 요구하는 말기 단계 질환으로 진행되기 전 CKD 환자를 치료하는 것과 유사하다. 이와 같은 결과들은 CKD 환자군에서 투석 및 약물 의존성을 감소시킬 수 있고, CKD의 치료 패러다임을 완화에서 치료로 궁극적으로 전환시킬 수 있다는 개념증명을 제공한다.
실시예 11 - 시험관 및 생체내에서 세뇨관 기능 속성에 의해 특징화된 설치류 신생-신장 세포의 분리
상기에서 설명된 바와 같이, 분리된 세포를 OPLA 비계에 접종시키고, 시험관 상태에서 5일간 관주 배양시켰다.
세뇨관 세포 기능의 주요 특징을 유지하는 세뇨관 세포를 또한 분리시켰다. 도 1에 나타난 바와 같이, 이와 같은 기능적 특징들은 3차원 배양 시스템에 의해 강화되었고, 이 시스템에서 세포들이 상호작용하여, 세뇨관-유사 구조를 형성하였다. 도 66은 또한 단합하여 작용하는 두 개 수용체, 메갈린 및 쿠비린과 특이적 상호작용을 통하여 전단 세뇨관 세포에 의해 로다민-콘쥬게이트된 알부민이 흡수된다는 것을 보여준다. 알부민 흡수의 특이성은 로다민-콘쥬게이트된 알부민이 흡수되는 것을 방해하는 경쟁적 억제제, RAP 단백질의 첨가에 의해 확인되었다.
생체내에서 신장 기능을 안정화시키는 배양된 세뇨관 세포의 능력은 도 67에서 설명하는데, 이 도면은 혈청 크레아티닌, 신장 기능 지표인 혈청 크레아티닌은 치료를 받지 않은 요독증 랫트와 비교하였을 때, 신생-신장 세포 치료를 받은 요독증 랫트에서 정상적인 수준에 근접하게 유지되었다는 것을 보여준다. 치료를 받지 않은 랫트의 62%는 16주 시점에서 죽었다.
실시예 12 - 인간 신장으로부터 세뇨관/사구체의 분리
세뇨관 및 사구체 세포를 본 내용에서 설명된 효소 분리 방법에 의해 정상적인 인간 신장 조직으로부터 분리시켜, 증식시켰다. 상기에서 설명된 구배 방법에 의해 배양후 세뇨관 세포 분취물을 생체외에서 농축시켰다. 도 68에서 볼 수 있는 바와 같이, 분리 및 증식에서 표현형 속성은 유지되었다. 라벨된 알부민의 흡수를 통하여 평가된 세뇨관 세포 기능 또한 반복된 계대 및 냉동 보존 후에도 유지되었다. 도 69는 세뇨관 풍부한 집단과 세뇨관-고갈된 집단을 3D 동적 배양에서 배양시켰을 때, 세뇨관 풍부한 집단에서 세뇨관 표식인, 캐드헤린의 발현의 두드러진 증가가 있었다는 것을 보여준다. 이것은 세포가 3D 동적 환경에서 배양될 때 초기 농축을 넘어서도 세뇨관 세포의 농축이 유지될 수 있다는 것을 확인시킨다.
실시예 13 - 유세포분석을 통하여 EPO를 생성하는 세포의 추가 분리
실시예 8에서 설명된 동일한 신장 세포의 배양된 집단을 유세포 분석하여 전방 산란 및 측면 산란을 검사하였다. 작고, 입도가 낮은 EPO를 생산하는 세포 집단은 식별가능하였으며(8.15%) 및 유세포분석의 분류 능력을 이용하여 작고, 입도가 낮은 집단의 포지티브 선택을 통하여 분리시켰다(도 70 참고).
실시예 14 - 빈혈증이 있는 신부전 랫트 모델에서 전달 시스템에 의한 신생-신장(신생-신장: NK) 세포 프로토타입 B2 및 B4의 효과
다양한 생체적합물질-기반 전달 시스템에서 신생-신장 (NK) B2 및 B4 세포의 프로토타입의 효과를 판단하기 위하여, B2 및 B4 프로토타입은 세 가지 전달 시스템 프로토타입 (CP1, CP2 또는 CP3) 중 하나에 의해 질환이 있는 설치류 신장 유조직으로 전달되었다. 정착된 신장 질환을 가진 랫트에서 신부전 및/또는 빈혈증의 진행을 지연시기커나 또는 역전시키는 세 가지 운반 시스템 프로토타입중 하나로 전달된 세포의 프로토타입의 비교 능력은 CREAT, BUN, HCT, RBC #, 혈청 단백질, 체중 및 상대적인 심장 중량을 포함하는 전신적 및 조직학적 다중 매개변수에 걸쳐 이식 후 3개월 동안 검사되었고, 평가되었다.
비-제한적 성공 인자들에는 다음이 포함된다:
1) 프로토타입은 적혈구생성을 유지/강화시켜, 항상성 HCT 및/또는 RBC을 가진다.
2) 프로토타입은 적혈구 자극의 조직학적 증거를 제공한다.
3) 프로토타입은 sCREAT 및 BUN에 의해 평가하였을 때 신장 기능의 측정가능한 개선 또는 안정화를 제공한다.
4) 프로토타입은 신장에서 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 복구 및/또는 재생의 조직학적 증거를 제공한다:
a. 사구체 복구, 재생, 또는 사구체생성
b. 세뇨관 복구, 세뇨관 재생, 세뇨관 생성 또는 네프론생성
c. 집합 도관 시스템의 복구, 재생 또는 형태형성
5) 프로토타입은 하나 이상의 신장 기능 개선과 연관된 유기체 수준의 개선(체중 증가, 생존)을 제공한다.
6) 프로토타입은 관련 다중 매개 변수에 걸쳐 포괄적인 장점들을 제공하여, 따라서 시험된 모든 프로토타입의 치료 특징의 수반되는 세뇨관의 정량적 평가는 시험된 모든 결과에 대해 프로토타입이 유익하거나 또는 중성이라는 것을 확인시킨다.
세포: Lewis 수컷 공여자로부터 1차 신장 세포 배양물을 정립하고, 표준 방법을 이용하여 확장시켰다. 이식전, 앞에서 설명된 집단 분취 방법을 이용하여 B2 및 B4 세포의 프로토타입 형태를 만들었다.
전달 시스템: 본 연구에서 세 가지 구조체 프로토타입 (CP) 전달 시스템을 평가하였다. CP1은 하이드로겔 형의 히알루론산(HA)으로 구성되었다. CP2는 다공성 포말 형의 히알루론산으로 구성되었다. CP3은 OPLA 포말로 구성되었다.
시험 대상물: 시험 대상물은 세포, 또는 세포 + 생체적합물질 전달 시스템으로 구성된다. B2 세포 프로토타입은 특정 세뇨관 세포와 매우 소량의 다른 신장 세포 유형의 분취물의 혼합물을 포함하였다. B4 세포 프로토타입은 EPO를 발현시키는 세포, 사구체 세포, 및 특이적 세뇨관 세포을 포함하였다. B4/CP1 및 B2/CP1의 경우, 세포는 이식 2-4시간 전에 CP1과 복합되었다. B4/CP2 및 B2/CP2의 경우, 이식 24시간 전에 세포를 포말 비계에 접종되었다. B4/CP3 및 B2/CP3의 경우, 이식 24시간 전에, 세포를 포말 비계에 접종되었다.
시험에 사용된 동물 모델: 성인기 암컷 Lewis 랫트를 Charles River Laboratories (CRL, Portage, MI)으로부터 구입하였고, 이들 랫트의 대부분이 2-단계 5/6 신적출 (NX)을 받았다(치료군 및 상세 내역은 표 2 참고). 시험군에 무작위로 할당된 랫트를 치료 전 5-8 주 동안 우리에 가두고 관찰하였다. 동물 모델과 실시된 외과적 시술은 실시예 7 및 9에서 설명된, 이용된 것들과 동일하였다. 기존 연구에서와 같이, 매주 혈청 분석을 통하여 요독증을 확인하기 위해, 이식 전 5-8주 동안 랫트는 신적출 상태로 유지되었다. 질환이 있는 신장 실질조직으로 프로토타입을 전달하였고, 이식 후 3개월 지켜보았다. 이 기간은 치료를 받은 랫트의 대부분이 살아 있는 동안 전체적인 비교 분석이 가능하고, 재생을 관찰하기 위한 최적 시간에서 조직의 조직학적 검사가 가능하여 선택되었다.
[표 12]
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외과술: B2, B4, B2/CP1, 및 B4/CP1의 주사를 통하여 질환이 있는 신장 실질조직으로 세포 및 세포/CP 프로토타입이 전달되었다. B4/CP2, B4/CP3, B2/CP2, 및B4/CP3는 남아있는 신장의 말단 극에 외과적으로 이식되었고, 복부 지방의 작은 조각으로 덮었다.
측정: 동물의 체중을 매주 측정하였다. 혈청 및 혈액 분석에 의해 이식 전 및 이식 후에 살아 있는 동안의 신장 기능 (혈청 BUN 및 혈청 크레아티닌 (sCREAT)) 및 적혈구생성 (HCT 및 RBC #) 평가가 제공된다. 완전한 혈청 및 혈액학 패널은 기준 시점, 이식 후 6주, 이식 후 12주 및 부검 전(빈사 상태 또는 연구 말기에 죽은 것이든)에 실행되었다. 부검 시, 기관(신장, 간, 비장, 심장, 폐)의 무게를 측정하고, 조직학을 위해 수집하였다. 조직학적 분석을 위해 대퇴부 골수도 수거하였다.
결과
수용자 동물은 5/6 신적출 시술의 4주 이내에 요독증 질환을 얻었다. 치료를 받지 않은 NX 동물은 실험 기간(이식 후 3개월)내에 모두 죽었다. NX 랫트의 군에서 빈혈증은 HCT를 10% 미만으로 감소시켰고, RBC #에서 심각한 감소는 없었다. NX 랫트와 비교하여, 세포 또는 세포/CP 프로토타입으로 치료를 받은 랫트는 더 오래 살았다. 연구 동안 모집한 혈청학적 데이터에서 B2 프로토타입은 신장 여과 기능의 안정화에 있어서 다른 모든 치료보다 월등하였으며, 연구 종료시 평균 혈청 CREAT는 겨우 0.78 ± 0.13 (치료를 받지 않은 NX에서 1.77 ± 0.7와 비교하여)이었으며, BUN도 겨우 34 ± 3.6 (치료를 받지 않은 NX에서 64 ± 17와 비교하여)이었다. 모든 치료군에서 CREAT 및 BUN 수준은 아래 표 13에 나타낸다. 이들 NX 랫트에서 나타난 빈혈증은 약하지만, 프로토타입 (B2, B4/CP1, 및 B4/CP2)은 건강한 대조군에 동등한 수준으로 HCT%를 복귀시켰다. 모든 매개변수들과 시점을 고려하였을 때, 연구 기간 동안 B2 프로토타입은 가장 포괄적인 치료 효과를 제공하였다(아래 표 13 참고).
B2를 이용한 치료와 함께, B4/CP1 및 B4/CP3는 T0 시점에서 치료후 3개월 시점까지 100% 생존 결과를 가져왔다(도 82 참고). 기존 연구로부터 예상된 바와 같이, 치료를 받지 않은 NX 랫트의 100%는 이식 12주 이내에 죽었다. 실시예 10에서 볼 수 있는 바와 같이, B2 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트 100%는 연구 종료 시점(3 개월)에서, 건강한 대조군이 살았던 바와 같이 생존하였다. 한 마리 허위 NX 랫트는 4주 시점에 원인 불명으로 자연사하였다. B4 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트의 50%는 3개월까지 살았다. 세포들이 단독으로 전달되었을 때, B2 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트의 생존은 최대였으며(100%), 그 다음 B2/CP3 (80%), B2/CP1 (66%), 및 B2/CP2 (60%) 순이었다. 대조적으로, B4 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트의 생존(50%)은 시험된 세 가지 모든 생체적합물질 전달 시스템에 의해 강화되었고, B4/CP1 및 B4/CP3에서는 60% 생존이 증가되었고, B4/CP2에서는 100%로 증가되었다.
도 83에 나타난 바와 같이, B2 치료는 연구 동안 체중 손실을 감소시켰고, 체중 증가를 촉진시켰다(도 83a, b). 모든 랫트의 체중은 매주 측정되었다(패널 83a). 체중 증가/손실은 각 랫트에게서 치료 전 체중과 사망 시점의 체중을 비교하여 별도로 계산되었다(패널 83b). 건강한 대조군 및 허위 Nx 랫트에서 확인된 체중 증가는 건강한 Lewis 암컷 랫트에서 실시된 기존 연구에서 확인된 3개월 체중 증가와 일관된다. 치료를 받지 않은 NX 랫트에서 확인된 체중 감소(~5%)는 시간 경과에 따라 체중 감소가 전형적인, 2-단계 5/6 신적출 모델과 일치한다. 건강한 대조군, 허위 NX군, 및 NX + B2치료를 받은 군은 이 연구에서 시간이 경과함에 따라 체중 증가를 나타낸 유일한 군들이다. 다른 군들의 체중은 치료를 받지 않은 NX 랫트와 일치하였다.
도 84-87에 나타난 바와 같이, 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소 (BUN)에 근거한 신장 세뇨관 기능의 안정화에 기초하여 신장 기능은 B2 치료에 의해 안정화되었다. 건강한 대조군 및 허위 Nx 랫트는 모두 연구 동안 혈청 크레아티닌 수준이 0.4 정도로 유지되었으며, 변이성은 낮았다(84-86). 치료를 받지 않은 NX 랫트의 평균 혈청 크레아티닌은 >1.2로 상승되었고(300% 증가), 이 시기 후 랫트는 거의 빈사상태가 되었고, 연구 담당 수의사에 의해 희생되었다. B2-치료를 받은 모든 랫트는 연구 동안 생존하였고, 연구 동안 안정적인 혈청 크레아티닌 수준을 유지하였는데, 치료 전 평균 0.68 ± 0.05으로부터 연구 종료 시점(치료 후 3개월) 평균 0.78 ± 0.13 이었다(도 84-85 참고). 도 84는 모든 치료군을 나타내지만, 더욱 분명하게 하기 위해 B2 및 B4 치료군은 NX, 건강한 대조군, 및 허위 Nx와 함께 도 85에서 나타나 있다. 에러 막대는 표준 편차를 나타낸다. 혈청 크레아티닌의 안정화에 대해 전달 시스템 프로토타입 (CP1, CP2, 또는 CP3)중 어느 것도 B2 또는 B4 세포 프로토타입의 성과를 개선시키지는 못하였다. 그러나, 대부분의 프로토타입은 치료를 받지 않은 NX 군을 능가하였다. 모든 시간대에서 얻은 데이터를 각 치료군에 대해 복합시키고, ANOVA 일원 분석하였다(도 86). 예상한 바와 같이, B2 치료 군이 혈청 크레아티닌의 안정화에 대해 다른 치료들보다 월등하였고(원으로 표시된 부분), 치료를 받지 않은 NX 뿐만 아니라 대부분의 다른 프로토타입 보다 분명히 개선되었다. B2 및 B4 세포 프로토타입은 본 연구에서 유사하게 및 실시예 10에서와 같이 실행되었다. 모든 시험군에서 연구 동안 혈청 BUN을 또한 모니터하였고, 이 결과는 치료군간에 B2 프로토타입은 시간의 경과에 따른 최저 혈청 BUN 값을 나타내는 특징과 같이 유사한 성과 패턴을 보임으로써, 크레아티닌 데이터를 뒷받침한다. (도 87).
도 88-90는 HCT의 복원에 근거하여 B2 프로토타입에 의해 적혈구생성이 상당히 개선되었다는 것을 보여준다. 치료를 받지 않은 NX 랫트에서 HCT(%)가 약간 감소되었음을 볼 수 있는데, 이것은 이 모델에서 신부전에 부차적으로 빈혈증의 발생을 반영한다. 그러나, 이 군의 랫트에서 나타난 빈혈증은 약하고, 일과적이며, 기존 연구에서 보다는 덜 심각한 영향을 주었다. 모든 치료군에 대해 HCT (건강한 대조군의 %로 반영됨)를 나타내고(도 88), 및 패널 (도 89)에서는 간결하게 허위 NX, B2, B4, 및 NX에 대한 HCT 만을 나타낸다. 모든 데이터를 ANOVA 일원 분석과 함께 고려하였을 때(도 90), B2 프로토타입에서 HCT는 건강한 랫트(허위 Nx)와 더 유사하였다는 것을 볼 수 있다(도 89, 원으로 표시됨). 흥미로운 것은, 3개월 시점에서 100% 생존을 특징으로 하는 B4/CP2 프로토타입 또한 HCT에서 개선을 나타내었다(도 88 및 90).
도 91에 나타난 바와 같이, B2 프로토타입의 치료는 상대적인 심장 중량을 상당히 더 낮추었다. 5/6 신적출 모델은 체중에 대한 상대적인 심장 중량이 증가되는 특징을 가진다. 사망 시에 전체적으로 관찰할 때, NX 랫트에서 좌 심실 벽의 비대는 감지할 수 있었으며, 심장의 평균 중량은 1.22 ± 0.07 g (건강한 대조군의 1.13 ± 0.07 g 와 비교하여)이었다. 5/6 신적출 시술을 받은 모든 랫트는 건강한 대조군 및 허위군 NX 랫트과 비교하여 심장 중량/체중 비율이 상당히 더 높았다 (p<0.05; 그래프상에 빗금친 막대들). B2 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트는 치료를 받지 않은 NX 랫트과 비교하였을 때, 심장중량/체중 비율이 상당히 감소되었다 (p<0.05*). 이와 같은 관찰은 실시예 10에서 본 결과들과 일치하였다. 치료를 받지 않은 NX과 비교하였을 때, 다른 모든 프로토타입도 심장 중량/체중이 감소되었지만, 통계학적으로 유의적인 것은 없었다.
도 92는 B2 및 B4 프로토타입으로 치료를 받은 랫트에서 단백질 체류(retention) 경향을 나타낸다. 전체 혈청 단백질, 알부민, 및 알부민/글로불린(A/G) 비율의 상당한 감소는 5/6 신적출 모델의 특징들이다. 예상했던 바와 같이, 신적출 시술을 받은 모든 랫트에서 전체 혈청 단백질이 상당히 감소하였다 (빗금친 막대, p<0.05). 기존 연구에서, B2 프로토타입으로 치료한 경우 혈청 단백질 농도가 약간 증가되었다. 개선된 단백질 체류에 대한 경향은 B2 치료를 받은 랫트, 및 B4 및 B2/CP2 프로토타입으로 치료를 받은 살아있는 랫트에서 나타났지만, 통계학적으로 유의적인 것은 없었다.
도 93에 나타난 바와 같이, 3개월 시점에서 조직학적 평가는 B2- 및 B4-치료를 받은 랫트에서 세뇨관 및 사구체 건강이 강화되었다는 증거를 제공한다. 5/6 신적출 시술을 받은 모든 랫트는 사망시 또는 희생시 진행성 사구체 및 세뇨관 손상을 특징으로 하는 신장을 가지고 있었다. 세뇨관들은 단백질성 원주의 축적으로 팽창되었고(도 7에서 PAS 착색에 의해 강조됨), 및 세뇨관 위축 및 세뇨관-간질 섬유화가 있었다(도 7에서 Masson 트리크롬 착색에 의해 강조됨). 모델에서 증명된 사구체 손상은 사구체주변 섬유증, 메산지움 부위 증식(mesangial proliferation), 사구체 비대, 및 약간의 사구체 위축을 포함하였다. NX 및 NX+B4과 비교하였을 때, NX+B2 치료를 받은 신장은 덜 심각한 사구체 손상, 세뇨관팽창의 감소 및 단백질의 축적의 감소, 및 상당히 감소된 세뇨관-간질 섬유화를 특징으로 하였다. B4의 치료 또한 세뇨관 팽창 및 원주 축적에서 약간의 개선을 제공하였지만, B2 프로토타입으로 치료를 받은 신장과 비교하였을 때, 그 효과는 덜 하였다. B4 치료는 또한 사구체 손상을 감소시켰다.
프로토타입의 다중-매개변수 비교에 의해 전체적으로 최고의 프로토타입을 선택할 수 있다(하기 표 13 참고). 각 치료군의 모든 랫트의 최종 측정으로부터 각 주요 매개변수(생존, 체중 변화, HCT, CREAT, BUN 및 심장 중량)를 표 형태로 열거하였다. 한 마리 허위 NX 랫트는 연구 중에 사망하였기 때문에, 80% 이상의 생존은 건강한 것으로 간주하였다. 건강한 대조군에 대등한 값들은 굵은 글씨로 나타낸다. NX 와 등가의 또는 더 나쁜 값들은 이태리체로 나타낸다. 건강한 대조군의 평균 수준에는 못 미치지만 그러나 NX보다는 분명하게 개선된 값들은 개선된 것으로 간주되며, 굵을 글씨와 밑줄로 표시하였다. 이와 함께, 데이터는 CKD에 대한 재생 요법의 성분으로 B2 세포 프로토타입의 이용에 관한 추가적인 조사를 할 수 있는 동기를 제공한다. 본 연구 및 실시예 10에서 설명된 연구 모두에서, B4 세포의 프로토타입은 제한적이지만 상당한 치료 효과를 제공하였다. 흥미로운 것은 생체적합물질-기반 전달 시스템에서 B4 세포의 프로토타입의 이식은 생존을 포함하는 다중 매개변수에 걸쳐 B4의 효과를 향상시켰다.
[표 13]
프로토타입의 다중 매개변수 비교.
Figure 112018083309028-pat00015
말기 및 살아있을 때 혈청/혈액학 데이터에 근거하여, B2 프로토타입 (NX + B2)은 분명히 100% 생존을 제공하였고, 이것은 실시예 10에서 얻은 B2 프로토타입의 결과와 일치한다. B4 단독으로 제공된 경우의 50%와 비교하였을 때, NX + B4/CP2 또한 100% 생존을 제공하였고, 이것은 CP2 전달 시스템이 B4 세포의 프로토타입에 특이적인 재생 및/또는 복구를 강화시키는 환경을 제공한다는 것을 암시한다. 전반적으로, 상기 데이터는 모든 프로토타입이 NX 랫트보다는 3개월 시점에서 더 높은 생존%를 제공한다는 것을 보여준다.
다음의 B2, B4/CP1, 및 B4/CP2 프로토타입은 허위 NX에 근접한 수준으로 HCT를 개선시켰고: 및 이와 같은 관찰들은 골수의 조직학적 분석에 의해 확인되었다. B4 세포가 CP1 또는 CP2 -모두 히알루론산으로 구성-에 의해 전달될 때 B4의 조혈 효과가 강화되었고, 따라서 B4의 조혈 효과는 기관형성 동안 발생하는 신장의 환경 일부에서 재현되는 세포외 환경을 만들어서 강화된다는 것을 암시한다.
신장적출된 랫트의 배치에서 HCT 반응은 기존 연구와 비교하였을 때 약하지만 (HCT에서 10% 미만 감소), 세 가지 프로토타입, B2, B4/CP1, 및 B4/CP2는 적혈구생성을 잘 지원하는 것이 분명하며, 이것은 골수의 조직학적 분석에 의해 확인되었다. 대조적으로, 두 가지 프로토타입 (B2/CP3 및 B2/CP2)은 다른 치료군과 비교하였을 때, HCT 감소를 초래하여, 단독으로 전달되었을 때 B2가 제공하는 적혈구 항상성 효과들은 CP3 및 CP2에 의해 세포가 전달될 때 저해되었다는 것을 암시한다. 흥미로운 것은, CP3 및 CP2 프로토타입 모두 신장을 통하여 분포되지 않는 고형 다공성 포말이며, B2 단독 및 B2/CP1 (CP1는 반-고형 겔임)은 신장을 통하여 분포되어, B2의 치료 작용은 신장을 통한 분포에 일부 의존적이며 및/또는 신장에 있는 다른 세포 유형과 접촉으로 개시될 수 있다는 것을 나타낸다 - 이들 모두 고정된 고체 비계를 사용하면 감소 또는 방해되었다.
다음의 프로토타입은 sCREAT에 의해 측정하였을 때 신장 기능의 어느 정도 안정화를 제공하는데 (순서대로): B2 > B2/CP1 > B4/CP3 > B4/CP1 > B2/CP2 > B4; 이들 중 B2 프로토타입이 가장 일관된 안정화 (연구 종료 시점에서 CREAT 0.78 ± 0.13)를 제공하고, 치료후 3개월 시점 동안 이 군에서 100% 생존을 제공하는 유일한 프로토타입이다.
B2 프로토타입를 이용한 치료는 NX 치료를 받지 않은 군과 비교하였을 때, 치료를 받은 랫트에서 상대적인 심장 중량을 감소시켰다. 이것은 실시예 10에서의 관찰과 일치하며, 혈압 조절에 관련된 어느 정도의 성과 수준을 나타낸다.
실시예 10에서 얻은 결과들과 일관되는, B2 및 B4 모든 치료 군에서 다음의 경향을 볼 수 있었다(통계학적으로 유의성은 없음): 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 감소; 혈청 전체단백질 및 알부민의 증가; 및 혈청 인의 감소.
시험된 다중 매개 변수에 대한 데이터들을 고려할 때(상기 표 13 참고), B2 세포의 프로토타입은 단독으로 전달될 때 대부분의 매개변수에 걸쳐 유의적이고, 반복적인 효과들을 제공하며, 본 연구에서 시험된 세 가지 전달 시스템중 임의의 것을 통한 전달에 의해서 유의적으로 강화되지 않는다. B4 세포의 프로토타입은 상당한 생존 효과 (50%)을 제공할 뿐만 아니라, 적혈구 항상성 및 사구체 복구를 지원한다. B4의 성과는 생체적합물질-기반 전달 시스템의 추가에 의해 대부분의 매개변수에 걸쳐 강화되었는데, 히알루론산-기반 물질 (CP1 및 CP2)이 추가 연구에서 최대 관심 대상이다.
요약하면, B2 세포의 프로토타입은 신장 여과 및 적혈구생성 모두에 대해 일관된 긍정적 효과를 제공한다. 흥미로운 것은, B4 프로토타입 또한 신장 부위에 실질적인 개선을 제공하는데, 이와 같은 개선은 세포가 생체적합물질-기반 전달 시스템으로 전달되면 강화된다. 따라서, 치료 효과를 최대화시키는 것을 목적으로 하는 실험은 세포- 및 전달 시스템-프로토타입의 복합을 시험하는 것을 포함할 수 있다.
실시예 15 - 빈혈증이 있는 신부전 랫트 모델에서 신생-신장 세포 프로토타입의 효과
랫트에서 신부전 및/또는 빈혈증의 진행을 지연 또는 역전시키는 6개의 신생-신장 (NK)-세포 병합 프로토타입(B2, B3, B2/B4, B2/B3, B3/B4 및 B1/B5)의 비교 능력을 평가하기 위하여, 6가지 조합 프로토타입을 신장 질환이 확립된 랫트에게 신장으로 전달하였다. 연구 계획은 아래 표 14에 제공된다. 비-제한적인 성공 인자들은 다음을 포함한다:
1) 프로토타입은 항상성 HCT/RBC #을 초래하는 적혈구 생성을 유지/강화시킨다
2) 프로토타입은 적혈구 자극의 조직학적 증거를 제공한다
3) 프로토타입은 sCREAT 및 BUN 으로 평가되는 신장 기능의 측정가능한 개선 또는 안정화를 제공한다
4) 프로토타입은 신장에서 복구 및/또는 재생의 조직학적 증거를 제공한다.
5) 프로토타입은 유기체 수준의 개선(가령, 생존, 체중 증가, 혈액)을 전달한다.
6) 병합 프로토타입은 (B2) 단독에 의해 제공되는 것 이상의 성과를 제공한다.
세포: 상기에서 설명된 바와 같이, Lewis 수컷 랫트 공여자로부터 1차 신장 세포 배양물을 확립하였고, 확장시켰다. 이식 전, (6) 세포의 프로토타입 형태를 분리하였고, 하기에서 설명된 바와 같이 조합하였다(시험 대상물)
시험 대상물: 시험 대상물은 배양된 1차 세포로 구성되며, 상기에서 설명된 바와 같이, 확장되고, 증식되고, 분취/농축 방법을 거쳐 특정 세포 하위집단을 얻었다. 특정 분취물들은 이식 전 이들의 표현형을 확인하기 위하여 분자적으로 및 기능적으로 특징화되었다. 각 분취물은 다음과 같은 특징을 가진다:
● B2: 강력한 알부민 흡수를 할 수 있는 대부분 전단 세뇨관 세포를 함유하는 세뇨관 세포를 주로 포함하며, 일부 말단 세뇨관 및 집합 도관 세포도 있다. 다른 확인된 세포 유형 (엔도크린, 사구체, 도관)은 단지 소량만 존재한다.
● B4: 엔도크린, 도관, 및 사구체 세포로 구성되나, 사실상 주로 전단의 일부 작은 세뇨관 세포도 포함된다. 이 분취물내에 일부 세포는 신장 줄기 또는 조상 세포 집단과 일치되는 특징을 가진다(가령, 낮은 측면- 및 전방-산란, 및 신장 발달과 연관된 표식들의 발현)
● B1: 말단 세뇨관 및 집합 도관 세포를 주로 포함하고, 다른 세포 유형이 소량 포함된다.
● B3: 주로 전단 세뇨관 세포를 포함하고, 소량의 엔도크린, 도관, 사구체, 및 조상세포-유사 세포 (특이적 발달 관련된 표식들의 발현 및 유세포 분석에 의해 낮은 측면 및 전방-산란이 존재하는 것으로 한정된)도 존재한다.
● B5: 매우 작은 세포, 엔도크린, 도관, 및 사실상 조상 세포-유사를 포함한다; 이 분취물은 또한 매우 낮은 생존력을 가진 세포도 포함하고, 전체적으로 집단의 매우 작은 부분을 나타낸다.
세포들은 시험을 위해 정상적인 건강한 신장에서 자연적으로 생성되는 혼합물에 근거한(서로에 대해 상대적) 비율로 복합되었다.
● B2: 신장 기능의 우수한 생존 및 안정화를 제공하였고, 특히 세뇨관 세포 격실의 복원과 관련된 우수한 기능을 제공하였다는 것을 논증하는 기존 실험에 근거하여 단독으로 시험되었다.
● B3: B3은 B2의 세뇨관 기능적 특징을 공유하고, 엔도크린, 사구체, 및 B4의 조상세포-유사 세포의 일부를 포함하고, 따라서 이들 두 집단의 복합 효과를 제공할 수 있다는 전제에 근거하여 단독으로 시험되었다.
● B2/B4: 이 병합은 기존 연구에서 B2에 의해 제공된 신장 여과 기능에서의 실질적인 효과와 B4 치료에 나타난 다소 덜 명확한(그러나 유의적인) 효과 (사구체 개선, 엔도크린 기능)가 복합되어 더 포괄적인 치료 효과를 제공할 수 있다는 전제에 근거하여 시험되었다.
● B2/B3: 이 병합은 기존 연구에서 B2의 성과, 및 B3의 B2 및 B4와의 공유된 특징에 근거하여 시험되었다.
● B3/B4: 이 병합은 선조세포-유사, 엔도크린, 및 사구체 세포의 상대적으로 더 많은 용량이 전달될 경우 치료 값을 강화시킬 수 있는 지를 판단하기 위하여 시험되었다.
● B1/B5: 이 병합은 집합 도관 세포 및 작은 조상세포-유사, 엔도크린, 및 도관 세포의 혼합물이 다양하게 시험된 신장의 기능에 걸쳐 치료 효과를 제공하는 지를 판단하기 위하여 소수의 랫트에서 시험되었다(이 혼합물에는 기능을 하는 세뇨관 세포는 거의 존재하지 않는다)
시험에 사용된 동물 모델: 성인기 Lewis 암컷 랫트를 Charles River Laboratories (CRL, Portage, MI)에서 구하였고, 대부분의 랫트는 운반 전에 2-단계 5/6 신적출 (NX)을 받았다(치료군 및 세부상항은 하기 표 14 참고). 본 연구를 위하여, 반-신장적출된 대조군이 추가되었고, 5/6-신장적출된 랫트의 생성에 이용된 전체-신장 제거 시술과 동일한 시술을 이용하여 CRL에서 만들었다. 신장적출된 랫트과 대조군 모두다 RTI International (Durham, NC)으로 이동시키고, 치료 전 약 5주간 우리가 가두고, 모니터하였다. 밴더에서 실행된 동물 모델 및 외과적 시술은 실시예 7 및 9에서 이용된 것과 동일하였다. 기존 연구에서, 랫트는 이식 전 5-8주간 신적출 후 상태를 유지시켜, 매주 혈청 분석을 통하여 유의적이고 지속적인 요독증을 확인하였다. 프로토타입은 질환이 있는 신장 유조직으로 전달되었고, 이식 후 3개월을 두었다. 본 연구는 이식후 6개월 까지 지속되며, 따라서, 다양한 조합의 프로토타입의 내구력에서의 차이를 구별할 수 있다.
외과술: 남아있는 신장의 말단을 통하여 접근되는 피질수질 접합점을 표적으로 하여 세포 프로토타입을 신장 실질조직으로 전달하였다.
측정: 동물의 체중을 매주 측정하였다. 2주마다 한 번씩 혈청 및 혈액학 분석은 치료 전 대조군으로부터 연구 동안 살아있을 때 신장 기능 (BUN 및 CREAT) 및 적혈구생성 (HCT 및 RBC)의 평가를 제공한다. 포괄적인 혈청 및 혈액학 패널은 기준 시점(치료전 주), 치료 후 6주 시점, 치료 후 12주 시점에 실시하였고, 연구 동안 6주 간격으로 반복하여 실시하였다. 혈압 측정은 꼬리 끝에서 6주, 12주 및 남은 연구 기간 동안 매 6주 마다 실시하였다. 소변 검사도 10-11주에 및 연구 동안 주기적으로 실시하였다. 부검시, 기관(신장, 간, 비장, 심장, 폐)의 중량을 측정하였고, 조직 분석을 위해 수거하였다. 대퇴부 골수를 적혈구생성 평가를 위한 조직학적 분석을 위하여 수거하였다.
[표 14]
Figure 112018083309028-pat00016
랫트는 무작위로 군으로 할당됨.
* #172는 이식 시점에 sCREAT >1.0 이었다 (건강한 대조군의 >2×).
** #183 및 188는 신적출의 외과적 부위에서 농양이 발현되었고, 이는 벤더로부터 전달을 받은 직후에 발견됨; 이들 랫트는 연구 수의사에 의해 Clavamox의 2주 과정으로 치료를 받았다.
결과
수용자 동물은 5/6 신적출 시술의 5주 이내에 요독증 질환을 얻었고, 이것은 혈청 크레아티닌의 배가, BUN의 상당한 상승 및 HCT의 약간 감소로 확인되었다. 치료 후 12주 시점에서, B2, B2/B4, B3, 및 B1/B5 군은 100% 생존률을 가졌다. 혈청 및 혈액 데이터에서 모든 치료군은 NX 치료를 받지 않은 또는 NX 운반체-치료를 받은 랫트과 비교하였을 때, 더 낮은 평균의 CREAT 및 BUN과 더 높은 HCT를 가진다. 상이한 조합에 걸쳐 임의의 주어진 매개 변수에 있어서 변수들이 있지만, B2/B4 조합이 가장 포괄적인 효과를 제공하였고, 데이터는 생존 (100%, 치료를 받지 않은 랫트는 25%), 체중 증가 (11%, 치료를 받지 않은 랫트는 -3.5% ), 여과 기능 (CREAT 및 BUN의 안정화), 단백질 보유 (소변 및 혈청 단백질 수준에 의해 확인됨), 적혈구생성 (건강한 대조군에 대등한 HCT%), 및 고혈압 (건강한 대조군보다 약 10%>정도의 평균 전신 혈압 증가, 치료를 받지 않은 랫트는 30% 증가)에 대해 치료 효과를 논증한다. 치료 후 3개월 및 말기 혈청 화학, 조직병리학, 소변 검사 및 혈압 측정은 모든 매개 변수에 걸쳐 B2/B4 조합이 최적의 성과를 보여준 3-5개월의 관찰을 뒷받침한다.
아래 표 15에 나타난 바와 같이, B2/B4 프로토타입은 20주를 통하여 100% 생존을 촉진시켰다. B2, B3, 및 B2/B3 프로토타입은 치료후 20주 시점에서 80% 생존율을 가졌다. 20 주 시점까지 생존한 NX 랫트는 없었다. B2 프로토타입에 대한 이와 같은 결과들은 실시예 9 및 13에서 볼 수 있는 기존 관찰과 일치한다.
도 95는 12 주 시점을 통하여 다중 프로토타입이 체중 증가를 촉진시켰다는 것을 보여준다. 체중 증가 (변화 %)는 기준 시점부터 랫트가 빈사로 인하여 희생될 때 까지 또는 12주 시점까지 각 랫트에게서 별도로 계산되었다. B2 프로토타입으로 치료할 때 기존 연구에서 체중 증가가 있었고, 본 연구에서 12 주 시점에서 다시 볼 수 있으며, B2 로 치료한 실시예 14의 3개월 시점에서 체중 증가 %와 일치한다. 기존 실험과 달리, 치료를 받지 않은 NX 랫트도 기준 시점(치료 전)과 12 주 시점 사이에 평균 5.81%의 체중 증가가 있었지만, 오로지 한 마리 NX 랫트만 12까지 생존하였다(도 94 참고). 흥미로운 것은, NX 군의 세 마리 랫트중 두 마리는 절개부-부위 농양으로 인하여 Clavamox 치료를 받았고, 따라서, 이들 랫트는 신장 손송 후 신적출의 준-급성 상 동안 항생제에 노출되었다. 이와 같은 이유로, 운반체로 치료(가령, 무세포 허위 치료)를 받은 NX 랫트가 본 연구에 더 신뢰성있는 대조군으로 간주될 수 있다. NX + VEH 랫트에서 볼 수 있는 체중 감소는 치료를 받지 않은 또는 허위-치료를 받은 랫트의 기존 연구에서 볼 수 있었던 감소와 유사하였다. 세 가지 프로토타입, B3, B2/B4, 및 B2/B3은 치료를 받은 랫트에서 B2보다 우수한 체중 증가를 나타내었고; B3 및 B2/B4 프로토타입은 모두 100% 생존하였다(도 94 참고).
신장 여과 기능은 12주를 통하여 B2/B4 및 B1/B5 프로토타입에 의해 안정화되었다(도 96-97). 기존 연구에서 B2 세포 프로토타입으로 치료할 때 시간의 경과에 따라 신장 기능(sCREAT 및 BUN)의 안정화가 입증되었다. 치료 후 12-주 시점에서, B2 세포 프로토타입으로 치료를 받은 랫트의 군은 NX + VEH 및 NX 대조군 (이들 대조군 모두 12주 시점에서 생존이 감소되었지만)과 비교하였을 때, 더 낮은 sCREAT (3a) 및 BUN (3b)을 나타내었다. 12주에 100% 생존을 나타내는 군은 녹색 막대로 나타내며; <100% 생존을 나타내는 군은 검정 막대로 나타낸다. 오류 막대 = STDEV. B2/B4 및 B1/B5 조합 프로토타입 모두 B2 프로토타입 보다 약간 더 우수하였지만, 다른 프로토타입 (B3/B4, 예를 들면)은 좋지 못한 성과를 보여주었다.
단백질 체류 또한 치료 후 11주를 통하여 프로토타입 B2/B4에서 상당히 강화되었다(도 98 참고). B2로 치료되었을 때 기존 연구에서 혈청 전체 단백질 및 알부민 수준에서 개선이 있었고, 이보다는 적지만, B4 프로토타입에서도 개선이 있었다. 지난 연구와 일관되게, NX 및 NX + VEH과 비교하였을 때, 치료를 받은 랫트에서 혈청 전체 단백질, 알부민, 및 A/G 비율은 약간 증가되었지만, 통계학적 유의적인 차이는 없었다. 치료후 11주 시점에서 모든 랫트에게서 16-hr 소변을 수거하였고, 뇨단백질 (uPRO) 및 기타 매개 변수에 대한 측정을 위하여 소변 검사를 실시하였다. 모든 NX 랫트는 허위 NX 및 HEMI NX과 비교하였을 때, 상당히 더 높은 uPRO를 가졌고(p<0.01), 및 몇 가지 프로토타입은 uPRO의 감소된 경향을 나타내었고, B2/B4 프로토타입으로 치료를 받은 랫트만 치료를 받지 않은 NX 랫트과 비교하였을 때, uPRO가 상당히 감소되었다(p<0.05). 주의: NX + VEH 랫트는 그래프에 나타내지 않았고, 그 이유는 이들 소변의 수거가 모든 다른 군보다 4주 일찍 완료되었기 때문이다. 모든 소변 검사 데이터를 건강한 대조군에 대해 표준화시켰다. 비록 통계학적으로 유의적이지 않지만, 치료 후 6주 시점에서 측정된 치료군의 혈청 A/G 비율은 uPRO 수준과 역비례의 패턴을 보였다(각 군에 대해 도 98 및 도 99의 비교). B2/B4 치료군에서, 치료 시 단백질 배출의 감소는 혈청에 있는 단백질의 체류에 수반된다.
도 100-101에 나타난 바와 같이, 12주를 지나, B1/B5 및 B2/B4 프로토타입에 의해 적혈구 생성이 지원된다. 실시예 14에서 기록된 바와 같이, 부차적인 빈혈증은 신장적출된 랫트에서 미약하다. 검정 막대는 12주 시점에서 100% 미만의 생존군을 나타내고, 녹색 막대는 12주 시점에서 100% 생존을 가진 군을 나타낸다. 나타낸 데이터는 +/- SDEV이다. B1/B5 및 B2/B4 프로토타입은 12주 시점에서 최강의 적혈구생성 지원을 제공하였다. 이것은 B5 및 B4 세포의 분취물에 있는 EPO를 생산하는 세포의 상대적인 농축에 의해 제공된 것이다. HCT (5a)보다는 덜 분명하지만, RBC #는 다양한 치료군에서 HCT를 반영한다 (5b).
고혈압은 신부전의 5/6 신적출 모델의 측정가능한 특징이며, B2/B4, B2/B3, 및 B1/B5 프로토타입에 의해 부분적으로 조정된다(도 102 참고). 실시예 9 및 13에서 5/6 신장적출된 랫트에서 일부 치료는 심장 비대를 감소시켰다는 전체적인 관찰에 근거하여, 본 연구에서 ~6주 간격으로 혈압 (BP)을 측정하였다. CODA 비-침투성 꼬리 BP 모니터(Kent Scientific)를 이용하여 확장기 및 수축기 BP를 측정하였다. 시점당 한 마리 랫트에서 최소한 10개의 소프트웨어-입증된 측정을 하였다. 시점에서 BP 경향을 비교하기 위하여, 각 시점에서 각 랫트에 대한 데이터를 건강한 대조군의 해당 시점에서의 평균값에 대응시켰다. 연구 중간 시점에서(12 주), 세 가지 프로토타입 (B2/B4, B2/B3, 및 B1/B5)은 NX 대조군과 비교하였을 때, 평균 BP를 낮추는 경향을 나타내었다(통계학적으로 유의적이지 않은). 흥미로운 것은, 두 개 프로토타입 (B2/B3 및 B1/B5)은 6주부터 12주 시점까지 BP를 감소시키는 일부 증거를 실질적으로 보여주었다(도 102, 그래프에서 화살표 참고).
[표 15]
Figure 112018083309028-pat00017
도 103에 나타난 바와 같이, 3-5M 시점에서 조직학적 평가는 B2/B4-치료를 받은 랫트에서 섬유증의 감소, 더 건강한 세뇨관, 단백질 원주 축적 감소, 및 감소된 사구체경화증에 대한 증거를 제공하며, 이는 Nx-치료를 받지 않은 동물과 확실하게 대비된다. 한 개 신장 제거와 관련된 신장 비대는 도 103의 상부에서 전체적으로 강조되었고, 도 103의 하부 패널에 조직학적으로 강조되었다(Hemi-NX). Nx-치료를 받지 않은 동물과 확실하게 대조적으로 (16 주에 신부전으로 100% 사망함), 섬유증 감소, 더 건강한 세뇨관, 단백질 원주 축적 감소 및 감소된 사구체경화증이 있다. 도 103에서 나타낸 착색은 Masson 트리크롬으로, 푸른 색이 섬유증을 나타낸다.
치료 후 12주 시점에서 관찰
치료 후 12 주 시점에서, NX + B2 랫트의 100%가 생존하였고, 이것은 실시예 10 및 14에서 이들 세포 프로토타입의 성과와 일치한다. 건강한 대조군, NX + B2/B4, NX + B3, 및 NX + B1/B5에서 12주 시점에서 100% 생존한다. 치료 후 12주 시점에서, 최악의 생존은 NX + VEH (25%) 및 NX (치료를 받지 않은) (66%)에서 있었다. 모든 다른 프로토타입은 100% 미만 이지만, NX 및 NX + VEH 보다는 더 크다.
이들 실시예를 통하여 나타난 바와 같이, 시간에 따른 체중 증가는 생존과 연관되며, 전반적인 건강의 우수한 지표가 된다. 본 연구의 12주 시점에서, 모든 군(NX + VEH 제외)은 약간의 체중 증가가 있었지만, 치료를 받은 군 중에서 NX+B2/B4가 최대의 체중 증가가 있었으며, 11.3% 증가되었다 (건강한 대조군의 21%와 비교하여).
치료 후 12주 시점에서, NX + B2, B2/B4, 및 B1/B5 군에서 적혈구 생성은 건강한 대조군(SHAM NX)에 가장 근접하였다. NX + B2, B2/B4 및 B1/B5에서 신장 여과 기능의 전반적인 안정화 (sCREAT에서 점전적 감소가 없어지는 것으로 판단하였을때)가 있었다.
치료를 받지 않은 NX 또는 NX + VEH 랫트는 평균 전신 혈압이 137 mm Hg (건강한 대조군의 105와 비교하여)이었다. 프로토타입 B2/B4, B2/B3, 및 B1/B5으로 치료를 받은 NX 랫트에서 평균 전신 혈압의 감소 경향(NX 대조군과 비교하였을 때)이 있었다.
소변 검사 및 혈청 화학을 통하여 단백질 처리 평가에서 다음과 같은 사실이 나타났다 : 1) 소변에 방출되는 단백질 양과 혈청 알부민/글로불린 (A/G) 비율 사이에 강력한 역관계가 있다; 및 2) B2/B4 프로토타입으로 치료하면 뇨 단백질 방출이 상당히 감소되며, 동시에 혈청 A/G 비율은 상승되는데, 이것은 신장에 의한 단백질 처리가 이와 같은 치료에 의해 개선된다는 것을 말한다.
상기 모든 매개 변수들을 고려할 때, B2/B4 조합이 대부분의 매개변수에 걸쳐 B2 및 기타 프로토타입보다 월등한 최강의 효과를 제공한다.
상기 데이터들은 작업 프로토타입과 비-작업 프로토타입 사이에 중요한 차이들을 강조한다. 전반적으로, 작업 프로토타입은 비-작업 프로토타입 보다는 신장 기능을 더 잘 안정화시킨다. 특히, 작업 프로토타입은 19주 시점에 100% 생존을 제공하고, 혈청 CREAT 및 BUN을 낮추고, 단백뇨의 50% 감소, 등가의 적혈구생성 및 전신 혈압을 낮춘다. 예를 들면, 도 104는 19주 시점을 지나 작업 프로토타입에서 개선된 혈청 크레아티닌 수준을 보여준다. 비교를 위해, 도 105는 19주 시점을 지나 비-작업 프로토타입에서 혈청 크레아티닌 수준을 보여준다(PPT 참고). 도 106은 또한 작업 프로토타입과 비-작업 프로토타입 사이에 차이들을 추가로 보여준다. 작업 프로토타입은 비-작업 프로토타입 보다 단백뇨를 더 잘 감소시켰다. 감소된 단백뇨는 알부민-운반 세뇨관 세포의 존재와 관련되며, B4 성분(사구체, 도관)들과 복합되면 최상이다 (도 107 참고). 작업 프로토타입은 또한 비-작업 프로토타입 보다 혈압을 더 잘 유지시켰다(도 108 참고).
이론에 구속되지 않고, 신생-신장 증대 프로토타입은 항-섬유화 경로의 조정을 통하여 부분적으로 기능을 하며, 이는 감소된 섬유증(사구체 및 간질)으로 증명된다. 또한 신생-신장 증대 프로토타입은 세포외 매트릭스 (ECM) 환경(구조적 가연성)을 조절할 수 있는 것으로 보인다-네프론생성의 지원과 연관된 HA 형태인 고분자량 히알루론산(HA)의 합성을 담당하는 HAS-2 (히알루론산 합성효소 2)의 증가된 발현으로 증명됨. 설명된 신생-신장 확대 프로토타입은 또한 손상 모델에서 백혈구 침윤이 관찰되었기 때문에 대식세포 활성화를 통하여 면역 시스템을 조절할 수 있는 것으로 보인다. 일부 치료를 받은 조직에서 원시 구조가 관찰되었기 때문에, 신생-신장 확대 프로토타입은 네프론형성과 같은 발생학적 프로그램을 다시 시작시키거나 또는 재개시를 자극할 수 있는 것으로 보인다. 더욱이, 신생-신장 확대 프로토타입은 신장 조직의 재생을 자극 또는 재생을 일으킬 수 있는 조직-특이적 보상 세포를 포함하거나 재활성화시킬 수 있는 것으로 보인다.
연구-말기 관찰
기존 연구와 일관되게, 특정 생체활성 하위집단 및/또는 시험된 이와 같은 하위집단의 특정 세포/세포 조합은 세뇨관, 사구체 및/또는 엔도크린 기능에 대해 분명한 치료 효과를 제공하였다. 다음의 데이터는 기준값과 비교하였을 때, 연구 말기 임상 화학의 평균을 나타낸다.
도 109에 나타난 바와 같이, 연구 말기 혈청 크레아티닌은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4 및 Nx + B2/B3 세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 또는 안정화되었다. 개별 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
연구 말기 BUN (혈액 요소 질소)은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4 및 Nx + B2/B3 세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 안정화되었다(도 110). 각 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
연구 말기 혈청 알부민 (ALB)은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4 및 Nx + B2/B3 세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 안정화되었다(도 111). 각 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
도 112에 나타난 바와 같이, 연구 말기 전체 혈청 단백질 (TPRO)은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4 및 Nx + B2/B3 세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 또는 안정화되었다. 각 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
연구 말기 혈청 인(PHOS)은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4 및 Nx + B2/B3 세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 안정화되었다(도 113). 각 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
도 114에 나타난 바와 같이, 연구 말기 전체 혈청 칼슘(전체 단백질 [Ca] - 0.4[TP] + 3.3 =전체 단백질에 대해 보정됨)은 Nx 대조군과 비교하였을 때, Nx + B2/B4세포/세포 조합에서 상당히 개선되거나 또는 안정화되었다. 각 동물의 연구 말기 측정값에서 기준값을 빼고, 그 다음 각 치료군에 걸쳐 평균하였다. 선택된 시험군에 대해 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
여기에서 연구를 통하여 시험된 프로토타입 시험의 기능 결과는 하기 표 16에 나타낸다. 표 16에 나타난 바와 같이, B2/B4 및 B2/B3의 세포/세포 조합은 상기 B2 단독에 의해 제공되는 것 이상의 효과를 제공하였다.
[표 16]
Figure 112018083309028-pat00018
결론적으로, 상기 데이터는 신장의 신장 여과 (사구체) 및 재흡수 (세뇨관) 기능(sCREAT, BUN, 단백질 체류, 칼슘 균형)에 있어서 상당한 개선이 있음을 나탄낸다. 중요한 것은, B2/B4 및 B2/B3의 세포/세포 조합의 생체내 치료 활성은 생체내에서 재생적 결과를 보강하기 위해 공조적으로 작용하였다. 이와 같은 조합 프로토타입은 B2 단독에 의해 제공되는 것 이상으로, 및 이를 넘어선 효과들을 제공하였다.
실시예 16 - 질환이 있는 인간 신장 생검으로부터 신장 세포의 분리 및 확장
본 연구의 목적은 질환이 있는 인간 신장의 작은 생검으로부터 세포 산출, 생존능 및 확장의 기술적 한계를 판단하기 위한 것이다.
신장 조직 획득: 외과적 외식편으로부터 약 19시간 후 운송기관을 통하여 NDRI로부터 신장 (우측)이 도착하였다. 포장을 열고, 70% 에탄올과 BacDown 클린져로 외부를 철저히 소독하고, 신장을 담고 있는 용기를 조직 배양 후드에 위치시켰다.
신장 생검 수거: 지방 및 결합 조직을 신장으로부터 제거하였고, 남아있는 신장은 고유한 상태로 캡슐에 넣는다. 멸균된 생검 펀치를 이용하여 신장으로부터 생검을 수거하였다(n=8)(데이터 나타내지 않음). 생검에서 분명한 신배(calyx)를 제거하고, 캡슐에 넣고, 무게를 측정하였다. 각 생검은 멸균된 15 mL 원뿔 튜브에 두고, 칼슘없는 PBS (생검 1-4) 또는 칼슘-함유 PBS (생검 5-8)에서 37℃에서 5분간 세척하였다. 후속적으로, PBS 헹굼액을 흡출에 의해 버리고, 생검 조직을 절단 하였다.
생검 절단: 각 생검을 3mL 절단 완충액 (4 단위의 Dispase 1 (Stem Cell Technologies)/HBSS, 300 Units/mL의 콜라게나제 타입 IV (Worthington) + 5mM CaCl2 (Sigma))에 담구고, 20분간 부드럽게 교반시키면서 37℃ 수조에서 항온처리하였다. 2mL의 절단된 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 배지를 넣고, swinging bucket 원심분리기에서 5분/1,100rpm으로 원심분리시켜 세포를 펠렛화시켰다. "Digest 1"동안 방출된 세포는 각 생검에서 별도로 헤아리고, 그 수를 기록하였다. 그 다음 세포를 배지 (1x)로 세척하고, 배지 1mL에 재현탁시키고, 라벨된 T25 조직-배양 처리를 받은 플라스크에 두었다. 각 나머지 생검에 1mL의 새로운 효소 절단 완충액을 첨가하였고, 남은 조직은 멸균된 가위를 사용하여 추가적으로 다졌으며, 생검 조직은 추가 40분간 부드럽게 교반시키면서 37℃ 수조에서 절단시켰다("Digest 2"). 절단 혼합물은 100μm필터를 통하여 깨끗하고, 멸균된, 15 mL 원뿔 튜브로 여과시키고, 5 mL 배지를 복합시켰다. 원심분리 및 세척(2×)후, 세포를 배지에 재현탁시키고, 수를 헤아렸다. 10% 용적 트립판 블루를 첨가하여 이 단계에서 생존능을 평가하였다. 세포 수 및 생존능 %을 기록하였다.
도말(Plating): 각 생검 (Digest 1 + Digest 2)에서 방출된 모든 세포를 함께 단일 T25 플라스크에 도말하였다. 배양물은 100% 배지 교체하고, 현미경 사진은 도말후 48시간에 촬영하였다.
결과
환자 정보/질환 상태 확인. 타입 II 당뇨병 및 신부전 병력이 있는 여성 공여자, 85kg, 52세 YO(카프카스인)으로부터 HK0019 신장을 수거하였다. 사망 원인은 심혈관 부전 및 산소결핍이었다. 사망시, 빈혈증 및 신부전의 전신 증거가 있었다(표 17). 높은 BUN 및 크레아티닌, 소변에 고단백질 및 낮은 혈청 단백질, 낮은 혈청 칼슘 및 높은 혈청 인, 및 심각한 빈혈증 (낮은 헤마토크릿, RBC, 및 헤모글로빈)이 두드러진다. 표 17에서 정상 범위를 명백하게 벗어난 매개변수를 굵게 표시하였다.
[표 17]
Figure 112018083309028-pat00019
신장, 전체적인 관찰. 전체적인 관찰시, 신장은 정상적인 크기였지만, 섬유증이 있는 부위에는 옅은 색이 나타났다. 양분시(도면 참고), 조직은 관주가 부족한 것으로 보였고, 피질과 수질 사이의 경계가 불명확하고 희미하였다. 신배를 침범하는 신장 주변 지방의 양이 상당하였다.
생검 결과 (수율 및 생존능). 각 생검에 대해 초기 중량, Digest 1 수율, Digest 2 수율, 및 최종 생존능%을 기록하였다(표 18). 칼슘없는 세척 단계를 이용하여 처리된 생검은 주로 단일 세포를 포함하는 현탁액을 만드는 경향이 있고, 칼슘-함유 세척 단계를 이용하여 처리된 생검은 크기가 3-7개의 세포 클러스터를 주로 포함하는 현탁액을 만들었다. 전반적인 수율은 칼슘-함유 세척 시술이 약간 더 높지만, 전체적인 생존능은 칼슘없는 세척 시술이 더 높았다. 모든 생검의 평균 세포 수율은 7,604 ± 807 세포/㎎ 조직이었다. 생검중 8/8 (100%)가 배양이 되었고(데이터 없음) 6일 기간에 걸쳐 확장되었다.
[표 18]
생검 산출 결과
Figure 112018083309028-pat00020
확장 수율 결과. 각 (8) 생검으로부터 개시된 p0 배양물은 트립신 치료하여 수확하였고, Nexcellom 세포분석기를 이용하여 세포수를 헤아렸다. 생존능을 계산하였다(표 19 참고). 생검 개시된 배양물중 대부분(7/8)은 5일에 걸쳐 상당히 확장되어(평균 6.0 배), 배양후, 생검당 평균 180만개의 살아있는 세포를 만들었다(데이터 나타내지 않음).
[표 19]
확장 후 수율(p0)
Figure 112018083309028-pat00021
요약하면, HK019 인간 공여자 신장은 명백한 신부전 및 빈혈증 환자로부터 구하였다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 질환이 있는 인간 신장으로부터 0.02 g의 적은 양과 피질/피질 수질 접점 조직을 포함하나, 신배 및 캡슐은 제외된 생검으로부터 배양물을 얻는 것이 가능하다. 질환이 있는 인간 조직의 신장 생검의 효소 절단 후 평균 수율은 7,604 +/- 807 세포/㎎ 조직이었다. 효소 처리 전, 칼슘없는 세척 단계는 생존능을 개선시켰고, 단일 세포를 주로 함유하는 현탁액을 만들었다. 효소 치료 전 칼슘-함유 세척 단계는 최저수준으로 수율을 개선시켰고, 전체적인 생존능을 감소시키고, 세포 클러스트를 주로 함유하는 현탁액을 만들었다. HK0019에서 시작된 모든 (8/8) 생검은 생존가능한 배양물을 만들었다. 생검-개시된 배양물의 대부분(7/8)은 시간이 경과함에 따라 상당히 확장되어, 5일 배양 동안 6.0배 평균 확장되었다.
실시예 17 - 다중 종으로부터 신장 세포 분리, 배양 및 확장
본 분석의 목적은 설치류, 갯과 동물, 돼지, 및 인간 신장 견본으로부터 생성시킨 신장 세포 분리체의 주요 분리, 특징 및 확장(ICE) 실행능 특징을 검사하고 비교하는 것이다.
신장 조직 획득: 모든 신장 조직은 연구를 목적으로 인간 또는 포유류 조직 사용에 대한 FDA 및 기관 지침에 따라 수거하고 제공되었다. 모든 인간 견본들은 National Disease Research Institute (NDRI)에서 제공하였다. 돼지의 견본들(PK01 및 PK02) 및 갯과 동물 견본(2)(DK01 및 DK02)은 University of North Carolina(Chapel Hill)의 Dr. Timothy Nichols 박사가 제공하였다. DK03는 정상 비이글(Jackson Laboratories)에서 얻은 것이다.
세포 분리 및 배양. 제공받은 조직들의 무게를 측정하였고, 분리시켰다. 일부 실험에서 다양한-크기의 생검 바늘을 이용하여 최소한의 조직 요건들을 평가하였다. 다른 실험들에서, 추가 실험에 이용할 수 있도록 냉동보존된 세포 원료를 만들기 위하여 가능한 최대한의 조직을 해리시켰다. 조직을 효소 절단 방법에 사용하거나 또는 외식편 배양에 사용하여 p0 1차 배양물을 확립하였다. 그 다음 확립된 배양물을 계대하거나 및/또는 냉동보존하였다.
결과
수율/특징 비교. 각 범주에서 조직 g당 평균 수율이 계산되었다(하기 표 20 참고). 청년기 설치류 조직 및 CKD 인간 조직을 제외하고, g 당 17 - 2,500만개 범위가 된다. 모든 종으로부터 확장이 이루어졌고(도 115-117), 및 설치류로부터 유도된 배양물을 제외하고, 일련의 계대 및 냉동 보존으로부터 배양물의 재확립이 되었다. 배양된 세포의 특정 하위집단의 분취 또한 모든 종에 걸쳐 이루어졌다. 모든 종의 배양된 세포로부터 EPO 유전자의 발현 탐지는 신뢰성있었고, 질환이 있는 신장 조직으로부터 세포가 분리된 경우도 마찬가지였다. 정상적인 성인기 랫트(질환이 있는 성인기 랫트 배양물은 저산소 자극을 나타내었다)와 정상 개를 제외하고, 모든 종에서 저산조에 의해 자극된 EPO 발현 유도가 관찰되었다. 세뇨관 세포 존재/기능은 특정 세뇨관 표식(아쿠아포린, 비타민 D 하이드록시라제, 쿠비린, 메갈린)의 탐지 및 기능적 알부민 흡수 분석에 의해 평가되었다. 도 115-117는 개, 돼지 및 인간에서 성장 역학의 예를 나타낸다. 도 118은 0.02-0.03g의 질환이 있는 조직 생검으로부터 생성된 HK019, CKD 신장 배양물로부터 인간 세포 성장 역학의 예를 나타낸다(상기 실시예 16에서 추가 상세한 것을 참고). 도 118에서, BP3는 최저 수율의 생검 (전체 8개로부터)을 나타내고, BP5는 최대 수율의 생검을 나타낸다.
[표 20]
신장 세포 ICE, 종 비교
Figure 112018083309028-pat00022
결론적으로, 설치류, 개, 돼지 및 인간 신장 조직으로부터 신장 세포 분리/확장을 얻을 수 있다. CKD 확인된 경우에도 신장 세포 분리/확장을 얻을 수 있다. 0.02g와 같은 작은 조직의 조각도 신장 세포의 보급가능한 배양물을 일으킬 수 있다. 기능을 하는 세뇨관 세포 및 저산소-반응성 EPO를 발현시키는 세포는 분리된 및 확장된 신장 세포 배양물의 성분들이다.
실시예 18 - 정상적인 신장 조직과 만성 질환이 있는 신장 조직으로부터 치료 잠재력을 가진 세포를 분리 및 증식시킬 수 있다.
본 연구는 최근 설명된 EPO를 생산하는 세포(Aboushwareb, World J Urol. 2008 Aug;26(4):295-300. Epub 2008 Jul 8)를 함유하는 신장 세포의 배양된 집단이 진행성 및 말기 신부전 모델에서 질환이 확립된 이후 제공되었을 때 전신적인 효과를 제공할 수 있는 지를 판단하기 위해 기획되었다. 설치류에서 실시된 준비 조사는 이 집단에 포함된 세포들의 다중-요인성 치료 능력을 분명하게 설명하였으며, 배양된 세포들의 이질성 성질을 강조하였는데, 이 집단은 명백한 기능적 속성을 가진 세뇨관 세포 및 엔도크린 세포의 우세 집단, 및 다른 세포 유형 (사구체, 도관, 및 집합 도관)도 포함하였다. CKD의 가능한 치료 방법으로 자가 재생적 약물 방법이 고려되기 때문에, 질환이 진행될 때 치료 능력을 가진 특정 세포의 성분이 유지되는지 또는 상실되는지를 판단할 필요가 있다. 따라서, CKD가 정착된 인간 기관 공여자로부터 전체 신장 세포를 수거하여, 기능을 하는 세뇨관 및 엔도크린 세포가 조직에 존재하는지, 및 성공적으로 분리시키고 증식시킬 수 있는지를 판단하였다. 여기에 제시된 데이터들은 다음과 같은 증거를 제공한다: 1) 기능을 하는 세뇨관 및 엔도크린 세포를 함유하는 분리된, 및 증식된 세포 배양물은 진행성 신장 질환의 설치류 모델에서 임상적으로 상당히 유관한 효과들을 제공하고; 및 2) 심각한 CKD에는 유사한 세포가 보유되어 있으며, 이로부터 분리 및 증식될 수 있다. 이와 함께, 이들 데이터들은 CKD 치료를 위한 자가 세포 기반 방법에 대한 추가 연구를 지원한다.
재료 및 방법
세포 분리 및 배양
마우스 신장 조직으로부터 이질성 세포 현탁액을 생성하기 위하여 이미 설명된 바와 같이 초기 조직 해리를 실시하였다 (Aboushwareb T, et al, World J Urol 2008, 26:295-300, Joraku A, et al, Methods 2009, 47:129-133). 간략하게 설명하면, 랫트, 돼지 또는 인간 신장을 Hanks 평형 염 용액 (HBSS) (Sigma, St. Louis MO)으로 세척하고, 침지 기술(digestion techniques)(Joraku A, et al, Methods 2009, 47:129-133)을 이용하기 전에 피질수질 접합 조직을 선별하기 위하여 크게 절단하였다. 크게 절단된 조직을 다지고, 중량을 측정하고, Hanks 평형 염 용액 (HBSS) (Sigma)에 Dispase 1 (Stemcell Technologies, Vancouver BC) 4 Unit, 300 Unit/ml의 콜라게나제 타입 IV (Worthington Biochemical Corp, Lakewood NJ)+ 5mM CaCl2 (Sigma)로 구성된 완충액에서 해리시켰다. 생성된 세포 현탁액을 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (D-MEM) + 10% 태아 소 혈청 (FBS) (Invitrogen, Carlsbad CA)에서 중화시키고, 세척시키고, 혈청 및 보충제 없는, 케라틴세포(Keratinocyte) 배지 (KSFM) (Invitrogen)에 재현탁시켰다. 그 다음 세포 현탁액을 15% (w/v) 요오딕사놀 (OptiPrep™, Sigma) 구배에 넣어 적혈구세포 및 잔해를 제거하고, 5% (v/v) FBS, 2.5㎍ 인간 재조합 상피 성장 인자 1-53 (rEGF 1-53), 25㎎ 소 뇌하수체 추출물(BPE), 1X ITS 인슐린/트란스페린/셀레늄)을 함유하는 고 포도당 (4.5g/L) DMEM:KSFM 1:1 혼합물, 및 1×항생제/항진균제(모두 Invitrogen 제품)에서 ㎠당 25,000개 세포의 밀도로 배양을 시작하였다. 일부 경우, 대체 세포 분리 방법들이 이용되었으며, 신장 조직으로부터 외식편 배양을 하였고, 조직 배양처리된 받은 폴리스티렌 접시에 소량(0.01-0.02g)의 피질수직 접합 조직을 부착시키고, 상기에서 설명된 동일한 배양 배지에서 37℃/5% O2에서 가습 배양하는 것을 포함한다. 7-14 일이내에, 외식편 조직은 증식가능한 세포 배양물을 제공하였고, 효소로 절단된 조직으로부터 만든 배양물과 동일한 방식으로 계대배양시켰다. 0.25% 트립신과 EDTA (Invitrogen)를 이용하여 수확 또는 계대를 위하여 세포들을 분리시켰다. 트립판 블루 배제법을 통하여 생존능을 평가하였고, 혈구계산기를 이용하여 수작업으로 계산하거나, 또는 자동화된 Cellometer® 카운팅 시스템(Nexcelom Bioscience, Lawrence MA)을 이용하였다.
설치류 예비 연구
앞서 25, 26에서 설명된 바와 같이, Lewis 수컷 랫트(Hilltop)로부터 공여자(donor) 설치류 배양물을 얻었다. 단층 배양물을 조직 배양처리된 폴리스티렌 플라스크에서 고-포도당 DMEM 및 보충된 KSFM (Invitrogen)의 1: 1 혼합물상에 유지시켰다. 이식 전, 세포를 0.25% 트립신 + EDTA (Invitrogen)으로 수거하였고, 멸균된 인산염 완충된 염(PBS), pH 7.4 (Invitrogen)에서 3×세척하여, 혈청 및 배지 성분들을 제거하였다. 수거된 신생-신장 세포 (신생-신장 세포)을 재현탁시키고, 멸균된 PBS, pH 7.4에서 천만개 세포/120㎕ 농도로 멸균된 튜브로 나누어넣었다. Charles Rivers Laboratories으로 부터 공급업자에 의해 2-단계 5/6 신적출을 받은 랫트를 수령 랫트로 사용하기 위해 구입하였다. 모든 취급, 조작 및 보관은 실험실 동물 사용에 있어서, IACUC 및 NIH 정책에 부응하여 RTI International (Research Triangle Park, NC)에서 실시하였다. 나이가 일치되며, 조작을 받지 않은 암컷 랫트를 건강한 대조군(건강한, n=5)으로 사용하였다. 허위 신적출 시술(절개는 했지만, 신장 손상 또는 조직 제거를 하지 않은 (허위 NX, n=5))으로 추가 대조군을 만들었다. Series 1에서, 랫트(2 마리)은 세포 이식물(10 x 106 신생-신장 세포)을 제공받고, 신장적출된 랫트(4 마리)은 치료를 받지 않은 대조군(NX)과 동일하게 유지되었다. Series 2에서, 랫트(5 마리)은 세포 이식물 (5 x 106 신생-신장 세포)을 제공받고, 랫트(4 마리)는 치료를 받지 않은 대조군(NX)과 동일하게 유지되었다. 신생-신장 세포를 제공받은 랫트는 0.3 ㎎/kg 부프레노르핀 (Buprenex®, Reckitt Benckiser Pharmaceuticals, Inc, Richmond VA)을 복합 주입을 통하여 진정시킨 후 외과적 처리를 하였다. 이소플루란 쳄버에 랫트를 들여놓음으로써 마취를 시작하고, 수술 시술 동안 노즈-콘으로 마취를 유지시켰다. 우측 복부 측면 부위를 면도하고, 베타딘 및 에탄올로 깨끗하게 닦고, 남아있는 신장이 노출되도록 복부 측면을 작게 절개하였다. 신생-신장 세포 현탁액을 23G 바늘이 장착된 멸균된 1.0cc 주사기(Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ)를 통하여 신장 실질조직으로 직접 주입하였다. 근육 층은 4-0 Vicryl으로 닫고, 피부는 상처 클립을 이용하여 닫았다(두 제품 모두 Ethicon, Somerville NJ). 동물에게 산소를 공급하고, 의식이 깨어날 때 까지 지켜보았다. 모든 랫트는 외과술 후 추가로 0.3 ㎎/kg 용량의 Buprenex®을 제공받았다. 꼬리 정맥을 통하여 또는 안와 출혈을 통하여 연구 동안 매주 채혈하여, 혈청 BUN 및 CREAT, HCT 및 RBC #을 모니터하였다. Antech (Research Triangle Park, NC)에서 모든 혈청 및 혈액학 검사가 실시되었다. 동물이 빈사상태에서 희생되거나, 또는 연구 종료시 희생될 때, 신체 및 기관 중량을 재고, 조직학적 분석을 위하여 조직 시료(신장, 대퇴 및 흉골)을 포르말린-고정 및 파라핀-임베드시켰다.
돼지 및 인간 조직 획득
돼지 조직은 Dr. Tim Nichols (Department of Pathology, University of North Carolina at Chapel Hill, School of Medicine)에게서 제공받았다. CKD 및 비-CKD 돼지 신장 조직은 실험 동물 사용을 규제하는 University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill에 모든 연구 정책에 따라, 성인기 수컷 돼지(Sus scrofa)를 희생시킬 때 구하였다. sCREAT 및 BUN 값이 6개월 동안 지속적으로 증가되어, 심각한 신부적으로 거의 죽게되어 희생될 때까지 특발성 신장질환을 가진 성인기 수컷 종축(breeder) 돼지로부터 시료 PK001을 구하였다. 시료 PK002는 신장 질환이 없는 성인기 수컷 돼지로부터 구하였다. 연구 목적으로 인간 조직의 사용을 규제하는 모든 NIH 지침에 따라 National Disease Research Institute (NDRI)에서 CKD 및 비-CKD 인간 신장 조직을 제공하였다. 아래 표 21에는 각 시료에 대해 나이, 성별, 질환 원인 및 사망 원인이 기재되어 있다. 도관 투석을 6년 받은 공여자로부터 HK018을 구하였다. HK019는 23년간 NIDDM을 앓고, 투석 없이 신부전을 8년 앓고, 약물 비-순응성인 공여자로부터 구하였다. HK020는 8년+ 이상의 복막 투석을 받은 공여자로부터 구하였다. 견본들은 Viaspan™ 기관 보존 용액 (DuPont, Wilmington DE) (인간용) 또는 Hypothermasol®(BioLife Solutions, Bothell WA) (돼지 조직용)으로 4℃에서 운반되었으며, 수확후 24시간 이내에 Tengion Labs에 제공되었다.
조직학적 분석
조직학적 분석을 위해 처리되는 모든 조직은 24-48 시간 동안 10% 완충된 포르말린에 조직을 두고, 연속하여 파라핀-임베딩 및 착색을 위해 Premier Laboratory (Longmont, CO)으로 운반하기 위하여 70% 에탄올에 두었다. 헤마토실린 및 에오신(H&E), Periodic Acid Schiff (PAS), 및 Masson 트리크롬 착색은 표준 프로코콜에 따라 실시되었다. Digital Sight (DS-U1) 카메라가 장착된 Nikon Eclipse 50i 현미경에서 100×, 400×, 1000×및 2000×에서 이미지를 캡쳐하였다. 사구체경화증, 세뇨간간질 섬유증, 세뇨관 관강에서 단백질 원주, 기본적인 격실 조직화의 정도를 평가하기 위하여 수의학 병리학자 및 조직병리학자들이 조직들을 검사하였다.
유전자 발현 분석
신장 조직 및 세포 배양 시료로부터 다음과 같이 RNA를 분리하였다: QIAshredder (Qiagen, Valencia CA)를 이용하여 조직 또는 세포를 균질화시키고, RNeasy Plus Mini 분리 키트 (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리시켰다. RNA 보존성을 확인하였고, 분광 분석을 통하여 시료를 정량화하였다. Superscript®Vilo cDNA 합성 키트(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 에리트로포에틴 (EPO), E-캐드헤린 (E-CAD), N-캐드헤린 (N-CAD), 쿠비린 (CUB), 1 알파, 25-디하이드록시비타민 D3-24-하이드록시라제 (CYP24), 아쿠아포린-1 (AQP-1), 아쿠아포린-2(AQP-2), 네프린 (NEPH), 포도신 (PODO), 도관 내피 성장 인자 (vEGF), CD31, 및 vEGF 수용체 (KDR)의 발현은 완전한(catalogued) Taqman Probes 및 Primer 세트(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI-Prism 7300 Real Time PCR 시스템을 이용하여 정량적 실시간 PCR를 통하여 검사하였다. 시료를 내생성 18s rRNA (완전하게 발현된 인간 또는 설치류 유전자용), 펩티딜프롤일 이소메라제 B (PPIB) (중간정도로 발현된 설치류 유전자용), 또는 펩티딜프롤일 이소메라제 A (PPIA) (중간정도로 발현된 인간 유전자용)로부터 증촉된 cDNA에 대해 표준화시키고, 신장 조직 원천 또는 OriGene Technologies (Rockville, MD)에서 구입한 동일 종의 신장 cDNA에 대해 조정하였다.
면역학적 분석
초기 조직 해리 또는 흡착된 배양물의 트립신 처리에 의해 세포 현탁액을 만들고, 세포의 성분들을 확인하고 정량화시키기 위하여 유세포분석을 통하여 분석하였다. 이용된 항체들은 세뇨관 표식 E-CAD, N-CAD (둘다 Becton Dickinson), 쿠비린 (CUB) (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz CA), AQP-1, 및 AQP-2 (Abcam, Inc, Cambridge MA)을 포함하였다. 사구체 세포를 네프린 (NEPH) (Zymed Laboratories, Inc, San Francisco CA)으로 라벨시켰다. 도관 표식 CD31 (Becton Dickinson)을 이용하여 내피 세포를 확인하였다. EPO를 생산하는 세포는 단클론 EPO 항체 (US Biological, Swampscott MA) 및 표준 간접 세포내 착색 기술을 이용하여 확인되었다. 집합 도관 세포는 Dolichos 비플로러스 아글루티닌 (DBA) (Zymed Laboratories, Inc.)의 결합으로 확인되었다. 종-특이적 항체의 부재 및 항체 시약간에 열악한 교차-반응성은 랫트 및 돼지로부터 유도된 세포에 모든 표식을 적용시키는 것을 방해하였다. 이소타입-특이적 1차 항체 음성 대조군이 모든 실험에 이용되었다. 라벨된 세포는 FACSAria 유세포기(Becton Dickinson) 및 FlowJo 소프트웨어(Treestar, Inc.)로 분석되었다. 적절한 이소타입-일치된 대조군을 이용하여 음성 집단을 제어하였다. 다중 매개변수 분석을 이용하여 세포내 간접 착색을 이용한 세뇨관 및 EPO 양성 세포의 상대적인 비율을 결정하였다. 세포를 표면 세뇨관 표식으로 라벨시킨 후, 침투/차단 완충액 (0.2% Triton X-100 및 10% 염소 혈청을 함유하는 PBS)을 이용하여 60분간 세포를 침투시켰고, 펠렛화시키고, EPO(US Biological)에 대한 1차 항체를 1㎍/㎖/1 X 106 세포의 농도로 함유하는 침투/착색 완충액 (0.2% Triton X-100 및 2% 염소 혈청을 함유하는 PBS)에서 재현탁시켰다. 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리 후, 세포를 펠렛화시키고, Triton 완충액 (0.2% Triton X-100/PBS)으로 2회 세척하고, 플루오르크롬 Alexa A647(Invitrogen)에 콘쥬게이트된 2차 항 염소 항-마우스 IgG2A를 함유하는 1 mL의 침투/착색 완충액에 재현탁시키고, 추가 30분간 세포를 항온처리하였다. 그 다음 세포를 PBS로 세척하고, 1 mL PBS에 재현탁시켜 FACSAria 및 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 분석하였다. 음성 대조군으로, 동일한 플루오르크롬에 콘쥬게이트된 이소타입-일치된 단클론 항체와 나란하게 세포를 항온처리하였다. 일부 실험에서, 단층 배양물을 상기에서 열거한 항체로 착색시키고, 배양된 집단내에 특정 세포의 존재와 상대적인 분포를 형광 현미경으로 추가 확인하였다. 96 웰 조직 배양 처리를 받은 평판(BD Falcon 353219)에 웰당 10,000개 세포 밀도로 ~85% 합류되도록 세포를 배양시키고, 4% 파라포름알데히드 (PFA)에서 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 세척하고, 그 다음 PBS+ 0.5% BSA (Sigma)에서 10분간 차단시켰다. 4℃에서 하룻밤 동안 차단된 세포에 3㎍/㎕ 1차 항체 또는 이소타입 일치된 대조군을 라벨시켰다(Zymed Laboratories, Inc, San Francisco CA). 라벨된 세포를 PBS에서 세척시키고, 빛이 차단된 실온에서 30분간 Alexa 488 또는 Alexa 647 (Invitrogen)에 콘쥬게이트된 이소타입-일치된 2차 항체를 1㎍/㎖의 농도로 세포에 라벨시켰다. 세포를 PBS에서 세척시키고, BD Pathway 855 High-Content BioImager(Becton Dickinson)를 이용하여 이미지화시켰다.
EPO 탐지를 위한 등전 포커싱(Isoelectric Focusing) 및 웨스턴 블롯팅
Optimum Cutting Temperature (OCT) 냉동 배지에 임베드된 냉동된 전체 신장 조직을 단백질 시료 수거에 이용하였다. 신장 (캡슐, 피질, 수질 및 신배 포함)의 비-연속 10 미크론 절단면(7-8개)을 1.5 mL 폴리프로필렌 마이크로퓨지(microfuge) 튜브에 모으고, 4℃로 해동되도록 한 후, 13,000 RPM에서 1분간 원심분리하였다. 잔류 OCT 배지를 제거하고, 50 mM Tris (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.5% NP40, 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Applied Science, Indianapolis IN)을 함유하는 완충액에 세포를 용해시켰다. 용해는 실온에서, 매 2분마다 간헐적 볼텍스하면서 10분간 진행되었다. 시료를 13,000 RPM에서 1분간 원심분리시키고, 용해 상층액을 새로운 튜브로 이동시켰다. 단백질 농도는 BSA를 표준으로 이용하여 Bio-Rad Quick Start Bradford Assay를 통하여 결정하였고, 시료는 용해 완충액으로 최소한으로 풍부한 시료에 표준화시켰다. 배양된 HepG2 세포 (EPO를 발현시키는 것으로 공지된 인간 간 세포계) 및 NIH3T3 마우스 섬유모세포 (음성 대조군)로부터 용해물을 또한 제조하였다. pH 3-10의 IEF Gels (Invitrogen)의 각 웰에 시료당 40㎍의 단백질을 첨가하여 등전점 포커싱(IEF)을 실시하였다. 겔을 pH 3-10 양극 및 음극 완충액 (Invitrogen)에서, 100V에서 1시간 동안 전기영동시키고, 이어서, 200V에서 1시간 및 500V에서 최종 30분간 전기영동시켰다. 그 다음 제조업자의 지시에 따라 I-Blot 시스템 (Invitrogen)을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 그 다음, 0.1% Tween-20 (TBS-T) (Sigma, St. Louis, MO)과 Tris 완충된 염에 용해된 4% w/v 저지방 우유 30mL로 진동시키면서 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 실온에서 하룻밤 동안 5 mL TBS-T (0.1% Tween 20)+ 2% w/v 저지방 우유로 1:600 희석시킨 항-인간 EPO 단클론 IgG2a MAb 2871 (R&D Systemss, Minneapolis MN)을 막에 프로브시켰다. 막을 TBS-T로 3회(10분) 세척하고, TBS-T + 2% w/v 저지방 우유로 1: 50,000 희석된 HRP-콘쥬게이트된 토끼 항-마우스 IgG (Zymed, San Francisco CA)를 실온에서 1.5시간 동안 진동시키면서 프로브시켰다. 막을 TBS-T로 3회/10분 세척하고, 이어서 diH2O로 2회 10분 세척하였다. 제조업자의 지시에 따라, ECL Advance 화학발광 시약(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway NJ)을 이용하여 블롯을 발생시켰다.
알부민 흡수 분석
Zhai et al 27에서 설명된 바와 같이, 특정 전단 세뇨관 수용체, 메갈린 및쿠비린에 의해 중재되는 알부민 세포내이입의 활성화 및 억제로 신장 전단 세뇨관 세포 기능을 평가하였다. 96-웰 평판(Optiplate™, Becton Dickinson)에서 표준 배양 배지 (고포도당 (4.5g/L) DMEM: KSFM 1:1 혼합물과 상기에서 설명된 모든 보충제)로 웰당 5,000개 및 10,000 세포의 밀도 또는 25,000개 및 40,000개 세포의 밀도(랫트의 경우)로 인간 및 돼지 신장 세포를 접종하였다. 37℃/5% CO2에서 세포를 배양하고, ~85% 합류되도록 성장시킨 후 분석하였다. 분석 시작 18-24시간 전, 성장 배지를 페놀적색 없는, 혈청 없는, 저-포도당 (1g/L) DMEM-1×항생제/항진균제 및 2mM 글루타민으로 교체시켰다(모두 Invitrogen 사 제품). 분석 당일에, 페놀 적색 없는, 저-포도당 DMEM+ 10mM HEPES, 2mM 글루타민, 1.8mM CaCl2 및 1mM MgCl2로 구성된 분석 완충액으로 세포를 2회 세척하고, 37℃/5% CO2에서 가습실에서 30분간 분석 완충액으로 항온처리하여 공인자에 적절하게 노출되도록 하였다. 그 다음 37℃/5% CO2에서, 30분간 최종 농도가 25㎍/㎖되도록 플로레신-콘쥬게이트된 또는 로다민-콘쥬게이트된 소 알부민 (Invitrogen) 또는 인간 혈청 알부민 (Abcam, Inc.)에 세포를 노출시켰다. 웰을 얼음 냉각된 PBS로 3회 세척하여 세포내이입을 중단시키고, 10 ㎍/㎖ Hoechst 핵 염료(Invitrogen)를 함유하는 2% PFA에 바로 고정시켰다. 억제 연구를 위하여, 재조합 수용체-연합된 단백질 (RAP) (Ray Biotech, Inc, Norcross GA), 메갈린:쿠비린 매개된 알부민 흡수 27의 특이적 경쟁 억제제를 이용하여 반응의 특이성을 설명하였다. 상기에서 설명한 바와 같이 배양물을 제조하였고, 1 μM RAP 및 12.5-25 ㎍/㎖의 형광 콘쥬게이트된 알부민으로 항온처리하였다. 추가 실험에서, 분석의 항온 처리 온도를 4℃로 낮추어 수용체 매개된 알부민 흡수를 부분적으로 억제시켰다. 모든 경우에, BD Pathway 855 High-Content BioImager (Becton Dickinson)를 이용하여 현미경을 통하여 세포를 눈으로 확인하고 이미지를 캡쳐하였다.
결과
기능을 하는 세뇨관 및 EPO를 발현시키는 세포는 신장 기능부전의 설치류 모델에 치료 효과를 제공한다.
마우스에 대해 Aboushwareb et al. (Aboushwareb T, et al, World J Urol 2008, 26:295-30025)에서 설명된 방법에 따라 Lewis 수컷 랫트로부터 1차 신상 세포 배양물을 성공적으로 분리시켰고, 배양물내의 세포에 의한 EPO 유전자의 산소-제어된 발현을 확인하였다 (도 125c에 포함된). 또한, 다중 확립된 배양물의 면역세포화학 특징에서 우세한 세포 표현형은 세뇨관 (전단 또는 말단)이지만, 사구체, 집합 도관, 및 도관 세포 또한 존재한다는 것을 보여주었다(도 119). 다중 준비물에 대한 유동세포 분석에서 전단 및 말단 세뇨관 세포의 상대적인 빈도는 각각 20-35%이며, 사구체 세포는 10-15%이고, 도관 세포는 5% 미만이며, 집합 도관 세포는 10-15%, 및 EPO를 생산하는 엔도크린 세포는 10% 미만이었다. 신장에서 고유 EPO를 생산하는 세포는 Maxwell et al에 의해 피질수질 접점 28의 세뇨관 주변 부위에 풍부한 고도로 특화된 간질 섬유모세포로 확인되었다. 생체 연구에서, 심각한 저산소 조건하에, EPO를 발현하는 간질 섬유모세포의 수가 증가되고(Eckardt KU, et al,Kidney Int 1993, 43:815-823), 및 염화 코발트에 노출시 세뇨관 세포에서 EPO가 발현되었다는 것이 설명되었다(Mujais SK, et al, Cell Biochem Biophys 1999, 30:153-166). 다중-매개변수 유세포분석를 이용하여, 랫트 배양물에 포함된 EPO를 발현시키는 세포들이 전단 및 말단 세뇨관 세포와 구별된다는 것이 설명되었다 (도 120 a, b). 배양물에서 쿠비린-양성 전단 세뇨관 세포의 기능은 형광-콘쥬게이트된 알부민의 흡수를 통하여 평가되었고, 경쟁 억제제, RAP의 추가에 의해 흡수의 특이성이 확인되었다(도 120 c-f). 따라서, 설치류 배양물은 치료와 관련된 잠재적 기능을 가지는 최소한 두 가지 세포 유형 - 저산소-반응성 EPO를 발현시키는 세포와 단백질 흡수를 할 수 있는 세뇨관 세포-를 포함하였다.
공급자에게서 2-단계 5/6 신적출을 받은 Lewis 암컷 랫트로부터 매주 채혈하여 sCREAT 및 BUN를 통하여 신장 여과 기능을, 및 HCT 및 RBC을 통하여 적혈구 생성을 평가하였다. 신적출 4주 이내에, 신적출을 하지 않은 또는 허위 신적출 시술을 받은 건강한 대조군과 비교하였을 때, sCREAT 및 BUN는 거의 2배가 되었고, HCT는 감소되었다. 신적출 시술을 받은 랫트의 100% (15마리중 15마리)는 신부전 상태로 진행되었으며, 자발적인 회복은 관찰되지 않았다. 신적출 후 7-8주 사이에 일부 랫트에게 배양된 수컷 신생-신장 세포를 정맥 투여하였다. 제2군 랫트는 어떤한 중재도 받지 않았다. 치료후 3개월까지 랫트를 관찰하였고, 매주 sCREAT 및 BUN를 통하여 여과 기능을 모니터하고(도 121a에 나타낸 sCREAT), 및 HCT 및 RBC 수를 통하여 적혈구 생성을 모니터하였다(도 121b에서 나타낸 HCT). 본 연구에서, 치료를 받지 않은 모든 랫트는 신적출 시술 12-16주이내에 죽었다 (치료 시점이후 4-8주). 대조적으로, 신생-신장 세포-치료를 받은 모든 랫트는 연구 종료시점까지 (치료 후 3개월) 생존하였다. 사망시, 세포 치료의 추가적인 잠재적 치료 효과를 확인하기 위하여 비교 임상 화학을 실시하였고(도 121c), 및 신장 및 골수 모두에서 조직-수준의 효과를 확인하기 위하여 조직학적 분석을 실시하였다(도 122). 시료 수는 작지만, 신장 기능 (sCREAT, BUN), 및 엔도크린/ 적혈구생성 기능 (HCT) 모두에 있어서, 신생-신장 세포로 치료하면 통계학적으로 유의적인 개선이 있었다. 도 121c는 HCT, RBC #, 헤모글로빈 (HB), 혈청 알부민 (sALB), 및 혈청 전체 단백질 (TPRO)에서 유의적인 감소, 및 혈청 BUN, sCREAT, 및 혈청 인 (sPHOS)의 유의적인 증가를 포함하는 5/6 Nx 모델의 주요 임상적 특징들을 강조한다. 중요한 것은, 신생-신장 세포는 치료를 받지 않은 NX 랫트에서 볼 수 있는 수준 보다 혈청 BUN, sCREAT, 및 sPHOS 수준을 훨씬 더 낮추었고, HCT, RBC #, sALB, 및 TPRO을 상당히 강화시켰다(도 121c). 더욱이, 신장 실질조직의 조직학적 비교 검사에서, 신장적출되고, 치료를 받지 않은 신장과 비교하였을 때, 초점 지역에 사구체병증이 약간 감소되었으며, 세뇨관의 초점 재생 및 단백질 원주가 약간 감소되었음을 보여주었다. 연구를 통하여 적혈구 생성(HCT 및 RBC)에서 주목된 전체적인 긍정적 효과는 전단 대퇴 및 흉골의 골수 검사에서 조직학적으로 확인되었으며, 치료를 받지 않은 랫트와 비교하였을 때, 신생-신장-CELL 치료를 받은 랫트의 골수는 적혈구 세포가 더 많이 존재한다는 것을 명확하게 보여주었다(도 122). 희생 시점에서 수컷 숙주 신장에 암컷 기증 세포의 존재는 숙주 신장의 게놈 DNA에서 y-염색체 특이적인 SRY 유전자의 탐지로 확인되었다(데이터 나타내지 않음). 이와 함께, 이와 같은 예비 생체 관찰에서, 신생-신장 세포는 만성 진행성 신부전의 5/6 신적출 모델에서 치료 가치를 제공하여, 전반적인 생존의 강화, 신장 여과 기능의 안정화, 혈청 단백질의 체류, 혈청 인의 감소 및 적혈구 항상성 복원을 유도할 수 있다(도 121c).
CKD가 있는 돼지 및 인간으로 기능을 하는 신장 세포 분리의 성공적인 해석
Aboushwareb et al의 작업 및 배양된 신장 세포 집단의 이식으로부터 얻은 치료 효과를 보여주었던 설치류 예비 연구의 결과에 근거하여, 우리는 1) 큰 포유류 종으로부터 유사한 세포 등가물의 분리 및 증식이 가능한 지; 및 2) CKD를 가진 피험자의 신장으로부터 확립한 배양물에 유사 세포 등가물이 존재하는지를 판단하기 위한 시도를 하였다. 돼지(2) 및 인간 신장(5) 견본을 재료 및 방법 부분에 따라 이용하였다. 인간 (HK018, HK019, 및 HK020) 및 돼지(PK001) CKD 견본에서 혈청 및 혈액학적 검사를 통하여 신부전을 확인하였다. 표 21은 사망시에 CKD 및 비-CKD 견본에서 측정하였을 때, 기능을 발휘하지 못하는 신장 기능과 연관된 주요 전신 매개 변수를 요약하였으며, 돼지 및 인간 CKD 피험자에서 BUN 및 sCREAT의 상승이 주목된다. 더욱이, CKD 피험자에서 진전된 신부전에 일반적으로 빈혈증이 수반되는 것을 나타내는 HCT 및/또는 헤모글루빈 HB은 약한 내지 중간 정도 부족하였다. CKD 견본의 조직병리학적 특징을 도 123에 제시하며, 인간 및 돼지의 비-CKD 견본의 조직학적 특징과 대조하였다. 비-CKD 조직과 비교하였을 때, CDK 조직에서 특정 무늬의 섬유증, 사구체 경화 및 세뇨관 팽창과 단백질 원주가 있었다. 세 가지 인간 CKD 견본은 광범위의 질환 상태 및 원인을 제공한다. HK018 및 HK019 피험자는 비-인슐린 의존적 진성 당뇨병 (NIDDM) 및 고혈압에 부차적인 신부전을 가지며; HK018은 사망시 6년 이상의 도관 투석을 한 순응적 환자이며, HK019는 투석이나 신뢰성있게 약물 복용없었던 복약지시를 따르지 않은 환자다. HK020는 자가면역 질환에 부차적 신부전 병력을 가지고 있으며, 8년 이상의 복막 투석을 한 순응 환자다. 흥미로운 것은, HK018 및 HK019와는 달리, HK020 신장은 상당히 작았으며(종축으로 3인치 미만) 및 전체적으로 옅은, 섬유성 담낭으로 나타났다. 도 123은 HK020에서 조직학적 질환의 심각성을 강조하는데, 눈으로 확인가능한 세뇨관 또는 사구체가 거의 없다.
기능을 하는 세뇨관 세포의 분리 및 증식.
설치류 배양물에서 다중 세포 유형이 탐지되는데 (도 119 및 표 22 참고), 주도적인 표현형은 자연 상태의 세뇨관이었고, 설치류 준비 조사에서 전신 및 조직학적 데이터는 설치류 신장 세포 배양물의 생체 이식 때 세뇨관 격실의 치료 효과를 뒷받침하였다. 따라서, 돼지 및 인간 조직으로부터 기능을 하는 세뇨관 세포 분리 및 증식 가능성을 판단하기 위하여 조사하였다. 비-CKD 조직을 초기 물질로 이용하여 확립된 방법에 의해 돼지 및 인간 CKD 조직으로부터 1차 세포 배양을 시작하였다. 질환 상태(비-CKD 또는 CKD) 또는 종(돼지 또는 인간)에 무관하게, 주로 세뇨관 상피 세포를 함유하는 배양물을 만들었고, 조직의 작은 조각(<0.02g)을 이용하여 효소 절단 방법 또는 비효소적 외식편 방법을 이용하여 증식시켰다. 직접적인 비교에서, CKD- 및 비-CKD으로부터 유도된 배양물 간에 확장 능력에서 유의적인 차이는 없었다(도 124a). 쿠비린 양성 세포의 일부에서 알부민의 수용체 매개된 흡수가 관찰됨으로써 배양물에서 세뇨관 세포 기능을 확인하였다(도 124b-d, 및 표 22). 돼지 및 인간의 CKD 및 비-CKD 조직으로부터 배양된 1차 세포는 연속 계대후(p4를 통하여) 세뇨관 표식 발현 및 알부민 흡수 기능을 유지하였다. 확립된 배양물에서 세뇨관, 사구체, 집합 도관, 도관, 및 엔도크린 표식의 존재 및 상대적 발현은 돼지 및 인간 배양물에서 정량적 실시간 PCR에 의해 평가되고, 설치류와 비교하였다(표 22).
산소-반응성 EPO를 발현시키는 세포의 분리 및 증식.
qRTPCR를 통하여 CDK 및 비-CKD 조직에서 EPO를 발현시키는 세포의 존재를 확인하였다. 조직 획득 시점에서 CKD 피험자에서 전신 빈혈증이 존재함에도 불구하고(표 1 참고), 수령시점에서 비-CKD 조직 견본과 비교하여 CDK 견본에서 EPO mRNA가 더욱 풍부하게 발현되었다(도 125a에 나타낸 대표적인 시료들). 이들 시료의 등전점 포커싱 및 웨스턴 블롯 분석에서 유전자 발현 패턴은 일반적으로 단백질 수준에서 반복되었다는 것을 확인하였다(도 125b). 모든 CKD 및 비-CKD 신장 조직은 EPO를 발현시키는 세포를 함유하는 증식가능한 배양물을 만들었다. 적혈구 항상성을 유지시키기 위하여 생체내에서 EPO를 발현시키는 세포에 요구되는 주요 특징은 산소-반응성이다. EPO를 발현시키는 배양된 세포가 저산소 자극에 반응하여 EPO 전사를 상향 조절하는 능력을 검사하였다. CKD 및 비-CKD 신장 견본에서 확립된 EPO를 발현시키는 세포 배양물은 저산소 자극에 반응하여 자극 24시간 이내에 EPO 유전자 전사를 다양하게 상향 조절하였다(도 125c). 저산소 자극에 의해 관리유지 또는 세뇨관 유전자가 유도되지 않았다는 관찰에 의해 상향조절의 특이성이 확인되었다(자료 제공안됨). CKD 및 비-CKD 인간 및 돼지 조직으로부터 확립되고, 증식된 배양물은 다중 계대 및 냉동보관 및 배양 재개시 후에도 EPO를 발현시키는 세포를 보유하였다.
아래 표 21에 나타낸 바와 같이, CKD 및 비-CKD 환자로부터 돼지 신장 (PK001 및 PK002), 인간 신장 (HK016-HK020), 및 랫트 신장을 수거하였다. *진행성 신부전을 유도하기 위하여 2-단계 5/6 신적출 시술을 겪은 Lewis 암컷군에서 랫트 데이터를 수거하고 평균을 내었다; 나이가 일치되는 건강한 대조군은 비교를 위하여 제공된다. 굵은 표시의 숫자들은 실험실 표준 값에 따른 정상 범위 밖의 값을 나타낸다.
하기 표 22에 나타난 바와 같이, 물질 및 방법 단락에 따라, 돼지(PK001 및 PK002), 인간 (HK016-HK020), 및 랫트 (Lewis) 신장로부터 배양물을 만들었다. 신장의 주요 세포 격실(세뇨관, 사구체, 세뇨관, 도관, 및 엔도크린)을 나타내는 확립된 배양물에서 세포의 존재는 qRTPCR로 확인되었다. 인간-특이적 프로브의 이용으로 인간 시료를 좀더 정략적으로 및 광범위하게 분석을 할 수 있었다. 각 유전자의 발현은 내생성 대조군에 대해 표준화시키고, 종-일치된 새로운 전체 신장 조직에 대해 계산되었다. EPO의 발현은 21% O2 및 2% O2에서 검사되었고, 나타낸 값은 21% O2 발현 수준을 나타내며, (R)은 2% O2 조건에서 관찰된 상향조절을 나타낸다. 표 22에는 (R)로 나타낸 부분이 없음 다중 계대 (돼지 및 인간의 경우 p0-p4, 랫트의 경우 p0-p1)에서 각 배양물에서의 알부민 흡수 (ALB-U)도 평가되었다. 각 배양물에서 유세포 분석에 의해 측정되었을 때, 뚜렷한 낮은 측면 산란/낮은 전방 산란 (SSC/FSC)를 가진 하위집단의 존재를 확인하였다.
[표 21]
Figure 112018083309028-pat00023
[표 22]
Figure 112018083309028-pat00024
고찰
진행성 및 말기 신부전 모델의 신장안으로 이질성 설치류 신생-신장 세포를 전달하면, 연구 기간 동안(질환 개시후 20주) 치료를 받은 랫트의 100%가 생존하고, 치료를 받지 않은 모든 랫트는 질환 개시후 16주 이내에 사망하였다. 5/6 신적출 시술 후, 랫트에서 혈청 크레아티닌 및 BUN8가 상당히 상승되었고, 신척출후 수명의 중간 시점이 되는 8주에 신생-신장 세포를 전달하였다. 신생-신장 세포 전달로 신장 여과 기능의 안정화 및 적혈구생성에 있어서 명백한 개선이 있었고, 신장 여과 기능의 안정화 또는 적혈구생성 중 하나 또는 이 두 가지 모두 상기 모델의 전반적인 생존에 영향을 줄 수 있다. 이식된 세포의 부분적인 특징으로, 특정 치료와 관련된 속성을 가진 성분 세포(알부민-운반 세뇨관 세포 및 산소에 의해 조절되는 EPO를 생산하는 세포)가 이 집단에 존재하며, 따라서, 설치류 예비 연구에서 질환 진행에서 관찰된 안정화에 기여하는 기회를 가진다는 것을 설명하였다.
인간의 CKD 및 2-단계 5/6 신적출 모델과 같은 설치류 모델에서 CKD는 진행성 신장 기능의 진행성 악화, 섬유증, 사구체 및 세뇨관 양 손실, 소변에서 단백질 손실을 특징으로 한다(de Zeeuw et al, Kidney Int 2004, 65:2309-2320). 단백질 손실은 신장에서 두 가지 기전에 의해 조절된다; 사구체 수준에서 발세포 및 사구체 기저막의 일체성은 얼마나 많은 단백질이 뇨 여과물로 침착되는지를 결정하고; 및 신장 세뇨관 수준에서, 세뇨관이 여과물로부터 단백질을 흡수하고, 이를 다시 순환계로 돌려보낸다(Birn et al,Kidney Int 2006, 69:440-449). 수용체 매개된 단백질 흡수 기능은 시험관에서 배양된 신생-신장 세포의 세뇨관 성분에서 확인되었으며, 신생-신장 세포로 생체 치료시 5/6 Nx 랫트에서 개선된 특징이기도 하였다. 따라서, 특정 이론에 구애됨이 없이, 신생-신장 세포 혼합물내에 단백질 흡수 능력이 있는 세포는 생체내에서 관찰된 단백질 체류의 개선을 부분적으로 담당하였을 것이다. 신생-신장 세포 배양물은 일정 비율의 사구체 세포도 포함하기 때문에, 어느 정도의 세포의 회복 및/또는 재생은 사구체 수준에서 일어날 수도 있다. 신생-신장 세포 치료를 받은 신장의 조직학적 평가에서 세뇨관의 초점 부위에서 관내 단백질 원주의 감소 및 사구체병증이 약간 감소되었음을 관찰함으로서, 이와 같은 가설을 추가적으로 뒷받침한다.
신생-신장 세포-치료를 받은 랫트에서 적혈구 항성성의 복원 또한 관찰되었는데, HCT 및 RBC 수준은 연구 기간 동안(3개월) 건강한 대조군의 수준에 도달하였고, HB 수준도 거의 정상적인 수준에 근접하게 유지되었다. 랫트에서 RBC의 긴 반감기(~14일) 때문에(Ganzoni et al, J Clin Invest 1971, 50:1373-1378), HCT, RBC, 및 HB에 대해 기록된 전체적인 긍정적 효과는 신생-신장 세포 세포 전달시 오로지 에리트론의 단기 자극으로 인한 것이라는 가능성을 배제시키는 것이 중요하다. 단기 볼루스(bolus) 효과는 주변 측정에서 장기적 영향을 가질 수 있지만, 골수에는 일시적 효과만을 가진다. 중요한 것은, 3개월 시점에서 신생-신장 세포-치료를 받은 랫트의 골수의 강건한 외양은 EPO를 생산하는 신생-신장 세포의 전달과 관련된 볼루스 효과에 대한 불리한 증거를 제공하였다. 설치류에게 전달된 단일 용량의 재조합 EPO의 연구에서, 골수에서 효과는 약 48시간 지속되며, RBC의 말초 자극은 약 6일쯤에 절정에 이르고, 21일에는 투약 전 수준으로 복귀된다는 것을 보여주었다(Bugelski et al, Pharm Res 2008, 25:369-378); Woo et al, J Pharmacol Exp Ther 2006, 319:1297-1306).
신부전(Togel et al, Am J Physiol Kidney Physiol 2005, 289:F31-42; Togel et al, Am J Physiol Kidney Physiol 2007, 292:F1626-1635)을 포함하는 급성 손상 상태에 이식된 세포의 작용 기전으로 파라크린 효과가 설명되었지만(Gnecchi et al, Circ Res 2008, 103:1204-1219), 본 연구에서 시험된 설치류 신생-신장 세포는 신장 여과 기능의 직접적인 강화 및 적혈구생성의 자극에 최소한 부분적으로 작용된 것으로 보인다. 3개월 시점에서 외식된(explant) 남아있는 신장의 분자적 분석에서 암컷 수용자 신장에서 수컷 공여자 세포의 지속적인 존재가 나타났지만, 빈도는 낮은(10% 미만) 것으로 예측되어, 관찰된 전신적인 개선은 이식된 세포의 초기 직접적인 영향과 숙주 세포 및/또는 조직 미세 환경에서 동시적 및 후속적 간접적 효과의 복합 때문일 것이라는 것을 말해준다. 관찰된 생체내 결과가 특이적 세포의 성분 때문이며, 신생-신장 세포 전달시 진행을 지연시키는 것에 관여하는 정확한 세포 및 분자 기전을 구별하기 위하여 추가 연구가 필요할 것이다.
자가 세포의 발생 및 전달 또는 재생적 의약 치료에서 실질적으로 많은 고유한 문제점들이 있다. 그러나, 자가 방법은 면역 억제를 요구하지 않고, 병인균에 대한 일부 우려를 우회할 수 있기 때문에 임상적으로 여전히 매력적이다. 관심 치료 세포가 타입 I 진성 당뇨병에서 인슐린을 생산하는 베타 세포의 상실과 같이(Pirot et al, Arq Bras Endocrinol Metabol 2008, 52:156-165), 질환 기전의 일부로 세포가 파괴되어 관심 대상의 치료 세포를 환자로부터 수득할 수 없을 때, 또는 생검을 통하여 세포를 수득함에 있어서, 환자에게 가해지는 위험이 너무나 클 때, 자가-방법은 실시될 수 없을 것이다. 이와 같은 제약으로 인하여 내피 세포 또는 평활근 세포와 같은 통상적인 세포 유형의 유도화와 관련된, 자가 정규 장소 이외의 부위로부터 분리에 의해 치료 관련된 세포를 생성시키는 방법을 추구하게 되었다. 또 다른 방법은 기원 조직이 아닌 다른 부위로부터 분리된 줄기 또는 조상 세포의 분화에 관한 것이고; 이와 같은 방법은 관심 세포가 고도로 특화된 조직 특이적 세포인 경우, 분화 프로세스의 비효율성, 재생 프로세스에서 미분화 세포의 불확실한 역할과 미분화 세포의 주입과 관련하여 발생되는 안정성 문제 때문에, 진척이 더욱 더디다(Hentze et al, Stem Cell Res. 2009 Feb 12). 따라서, 자가/동족 방법이 바람직한 임의의 표적 질환의 경우, 치료 능력이 있는 세포를 관심 조직으로부터 분리시킬 수 있는 지를 판단하는 것이 필수적이다.
CKD 환자에서 유도된 전체 돼지 및 인간 신장 조직, 및 이들 조직에서 확립되고, 증식된 세포 배양물에서 모든 주요 세포 유형(세뇨관, EPO를 생산하는 세포, 사구체, 집합 도관, 및 도관 세포)의 존재 및 기능을 조사하였다. 흥미로운 것은, 모든 인간 및 돼지 신장에서 질환의 원인 및 상태의 중증도와는 무관하게 세뇨관 표식에 대해 양성이며, 수용체 중재된 알부민을 흡수시킬 수 있는 세포가 존재하고 증식될 수 있었다. 질환의 원인 및 상태의 중증도와는 무관하게, 모든 만성 질환의 신장으로부터 저산소에 반응하는 EPO를 생산하는 세포를 분리할 수 있고, 증식시킬 수 있었다. 흥미로운 것은, 비록 다른 모든 배양물에는 집합 도관 세포 및 소수의 도관 세포와 마찬가지로 사구체 세포가 존재하지만, 자가면역 사구체신염의 매우 진행된 경우인 HK20로부터, 사구체 세포를 분리시키지 못하였고, 증식시키지 못하였다.
만성 신부전에 부차적인 빈혈증의 기전에 대해 여러 가설이 제시되었다. 일반적으로 신부전의 빈혈증은 혈청 EPO 수준이 빈혈증 수준으로 감소되기 때문에 절대적인 또는 상대적인 EPO 결핍으로 인한 것이라는 것이 일반적인 견해다 (Nangaku et al, Semin Nephrol 2006, 26:261-268). 신장의 EPO를 생산하는 세포는 질환이 진행됨에 따라 상실되거나, 또는 신장에 존재하지만, 국소적인 산소화 및 세포내 기전 사이에 상관 관계의 혼란으로 인하여 생산 신호에 적절하게 반응하지 못한다는 가설이 있다. (Maxwell et al, J Am Soc Nephrol 2003, 14:2712-2722). 질환 진행의 일부로써 섬유증 및 맥관 구조의 파괴로 인하여 신장에서 생산된 EPO 단백질을 순환계로 효과적으로 전달시키는 능력이 제한된다는 것 또한 있을 법하다. CKD의 요독증 환경이 빈혈증에 기여하여, 혈장에서 요독증 용질이 RBC 반감기를 단축시키는데 연루된다(Nangaku et al, Semin Nephrol 2006, 26:261-268). 혈액 손실 또는 투석으로 인한 요독증의 만성 염증 및 철 결핍 또한 CKD의 빈혈증의 원인이 될 수 있다. 우리의 데이터는 신장에서 EPO를 발현시키는 세포가 파괴된다는 가설에 반대되는 증거를 제공하는데, mRNA 및 단백질이 조직내에 명백하게 존재하고, 조절된 EPO 기능을 발현시키는 세포가 CKD 및 비-CKD 신장 견본으로부터 증식되었기 때문이다. 자가면역 사구체신증(HK20)이 있는 인간 CKD 견본은 조직 수준에서 상당히 낮은 EPO mRNA 및 단백질 발현을 가지고, 배양물에서도 전반적으로 약한 발현을 나타내었다. 배양물에 사구체 세포가 없는 점을 함께 고려하였을 때, 자가면역 질환에 부차적으로 발생되는 CKD는 사구체 또는 엔도크린 세포를 성분으로 요구하는 자가 세포-기반 치료제의 좋은 표적 질환이 아닐 수 있다는 것을 암시할 수도 있다.
요약하면, 본 연구는 치료 활성 세포를 분리시키고, 확장시키고, 만성적으로 손상된 신장 실질조직으로 이식시켜, CKD 말기 모델에서 신장 기능을 안정화시키고, 진행을 지연시킬 수 있다는 것을 제안한다. 신생-신장 세포 분리 방법을 큰 동물 및 인간 CKD 견본에 성공적인 적용은 이와 같은 방법의 변형가능한 성질을 강조한다. 진행된 섬유증 및 대사적 질환의 잠재적 복잡성에도 불구하고, 세뇨관 포켓, 엔도크린, 집합 도관, 및 사구체 세포는 CKD으로부터 유도된 조직에 유지되어, CKD 치료를 위한 자가 재생적 의약 방법을 확립시키는데 필수적인 것이 될 수도 있는 "빌딩 블록"에 통로를 제공한다. 본 연구에 의해 고려되는 재생적 의약 요법은 장기 투석으로 곤란을 겪는 많은 CKD 환자에서 신장 기능을 보존하고, 수명을 연장시키는 가능성을 제공하며, 장기 기증의 부족 및 지연 문제를 다룰 수 있다.
실시예 19 - 기능을 하는 NKA 프로토타입의 분리는 나이와 무관하다 .
본 연구는 성인기 설치류 신장으로부터 신생-신장 확대 세포 프로토타입을 수득할 수 있는지를 판단하기 위해 실시되었다.
랫트 세포 분리 및 배양 개시를 위하여 표준 시술을 이용하여 성인기(3월령 이상) 랫트로부터 성인기 설치류 NKA 세포 준비물 (RK102, RK105)를 얻었다. 모든 플라스크를 총 3일 배양시켰다. 첫 2일간 21% (대기중) 산소 조건하에 둔 후, 배지를 교체하였고, 플라스크를 추가 24시간 동안 산소가 2%로 설정한 산소-조절된 배양기에 재-배치하였다. 그 다음 효소에 의한 표준 수거 시술을 이용하여 세포를 수거하였다. 표준 시술에 따라 층 구배를 준비하였고, 배양물을 수거하여, 층 구배에 제공하였다. 생성된 밴드는 2-주령(청소년기) 신장 조직으로부터 만든 준비물의 분포 및 빈도(도 126, 표 23)와 유사하였다. 성인기 랫트로부터 유도된 것과 청소년기로부터 유도된 NKA 프로토타입 사이에 유전자 발현 패턴은 유사하였고, 에리트로포에틴, 네프린, 포도신, 쿠비린, 및 Cyp의 유전자 발현 패턴을 검사하여 결정된 B2-특정 세포 및 B4-특정 세포 유형은 예상과 같이 풍부하였다. (도 127).
[표 23]
상대적인 빈도/밴드 분포
Figure 112018083309028-pat00025
말기, 만성 질환을 가진 (5/6 신장적출된) 성인기 설치류의 남아있는 신장으로부터 랫트 세포 분리 및 배양 개시를 위한 표준 시술을 이용하여 RK091 NKA 세포 준비물을 얻었다. 첫 2일간 21% (대기중) 산소 조건하에 둔 후, 배지를 교체하였고, 플라스크를 추가 24시간 동안 산소가 2%로 설정한 산소-조절된 배양기에 재-배치하였다. 그 다음 효소에 의한 표준 수거 시술을 이용하여 세포를 수거하였다. 밀도 층 구배를 이 배양물에 적용하지 않았지만, 특정이적 "B2" 및 "B4" 유전자 (가령, Cyp, EPO, HIF1a, 포도신, 및 VEGFA)의 발현은 공지의 B2- 및 B4-특이적 세포 유형이 이 배양물로부터 분리되고 증식되었다는 것을 설명한다(도 129).
청년기 (2-주령) 또는 성인기 (3.5-월령) Lewis 수컷 랫트로부터 나란히 NKA 세포 준비물을 만들었다. 표준 배양 요법 및 층-구배 시술 후, 각 준비물로부터 분리시킨 ‘B2’ 분취물을 빈혈/요독증이 있는 Lewis 암컷 랫트에게 이식시켰다(2-단계 5/6 신적출 시술에 의해 CRL에서 만듬). 크레아티닌 및 BUN의 기저 값을 이식 전에 측정하였고, 치료 후 16주간 매 2주마다 측정하였다(도 130 및 131 참고).
상기 결과는 청년기 신장으로부터 유도된 배양물에 이용된 동일한 배양 방법 및 층 구배 기술을 이용하여, 성인기 설치류 신장에서 "B4" 세포 집단에서 볼 수 있는 특화된 세포(에리트로포에틴을 생산하는 세포, 도관 세포, 및 사구체 세포)로부터 ‘B2'에서 발견되는 세뇨관 세포를 분리시키는 것이 가능하다는 것을 보여준다. ‘B4’- 특이적 특화된 세포 (EPO를 생산하는, 도관, 및 사구체)는 성인기 설치류의 예상 밀도의 ‘B4’에 존재한다. 상기에서 볼 수 있는 바와 같이, 말기 동물에서 수득된 질환이 있는 성인기 설치류 신장으로부터 NKA 세포(세뇨관 및 EPO를 생산하는 세포)를 얻는 것 또한 가능하다. 청년기 및 성인기로부터 유도된 NKA ‘B2’ 세포는 질환 개시 후 요독증 (2-단계 5/6 Nx) 모델에 이식된 후, 신장 기능 안정화를 제공하였다.
실시예 20 - 치료 관련된 신장 생체활성 세포 집단의 유전적 프로파일링
신장 조직으로부터 분리시키고, 확장시킨 특정 하위 집단 신장 세포의 비-편파적 유전자형 조성물을 결정하기 위하여, 유전자 배열 및 정량적 실시간 PCR (qrtpcr) 분석 (Brunskill et al, 2008)을 이용하여 세포 하위분취물에서 차등적인 세포-타입-특이적 및 경로 특이적인 유전자 발현 패턴을 확인하였다.
신장 세포의 비-분취된 이질성 혼합물의 분리 및 1차 배양에 대해서는 이미 설명되었다(Aboushwareb et al, 2008). 연속적으로, 표준 밀도-구배 방법을 이용하여 세포 하위분취물을 생성시켰고, 특이적 생물학적 활성 및 표현형 특징에 근거하여 특징화시켰다. 끝으로, "B2" 및 "B4"로 명명된 두 가지 특정 하위분취물은 Lewis 암컷 랫트의 2-단계 5/6 Nx 시술에 의해 생성된 CKD 진행성 모델의 신장으로 이식되었을 때, 단독으로 및 복합적으로 특정 치료 가치를 가진다는 것이 설명되었다.
세포 및 세포 배양 조건:
Lewis 수컷 신장 세포의 이질성 배양물은 실시예 8에 따라 분취시켰다. 구배 분취 이전에, 신장 세포를 5% (v/v) FBS, 2.5 ㎍ EGF, 25 ㎎ BPE (소 뇌하수체 추출물), 1×ITS (인슐린/트란스페린/나트륨 셀레네이트 배지 보충제), 항생제/항진균제 (MFR)를 함유하는 고 포도당 DMEM 50:50 혼합물에 배양시키고, 표준 조건의 습도 및 산소 분압에서, 37℃에서 배양시켰다. 생성된 하위분취물 (B1, B2, B3, B4, 및 펠렛)을 샘플링하여 발현 분석을 위한 RNA를 얻고, 요독증 랫트에 이식하여 생체내에서 생물학적 기능을 평가하였다.
물질 및 방법:
Microarray 플랫폼: Affymatrix GeneChip Rat Genome 230 2.0 Array; 계약 설비: Wake Forest University Health Sciences, Microarray Core Facility; 실증 방법: ABI/Invitrogen 7300 정량적 실시간 PCR (qrtpcr) 분석; RNA 분리: Qiagen RNA 분리 키트; cDNA 합성: Invitrogen Vilo superscript cDNA 분리 키트; Primers & probes: ABI/Invitrogen Taqman 분석 (‘Inventoried’ 프라이머 및 프로브 세트)
시술:
● 하위 분취 시술 직후, 세포 하위분취물로부터 RNA 분리 및 정량화(표 24-25)
● 표준화된 RNA 시료 (2 ㎍)에서 Affymetrix Gene 배열 분석 (데이터 미제시)
● p-값 및 배수 변화 유의성에 근거하여 차등적으로 발현된 유전자 선별(데이미제시)
● 차등적으로 발현된 유전자를 유별하기 위하여 David 주석 할당(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)을 이용한다 (데이터 미제시)
● Lewis 랫트 세포 준비물, 정상적인 인간 신장 세포 준비물, 및 인간 만성 신장 질환 세포 준비물에서 생성된 특정 하위 분취물의 qrtpcr에 의해 미세배열를 입증하는 유전자를 선택한다. (표 27)
[표 24]
배양 조건 및 구배 부하
Figure 112018083309028-pat00026
[표 25]
RNA 농도 및 표준화
Figure 112018083309028-pat00027
결과:
다음의 엄격한 조건하에 분취물(B1-B4) 및/또는 PreG(pre-gradient) 물질간에 차등적인 발현을 판단하였다: 열거된 유전자들은 모두 유의성 기준에 부합하였다: p-값 < 0.05, 및 배수 변화 <-0.5 또는 >0.5. 유전자 이름/설명 없는 프로브 세트 IDs (ex.: 1395810_at|---|---)는 아직 할당되지 않은 유전자 배열 올리고뉴클레오티드(oligo)에 대응한다. 이들 올리고뉴클레오티드들은 Affymetrix "Netaffx" 웹 페이지 https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx 을 통하여 선택될 수 있고, 유전자 할당에 대한 가능성을 얻기 위하여 NCBI 게놈 데이터베이스에 대해 블라스트될 수 있다.
표 26에는 구배 전과 구배 후 (B1-B4) 세포 집단 사이에 차등적으로 발현된( 상향 /하향) 유전자를 요약하였다. 유전자 발현에서 차이를 결정하는 선별 기준 : 세포 집단 사이에 T-시험 p값 ≤ 0.05, 절대적인 배수 변화 ≥ 0.5 . 예를 들면, 하기 표 26에 나타난 바와 같이, 구배 전과 B1에서 차이는 차등적으로 발현된 유전자 165개중에서 B1에서 32개는 상향 발현되었고, 133개 사전 구배보다는 B1에서 하향 발현되었다. 이들 세포 집단에서 발현의 차이를 나타내는 유전자들이 결정되었다.
[표 26]
구배 전과 구배 후(B1-B4) 세포 집단 사이에서 상향/하향 발현된 유전자들의 요약.
[표 27]
Figure 112018083309028-pat00028
고찰
본 보고서는 밀도 구배 분리에 의해 본 경우에서 생성된 특이적 생체 활성 신장 세포 하위집단의 유전적 프로파일링을 설명한다. 미세배열(Microarray) 분석은 한 시료에 대해 다른 시료에서 표준화된 신호 강도의 발현 수준을 결정하기 위한 비편향적 방법을 제시한다(데이타 제공하지 않음). 클러스터(Cluster) 분석 및 Treeview 응용으로 다중 시료에서 유전자 발현의 강도 및 패턴을 가시화시킬 수 있다(데이타 제공하지 않음). 본 보고서에서 검사된 세포 분취물들은 생체내에서 광범위하게 연구되었다(Lewis 암컷 CKD 수용자에게 제공된 Lewis 수컷 제공자(Kelley et al, 2009)). 전체적인 유기체 개선(가령, 생존, 체중 증가), 혈청학적 프로파일링 및 조직학적 증거는 B2가 질환이 있는 신장으로 단독 이식되었을 때 최대의 치료 관련성을 가진 세포 분취물임을 압도적으로 뒷받침하며 분취물 B4도 생체내에서 제한적인 치료 효과를 제공하였다.
추적조사 부분 요인 생체내 연구에서, B2와 B4를 복합하면, B2 단독의 효과를 능가한다는 것을 확인하였다. 본 미세배열 연구에서 모든 세포 분취물간에 차이를 발견하였으며, David Annotation 프리웨어를 통하여 유전자 분류를 포함하는, B2와 B4 사이에 차이를 강조하였다(데이터 제시하지 않음). 흥미로운 것은, B2 와 B4 사이에 차등적으로 발현된 유전자들은 이들 군에서 유의적인 p-값 (pv ≤ 0.05)을 가지는 33개의 상이한 기능군과 163개의 주석을 제시한다. 어래이는 7개의 상이한 (Go) 유전자 주석 범주를 나타내는 유전자의 선택된 패널을 이용한 qrtpcr에 의해 실증되었다(데이터 제시하지 않음). 두드러진 것은, 설치류 어래이에서 실증을 위하여 선택된 유전자들은 정상적인 인간 및 인간 CKD 환자 모두에 번역되었다(표 27 참고). 유전자 어레이 분석과 같이 일반적으로, 하위분취물의 알려진 표식이 단백질 수준에서 실증될 때까지 해석에 주의를 해야한다는 것이다. 더욱이, 하위분취물내의 드문 성분들은 유전자 발현 분석을 이용하였을 때 탐지되지 않을 수 있고, 개당-세포 기반에서 구별되는 방법을 별도 이용해야만 한다.
결론적으로, 미세배열 분석은 밀도 구배 분리가 신장 세포를 특이적 기능 및 성질을 가진 하위분취물로 구별하는 효율적인 수단임을 실증하였다. 계층적 클러스터(Hierarchical Cluster) 분석에서 각 하위분취물은 모든 다른 것과 구별되고, 구배-전 초기 세포 집단과도 구별된다는 것을 설명하였다. 상기에서 나타낸 바와 같이, 비-분취된 세포의 발현 패턴은 B2 하위분취물에서 발현되는 것과 거의 유사한데, 그 이유는 높은 빈도(~80%)의 세뇨관 및 집합 도관 세포를 함유하는 이질성 배양물 뿐만아니라 B2 하위분취물 때문이다. 또한, 예상했던 바와 같이, 유전자 발현에서 가장 큰 차이는 밀도 구배의 첫 분취물과 최종 분취물 사이에서 일어난다 (B1 대 B4).
클러스터 분석 (다중 군 비교에 근거한, Kruskal Wallace 유의성), 및 모든 군 간에 T-시험 비교에서 분취물 B1-B2는 구배에서 B3-B4와 구별된다는 것이다. B2 분취물은 이질성 배양물에서 가장 풍부한 세포(세뇨관 및 집합 도관)로 주로 구성되며; 이 분취물에는 다른 세포 유형은 소량만이 존재하지만, B4 분취물은 성장 및 발생, 특히 혈관 발생을 조절하는 인자로 상당히 농축되어 있다. 눈에 띄는 것은, B1 및 B3 분취물은 B2 분취물의 치료 가치를 상쇄시킬 수 있는 면역/염증성 물질을 포함한다. B2 및 B4 사이에 관찰된 미세배열 유전자 발현의 차이는 13/13 설치류 표식에 의해 실증되었다. 설치류 세포 분취물 및 유전자 발현은 정상적 견본 및 CKD 인간 견본에서 시험된 표식의 90% 이상이 강력하게 번역된다. 상기 데이터는 인간 CKD 신장이 구성적으로 결함은 있지만, 대부분의 세포 유형이 살아 있는 상태로 존재하고, 생체외로 보급될 수 있다는 가설을 뒷받침한다.
실시예 21 - B2에 의한 히알루론산 합성
놀랍게도, 이식전 시험관에서 B2 세포 준비물에 의해 HAS-2 (고분자량 히알루론산 (HA)의 합성을 담당하는 히알루론산 합성효소의 한 종류)가 생산되며, B4 세포 준비물에서도 다소 적은 수준으로 생산되었다. 도 132에 나타난 바와 같이, 시험관에서 히알루론산 합성효소 (HAS)의 주도적 발현은 B2 세포 준비물 에서 있었지만, B4 세포 준비물에서도 탐지가능한 발현이 있었다.
생체내에서 HAS mRNA 및 단백질의 발현은 도 133에 나타낸다. 도 133에 나타난 바와 같이, B2 세포를 5/6 Nx 만성 신부전 설치류에 이식하면, Nx 치료를 받지 않은 조직과 비교하였을 때, 치료를 받은 조직에서, 유전자 수준 (qRTPCR, 아래 그래프) 및 단백질 수준 (위쪽 도면, 웨스턴 블롯)에서 HAS-2가 상향조절되었다.
실시예 22 - 대사질환 모델에서 신생-신장 확대의 평가를 위한 연구 계획
본 연구의 목적은 만성 진행성 신부전과 대사 질환을 가진 ZSF1 설치류 모델에서 신생-신장 (NK) 프로토타입 (가령, 세포 준비물 또는 세포 집단)을 평가하는 것이다. 비만 ZSF1 랫트 균주는 대사증후군의 광범위하게 이용되는 모델이며, 이상식욕 항진, 비만, 고혈압, 심각한 이상지질혈증, 비-인슐린-의존적 진성 당뇨병(NIDDM), 좌심실 이상기능 및 2차 진행성 신증을 포함한 복합적인 관련 질환을 특징으로 한다. 비만 ZSF1 랫트는 1-년 사망률이 50%이며, 일반적으로 말기 신부전 및 충혈성 심부전으로 사망한다. 비만 ZSF1 균주는 야윈 암컷 Zucker 당뇨성 지방(ZDF +/fa) 랫트와 야윈 수컷 자발적 HTN (고혈압) 심부전 (SHHF/Mcc-facp, +/fa) 랫트를 교배하여 비만 ZDFxSHHF-fa/facp F1 자손(ZSF1)으로부터 유도되었다; Charles River Laboratories 명명: ZSF1 -Lepr fa Lepr cp . 각 부모 균주는 별개의 렙틴 수용체 돌연변이(fa 및 fa cp; cp, ‘비만(corpulent)’ 유전자 돌연변이)를 가진다. ZSF1 하이브리드 자손은 동일한 MHC II 하플로타입을 가지기 때문에, 인간 세포 및 조직 이식에서 일치된 살아있는 관련 제공자에 유사한 우수한 이식 모델이 된다.
ZSF1을 포함하는 Zucker으로부터 유도된 동물 균주는 광범위하게 연구되었으며, 문헌들에서 잘 설명되어 있다(Duarte et al, 1999 Eur J Pharmacol. 365:225-32; Griffin et al, 2007 Am J Physiol Kidney Physiol. 293:F1605-13; Harmon et al, 1999 Diabetes. 48:1995-2000; Jackson et al, 2001 J Pharmacol Exp Ther. 299:978-87; Joshi et al, 2009 J Cardiovasc Pharmacol. Jul;54(1):72-81.; Khan et al, 2005 Am J Physiol Kidney Physiol. 289:F442-50; Mizuno et al, 2006 Cardiovasc Pharmacol. 48:135-42; Rafikova et al, 2008 Metabolism. 57:1434-44; Renaud et al, 2004 Fundam Clin Pharmacol. 18:437-47; Tofovic and Jackson, 2003 Methods Mol Med. 86:29-46; Tofovic et al, 2001b Ren Fail. 23:159-73; Uhlenius et al, 2002, Kidney Blood Press Res. 25:71-9.). ZDF1 균주는 비만 및 NIDDM을 포함하는 신장 질환의 위험 인자를 평가하기 위하여 전임상 연구에 이용되었다.
신생-신장 프로토타입을 ZSF1 랫트에게 전달하기 위해 제안된 방법은 다음의 세포 분리 및 전달 방법이다. 간략하게 설명하면, 시험 모델을 제공하기 위하여 2-단계 5/6 신적출 시술을 이용하여 요독증 및 빈혈을 랫트에게 부여한다. 야윈 또는 비만 ZSF1 제공자 랫트로부터 유도된 NKA 세포 프로토타입을 전달 배지에 현탁시키고, 신장안으로 전달될 것이다. 동물의 수술기 주위 평가는 동물이 시술로부터 회복될 기간동안 실행될 것이다. 건강 및 신장 기능은 혈청 화학, 뇨용해, 혈압, 생존, 및 체중 증가를 통하여 전달 시점(3월령)부터 최대 1 연령까지 보름에 한번씩 모니터할 것이다. 측정된 매개변수에는 혈청 크레아티닌, 혈액 요소 질소, 혈청 알부민, 전체단백질, A/G 비율, 콜레스테롤 및 트리글리세리드, 혈청 나트륨, 인과 칼슘, 소변 단백질, 및 헤마토크릿을 포함한다. 희생 시점에서 (이식후 6-9개월), 신장, 골수, 간, 폐, 비장, 심장에서 조직병리학적 분석을 실시할 것이다. 낮은 단백질 식이 및 표준-관리 약리학적 요법(혈압 대조군, 포도당 대조군)은 모두 인간 및 실험 동물 (Zucker으로부터 유도된 랫트 균주 포함)에서 대사 질환에 부차적 신부전의 진행을 지연시킬 수 있다는 것을 보여주었고, 이와 같은 완화 치료 동안 NKA 프로토타입 +/- 성과를 평가하기 위하여 다른 연구들을 실행할 수도 있다. 추가 연구 프로토콜은 동물의 삶의 질 및 생존을 연장시키기 위하여 식이 및/또는 약리학적 중재하에 또는 중재없이 후속 중재 치료(재시술)를 평가할 수 있다.
대사적 랫트 균주(Zucker, ZDF 및 SHHF를 포함) 중에서, ZSF1 모델은 적시적인 방식 (NKA 프로토타입 전달 후 ~6개월)으로 NKA 요법을 평가하는데 충분한 질환 중증도를 가지며(Tofovic et al, 2000 Ren Fail. 22:387-406; Vora et al, 1996 J Am Soc Nephrol. 7:113-7), 인간 비만 및 NIDDM에 공통적인 특징을 나타낸다. ZSF1 랫트에게서 인슐린 저항성을 포함하는 NIDDM의 각인적 증상과 결과적으로 고혈당, 비만, 심각한 지질이상혈증, 상당히 상승된 혈압, 말기 신부전, 심장 비대가 발생하였고, 수명이 단축되었다(Tofovic and Jackson, 2003 Methods Mol Med. 86:29-46). ZSF1 전조 랫트 균주의 질환 특징은 표 28에 열거되어 있다(Charles River).
[표 28]
Figure 112018083309028-pat00029
ZSF1 랫트 균주는 Charles Rivers Laboratories (CRL)을 통하여 시판되는 것을 이용할 수 있다. 시간 경과(ZSF1 2-47 주령)에 따른 질환 진행을 평가하기 위하여 공개된 ZSF1 여구에 대한 조사를 실행하였다(Griffin et al, 2007 supra; Joshi et al, 2009 supra; Rafikova et al, 2008 supra; Tofovic et al, 2001a J Pharmacol Exp Ther. 299:973-7.; Tofovic and Jackson, 2003 supra; Tofovic et al, 2001b supra; Tofovic et al, 2000 Ren Fail. 22:387-406). 12주 시점에서 5마리 ZSF1 랫트의 최근 혈액 분석을 실시하여, 심각한 주요 질환 매개변수의 나이-의존적 진행 또한 확인하였다. 말기 질환 및 사망으로의 진행이 상대적으로 느리지면(~1 년), 신장 기능 감소는 20 주 시점에 상당히 감소되었다 (8주 시점에 혈청 크레아티닌 0.77 ㎎/dl은 20주 시점에 1.47 ㎎/dl이 되어 배 이상이 되었다) (Tofovic and Jackson, 2003 supra).
일부 제약은 있지만, 다른 대사 모델을 고려할 수 있다. 비만 Zucker 모델은 당뇨병의 많은 증상을 나타내지만, 이들 랫트는 정상혈압이며, 더욱 중요한 것은 면역억제 요법의 동시 사용없이 이식 모델로 잠재적으로 부적합한 폐쇄적(outbred) 균주다. Zucker으로부터 유도된 ZDF 모델은 종종 인슐린 저항성 및 NIDDM의 혈당 과다와 연합하여, 신증 및 약한 고혈압과 같은 증상을 포함한 당뇨병 질환을 더 잘 나타내는 (비만 Zucker와 비교하였을 때) 근친교배(inbred) 모델이다. 그러나, 이 모델은 자발적 중증 수신증(hydronephrosis) 발생율이 높기 때문에 신장내 이식에는 잠재적으로 부적합하다(Vora et al, 1996 supra). 자발적 고혈압 심부전 (SHHF): 이균주의 랫트는 ZSF1와 유사한 대사 상태를 가진다. 그러나, SHHF는 상대적으로 약한 신증을 특징으로 하여, ZSF1 하이브리드와 비교하여 말기 신부전으로 진행이 느리다.
ZSF1 신장 질환 대사모델은 다음과 같은 이유로 인하여 신부전의 생체 연구에 적합하다: 모델에 대한 문헌적 선례; 모델의 상업적 이용가능성 및 재생산성; 동계 제공자 접근을 위한 모델의 적합성. 또한, 이 모델은 SHHF가 당뇨병을 발생하지 않고, ZDF 모델이 심각한 수신증을 나타내는 경향을 보이기 때문에 SHHF 및 ZDF 부모 보다는 유리하다. 신장 질환의 심각성은 부모 균주와 비교하였을 때, 비만 ZSF1에서 더 크다. 신장 이식이외에 만성 신장 질환 (CKD)을 치료할 수 있는 치료법은 현재 없다. 모든 기존의 치료법(식사 조절 및 약제학적 중재)은 한정된 기간 이상 완화시켜 주지만, 명백한 비가역적 신장 손상에 의해 제한된다. 본 프로토콜은 대사증후군에 부차적인 인간 CKD의 실험 모델에서 NKA 세포 프로토타입의 평가를 허용할 것이다. 주요 목적은 신장 질환의 진행 동안 (약한, 중간 및 심각한 CKD) NKA의 전달을 시험하는 것이다.
추가 연구는 초기 치료 효과의 내구성을 연장시킬 수 있는 추가적인 후속 신장 세포 이식 시술(재시술)을 고려할 수 있다. 신장 세포 이식의 재시술은 식사 조절 및 제리학적 중재와 수반될 수 있다. 자가 근원적 전략도 ZSF1 모델을 이용한 앞으로의 연구에 고려될 수 있다. 이론적으로, ZSF1의 근친교배 부모 균주, 또는 ZDFs를 유도하기 위하여 이용된 폐쇄적 균주의 한 세대 이전 균주 모두, Zucker 랫트는 진행된 CKD 또는 말기 신장 질환 (ESRD)이 있는 ZSF1에 신장 조직의 동종이계 기증 원천으로 이용될 수도 있다
유기체가 본 연구에서 및/또는 추적조사 연구 프로토콜 동안 말기 신장 질환 신장 질환 (가령, ESRD)으로 진입할 때, ZSF1 모델에서 NKA의 평가에 표준 관리 약물 요법 및/또는 저칼로리(지방, 단백질, 당), 저염식사가 수반할 수 있다.
앙지오텐신 수용체 차단제(ARB) 및 앙지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (가령 캡토프릴 또는 페린도프릴 )를 함유하는 레닌-앙지오텐신 시스템 (RAS)은 인간에서 통상적으로 이용되는 항-고혈압 약물의 종류이며, Zucker 랫트에서 효과가 있는 것으로 나타났다(Duarte et al, 1999 supra; Tofovic and Jackson, 2003 supra; Uhlenius et al, 2002 supra). 인간에서 인슐린 매개된 세포의 포도당 흡수를 개선시키기 위해 흔히 사용되는 인슐린 증감 약물 가령, 로시글리타존(Rosiglitazone) 또는 프로글리타존(Troglitazone) 또한 Zucker 랫트에서 효과가 있는 것으로 확인되었다(Harmon et al, 1999 supra; Khan et al, 2005 supra). 콜레스테롤 합성을 조절하는 HMG CoA 환원효소 효소의 억제제인 스태틴(Statin)은 이상지질혈증을 치료에 광범위하게 이용되는 약물이다(Yoshimura et al, 1999 supra). 표 29는 환자의 수용상태를 모방한 광범위한 식이 및 약리학적 요법에서 관리된 랫트에 있어서 야윈 랫트에서 유래된 NKA 세포와 비만 랫트에서 유래된 NKA 세포, 두 가지 모두를 시험하기 위하여 제안된 대표적인 매트릭스화된 방법을 설명한다.
[표 29]
Figure 112018083309028-pat00030
실시예 23 - 면역억제성 연구 계획
면역억제성 연구 계획을 이용하여, 비-자가 원천으로부터 NKA 프로토타입의 생체 성과를 평가할 수 있다. 다양한 면역억제 요법은 매일 위관영양을 통하여 공급되는 사이클로스포린 A (CsA) (10 ㎎/kg) ; 매일 위관영양을 통하여 공급되는 타크로리무스(Tac) (0.2 ㎎/kg)(두번째 선택); 매일 위관영양을 통하여 공급되는 라파마이신(Rapa) (1㎎/kg) (첫번째 선택); 및 매일 위관영양을 통하여 공급되는 미소페놀레이트 모페틸(MMF) (10 ㎎/kg)을 포함할 수 있다(Yang, H.C, Nephrol Dial Transplant. 2003 May;18 Suppl 1:i16-20). 내성이 되도록 이식 12일 전에 제공자 특이적 수혈을 실시하여 내성에 근거한 면역억제 요법이 실시될 수 있다 (Koshiba T, Li Y, Takemura M, Wu Y, Sakaguchi S, Minato N, Wood KJ, Haga H, Ueda M, Uemoto S. Transpl Immunol. 2007 Feb;17(2):94-7; Jovanovic V, Lair D, Soulillou JP, Brouard S. Transpl Int. 2008 Mar;21(3):199-206. Epub 2007 Dec 5. Review.
NKA 프로토타입의 투여를 위한 가능한 몇 가지 랫트 모델이 있다. 한 가지 모델은 동종이식편 모델이며, 여기서 랫트 균주 Wistar-Furth (WF) (강력한 조직적합성)에게 근친교배 랫트 균주 DA (d=d 혈액군, A=agouti) 제공자를 이용한다.
1. MHC 적합성 쌍: Lewis 랫트 균주(LEW)에 대한 Fisher 랫트 균주(F344)
2. ZSF 랫트:
a. 자발적 고혈압 shhf (심각한 고혈압 및 심부전) 랫트×Zucker 당뇨성 지방 (ZDF) 랫트의 후손 제 1 세대(F1)으로부터 생성됨.
i. 비만, 당뇨, 고혈압; 단백뇨
ii. ZDF×SHHF의 후손은 새끼에 동계이며,
1. 후손의 절반은 비만+질환을 가지며; 다른 절반은 야위었다.
iii. F1 후손은 부모 SHHF 및 ZDF 균주로부터 이식편을
수용할 수 있다.
3. 동종이계 제공자 선택
a. 원래 마른 Zucker 지방 랫트 (ZF) - 폐쇄성 균주(outbred)
b. ZF-Wistar의 부모 균주
4. RT1.B 및 RT1.D (주요 조직 적합성 클래스 II 분석)으로 ZSF1 및 SHHF 시험
a. ZSF1-- L/K 하플로타입(haplotype)
b. SHHF―K 하플로타입(haplotype)
실험 계획
방법―주사용 세포
1. 대조군 및 자가치료군
a. ZSF 이식 없음; 면역억제 없음 (n=3) - 순수 대조군
b. ZSF 이식 없음; 면역억제 있음 (n=3) - 약물 효과
c. ZSF, 빈 매개체; 면역억제 있음 (n=3) - 약물 효과 및 매개체 충격
d. ZSF 에서 ZSF로; 면역억제 없음 (n=5) - 세포 효과; 약물 성분 없음
e. ZSF 에서 ZSF로; 면역억제 있음 (n=5) - 시술로 약물 효과
2. 동종이식편 실험(Allotransplant Experiments)
a. Wistar 에서 ZSF로 (또는 마른 Zucker에서 ZSF로); 면역억제 있음 (n=5) - 동종이식 모델에서 약물 효과
b. 다음중 하나 이상 면역억제 요법은 동종이계 세포의 전달과 함께 실시될 것이다:
i. 사이클로스포린 A (CsA) (10 ㎎/kg), 위관영양을 통해 매일
ii. 타크로리무스 (0.2 ㎎/kg) 위관영양을 통해 매일 (2차 선택)
iii. 라파마이신 (1㎎/kg) 위관영양을 통해 매일(1차 선택)
iv. 미코페놀레이트 모페틸 (10 ㎎/kg) 위관영양을 통해 매일
SEQUENCE LISTING <110> PRESNELL, SHARON C. BRUCE, ANDREW WALLACE, SHAY M. CHOUDHURY, SUMANA KELLEY, RUSSELL W. JAYO, MANUEL J. REINSCH, JESSICA J. TATSUMI, PATRICIA D. BERTRAM, TIMOTHY A. WERDIN, ERIC S. KNIGHT, OLUWATOYIN A. RAPOPORT, H. SCOTT ILAGAN, ROGER M. <120> ISOLATED RENAL CELLS AND USES THEREOF <130> TGN1009 <140> 12/617,721 <141> 2010-03-31 <160> 3 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 1 aagcgcccca tgaatgc <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide primer <400> 2 agccaacttg cgcctctct <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide probe <400> 3 tttatggtgt ggtcccgtg

Claims (17)

  1. (a) 피험자의 신장 시료로부터 유도된 배양된 신장 세포 또는 인간 신장 조직에서 유도된 세포를 분취하여 제조되고, 상기 분취는 밀도 구배 분리의 단계를 포함하는 것이고,
    (b) 분취의 결과로서, (i) 분취 전의 피험자의 신장 시료 또는 인간 신장 조직에 비하여 상대적으로 신장 세뇨관(tubular) 세포에 대하여 농축되고, (ii) 피험자의 신장 시료 또는 인간 신장 조직의 집합 도관(collecting duct), 엔도크린(endocrine), 도관(vascular), 및 사구체(glomerular) 세포를 포함하고;
    (c) 신장에 재생적 효과를 촉진시키는,
    신장 질환 치료의 방법에 사용하기 위한, 분리되고 농축된 인간 신장 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서, 신장 엔도크린 세포, 도관 세포, 및 사구체 세포에 대하여 농축되고 분취에 의하여 제조된 제2의 분리되고 농축된 인간 신장 세포 집단과 추가로 조합된 것인 세포 집단.
  3. 제1항에 있어서, 신장 세뇨관 세포가 전단(proximal) 세뇨관 세포를 포함하는 것인 세포 집단.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 집단의 세포가 저산소(hypoxia)-저항성 및 요오딕사놀(iodixanol)-저항성인 세포 집단.
  5. 제4항에 있어서, 히알루론 합성효소-2를 발현하는 세포를 포함하는 세포 집단.
  6. 제4항에 있어서, 수용체 매개된 알부민 운반을 할 수 있는 세포를 포함하는 세포 집단.
  7. 제5항에 있어서, 수용체 매개된 알부민 운반을 할 수 있는 세포를 포함하는 세포 집단.
  8. 제1항에 있어서, 자가 신장 시료로부터 유도된 것인 세포 집단.
  9. 제1항에 있어서, 비-자가 신장 시료로부터 유도된 것인 세포 집단.
  10. (a) 제1항의 분리되고 농축된 인간 신장 세포 집단, 및
    (b) 약제학적으로 수용가능한 운반체 또는 부형제
    를 포함하는, 급성 신부전, 만성 신부전, 빈혈증, 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환, 또는 간 질환 중 하나 이상과 연관된 신장 기능의 상실로 인한 질환인 신장 질환의 치료를 위한 제약 조성물.
  11. (a) 하나 이상의 생체적합성 폴리머, 단백질, 또는 펩티드를 포함하는 생체적합물질; 및
    (b) 생체적합물질로 피복되고, 생체적합물질 상에 또는 생체적합물질 내에 침착되고, 생체적합물질에 포집되고, 생체적합물질에 현탁되고, 생체적합물질에 임베드된, 또는 그렇지 않으면 생체적합물질과 복합된, 제1항의 분리되고 농축된 인간 신장 세포 집단
    을 포함하는, 개선된 신장 기능을 필요로 하는 피험자로의 이식을 위한 구조체.
  12. 제11항에 있어서, 생체적합물질이
    (i) 세포 집단의 포집, 부착, 또는 포집 및 부착에 적합한 3차원적(3-D) 다공성 생체적합물질; 또는
    (ii) 세포 집단을 임베딩, 부착, 현탁 또는 피복시키는데 적합한 액체 또는 반-액체 겔
    로 형성된 것인 구조체.
  13. 제11항에 있어서, 생체적합물질이
    (i) 하이드로겔 형태의 히알루론산(HA); 또는
    (ii) 다공성 포말 형태의 히알루론산; 또는 50 미크론 내지 300 미크론 사이의 포어(pore) 및 개방-셀 구조를 갖는 폴리-락트산 기반의 포말
    을 포함하는 것인 구조체.
  14. 제11항에 있어서, 필요로 하는 피험자에서 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료, 필요로 하는 피험자에서 적혈구 항상성의 제공, 또는 필요로 하는 피험자에서 신장 기능의 개선의 방법에 사용하기 위한 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 신장 질환이 에리트로포에틴(EPO) 결핍을 수반하고, 여기서 EPO 결핍은 피험자에서의 신부전, 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염, 및 다장기부전증으로 구성된 군으로부터 선택된 질환에 부차적으로 발생하는 것인, 구조체.
  16. 제15항에 있어서, EPO 결핍이 빈혈증인 구조체.
  17. 삭제
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