CN102271692A - 分离的肾细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的肾细胞，其包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群，及其分离和培养方法，以及用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。

Description

分离的肾细胞及其用途
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2008年11月12日提交的美国临时申请No.61/114,025、2008年11月12日提交的美国临时申请No.61/114,030、2008年12月5日提交的美国临时申请No.61/201,056、2008年12月8日提交的美国临时申请No.61/201,305和2008年12月10日提交的美国临时申请No.61/121,311的优先权，这些申请的全部内容通过引用并入本文。本申请的主题与2009年11月12日提交的美国临时申请No.61/260,833相关，该申请的公开内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及分离的肾细胞(包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，及其分离和培养方法，以及用所述细胞群治疗有需要的受试者的方法。
背景技术
在美国，有超过1900万的慢性肾病(CKD)患者，该疾病往往是由包括肥胖症、糖尿病和高血压在内的代谢障碍所致。数据检索显示，慢性肾病发病率的增加源于由高血压和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)所继发的肾衰竭的发展(美国肾病数据系统(United States Renal Data Service(USRDS))：用于CKD和ESRD的费用(Costs of CKD and ESRD)第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所(National Institute ofDiabetes and Digestive and Kidney Diseases)Bethesda，MD编著)所述两种疾病在全球范围内也呈上升趋势。已证实肥胖症、高血压和血糖控制不良是肾损害的独立危险因素，引起肾小球和肾小管损害并引起蛋白尿和其它全身可检测到的肾过滤功能的改变(Aboushwareb等，World J Urol，26：295-300，2008；Amann，K.等，Nephrol Dial Transplant，13：1958-66，1998)。对于处于1-3进行期的CKD患者，通过改变生活方式和旨在控制一种或多种潜在病情的药物介入进行控制；而对于处于4-5期的CKD患者，则通过透析和药物疗法进行控制，该药物疗法通常包括抗高血压药、红细胞生成刺激剂(ESA)、补充铁和维生素D。根据美国肾病数据系统(USRDS)，晚期肾病(ESRD)患者每个月在注射型红细胞生成刺激剂(ESA)、维生素D补充剂和铁补充剂上的平均费用超过$600(美国肾病数据系统：用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。再加上用于透析的年平均费用($65,405)，用于维持每位患者的医疗费用上升至每年超过$72,000(美国肾病数据系统：用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)-该数值仅反映了标准治疗的费用，并不包括其它并发症的治疗、紧急治疗或辅助治疗(例如放置用于透析通路的血管移植物)的费用。2005年，用于CKD和ESRD的联合医疗保健费用总计为$620亿-占该年所有医疗保健支出的19％(美国肾病数据系统：用于CKD和ESRD的费用第223-238页(2007)，由美国国立卫生研究院国立糖尿病、消化与肾病研究所Bethesda，MD编著)。虽然对于4-5期患者而言，肾移植作为先行措施以避免透析或当透析已不足以控制病情时是有效的方案，但在美国，可受益于全肾移植的5期CKD患者人数(＞400,000)远超过任何指定年份可获得的合适供体肾的数量(～16,000)(Powe，NR等，Am J Kidney Dis，53：S37-45，2009)。因此，需要新的治疗模式来延缓或降低对透析的依赖性并填补由供体肾短缺留下的空白。
进行性肾病是由初期疾病损伤(如，高血压)和随后对该损伤适应不良的肾反应联合所致。此类反应包括产生促炎性和促纤维化细胞因子和生长因子。因此，延缓CKD恶化的一种策略为改善炎性和纤维化反应以及通过肾组织的修复和/或再生来减轻或逆转肾溃变。
慢性肾衰竭常见于人类以及一些驯养的动物中。肾衰竭的患者不仅经受肾功能丧失(尿毒症)，而且会由于骨髓不能经由红细胞生成而产生足量的红细胞(RBC)而发展成贫血症。红细胞稳态取决于由驻留于肾脏中的特化间质成纤维细胞产生的促红细胞生成素(EPO)和骨髓中的靶红系祖细胞响应EPO并生成更多RBC的能力。肾衰竭的贫血源于肾脏中的EPO的生成的量的降低和尿毒症因素对骨髓中EPO作用的负面影响。
迄今为止，治疗慢性肾衰竭的临床方法包括用于恢复肾过滤和尿液生成的透析和肾移植，以及用于恢复红细胞团块的重组EPO或EPO类似物的全身性递送。透析延长了中期至晚期肾衰竭患者的生存期，但却导致严重的生活质量问题。肾移植对于晚期肾衰竭患者而言是非常理想(并且往往是唯一)的方案，但优质的供体肾的供应不能满足肾衰竭群体的需求。用于治疗贫血的含重组EPO的丸剂现已与严重的下游健康风险相关，致使FDA对该药物发出黑框警告(black box warning)，并且需要进一步研究用于恢复此群体中红细胞稳态的替代疗法。临床前研究已检测了经由基因治疗方法所产生的EPO生成细胞的体内功效和安全性。这些研究表明，可通过EPO生成细胞的体内递送来瞬时刺激红细胞生成和RBC数量。然而，迄今为止，这些方法均未提供可调的红细胞稳态或长期的体内功能性。因此，HCT和RBC数量通常增加超过正常值，导致真性红细胞增多症和其它并发症。与治疗相关的并且相比重组EPO递送提供更多优势的EPO生成细胞的递送不仅必须增加HCT，而且还应恢复红细胞稳态，同时保持正调节机制和负调节机制未受损。需要指出的是，虽然EPO缺乏性贫血常见于肾病患者中，但是其发病也可由其它病情引起，包括心力衰竭、多器官系统功能衰竭和其它慢性疾病。
肾是由许多不同的特化细胞类型(10种以上)构成的独特器官，这些细胞类型均从间介中胚层起源发育，但在成熟时却形成形态学上和功能上不同的区室以及解剖单元，这些解剖单元协同作用以过滤血液、产生尿液、调节酸碱及电解质平衡和调节内分泌功能，诸如产生促红细胞生成素(Epo)、维生素D、肾素和血管紧张素。肾的细胞区室在稳态功能方面具有很大的相互依赖性，这在下列实例中重点描述。入球小动脉细胞与髓袢升支粗段(thethick ascending limb of the loop of Henle)中的特化肾小管细胞(致密斑)协同作用，以调节流经肾小球的血流(Castrop，H.Acta Physiol(Oxf)，189：3-14，2007)。肾小球的有孔内皮细胞、足细胞和基底膜与特化的近端肾小管细胞对来自肾小球滤液的蛋白质所进行的受体介导的内吞和重吸收相配合，以此实现肾对蛋白质的处理(Jarad，G & Miner，JH.Curr Opin Nephrol Hypertens，18：226-32，2009)。由肾小管细胞生成的活性维生素D通过直接或间接机制调节间质细胞的稳态，这些机制控制细胞外基质的沉积、间质细胞向肌成纤维细胞的转化以及上皮-间充质细胞转化(Tan，X等，J Steroid Biochem MolBiol，103：491-6，2007)。无论具体实例如何，肾中细胞间的相互作用至少部分地取决于空间和结构关系。在细胞水平上，CKD的进展可涉及由细胞机能不全或稳态细胞间相互作用的缺失而导致的特定细胞类型的缺失或一种或多种细胞类型的功能丧失。因此，治疗CKD的有效再生方法必须通过恢复细胞组织和细胞间通讯来对稳态进行部分重建。
已设想通过增强特定的肾功能(例如肾小管转运或Epo生成)来降低与CKD进展相关的发病率和死亡率。大多数基于细胞的肾病治疗方法侧重于用干细胞或祖细胞类型对急性肾衰竭(ARF)进行治疗干预(Hopkins，C等，JPathol，217：265-81，2009)。目前存在许多临床前研究，其涉及在诱发ARF之前或之后便立即递送各种细胞类型，包括肾内或全身性递送MSC(Humphreys BD & Bonventre JV，Annu Rev Med 2008，59：311-325)、内皮祖细胞(EPC)(Chade AR等，Circulation 2009，119：547-557；Patschan D等，CurrOpin Pharmacol 2006，6：176-183)以及胎儿细胞或组织原基(Hammerman MR，Curr Opin Nephrol Hypertens 2001，10：13-17；Kim SS等，Stem Cells 2007，25：1393-1401；Marshall D等，Exp Physiol 2007，92：263-271；Yokoo T等，JAmSoc Nephrol 2006，17：1026-1034)。将包含肾小管细胞的体外中空纤维过滤装置进行测试作为治疗人类ARF的传统透析的辅助(Ding，F & Humes，HD.Nephron Exp Nephrol，109：e118-22，2008；Humes，HD等，Kidney Int，66：1578-88，2004；Humes，HD等，Nat Biotechnol，17：451-5，1999)。还对心血管外科手术继发性ARF发作的高危患者群体进行了经肾动脉移植间充质干细胞的临床试验(Westenfelder，C.Experimental Biology.New Orleans，LA，2009)。针对基于细胞的CKD治疗干预而进行的临床前研究数量有限(Chade，AR等，Circulation，119：547-57，2009；Eliopoulos，N等，J Am Soc Nephrol，17：1576-84，2006；Kucic，T等，Am J Physiol Renal Physiol，295：F488-96，2008)。已在啮齿动物中对胎儿肾原基+/-间充质干细胞的组合进行了研究(Yokoo，T等，Transplantation，85：1654-8，2008；Yokoo，T等，J Am Soc Nephrol，17：1026-34，2006)，其中移植到合适环境(如网膜)的整个胎儿肾组织显然可发展成为功能有限的肾结构。然而，MSC作为胎儿肾组织原基组分的治疗作用并不明确，并且用于治疗目的之人体胎儿肾组织的来源面临着许多操作和伦理的挑战。在其它研究中，将来源于健康供体骨髓的细胞移植到经辐射的COL4A3(-/-)小鼠体内，该小鼠为患有肾小球性肾炎、蛋白质流失和纤维样变性的奥尔波特综合征(Alport Syndrome)模型，其中所述细胞通过用没有胶原基因突变的健康细胞替换渗漏肾小球足细胞从而部分延缓了模型中综合征的进展(Prodromidi，EI等，Stem Cells，24：2448-55，2006，Sugimoto，H等，Proc Natl Acad Sci U S A，103：7321-6，2006)。认为细胞移植有助于使sCREAT、BUN和钠的水平稳定，而在研究24中，未治疗的/肾受损对照组没有给出比较结果。Chade等采用单侧肾动脉狭窄的猪模型对损伤6周后于肾内递送的自体EPC的效果进行检验(Chade AR等，Circulation 2009，119：547-557)。EPC在某种程度上改善了肾小管-间质纤维化，显著改善了肾小球硬化症并改善了肾血流量，但在治疗后未观察到血压的变化(Chade AR等，Circulation 2009，119：547-557)。迄今为止，对基于细胞的CKD疗法的体内功效进行检验的研究已产生即时和/或局部效应，且很少有研究同时收集到功能的全身性和组织学证据。少数研究提供对进行性CKD模型干预后的临床相关益处的证据，这些研究提出了有关基于细胞的疗法完全恢复肾功能潜力的问题。然而，稳定肾功能并延缓进展的再生疗法能够解决此患者群体范围内未得到满足的医疗需求。
进行性CKD的体内可再生模型对于评价候选疗法的治疗潜力而言必不可少。虽然ARF模型数目众多并且包括多种化学物质或局部缺血/再灌流诱发的肾小管损伤，但未经显著干预的进行性和晚期CKD模型较少。在大鼠中进行两步5/6肾切除手术再生地产生了晚期和进行性肾衰竭状态，导致全身地和组织学上地可检出的疾病，这些疾病伴有CKD的若干关键特征，包括高血压、肾小球滤过率(GFR)降低、血清肌酸酐(sCREAT)和BUN升高、肾小球和肾小管-间质纤维化、高脂血症、高磷酸盐血症和贫血(Kaufman，JM等，Kidney Int，6：10-7，197422；Platt，R等，Clin Sci(Lond)，11：217-31，1952；Ormrod，D & Miller，T.Nephron，26：249-54，1980；Brenner，BM.Am J Physiol，249：F324-37，1985)。这些临床相关特征的存在，连同技术再现性和商业可用性为本文所述研究模型的选择提供了基础。
因此，需要显著并持久增强肾功能的新治疗模式，以延缓病情发展和改善此患者群体的生活质量，并减轻医疗保健体系的年度费用负担。再生医疗技术可提供CKD的下一代治疗方案。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一些实施方案中，混合物还包括第三细胞群。在一个实施方案中，B2细胞群还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，B2细胞群具有耐低氧性。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。在另一个实施方案中，B2细胞群具有碘克沙醇耐受性。在某些实施方案中，B2细胞群的密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间。在其它实施方案中，第二细胞群为B4细胞群。在一个实施方案中，B4细胞群的密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间。在某些其它实施方案中，第二细胞群为B3细胞群。在一个实施方案中，B3细胞群的密度介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间。在其它实施方案中，混合物包括B2细胞群和B3细胞群。
在其它实施方案中，混合物缺乏惰性或不需要的组分。在一个实施方案中，混合物不包括或缺乏B1细胞群。在一个实施方案中，B1细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其密度小于～1.045g/mL。在某些其它实施方案中，混合物不包括或缺乏B5细胞群。在一个实施方案中，混合物不包括密度大于～1.091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
在某些实施方案中，细胞混合物可稳定和/或改善和/或恢复肾功能。在一个实施方案中，混合物能够吸收受体介导的白蛋白。在其它实施方案中，细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。在其它实施方案中，混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。在一个实施方案中，经由体内递送，混合物能够提供再生刺激。在其它实施方案中，经由体内递送，混合物够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
在所有实施方案中，第一细胞群和第二细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。在一个实施方案中，B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在另一个实施方案中，B2还通过集合管标记物水通道蛋白-4(Aqp4)标记物的表达来表征。
在所有实施方案中，B4可通过选自PECAM、VEGF、KDR、HIF1a的血管标记物的表达来表征。在某些其它实施方案中，B4可通过肾小球标记物Podocin(Podn)或Nephrin(Neph)的表达来表征。在另一个实施方案中，B4可相对于未分化的(UNFX)B2和B3细胞群表征为氧可调EPO富集群。在另一个实施方案中，B4通过选自下列各项的标记物的表达来表征：趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原α2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(Cdh5)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3(Timp3)、维耳姆斯瘤1(Wt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)。
在所有实施方案中，B3可通过选自下列各项的标记物的表达来表征：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节子2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白(claudin)2(Cldn2)、napsin A天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(易化葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基辅酶A合成酶介质链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1，6-二磷酸酶1(Fbp1)和丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)。在某些其它实施方案中，B3通过血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin(Podn)来表征。
在一个方面，本发明提供了一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中第二细胞群包括表达血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin (Podn)的一个或多个细胞群。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。在某些实施方案中，B2细胞群不包括密度小于～1.045g/mL的B1细胞群，B1细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间的B3细胞群，B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，B2细胞群不包括密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的B4细胞群。在另外一个实施方案中，B2细胞群不包括密度大于～1.091g/mL的B5细胞群，B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种制备人B2细胞群的方法，其包括：a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B2细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括：将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间的梯度中。
在另一个方面，本发明提供了一种制备人B4细胞群的方法，其包括：a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B4细胞群的第一细胞组分。在一个实施方案中，相比非富集细胞群时，通过本发明方法得到的B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括：将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的梯度中。
在另一个方面，本发明提供了一种制备人B3细胞群的方法，其包括：a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；和b)提取包括B3细胞群的第一细胞组分。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，该步骤包括：将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中第一细胞组分在离心后存在于比密度介于1.052g/mL和约1.063g/mL之间的梯度中。
在另一个方面，本发明还提供了一种制备B2细胞制剂的方法，其包括：a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B2细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B2细胞亚群通过高前向散射和高侧向散射来表征。
在另一个方面，本发明还提供了一种制备B4细胞制剂的方法，其包括：a)将包括非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将B4细胞亚群与细胞群分离，其中相对于所述细胞群的大部分而言，B4细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。在所有实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在所有实施方案中，侧向散射对应于细胞颗粒度。
在另一个方面，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供稳定和/或改善的肾功能的可植入构建体，其包括：a)生物材料，其包括一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)哺乳动物肾细胞的混合物，其包括用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第一细胞群、B2和第二细胞群。在一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第二细胞群为B4。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的第二细胞群为B3。在另一个实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物还包括第三细胞群。在某些实施方案中，用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合的混合物包括B3和B4。在所有实施方案中，混合物可源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。在一个实施方案中，构建体包括被构建为适于截留和/或附着混合物的三维(3-D)多孔生物材料的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括由大小范围为5.1kDA至2×106kDA以上的HA分子构成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由具有介于约50微米至约300微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成的生物材料。在另外一个实施方案中，构建体包括源自自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，肾样本为肾活组织检查样本。在另外一个实施方案中，构建体包括源自非自体肾样本的一个或多个细胞群。在一个实施方案中，构建体提供红细胞稳态。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗有需要的受试者的肾病的方法，其包括：a)对受试者施用包含哺乳动物肾细胞混合物的组合物，所述哺乳动物肾细胞混合物包括第一细胞群、B2和第二细胞群；和b)确定来自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。在某些实施方案中，所述方法包括含有第三细胞群的细胞混合物。在一个实施方案中，第二细胞群为B4或B3。在另一个实施方案中，第三细胞群为B4或B3。在某些实施方案中，待由本发明方法治疗的肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。在某些实施方案中，EPO缺乏为贫血。在一些实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在一些其它实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病：慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。在某些实施方案中，用于该方法的组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中混合物用生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
在另一个方面，本发明提供了本发明的细胞制剂及其混合物或可植入构建体用于制备治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的制剂的用途。
在一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.045g/mL至约1.052g/mL的部分，其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的梯度中；(ii)包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能。
在另一个方面，本发明提供了一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.063g/mL至约1.091g/mL的部分，其中细胞群(i)在离心后保留于密度介于约1.063g/mL至约1.091g/mL之间的梯度中；(ii)包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求65所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。
在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作：i)置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25,000个细胞/厘米2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1∶1混合物组成，其中含5％的胎牛血清，在37℃和21％的氧气条件下培养24-72小时；ii)用相同培养基更换50-100％的培养基，并在37℃和2％的氧气条件下培养18-24小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集，再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备，液体总体积不小于5mL且不大于14mL，并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过1亿；v)通过在800x G下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙黏着蛋白(Ncad)、E-钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)、钙蛋白酶-8(Capn8)和水通道蛋白-4(Aqp4)标记物；和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能的衰退减轻，使其稳定或改善。
在另一个方面，本发明提供了一种肾细胞群，其中将所述细胞进行如下操作：i)置于经组织培养处理的标准塑料盘上进行贴壁培养，其中初始密度为25,000个细胞/厘米2，培养基由高含量葡萄糖DMEM和完全补充KSFM培养基的1∶1混合物组成，其中含5％的胎牛血清，在37℃和21％的氧气条件下培养24-72小时；ii)用相同培养基更换50-100％的培养基，并在37℃和2％的氧气条件下培养18-24小时；iii)经由胰蛋白酶消化来收集，再悬浮，并用不含血清的KSFM培养基或PBS洗涤；iv)加载到制备好的密度梯度中，所述梯度包含限定密度介于1.063g/mL至约1.091g/mL之间的层，并包含密度较大的至少一层和密度较小的至少一层，其中梯度在15mL圆锥管中制备，液体总体积不小于5mL且不大于14mL，并且加载到该梯度中的细胞数目至少为5000万但不超过1亿；v)通过在800x G下连续离心20-30分钟来迫使细胞通过梯度；在介于1.063g/mL和约1.091g/mL之间的密度处分段；和/或通过选自下列各项的标记物表征：VEGF、KDR、HIF1a、Podocin(Podn)或Nephrin(Neph)、趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原α2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(Cdh5)、组织纤溶酶原激活因子(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3(Timp3)、维耳姆斯瘤1(Wt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)；和/或能够使患有肾病的免疫相容受试者的一种或多种肾功能的衰退减轻，使其稳定或改善。
在一个方面，本发明提供了分离的促红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群。在一个实施方案中，该细胞群为分离的EPO生成哺乳动物细胞富集群。在另一个实施方案中，该细胞群为分离的促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞富集群，其相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞群的非富集群而言，其包含较大比例的EPO生成细胞。
该细胞群可源自肾组织或培养的肾细胞。该细胞群可源自得自受试者的肾样本。该样本可为来源于得自受试者的肾样本的肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含EPO生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较大比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言包含较小比例的肾小管细胞。
在所有实施方案中，该细胞群可富集EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集非EPO生成细胞。在所有实施方案中，该细胞群可富集肾小管细胞。
在另一个方面，本发明提供了在某些培养条件下生物应答的促红细胞生成素(EPO)生成细胞的细胞群。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，当相对于在非低氧条件下培养的细胞群而将细胞群在低氧条件下培养时，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5％，而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21％)。在另一个实施方案中，相比在大于或等于21％的氧含量下试验的培养物而言，可在低于大气水平(21％)的氧含量下观察到EPO表达的增加。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5％的氧气(即低氧培养条件)下培养时，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21％)(即非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增加。在一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF来调节。在另一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过HIF1α来调节。在另一个实施方案中，对低氧条件生物应答的EPO表达通过低氧诱导因子HIF2α来调节。
在一个实施方案中，当相对于未经灌流培养的细胞群而将细胞群经由灌流培养时，生物应答为EPO表达的诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，生物应答为EPO表达的增加。在一些实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中，所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或其上培养。
在另一个方面，本发明提供了包含本文所述细胞群的肾细胞的混合物或组合。在一个实施方案中，细胞混合物包括富集EPO生成细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，第二细胞群可包含一种或多种类型的肾源细胞，其可包括但不限于下列一种或多种细胞：源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。
在所有实施方案中，本文所述的肾小管细胞可通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列各项的一种或多种：透明质酸合酶2(HAS2)、CYP2D25(维生素D325-羟化酶)、巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
在一个方面，本发明提供了分离的哺乳动物肾小管细胞富集群。在一个实施方案中，分离的细胞群富集肾小管细胞并包含至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，该细胞群相比包含肾小管细胞的非富集群而言具有较大比例的肾小管细胞。在另一个实施方案中，分离的哺乳动物肾小管细胞富集群相比包含肾小管细胞的非富集群而言包含较大比例的肾小管细胞和至少一些EPO生成哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，相比未分化的异质性混合物或相比EPO生成细胞富集群而言，哺乳动物肾小管细胞富集群相对缺乏EPO生成细胞。
在所有实施方案中，本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的来源类型可为自体的、同种异体的、同系的(自体的或同基因的)及其任意组合。例如，在一些实施方案中，细胞混合物可包含(i)源自自体源的第一细胞群和源自自体源的第二细胞群；或(ii)源自自体源的第一细胞群和源自同种异体源的第二细胞群。
在另一个方面，本发明提供了产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备具有非富集异质性啮齿动物肾细胞群的细胞悬液；b)将细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心以限定一种或多种细胞组分；和d)提取包含富集细胞群的第一细胞组分，其中富集细胞群相比非富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.025g/mL和约1.035g/mL之间或小于约1.045g/mL的层。在另一个实施方案中，步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.025g/mL和约1.035g/mL之间或小于约1.045g/mL的梯度中。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e)提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.062g/mL和约1.088g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.062g/mL和约1.088g/mL之间的梯度中。
在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的非富集异质性哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)使细胞悬液与密度梯度接触，以基于浮力密度分离一种或多种细胞组分；c)将步骤b)的细胞悬液离心，以限定一种或多种细胞组分；和d)提取包含富集细胞群的第一细胞组分，其中相比非富集细胞群，富集细胞群具有较大比例的EPO生成细胞和较小比例的非EPO生成细胞。在一个实施方案中，步骤a)的细胞悬液得自培养的非富集异质性啮齿动物细胞群。在此实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.073g/mL和约1.091g/mL之间的层。在一个实施方案中，步骤d)的第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.073g/mL和约1.091g/mL的梯度中。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述EPO生成富集细胞群。在另一个实施方案中，该方法还包括步骤e)提取至少一种附加细胞组分。在另一个实施方案中，密度梯度包括比密度介于约1.041g/mL和约1.062g/mL之间的层。在另一个实施方案中，附加细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.041g/mL和约1.062g/mL之间的梯度中。
在一些实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞，而缺乏非EPO生成细胞。在其它实施方案中，富集细胞群富集间质成纤维细胞，而缺乏肾小管细胞和集合管细胞。在另一个实施方案中，富集细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，离心步骤(c)还产生至少一种附加细胞组分，其未富集所述富集细胞群。在一些实施方案中，相比非富集细胞群而言，附加细胞组分包含较大比例的非EPO生成细胞和较小比例的EPO生成细胞。在一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，至少一种附加细胞组分具有较小比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，相比第一细胞组分而言，附加细胞组分包含较大比例的肾小管细胞。
在一些实施方案中，产生富集EPO生成细胞的细胞群的方法中所使用的密度梯度为碘克沙醇密度梯度。
在另一个方面，本发明提供了使用流式细胞术产生促红细胞生成素EPO生成细胞富集群的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)由机械分离或酶消化的哺乳动物肾组织制备包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离，其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)由培养的包含至少一些表达或能够表达EPO的细胞的哺乳动物细胞群制备细胞悬液；b)将细胞悬液施加到流式细胞仪中，该流式细胞仪能够同时测量细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；c)从细胞群中选出细胞亚群；d)分选来自细胞群的细胞亚群；和e)将细胞亚群与细胞群分离，其中相对于整个细胞群而言，细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
在另一个实施方案中，前向散射对应于细胞尺寸。在一个实施方案中，侧向散射对应于细胞粒度。本发明的其它实施方案提供了富集的细胞组分，其：i)富集EPO生成细胞而缺乏非EPO生成细胞；或ii)富集生成EPO的特化间质皮质成纤维细胞而缺乏上皮细胞细胞。在另一个实施方案中，选择步骤c)包括产生所述未富集细胞群的至少一种附加组分。在另一个实施方案中，相比EPO富集组分而言，一种或多种附加组分包含较小比例的EPO生成细胞。
在本发明的另一方面，所述方法包括进一步体外培养的步骤。在一个实施方案中，在分离后将富集细胞群进行体外培养。在另一个实施方案中，该培养步骤包括在适于支持所述细胞群生长和/或维持的培养基中，在适于哺乳动物细胞培养的玻璃或塑料表面上采用二维单层培养。在其它实施方案中，培养步骤包括在适于细胞维持和/或生长的三维(3D)支架上培养细胞。在另一个实施方案中，支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，支架被构建为适于截留或附着哺乳动物细胞的多孔支架。在其它实施方案中，支架被构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的凝胶。
在另一个方面，本发明提供了包括在灌流条件下进行培养步骤的方法。在一个实施方案中，灌流条件包括但不限于对流体进行短暂、间歇或连续的循环或搅拌，使得动力经由流体流动传递至细胞。在另一个实施方案中，所进行的灌流培养条件应使得细胞群在可提供允许形成三维结构的骨架和/或空间的材料中或之上培养。
在另一个方面，本发明提供了包括在低氧条件下进行培养的步骤的方法。在一些实施方案中，低氧培养条件包括但不限于相对于在氧含量未降低的条件下培养的细胞群而言，将细胞群的培养体系中的可用氧含量降低。在另一个实施方案中，可用氧含量的降低约小于5％，而氧含量未降低的条件为大气氧含量(约21％)。在另一个实施方案中，低氧条件以氧含量小于21％(大气)为代表。
在另一个方面，本发明提供了包括对细胞群中的EPO表达进行测量的步骤的方法。在所有实施方案中，EPO表达为EPO mRNA表达。在所有实施方案中，可检测和/或检测出EPO表达。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，EPO表达在经由灌流培养的细胞群中诱导。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言，EPO表达在低氧条件下培养的细胞群中诱导。在另一个实施方案中，相对于未经灌流培养的细胞群而言，经灌流培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在其它实施方案中，相对于在非低氧条件下培养的细胞群而言，低氧条件下培养的细胞群中可检测到的EPO表达较高。在另一个实施方案中，当将细胞在约小于5％的氧气(即，低氧培养条件)下培养，并且将诱导水平和/或增加的表达与在大气氧含量(约21％)(即，非低氧培养条件)下培养的细胞进行比较时，可观察到EPO表达的诱导和/或增加。在另一个实施方案中，在低于21％氧气(大气)的条件下培养细胞时可观察到EPO表达的增加。
在另一个方面，本发明提供了包含本文所述的一个或多个细胞群的可植入构建体。在一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素(EPO)生成细胞群的可植入构建体，其中该构建体包括：a)支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群，其沉积在支架表面上或表面中。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于向有需要的受试者提供促红细胞生成素EPO生成细胞群的可植入构建体，其中该构建体包括：a)多孔支架，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和b)细胞混合物，其包含i)富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群，和ii)富集非EPO生成细胞的第二细胞群，其中细胞混合物沉积在支架表面上和/或支架孔内。在一些实施方案中，相对于第二细胞群而言，第一细胞群中的EPO表达较高。在另一个实施方案中，第二细胞群包含一种或多种肾源细胞类型，其可包括但不限于下列一种或多种细胞：源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自结缔组织的细胞、源自集合管的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。本发明的一些实施方案提供了富集肾小管细胞的细胞群，所述肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物包括但不限于下列蛋白的一种或多种：巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
在一个实施方案中，本发明所提供的肾细胞混合物可包括源自本文所述类型的肾组织源的细胞群。在其它实施方案中，第一细胞群和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。在另一个实施方案中，相比包含促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，除了EPO生成细胞外，第一细胞群还包含肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较大比例的EPO生成细胞。本发明的其它实施方案包括第一细胞群，相比促红细胞生成素(EPO)生成哺乳动物细胞的非富集群而言，该第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在其它实施方案中，相比第二细胞群而言，第一细胞群包含较小比例的肾小管细胞。在一些实施方案中，用细胞和生物材料配合。在一个实施方案中，将支架或生物材料构建为三维(3-D)多孔支架。在另一个实施方案中，3-D多孔支架适于截留或附着哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，将支架或生物材料构建为适于包埋、附着或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。在一个实施方案中，适用于本发明构建体的细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。
在另一个方面，本发明提供了对需要富集EPO生成细胞的细胞群的受试者进行治疗的方法。在一个实施方案中，治疗有需要的促红细胞生成素(EPO)缺乏的受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个实施方案中，EPO缺乏为贫血。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于受试者的肾衰竭。在另一个实施方案中，EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病：慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。
在另一个实施方案中，治疗有需要的肾病受试者的方法包括对受试者施用组合物的步骤，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
在一些实施方案中，向有需要的受试者施用的组合物还包含未富集EPO生成细胞的第二肾细胞群。在其它实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架的孔内。在另一个实施方案中，该组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。
在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于下列蛋白的一种或多种：巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
在所有的实施方案中，第二细胞群包含选自下列的一种或多种肾源细胞类型：源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质组织的细胞、源自集合管的细胞、源自结缔组织的细胞、源自血液的细胞或源自血管的细胞。在所有实施方案中，相对于异质性未分化群或第一细胞群而言，第二细胞群相对缺乏肾小球细胞、血管细胞和氧应答EPO生成细胞。
在另一个方面，本发明包括为有需要的受试者提供红细胞稳态的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。
在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b)确定来自受试者的样本中红细胞生成功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的红细胞稳态。
在另一个方面，本发明包括改善有需要的受试者的肾功能的方法。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群；和b)确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。
在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：a)对受试者施用组合物，该组合物包含富集EPO生成哺乳动物细胞的第一细胞群和未富集EPO生成细胞的第二细胞群；和b)确定来自受试者的样本中肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中指标水平的差值指示受试者的肾功能得到改善。在另一个实施方案中，所述组合物还包括多孔支架，该多孔支架包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽，其中第一细胞群和第二细胞群沉积在支架表面上和/或支架孔内。
在其它实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群和/或第二细胞群源自自体或非自体肾样本。在另一个实施方案中，样本为肾活组织检查样本。
在一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第一细胞群富集低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
在一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，肾小管细胞通过肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于以下物质的一种或多种：透明质酸合酶2(HAS2)、CYP2D25(维生素D3 25-羟化酶)、巨蛋白、cubilin、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白-1、水通道蛋白-2和水通道蛋白-4。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并包含集合管的上皮细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群相对富集肾小管细胞，包含集合管上皮细胞，而相对缺乏低氧应答EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
附图简述
图1示出突出患病肾组织相比正常肾组织的纤维化的Gomori Trichrome染色。
图2示出患慢性肾病的猪的细胞中促红细胞生成素基因的氧调节表达。
图3示出增殖培养物中的小管样结构。
图4示出培养的功能性肾小管细胞对受体介导的白蛋白吸收。
图5示出EPO表达在分离后比在初始人肾组织中相对更高。
图6示出培养的人肾细胞中对EPO基因表达的保留水平。
图7示出大气(21％)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)EPO表达的结果。
图8示出低(2％)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)EPO的表达。
图9示出长期培养物中动态培养的(+)肾小管基因的表达。
图10示出低氧培养物(相对常氧培养物)中的EPO表达。
图11示出体外动态3D培养物对EPO表达的刺激。
图12示出从2D培养物和3D培养物中收集的细胞裂解物(上图)和条件培养基(下图)中定量靶蛋白的ELISA结果。
图13示出H&E染色的接种OPLA和1型胶原支架(灌流或静态培养(7)天后染色)，其通过标准技术固定在10％福尔马林缓冲液中并经石蜡包埋。进行H&E染色以检验细胞的存在和形态。灌流支架中的细胞含量高于静态支架中的细胞含量，相比OPLA支架，1型胶原支架中的细胞含量明显更高。灌流1型胶原支架中的细胞形成相比静态1型胶原支架中更为显著。
图14示出(灌流或静态)培养(7)天后OPLA和1型胶原支架的扫描式电子显微照片(SEM)。注意到灌流(相比静态)具有更高的细胞含量，并且在1型胶原支架灌流(相比静态)条件下具有优良的细胞形成和互联性。
图15示出通过添加裂解缓冲液(Qiagen)从支架或2D培养物分离的mRNA的RT-PCR结果。对于3D支架，利用电匀浆化(polytron)来确保RNA的充分裂解与释放。用对目标靶基因特异的内含子跨越引物对纯化的mRNA进行RT-PCR分析(泳道1-7：各3D结构(灌流)/5日培养物；泳道8-10：各2D结构/5日培养物；泳道11-17：各初始细胞群(接种前)；泳道18-19：2D培养物/4日培养物；泳道21：宏观解剖的新鲜组织)。
图16示出三种不同接种的支架中的代谢活性。
图17示出原代肾细胞的灌流和静态3D培养物对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗。
图18示出治疗后的啮齿动物平均存活率(天)。
图19示出整个研究过程中的啮齿动物体重。
图20图示了治疗前至死亡期间的重量增量。
图21示出每周平均血清BUN浓度。
图22示出每周平均血清肌酸酐浓度。
图23示出中期时的相对BUN/个体大鼠数据。
图24示出中期时的相对血清肌酸酐/个体大鼠数据。
图25示出每周中期时的平均HCT、相对HCT(个体大鼠数据)。
图26a示出中期时的相对HCT(个体大鼠数据)。
图26b示出肾切除术后的血清肌酸酐(A)和血细胞比容(B)。
图27示出每周的平均RBC#。
图28示出中期时的相对RBC#/个体大鼠数据。
图29示出最终血清电解质浓度。
图30示出相对血清磷(最终)/个体大鼠数据。
图31示出最终血清蛋白浓度。
图32示出相对血清白蛋白&蛋白总量(最终)/个体大鼠数据。
图33示出最终血清肝功能。
图34示出最终血清胆固醇、三酸甘油酯和葡萄糖。
图35示出相对血清胆固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(最终)/个体大鼠数据。
图36示出最终Hb、MCH和MCHC。
图37示出最终相对[Hb]/个体大鼠数据。
图38示出最终WBC计数。
图39示出最终WBC组成。
图40示出最终网织红细胞。
图41示出最终血小板数据。
图42示出游泳试验结果。
图43示出每个试验组的代表性H&E-染色的骨髓组织切片。上图显示，与对照组相比，肾切除+细胞注入组的骨髓细胞含量和骨髓与红细胞的比率看起来相同。相比之下，肾切除+构建体组和未治疗动物组中的骨髓分别显示出中度、显著降低的骨髓细胞含量(放大率200倍)。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
图44示出每个试验组的代表性H&E-染色的脾组织切片。上图显示在对照组和肾切除+细胞注入组之间没有观察到显著的组织学差异或变化。相比之下，在肾切除+构建体组和未治疗动物组中的紧邻囊下的红髓间隙，显示成人红细胞(RBC)和RBC前体分别存在中度和显著的降低(放大率200倍)。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
图45示出每个试验组的代表性H&E-染色的肝组织切片。相比对照组，在肾切除+构建体组或未治疗的肾切除动物组中未观察到显著的肝实质和/或肝门三联征变化。相比之下，未在肾切除+细胞注入组中观察到窦状隙血细胞生成焦点区(圆形)(放大率200倍)。下图示出上图中示出的肝门三联征的高清视图(放大率未知)。
图46示出每个试验组的代表性H&E-染色的肾组织切片(放大率1倍)。上图显示，相比对照组，其它三组的肾切片显示出结构缺失的进行性肾小球和肾小管变性，在所有对照组中，通过不良的血铁黄素和多灶性肾小管再生来表征(放大率200倍)。箭头指向构建体治疗部位。下图示出上图中被框起的图的高清视图(放大率未知)。
图47示出个体大鼠数据/HCT％(相对血清肌酸酐)。第5组＝实心圆；第6组＝环绕的“3”；第4组＝环绕的“1”；第1组＝环绕的“4”；第2组＝环绕的“2”。
图48示出采用多层分级梯度技术(左图)或单层混合梯度技术使来自新鲜分离肾组织的epo生成细胞组分富集。两种方法均导致非epo生成细胞组分(主要为肾小管细胞)从epo带局部缺失，该epo带介于1.025g/mL和1.035g/mL之间。
图49a示出确定上皮钙黏着蛋白表达的定量实时PCR(QRTPCR)结果。
图49b示出采用密度分级梯度确定Epo富集的定量实时PCR(QRTPCR)结果。
图50图示了分级梯度组分在分离和培养时的相对基因表达。图(a)和(b)示出在组织分离后立即进行密度梯度分离的两批独立的原代肾细胞。在两批细胞中，促红细胞生成素(Epo)mRNA的表达在分级梯度的带1中可再生地富集。将所有样本中的Epo表达标准化为新鲜消化的异质性肾细胞群。图(c)清楚地显示除了富集EPO表达外，带1还相对缺乏肾小管细胞，这可通过肾小管标记物、神经钙黏着蛋白、上皮钙黏着蛋白、水通道蛋白1和水通道蛋白2的低表达来证实。相比之下，肾小管标记物在带2和带3中富集，突出分级梯度的附加特征-同时富集肾小管细胞组分。
图51示出水通道蛋白-1(肾小管细胞标记物)的蛋白质印迹分析(Western Blot analysis)。此蛋白质印迹示出水通道蛋白1在带2和带3中有清晰和明确的富集，这进一步支持了组分2和组分3的肾小管细胞富集，如图2中图(d)所描述。
图52示出治疗后16周的血细胞比容水平。
图53示出治疗后12周的血红蛋白水平。
图54示出用两种不同剂量的rEPO治疗的5/6肾切除大鼠(与对照组和未治疗组相比)随时间变化的血细胞比容水平。
图55示出用高和低剂量的EPO富集细胞治疗的5/6肾切除大鼠(与肾小管富集细胞和rEPO相比)随时间变化的血细胞比容水平。
图56a和56b示出治疗后16周的血清肌酸酐浓度以及治疗前至治疗后16周期间肌酸酐占对照组的百分比。
图57示出治疗后12周的游泳耐力结果。
图58示出治疗后16周的重量增量占初始重量的百分比。
图59示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗的尿毒症大鼠中血清肌酸酐占健康对照组的百分比。
图60示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中白蛋白/球蛋白的比率。
图61示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中磷：钙的比率。
图62示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清三酸甘油酯水平。
图63示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血清胆固醇水平。
图64示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)处理后12周的尿毒症大鼠中的血清血红蛋白水平。
图65示出未治疗的尿毒症大鼠和用高剂量EPO富集细胞(原型#2)或肾小管富集细胞(原型#4)治疗后12周的尿毒症大鼠中的血细胞比容水平。
图66示出功能性啮齿动物肾小管细胞对罗丹明缀合白蛋白的吸收。
图67示出与未治疗的尿毒症大鼠相比，新肾细胞(异质性EPO生成细胞)治疗的尿毒症大鼠的血清肌酸酐、肾功能指标维持在接近正常的水平。
图68示出对从正常人体肾脏分离和增殖的肾小管和肾小球细胞的表型特征的维持。
图69示出与3D动态培养物中的肾小管缺乏群相比，肾小管富集群中的肾小管标记物、钙黏着蛋白的表达增加。
图70示出通过流式细胞术对EPO生成细胞进行分离。
图71示出“常氧”(21％氧)和“低氧”(2％氧)啮齿动物培养物的分级梯度，这些培养物分别收集并一起施加至相同的分级梯度中。
图72示出“常氧”(21％氧)和“低氧”(2％氧)犬科动物培养物的分级梯度，这些培养物分别收集并一起施加至相同的分级梯度中。
图73示出低氧培养对B4中基因表达的影响。
图74示出B2和B4亚组分的组成分析结果。使用定量实时PCR(qRTPCR)来评价B2和B4亚组分中肾细胞型特异基因的表达。(a，b)根据维生素D羟化酶(CYP2R1)和Cubilin的相对表达，亚组分B2相对于B4和所有其它亚组分富集近端肾小管细胞。(c)与B4相比，亚组分B2中也富集远端肾小管标记物上皮钙黏着蛋白。(e，f)亚组分B4中富集肾小球标记物nephrin和podocin，还富集血管标记物kdr(d)。(g，h)B4中还富集氧调节间质标记物Hif2α和Epo。(i)B2和B4的结果定量展示。(j)通过对亚分级分离后培养的细胞进行免疫细胞化学分析来确定B2近端(神经钙黏着蛋白/绿色)和远端(上皮钙黏着蛋白/红色)肾小管标记物的高效表达。(j)相比之下，上皮钙黏着蛋白-或神经钙黏着蛋白阳性细胞很少存在于B4培养物中。
图75示出B2和B4亚组分的功能特征。(a)将B2和B4细胞进行继代培养并评价cubilin表达及受体介导的白蛋白吸收。图表示：i.用cubilin的同型匹配IgG对照抗体染色的B2细胞；ii用竞争性抑制剂RAP预处理并用罗丹明缀合的人血清白蛋白(HSA-罗丹明)脉冲处理15分钟(10μg/ml)的B2细胞；iii.用HSA-罗丹明脉冲处理15分钟(10μg/ml)(红色)并用抗-cUbilin抗体(绿色)标记的B2细胞；iv.(iii)的重叠图像，其显示出cubilin+细胞(绿色)与HSA-罗丹明(红色)吸收的共定位；v与(iii/iv)相同，但B4细胞显示出极少的cubilin+细胞(绿色)并且几乎无白蛋白吸收(红色)。在所有情况中，用烟酸己可碱(Hoechst)(蓝色)对细胞核复染。(b)检验各组分(B1-B4)中Epo的表达，其在大气(21％)或低(2％)氧张力下(均在37℃下)暴露24小时后产生。在亚组分B4中，能够响应氧张力的降低而上调Epo的Epo表达细胞的相对比例最大。注意B2和B4中Epo相对表达的一致性，结果在图1(i)中示出。
图76示出B2和B4的体内移植对尿毒症/贫血大鼠的存活率、体重和心脏重量的影响。(a)示出研究期间(肾切除后30周，治疗后6个月)各对照组和治疗组的存活率。在治疗组中，仅B2治疗的大鼠具有100％的存活率，等于健康对照组。(b)按下式分别计算每只大鼠随时间的体重变化百分比：((死亡时的重量)-(开始研究时的重量))/(开始研究时的重量)。相比肾切除对照动物的5％体重损失，B2治疗的动物的14.3％的体重增量视为极其显著(P值＜0.0001)。B4(P值＝0.0239)和载体(P值＝0.0125)也表现出显著高于肾切除动物的重量增量。(c)计算相对心脏重量占尸体剖检时体重的百分比。未治疗的肾切除大鼠在尸体剖检时具有显著增大的心脏(健康对照组的150％)。相比肾切除动物(P值＜0.0001)，治疗后六个月，B2仅表现出25％的相对心脏重量增量(图3c)。与肾切除对照组相比，B4(P值＝0.0002)和载体(P值＜0.0001)也具有统计意义上的显著性。
图77示出对滤过性和红细胞生成治疗效果的时间和统计评价。采用得自SAS Institute Inc(Cary，NC)的7.0版JMP对来自10至20周数据的血清化学结果进行单因素方差分析(ANOVA)。(a，b，c)观察到治疗组中的红细胞生成存在显著差异(HCT，p＝0.0005；RBC，p＝0.0029)，其中与未治疗的肾切除组、UNFX治疗组和rEPO治疗组相比，B2和B4治疗的大鼠显示最大的改善。(d，e，f)观察到治疗组中的滤过功能存在显著差异(sCREAT，p＜0.0001；BUN，p＜0.0001)，其中B2治疗的效果最为显著，其次为B4。
图78示出研究中期(12-14周)的临床评价结果。在研究中期(12-14周)采集血液，以进行临床化学分析，突出健康对照组和肾切除组之间或肾切除组相对于B2、B4或UNFX治疗组差异的参数在图(a)中示出。两种B2治疗特有的显著效果为(b)增强的蛋白质保留性，正如B2组相对于肾切除组在血清白蛋白(sALB)和白蛋白/球蛋白(A/G)比率方面的增加(p＜0.001)所证实，和(c)B2相对于肾切除组在血清甘油酸三酯和胆固醇方面的降低(p＜0.001)。
图79显示肾脏质量与肾功能相关。在尸体剖检时采集(右)肾重量。(a)B2治疗的肾中的单侧肾脏质量等于健康对照组。对在尸体剖检时收集的血清中的sCREAT的检验显示，肾脏质量和sCREAT之间存在明显的相反关系(图a，副轴)。(b)对所有所研究大鼠的肾脏质量和sCREAT的线性回归分析确定了肾重量和肾功能存在显著逆相关性(r2＝0.38；p值＜0.001)。
图80示出用SRY探针进行基于PCR的DNA分析。
图81示出对肾和骨髓的组织病理学分析。(a)假手术对照组和残肾(Masson Trichrome染色和PAS染色)的代表性光显微图。假手术组(对照组)的肾具有正常的实质结构，其通过界限清楚的皮质-髓质节和肾小管或肾小球无损伤来表征。肾切除未治疗的动物表现出由中度至显著的肾小管-间质纤维化和肾小球硬化组成的进行性肾小球肾小管变性(通过MassonTrichrome法染成蓝色)、具有管腔管型的肾小管扩张(PAS嗜伊红染色)和降低的骨髓细胞含量(骨髓细胞与红细胞比率)。相比肾切除动物，B2治疗的大鼠证明了治疗效果，其通过肾小管-间质纤维化和肾小球硬化的减轻、近乎正常的骨髓细胞含量和等于健康对照组的骨髓细胞与红细胞比率来表征。(b)H&E染色的骨髓充分证明了未治疗的肾切除大鼠中存在骨重吸收，显著的破骨细胞并形成骨质糜烂的陷窝。类似于健康对照组，B2治疗的大鼠的骨内膜表面平滑，无破骨细胞、陷窝或骨质糜烂的迹象。(c)终末血清磷(mg/dl)和钙(mg/dl，更正蛋白总量[Ca]-0.4[TP]+3.3)为模型中骨重吸收的组织学观察和经B2治疗的重吸收改善提供了全身支持。
图82a示出治疗后12周的存活率。
图82b示出治疗25周后的存活率。
图83a示出初始重量至死亡期间的总体重。
图83b示出在用递送体系中的细胞群治疗的啮齿动物中，初始重量至死亡期间的重量变化百分比。
图84示出所有治疗组在12周期间的血清肌酸酐水平。
图85示出B2和B4治疗组以及肾切除组、健康对照组和假手术肾切除组在12周期间的血清肌酸酐水平。
图86示出在所有时间点对血清肌酸酐进行的单因素ANOVA分析。
图87示出血液尿素氮(BUN)水平。
图88示出所有治疗组在12周间的HCT百分比。
图89示出B2和B4治疗组以及肾切除组、健康对照组和假手术肾切除组在12周期间的HCT百分比。
图90示出在所有时间点对HCT百分比进行的单因素ANOVA分析。
图91示出心脏重量占总体重的百分比。
图92示出研究终点时的总血清蛋白水平。
图93示出3个月时间点的组织学评价。
图94示出治疗后12周的存活率数据。
图95示出治疗前至治疗后12周间的重量变化百分比。
图96示出12周时的血清肌酸酐水平。
图97示出12周时的血清BUN水平。
图98示出相对于健康对照组表达的尿蛋白水平。
图99示出治疗后六周时的血清A/G比率。
图100示出12周时的HCT百分比。
图101示出12周时的RBC个数。
图102示出治疗后6周和12周时的平均全身血压。
图103示出3-5个月时间点时的组织学评价。
图104示出工作原型对血清肌酸酐水平的影响。
图105示出非工作原型对血清肌酸酐水平的影响。
图106示出B3和B2/B4对血清肌酸酐水平的影响。
图107示出B2、B2/B4和B2/B3对尿蛋白水平的影响。
图108示出B2/B4、B2/B3和B3/B4对血压的影响。
图109示出研究初期末期肌酸酐水平之间的差值。
图110示出研究初期与末期BUN水平之间的差值。
图111示出研究初期与末期ALB水平之间的差值。
图112示出研究初期与末期TPRO水平之间的差值。
图113示出研究初期PHOS水平与研究末期PHOS水平之间的差值。
图114示出研究初期末期更正总蛋白修的钙之间的差值。
图115示出犬科动物肾细胞生长。
图116示出猪肾细胞生长。
图117示出人肾细胞生长。
图118示出人活组织检查的细胞扩增结果。
图119示出细胞的免疫细胞化学结果。
图120示出流式细胞术的结果，证明大鼠培养物中所含的EPO表达细胞与近端和远端肾小管细胞(图120a、图120b)截然不同。经由荧光缀合的白蛋白的吸收评估培养物中cubilin阳性近端肾小管细胞的功能性，吸收的特异性通过添加竞争性抑制剂RAP来确定(图120c-f)。
图121示出每个月对对滤过功能的监测((a)示出sCREAT；(b)示出HCT；(c)示出比较临床化学结果)。
图122示出用于鉴定肾和骨髓中组织水平影响的组织学分析。
图123示出来自猪和人的CKD样本的组织病理学特征和非CKD肾样本的组织学特征组织比较。
图124示出源自CKD-和非CKD培养物之间的扩增能力(a)；通过观察一部分cubilin阳性细胞中受体介导的白蛋白吸收来确定建系培养物中的肾小管细胞功能(b-d)。
图125示出CKD组织样本(相对于非CKD组织样本)中的EPO mRNA表达(a)；这些样本的等电聚焦和蛋白质印迹分析确定了将基因表达模式一般在蛋白质水平上重复(b)；由CKD和非CKD肾样本构建的EPO表达细胞培养物响应低氧刺激，同时在刺激的24小时内对EPO基因转录进行可变上调(c)。
图126示出成年啮齿动物分级梯度的细胞带。
图127示出促红细胞生成素、nephrin、podocin、cubilin和Cyp在成年啮齿动物细胞制剂中的基因表达模式。
图128示出自患病成年啮齿动物肾脏分离的细胞制剂(5X)。
图129示出分离自患末期肾衰竭的成年大鼠的细胞中B4特异基因的表达。
图130示出幼年和成年B2细胞制剂中肌酸酐值的直接比较。
图131示出幼年和成年B2细胞制剂中血清BUN值的直接比较。
图132示出B2和B4细胞制剂中Has-2的表达。
图133示出HAS mRNA(qRTPCR，下图)和蛋白质(上图，蛋白质印记)的体内表达。
发明详述
本发明涉及分离的肾细胞(包括肾小管细胞群和生成促红细胞生成素(EPO)的肾细胞群)，及其分离和培养方法，以及用生物活性肾细胞(包括富集的肾小管和EPO生成细胞群)治疗有需要的受试者的方法。
定义
除非另有定义，本文所用技术和科学术语的与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。由R Lanza、R Langer和J Vacanti编著的Principles of Tissue Engineering第三版(2007)为本领域技术人员提供了本申请中所用许多术语的一般性指导。本领域的技术人员将认识到许多方法和材料与本文所述的方法和材料类似或等同，这些方法和材料可用于本发明的实施。实际上，本发明决不限于所述方法和材料。
如本文所用，术语“细胞群”是指通过从合适的组织源(通常从哺乳动物)直接分离得到的细胞数量。可随后对分离的细胞群进行体外培养。本领域的普通技术人员将意识到用于分离和培养与本发明一起使用的细胞群的各种方法以及适用于本发明的细胞群中的各种数量的细胞。细胞群可为源自肾的未分化、异质性细胞群。例如，异质性细胞群可从肾活检组织或全肾组织中分离。作为另外的选择，异质性细胞群可源自哺乳动物细胞的体外培养物，这些培养物由肾活检组织或全肾组织构建。也可将未分化的异质性细胞群称为非富集细胞群。
如本文所用，术语“混合物”是指两个或更多个分离的富集细胞群的组合，这些分离的富集细胞群源自未分化的异质性细胞群。根据某些实施方案，本发明的细胞群为肾细胞群。
“富集”细胞群或制剂是指源自原始肾细胞群(例如，未分化的异质性细胞群)的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的特定细胞类型。例如，原始肾细胞群可富集第一、第二、第三、第四、第五等目标细胞群。如本文所用，术语“细胞群”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换使用。
在一个方面，如本文所用，术语“富集”细胞群是指源自原始肾细胞群(例如，肾活检或培养的哺乳动物肾细胞的细胞悬液)的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的能够生成EPO的细胞。例如，术语“B4”为源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。本发明的细胞群可富集一种或多种细胞类型而缺乏一种或多种其它细胞类型。例如，相对于非富集细胞群(即富集细胞群源于此的原始细胞群)中的间质成纤维细胞和肾小管细胞而言，富集的EPO生成细胞群可富集间质成纤维细胞而缺乏肾小管细胞和集合管上皮细胞。在提及EPO-富集或“B4”细胞群的所有实施方案中，富集细胞群为异质性细胞群，其包含可以氧调节的方式生成EPO的细胞，正如内源EPO基因的氧可调EPO表达所证实。
在另一个方面，富集细胞群也可指上述源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞。例如，术语“B2”是指源自原始肾细胞群的细胞群，其相比原始细胞群包含较大比例的肾小管细胞。此外，富集表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)可包含一些来自集合管系统的上皮细胞细胞。尽管富集表达一种或多种肾小管细胞标记物的细胞的细胞群(或“B2”)相对缺乏EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，但与原始细胞群相比，富集群可包含较小比例的这些细胞(EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞)。通常，异质性细胞群缺乏一种或多种细胞类型，使得相对于缺乏前异质性细胞群中所含一种或多种细胞类型的比例而言，缺乏的细胞群含有较小比例的一种或多种细胞类型。可能缺乏的细胞类型为任何类型的肾细胞。例如，在某些实施方案中，可能缺乏的细胞类型包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其密度小于约1.045g/mL，称为“B1”。在某些其它实施方案中，可能缺乏的细胞类型包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞，其密度大于约1.095g/mL，称为“B5”。在一些实施方案中，富集肾小管细胞的细胞群相对缺乏下列所有细胞：“B1”、“B5”、氧可调EPO表达细胞、肾小球细胞和血管细胞。
如本文所用，术语“低氧”培养条件是指相对于将细胞在大气氧含量(约21％)下培养的标准培养条件而言，在培养体系中使细胞经受可用氧含量降低的培养条件。本文将非低氧条件称为正常或常氧培养条件。
如本文所用，术语“氧可调”是指细胞根据其中可用氧量调节(上调或下调)基因表达的能力。“低氧诱导”是指响应氧张力的降低而上调基因表达(无论是先期诱导还是初始氧张力)。
如本文所用，术语“生物材料”是指适于导入活组织的天然或合成的生物相容性材料。天然生物材料是由生命体系产生的材料。合成生物材料不是由生命体系产生的材料。本文所公开的生物材料可为天然和合成的生物相容性材料的组合。如本文所用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域的普通技术人员将意识到，一种或多种生物材料可被构建为多种形式(例如，构建为液体水凝胶悬浮液、多孔泡沫)，并且可包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。
如本文所用，术语“贫血”是指红细胞数量和/或血红蛋白水平不足，这是由受试者的EPO生成细胞生成的功能性EPO蛋白不足、和/或释放于体循环内的EPO蛋白不足、和/或骨髓中的成红血细胞无法响应EPO蛋白所导致。患有贫血的受试者不能维持红细胞稳态。通常，贫血可能伴随肾功能衰退或丧失(例如，慢性肾衰竭)，还包括与相对EPO缺乏相关的贫血、与充血性心力衰竭相关的贫血、与骨髓抑制性疗法如化学疗法或抗病毒疗法(如AZT)相关的贫血、与非骨髓癌相关的贫血、与病毒感染(如HIV)相关的贫血以及与慢性疾病如自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝病和多器官系统衰竭相关的贫血。
术语“EPO缺乏”是指可用促红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的任何病症或疾病，包括贫血。
如本文所用，术语“肾病”是指与任何阶段或程度的急性或慢性肾衰竭疾病相关的疾病，所述肾衰竭导致肾丧失执行血液滤过功能和从血液中排除多余的体液、电解质和废物的功能的能力。肾病还包括内分泌功能障碍，诸如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质不平衡(维生素D缺乏)。肾病可发生于肾脏中或可继发于多种病症，包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫疾病或肝病。
术语“治疗”是指治针对肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的治疗剂治疗和预防性或防治性措施，其中目的是逆转、预防或延缓(减轻)目标疾病。需要治疗的患者包括已患和易患或需预防肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的患者。术语如本文所用，“治疗”包括稳定和/或改善肾功能。
术语“构建体”是指沉积在支架或基质表面上或表面中的一个或多个细胞群，该支架或基质由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料制成。所述一个或多个细胞群可用生物材料包覆、沉积在其上、包埋于其中、附着到其上或截留于其中，该生物材料由一种一种或多种合成或天然存在的生物相容性聚合物、蛋白质或肽制成。所述一个或多个细胞群可与生物材料或支架或基质在体外或体内结合。通常，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料，以引导、促进或允许形成至少一个细胞群沉积在其上的多室三维结构。也可选择用于形成构建体的一种或多种生物材料，以引导、促进或允许构建体或构建体细胞组分的分散和/或其与内源性宿主组织的整合，或引导、促进或允许构建体或构建体细胞组分的存活、移植、耐受或功能性。
术语“受试者”应指任何单一的人受试者，包括需要治疗的患者，其正在患有或已患有肾病、贫血或EPO缺乏的一种或多种病征、症状或其它指征。此类受试者包括但不限于新近确诊的或以前已确诊且正在经历复发或再发，或具有患肾病、贫血或EPO缺乏风险的受试者(无论何种原因)。此前已针对受试者肾病、贫血或EPO缺乏对受试者进行了治疗或未如此进行治疗。
术语“患者”是指需要治疗的单个动物，更优选哺乳动物(包括非人动物，例如犬、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类)。最优选的是，本文中的患者为人。
术语“样本”或“患者样本”或“生物样本”通常应指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样本。该术语包括组织活检样本，诸如肾活检样本。该术语包括培养的细胞，诸如培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获取组织活检及培养细胞的方法是本领域所熟知的。如果术语“样本”单独使用，则其仍应意味着该“样本”是“生物样本”或“患者样本”，即，这些术语可互换使用。
术语“试样”是指得自经本发明方法治疗的受试者的样本。试样可源于哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘液、组织等。
术语“对照物”或“对照样本”是指阴性或阳性对照物，其中预期阴性或阳性结果有助于使试样的结果相关联。适于本发明的对照物包括但不限于已知表现出正常红细胞稳态指征的样本、已知表现出贫血指征的样本、得自已知未贫血受试者的样本和得自已知贫血受试者的样本。适用于本发明方法的其它对照物包括但不限于源自经已知可调节红细胞生成的药理学药剂(如重组EPO或EPO类似物)治疗的受试者的样本。此外，对照物可为得自经本发明方法治疗之前的受试者的样本。另外的合适对照物可为得自已知患有任何类型或阶段肾病的受试者的试样，和得自已知未患有任何类型或阶段肾病的受试者的样本。对照物可为正常健康的对比对照物。本领域的技术人员将意识到适用于本发明的其它对照物。
细胞群
本发明提供了用于治疗肾病，即，使肾功能稳定和/或改善和/或再生的分离的异质性肾细胞群及其混合物，所述肾细胞群和混合物富集特定的生物活性组分或细胞类型和/或缺乏特定的无活性或不需要的组分或细胞类型。生物活性细胞群
在一个方面，本发明基于意外的发现，即，富集生物活性组分而缺乏无活性或不需要的组分的异质性肾细胞群的某些亚组分提供了优于原始细胞群的治疗和再生效果。例如，本发明的缺乏无活性或不需要的组分的生物活性组分(例如B2、B4和B3)，例如B1和B5，可单独或在混合时使肾功能得到意想不到的稳定和/或改善和/或再生。在一个优选的实施方案中，生物活性细胞群为B2。在某些实施方案中，将B2细胞群与B4混合。在其它实施方案中，将B2细胞群与B3混合。
B2细胞群通过选自下列一种或多种的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白(megalin)、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)以及集合管标记物水通道蛋白-4(Aqp4)，其中B2细胞群比B3和/或B4具有更大和更多的颗粒细胞，因此其浮力密度介于约1.045g/mL和约1.063g/mL之间(啮齿动物)、介于约1.045g/mL和1.052g/mL之间(人)和介于约1.045g/mL和约1.058g/mL之间(犬科动物)。
B3细胞群通过用EPO生成细胞表达血管、肾小球和近端肾小管标记物来表征，与B2和B4相比，所述B3细胞群具有中等大小和中等粒度，因此其浮力密度介于约1.063g/mL和约1.073g/mL之间(啮齿动物)、介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间(人)和介于约1.058g/mL和约1.063g/mL之间(犬科动物)。B3可通过选自下列一种或多种的标记物的表达来表征：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节子2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白2(Cldn2)、napsinA天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(易化萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基辅酶合成酶介质链家族成员2(Acsm2)、谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1，6-二磷酸酶1(Fbp1)和丙氨酸乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)。B3还通过血管表达标记物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标记物podocin(Podn)来表征。
B4细胞群通过选自下列一种或多种的血管标记物的表达来表征：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a；包含下列一种或多种的肾小球标记物组：Podocin(Podn)和Nephrin(Neph)；和相对于未分化(UNFX)B2和B3的氧可调EPO富集群。B4还通过选自下列一种或多种的标记物的表达来表征：：趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素B型受体(Ednrb)、V型胶原α2(Col5a2)、钙黏着蛋白5(Cdh5)、组织纤溶酶原激活物(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、富含半胱氨酸的酸性分泌性蛋白(骨粘连蛋白)(Sparc)、丝甘蛋白(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制因子3(Timp3)、维耳姆斯瘤1(Wt1)、无翅型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号转导调节子4(Rgs4)、血小板-内皮细胞粘附分子(Pecam)和促红细胞生成素(Epo)。B4还通过比B2或B3更少、更小的颗粒细胞来表征，其浮力密度介于约1.073g/mL和约1.091g/ml之间(啮齿动物)、介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间(人和犬科动物)。
B2和B4生成的透明质酸
透明质素(hyaluronan)(也称为透明质酸或透明质酸盐)为糖胺聚糖(GAG)，其由非硫酸化二糖单元(具体为N-乙酰葡糖胺和葡萄糖醛酸)的规则重复序列组成。其分子量的范围可为400道尔顿(二糖)至一百万道尔顿以上。经发现，透明质酸以各种量存在于所有组织(诸如皮肤组织、软骨组织和眼组织)中，并存在于成年动物的大部分(如果不是所有)体液中。其尤其富含于早期胚胎中。由透明质素(实际上通常为GAG)形成的空间使其可在细胞迁移、细胞附着、伤口修复期间、器官形成、免疫细胞粘附、细胞内信号转导的激活以及肿瘤转移方面发挥作用。这些作用由结合至透明质素的特异蛋白和蛋白聚糖介导。细胞运动和免疫细胞粘附由细胞表面受体RHAMM介导(Receptor for Hyaluronan-Mediated Motility；Hardwick等，1992)和CD44(Jalkenan等，1987；Miyake等，1990)。透明质素直接在细胞表面的内膜处合成，在其合成过程中，生长的聚合物从膜中伸至细胞外部。合成由单一蛋白酶、透明质素合酶(HAS)介导，其中透明质素合酶的基因家族由至少3个成员组成。
近来已证实透明质酸可与CD44相互作用，并且此类相互作用(除了其它作用外)可为损伤肾组织补充非居留细胞(诸如间充质干细胞(MSC))并增强肾脏再生性(Kidney International(2007)72，430-441)。
意外地的是，已发现B2和B4细胞制剂均能够通过透明质酸合酶-2(HAS-2)-更特异地富集在B2细胞群中的标记物的作用在体外和体内表达较高分子量类型的透明质酸(HA)。经证实，在5/6Nx模型中用B2进行治疗可减轻纤维化，同时增强HAS-2的体内表达，并预期可在治疗过的组织内产生高分子量HA。值得注意的是，未经治疗的5/6Nx模型产生纤维化，同时检测到有限的HAS-2且产生极少的高分子量HA。不希望受理论束缚，假定主要由B2(在一定程度上由B4)产生的这种高分子量类型的抗炎HA与细胞制剂协同作用，以减轻肾脏纤维化并辅助肾脏再生。因此，本发明包括在包含透明质酸的生物材料中递送本发明的细胞原型。本发明还构思了通过直接生成或经植入细胞刺激生成来提供再生刺激的生物材料组分。
在一个方面，本发明提供了分离的异质性EPO生成肾细胞群，其用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，细胞群源自肾活检。在另一个实施方案中，细胞群源自全肾组织。在另一个实施方案中，细胞群源自哺乳动物细胞的体外培养物，这些培养物由肾活检组织或全肾组织构建。在所有实施方案中，这些细胞群为未分化的细胞群，在本文中也称为非富集细胞群。
在另一个方面，本发明提供了分离的促红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群，其进一步富集，使得富集亚群相对于原始或初始细胞群而言包含较大比例的EPO生成细胞。在一个实施方案中，相对于未富集的初始细胞群而言，富集的EPO生成细胞组分包含较大比例的间质成纤维细胞和较小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，相对于未富集的初始细胞群而言，富集的EPO生成细胞组分包含较大比例的肾小球细胞和血管细胞以及较小比例的集合管细胞。在此类实施方案中，这些细胞群在本文中称为“B4”细胞群。
在另一个方面，本发明提供了与一种或多种附加肾细胞群混合的EPO生成肾细胞群。在一个实施方案中，EPO生成细胞群为富集EPO生成细胞的第一细胞群，例如，B4。在另一个实施方案中，EPO生成细胞群为未富集EPO生成细胞的第一细胞群，例如，B2。在另一个实施方案中，第一细胞群与第二肾细胞群混合。在一些实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞，这可通过肾小管细胞表型的存在来证实。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可通过一种肾小管细胞标记物的存在来指示。在另一个实施方案中，肾小管细胞表型可通过一种或多种肾小管细胞标记物的存在来指示。肾小管细胞标记物包括但不限于巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在另一个实施方案中，第一细胞群与若干种肾细胞中的至少一种混合，所述肾细胞包括但不限于源自间质的细胞、肾小管细胞、源自集合管的细胞、源自肾小球的细胞和/或源自血液或脉管系统的细胞。
在一个方面，本发明的EPO生成肾细胞群通过EPO表达和对氧的生物应答来表征，使得培养体系中氧张力的降低而诱导EPO的表达。在一个实施方案中，EPO生成细胞群富集EPO生成细胞。在一个实施方案中，相对于在正常大气(～21％)含量的可用氧下培养的细胞群而言，当细胞群在培养体系中使细胞经受可用氧含量降低的条件下进行培养时，EPO表达得以诱导。在一个实施方案中，低氧条件下培养的EPO生成细胞的EPO表达水平比常氧条件培养的EPO生成细胞相对更高。通常，相比将细胞在正常大气含量的可用氧(也称为正常或常氧培养条件)下培养时，将细胞在低含量的可用氧(也称为低氧培养条件)下进行培养意味着低氧含量相对降低。在一个实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于1％的氧、约小于2％的氧、约小于3％的氧、约小于4％的氧或约小于5％的氧下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或常氧培养条件包括在约10％的氧、约12％的氧、约13％的氧、约14％的氧、约15％的氧、约16％的氧、约17％的氧、约18％的氧、约19％的氧、约20％的氧或约21％的氧下培养细胞。
在另一个实施方案中，通过将细胞在约小于5％的可用氧下培养，并且将EPO表达水平与在大气(约21％)氧下培养的细胞进行比较时，可获得EPO表达的诱导或增加。在另一个实施方案中，通过下述方法在能够表达EPO的细胞培养物中获得EPO的诱导，所述方法包括第一培养阶段，其中细胞培养物在大气氧(约21％)下培养一段时间；和第二培养阶段，其中可用氧含量降低并且在约小于5％的可用氧下培养相同的细胞。在另一个实施方案中，响应低氧条件的EPO表达通过HIF1α调节。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它氧操纵培养条件也可用于本文所述的细胞。
在一个方面，EPO生成哺乳动物细胞的富集群通过对灌流条件的生物应答(例如EPO表达)来表征。在一个实施方案中，灌流条件包括短暂、间歇或连续的流体流(灌流)。在一个实施方案中，当以使得动力经由流动传递至细胞的方式对培养细胞的培养基进行间歇或连续的循环或搅拌时，可机械诱导EPO表达。在一个实施方案中，将经受短暂、间歇或连续流体流的细胞以使其在材料中或之上呈三维结构的方式进行培养，所述材料提供用于形成此类三维结构的骨架和/或空间。在一个实施方案中，将细胞在多孔珠上培养，并借助于平台摇晃式摇床、轨道式平台或旋转瓶使其经受间歇或连续流体流。在另一个实施方案中，将细胞在三维支架上培养并置于装置中，通过所述装置使支架固定并且使流体定向地流经或穿过支架。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它灌流培养条件也可用于本文所述的细胞。
无活性细胞群
如本文所描述，本发明部分基于意外的发现，即，富集生物活性组分而缺乏无活性或不需要的组分的异质性肾细胞群的某些亚组分提供了优于原始细胞群的治疗和再生效果。在优选的实施方案中，本发明的细胞群缺乏B1和/或B5细胞群。
B1细胞群包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，其中细胞群中细胞的浮力密度小于约1.045g/m。B5细胞群由低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞构成，其浮力密度大于约1.091g/mL。
分离和培养细胞群的方法
在一个方面，本发明提供了用于离析和分离肾细胞组分(例如，富集细胞群)的方法，所述肾细胞组分用于治疗用途，包括治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷和肾小球滤过缺陷。在一个实施方案中，将细胞群与新鲜消化的(即，机械或酶消化的)肾组织分离或与哺乳动物肾细胞的异质性体外培养物分离。
意外地发现，将肾细胞的异质性混合物在密度梯度上分离之前在低氧培养条件进行培养可使得B4和B2组分中的细胞分布和组成得以改善。在从患病或非患病肾分离的肾细胞中，观察到氧依赖性细胞从B2至B4的富集。不希望受理论束缚，这可归因于下列现象中的一种或多种：1)特定细胞组分在低氧培养期间的选择性存活、死亡或增殖；2)细胞颗粒度和/或大小为响应低氧培养而变化，从而导致密度梯度分离过程中浮力密度和随后的定位发生变化；和3)细胞基因/蛋白质表达响应低氧培养期而变化，从而导致任何给定的梯度组分中的细胞存在差异特征。因此，在一个实施方案中，富集肾小管细胞的细胞群(例如，B2)具有抗低氧性。
用于离析和分离本发明细胞群的示例性技术包括基于目标群中所含不同细胞类型的比重差而进行的密度梯度分离。任何给定细胞类型的比重可受细胞内的颗粒度、细胞内水的体积和其它因素影响。在一个方面，本发明提供给了用于分离本发明细胞制剂(如，B2和B4)的最佳梯度条件，这些细胞制剂遍及多个物种，包括但不限于人、犬科动物和啮齿动物。在一个优选的实施方案中，密度梯度用于获得肾小管细胞组分的新富集群，即，B2细胞群，其源自异质性肾细胞群。在一个实施方案中，密度梯度用于获得EPO生成细胞组分的新富集群，即，B4细胞群，其源自异质性肾细胞群。在其它实施方案中，密度梯度用于获得肾小管细胞、肾小球细胞和肾内皮细胞的富集亚群。在一个实施方案中，将EPO生成细胞和肾小管细胞与红细胞和细胞碎片分离。在一个实施方案中，将EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞与其它细胞类型分离，并且与红细胞和细胞碎片分离，而将肾小管细胞和集合管细胞亚群同时与其它细胞类型分离，并且与红细胞和细胞碎片分离。
基于下述某些关键特征，本发明通过部分采用包含60％非离子碘化化合物碘克沙醇水溶液的
Figure BDA0000073731760000401
(Axis-Shield)密度梯度介质来产生新细胞群。然而，本领域的技术人员将认识到，包括用于分离本发明细胞群的必要特征的任何密度梯度或本领域中已知的其它方式(例如使用细胞表面标记物的免疫分离)均可根据本发明进行使用。本领域的技术人员也将认识到，可利用有助于经由密度梯度分离细胞亚群的相同细胞特征(大小和颗粒度)来通过流式细胞术分离细胞亚群(前向散射＝流式细胞术对大小的反映，并且侧向散射＝对颗粒度的反映)。重要的是，密度梯度介质应对特定的目标细胞具有低毒性。虽然密度梯度介质应对特定的目标细胞具有低毒性，但本发明也构思了使用在目标细胞选择过程中发挥作用的梯度介质。不希望受理论束缚，通过包含碘克沙醇的梯度回收的本发明细胞群似乎具有碘克沙醇耐受性，因为在加载和回收步骤之间存在相当的细胞损失，这表明在梯度条件下暴露于碘克沙醇会导致某些细胞的消除。经碘克沙醇梯度后出现在特定条带中的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度暴露的不利影响具有耐受性。因此，本发明还构思了在本发明细胞群的分离和/或选择中使用对中度肾毒素温和的附加对比介质。此外，密度梯度介质也不应与人血浆中的蛋白质结合或不利地影响目标细胞的关键功能。
在另一个方面，本发明提供了对肾细胞群进行三维培养的方法。在一个方面，本发明提供了经由连续灌流培养细胞群的方法。在一个实施方案中，相比静态培养的细胞群而言，经由三维培养和连续灌流培养的细胞群显示出较高的细胞含量和互联性。在另一个实施方案中，经由三维培养和连续灌流培养的细胞群相比此类此类细胞群的静态培养物而言，显示出较多的EPO表达以及增强的肾小管相关基因(如上皮钙黏着蛋白)表达。
在另一个实施方案中，相比静态培养的细胞群而言，经由连续灌流培养的细胞群显示出较高的葡萄糖水平和谷氨酰胺消耗。
本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它分离和培养方法也可用于本文所述的细胞。
生物材料(聚合物基质或支架)
如已公布的Bertram等的美国专利申请20070276507(其全文以引用方式并入本文)所述，可将聚合物基质或支架成形为任意数量的所需构型，以满足任意数量的整个系统、几何形状或空间限制。在一个实施方案中，本发明的基质或支架可为三维的，并且可成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的过程中，可使用三维(3-D)基质。可使用多种不同形状的3-D支架。当然，聚合物基质可成形为不同的尺寸和形状，以符合不同体型的患者。聚合物基质也可以其它方式成形以满足患者的特殊要求。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可为生物相容性的多孔聚合物支架。支架可由多种合成的或天然存在的材料形成，这些材料包括但不限于开孔聚乳酸
Figure BDA0000073731760000421
纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚醛、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚亚胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚恶二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、多硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、丝蛋白、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或它们的共聚物或物理共混物。支架构型的范围可为液体水凝胶悬浮液到柔性多孔支架至刚性保形多孔支架。
水凝胶可由多种聚合物材料形成并可用于多种生物医学应用中。水凝胶可在外形上描述为亲水性聚合物的三维网络。根据水凝胶的类型，其含有多种百分比的水，但整体不溶于水。虽然其具有高含水量，但由于存在亲水残基，水凝胶能够另外结合大量液体。水凝胶大范围溶胀而未改变其凝胶状结构。可根据所用聚合物的性质和附加的产品专用设备对水凝胶的基本物理特征进行具体的改进。
优选地，水凝胶可由聚合物、生物衍生材料、合成衍生材料或其组合制成，其具有生物惰性并与哺乳动物组织在生理上相容。水凝胶材料优选地不包括炎症应答。可用于形成水凝胶的其它材料的实例包括：(a)改性的藻酸盐；(b)多糖(例如，结冷胶和角叉菜胶)，其通过接触一价阳离子而胶凝；(c)多糖(例如透明质酸)，其为极粘滞的液体或通过结构的缓慢演变而随时间触变并形成凝胶；和(d)聚合物水凝胶前体(例如，聚氧乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利No.6,224,893B1对适于制备根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的性质做了详细的描述。
支架或生物材料特性能够使细胞附着到支架或生物材料上并与其相互作用，和/或可提供截留细胞的多孔空间。在一个实施方案中，本发明的多孔支架或生物材料允许将一种或多种细胞群或细胞混合物添加或沉积到被构建为多孔支架的生物材料上(例如，通过附着细胞)和/或支架孔内(例如，通过截留细胞)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内细胞：细胞和/或细胞：生物材料的相互作用，以形成本文所述的构建体。
在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)构成，其还包含大小范围在5.1kDA至大于2×106kDA的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由呈多孔泡沫形式的透明质酸(HA)构成，其还包含大小范围在5.1kDA至大于2×106kDA的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由聚乳酸(PLA)基泡沫构成，其具有开孔结构和约50微米至约300微米的孔径。在另一个实施方案中，特定的细胞群(优选B2和B4)尤其可在肾内植入后通过透明质酸合酶-2(HAS-2)直接合成和/或刺激合成高分子量透明质酸。
本领域的普通技术人员将意识到，可使用本领域中已知的其它类型合成或天然存在的材料以形成本文所述的支架。
在一个方面，本发明提供了由上述支架或生物材料制成的本文所述的构建体。
构建体
在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的可植入构建体，其具有本文所述的一种或多种细胞群。在一个实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质、以及通过附着和/或截留沉积在支架表面上或包埋于其中的一种或多种本文所述的细胞群或细胞混合物构成。在某些实施方案中，构建体由生物材料和本文所述的一种或多种细胞群或细胞混合物构成，所述细胞群或细胞混合物用一种或多种生物材料组分包覆、沉积在其上、与其附着、截留于其中、包埋于其中和/或与其结合。在另一个实施方案中，构建体的沉积细胞群或细胞组分为富集氧可调EPO生成细胞的第一肾细胞群。在另一个实施方案中，除了氧可调EPO生成细胞外，第一细胞群还包含肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，构建体的沉积细胞群或一种或多种细胞组分包括第一富集肾细胞群和第二肾细胞群。在一些实施方案中，第二细胞群未富集氧可调EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群富集肾小管细胞并包含集合管上皮细胞。在其它实施方案中，肾小管细胞可通过一种或多种肾小管细胞标记物的表达来表征，所述肾小管细胞标记物可包括但不限于：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与其结合以形成本发明构建体的细胞群源自多种来源，诸如自体、同种异体、或同系(自体或同基因)来源。
本领域的普通技术人员将意识到，存在若干种适用于沉积细胞群或将其以其它方式与生物材料结合以形成构建体的方法。
在一个方面，本发明的构建体适用于本文所述的方法。在一个实施方案中，构建体适于对有需要治疗任何病源的肾病、贫血或任何病源的EPO缺乏的受试者进行施用。在其它实施方案中，构建体适于对有需要改善或恢复红细胞稳态的受试者进行施用。在另一个实施方案中，构建体适于对有需要改善肾功能的受试者进行施用。
使用方法
在一个方面，本发明提供了用本文所述的肾细胞群和肾细胞混合物治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的方法。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用包括富集EPO生成细胞的第一肾细胞群的组合物。在另一个实施方案中，第一细胞群富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在另一个实施方案中，组合物还可包括一种或多种附加的肾细胞群。在一个实施方案中，附加的细胞群是未富集EPO生成细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，附加的细胞群是未富集EPO生成细胞、肾小球细胞或血管细胞的第二细胞群。在另一个实施方案中，组合物还包括沉积于生物材料中、沉积在其上、包埋于其中、用其包覆或截留于其中以形成本文所描述的可植入构建体的肾细胞群或肾细胞混合物，其用于治疗本文所述的疾病或病症。在一个实施方案中，将细胞群单独使用或与其它细胞或生物材料(例如水凝胶、多孔支架或天然或合成肽或蛋白质)联合使用，以刺激急性或慢性病情恢复。
在另一个方面，通过本发明方法对受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的有效治疗可通过红细胞生成和/或肾功能各种指标进行观察。在一个实施方案中，红细胞稳态的指标包括但不限于血细胞比容(HCT)、血红蛋白(HB)、红细胞平均血红蛋白(MCH)、红细胞计数(RBC)、网织红细胞数量、网织红细胞百分比、平均红细胞容积(MCV)和红细胞分布宽度(RDW)。在另一个实施方案中，肾功能指标包括但不限于血清白蛋白、白蛋白与球蛋白的比率(A/G比率)、血清磷、血清钠、肾大小(可通过超声测量)、血清钙、磷∶钙比率、血清钾、尿蛋白、尿液肌酸酐、血清肌酸酐、血液尿素氮(BUN)、胆固醇水平、三酸甘油酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，一般健康和健康的若干指标包括但不限于重量增量或重量损失、存活率、血压(平均全身血压、心脏舒张压或心脏收缩压)和体能耐力表现。
在另一个实施方案中，有效治疗通过一个或多个肾功能指标的稳定来证实。通过对经本发明方法治疗的同一受试者的相同指标的变化(相对于未经本发明方法治疗的受试者的指标而言)进行观察来证实肾功能的稳定。可选地，可通过对经本发明方法治疗的同一受试者的相同指标的变化(相对于治疗前的受试者的指标而言)进行观察来证实肾功能的稳定。第一指标的变化可为值的增加或降低。在一个实施方案中，通过本发明提供的治疗可包括使受试者的血液尿素氮(BUN)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的BUN水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较低。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的血清肌酸酐水平稳定，其中在该受试者体内观察到的血清肌酸酐水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较低。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的血细胞比容(HCT)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的HCT水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较高。在另一个实施方案中，治疗可包括使受试者的红细胞(RBC)水平稳定，其中在该受试者体内观察到的RBC水平与病情相同但未经本发明方法治疗的受试者相比时相对较高。本领域的普通技术人员将意识到，可测量本文所述或本领域中已知的一个或多个附加指标来确定对受试者肾病的有效治疗。
在另一个方面，本发明涉及为有需要的受试者提供红细胞稳态的方法。在一个实施方案中，该方法包括下列步骤：(a)对受试者施用肾细胞群，例如B2或B4或肾细胞混合物，如B2/B4和/或B2/B3，如本文所述；和(b)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(a)，或(ii)指示受试者的红细胞稳态。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：(a)对受试者施用组合物，其包括本文所述的肾细胞群或肾细胞混合物；和(b)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(s)，或(ii)指示受试者的红细胞稳态。在另一个实施方案中，该方法包括下列步骤：(a)提供生物材料或生物相容性聚合物支架；(b)以本文所述的方式将本发明的肾细胞群或肾细胞混合物沉积在生物材料或支架上或沉积在其中，以形成可植入构建体；(c)向受试者植入构建体；和(d)确定来自受试者的生物样本的红细胞生成指标水平与对照的指标水平不同，其中指标水平的差值(i)指示受试者响应施用步骤(a)，或(ii)指示受试者的红细胞稳态。
在另一个方面，本发明涉及使有需要的受试者的肾功能稳定并使红细胞稳态恢复的方法，所述受试者患有肾功能缺陷和贫血和/或EPO缺乏。在一个实施方案中，该方法包括施用本文所述的肾细胞群或肾细胞混合物的步骤，所述肾细胞群或肾细胞混合物包含下列细胞类型中的至少一种：源自肾小管的细胞、源自肾小球的细胞、源自间质的细胞、源自集合管的细胞、源自间质组织的细胞或源自脉管系统的细胞。在另一个实施方案中，细胞群或混合物包含EPO生成细胞和肾小管上皮细胞，所述肾小管细胞通过下列标记物中的至少一种来鉴定：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。在此实施方案中，相对于未经治疗或治疗前的受试者的指标水平而言，对受试者的治疗可通过至少一个肾功能指标的改善以及伴随的至少一个红细胞生成指标的改善来证实。
在一个方面，本发明提供了通过施用本文所述的富集EPO生成细胞的肾细胞群或包含富集EPO生成细胞的细胞群的肾细胞混合物来(i)治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能；(iii)恢复红细胞稳态或(iv)其中任何组合的方法，其中施用的有益效果优于施用未富集EPO生成细胞的细胞群的效果。在另一个实施方案中，富集细胞群使血清血液尿素氮(BUN)水平得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群使血清中蛋白质的保留得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群提供了血清胆固醇和/或三酸甘油酯水平。在另一个实施方案中，富集细胞群使维生素D水平得以改善。在一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使磷：钙比率得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血红蛋白水平得以改善。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血清肌酸酐水平得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血细胞比容水平得以改善。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使红细胞数量(RBC#)水平得以改善。在一个实施方案中，改善的血细胞比容恢复至正常健康水平的95％。在另一实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使网织红细胞数量得以改善。在其它实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使网织红细胞比例得以改善。在其它实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使红细胞容积分布宽度(RDW)水平得以改善。在另一个实施方案中，相对于非富集细胞群而言，富集细胞群使血红蛋白水平得以改善。在另一个实施方案中，富集细胞群使骨髓中具有红细胞生成应答，使得骨髓细胞含量接近正常并且使得骨髓细胞与红细胞比率接近正常。
在另一个方面，本发明提供了通过施用富集细胞群来(i)治疗肾病、贫血或EPO缺乏；(ii)稳定肾功能；(iii)恢复红细胞稳态或(iv)其任何组合的方法，其中相对于施用重组EPO(rEPO)所提供的有益效果而言，施用本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的有益效果通过改善的红细胞稳态来表征。在一个实施方案中，相比施用重组EPO蛋白质而言，细胞群或混合物在施用至有需要的受试者时使红细胞稳态得以改善(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#确定)。在一个实施方案中，相比重组EPO而言，细胞群或混合物在施用时使血细胞比容、RBC或血红蛋白的水平得以改善，其不大于对照组中血细胞比容的约10％左右。在另一实施方案中，单次剂量或单次递送的细胞群或混合物在施用时使经治疗的受试者的红细胞稳态在一段时间内得以改善(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#的增加来确定)，其中改善时间显著超过单次剂量或单次递送的重组EPO蛋白质使红细胞稳态得以改善的时间。在另一个实施方案中，细胞群或混合物在以本文所述的剂量施用时未导致血细胞比容、血红蛋白或RBC#大于对比的健康对照组中正常水平的约110％。在另一实施方案中，相比以本文所述的剂量递送的重组EPO蛋白质而言，细胞群或混合物在以本文所述的剂量施用时提供了较好的红细胞稳态(通过血细胞比容、血红蛋白或RBC#来确定)。在另一个实施方案中，以约100IU/kg、约200IU/kg、约300IU/kg、约400IU/kg或约500IU/kg的剂量递送重组EPO。本领域的普通技术人员将意识到，本领域中已知的其它剂量的重组EPO也是适用的。
本发明的另一个实施方案涉及本文所述的至少一种细胞群或本文所述的可植入构建体在制备药物方面的用途，所述药物可用于治疗有需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏，为有需要的受试者提供红细胞稳态，或使有需要的受试者的肾功能得以改善。
本发明的另一个实施方案涉及一种或多种特定富集细胞群(本文所述)治疗特定病源的肾病的用途，这基于根据已证实的特定治疗特性对一种或多种特定细胞亚群进行的选择。
施用方法和途径
本发明的细胞制剂可单独施用或可与其它生物活性组分组合施用。
本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物的治疗有效量的范围可为从受试者可安全接受的最大细胞数量到治疗肾病(例如，使一种或多种肾功能稳定、降低其衰退率或使其改善)所必需的最小的细胞数量。在某些实施方案中，本发明的方法提供了以下列剂量对本文所述的肾细胞群或肾细胞群混合物进行施用：约10,000个细胞/千克、约20,000个细胞/千克、约30,000个细胞/千克、约40,000个细胞/千克、约50,000个细胞/千克、约100,000个细胞/千克、约200,000个细胞/千克、约300,000个细胞/千克、约400,000个细胞/千克、约500,000个细胞/千克、约600,000个细胞/千克、约700,000个细胞/千克、约800,000个细胞/千克、约900,000个细胞/千克、约1.1×106个细胞/千克、约1.2×106个细胞/千克、约1.3×106个细胞/千克、约1.4×106个细胞/千克、约1.5×106个细胞/千克、约1.6×106个细胞/千克、约1.7×106个细胞/千克、约1.8×106个细胞/千克、约1.9×106个细胞/千克、约2.1×106个细胞/千克、约2.1×106个细胞/千克、约1.2×106个细胞/千克、约2.3×106个细胞/千克、约2.4×106个细胞/千克、约2.5×106个细胞/千克、约2.6×106个细胞/千克、约2.7×106个细胞/千克、约2.8×106个细胞/千克、约2.9×106个细胞/千克、约3×106个细胞/千克、约3.1×106个细胞/千克、约3.2×106个细胞/千克、约3.3×106个细胞/千克、约3.4×106个细胞/千克、约3.5×106个细胞/千克、约3.6×106个细胞/千克、约3.7×106个细胞/千克、约3.8×106个细胞/千克、约3.9×106个细胞/千克、约4×106个细胞/千克、约4.1×106个细胞/千克、约4.2×106个细胞/千克、约4.3×106个细胞/千克、约4.4×106个细胞/千克、约4.5×106个细胞/千克、约4.6×106个细胞/千克、约4.7×106个细胞/千克、约4.8×106个细胞/千克、约4.9×106个细胞/千克或约5×106个细胞/千克。在另一个实施方案中，对受试者施用的细胞剂量可为单剂量或单剂量加附加剂量。在其它实施方案中，剂量可经由本文所述的构建体提供。在其它实施方案中，对受试者施用的细胞剂量可根据估计的肾脏质量或功能性肾脏质量来计算。
治疗有效量的本文所述的肾细胞群或其混合物可悬浮于药学上可接受的载体或赋形剂。此类载体包括但不限于基础培养基加1％血清白蛋白、盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、胶原、藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白胶、聚乙二醇、聚乙烯醇、羧甲基纤维素以及它们的组合。制剂应适合施用方式。因此，本发明提供了肾细胞群或其混合物(例如，单独的B2细胞群或其与B3和/或B4细胞群的混合物)在制备治疗受试者肾病的药物方面的用途。在一些实施方案中，药物还包含重组多肽，诸如生长因子、趋化因子或细胞因子。在其它实施方案中，药物包含源自人肾的细胞群。可采用提供给本文所述方法的任何变型形式来分离、衍生或富集用于制备所述药物的细胞。
按照常规步骤将一种或多种肾细胞制剂或其混合物或组合物配制为适于对人类施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用、动脉内施用或肾包膜内施用的组合物例如为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包括局部麻醉剂以缓解注射部位的任何疼痛。一般而言，将成分单独或混合在一起以单位剂型提供，例如提供为密闭容器(如指示活性剂量的安瓿瓶)中的冷藏保存浓缩物。当组合物通过输注施用时，其可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿无菌注射用水或盐水，以使得所述成分可在施用前混合。
药学上可接受的载体部分由要施用的具体组合物以及用于施用组合物的具体方法决定。因此，存在多种合适的药物组合物制剂(参见例如AlfonsoR Gennaro(编著)，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，以前为Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins，2003，其全文以引用方式并入本文)。一般将药物组合物配制为无菌的、基本上等渗的，且与美国食品与药物管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)的规定完全相符。
本发明的一个方面还提供了一种药物制剂，其包含本发明的肾细胞制剂，，例如单独的B2细胞制剂或其与B3和/或B4细胞制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，该制剂包含104至109个哺乳动物肾源细胞。
在一个方面，本发明提供了对有需要的受试者提供本文所述的一种或多种细胞群，包括混合物。在一个实施方案中，一种或多种细胞群的来源可为自体的或同种异体的、同系的(自体的或同基因的)及其任何组合。在来源并非自体来源的情况下，所述方法可包括施用免疫抑制剂。合适的免疫抑制药物包括但不限于硫唑嘌呤、环磷酰胺、咪唑立宾(mizoribine)、环孢素、他克莫司(tacrolimus)水合物、苯丁酸氮芥、氯苯扎利二钠、金诺芬(auranofin)、前列地尔(alprostadil)、盐酸胍立莫司(gusperimus hydrochloride)、biosynsorb、莫罗莫那(muromonab)、阿法赛特(alefacept)、喷司他丁、达利珠单抗(daclizumab)、西罗莫司(sirolimus)、霉酚酸酯、来氟米特(leflonomide)、巴利昔单抗(basiliximab)、链道酶α、bindarid、克拉屈滨(cladribine)、吡美莫司(pimecrolimus)、伊洛白介素(ilodecakin)、西利珠单抗(cedelizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、依维莫司(everolimus)、阿尼莫司(anisperimus)、加维莫单抗(gavilimomab)、法拉莫单抗(faralimomab)、氯法拉滨(clofarabine)、雷帕霉素(rapamycin)、希普利珠单抗(siplizumab)、saireito、LDP-03、CD4、SR-43551、SK&F-106615、IDEC-114、IDEC-131、FTY-720、TSK-204、LF-080299、A-86281、A-802715、GVH-313、HMR-1279、ZD-7349、IPL-423323、CBP-1011、MT-1345、CNI-1493、CBP-2011、J-695、LJP-920、L-732531、ABX-RB2、AP-1903、IDPS、BMS-205820、BMS-224818、CTLA4-1g、ER-49890、ER-38925、ISAtx-247、RDP-58、PNU-156804、LJP-1082、TMC-95A、TV-4710、PTR-262-MG和AGI-1096(参见美国专利No.7,563,822)。本领域的普通技术人员将意识到其它合适的免疫抑制药物。
本发明的治疗方法涉及向个体递送分离的肾细胞群或其混合物。在一个实施方案中，优选将细胞直接递送至目标受益部位。在一个实施方案中，本发明的细胞制剂或其混合物经由递送载体递送至个体。
依据本说明书，对患者施用细胞的多种方法对本领域的技术人员是显而易见的。此类方法包括将细胞注射到受试者的靶部位内。可将细胞插入递送装置或载体中，该递送装置或载体有利于通过向受试者体内注射或植入来导入。在某些实施方案中，递送载体可包括天然材料。在某些其它实施方案中，递送载体可包括合成材料。在一个实施方案中，递送载体提供一定的结构来模拟或适当地符合器官结构。在其它实施方案中，递送载体具有类似流体的性质。此类递送装置可包括用于将细胞或流体注射到受体受试者体内的管，例如导管。在一个优选的实施方案中，所述管另外具有针头，例如注射器，通过其可将本发明的细胞导入到患者的预期位置。在一些实施方案中，配制哺乳动物肾源细胞群用于经由导管施用到血管中(其中术语“导管”意在包括多种用于将物质递送至血管的管样系统中的任一种)。作为另外的选择，可将细胞插入生物材料或支架中或插在其上，所述生物材料或支架包括但不限于纺织物，如梭织、针织、编织、筛，和非纺织物、有孔膜、海绵和泡沫，以及珠，例如实体或多孔珠、微粒、纳米颗粒等。可将细胞制备为以多种不同形式递送。例如，细胞可悬浮在溶液或凝胶中。可将细胞与药学上可接受的载体或稀释剂混合，其中本发明的细胞在所述载体或稀释剂中保持存活。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的用途是本领域中所熟知的。溶液优选是无菌的且为液体，并且通常是等渗的。优选地，溶液在生产和储存条件下是稳定的，并通过使用例如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等防腐，以对抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。本领域的技术人员将意识到，用于递送本发明的细胞群及其混合物的递送载体可包括上述特性的组合。
一种或多种分离的肾细胞群(例如，单独的B2细胞群或其与B4和/或B3的混合物)的施用方式包括但不限于全身性、肾脏内(例如实质)、静脉内或动脉内注射和直接注射到组织中的预期作用部位。可根据本发明使用的另外的施用方式包括通过直接剖腹手术、直接腹腔镜检查、经腹或经皮进行的一次或多次注射。可根据本发明使用的另外的施用方式包括例如逆行输注和输尿管肾盂输注。施用的外壳手术方法包括一步手术，例如但不限于部分肾切除术和构建体移植、部分肾切除术、部分肾盂切除术、带网膜±腹膜的血管化、多灶性活检针迹、圆锥或锥体、至圆柱体和肾极状替换，以及两步手术，包括例如用于移植的类器官内部生物反应器。在一个实施方案中，将细胞混合物在同一时间经由相同途径进行递送。在另一个实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法，将包含控释混合物的每种细胞组合物分别递送至特定位置，或经由特定方法将其同时或以时序可控的方式进行递送。
人的适宜细胞植入剂量可由涉及细胞活性(例如EPO生成)的现有信息来确定，或根据临床前研究所进行的剂量研究来推测。由体外培养和体内动物实验可对细胞量进行定量，并用该量计算植入材料的适宜剂量。此外，可监测患者以确定是否可进行额外的植入，或相应减少植入材料。
可向本发明的细胞群及其混合物中添加一种或多种其它组分，包括选定的细胞外基质组分，诸如本领域中已知的一种或多种类型的胶原或透明质酸和/或生长因子、富含小板块的血浆和药物。
本说明书所引用的所有专利、专利申请和参考文献的全文均在此以引用的方式并入。
以下提供的实施例仅为示例性目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1-来自患肾衰竭成年猪的生物应答肾细胞的分离和特征
患有伴随贫血的特发进行性慢性肾病(CKD)的成年公猪(野猪)提供了新鲜的患病肾组织，以通过与年龄相一致的正常猪肾组织的直接比较来评价细胞组成和特征。
收集时的肾组织的组织学检查证实，由重度弥漫性慢性间质纤维化和伴随多灶性纤维化的新月体性肾小球肾炎表征的肾病。临床化学证实了氮血症(血液尿素氮和血清肌酸酐升高)和轻度贫血(血细胞比容轻度降低且血红蛋白水平降低)。将细胞从患病和正常肾组织中分离、扩增并表征。
图1示出突出患病肾组织相比正常肾组织的纤维化的Gomori Trichrome染色(箭头指示的蓝染色)。表达cubulin：巨蛋白并且能够转运受体介导的白蛋白的功能性肾小管细胞从患病和正常肾组织中增殖。促红细胞生成素(EPO)表达细胞存在于培养物中并经多次传代和冻-融循环保留。此外，分子分析证实来自患病和正常肾组织的EPO表达细胞通过EPO和低氧调节基因靶位(包括vEGF)的HIF1驱动诱导响应体外低氧条件。
经由胶原酶+分散酶的酶消化从猪肾组织分离细胞，或通过进行简单的机械消化和外植体培养，在独立的实验中分离细胞。传代时，使两种源自外植体的包含epo表达细胞的细胞培养物经受大气(21％)和变化的低氧(＜5％)的培养条件，以确定低氧下的暴露是否最终使EPO基因表达上调。正如通过啮齿动物培养物(见实施例3)可注意到，正常猪表现出EPO基因的氧依赖性表达和调节。意外的是，尽管CKD猪存在尿毒症/贫血状态(血细胞比容＜34，肌酸酐＞9.0)，EPO表达细胞仍易于从组织中分离并增殖，并且EPO基因的表达仍保持低氧调节，如图2所示。
如图3所示，增殖培养物中的细胞显示出自组织成小管样结构的能力。
如所示图4，通过观察经培养的细胞对FITC缀合白蛋白的受体介导吸收来证实培养物(第3代)中存在功能性肾小管细胞。(由白色细箭头指示的)绿色圆点代表内吞的荧光素缀合白蛋白，其由肾小管细胞特异受体、巨蛋白和Cubilin介导，指示功能性肾小管细胞的蛋白质重吸收作用。(由白色粗箭头指示的)蓝染色为Hoescht染色的细胞核。
合在一起，这些数据表明可从猪肾组织，甚至已严重受CKD损害的肾组织中分离并增殖功能性肾小管细胞和内分泌细胞。此外，这些发现支持了基于自体细胞的治疗产品在治疗CKD方面的进展。
实施例2-从人肾分离生物应答EPO细胞
通过酶解从正常成人肾中分离EPO生成细胞(如上文实施例1所述)。如图5所示，分离程序导致相对EPO表达在分离后比在初始组织中更多。如图6所示，可在培养物中维持保留EPO基因表达的人EPO生成细胞。在经组织培养处理的平塑料板或用一些细胞外基质(诸如纤连蛋白或胶原)包覆的塑料板上培养/增殖人细胞，并且发现所有细胞均支持随时间的EPO表达。
实施例3-来自啮齿动物肾的生物应答EPO表达细胞和肾小管细胞的培养
本研究利用分离自Lewis大鼠(Lewis rat)的原代肾细胞对响应低氧和剪切力的EPO表达和肾小管标记物表达进行了体外分析。
使用适于小鼠的标准方法从Lewis大鼠中分离原代肾细胞(Aboushwareb等，2008.World J.Urol.Aug；26(4)：295-300)，并使其在低氧和高氧或静态和动态3D培养物中增殖。
通过将细胞在大气“常氧”培养条件(平衡至21％O2、5％CO2的37℃培养箱)下进行培养，然后将氧张力减至低氧培养(平衡至2％O2、5％CO2的37℃培养箱)以活化Epo的低氧依赖性基因转录，从而确定Epo生成细胞的氧依赖性。最终转回常氧条件会抑制在低氧条件下发生的基因转录。将原代肾细胞在常氧条件下于2维(2D)板和3D(见下文Cultisphere实施例)构建体上进行培养，以使细胞附着(通常48小时)。然后将附着的细胞移至低氧培养箱中，并将其培养48小时。48小时的低氧培养时间点结束后，将细胞移回至常氧培养。在初始常氧培养、然后低氧培养并且最终转回常氧培养下的每个规定时间点处，收集来自三个板上的样本的细胞。分析前，将收集的样本在液氮中急冻、储存在-80℃下。通过从每个样本中分离总mRNA，再由总mRNA进行cDNA合成来进行基因表达分析，并且用实时定量pcr(qrtpcr)来确定相对基因表达。除了3个板上的样本外，还通过qrtpcr分析了2个技术性样本，从而在每种培养条件下于每个时间点处获得总共6个样本。
Cultisnhere-S明胶微载体珠
采用标准方法从幼鼠分离原代肾细胞。将大约200,000个细胞置于培养物中，该培养物中包含无菌Cultisphere-S(Sigma-Aldrich cat#M9043)大孔明胶微载体珠(130-380μm)的200μl 50％(v/v)的浆料，所述大孔明胶微载体珠位于低附着6孔板上。静态(包含细胞的板在整个实验过程中不作任何移动)条件或动态(持续移动)条件下将细胞置于含2％或21％氧的室中。随研究的时间时程(7天)定期收集每种条件下的样本。每天收集每种条件下的三个样本。将所有样本的基因表达均标准化为起始物料、来自初始分离的原代细胞的未分化细胞悬液。进行QRTPCR以分别检验肾小管细胞和内分泌细胞标记物、上皮钙黏着蛋白和EPO的表达。
结果：培养的内分泌细胞中的EPO表达经由动态培养而上调，这与静态和/或低氧培养相反。图7示出大气(21％)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)EPO表达的结果。图8示出低(2％)氧含量下的3D培养物中动态培养的(+)EPO的表达。图9同样示出长期培养时动态培养的(+)肾小管基因的表达。相对于高氧和静态培养而言，低氧和动态3D培养分别显著增加了EPO表达(p＜0.05)。图10示出低氧培养物(相对常氧培养物)中的EPO表达。图11示出图11示出体外动态3D培养物对EPO表达的刺激。EPO表达的增加往往伴随着其调节子、HIF1α和其它HIF1α靶基因(如VEGF)表达的增加。因此，清楚的是培养的新肾细胞中的EPO表达经由HIF1α、通过氧含量来调节。以上结果表明保持氧和对EPO表达的机械转导调节的生物应答性原代啮齿动物肾细胞可分离并在体外增殖。
实施例4-3D构建体和对比培养物
为了确定包含细胞、支架和培养基的新组织/新器官结构的体内功能性(如治疗潜力)的最佳体外指征，设计了许多三维培养结构。新组织/新器官结构设计如下：将原代肾细胞培养物(包含EPO生成细胞和肾小管细胞)接种到直径为5mm、高度为5mm的多孔圆柱形支架上。将细胞以500K至1,000,000个细胞/支架的密度接种，并在原型多孔灌流系统(MPS，BDTechnologies)上进行培养，该系统在整个实验过程中提供连续的单向流体流。培养基由DMEM+10％FBS(培养基A)或DMEM+10％FBS与KSFM培养基的1∶1混合物(培养基B)构成。这些实验中评估的支架包括采用标准方法制成的开孔聚乳酸(OPLA)和胶原1支架(均得自BD)和聚乙醇酸基支架(PGA)。
特征包括：足以使流体流经细胞-支架复合物的孔径和结构；可为细胞-支架和细胞-细胞相互作用提供微环境的支架结构和组成；存在表达和/或生成和/或转运肾再生和/或稳态中所涉及的蛋白质和/或分子或具有表达和/或生成和/或转运肾再生和/或稳态中所涉及的蛋白质和/或分子的潜力的细胞。
例如，在由开孔聚乳酸(OPLA)构成的优选3D支架中接种哺乳动物肾细胞，并使其在生物反应器装置中进行体外培养，该装置在整个支架中提供连续的培养基灌流。体外条件支架+细胞复合物通过下列表征：存在存活的、代谢活性细胞；细胞-细胞以及细胞-材料的相互作用；包括但不限于巨蛋白、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、上皮钙黏着蛋白和神经钙黏着蛋白的肾小管标记物的表达；以及包括但不限于促红细胞生成素的肾内分泌标记物的表达。
结果：从所示2D和3D培养物中收集到条件培养基和总蛋白裂解物。进行ELISA分析以定量细胞裂解物(图12中上图)和条件培养基(图12中下图)中的靶蛋白。
经数天灌流或静态培养后，采用标准技术将接种的OPLA和1型胶原支架固定在10％福尔马林缓冲液中并经石蜡包埋。进行苏木精和伊红(H&E)染色以检验细胞的存在和形态。灌流支架中的细胞含量高于静态支架中的细胞含量，相比1型胶原支架，整个OPLA支架中的细胞分布更为显著(见图13)。
图14示出(静态和灌流)培养七天后OPLA和1型胶原支架的扫描式电子显微镜(SEM)照片的结果。相比静态培养物，灌流培养物显示出较大的细胞含量和细胞组织。
通过添加裂解缓冲液(Qiagen)使mRNA从支架或2D培养物中分离，并通过在裂解缓冲液中进行电均化(polytron)使其从3D支架中分离。通过用对目标靶基因特异的内含子跨越引物对纯化的mRNA进行RT-PCR分析显示，所检验的3/73D结构经5天培养后表现出靶基因(即EPO)的表达。
相反，2D结构(图15中泳道8-10)在5天中没有可检测的靶基因mRNA。图15的泳道1表示3D结构，其在5天中的表达水平接近已知表达靶基因的显微解剖的新鲜组织(泳道21)中所观察到的水平。
图16示出CellTiter BlueTM(刃天青代谢)的结果，其用于评价支架中的代谢活性。支架结构C在灌流和静态条件下均得到了最佳的代谢反应，接着分别为支架B和支架A。在所有支架结构中，就刃天青代谢而言，灌流培养优于静态培养。
为检验原代肾细胞的灌流和静态3D培养物对葡萄糖和谷氨酰胺的消耗，收集条件培养基并在Nova
Figure BDA0000073731760000561
400对其进行分析。葡萄糖的消耗在灌流(相比静态)条件下显著加快。谷氨酰胺在所有3D条件下均消耗至一定的程度，其中在灌流(相比静态)条件下消耗略多。在所有测试的支架结构中，谷氨酸盐(谷氨酰胺代谢的副产物)的生成在灌流(相比静态)条件下较多，乳酸盐(葡萄糖代谢的副产物)的生成同样如此(见图17)。
实施例5-未分化的肾细胞混合物异质性群(供试品#1)的分离
将主要由肾小管细胞构成但也包含集合管、肾小球、内分泌、血管和其它细胞类型的较小亚群的未分化的肾细胞混合物(UNFX)富集群按以下方式从全肾中分离：
细胞供体：将二十只(20)2周大的雄性Lewis大鼠处死并获取其肾脏。将新切离的肾置于含50mL冷(4℃)Hypothermasol(Biolife Solutions，Inc.Bothell，WA)的50mL圆锥管中(每个管中10个肾)并保存在冰块上。第二天，用70％的乙醇冲洗装有肾的管，然后置于生物学安全柜(BSC)中，以供处理。
肾细胞分离方法：用包含50μg/ml庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)的1XPBS(Gibco，Grand Island，NY)冲洗肾，并用镊子和解剖刀手动移除结缔组织和肾盏。用无菌镊子和解剖刀将肾手动切碎成细胞/组织浆液。
在平台摇晃式摇床上，将细胞/组织制剂在包含分散酶(4U/mL)(#07193Stem Cell Technologies，Vancouver，BC)+5mM CaCl2+IV型胶原酶(300U/mL)(Worthington，Newark，NJ)的Kreb缓冲液中在37℃下用酶消化30分钟。然后将所得细胞悬液通过带70μm孔的细胞过滤网(BD Biosciences，FranklinLakes NJ)过滤到包含50∶50肾细胞生长培养基(1∶1的高糖DMEM∶KSFM)的50mL无菌聚丙烯圆锥管中。然后将悬浮液在300×g下离心5分钟，并再悬浮于10ml的50∶50肾细胞生长培养基中。
将10mL细胞悬液分装在两个15mL的圆锥管中(每个管中5ml)。将5ml 30％w/v Optiprep(Sigma，St.Louis，MO)添加到每个管中并翻转6次。混合后，将1毫升1X PBS小心铺在各悬浮液的顶部。将管在800xg下连续离心15分钟(室温)。经10mL无菌移液管移除细胞带(包含存活的新肾细胞原型#1)，用50∶50肾细胞生长培养基(用低糖DMEM制备)稀释5倍，并且在300xg下离心5分钟。离心后，小心移除上清液，并将细胞沉淀在10ml50∶50(低糖)肾细胞生长培养基中再悬浮并计数。对500K细胞进行抽样用于基因表达测试。存活细胞的总收率为230×106(94％存活率)。
将总共46.8×106个细胞接种在50∶50(低糖)培养基中的(40)p100组织培养处理的聚苯乙烯板(BD Biosciences，Franklin Lakes NJ)上(每块板1.17×106个细胞)，然后放置在标准CO2培养箱(21％O2)中。48小时后，用50∶50(低糖)培养基对培养物进行100％的培养基更换，并将其置于37℃的2％O2环境中。24小时后，将细胞在2％O2下收集以供移植。将每块板在无菌PBS中洗涤1次，然后添加5.0mL 0.25％的温胰蛋白酶w/EDTA(Sigma)，并回放在37℃下并保持5-7分钟。将生长培养基(5.0mL)添加至每块板中，并移除细胞悬液，然后倒入50mL无菌聚丙烯圆锥管中。通过在300xg下离心5分钟使细胞沉淀，在无菌PBS中洗涤2次，再悬浮于冷(4℃)PBS中，然后经由血细胞计数器计数。在无菌冷PBS中制备10×106个细胞/100μL的等分试样。存活细胞的培养后总收率为91×106(90％存活率)。扩增倍数(接种→收集)为3.91倍。
实施例6-未分化的肾细胞混合物异质性群的分离和支架接种(供试品#2)
细胞供体：将十只(10)2周大的雄性Lewis大鼠处死并获取其肾脏。将新切离的肾置于含50mL冷(4℃)Hypothermasol(Biolife Solutions，Inc.Bothell，WA)的50mL圆锥管中(每个管中10个肾)并保存在冰块上。第二天，将装有肾的管用70％的乙醇冲洗，然后置于生物学安全柜(BSC)中以供处理。
肾细胞分离方法：将肾用包含50μg/ml庆大霉素(Sigma，St.Louis，MO)的1X PBS(Gibco，Grand Island，NY)冲洗，并用镊子和解剖刀手动移除结缔组织。用无菌镊子和解剖刀将肾手动切碎成细胞/组织浆液。
在平台摇晃式摇床上，将细胞/组织制剂在包含分散酶(4U/mL)(#07193Stem Cell Technologies，Vancouver，BC)+5mM CaCl2+IV型胶原酶(300U/mL)(Worthington，Newark，NJ)的Kreb缓冲液中在37℃下用酶消化30分钟。然后将所得细胞悬液通过带70μm孔的细胞过滤网(BD Biosciences，FranklinLakes NJ)过滤到包含50∶50肾细胞生长培养基(1∶1的高糖DMEM∶KSFM)的50mL无菌聚丙烯圆锥管中。然后将细胞悬浮液在300xg下离心5分钟，并再悬浮于10ml的50∶50肾细胞生长培养基中。
将10mL细胞悬液分装在两个15mL的圆锥管中(每个管中5ml)。将5ml 30％w/v Optiprep(Sigma，St.Louis，MO)添加到每个管中并翻转6次。混合后，将1毫升1X PBS小心铺在各悬浮液的顶部。将管在800xg下连续离心15分钟(室温)。经10mL无菌移液管移除细胞带(包含存活的新肾细胞原型#1)，用50∶50肾细胞生长培养基(用低糖DMEM制备)稀释5倍，并且在300xg下离心5分钟。离心后，小心移除上清液，并将细胞沉淀在10ml50∶50(低糖)肾细胞生长培养基中再悬浮并计数。存活细胞的总收率为71×106(97％存活率)。
将24个无菌封装的开孔聚乳酸
Figure BDA0000073731760000581
支架(BD Biosciences，FranklinLakes NJ)用50∶50(低糖)培养基预润湿，并且在50μL 50∶50(低糖)培养基中，在支架上接种1×106个RK42新肾细胞原型#1。使支架在37℃/21％O2下适应2小时，然后转移至装有MPS(多孔灌流系统)的装置(BD Technologies，RTP NC)中，并在2％O2下连续流动的50∶50(低糖)培养基中保持5天。每隔两天更换(50％体积变化)培养基。第五天，将支架从MPS中小心移除，在无菌PBS中冲洗，并将其在运送以备移植时于环境温度下保持大约2小时。
实施例7-将来分化的肾细胞混合物植入肾衰竭和贫血的大鼠模型中
要评价新肾细胞原型#1(UNFX)的治疗潜力和安全性，应评价新肾细胞原型#1在肾切除手术啮齿动物中延缓或逆转肾衰竭和/或贫血的能力，其中新肾细胞原型#1包含异质性细胞混合物，其包括分离自大鼠肾脏的EPO生成间质成纤维细胞、近端和远端肾小管上皮细胞、肾小球细胞和内皮细胞，如上文所述。下表1中示出了研究设计。非限制性成功因素包括下列各项：
1)对HCT和/或RBC数量的显著积极效果
2)血清BUN和/或肌酸酐的显著降低
3)红细胞刺激的组织学证据
4)肾再生的组织学证据
5)生物体水平改善(体重增量、存活率)
根据研究设计，从Charles River Laboratories(Wilmington，MA)获取二十四(24)只成年雌Lewis大鼠(8-10周大)，并指定为下表1中所示的研究受体。通过每天的健康评估以及每周的血液学和血清学分析来监测每组个体的病情发作情况。所有受体动物在用新肾原型进行治疗前均已患有贫血/尿毒症。在研究开始前，要求肾切除大鼠在连续两周中的血清肌酸酐升高(2倍于对照水平)。将肾切除大鼠分配到四组之一中(见下表1)。第1组大鼠接受10,000,000个新肾细胞原型#1(供试品1)，该新肾细胞原型#1悬浮在无菌PBS中并经由直接注射到肾的皮髓区域进行递送。通过使新肾构建体原型#1(接种有1×106个新肾原型#1细胞并培养4天的OPLA支架)附着到残肾远极上来对第2组大鼠进行治疗。通过使空OPLA支架附着到残肾远极上来对第3组大鼠进行治疗。第4组大鼠未接受治疗。将未处理的、年龄相一致的对照大鼠指定为第5组；将经受肾切除假手术但未做进一步处理的年龄相一致的对照大鼠指定为第6组。
每周经由尾静脉从所有动物抽取血液(500μL)，以评价肾功能(肌酸酐和BUN)和红细胞生成(HCT、RBC和有核RBC(nRBC))。在研究过程中，每周进行健康观察并收集体重。研究结束(84天)时，使存活的大鼠经受游泳耐力试验。在尸体剖检时采集股骨、肾、肝、脾、心脏和肺，称重并通过福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)以用于组织学分析。将肾的一部分包埋到OCT培养基中，冷冻并经由冰冻切割处理。将FFPE组织进行处理并进行H&E染色。
表1.研究设计
Figure BDA0000073731760000601
时间点
起始日：第一次肾切除术(50％)
第7天：第二次部分肾切除术(移除2/3的残肾)
第43天：第一次释放/血清学/血液学分析日期
第83-91天：治疗日期
第170天：处死/研究结束日期
供试品：
供试品#1-新肾细胞原型#1(UNFX)，其包括培养的肾细胞的异质性混合物，该混合物包含上述实施例3中分离的EPO生成细胞亚群。
供试品#2-新肾构建体原型#1，其包括接种有培养的肾细胞的异质性混合物的
Figure BDA0000073731760000602
支架，该混合物包含上述实施例4中分离的EPO生成细胞亚群。
供试品#3
Figure BDA0000073731760000611
支架
受体5/6肾切除术的雌性Lewis大鼠：在如前所述的Charles RiversLaboratories(Wilmington，PA)中对十三(13)只雌性Lewis大鼠(8-10周大)进行2步5/6肾切除手术。
简单地讲，在手术第1阶段，做进入腹腔的下腹正中切口并施加无菌消毒盖布。将肠向侧面缩回以暴露动物的右肾。将肾与周围组织分离。将一根缝线置于肾的每个肾极的1/3的位置附近。将缝线环绕肾轻轻绑扎。将每端上刚好超出绑扎的1/3肾切除。用缝线和创缘夹将腹部切口缝合。在手术第2阶段及第一步骤完成一周后，将动物麻醉并按前述进行处理。剃去腰椎区域的背毛。在动物的脊柱左侧位做颅-尾外皮切口，同时使其颅末端恰好在胸腔后方。进入腹腔。将肾与周围组织分离并轻轻拉出切口。通过扯断附着物将经由结缔组织和脂肪松散附着到肾前极的肾上腺轻轻分离，并将其放回腹腔中。烧灼肾血脉管和输尿管。然后通过横切恰好位于烧灼点远端的血管和输尿管来移除肾。用缝线和创缘夹将切口缝合。
对于对照组，对(6)只年龄相一致的对照大鼠进行肾切除假手术(两手术均采用开放式和闭合式外科麻醉)。此外，获取(5)只年龄相一致的未处理对照大鼠。恢复时，将所有大鼠均保持隔离(5)天。将每只大鼠分配入组并给定数字标识，该数字标识与研究编号、供应商以及研究负责人一起置于笼子卡片上。每个笼子中装入(1)只鼠，并用Purina Certified Regular Rodent Chow#5002饲养。可随意供水。
存活期临床参数评价：采用已校准的分析天平每周对体重进行观察和记录。
血液学/临床化学：从第43天开始，每周收集血液和血清送往Antech，以确定血细胞比容(HCT)、红细胞数量(RBC)、有核红细胞数量(nRBC)、肌酸酐(CRE)和血液尿素氮(BUN)。从尾静脉或隐静脉无菌抽取血液，并放置到血液或血清收集管(均得自BD，Franklin Lakes，NJ)中。在8:00AM和12:00PM之间采集血液以控制昼夜差异变异。
外科治疗手术：
麻醉/镇静/镇痛：通过在术前准备时用配备有26计量注射针(IP)的注射器首次施用0.05cc(0.3mg/ml)丁丙诺啡(Buprenex)来使大鼠镇静。经由异氟醚吸入麻醉剂来麻醉大鼠，方式如下：将大鼠首先置于浓度为4-5％的异氟醚室中，然后在整个手术过程中经由鼻锥吸入异氟醚(3％)来保持麻醉。在手术后，对每只大鼠施用第二剂量的Buprenex，第二天施用第三剂量。
手术准备：当达到足够的麻醉平面后(通过捏脚趾评价)，使动物背侧横卧，并使用5号剃毛剪且以同心圆的方式施加聚烯吡酮磺(3次)和乙醇(4次)来对右背外侧区域进行剃毛处理。采用无菌透明胶粘消毒盖布得到用于无菌手术的区域，使得能够对呼吸进行精确检测。
直接注射新肾细胞原型#1(供试品#1或UNFX)：在右背外侧区域做纵向切口以暴露腹膜腔。采用无菌纱布和钝手术镊将残余的右肾分离并部分从腹膜空间引出。将新肾细胞原型#1(prep RK40，供试品1)轻轻再悬浮并装入单个无菌1cc注射器(BD，Franklin Lakes，NJ)中，然后为该注射器配备23G针头。将100μL细胞悬液(10,000,000个细胞)通过针头缓慢递送至肾实质，以试图靶向皮髓交界区域。对每只动物均采用新的无菌23G针头。抽出针头时将胶原盘(GelFoam，2mm×2mm)置于注射部位，以延缓出血。将肾放回腹腔，并加入1mL无菌温盐水以进行水合。使用4.0Vicryl缝线缝合肌壁，并使用创缘夹缝合外皮(两者均得自Ethicon Inc.Somerville，NJ)。术后施加氧气(经由吸入/鼻锥)，监测动物直到其警觉并有意识为止。
基于支架的供试品(#2&#3)的手术递送：在右背外侧区域做纵向切口以暴露腹膜腔。采用无菌纱布和钝手术镊将残余的右肾分离并部分从腹膜空间引出。定位残肾的远极，然后采用钝手术技术或镊子挑离附着的腹脂，直至观察到肾的深红色组织。使用Sklar#10解剖刀(Sklar Scientific，West Chester，PA)使肾暴露，用解剖刀清除伤口，直至暴露～4×4mm肾实质区域并开始轻度出血。将单个新肾构建体原型#1(供试品#2)或单独的支架(供试品#3)平分(以对暴露的肾实质提供大的接触平端)并通过纤维蛋白胶(Ethicon Inc.Somervile，NJ)附着(至清创区的切面)至清创区。通过折叠支架上方的腹脂并用附加的纤维蛋白胶将脂肪塞封在肾表面上从而为附着支架提供补充的血液供应。对肾进行～1分钟的观察以确定是否有出血迹象；用纤维蛋白胶抑制任何出血现象，然后将具有附着支架的残肾放回到腹膜腔的中位处。然后将1.0mL无菌温盐水添加到IP腔中以辅助进行水合。使用4.0Vicryl缝线缝合肌壁，并使用创缘夹缝合外皮(两者均得自Ethicon Inc.Somerville，NJ)。术后施加氧气(经由吸入/鼻锥)，监测动物直到其警觉并有意识为止。
手术恢复：用装有吸收垫(但无疏松衬垫)的笼子使经外科手术后的所有动物在手术室中恢复，其中所述吸收垫置于加热垫上。一旦这些大鼠开始活动并恢复意识，就将其放回各自的笼子中，在当天剩余的时间进行观察，并在第二天早上立即进行观察。
尸体剖检前的步骤：
游泳耐力耐力试验：将1个大的圆形金属槽(140cm直径×45cm深度)装满水并保持在32℃下。将大鼠(每次一只)面朝水槽侧轻轻降低到水中并释放。用秒表测量从释放至大鼠停止游动且不能保持在水面上的时间并记录。在回笼前，将大鼠用棉毛巾擦干并使其在加热垫上恢复。在轮换动物时，清理水池中的粪便物，并检查和记录温度。
最终体重：将动物转移至尸体剖检室。使用分析天平获得最终体重并以克记录。
安乐死：将大鼠置于CO2室内。通过深部痛觉的丧失和眼部测试确认死亡。
尸体剖检步骤：
心脏穿刺/血液采集：将安乐死大鼠置于尸体剖检台上，并将血液直接采集到血清和血液采集管中。对血清样本进行旋转，并采集血清用于全血清化学分析。采集血液样本用于全血液分析。
组织采集：将残肾(或对于对照组和假手术组而言为整个右肾)小心移除，称重并沿纵向平分。将一半置于10％福尔马林缓冲液中并处理以进行石蜡包埋和H&E染色。将另一半置于干冰上的预冷模中，用OCT包埋介质包埋，并冷冻。将冷冻的两半肾保持在干冰上并在-80℃下储存，直至制备冷冻切片用于进行Y染色体分析。在尸体剖检时，将脾、肝、心脏和肺移除、称重，并在置于10％福尔马林缓冲液中进行石蜡包埋和H&E染色时，在每个器官上切一条小的狭长切口。最后，移除股骨并移除相关的基质组织。用手术刀片剃刮近端骨节，以暴露骨髓，然后在对整块股骨进行石蜡包埋和H&E染色步骤之前置于10％的福尔马林缓冲液中。
结果
存活率：大部分的肾切除大鼠不会在经历整个研究过程后仍然存活。第1组、第5组和第6组在第84天处死之前存活。第4组肾切除的未治疗大鼠平均存活时间(以天数计)为48.25±29.8天。仅接受支架(第3组)的肾切除大鼠在治疗后存活了25天。接受新肾构建体原型#1的大鼠(第2组)存活平均57.5±14.3天，或比未治疗的肾切除大鼠的存活时间长9.25天。用新肾细胞原型#1治疗的第1组大鼠在整个研究过程中存活，并在第84天(箭头)将其与第5组和第6组(图18)一起处死。
体重：从研究开始(第14天)至处死(第170天)期间每周对体重进行测量。图19中展示了每组的体重数据(g)。第5组(对照组)大鼠在整个研究过程中具有平均56％(±5.5％)的体重增量，并且第6组(假手术组)大鼠具有平均30.3％(±5.3％)的体重增量。在整个研究过程中，所有肾切除大鼠(第1-4组)具有显著较小的体重增量百分比，其中第1组(新肾细胞原型#1)的增量为平均13.5％，第2组(新肾构建体原型#1)的增量为平均13.3％，第3组(空支架)的增量为平均7.8％，并且第4组(未治疗)的增量为平均13.7％。当在治疗和处死或死亡的时间之间检查到体重增量时，各组之间的差异变得更加明显(图20)。虽然第5组和第6组大鼠在治疗期间获得11.9％和8.8％的体重增量(第83天-第170天)，但未治疗的肾切除大鼠(第4组)损失平均4.8％的体重。接受新肾细胞原型#1、构建体或仅支架(第1、2和3组)的大鼠也在治疗期间损失体重，但是不如第4组未治疗的肾切除大鼠损失那么多。
肾功能(BUN和肌酸酐)的周评价：在整个研究过程中(从第4周开始至第170天处死)每周获取血清的BUN和肌酸酐测量值。下列表2和表3示出了个体大鼠的平均数据。图21和图22以周平均值分别示出了各组的BUN和肌酸酐随时间的测量值。对照组和假手术组在整个研究过程中的[BUN]平均为19.1±1.9。在移植时(图中第7周和第8周之间，箭头)，所有肾切除大鼠的血清BUN均升高，其平均[BUN]为53.3±19.9。在研究过程中，第4组未治疗的肾切除大鼠显示出连续升高的[BUN]，在死亡之前达到大于100的值。用新肾细胞原型#1治疗后，第1组大鼠在第14周时显示出稳定的血清[BUN]，从第14周至第19周(处死时间)，[BUN]每周均增加。接受新肾构建体原型#1的第2组大鼠的血清[BUN]低于第4组，但未显示出与第1组相同的稳定程度。接受仅支架的第3组大鼠在手术后快速下降，正如快速升高的[BUN]和第10周的死亡所证实。
每组的血清肌酸酐结果显示出与所观察的[BUN]相同的治疗效果趋势(图22)。在整个研究过程中(第7周-第19周)，第5组对照组和第6组假手术组动物的血清[肌酸酐]均稳定在0.4±0.5。相反，第4组肾切除的未治疗大鼠在第7周研究开始时的平均[肌酸酐]为1.38±0.75，在死亡时达到最大值2.7和平均值2.6±0.15。接种支架动物死亡时的平均[肌酸酐]为2.3(标准值为0.92)，表示相对于第4组有较小的改善。有意思的是，接受新肾细胞原型#1(第1组)的肾切除大鼠的[肌酸酐]水平从第7周移植细胞(0.8±0.0)至第15周(1.0±0.0)期间保持稳定，仅在研究结束(第16-19周)时略微上升，平均值为1.3±0.18。
在研究中期(第12周和第13周)检查BUN和肌酸酐值，其中每个个体大鼠的数据表示为占(对照组+假手术组-第5组和第6组)的百分比，这提供了对每组大鼠的差异进行检验的方法(图23和图24)。在第12周和第13周，3/5的第2组新肾构建体原型#1大鼠的BUN和肌酸酐显著低于第4组未治疗的肾切除大鼠。第1组新肾细胞治疗的大鼠(2/2)的BUN和肌酸酐均显著低于第2组或第4组。
Figure BDA0000073731760000661
Figure BDA0000073731760000671
红细胞生成(HCT、RBC、nRBC)的周评价：所有数据在下表4和表5示出。从第7周(治疗时间)至第19周(研究结束)，第5组对照组和第6组假手术组的平均HCT分别为46.9±0.8和46.2±1.2。相反，未接受治疗的第4组肾切除动物在第7周的平均HCT为40±2.6，并且之后迅速下降，直至发病死亡，死亡时的平均HCT为35.6±1.8。第2组新肾构建体原型#1动物死亡时的平均HCT为38.4±4.3，表示相对于第4组有所改善，但未达到第5组对照组的HCT。有意思的是，接受新肾细胞原型#1的第1组动物显示HCT的改善，从移植前(第7周)的平均42.8±0.2至第14周时等于第5组和第6组的值(48.9±0.4)。第1组的HCT值从第15周-第19周逐渐下降，在死亡时达到平均值36.8±7.1。周平均数据在图25中示出。由于各个治疗组中大鼠的差异度有时较高，因此有望以另外的方式观察HCT数据，从而可评价个体大鼠数据。图26a提供了第12周和第13周时所有治疗组的数据，其表示为对照组的百分比(对照组的百分比＝所述日期所有对照组和假手术组的平均值)。
每周还对RBC和有核RBC(nRBC)进行测量。在整个研究过程中未检测到有核RBC并且未以图表形式显示。平均数据在下表5中示出。从第7周(治疗时间)至第19周(研究结束)，第5组对照组和第6组假手术组的平均RBC#为8.32±0.2。未接受治疗的肾切除大鼠在第7周开始时的平均RBC#为7.58±0.58并且快速降低直至死亡，其中死亡时的平均RBC#为6.5±0.5。第2组新肾构建体原型#1动物死亡时的平均RBC#为6.94±0.7。接受新肾细胞原型#1的第1组动物的RBC#表现出稳定和持续的改善，从第8周的6.71±2.53至第18周的8.03±0.32。注意到第19周时(研究结束)的平均RBC#显著降低，为6.6±1.15。通常，周平均RBC数量用HCT来示踪(图27)。同样，各治疗组中动物之间的差异使得有必要添加中期图，该图中将个体动物的RBC#(第12周-第13周)表示为对照组的百分比(图28)。
Figure BDA0000073731760000691
Figure BDA0000073731760000701
处死时的血液学和临床化学
电解质平衡：对处死时血清的钙、钾、氯化物和磷酸盐水平进行测量(除非发现动物已死亡，从其中不能收集血液)。下表7a-7c中示出所有数据。结果总结在图29中。所测每个参数的正常范围通过图中两条虚线表示(正常参考范围得自Gad编著的Animal Models in Toxicology第2版(2008)，InformaHealthcare USA(New York，NY)。肾衰竭通常与钾、钠和磷的上升以及钙和氯化物的水平降低相关。相比对照组，第4组肾切除大鼠未显示出升高的钠和磷酸盐(但钾未升高)以及较低的氯化物水平。肾切除大鼠中最一致的电解质变化为氯化物水平降低和磷水平升高。相比第4组，用新肾细胞原型#1进行治疗(第1组)导致磷和钙降低，以及氯化物略微升高(见图30)。
如果对所分析大鼠的血清磷水平进行单独考虑，则清楚的是如同BUN、肌酸酐、HCT和RBC值，第2组大鼠的反应不同，其中2/4的大鼠表现出的磷水平与第5组对照组和第6组假手术组以及第1组新肾细胞治疗的大鼠的磷水平一样低。
血清蛋白：测量所有大鼠在处死时的总的血清蛋白、血清白蛋白和血清球蛋白水平，除了发现已死亡且不能从其中采集血液的大鼠。第5组对照组和第6组假手术组中大鼠的血清白蛋白和球蛋白在正常范围内。相比对照组和假手术组，第4组肾切除的未治疗大鼠的血清白蛋白和蛋白质总量显著降低。用新肾细胞原型#1(第1组)进行治疗导致血清白蛋白和血清蛋白总量轻度恢复(图31)。用新肾构建体原型#1(第2组)进行治疗也导致血清蛋白总量轻度恢复。各个大鼠数据的血清白蛋白和蛋白总量在图32中表示为对照组的百分比。
肝功能：通过测量胆红素、AST、ALT、GGT和ALP评价肝功能。这些试验的所有数据在表7a-7c中示出。第6组假手术组和第1组Nx+新肾细胞原型#1台疗的大鼠的平均血清AST在上述报导的正常范围之上(图33)。与第4组和第2组相同，第5组属于正常范围，但具有较高的差异度。除了第2组(新肾构建体原型#1)外，所有组的平均血清ALT和ALP高于大鼠的正常报导范围。胆红素水平在所报导的正常范围内并且在治疗组中没有不同。
脂质和糖：还对采集自处死时动物血清中的胆固醇、三酸甘油酯和葡萄糖进行测量。所有数据均以表格形式示出于附录F中。无论治疗与否，肾切除组(第1、2和4组)中的平均血清胆固醇和三酸甘油酯水平均显著升高。值得注意的是第1组新肾细胞原型#1治疗的三酸甘油酯平均水平，其不仅显著高于对照组和假手术组(第5组和第6组)，而且也显著高于第4组和第2组(图34)。所有组的平均血清葡萄糖水平高于正常报导范围。第1组新肾细胞治疗大鼠的血清[葡萄糖]等于对照组和假手术组，而第4组和第2组大鼠具有显著较低的血清[葡萄糖]。以对照组+假手术组百分比表示的个体大鼠数据示出在图35中，从而可评价每组中大鼠的差异。
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处死时的血液学分析
血红蛋白：在处死时，采集血液并用于测量血红蛋白(Hb)、红细胞平均血红蛋白(MCH)和红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)。所有数据均在表7a-7c中示出。相比对照组和假手术组，第4组肾切除的未治疗大鼠具有显著较低的[Hb](图36)，正如对第4组中HCT和RBC#降低的预期。第1组和第2组的平均[Hb]较高，其中许多大鼠均回到正常范围(见图37中的各个数据)。对所有大鼠而言，MCH相对相等，这表明每个RBC的血红蛋白浓度在所有治疗组中均相似。在用新肾细胞原型#1或新肾构建体原型#1治疗的第1组和第2组大鼠中所观察到的[Hb]的增加与在这些大鼠中所观察到的RBC#和血细胞比容的增加相一致。合在一起，这些数据表明对经治疗的大鼠中红细胞生成的刺激及携氧能力。
WBC和RBC计数和组成：处死时，获取所有大鼠的白细胞计数(WBC)和红细胞计数(RBC)，除了发现已死亡且不能从其中采集血液的大鼠。所有血液学数据均在表7a-7c中示出。此外，评估每只大鼠的WBC总数，以确定淋巴细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和未染色大细胞(LUC)的相对百分比。如所示图38，除了其中WBC降低的第4组肾切除的未治疗大鼠之外，所有组的平均WBC均在正常范围内。图39突出了各组之间的WBC组成差异。在第4组肾切除的未治疗大鼠和接受新肾构建体原型#1的第2组肾切除大鼠中注意到较低的淋巴细胞百分比和较高的嗜中性粒细胞百分比。
对红细胞群而言，测量所抽取的最终血液中网织红细胞数量和百分比(见图40)。RBC和HCT已做报道(见图26-29)。相比第5组对照组和第6组假手术组，第4组肾切除的未治疗大鼠中网织红细胞数量和百分比降低。相比第4组，治疗组(1和2)都表现出略微的改善，但差异在统计学上并不显著。还评价了RDW(测量RBC宽度的变化)以及MCV(平均红细胞容积)，但未观察到各组之间显著的差异(未示出数据)。所有血液学数据均在表7a-7c中示出。
血小板：测量在处死时所取血液中血小板计数和血小板平均容积(MPV)。所有组中的血小板计数略高于正常报道范围。治疗组中的血小板计数或MPV无显著的差异(见图41)。
游泳耐力：在研究结束时(即恰好在第84天处死前)，按照方法部分中所述，使剩余的大鼠经受游泳耐力试验。在第1组新肾细胞治疗大鼠与对照组和假手术组(第5组和第6组)之间进行游泳试验。如图42所示，健康大鼠平均游泳2分钟12秒，其中大鼠间可存在合理的差异度(±33秒)。该试验也确认了第1组新肾细胞治疗大鼠的表现水平与对照组相同。
组织病理学
图43-46中可见所检查各组织的代表性图。下文提供了所有组中各个组织的结果汇总。
肝：相比第5组对照组和第6组假手术组，未观察到肝实质和/或第4组(Nx)或第2组(Nx+新肾构建体)的肝门三联征中存在显著的变化。相反，在第1组(Nx+新肾细胞)大鼠中观察到窦状隙血细胞生成焦点区域。
肾：相比第5组和第6组，所有其它试验组均表现出伴随结构缺失的进行性肾小球和肾小管变性，其通过下列来表征：皮质和髓质之间界限不清、囊性空腔、肾小球周围纤维化、无血管玻璃样物质替换肾小球毛细血管丛、血铁黄素和多灶性肾小管再生。
脾：在第5组对照组和第6组假手术组与第1组(Nx+新肾细胞注射)之间未观察到主要的组织学差异或变化。对第2组和第4组动物的即时被膜下红髓的检查显示，成体红细胞(RBC)和RBC前体分别存在中度和显著的降低。
骨髓：相比第5组对照组和第6组假手术组，第1组大鼠的骨髓细胞含量和骨髓细胞与红细胞比率看起来相等。相反，第2组和第4组动物的骨髓分别通过骨髓细胞含量的中度和显著降低来表征。如图26所示，新肾细胞向尿毒症/贫血大鼠的体内递送对骨髓，特别是对红细胞群具有刺激效应。图26还显示新肾细胞向尿毒症/贫血大鼠的体内递送还刺激整体细胞含量增加，这在递送后至少三个月仍然持续。
如上所示，单独递送的或3D支架中的新肾细胞原型#1(UNFX)对5/6肾切除手术模型中的红细胞生成和红细胞稳态具有恢复效应，这可通过RBC#和HCT的时域分析确定并通过其它参数(Hb、MHC、网织红细胞)代表的末期血液情况(bloodwork)证实。这些效应在动物(尤其是第5组新肾构建体原型#1治疗的大鼠)之间具有一定程度的变化，这归因于肾对支架的保留性差异或归因于肾实质内支架破裂所引起的未识别的并发症。重要的是，在任何给定的大鼠中，HCT或肌酸酐的改善还转变为RBC#和BUN值的改善，从而使观察到的治疗组的积极整体效应增强。图47描绘了每只大鼠相对于血清[肌酸酐]的HCT数据。所有第5组对照组和第6组假手术组集中在右上象限，具有较高的HCT和较低的肌酸酐。第1组大鼠和第2组大鼠的2/2和2/5与第5组和第6组分隔在右上象限。相比第4组，第2组治疗大鼠的1/3显示出肌酸酐得以改善，但HCT未改善，因此其出现在左上象限。剩余的(2)第2组大鼠的任一参数具有极小的改善或无改善，因此其与第4组大鼠一起集中在左下象限(高肌酸酐，低HCT)。
总之，以上结果显示，新肾细胞植入物(第1组)改善了5/6肾切除大鼠的存活率。2/2的第1组大鼠达到治疗后的3个月时间点，并且在第84天与对照组和假手术组一起被处死。在此模型中，新肾细胞植入物(第1组)使贫血逆转了大约12周的时间，正如HCT和RBC回到正常值范围所证实。此外，图47显示新肾细胞原型#1向尿毒症/贫血大鼠的体内递送使血细胞比容恢复到正常水平并且使存活率超过未治疗的尿毒症/贫血大鼠。另外，如上所示，新肾细胞植入物在12周期间调节红细胞稳态，正如治疗不会过校正贫血并导致真性红细胞增多所证实。有趣的是，新肾细胞植入物使得肾功能稳定，正如从治疗时间到第12周期间血清BUN和CREA稳定所证实。在研究中期，新肾构建体原型#1使得2/5大鼠的HCT得以改善并使得其肾功能得以稳定。在大鼠因发病致死时，其肾功能和红细胞功能仍显著优于因发病致死时的第4组肾切除的未治疗大鼠。观察到用于这些实验的经培养的新肾细胞中存在异质性，并且在移植后清楚地观察到治疗有益效果，这可促使对群内用于递送疗效的一种或多种特定细胞组分进行鉴定。
以上结果还显示，在递送新肾细胞原型#1(2/2)和新肾构建体原型#1(3/5)时，可观察到对HCT和RBC数量的清楚且显著的积极效果。新肾细胞原型#1的积极效果快速表现出来(治疗1周内)并持续到治疗后3个月。该研究还显示相对于未治疗的肾切除大鼠，新肾细胞原型#1(2/2)和新肾构建体原型#1(3/5)使肾功能稳定并使疾病的进展延缓。此外，清楚的组织学证据表明新肾细胞原型#1(2/2)对骨髓中的成红细胞提供刺激足以使处死时(治疗后3个月)的细胞含量和M∶E比率正常。此外，虽然新肾构建体原型#1(第2组)大鼠在处死时未表现出正常的骨髓组织学，但红细胞系细胞的含量和外形优于第4组未治疗的肾切除大鼠。本研究中得到的组织学证据还表明，第2组新肾细胞使肾的某些方面具有轻度的组织学改善，这可通过移植部位附近的肾小管小囊再生确定。然而，这些变化是轻度的并且未遍布整个肾脏。虽然不希望受理论束缚，但假定所观察到的肾功能的任何系统性改善归因于第2组大鼠中个体细胞水平上的效应并且在组织学水平上未必十分显著。最后，以上研究显示新肾细胞原型#1和新肾构建体原型#1使寿命延长，其中新肾细胞原型#1治疗的大鼠在研究期间存活(3个月)。虽然所有肾切除大鼠组的体重在研究期间从治疗期至处死期未增加，但用新肾细胞原型#1治疗的组的重量损失较小。
实施例8-肾细胞分离和来自异质性细胞群的特定生物活性肾细胞的富集
肾细胞分离：简单来讲，从商业供应商(Hilltop Lab Animals Inc.)购得10只2周大的一批雄性路易大鼠肾，并将其在温度为大约4℃的Viaspan保藏培养基中运送过夜。本文所述的步骤均在生物学安全柜BSC)中进行，以保持无菌。将肾在Hank平衡盐溶液(HBSS)中洗涤3次，以将Viaspan保藏培养基冲洗干净。在第三次洗涤后，去除残余的肾包膜以及任何残余的间质组织。还使用显微解剖技术移除肾大盏。然后使用无菌解剖刀将肾切碎成浆液。然后将浆液转移到50ml尖底离心管中并称重。收集RNA的小样本，置于不含核糖核酸酶的1.5ml无菌微量离心管中，并在液氮中急冻。一旦冻结，就将其转移到-80℃冷冻机中，直至分析为止。10个幼鼠肾的组织重量等于大约1克。根据该批肾的重量调节消化培养基，以递送每克组织20ml的消化培养基。用于此步骤的消化缓冲液包含HBSS中的4单位分散酶1(Stem CellTech)、300单位/毫升IV型胶原酶(Worthington)以及5mM CaCl2(Sigma)。
将适当体积的预热消化缓冲液添加到管中，然后将管密封并置于37℃培养箱中的振荡器上，保持20分钟。该第一消化步骤去除了许多红细胞并增强了残余组织的消化。20分钟后，将管移走并置于BSC中。使组织沉降到管底，然后移除上清液。然后为残余组织补充体积等于初始体积的新鲜消化缓冲液。将管再次置于37℃培养箱中的振荡器上，保持另外30分钟。
在30分钟后，将消化混合物通过70μm细胞过滤网(BD Falcon)吸移到等体积的中和缓冲液(DMEM w/10％FBS)中，以终止消化反应。然后通过在300xg下离心将细胞悬液洗涤5分钟。在离心后，将沉淀再悬浮于20ml KSFM培养基中，并采用台盼蓝排除法对获取的样本进行细胞计数和成活力评价。一旦计算得到细胞计数，收集针对RNA的1,000,000个细胞，在PBS中洗涤，并在液氮中急冻。用KSFM培养基使残余的细胞悬液上升至50ml，并通过在300xg下离心再次洗涤5分钟。洗涤后，将细胞沉淀再悬浮于每毫升KSFM 15,000,000个细胞的浓度中。
然后将5毫升肾细胞悬液加到15ml尖底离心管(BD Falcon)中的5ml30％(w/v)
Figure BDA0000073731760000801
中，并翻转混合6次。这形成了15％(w/v)
Figure BDA0000073731760000802
的最终混合物。翻转后，将1mL PBS小心地层铺在管中。将管在800xg下连续离心15分钟。离心后，将管移走，并且细胞带形成在混合梯度的顶部。还存在包含红细胞、死细胞和小的活细胞群的沉淀，该小的活细胞群包括一些较少的小颗粒细胞、一些epo生成细胞、一些肾小管细胞和一些内皮细胞。用移液管将带小心地移除并转移至另一个15ml圆锥管中。通过抽吸移除梯度培养基，并通过再悬浮于1mL KSFM中来收集沉淀。然后使带细胞和沉淀细胞重组，并采用KSFM使其再悬浮于具有所收集带体积的至少3倍稀释溶液中，并且通过在300xg下离心洗涤5分钟。洗涤后，将细胞再悬浮于20mlKSFM中，并收集用于细胞计数的样本。一旦采用台盼蓝排除法计算得到细胞计数，则收集1,000,000个细胞作为RNA样本，在PBS中洗涤，并在液氮中急冻。
采用密度梯度分离法进行培养前的“清理”，以增强特定生物活性肾细 胞的成活力及培养性能：要得到用于培养的清洁活细胞群，应首先按照以上“肾细胞分离”中所述形成细胞悬液。作为任选步骤和清理初始制剂的方法，将无菌等渗缓冲液中悬浮的总共多达1亿个细胞与等体积的30％
Figure BDA0000073731760000803
以1∶1的比例充分混合，30％
Figure BDA0000073731760000804
由60％(w/v)碘克沙醇原液在室温下制备(从而产生最终15％w/v Optiprep溶液)并通过翻转6次充分混合。混合后，将1ml PBS缓冲液小心地层铺在混合细胞悬液的顶部。然后将梯度管小心地放入离心机中，确保适度平衡。将梯度管在25℃下以800xg连续离心15分钟。清理的细胞群(包含成活的和功能性集合管细胞、肾小管细胞、内分泌细胞、肾小球细胞和血管细胞)在6％和8％(w/v)
Figure BDA0000073731760000805
之间(对应于介于1.025g/mL和1.045g/mL之间的密度)分段。其它细胞和细胞碎片沉淀在管底。
肾细胞培养：将混合的细胞带和沉淀置于经组织培养处理的三口烧瓶(Nunc T500)中或将其在150ml DMEM(高糖)/KSFM的50∶50混合物中的细胞密度维持在30,000个细胞/cm2，所述混合物包含5％(v/v)FBS、2.5μgEGF、25mg BPE、1X ITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂)和抗生素/抗霉菌素。将细胞在潮湿的5％C02培养箱中培养2-3天，从而为细胞提供21％的大气氧含量。两天后，更换培养基，并将培养物在由C02/氮气多气体潮湿培养箱(Sanyo)所提供的2％氧含量环境中放置24小时。经24小时培养后，将细胞用60ml 1XPBS洗涤，然后将其用40ml 0.25％(w/v)胰蛋白酶/EDTA(Gibco)移除。移除后，用等体积的含10％FBS的KSFM中和细胞悬液。然后通过在300xg下离心将细胞洗涤10分钟。洗涤后，将细胞再悬浮于20ml KSFM中并转移至50ml圆锥管中，并收集样本以进行细胞计数。一旦采用台盼蓝排除法确定了细胞数量，则收集1,000,000个细胞作为RNA样本，在PBS中洗涤，并在液氮中急冻。将细胞在PBS中再次洗涤，并通过在300xg下离心5分钟来收集。将洗涤的细胞沉淀再悬浮于密度为37,500,000个细胞/毫升的KSFM中。
采用密度分级梯度分离富集特定生物活性肾细胞：
采用密度分级梯度法将主要由肾小管细胞构成但包含其它细胞类型(集合管细胞、肾小球细胞、血管细胞和内分泌细胞)的小亚群的培养肾细胞从多种浓度w/v的碘克沙醇(Optiprep)中分离到其组分亚群中。在收集并施加至梯度之前，将培养物置于低氧环境中并保持24小时。通过在无菌15mL圆锥管中将四种不同密度的培养基放置在彼此顶部，其中将密度最大的溶液置于底部并将密度最小的溶液置于顶部，从而形成分级梯度。将细胞施加至分级梯度顶部并离心，这导致细胞群根据大小和颗粒度离析成多条带。
简单地讲，采用KFSM作为稀释剂，形成7％、11％、13％和16％的(60％w/v碘克沙醇)密度。例如：对于50ml 7％(w/v)
Figure BDA0000073731760000812
将5.83ml60％(w/v)碘克沙醇原液添加到44.17ml KSFM培养基中并通过翻转充分混合。将设置有连接至无菌毛细管的无菌L/S 16 Tygon管的蠕动泵(Master Flex L/S)的流速设定为每分钟2mL，并且将四种溶液各取2mL装入15mL无菌圆锥管中，其中初始浓度为16％溶液，接着为13％溶液、11％溶液和7％溶液。最后，将包含75,000,000个培养的啮齿动物肾细胞的2mL细胞悬液加载到分级梯度(按照“肾细胞培养”中所述形成的悬浮液)的顶部。重要的是，当启动泵以将梯度溶液递送到管中时，应注意使流体以45°角沿管侧缓慢往下流，以确保梯度的各层之间形成适宜的界面。然后将载有细胞的分级梯度在800xg下连续离心20分钟。离心后，将管小心移走以免于干扰各界面。形成五种不同的细胞组分(4条带和一种沉淀)(B1-B4，+Pellet)(见图48，左圆锥管)。用无菌一次性无菌胖肚移液管或5ml移液管收集各组分，并在表型和功能上对其进行表征(见实施例10)。当将啮齿动物肾细胞悬液在分离后就立即进行分级梯度分级分离时，富集肾小管细胞(并包含来自集合管的一些细胞)的组分分段至介于1.062g/mL至1.088g/mL之间的密度。相比而言，当在体外培养后便进行密度梯度分离时，富集肾小管细胞(并包含来自集合管的一些细胞)的组分分段至介于1.051g/mL至1.062g/mL之间的密度。相似地，将啮齿动物肾细胞悬液在分离后就立即进行分级梯度分级分离时，富集epo生成细胞、肾小球足细胞和血管细胞(“B4”)的组分在介于1.025g/mL至1.035g/mL之间的密度处分离。相比而言，当在体外培养后便进行密度梯度分离时，富集epo生成细胞、肾小球足细胞和血管细胞(“B4”)的组分在介于1.073g/mL至1.091g/mL之间的密度处分离。重要的是，细胞在培养后向“B2”和“B4”组分中的分配可通过在收集和分级梯度步骤之前将培养物在低氧培养环境(低氧定义为＜21％(大气)氧含量)下暴露(约1小时至约24小时)来增强(有关低氧对带分布的影响的其它细节在实施例9中提供)。
通过用3倍体积的KSFM稀释来洗涤每条带，充分混合，并在300xg下离心5分钟。将沉淀再悬浮于2ml KSFM中，并采用台盼蓝排除法和血细胞计数器对成活的细胞进行计数。收集1,000,000个细胞作为RNA样本，在PBS中洗涤，并在液氮中急冻。将来自B2和B4的细胞移植到尿毒症和贫血雌性大鼠中进行研究，所述大鼠经由Charles River Laboratories中的两步5/6肾切除手术步骤而得到。通过定量实时PCR确认B4的特征，包括促红细胞生成素和vEGF的氧调节表达、肾小球标记物(nephrin、podocin)的表达和血管标记物(PECAM)的表达。‘B2’组分的显型经由上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白和水通道蛋白-2的表达来确定。见图49a和图49b。
因此，采用分级梯度策略不仅可富集稀少的epo生成细胞(B4)群，而且也是生成相对富集的功能性肾小管细胞(B2)组分的手段(见图50和51)。分级梯度策略还使得epo生成细胞和肾小管细胞可与红细胞、细胞碎片和其它可能不需要的细胞类型(诸如大细胞集合体和某些类型的免疫细胞)分离。
分级梯度步骤可能需要根据用于使细胞组分良好分离的比密度进行调节。用于调节梯度的优选方法涉及1)进行连续密度梯度操作，从梯度底部的高密度(例如，16-21％Optiprep)到梯度顶部的较低密度(例如，5-10％)。可根据标准方法(Axis Shield)由任何标准密度梯度溶液(Ficoll，Percoll，Sucrose碘克沙醇)制备连续梯度。将目标细胞加载到连续梯度上，并在800xG下连续离心20分钟。具有类似大小和颗粒度的细胞在梯度中趋于一起分离，使得可测量梯度中的相对位置，并且还可测量该位置处溶液的比重。因此，随后可得到确定的分级梯度，该梯度重在根据特定细胞群在特定条件下贯穿密度梯度的能力对其进行分离。当将细胞从患病与健康组织中分离时或将特定细胞从不同物种分离时，可能需要利用此类优化。例如，对犬科动物和人肾细胞培养物进行优化，以确保在大鼠中鉴别的特定B2和B4亚群可与其它物种分离。用于啮齿动物B2和B4亚群的最佳梯度由7％、11％、13％和16％(w/v)的Optiprep组成。用于犬科动物B2和B4亚群的最佳梯度由7％、10％、11％和16％(w/v)的Optiprep组成。用于人B2和B4亚群的最佳梯度由7％、9％、11％和16％(w/v)的Optiprep组成。因此，表8中提供了用于对来自经培养的啮齿动物、犬科动物和人肾细胞的B2和B4进行定位的密度范围。
表8.物种密度范围
Figure BDA0000073731760000831
实施例9-梯度之前的低氧培养影响带分布、组成和基因表达
为测定氧条件对原型B2和B4的分布和组成的影响，在梯度步骤前将来自不同物种的新肾细胞制剂暴露在不同的氧条件下。
采用大鼠细胞分离和启动培养的标准步骤构建啮齿动物新肾增强(NKA)细胞制剂(RK069)，如上所述。所有烧瓶均在21％(大气)氧条件下培养2-3天。更换培养基，并将一半烧瓶重新安置至设定为2％氧的氧控培养箱中，同时将剩余的烧瓶在21％氧条件下再保持24小时。然后采用上文所述的标准酶收集步骤收集每组条件下的细胞。根据标准步骤制备分级梯度，并分别收集“常氧”(21％氧)和“低氧”(2％氧)培养物并一起施加至相同的分级梯度中(图71)。虽然在两种条件下均产生4条带和沉淀，但整个梯度的细胞分布在21％和2％的氧培养组中不同(表1)。具体地讲，B2的收率随低氧条件而增加，同时伴随B3的减少。此外，B4特异基因(诸如促红细胞生成素)的表达在由低氧培养细胞产生的所得梯度中增强(图73)。
采用犬细胞分离和培养的标准步骤(类似于啮齿动物分离和培养步骤)构建犬科动物NKA细胞制剂(DK008)，如上文所述。所有烧瓶均在21％(大气)氧条件下培养4天，然后将一小组烧瓶转移至低氧(2％)下并保持24小时，同时将一小组烧瓶保持在21％氧条件下。随后，将每组烧瓶收集并使其经受相同的分级梯度(图72)。类似于大鼠的结果(实施例1)，不同于大气氧培养的犬细胞(表9)，低氧培养的犬细胞分布在整个梯度中。B2的收率再次随着梯度前的低氧暴露而增加，同时伴随着在B3中分布的降低。
表9.
Figure BDA0000073731760000841
以上数据显示，梯度前的低氧暴露改善了B2的组成以及特定特化细胞(促红细胞生成素生成细胞、血管细胞和肾小球细胞)在B4中的分布。因此，低氧培养后进行上文所述的密度梯度分离是在整个物种范围内产生‘B2’和‘B4’细胞群的有效方法。
实施例10-将新肾原型移植到肾衰竭和贫血的大鼠模型中
在2008年，对从原生组织中分离和增殖EPO生成细胞进行了首次描述，同时证实了小鼠肾细胞的原代培养物可表达EPO mRNA和蛋白质(Aboushwareb，T等，World J Urol，26：295-300，2008)。随后，将类似的细胞分离和培养方法应用于大鼠、猪和人肾组织，结果发现，来自所有检验物种的培养物均由多种细胞类型构成，包括Aboushwareb等描述的小EPO表达细胞亚群，但主要由肾小管细胞构成，并包括肾小球细胞群，集合管细胞群和血管细胞群。初步实验表明，异质性细胞培养物向尿毒症/贫血大鼠的体内移植可稳定肾滤过，恢复红细胞稳态，并提高整体存活率。综合这些数据表明，一种或多种生物活性细胞组分驻留在异质性原代肾培养物中并能递送显著的治疗有益效果。
本研究的目的是基于体外特化功能特性和体内翻译证据来鉴定异质性肾细胞培养物内所含的生物活性细胞组分。结果发现，在所有评价过滤性、红细胞生成和生物体功能的一系列临床参数方面，肾小管富集亚组分(B2)和包含氧调节EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞的亚组分(B4)比异质性混合物(UNFX)更有效且更持久。本文展示了各个亚组分的特定体外特征和体内表现。
为了确定异质性新肾细胞群的特定组分的具体效果，制备B4组分(富集EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞)和B2组分(富集肾小管细胞而缺乏EPO生成细胞、肾小球细胞、血管细胞)，并将其移植到肾衰竭和贫血大鼠模型中。该研究计划在表10中示出。
组织获取和原代细胞培养
由购自Hilltop Labs的雄性Lewis大鼠供体构建原代肾细胞培养物。将样本在4℃下于Hypothermasol(BioLife溶液)中运送，并在24小时的收集期内接收。细胞根据此前公布的方法(Aboushwareb，T等，World J Urol，26：295-300，2008)分离原代肾，并在组织培养处理的聚苯乙烯烧瓶或盘中培养，其在高糖DMEM的50∶50混合物中的密度为每平方厘米30,000个细胞，所述混合物包含5％(v/v)FBS、2.5μgEGF、25mg BPE、1X ITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂)和抗生素/抗霉菌素(均得自Invitrogen)，培养条件为37℃、加湿的5％CO2、大气氧(21％氧)。对于涉及低氧暴露的实验而言，将培养物转移到37℃的低氧(2％)条件下培养24小时，然后收集细胞以进行分析。为了收集或连续传代，用0.25％胰蛋白酶EDTA分离所培养的细胞。将为进行基因表达分析而收集的样本在液氮中急冻，并储存在-80℃下，然后分离RNA。标准密度梯度技术适于在培养后(14、28、36)分离细胞，以产生富集特定肾细胞类型(包括肾小管细胞、血管细胞、集合管细胞、肾小球细胞、氧调节EPO生成细胞)的亚组分。简单地讲，使用无菌等渗缓冲液中浓度范围为7-16％(v/v)的碘克沙醇(OptiprepTM)制备多元梯度。将低氧暴露的细胞层铺在分级梯度顶部，并在25℃下以800xg连续离心20分钟。按顺序从顶部(B1)到底部(B4)收集细胞组分(离心后在梯度中呈明显的带)。经由台盼蓝排除法评估成活力，并采用血细胞计数器手动进行计数。
试验品：递送至肾的细胞原型在下文列出。B2和B4亚群剂量的选择基于其对上述实施例7中所测异质性细胞混合物的相对定量作用。
UNFX由通过肾组织的解离和体外培养而生成的未分化的异质性肾细胞混合物构成。分离和培养条件有助于细胞株的构建，该细胞株主要由肾小管细胞构成，但也包含集合管细胞、肾小球细胞、内分泌细胞、血管细胞和其它细胞类型的较小亚群。
B2是一种相对丰富的UNFX亚群，其包含能够在体外稳定吸收白蛋白的近端肾小管细胞，包含一些远端肾小管细胞和集合管上皮细胞以及仅痕量的其它细胞类型。
B4是一种稀少的UNFX亚群，相比B2或UNFX，其富集低氧应答EPO表达细胞以及肾小球足细胞、特化的血管细胞和通过低前向散射和侧向散射(大小和颗粒度)表征的细胞群。
免疫细胞化学
在通过梯度后，对来自B2和B4的细胞进行继代培养，并且经免疫细胞化学分析，这些细胞通过远端和近端肾小管标记物的表达来表征。将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种，并在96孔组织培养处理板(BD Falcon353219)上培养到85％汇合，然后在室温下于冰冷的丙酮/甲醇的1∶1混合物中固定10分钟。将固定细胞在PBS(Gibco)中洗涤两次，并在含0.5％BSA(Sigma)的PBS中封闭10分钟。封闭细胞与原代小鼠单克隆细胞抗体同时共标记在神经钙黏着蛋白IgG1(BD Biosciences 610921)和上皮钙黏着蛋白IgG2a(BD Biosciences 6101822)上，两者均为3μg/ml/4℃/过夜。同型匹配的对照组(分别为小鼠骨髓瘤IgG1(Zymed 02-6100)和小鼠骨髓瘤IgG2a(Zymed 02-6200))，也在3μg/ml/4℃/过夜条件下施加。将最初标记的细胞在PBS洗涤3次，并用二抗标记：山羊抗小鼠IgG1 Alexa488(分子探针A21121)和山羊抗小鼠IgG2a Alexa 647(分子探针A21241)，均以浓度1μg/ml在室温下避光保存30分钟。将细胞在PBS中洗涤3次并使用BD Pathway 855生物成像仪(Becton Dickinson)成像。
基因表达
使用得自ABI和ABI棱镜7300实时PCR系统(Applied Biosystems；Foster City，Ca)的编目TaqMan探针和引物组，经由定量实时PCR(qRTPCR)来检查靶基因的表达水平。18s rRNA可用作优势表达基因的内源性对照，并且用Peptidylprolyl异构酶B(PPIB)标准化低丰度转录本。购自OriGeneTechnologies(Rockville，MD)的多重校准器用于比较目标转录本(包括全肾组织和Origene肾cDNA)的相对量。下列Taqman引物和探针组购自ABI(FosterCity，Ca)。促红细胞生成素，Rn01481376_m1；低氧诱导因子2α(HIF2α)Rn00576515_m1；Kdr，Rn00564986_m1；上皮钙黏着蛋白，Rn00580109_m1；Cubilin，Rn00584200_m1；CYP2R1，Rn01423150_m1；Nephrin，Rn00575235_m1；podocin，Rn00709834_m1；Custom SRY：正向引物AAGCGCCCCATGAATGC：反向引物AGCCAACTTGCGCCTCTCT：探针TTTATGGTGTGGTCCCGTG-MGB。
外科手术和体内分析
进行两步5/6肾切除术(5/6NX)的雌性Lewis大鼠购自Charles RiverLaboratories(CRL)，并运送到Research Triangle Institute，International(RTI)，其中将大鼠安置，进行监测，并进行各种治疗程序(治疗组和详细信息见表10)。手术程序后，经由每周的血清学分析确认治疗前患有尿毒症。由CRL和RTI各自的动物护理和使用委员会机构(IACUC)管理和护理动物的健康。在麻醉之前，使大鼠在异氟醚室(4-5％)中镇静，并在经由鼻锥施用的异氟烷吸入剂(3％)下保持整个手术过程。将细胞通过右背外侧切口直接递送到肾的残余部分，通过配备有23G针头发无菌1cc注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes NJ)将体积为100μL的无菌盐水中的细胞(5x106UNFX或B2，1x106B4)移植到内实质中，并在在植入后持续达6个月。细胞递送后，将1ml的无菌温盐水添加到腹膜腔内用于水合，使用4.0Vicryl缝线缝合肌肉层，然后用伤口夹(两者均得自Ethicon Inc.，Somerville，NJ)封闭外皮。术后施加氧气(经由吸入/鼻锥)，监测动物直到其警觉并有意识为止。手术后立即向大鼠的腹腔内注射0.5cc(0.3mg/ml)丁丙诺啡(Buprenex)。第二天，对大鼠施用(经口腔灌服)0.6毫升(1mg/ml)反胺苯环醇来控制疼痛。对接受重组人EPO(R&D系统)的大鼠经由腹膜内注射每周给药两次，剂量为100IU/kg或500IU/kg。在整个研究中，每周经尾静脉或眶内出血抽取血液进行血清学和血液学分析。每周对BUN、sCREAT、HCT和RBC#进行跟踪，而完整的血清和血液分析在初期(治疗前)、研究中期(12-14周)和尸体剖检时进行。在尸体剖检中，对一个或多个肾、心脏、肝、脾进行称重并将其冷冻且经福尔马林固定/石蜡包埋切片以供利用。还收集股骨和胸骨进行组织病理学分析，注意固定前使骨髓暴露。每周采集体重数据。
对下列编号的第1组RK68大鼠进行手术/抽血：66、36、59、46、63、34、32、79、54、43、67、52、76、51、78、44、62、48、69、71、74、33、77、81、82、83、86和87。对下列编号的第2组RK69大鼠进行手术/抽血：68、38、70*、37、31、65、45、41、64、42、50、35、58、80、56、57、72、75、49、61、39、55、84、85、88、89和90。对下列编号的RK70大鼠进行手术：70和65。
肾和骨骼的组织病理学评价
尸体剖检后，将残肾称重并沿纵向一分为二。一半用于制备冷冻切片和分离DNA与RNA，另一半在10％的福尔马林缓冲液中放置24个小时，然后转移到70％乙醇中，运送到组织病理学实验室(Premier Laboratories，Colorado)。使组织脱水，经石蜡包埋，切成5微米的切片，用苏木精和伊红(H和E)，Masson Trichrome和过碘酸希夫(PAS)染色，均按照标准实验室程序进行。收集左股骨并使用上述方法对其进行组织学研究，并用H&E染色。肾小球损伤通过肾小球膜基质的节段性肾小球硬化和/或与肾小球毛细血管丛粘连和/或Bowman囊增厚的透明变性的增加来表征。肾小管损伤通过肾小管萎缩，扩张，淋巴细胞积聚，内腔蛋白管型积聚，肾小管坏死和间质性纤维化来表征。使用H&E染色对股骨切片进行微观评价。在200和400原始放大倍数下检查切片，以检查骨髓细胞含量和骨髓细胞与红细胞比率的任何增加/减少。
测量：每周对动物进行称重，每两周进行血清学和血液学分析，得到移植前后肾功能(BUN和CREAT)和红细胞生成(HCT和RBC)的存活期评估。在初期、第6周、第12周和尸体剖检前进行总血清和血液分析。尸体剖检时，将器官(肾，、肝、脾、心脏、肺)称重并收集用于组织学研究。收集股骨骨髓进行组织学研究和骨髓涂片分析。
表10.研究计划
Figure BDA0000073731760000891
结果
候选生物活性细胞群(B2和B4)的生成和区室表征
体内试验研究明确表明，能够增强肾功能的生物活性细胞包含在所培养的肾细胞(见实施例7)的异质性群(UNFX)中。根据以往研究中由UNFX群的递送而影响的临床参数，影响肾稳态的理想候选细胞群为功能性肾小管细胞(基于肌氨酸酐排泄和蛋白质存留的改善)、肾小球细胞(基于蛋白质存留的改善)以及皮髓交界高度特化氧应答EPO生成细胞(基于红细胞生成的修复)(Maxwell，PH等，Kidney Int，52：715-24，1997；Obara，N等，Blood，111：5223-32，2008)。在大鼠以及其它物种构建和增殖的肾培养物中证实肾小管细胞、肾小球细胞和Epo生成细胞的存在。对密度梯度法(Qi，W，等Nephrology(Carlton)，12：155-9，2007；Gesek，FA等，Am J Physiol，253：F358-65，1987；McLaren，J等，Hum Exp Toxicol，14：916-22，1995)进行调整和优化，以使得由构建的UNFX异质性细胞群培养物再生一代不同的细胞亚组分(B1至B4)。该亚组分基于功能，分子和表型特征，彼此区分并与UNFX区别开来，两种亚组分(B2和B4)被选作进行进一步体外和体内研究的生物活性候选物。
基于肾小管细胞相对富集程度，选择代表UNFX混合物显著(从约20％至约50％)组成的亚组分B2，其为构建和扩增的UNFX培养物中的主要细胞类型。进行靶向基因表达分析，以评估肾的主要细胞区室到B2和B4亚组分的相对分布。亚组分B2相对缺乏血管细胞(kdr+)、肾小球细胞(nephrin+、podocin+)和EPO生成细胞(图774d-h)。与临床相关肾小管细胞功能相关的两个近端肾小管标记物明显富集于B2中，维生素D羟化酶(CYP21R)(4.3倍富集)和Cubilin(3.0倍富集)。大多数(＞75％)远端肾小管细胞(上皮钙黏着蛋白+)和集合管细胞(D.biflorus凝集素+、水通道蛋白-2+)定位在亚组分B1中，其未被选择以在这些研究进行进一步评估，这是因为相对缺乏白蛋白转运cubilin+细胞和存在其它不需要的特征。然而，相对于B4，远端肾小管标记物(上皮钙黏着蛋白)的表达相对富集于B2中(1.6倍)(图74c)。
基因表达数据的定量差异以表格形式给出(图74i)。通过对神经钙黏着蛋白(近端)和上皮钙黏着蛋白(远端)进行免疫荧光染色来定量确定B2和B4的近端和远端细胞组分在蛋白质水平上的相对分布(图74j、k)。与近端肾小管细胞相关的主要功能是对来自肾小球滤液的白蛋白进行受体介导的重吸收，从而减少蛋白尿和促进血清蛋白稳态(7)。用于获取cubilin/巨蛋白介导的白蛋白吸收(45)的功能分析适于证实B2亚组分的cubilin表达细胞中的高效蛋白质运送活性(图75a)。相反，很少在B4亚组分中检测到cubilin蛋白质表达和白蛋白吸收(图75a)，证实了在基因表达水平上观察到B2和B4的不同细胞组成。通过主动运送的低温抑制，通过肾小管细胞进行的受体介导的白蛋白运送显著降低(数据未显示)，通过使用竞争性抑制剂(受体相关蛋白(RAP))阻断cubilin/巨蛋白-介导的内吞作用(30)来证实吸收的特异性(图75a)。
B4亚组分代表未分化(UNFX)细胞群的稀少组分(＜10％)，其由若干特化细胞类型组成，基于体外特征，这些细胞类型均具有明确的理论治疗价值。根据低氧应答Epo生成细胞、肾小球足细胞和血管源性细胞的相对富集选择B4亚组分(图74-76)。先前对UNFX群的流式细胞术分析表明，Epo表达细胞不同于UNFX群中的肾小管细胞，其进一步通过小细胞(低前向散射)和低颗粒度(低侧向散射)(34)来表征。B4亚组分富集约15倍的小的、低颗粒度细胞，其响应低氧刺激而使Epo表达显著上调(图74g、h、i，图75b)。B4亚组分同样也富集约200倍的肾小球足细胞(nephrin和podocin)和约15倍的血管细胞(Kdr)(图74i)。
B2和B4在患有进行性肾衰竭的大鼠中的体内功能比较。
存活率和体重增量
涉及UNFX细胞肾内移植的试验研究表明，UNFX群包含生物活性细胞，其能够稳定过滤/尿生成，并可在原位移植3个月后恢复红细胞稳态。B2(白蛋白吸收)和B4(氧调节Epo生成)的细胞组成和功能特性使得两种亚组分均可作为UNFX群的生物活性组分而用于进一步研究的理想候选物，可能是分别观察到的过滤改善和红细胞生成增强的体内效应的原因。雌性尿毒症/贫血大鼠通过两步5/6肾切除术得到，确定进行性病情后，原位递送同系雄性细胞，损伤后5-6周，肾切除大鼠相比健康对照组血清肌氨酸酐水平已大于250％(0.76±0.02对0.3±0.00)，并且血细胞比容减少了8％(41.8±0.67对45.6±0.70)。按此前的研究递送UNFX细胞，并且将B2和B4亚组分以分别接近其在UNFX群中所占的比例的剂量进行递送；每只大鼠为5×106B2和1×106B4。另外的对照组包括仅递送载体(PBS)，和每周两次的重组人Epo蛋白(rEpo)，剂量为100IU/kg和500IU/kg。所有未操作的健康对照组和假手术Nx大鼠在研究周期间存活(肾切除术后30周)。根据以往的研究预计，100％的未经治疗的Nx大鼠在肾切除手术后22周内死亡(图76a)。在治疗组中，100％B2治疗的大鼠在治疗后存活了6个月，B4治疗和UNFX治疗的大鼠在治疗后6个月的存活率分别为20％和0％。用100IU/kg rEpo治疗的大鼠在治疗后6个月的存活率为25％，类似于B4(EPO生成细胞组分)治疗。相比之下，用500IU/kg rEPO治疗导致死亡加速，100％的经治疗的大鼠在开始给药方案后14周内死亡，大部分在死亡时严重贫血。具体而言，相比健康对照组，高剂量(500IU/kg)rEPO在一个月将HCT和RBC的水平提高到健康对照组的125％以上，导致严重贫血和死亡，而低剂量(100IU/kg)rEPO将HCT和RBC维持在较高的正常范围并保持1个月，75％的大鼠经过3个月后出现贫血(见图53-55)。还应指出的是，重组EPO不能支持超过4周重复给药的6/8大鼠的红细胞生成。rEpo治疗后的存活率较差，可能是因为骨髓耗尽和针对rEpo的抗体的产生共同所致，这与先前所描述的免疫抵抗人Epo一致(Campeau，PM等，Mol Ther，17：369-72，2009)。
如图52所示，EPO富集(B4)细胞以两种不同的剂量(高与低，分别为1M和0.1M)施用，并在16周超过重组EPO组。具体而言，如下表11所示，通过使用EPO富集细胞使血细胞比容恢复到正常健康水平的95％。此外，相比重组EPO蛋白，发现递送EPO富集细胞时得到的结果中变化更小。
相比非EPO富集治疗组而言，治疗16周后测得EPO富集治疗组的体重增量也有所提高(见图58)。健康对照组和假手术Nx大鼠在整个研究过程中体重增加了平均30％，而未经治疗的Nx大鼠在其死亡时平均损失其初始体重的5％(图76b)。与此相反，B2治疗的大鼠在治疗6个月后体重平均增加了14.3％(p＜0.0001)(图76b)，表明饲养和整体健康的在生物体水平显著改善。B4和载体组也显示出显著高于Nx动物的体重增量(B4：p＝0.0239；载体：p＝0.0125)。慢性高血压可以是CKD的致因和结果；无论病因如何，慢性全身性高血压会对心脏造成过度的负担，结果由于显著的左心室肥大(LVH)而导致相对的心脏肥大(Foley，RN等，Kidney Int，47：186-92，1995)。高血压和LVH已在肾切除的啮齿类动物模型中得到证实(Amann，K等，Nephrol Dial Transplant，13：1958-66，1998)。在本研究中，在尸体剖检时收集心脏重量与体重数据，以确定心脏肥大/LVH是否为Lewis大鼠中两步5/6肾切除引起的肾衰竭的特征，并确定这些治疗的任何一种是否减少或消除了这种心脏肥大反应。相对于正常动物，Nx大鼠心脏重量增加了50％，而用B2治疗的大鼠在治疗六个月后显示其相对心脏重量仅增加了25％(P＜0.0001)(图76c)。虽然不如B2的治疗效果显著，但B4和载体治疗均使心脏重量明显小于未经治疗的Nx对照组。这些数据共同支持了肾调节心血管功能的治疗依赖性增强。
尿毒症和贫血的进展
如上所述，当递送各种治疗物时，经两步5/6肾切除术的大鼠在肾切除术后5-6周出现尿毒症和贫血。在初期(移植前)和整个研究中的每周，通过sCREAT和BUN对尿毒症进行评估，并通过HCT和RBC#对红细胞生成进行评估。
当每组具有足量存活的大鼠使得能够进行充分比较时，通过得自治疗后10-20周的数据对各组的表现进行统计评估。使用得自SAS Institute Inc(Cary，NC)的JMP7.0版对10至20周样本的血清化学结果进行单因素方差分析。此时间范围内，在各治疗组中观察到显著的差异：上图，BUN(p＜0.0001)；(图77d)，肌氨酸酐(p＜0.0001)(图77e)。对第10至20周BUN和CREAT水平的测量值进行ANOVA表明，经过B2和B4细胞治疗的Nx大鼠与单独Nx和Nx+Unfx细胞治疗相比，表现出肾滤过稳定性和较低的BUN和CREAT水平，这表明治疗物的一般肾保护效果。经B2和B4原型治疗的Nx大鼠也显示出血液学参数的改善。在此时间范围内的治疗组中可观察到显著差异：RBC(p＜0.0029)(图77a)；HCT(p＝0.0005)(图77b)。这些数据清楚地表明，相比Nx和UNFX，经B2治疗的大鼠有较高的平均HCT和RBC数量(图77a-c)和较低的平均CREAT和BUN水平(图77d-F)，这表明B2为UNFX的有效生物活性组分，并且B2亚组分的递送(无UNFX的其它组分)同时增加了治疗反应的强度和耐久性。该生物体观察通过经B2治疗的动物中的原生状肾小球，肾小管和肾单位结构的组织学证据得以支持，而在其它组中未观察到此类证据。虽然B4未显著影响过滤功能，但正如RBC#和HCT显著增强所证实(图77a-C)，B4治疗刺激了红细胞生成。定期给予重组Epo导致对红细胞生成的短期刺激，伴随初始阶段的红细胞增多和随后的严重贫血，并最终使接受药物的大多数(7/8)大鼠死亡。在此研究中，重组EPO的不良整体功效可能是由于在具有免疫能力的大鼠体内形成了人EPO蛋白的抗体。
如图57所示，当在治疗后12周进行游泳耐力试验时，肾切除(NX)大鼠的平均游泳时间短于健康大鼠。经未富集新肾细胞治疗的大鼠的平均游泳时间比NX大鼠长，但是具有较大差异性。相比之下，经高剂量B4细胞治疗的大鼠和对照组的游泳时间接近，并且治疗组中的差异性较小。所有治疗组的存活率优于肾切除的未经治疗大鼠。
表11.治疗后12-14周时临床值占健康对照组的百分比
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治疗和未治疗尿毒症大鼠中的肾小管相关功能增强
蛋白质处理和脂类代谢
全面的临床化学分析在研究中期(治疗后12-14周)完成，使得可在大多数大鼠仍然存活并可用于样本采集时对各治疗组进行另外的比较(图78a)。如图78所示，B2治疗增强了进行性肾衰竭5/6Nx模型中肾对蛋白质的处理并改善了血脂异常。将假手术NX、NX、NX+VEH、NX+UNFX、NX+B2和NX Nx+B4标准化为健康对照组，并在第12-14周进行比较(见上表11)。相对于健康对照组，未治疗Nx大鼠的血清白蛋白和白蛋白/球蛋白(A/G)比率分别下降了30％和34％，这证实显著的蛋白质损失是患有CKD的5/6Nx模型的特点(图78)。用B2治疗显著增加了血清白蛋白的水平(p＜0.05)，这表明肾小球滤过机制的完整性得以改善和/或肾小管上皮细胞对白蛋白的重吸收得以增强(图78a、图78b)。经B2治疗的动物(相对于Nx动物)中的血清A/G比率的显著增加(p＜0.05)进一步证实了这一观察(图78a、图78b)。有趣的是，与B2治疗相关的体内观察和B2的关键体外特征一致，即蛋白转运受体(cubilin/巨蛋白)强表达和高效的受体介导白蛋白吸收(图75a所示)。
高脂血症是人CKD(23)和大鼠5/6肾切除CKD模型证据充分的特征(Kasiske，BL等，Circ Res，62：367-74，1988)(图78a、图78c)。中期临床化学显示，B2治疗改善了Nx诱导的血清三酸甘油酯升高，使其恢复到正常水平(图78a、图78c)。B2治疗的大鼠中的血清胆固醇也得以降低，相比Nx组中大于健康对照组水平的250％，经B2治疗的大鼠达到健康对照组的150％的水平(图78a、图78c)。血清胆固醇的改善可间接归因于通过B2治疗使肾滤过功能得以改善，从而在较大程度上排除胆固醇。中期临床分析支持以下观察，即，一系列相关临床参数表明B2在改善肾功能方面具有生物活性，这些临床参数包括与尿液生成相关的参数(sCREAT、BUN、血清白蛋白、A∶G比率)、与红细胞生成相关的参数(HCT、RBC#)、与矿物质平衡相关的参数(钙∶磷)和与脂类代谢相关的参数(三酸甘油酯、胆固醇)。
图59-61还显示，在研究中期，经细胞原型#4(B2)(肾小管富集细胞)治疗的尿毒症大鼠相比未治疗的大鼠而言，其血清肌酸酐随时间的推移得以改善，血清白蛋白稳定并且磷∶钙比率接近正常。图61显示，经细胞原型#2(1M剂量的EPO富集细胞)治疗的尿毒症大鼠也显示磷∶钙比率接近正常。图62-63显示，经治疗的大鼠相对未治疗的尿毒症大鼠而言脂类代谢得以改善。图11显示，经细胞原型#2(B4高)和#4(B2)治疗的尿毒症大鼠具有较低的血清胆固醇和血清三酸甘油酯(见图62-63)。图64和65显示，在经细胞原型#2(B4高)和#4(B2)治疗的尿毒症大鼠中，增加的血红蛋白水平及血细胞比容水平大于正常大鼠的95％，这表明了红细胞刺激的系统性证据。
肾脏质量与肾功能相关
通过治疗后六个月的系统性和组织学分析明确了将B2细胞递送至肾的长期有益效果(图76-79)，这表明细胞可直接或间接提供恢复和/或再生，从而使功能性肾脏质量得以保留和/或再生。用SRY(定位于Y染色体的基因)的探针进行的基于PCR的DNA分析用于证实收集时(治疗后六个月)雄性B2供体细胞在雌性肾组织中的保留性，通过此方法在该时间点估计的雄性细胞占宿主肾的比例相对比较低(约1％)(见图80)。收集残余(Nx、B2、B4和UNFX)或完整的(健康对照组和假手术Nx)右肾来得到死亡后的肾重量。对于假手术对照组而言，未经治疗的Nx肾残余部分的肾脏质量减少了平均43％，而同位接受B2治疗的肾残余部分的平均肾脏质量等于假手术对照组(图79a)。有趣的是，每组的平均肾质量与该组的平均血清肌酸酐值成反比(图79a)。通过线性回归分析进一步证实肾重量和血清肌酸酐之间的互反关系，分析显示每只大鼠的这两个参数之间存在显著的(R2＝0.38)逆相关(图79b)。这些数据说明肾脏质量和肾功能之间存在直接联系，并且再次突出了B2相对于B4和UNFX具有明显的治疗优势。
组织学评估
啮齿动物动物5/6肾切除留下残肾，其最初经历肥大的反应，该反应通过现存肾单位的补偿性扩大使肾脏质量部分恢复，而非形成新的肾单位(Brenner，BM.Am J Physiol，249：F324-37，1985，Kaufman，JM等，Kidney Int，6：10-7，1974)。虽然存在初始的肥大反应，但与肾脏质量损失相关的肾血液动力学的变化最终导致高血压、尿毒症、贫血、肾组织结构的慢性形态破坏。标准组织学技术和染色(H&E、PAS和Masson Trichrome)用于比较假手术Nx、Nx和B2治疗，特别关注经B2治疗的大鼠的肾、骨髓和骨内膜表面(图81a、81b、81c)。在未治疗的5/6Nx大鼠中观察到的组织病理学变化包括中度到显著的肾小球-肾小管损伤，其由伴随节段性至球形肾小球硬化的多灶性至弥漫性肾小球肥大组成，并通过均质嗜酸性材料(蛋白质)替代肾小球基质和中度肾小球膜增生来表征。存在与Nx动物相关的多灶性肾小球毛细血管丛粘连和病灶性肾小球萎缩。此外，Nx大鼠肾有伴随多灶性炎症的轻度至中度肾小管间质纤维化。主要在近端肾小管中观察到多灶性肾小管肥大和增生，并且弥漫性肾小管扩张影响近端和远端肾小管。大多数扩张的肾小管显示出变薄的上皮和增厚的基底膜，其中许多肾小管含有透明管型，这说明了内腔蛋白质的积累。
相比手术模型中观察到的球样形态破坏，B2治疗的肾中的比较显微解剖学特点与健康对照组的肾在形态学上更加一致。具体而言，经B2治疗的肾具有更大比例的健康肾小球、肾小管、肾单位结构，其肾小管扩张减少、肾小管透明管型减少、肾小管间质纤维化降低并且肾小球硬化降到最低(图81a)。虽然经B2治疗的动物的实质内具有偶尔聚集的明显损伤肾组织，但其主要形态与健康对照组一致。相反，相对于Nx动物，经B4治疗的肾在比例上具有更多的健康肾小球和较少的肾小管硬化，但肾小管病状(包括扩张和肾小管管型)与未治疗的Nx对照组相似。此外，经B4治疗的肾通过主要的损伤区域来表征，相比于未治疗的Nx大鼠略有改善，但未接近健康对照组。
认为健康假手术Nx大鼠的股骨和骨髓是正常的，并且无显著的组织学变化。未经治疗的Nx大鼠的骨髓和骨中具有两个组织学特征：1)骨髓中的细胞总量降低、红细胞缺乏并且骨髓细胞∶红细胞比率增加(图81b)；和2)中度骨重吸收，其通过具有普遍破骨细胞的扇形骨内膜表面和腔隙的形成来表征(图81b)。在Nx动物中，存在指示骨质减少的皮质和骨小梁变薄。与Nx组的骨髓相比，经B2治疗的动物骨髓具有更多的自由红细胞、稳态的骨髓细胞∶红细胞比率，并且不存在骨重吸收的组织学证据(B2)。在所有治疗组中，对B2治疗的骨髓应答强度最突出，其骨髓组成和形态学接近健康对照组。
对Nx大鼠中骨质糜烂的组织学观察以及B2治疗大鼠中明显不存在此现象使得需对血清钙和血清磷水平进行另外的评估。与所述肾病末期的骨质营养不良(37)相一致，在Nx动物中观察到高磷酸盐血症和低钙血症(图81c)。正如对股内膜表面组织病理学的观察所预期，经B2治疗的动物的磷和钙水平与健康对照组相同，这表明对这些矿物质的系统性和稳态调节(图81c)。总之，组织学观察结果提供了系统性指标，证明B2可增强进行性肾衰竭啮齿动物模型的肾滤过功能并恢复红细胞稳态。
讨论
由具有特定体外功能特性的选定肾源细胞的原位移植所引起的再生性刺激使得啮齿动物CKD模型的死亡率降低、功能增强并且使体内疾病进展延缓。本文示出的数据提供了这样的系统性和组织学证据，即，相比未分化的异质性混合物，异质性肾细胞群的特定细胞亚组分提供宽泛的临床相关有益效果，对具体的临床参数更加有效，并且使临床效果的耐久性延长了至少50％。在这些研究中比较测试的两种细胞亚组分(B2和B4)通过体外增殖后分离得到，并且其显示具有与过滤(B2)和红细胞生成(B4)相关的独特组成和功能特性。亚组分B2(由近端和远端的肾小管细胞(约90％)和一些集合管细胞(约10％)组成)富集特定的cubilin+/巨蛋白+近端肾小管细胞，这些肾小管细胞具有高效的受体介导的白蛋白内吞作用。鉴于B2的细胞组成和功能特性，观察到此亚组分经由诸如稳定血清肌酸酐和BUN、重吸收蛋白质和平衡电解质的效应使整个肾单位的功能得以增强，这并不令人意外。B2的肾稳态效应伴随着整个生物体水平的显著有益效果，诸如存活时间延长、体重增量增加、血脂特征正常、骨分解代谢减少。合起来，本文提供的生理数据反映了CKD晚期模型中肾功能的广泛且相关的稳定性，经由B2细胞亚组分的移植实现。
6个月时的组织病理学分析直接支持稳定肾功能的生理学证据，显示经B2治疗的大鼠残肾中具有接近原生的肾小管和肾小球形态。通过B2治疗对肾脏质量的恢复(图79)伴随着以下组织学证据：肾小球硬化，肾小管间质纤维化和内腔蛋白质的沉积在B2治疗的肾(相对于未治疗Nx肾)中减弱，并且骨髓中的红细胞生成反应类似于健康对照组(图81)。虽然不太显著，但B4治疗实际也提供了一些明显的组织水平改善，包括肾小球硬化减轻和骨髓中红细胞稳态的恢复。同系雄性供体/雌性受体方法能够通过检测处死时雌性受体肾的基因组DNA中的雄性细胞(SRY)来对组织嵌合性进行评估。通过此方法，移植后六个月在雌性肾中仍可检测到雄性细胞，几率为大约1％。采用每克组织中大约有1亿个细胞的历史估计，以及移植时残肾重约0.8克的估计，递送到肾的B2细胞的剂量(500万个)占残肾的约6.25％。因为B2细胞亚组分主要由功能成熟的细胞构成，这些细胞迄今为止无长期移植干细胞或祖细胞的特点，假定肾的细胞更新率适中，则预期100％的移植细胞不会在体内保留6个月。B2细胞的疾病衰减效应可能是由于具有功能细胞的宿主肾单位的再生(补救)、移植细胞对宿主细胞的细胞保护和再生的影响(调节)、经由移植供体细胞和新生宿主细胞的联合作用使新肾单位再生(nephronogenesis)或这些机制中一种或多种的组合。B2中至今仍未鉴别的组分也有可能对观察到的治疗效果产生影响。例如，免疫调节细胞(如组织特异性巨噬细胞)的存在或缺失也会调节肾的发病机理，特别由于其涉及到纤维化和组织重塑机制。此外，肾的特异性干细胞或祖细胞可切实促进再生机制，诸如上文构思的nephronogenesis。需要对经治疗的肾组织的分子和细胞组分进行控制良好的暂时性研究，以对B2和B4的一种或多种作用机理进行深入的了解。
本研究主要成功测量的是存活率。B2细胞将存活时间延长到治疗后大约6个月(肾切除后30周)，或比未治疗的Nx大鼠(这些大鼠在肾切除后22周内由于肾衰竭死亡)平均存活时间长3个月。在经B2治疗中观察到的存活时间比在其它公布的对肾衰竭进行基于细胞的治疗中观察到的治疗后存活时间长(Kim，SS等，Improvement of kidney failure with fetal kidneyprecursor cell transplantation.Transplantation，83：1249-58，2007；Choi，S等，Stem Cells Dev，18：521-9，2009；Zeisberg，M等，Am J Physiol Renal Physiol，285：F1060-7，2003；Eliopoulos，N等，JAm Soc Nephrol，17：1576-84，2006)。B2治疗组存活较长可能是由于植入细胞递送或诱导的对肾功能的积极效果：过滤(sCrea、BUN)、肾小管重吸收(蛋白质)、电介质平衡(钙、磷)和内分泌(维生素D、Epo)。B2细胞显著影响肾中多个细胞区室的假说通过以下各项进一步得到支持：1)观察到肾重量的增加，其中B2治疗后肾的重量达到年龄相一致的未处理的对照大鼠的重量(图79)；以及2)B2治疗的肾中疾病进行缓慢的清楚组织学证据，包括肾小管间质纤维化减少、肾小球硬化减少，以及伴随肾小管管腔中蛋白质聚集降低的肾小管再生的病灶证据和(图81)，这证实了蛋白质重吸收改善的系统性证据(图78)，并且连同认识到B2细胞中的高效蛋白吸收的体外证据(图75a)。因此，B2对肾功能的稳定减轻了与5/6肾切除模型相关的尿毒症并减少了废物，通过对营养物质的代谢和生理反应(例如显著的体重增量，图76b)、正常的血氧水平(红细胞生成；图77a-c、图78a)以及废物的消除(功能性肾单位；图77d-f、图78)使经治疗的动物存活并健康生长。
5/6肾切除模型中的CKD伴随多种并发症，这些并发症会进一步恶化肾小球的硬化病变和肾小管间质空间。随着尿毒症发病，涉及循环激素生成和调节的器官系统常常会发生功能障碍。在肾中，尿毒症扰乱了肾的正常内分泌功能，例如，维生素D活化、生成Epo并将其递送到骨髓中的红细胞前体中。血清和骨的正常矿化作用需要与甲状旁腺激素反馈平衡的肾调节维生素D活化。在Nx大鼠中观察到的骨质糜烂(图81b)、高磷酸盐血症(图81c)和低钙血症(图81c)与肾病末期的骨营养不良和继发性甲状旁腺机能亢进一致(Ritz，E.J Nephrol，18：221-8，2005)。与此研究中的B2治疗所提供的多种有益效果一致，治疗后满六个月便构建了正常的血清钙/磷平衡并且与健康对照组相等，这强调了B2的长期稳定的治疗效果。贫血是与人CKD和5/6肾切除术模型的进行相关的另一种内分泌功能障碍。虽然基于基因表达分析及体外功能特性预测B4对贫血具有最大的影响(图74、图75)，但B4和B2都对Epo依赖性肾内分泌功能产生了积极影响(图77、图78、图81)。有趣的是，当整体考虑研究结果时，B2治疗比B4治疗使红细胞生成更稳定和更持久。虽然还不了解B2影响红细胞生成的一种或多种机理，但当将这些结果与我们此前的观察(患有重度CKD的人的肾中的局部EPO生成是稳定的)相比时，可行的是在经B2治疗的肾中观察到的稳态组织结构的重建具有提供微环境元素的辅助效果，这些元素对EPO从皮质成纤维细胞到血液的有效释放是必须的。
正如文献所报道和本研究中所观察，经5/6肾切除的大鼠会发生血脂异常(Kasiske，BL等，Circ Res，62：367-74，1988)。意外的是，在B2治疗的动物中观察到正常的血脂水平(胆固醇和三酸甘油酯)。虽然还不了解B2改善血清三酸甘油酯和胆固醇水平的一种或多种细胞机理，但改善饲料蛋白处理(图80)可直接影响肾单位排泄饲料胆固醇、三酸甘油酯和游离脂肪酸的能力。这些数据表明，B2或其它恢复组织稳态的基于的细胞的治疗可能会减少或避免CKD患者群体对用于血脂控制的药物干预的需求(Kasiske，BL等，Circ Res，62：367-74，1988)。
原发性或特发性高血压的发病机理往往与肾病相关(Brenner，BM等，Am J Hypertens，1：335-47；1988，Hoy，WE等，J Am Soc Nephrol，16：2557-64，2005；Silberberg，JS等，Kidney Int，36：286-90，1989)。在5/6肾切除模型肾切除后不久所继发的进行性高血压与高补偿肾小球毛细管压(Kaufman，JM等，Kidney Int，6：10-7，1974)和肾素-血管紧张素II醛甾酮轴中断(Greene，EL，et al.J Clin Invest，98：1063-8，1996z)相关。已证实慢性高血压患者的肾的肾小球比正常对照组少(Keller，G，et al.N Engl J Med，348：101-8，2003)。5/6残肾中肾单位缺失与肾血液动力学变化相关，这些变化包括肾小球滤过率增加(Kaufman，JM，et al.Kidney Int，6：10-7，1974)和肾小球和肾小管肥大(Brenner，BM.Am J Physiol，249：F324-37，1985)。CKD和继发性高血压常常导致LVH(Zolty，R等，Am J Transplant，8：2219-24，2008)，一种可能最终发展为充血性心力衰竭的适应性变化。CKD的心脏并发症由克服外周血管阻力增加或高血压所需的左心室补偿压力所致。相对于未治疗的肾切除对照组和用未分化细胞治疗的组，B2对肾功能的增强显著减弱心脏肥大的发展(图76c)。这些数据提供了另一个实例，其中对(在此例中用于控制血压的)药物干预(即ACE抑制剂或ARBs)的依赖性可通过基于细胞的选择性再生疗法潜在地降低。
在此模型中，这些功能结果不仅反映了对进行性肾病的预防，而且当与肾单位的解剖学改善结合时，表明B2组分还可促进正常肾区室(如肾小球和肾小管)的再生。这些研究表明，B2原型具有保护和恢复与肾的主要区室(如肾小管、肾小球和间质区室)相关的正常细胞和组织功能的潜力。目前正在研究B2细胞促进再生结果的潜在分子和细胞机理。总的来说，这些数据表明，具有体外功能特性的特异性肾细胞可恢复稳态组织结构和细胞环境，以防止或延缓向末期进行性CKD发展。本研究拟进行的基于细胞的再生药物方法类似于对已确定患有清楚的进行性病情，但在肾衰竭发展到需要透析或移植整个器官的末期疾病之前的CKD患者进行治疗。这些结果提供了这种概念和证明，即，再生策略可减少CKD患者群体对透析和药物的依赖，并可能最终使CKD患者的治疗模式从缓和转向治愈。
实施例11-通过体外和体内肾小管功能特性表征的啮齿动物新肾细胞的分离
将按照上述方法分离的细胞接种在OPLA支架上，并在体外灌流培养五天。
同时也分离保持肾小管功能的关键特征的肾小管细胞。如图1所示，这些功能特征通过三维培养系统在体外增强，其中细胞相互作用并形成管状结构。图66还显示，罗丹明缀合的白蛋白由近端肾小管细胞通过协同作用的两个受体(巨蛋白和cubilin)之间的特异性相互作用而吸收。通过添加竞争性抑制剂RAP蛋白来确认白蛋白吸收的特异性，所述RAP蛋白可阻止罗丹明缀合的白蛋白被吸收。
图67显示了培养的肾小管细胞使体内肾功能稳定的能力，其表明相对于未治疗的尿毒症大鼠而言，新肾细胞治疗的尿毒症大鼠的血清肌酸酐(肾功能指标)保持在一个接近正常的水平，62％的未经治疗大鼠在第16周的时间点之前死亡。
实施例12-从人肾中分离肾小管/肾小球细胞
通过通篇所述的酶分离法从正常人肾组织中分离肾小管和肾小球细胞，并使其增殖。通过上述梯度方法，肾小管细胞在培养后于体外富集。如图68所示，表型特性在分离和增殖中得以维持。经由标记的白蛋白的吸收评价的肾小管细胞功能也在反复传代和深低温保藏中得以保留。图69显示，当将肾小管富集群和肾小管缺乏群在3D动态培养物中培养时，肾小管标记物(钙黏着蛋白)表达的显著增加在肾小管富集群中得以表达。这证实当细胞在3D动态环境中培养时，肾小管细胞的富集可保持超过初始富集。
实施例13-经由流式细胞术进一步分离EPO生成细胞
对与实施例8中所述相同的肾细胞培养群进行流式细胞检测分析，以检查前向散射和侧向散射。采用流式细胞仪的分选功能，经由对小的、低颗粒度细胞群进行正向选择来辨别和分离小的、低颗粒度EPO生成细胞群(8.15％)。
实施例14-新肾(NK)细胞原型B2和B4在伴随贫血的肾衰竭大鼠模型递送 体系中的影响
为了确定新肾(NK)B2和B4细胞原型在各种基于生物材料的递送体系中的影响，在3种递送体系原型(CP1、CP2或CP3)之一中将B2和B4原型递送到患病的啮齿动物肾实质中。对于在3种递送体系原型之一中递送以延缓或逆转已患肾病大鼠的肾衰竭和/或贫血的进展的细胞原型，将其比较能力在移植后检查三个月，并通过多系统和组织学参数(包括CREAT、BUN、HCT、RBC#、血清蛋白、体重、相对心脏重量)对其进行评估。
非限制性成功因素包括：
1)原型维持/增强导致稳态HCT和/或RBC的红细胞生成
2)原型得到红细胞刺激的组织学证据
3)如由CREAT和BUN所评估，原型对一种或多种肾功能提供了显著的改善或稳定
4)原型得到肾修复和/或再生的组织学证据，包括(但不限于)：
a.肾小球修复、再生或肾小球新生(glomerulogenesis)
b.肾小管修复、肾小管再生、肾小管新生(tubulogenesis)或nephronogenesis
c.集合管系统的修复、再生或形态形成
5)原型提供与一种或多种肾功能改善相关的生物体水平的改善(体重增量、存活率)
6)原型提供关于多个相关参数的综合有益效果，使得对所有测试原型的治疗特点所进行的伴随肾小管定量评估将所有测试结果的原型标识为有益或中性。
细胞：采用标准方法从雄性供体Lewis大鼠中构建原代肾细胞培养物并扩增。移植前，采用上述群分级方法来形成B2和B4细胞原型结构。
递送体系：在研究中评估三种构建体原型(CP)递送体系。CP1由呈水凝胶形式的透明质酸(HA)构成。CP2由呈多孔泡沫形式的透明质酸构成。CP3由OPLA泡沫构成。
试验品：试验品由细胞或细胞+生物材料递送体系构成。B2细胞原型包含特定的肾小管细胞与极小比例的其它肾细胞类型的混合物。B4细胞原型包含EPO表达细胞、肾小管细胞和特定的肾小管细胞。对于B4/CP1和B2/CP1，细胞在移植前与CP1结合2-4小时。对于B4/CP2和B2/CP2，将细胞在移植前24小时接种到泡沫支架上。对于B4/CP3和B2/CP3，将细胞在移植前24小时接种到泡沫支架上。
用于测试的动物模型：从Charles River Laboratories (CRL，Portage，MI)购得成年雌性Lewis大鼠，其中对大部分大鼠进行两步5/6肾切除术(Nx)(治疗组和详细信息见表12)。将大鼠随机分配到研究组中，在治疗前将对其安置并监测5-8周。动物模型和所进行的手术程序与实施例7和实施例9中所述用的那些相同。如此前的研究，将大鼠在肾切除后保持5-8周，然后移植，以通过每周的血清分析来证实尿毒症。将原型递送到患病肾实质中，并在移植后3个月再次进行。选择此时间段，使得可在最佳的时间进行组织学检查以观察再生，并且在大部分经治疗的大鼠得以存活的同时能够进行比较系统分析。
表12.研究设计
Figure BDA0000073731760001061
手术：通过注入B2、B4、B2/CP1和B4/CP1将细胞和细胞/CP原型递送到病变的肾实质中。将B4/CP2、B4/CP3、B2/CP2和B4/CP3通过手术移植到残肾的远极并用一小片腹脂包裹。
测量：每周对动物进行称重。血清和血液分析对移植前后的肾功能(血清BUN及血清肌酸酐(sCREAT))和红细胞生成(HCT及RBC#)提供了存活期评估。所有血清和血液分析均在初期、移植后6周、移植后12周和尸体剖检前进行(无论是在处死时还是在研究结束时)。在尸体剖检时，对器官(肾、肝、脾、心脏、肺)称重并收集用于组织学研究。收集股骨骨髓用于组织学研究。
结果
在5/6肾切除术4周内受体动物出现了尿毒症病情。未治疗的NX动物均在实验时间范围内(移植后三个月)死亡。该NX大鼠组的贫血使得HCT下降小于10％而RBC#没有显著减少。相比NX大鼠，用细胞或细胞/CP原型治疗的大鼠存活时间更长。在整个研究中收集的血清数据表明，对稳定肾滤过功能而言，B2原型优于所有其它治疗，研究完成后平均血清CREAT仅为0.78±0.13(相比未治疗NX组的1.77±0.7)，BUN仅为34±3.6(相比未治疗NX组的64±17)。所有治疗组的CREAT和BUN水平在下表13中示出。虽然这些NX大鼠中产生的贫血为轻度贫血，但3种原型(B2、B4/CP1和B4/CP2)将HCT％恢复到等于健康对照组的水平。考虑到所有参数和时间点，B2原型在整个研究过程中提供了最综合的治疗有益效果(见下表13)。
用B2、B4/CP1和B4/CP3治疗后0到3个月得到100％的存活率(见图82)。如从此前研究预期的一样，100％的未治疗NX大鼠在移植后12周内死亡。例如在实施例10中，100％的经B2细胞原型治疗的大鼠同健康对照组一样存活到研究终点(3个月)。一只假手术NX大鼠在第四周期间因未知原因而自然死亡。50％的经B4细胞原型治疗的大鼠存活了3个月。当细胞单独递送时，经B2细胞原型治疗的大鼠存活率最高(100％)，其次为B2/CP3(80％)、B2/CP1(66％)和B2/CP2(60％)。相反，经B4原型治疗的大鼠存活率通过所有三种所测生物材料递送体系得以提高(50％)，B4/CP1和B4/CP3的存活率增加至60％，B4/CP2的存活率增加至100％。
如图83所示，B2治疗在整个研究中减少了重量损失，并提高了重量增量(图83a、图83b)。每周测量所有的大鼠的体重(图83a)。通过比较治疗前与死亡时的重量来分别计算每只大鼠的重量增量/损失(图83b)。在健康对照组和假手术Nx大鼠中观察的重量增量与此前对健康雌性Lewis大鼠的研究中观察的3个月重量增量一致。未治疗的NX大鼠中观察的重量损失(约5％)与两步5/6肾切除模型中观察的重量损失一致，其中随时间推移的重量损失在该模型中是典型的。在该研究中，仅健康对照组、假手术NX和NX+B2治疗组显示出了随时间推移的重量增量。其它组的重量与未治疗的NX大鼠一致。
如图84-87所提供，B2治疗的肾功能稳定取决于基于血清肌酸酐和血液尿素氮(BUN)的肾小管功能的稳定。在整个研究中，健康对照组和假手术Nx大鼠的血清肌氨酸酐水平均维持在0.4左右，且差异度较低(84-86)。未治疗NX大鼠的平均血清肌酸酐水平攀升至大于1.2(增长了300％)，之后，大鼠为垂死状态，通知研究兽医将其处死。所有B2治疗的大鼠在研究中存活下来，并且其在整个研究过程中维持稳定的血清肌酸酐水平：从治疗前的平均0.68±0.05到研究结束(治疗后3个月)平均0.78±0.13(见图84-85)。虽然图84示出了所有治疗组，但为了进一步清晰起见，将B2和B4治疗组连同NX组、健康对照组和假手术Nx组一起示出在图85中。误差线代表标准偏差。无递送体系原型(CP1，CP2或CP3)改善B2或B4细胞原型在稳定血清肌酸酐方面的性能。然而，大部分原型优于未治疗的NX组。将每个治疗组的所有时间点数据组合并进行单因素方差分析(图86)。正如预期，B2治疗(圆形)在稳定血清肌酸酐方面优于其它治疗，相对于未治疗的NX组和大部分其它原型提供显著的改善。B2和B4细胞原型在此研究中和实施例10中具有类似的表现。在整个研究过程中，还对所有试验组的血清BUN进行监测，并且这些结果通过在治疗组中显示相似的表现模式支持肌酸酐数据，其中B2原型通过随时间推移的最低BUN值来表征(图87)。
图88-90显示，B2原型在HCT恢复的基础上意外地改善了红细胞生成。在未治疗的NX大鼠中观察到HCT(％)轻度降低，这表明形成于此模型中的贫血继发于肾衰竭。然而应注意，这群大鼠的贫血是轻度和暂时的，因此产生的影响没有此前的研究显著。显示了所有治疗组的HCT(以占健康对照组的百分比表示)(图88)，为了清晰起见，在图中仅示出假手术NX、B2、B4和Nx(图89)。使用单因素方差分析对所有数据进行分析(图9)时，应注意的HCT更类似于B2原型中的健康大鼠(假手术Nx)(见图89，圆形)。有趣的是，通过第3个月时间点的100％存活率表征的B4/CP2原型也显示出对HCT的改善(见图88和图90)。
如图91所示，用B2原型治疗使得相对心脏重量显著降低。5/6肾切除模型通过心脏重量相对于体重的增加来表征。死亡时用肉眼进行观察，NX大鼠左心室壁肥大显著，心脏的平均重量为1.22±0.07克(相比健康对照组的1.13±0.07克)。相比健康组对照组和假手术NX大鼠，所有经5/6肾切除术后的大鼠均具有较高的心脏重量/体重比率(p＜0.05；图中条纹柱)。相比未经治疗的NX大鼠，经B2原型治疗的大鼠心脏重量/体重比率显著降低(p＜0.05*)。该观察结果与此前实施例10中示出的结果一致。虽然相比未治疗的NX组，所有其它原型的心脏重量/体重比率均有所降低，但在统计学上均不显著。
图92示出经B2和B4原型治疗的大鼠中有蛋白质保留的趋势。5/6肾切除术模型的特点是总血清蛋白，白蛋白和白蛋白/球蛋白(A/G)比率显著降低。正如所预期，接受肾切除术的所有大鼠的总血清蛋白显著下降(条纹柱，p＜0.05)。此前的研究中指出，经B2原型治疗的血清蛋白浓度略有增加。在B2治疗的大鼠以及B4和B2/CP2原型治疗后存活的大鼠中观察到蛋白质保留呈提高的趋势，但在统计学上并不显著。
如图93所示，3个月时间点时的组织学评估提供了B2和B4治疗的大鼠肾小管和肾小球健康增强的证据。所有经5/6肾切除术的大鼠的肾在死亡或处死时均通过进行性肾小球和肾小管损伤来表征。肾小管随着含蛋白质管型的聚集而膨胀(在图7中通过PAS染色突出)，并存在肾小管萎缩和肾小管间质纤维化(在图7中通过Masson Trichrome突出)。模型中明显的肾小球损伤包括肾小球周围纤维化、肾小球膜增生，肾小球肥大和一些肾小球萎缩。相比经NX和NX+B4，使用NX+B2治疗的肾通过不太严重的肾小球损伤，较少的肾小管扩张和蛋白质聚集以及显著减少的肾小管间质纤维化来表征。用B4治疗对肾小管膨胀和管型聚集沉积具有一定程度的改善，但相比用B2原型治疗的肾，效果不是很显著。B4治疗也可减轻肾小球损伤。
对原型进行多参数比较能够选择最佳整体原型(见下表13)。每个治疗组中所有大鼠最后测量的每个主要参数(存活率、重量变化、HCT、CREAT、BUN和心脏重量)以表格形式显示。由于一只假手术NX大鼠在研究过程中死亡，因此认为80％或以上的存活率是健康的。等于健康对照组的值以粗体表示。等于或差于Nx的值以斜体表示。未达到健康对照组的平均值但明显优于NX的值被认为是改善的，并其以粗体和下划线表示。合在一起，这些数据对使用B2细胞原型所为CKD再生疗法的组分进行进一步研究提供了动力。在该研究和实施例10所述的研究中，B4细胞原型产生了有限但显著的治疗有益效果。有趣的是，多个参数(包括存活率)显示将B4细胞原型植入基于生物材料的递送体系中可增强B4的效果。
表13.原型的多参数比较
Figure BDA0000073731760001101
根据末期和存活期血清/血液数据，B2原型(NX+B2)显著提供了100％的存活率，这与得自实施例10中B2原型的结果一致。相比单独递送B4的50％的存活率，NX+B4/CP2也提供了100％的存活率，这表明CP2递送体系提供了增强B4细胞原型特异性再生和/或修复的环境。总体而言，以上数据表明，所有原型在3个月时的存活率(％)高于NX大鼠。
下列原型将HCT改善到接近假手术NX的水平：B2、B4/CP1和B4/CP2，并且这些观察结果通过骨髓组织学分析得以证实。当将细胞在均由透明质酸构成的CP1或CP2中递送时，B4的红细胞生成效应得以增强，因此说明可通过引入细胞外环境增强B4的红细胞生成效应，所述细胞外环境部分再现了器官形成期间形成肾的环境。
虽然与此前研究相比，该批肾切除大鼠的HCT反应是轻度(HCT降低量＜10％)，但仍然明显的是，三个种原型B2、B4/CP1和B4/CP2均良好地支持红细胞生成，这可通过骨髓的组织学分析证实。相反，当相比其它治疗组时，两种原型(B2/CP3和B2/CP2)导致HCT降低，这表明当细胞在CP3和CP2中递送时，红细胞稳态效应使得单独递送的B2受到抑制。有趣的是，CP2和CP3原型均为固体多孔泡沫，其不会分布在整个肾中，而单独的B2和B2/CP1(CP1为半固态凝胶)分布在整个肾中，这表明B2的治疗作用可能部分取决于在整个肾中的分布和/或肾中其它细胞类型的紧密接触-两者均可通过使用固定固体支架减少和预防)。
下列原型提供了一些由sCREAT确定的肾功能稳定水平(等级次序)：B2＞B2/CP1＞B4/CP3＞B4/CP1＞B2/CP2＞B4；但其中应该指出是，在这些当中，B2原型提供了最一致的稳定性(研究结束时CREAT为0.78±0.13)，为该组中唯一一种治疗后3个月的存活率为100％的原型。
相比Nx未治疗组，B2原型治疗减轻了经治疗的大鼠的相对心脏重量。这与实施例10中观察到的一致，并可指示一些与血压控制相关的表现水平。
与实施例10中得到的结果一致，在所有B2和B4治疗组中均可注意到下面的趋势(尽管在统计学上不显着)：血清胆固醇和三酸甘油酯降低；血清总蛋白质及白蛋白增加；和血清磷减少。
当考虑所测多个参数的数据时(见上表13)，B2细胞原型在单独递送时在大多数参数方面提供了显著且可再生的有益效果，并且未通过在本研究中所测三种递送体中的任一体系中进行递送而显著增强。B4细胞原型提供了显著的存活率有益效果(50％)并支持红细胞稳态和肾小球修复。通过添加基于生物材料的递送体系使B4在大多数参数中的表现得以增强，其中基于透明质酸的材料(CP1和CP2))在进一步的研究中最值得关注。
总之，B2细胞原型在肾滤过和红细胞生成方面提供了一致的积极有益效果。有趣的是，B4原型也在关键区域提供了显著改善，并且这在将细胞于基于生物材料的递送体系中递送时得以增强。因此，旨在使治疗有益效果最大化的实验可涉及测试细胞和递送体系原型的一种或多种组合。
实施例15-新肾细胞原型的组合在患有伴随贫血的肾衰竭大鼠模型中的效应
为了评估6种新肾(NK)和细胞组合原型(B2、B3、B2/B4、B2/B3、B3/B4和B1/B5)减缓或逆转大鼠肾衰竭和/或贫血进展的比较能力，将6种组合原型经肾内递送到患有肾病的大鼠中。下表14示出了研究计划。非限制性成功因素包括一下内容：
1)一种或多种原型维持/增强导致稳态HCT和/或RBC的红细胞生成
2)一种或多种原型得到红细胞刺激的组织学证据
3)一种或多种原型对一种或多种肾功能提供了显著的改善或稳定，其可通过sCREAT和BUN评估
4)一种或多种原型得到肾修复和/或再生的组织学证据
5)一种或多种原型递送生物体水平的改善(例如，存活率、体重增量、血压)
6)一种或多种组合原型提供的一种或多种有益效果优于单独的(B2)所提供的有益效果
细胞：按照上述方法从雄性供体Lewis大鼠中构建原代肾细胞培养物并扩增。移植前，按照下述方法将(6)细胞原型分离并组合(试验品)。
试验品：试验品由培养的原代细胞组成，使其扩增、增殖，并按照上述分级分离/富集来构建特定细胞亚群。特定组分通过分子性和功能性来表征，以在植入前确认其显型。各组分的特征如下：
B2：主要由肾小管细胞构成，其包含能够进行高效白蛋白吸收的大多数近端肾小管细胞，其中存在一些远端肾小管细胞和集合管细胞。其它已确认的细胞类型(内分泌细胞、肾小球细胞、血管细胞)仅以痕量存在。
B4：由内分泌细胞、血管细胞和肾小球细胞构成，但也包括一些小的肾小管细胞(实际上主要为近端肾小管细胞)。此组分内的一些细胞也具有与肾干细胞或祖细胞群一致的特征(即，低侧向散射和前向散射以及与肾发育相关的标记物表达)。
B1：主要由远端肾小管细胞和集合管细胞构成，同时存在痕量的其它细胞类型。
B3：主要由近端肾小管细胞构成，还存在少量的内分泌细胞、血管细胞、肾小球细胞和祖细胞样细胞(由特定发育相关标记物的表达和通过流式细胞术确定的低侧向散射和前向散射群的存在来定义)。
B5：由极小的细胞、内分泌细胞、血管细胞和性质类似祖细胞的细胞构成；此组分还包含低成活力的细胞，并代表了整体群中极小的一部分。
将细胞组合，以根据其天然存在的混合物(相对于彼此)在正常健康肾中的比率进行测试。
B2：根据此前的实验进行单独测试，该实验证实此组分提供了良好的存活率和肾功能(特别是与肾小管细胞区室恢复相关的功能)稳定性。
B3：单独进行测试，前提是其具有B2的肾小管功能特点，以及包含B4的一些内分泌细胞、肾小管细胞和祖细胞样细胞，因此可提供两种群的有益效果的混合物。
B2/B4：该组合基于以下前提进行测试，即，此前研究中的B2对肾滤过功能的显著影响，并且B4治疗中观察到的较少(但显著)的有益效果(肾小球改善、内分泌功能)可联合提供更加全面的治疗效果。
B2/B3：该组合基于以下前提进行测试，即，此前研究中B2的过去表现以及B3具有的B2和B3的特征。
B3/B4：对此组合进行测试，以确定递送相对较大剂量的祖细胞样细胞、内分泌细胞和肾小球细胞是否会提高治疗价值。
B1/B5：该组合在少量大鼠中进行，以确定集合管细胞和小祖细胞样细胞、内分泌细胞和血管细胞的混合物是否会对所有测试的肾功能提供治疗有益效果(此混合物中存在极少的功能性肾小管细胞)。
用于测试的动物模型：从Charles River Laboratories (CRL，Portage，MI)购得成年雌性Lewis大鼠，在运送之前对多数大鼠进行两步5/6肾切除术(NX)(治疗组和详细信息见下表14)。对于此研究，增加了半肾切除对照组，并且这些对照组采用与形成5/6肾切除术大鼠相同的全肾移除手术、在CRL下形成。所有肾切除大鼠和对照组都交付给RTI International(Durham，NC)，安置并在治疗前大约5周进行监测。该动物模型和供应商进行的外科手术与实施例7和实施例9所使用的那些相同。正如此前研究，在移植前将大鼠的肾切除后状态保持5-8周，经由每周的血清分析来证实显著和持续的尿毒症。将原型递送至病变肾实质，在移植后3个月进行跟踪观察。该项研究一直持续到移植后6个月，以便识别出各种组合原型的耐久性差异。
手术：将细胞原型递送到肾实质中，以靶向残肾远极通过的皮髓交界处。
测量：每周对动物进行称重，每两周进行血清和血液分析，以得到初期(治疗前)至整个研究过程中对肾功能(BUN和CREAT)和红细胞生成(HCT和RBC)的存活期评估。在研究期间以6周的间隔在初期(治疗前一周)、治疗后6周、治疗后12周进行全面的血清和血液分析。在6周、12周和整个研究的剩余时间以6周的间隔通过尾套法测量血压。在10-11周和在整个研究区间间隔进行尿分析。尸体剖检时，将器官(肾、肝、脾、心脏、肺)称重并收集用于组织学研究。收集股骨骨髓进行组织学研究以评估红细胞生成。
表14.研究计划
Figure BDA0000073731760001131
Figure BDA0000073731760001141
大鼠随机分配到各组中
*在移植时，#172的sCREAT大于1.0(大于健康组的两倍)。
**从供应商运送后立即发现在#183和#188的肾切除手术部位产生了脓肿；研究兽医对其进行两周的Clavamox治疗。
结果
受体动物经5/6肾切除手术后的5周内产生了尿毒症病情，正如血清肌酸酐加倍、BUN显著上升和HCT轻度降低所证实。在治疗后12周，B2、B2/B4、B3和B1/B5组的存活率为100％。血清和血液数据显示，相比NX未治疗的大鼠或NX载体治疗的大鼠，所有细胞治疗组均具有较低的平均CREAT和BUN以及较高的HCT。虽然不同组合的任何给定参数始终存在差异，但B2/B4组合最具综合效应，其中数据显示其在以下各方面具有已证实的治疗有益效果：存活率(100％，相对于未治疗组25％)、重量增量(11％，相对于未治疗组-3.5％)、滤过功能(CREAT和BUN稳定)、蛋白质保留水平(通过尿蛋白水平和血清蛋白水平证实)、红细胞生成(HCT％，等于健康对照组)和高血压(相对于未治疗组的30％的增量，全身平均血压仅比健康对照组高10％)。3个月后和末期血清化学分析、组织病理学、尿分析和血压测量支持3-5月的观察结果，该结果显示B2/B4组合在所有参数中具有最佳的表现。
如下表15所示，B2/B4原型将至第20周的存活率提高到100％。B2、B3和B2/B3原型在治疗后20周的存活率为80％。在第20周无NX大鼠存活。B2原型的这些结果与此前观察到的结果(如实施例9和实施例13所示)一致。
图95显示，至第12周的时间点时，多种原型可促进重量增加。分别计算每只大鼠从初期(治疗前)直至其处死或垂死或第12周的时间点期间的重量增量(以变化百分比表示)。在用B2原型治疗的此前研究中观察到重量增量，而在此研究的第12周的时间点处再次观察到重量增量，并且与实施例14中用B2治疗的第3个月时间点的增量百分比一致。不同于此前实验，未治疗的NX大鼠的重量在初期(治疗前)和第12周时间点之间平均增加了5.81％，但只有一只NX大鼠存活至第12周(见图94)。有趣的是，使用Clavamox对Nx组中的三分之二大鼠的切口脓肿进行治疗，因此将大鼠在肾切除后的肾损伤亚急性阶段暴露在抗生素中。鉴于此原因，可认为经载体治疗的NX大鼠(即，无细胞假手术治疗)为本研究的更可靠的对照组。NX+VEH大鼠中观察到的重量损失与此前研究中所见的未治疗大鼠或假手术治疗大鼠的重量损失相似。三种原型B3、B2/B4和B2/B3使治疗的大鼠产生的重量增量大于B2；B3和B2/B4原型还都表现出100％的存活率(见图94)。
B2/B4和B1/B5原型使肾滤过功能至第12周时稳定(图96-97)。此前研究证实，经B2细胞原型治疗后的肾功能(sCREAT和BUN)随时间的推移而稳定。在治疗后12周时间点时，相对于NX+VEH和NX对照组(尽管这两个对照组在第12周时间点处的存活率都降低)，经B2原型治疗的大鼠组表现出较低的sCREAT(3a)和BUN(3b)。在第12周具有100％存活率的组以绿色柱表示；存活率小于100％的组以黑色柱显示。误差线＝STDEV。B2/B4和B1/B5组合原型均略优于B2原型，而其它原型(例如，B3/B4)表现不佳。
至治疗后11周，B2/B4原型中的蛋白质保留水平显著增强(见图98)。在此前的研究中，观察到经B2治疗使血清总蛋白和白蛋白水平改善，而经B4原型治疗，改善程度较低。与此前的研究一致，相比Nx和NX+VEH，经治疗的大鼠中血清总蛋白、白蛋白、A/G比率略微增加，但差异在统计学上并不显著。治疗后11周对所有大鼠进行16小时尿液收集，对这些尿液进行尿分析以测量尿蛋白(uPRO)和其它参数。虽然所有NX大鼠相比假手术NX和HEMI NX具有显著较高的uPRO(p＜0.01)，并且若干种原型表现出uPRO降低的趋势，但只有经B2/B4原型治疗的大鼠的uPRO相对于未治疗的NX大鼠显著减少(p＜0.05)。注意：图中未示出NX+VEH大鼠，因为其尿液收集比其它组整整早4周。将所有尿分析数据均标准化为健康对照组。虽然在统计学上并不显著，但在治疗后6周测量的治疗组血清A/G比率遵循与uPRO水平成反比的关系(比较每组的图98和图99)。在B2/B4治疗组中，治疗后蛋白排泄的减少伴随着血清中该蛋白的保留。
如图100-101所示，至第12周，B1/B5和B2/B4原型支持红细胞生成。正如实施例14中所指出，此肾切除大鼠组中的继发性贫血是轻度的。黑色柱代表第12周时存活率＜100％的组，而绿色柱代表第12周时存活率为100％的组。所示数据为组平均值+/-SDEV。B1/B5和B2/B4原型对第12周时的红细胞生成提供了最强有力的支持。假设B5和B4细胞组分中EPO生成细胞相对富集，这是合理的。虽然不如HCT(5a)显著，但RBC#反映了多个治疗组(5b)中的HCT。
高血压是5/6肾切除术肾衰竭模型中的可测量特征，并可通过B2/B4、B2/B3和B1/B5原型进行部分调节(见图102)。基于对实施例9和实施例13中的整体观察结果，即，一些治疗减轻了5/6肾切除大鼠的心脏肥大，在该研究中以约6周的间隔对血压(BP)进行评估。采用CODA非侵入性尾套BP检测仪(Kent Scientific)对心脏收缩压和心脏舒张压进行测量。在每个时间点对每只大鼠进行至少10次软件验证测量。为了比较各时间点的BP趋势，将每个时间点的每只大鼠的数据均校准为健康对照组在该时间点的平均值。在研究时间点(12周)，相比NX对照组，3种原型(B2/B4、B2/B3和B1/B5)表现出降低平均BP的趋势(统计学上并不显著)。有趣的是，两种原型(B2/B3和B1/B5)实际上显示出从时间点第6周到第12周使BP下降的一些证据(见图102中的箭头)。
表15.
如图103所示，在3-5月时间点的组织学评估为B2/B4治疗大鼠中的纤维化减少、健康肾小管增多、蛋白质管型聚集减少和肾小管硬化减轻(与未治疗的Nx大鼠形成鲜明的对比)提供了证据。与移除一个肾除相关的肾肥大在图103的上图中进行了整体突出，并在图103的下图中从组织学的角度(半Nx)进行了突出。与未治疗的Nx动物形成鲜明对比(截止16周，100％因肾衰竭死亡)，其中纤维化减少、健康肾小管增多、蛋白质管型聚集减少且肾小管硬化减轻。图103中示出的染色是Masson Trichrome，其以蓝色突出纤维化。
治疗后12周的观察结果
在治疗后12周，100％的NX+B2大鼠存活，这与实施例10和实施14中细胞原型的表现相一致。在健康对照组、NX+B2/B4、NX+B3和NX+B1/B5中，第12周时间点的存活率也为100％。在治疗后12周，NX+VEH(25％)和NX(未治疗)(66％)中的存活率最差。所有其它组的存活率均小于100％，但高于NX和NX+VEH。
如整个实施例中所示，随时间推移的重量增量与存活率相关，并且是整体健康的良好指标。在本研究中的第12周时间点处，所有组(除了NX+VEH)的重量均得以增加，但在所有治疗组中，NX+B2/B4重量增量百分比最高，增加了11.3％(相比健康对照组的21％)。
在治疗后12周，NX+B2、B2/B4和B1/B5组中的红细胞生成最接近健康组(假手术NX)。在NX+B2、B2/B4和B1/B5组中实现了肾滤过功能的整体稳定性(通过对sCREAT逐渐下降的消除确定)。
未治疗Nx或NX+VEH大鼠表现出137mm Hg的全身平均血压(相比健康对照组的105)。在经原型B2/B4、B2/B3和B1/B5治疗的NX大鼠(相比NX对照组)中观察到全身平均血压下降的趋势。
经由尿分析和血清化学分析对蛋白质处理的评估显示：1)尿液中的蛋白质排泄量与血清白蛋白/球蛋白(A/G)比率成明显的逆相关；2)经B2/B4原型治疗使尿蛋白排泄显著降低，同时伴随血清A/G比率的升高，这表明此治疗改善了肾的蛋白质处理。
当考虑以上所有参数时，B2/B4组合提供了最佳的有益效果，在大多参数上优于B2及其它原型。
以上述数据强调了工作原型相对于非工作原型的重要差异。总体而言，工作原型在稳定肾功能方面优于非工作原型。具体而言，工作原型在第19周时提供100％的存活率、较低的血清CREAT和BUN、减少50％的蛋白尿，等效的红细胞生成和较低的全身血压。例如，图104示出工作原型在19周期间的血清肌酸酐水平得以改善。作为比较，图105示出非工作原型在19周期间的血清肌酸酐水平(见PPT)。图106进一步示出了工作原型相对于非工作原型的差异。同时还显示相比非工作原型而言，工作原型在减少蛋白尿方面表现更佳。蛋白尿的减少与转运白蛋白的肾小管细胞的存在相关，并且与B4组分(肾小球、血管)组合时效果最佳(见图107)。还显示工作原型在维持血压方面优于非工作原型(见图108)。
不希望受理论束缚，新肾增大原型似乎部分通过介导抗纤维化路径而起作用，这通过纤维化(肾小球和间质)减少得以证实。新肾增大原型似乎能够能够调节细胞外基质(ECM)环境(结构塑性)，这通过HAS-2(透明质酸合酶2)的表达增加得以证明，HAS-2负责合成高分子量透明质酸(HA)(与支持肾形成相关的HA形式)。所公开的新肾增大原型也似乎能够通过吞噬细胞活化来调节免疫系统，因为已在损伤模型中观察到白细胞浸润。因为在一些治疗组织中观察到原始结构，并且新肾增大原型似乎也能够再次引发或刺激其再次引发发育程序(即，肾形成)。此外，新肾增大原型似乎可包含或再次活化能够参与、刺激或引起肾组织再生的组织特异性祖细胞。
研究末期观察
与此前研究一致，特定生物活性亚群和/或这些所测亚群的特定细胞/细胞组合对肾小管、肾小球和/或内分泌功能具有不同的治疗有益效果。以下数据表示研究结束时各组的平均临床化学值(相对于初期值)。
如图109所示，相比Nx对照组，细胞/细胞组合Nx+B2/B4和Nx+B2/B3中的血清肌酸酐在研究结束时显著改善或稳定。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
相比Nx对照组，在细胞/细胞组合Nx+B2/B4和Nx+B2/B3中的BUN(血液尿素氮)在研究结束时得到显著改善或稳定(见图110)。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
相比Nx对照组，细胞/细胞组合Nx+B2/B4和Nx+B2/B3中的血清白蛋白(ALB)在研究结束时得到显著改善或稳定(见图111)。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
如图112所示，相比Nx对照组，细胞/细胞组合Nx+B2/B4和Nx+B2/B3中的总血清蛋白(TPRO)在研究结束时得到显著改善或稳定。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
相比Nx对照组，细胞/细胞组合Nx+B2/B4和Nx+B2/B3中的血清磷(PHOS)在研究结束时得到显著改善或稳定(见图113)。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
如图114所示，相比Nx对照组，细胞/细胞组合Nx+B2/B4中的血清钙(更正蛋白总量[Ca]-0.4[TP]+3.3＝更正蛋白总量)在研究结束时得到显著改善或稳定。用各个动物的初期值减去研究结束时的测量值，然后计算每个治疗组的平均值。示出所选研究组的平均值和标准误差。
在本文所述整个研究中测试的原型功能结果在下表16中示出。如表16所示，细胞/细胞组合B2/B4和B2/B3提供的有益效果超过且优于单独B2所提供的有益效果。
表16.
Figure BDA0000073731760001211
总的来说，以上数据强调了对肾的肾滤过(肾小球)和重吸收(肾小管)功能(sCREAT、BUN、蛋白质保留、钙平衡)的显著改善。重要的是，细胞/细胞组合B2/B4和B2/B3的体内治疗活性协同作用，从而增强了体内再生结果。这些组合原型提供的有益效果超过单独B2所提供的有益效果。
实施例16-来自患病人肾活检组织的肾细胞的分离和扩增
此研究的目的是确定细胞产率、存活率和从患病的小块人肾活检组织中扩增的技术限制。
肾组织获取：手术移植后大约19个小时，(右)肾自NDRI经快递送达。打开包装，用70％的乙醇和BacDown清洁剂充分清洗外部，然后将盛放肾的容器置于组织培养柜中。
肾活检组织采集：从肾中移除脂肪和结缔组织，同时保持肾包膜完整。使用无菌活体取样钳从肾中采集活检组织(n＝8)(未示出数据)。对活检组织中明显的肾盏和肾包膜进行修剪并称重。将每个活检组织放置在15mL无菌圆锥管中，并在37℃下于无钙PBS(活检组织1-4)或含钙PBS(活检组织5-8)中冲洗10分钟。随后，将PBS洗液通过抽吸除去，并对活检组织进行消化步骤。
活检组织消化：将每个活检组织浸入的3mL的在HBSS中的消化缓冲液(4单位分散酶1(Stem Cell Technologies)、含5mM CaCl2(Sigma)的300单位/mL IV型胶原酶(Worthington))中，然后在37℃的水浴中孵育20分钟，并轻微的搅拌。将2mL消化上清液移到新管中，与培养基混合并在浮桶式离心机中以1,100RPM的速度离心5分钟，形成沉淀细胞。对于每个活检组织而言，对从“消化1”释放的细胞进行单独计数并记录数量。然后将细胞在培养基中洗涤(1次)并再悬浮于1mL培养基中，然后置于标记为T25的组织培养处理的烧瓶中。将1mL的新鲜酶消化缓冲液添加到每个活检组织残余部分中，另外使用无菌剪刀将组织残余部分剪碎，然后将活检组织在摇动的37℃水浴中轻微搅拌，以进行另外40分钟消化(“消化2”)。使用100微米的滤网将消化混合物滤过到15mL清洁无菌的圆锥瓶中并与5mL培养基合并。经离心和洗涤(2次)后，将细胞再悬浮于培养基中并计数。在此步骤中，通过添加10％体积的台盼蓝对存活率进行评估。记录细胞数量成活率(％)。
接种：将每个活检组织(消化1+消化2)中释放的所有细胞一起接种到单独的T25烧瓶中。对培养物的培养基进行100％的更换，并且在接种后的48小时拍摄显微照片。
结果
患者信息/确定细胞状态。从患有II型糖尿病和肾衰竭病史的女性供体(85Kg，52岁，白种人)中获得HK0019肾。死因是缺氧、继发性心血管衰竭。在死亡时，存在明显的伴随贫血的肾衰竭的全身性证据(表17)。值得注意的是高BUN和肌酸酐、尿中的高蛋白，伴随有低血清蛋白，低血清钙和高血清磷以及显著的贫血(低血细胞比容，RBC和血红蛋白)。明显在正常范围之外的参数在表17中用粗体表示。
Hk019       最终血清/血液分析
Figure BDA0000073731760001241
Figure BDA0000073731760001251
肾，大体观察。经大体观察，肾为正常大小，但颜色苍白且出现了明显的纤维化区域。平分后(见下图)，组织出现了不良灌注，并且呈苍白色，皮质和髓质之间界限不清。也有大量的肾周围脂肪侵入肾盏。
活组织检查结果(收率和存活率)。记录每个活检组织的初始重量、消化1收率、消化2收率和最终存活率(％)(表18)。采用无钙冲洗步骤处理的活检组织趋于产生主要由单个细胞构成的悬浮液，而采用含钙冲洗步骤处理的活检组织产生主要由细胞群(大小为3-7个细胞)构成的悬浮液。经含钙洗涤得到总收率稍高，但无钙洗涤的整体存活率较高。从所有活检组织中得到的平均细胞收率为7604±807个细胞/毫克组织。8/8(100％)的活检组织形成培养物，该培养物在6天的时间内构建(未示出数据)并扩增。
扩增收率结果。将源自(8)个活检组织中每一者的p0培养物通过胰蛋白酶消化来收集，并使用Nexcellom细胞计进行计数。还计算了存活率(见表19)。大部分(7/8)的源自活检组织的培养物在5天中经历了显著扩增(平均6.0倍)，从而在培养后达到每个活检组织具有平均118万个细胞(未示出数据)。
表19.扩增后收率(p0)
总的来说，HK019人供体肾得自患有显著肾衰竭和贫血的患者。如上述所示，可从患病人肾的活检组织构建培养物，这些活检组织的重量为0.02g，并包括皮质/皮髓交界/骨髓组织，但不包括肾盏和肾包膜。来自患病人组织的肾活检组织在酶消化后的平均收率为7,604+/-807个细胞/毫克组织。在酶消化前进行无钙冲洗步骤可改善存活率，并形成主要由单个细胞构成的悬浮液。在酶消化前进行含钙冲洗步骤可略微提高收率，降低整体存活率，并形成主要由细胞群构成的悬浮液。源自HK0019的所有(8/8)活检组织都得到成活的培养物。随着时间的延长，大多数(7/8)的源自活检组织的培养物随着时间的推移显著扩增，其中5天间的平均扩增倍数为6.0。
实施例17-来自多个物种的肾细胞的分离、培养和扩增
此分析的目的是检查和比较产生自啮齿动物、犬科动物、猪和人肾样本的肾细胞分离物的关键分离、表征和扩增(ICE)性能特征。
肾组织获取：所有肾组织均按照FDA和有关研究用人或哺乳动物组织的使用的制度准则来采集/提供。所有的人样本由国家疾病研究所(NDRI)提供。猪样本(PK01和PK02)以及(2)犬科动物样本(DK01和DK02)由在Chapel Hill的北卡罗琳娜大学(University of North Carolina)的TimothyNichols博士提供。DK03来自正常小猎犬(Jackson Laboratories)。
细胞分离和培养：将接收的组织称重并分离。在一些实验中，通过使用各种大小的活检针来评估最小组织要求。在其它实验中，将可能的最大量组织分离，以便得到可以用于之后实验的低温冷藏细胞库。对组织进行酶消化方法或移植培养以构建p0原代培养物。然后将构建的培养物传代和/或低温冷藏。
结果
产率/特征比较：针对每个类别(参见下表20)计算每克组织的平均产率。除了幼小啮齿动物组织和CKD人组织，大部分的产率都属于17至25百万个细胞/克的范围。还从所有物种实现扩增(图115-117)，并且除了来源于啮齿动物的培养物，来自低温冷藏的培养物均实现了连续传代和重建。还实现了将所有物种的培养细胞分级成特定亚群。在来自所有物种的培养细胞中对EPO基因表达的检测均为可靠的，即使细胞是分离自患病肾组织。在所有物种中都观察到低氧刺激诱导的EPO表达，正常成年大鼠(患病的成年大鼠培养物的确表现了低氧刺激)和正常犬除外。通过检测特定肾小管标记物(水通道蛋白、维生素D羟化酶、Cubilin、巨蛋白)以及通过功能白蛋白吸收测定来测定肾小管细胞的存在/功能。在(图115-117)显示了针对犬、猪和人的生长动力学实例。图118是来自HK019(CKD肾培养物，产生自重量在0.02-0.03g的患病组织活检)(参见上述实施例16的其它细节)的人细胞生长动力学的实例。在图118中，BP3表示具有最低收率的组织活检(自总共8个)而BP5表示一个具有高收率的组织活检。
表20.肾细胞ICE，物种比较。
Figure BDA0000073731760001291
总的来说，可以自啮齿动物、犬、猪和人肾组织实现肾细胞的分离/扩增。可自确认的CKD病例实现肾细胞的分离/扩增。重量小至0.02g的小块组织可以产生肾细胞的可增殖培养物。功能性肾小管细胞和低氧应答epo表达细胞是分离和扩增的肾细胞培养物的组分。
实施例18-具有治疗潜力的细胞可以从正常和具有慢性疾病的肾组织中分离 和增殖`
设计本研究旨在确定当在病情确定后进行递送时，所培养的肾细胞群，包括新近描述的EPO生成细胞(Aboushwareb，World J Urol. 2008 Aug；26(4)：295-300.Epub 2008Jul 8)在肾衰竭的进行性模型和晚期模型中是否能够递送全身有益效果。在啮齿动物中进行的实验性研究表明了群体内所包含的细胞的明确的多因素治疗潜力，并突出了该培养细胞的异质性质，其包含具有明确功能特性的肾小管细胞和内分泌细胞以及其它细胞类型(肾小球、血管和集合管)的突出细胞群。由于自体再生医学途径被预期为针对CKD的潜在治疗，因此必需确定当疾病发展时具有治疗潜力的特定细胞组分是否被保留下来或遗失。因此，自具有构建的CKD的人器官供体收集整个肾组织，以确定功能性肾小管细胞和内分泌细胞是否存在于组织中和能够被成功分离和增殖。本文给出的数据提供了下列证据，即：1)在患有进行性肾病的啮齿动物模型中，包含功能性肾小管和内分泌细胞的分离和扩增的细胞培养物提供了显著的临床相关有益效果；以及2)类似细胞得以保留并可从重症CKD中分离和增殖。合在一起，这些数据支持了针对CKD治疗的基于自体细胞的途径的进一步研究。
材料和方法
细胞分离和培养
如前所述进行初始组织分离以自小鼠肾组织生成异质性细胞悬液(Aboushwareb T等，World J Urol 2008，26：295-300；Joraku A，等，Methods2009，47：129-133)。简单地讲，在采用消化方法(Joraku A，等，Methods 2009，47：129-133)之前，用汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution)(HBSS)(Sigma，St.Louis MO)洗涤大鼠、猪或人肾并进行显微解剖以挑选皮髓交界组织。将显微解剖的组织切碎、称重并在缓冲液中分离，该缓冲液由4单位的在汉克斯平衡盐溶液(HBSS)(Sigma)中的分散酶1(Stemcell Technologies，Vancouver BC)、含有5mM CaCl2(Sigma)的300单位/毫升IV型胶原酶(Worthington Biochemical Corp.，Lakewood NJ)组成。将所得细胞悬液在杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(D-MEM)+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，Carlsbad CA)中进行中和，洗涤并再悬浮在无血清、无补充物的角质细胞培养基(KSFM)(Invitrogen)中。然后使细胞悬液经受15％(w/v)碘克沙醇(OptiPrepTM，Sigma)梯度，以移除红细胞和细胞碎片，然后开始在1∶1的高糖(4.5g/L)DMEM∶KSFM混合物中以每平方厘米25,000个胞细的密度于组织培养处理过的聚苯乙烯烧瓶或盘上培养，所述混合物包含5％(v/v)FBS、2.5μg人重组表皮生长因子1-53(rEGF 1-53)、25mg牛垂体提取物(BPE)、1X ITS胰岛素/转铁蛋白/硒)，并含有1X抗生素/抗霉菌素(都购自Invitrogen)。在一些情况下，采用可选的细胞分离方法并自肾组织构建外植体培养物，其涉及将小的(0.01-0.02g)皮髓交界组织核附着到组织培养处理的聚苯乙烯盘上，随后在与上述同样的培养基中于37℃/5％CO2加湿孵育。在7-14天内，移植组织产生可增殖的细胞培养物，以与自酶消化的组织构建的培养物的相同培养方式对该可增殖的细胞培养物进行继代培养。用含有EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)分离细胞以进行收集或传代。通过台盼蓝排除法评估成活力，并使用血细胞计数器进行手动计数或使用自动
Figure BDA0000073731760001311
计数系统(Nexcelom Bioscience，Lawrence MA)进行计数。
啮齿动物实验性研究
按照前述25、26所述自雄性Lewis大鼠(Hilltop)构建供体啮齿动物培养物。将单层培养物保持在组织培养处理的聚苯乙烯烧瓶上，置于1∶1高糖DMEM和补充KSFM(Invitrogen)的混合物中。在移植之前，用0.25％胰蛋白酶+EDTA(Invitrogen)收集细胞并在pH 7.4的无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)(Invitrogen)中清洗3次，以移除血清和培养基组分。将收集的新肾细胞(NK-CELLS)再悬浮并以1千万个细胞/120毫升无菌PBS(pH 7.4)的浓度分装在无菌管中。在供应商处进行两步5/6肾切除术后，受体大鼠购自CharlesRivers Laboratories。所有大鼠的处理、操作和护理均以符合关于实验动物使用的IACUC和NIH政策的RTI International(Research Triangle Park，NC)进行。将年龄相一致的未处理雌性大鼠作为健康对照组(健康，n＝5)。通过进行肾切除假手术产生另外的对照，其中造成一个切口但不发生肾损伤或组织移除(假手术NX，n＝5)。在系列1，接受细胞移植(10×106NK细胞)的(2)只大鼠和进行肾切除术的(4)只大鼠保持为未治疗的对照组(NX)。在系列2，接受细胞移植(5x 106NK-CELLS)的(5)只大鼠和(4)只大鼠保持为未治疗的对照组(NX)。在手术准备之前，用0.3mg/kg丁丙诺啡(
Figure BDA0000073731760001312
Reckitt BenckiserPharmaceuticals，Inc.，Richmond VA)通过腹膜内注射递送使接受NK细胞的大鼠镇静。通过置于异氟醚室中开始麻醉，并在整个手术过程中通过鼻锥来维持。在做小的背外侧切口以暴露残肾之前，将右背外侧区域剃毛并用聚烯吡酮磺和乙醇清洗。通过配有23G针头的无菌1.0cc注射器(Becton Dickinson，Franklin Lakes NJ)将NK细胞悬液直接递送到肾实质中。用4-0薇乔(Vicryl)封闭肌层，并用伤口夹封闭外皮(薇乔和伤口夹均得自Ethicon，SomervilleNJ)。给动物施用氧气并在手术后监控直到其清醒并警觉。在手术后，所有大鼠均接受另外0.3mg/kg剂量的
Figure BDA0000073731760001313
在整个研究中，每周通过尾静脉或框内出血抽取血液以监测血清BUN和CREAT、HCT和RBC#。在Antech(Research Triangle Park，NC)进行所有血清分析和血液分析。当动物在垂死或研究结束时被处死时，收集身体和器官重量，用福尔马林固定组织样本(肾、股骨和胸骨)，并用石蜡包埋以用于组织学分析。
猪和人组织获得
猪组织由Tim Nichols博士(Department of Pathology，University of NorthCarolina at Chapel Hill，School of Medicine)慷慨提供。遵守University of NorthCarolina at Chapel Hill制定的管理实验动物使用的所有制度政策，在处死时，自成年雄性猪(Sus scrofa)获得CKD和非CKD猪肾组织。样本PK001得自成年雄性繁殖猪，其患有持续了六个月过程的特发性肾病，伴随有sCREAT和BUN值增加，直到患有重度肾衰竭而垂死死亡。样本PK002获得自未患肾病的成年雄性猪。CKD和非CKD人肾组织由国家疾病研究所(NDRI)提供，遵守管理研究用人组织的使用的所有NIH准则。下表21针对每个样本展示了年龄、性别、病因和死因。HK018获自具有六年血管透析历史的供体。HK019获自具有23年NIDDM和8+年未透析并不遵从药物治疗的肾衰竭历史的供体。HK020获自具有8年以上腹膜透析历史的供体。4℃下，样本在ViaspanTM器官保存溶液(DuPont，Wilmington DE)(人)或
Figure BDA0000073731760001321
(BioLife Solutions，Bothell WA)(猪组织)中冰上运输，在收集的24小时之内在Tengion实验室接收。
组织学分析
将所有用于组织学分析而处理的组织在10％缓冲福尔马林中放置24-48小时，随后置于70％乙醇中以运输到Premier Laboratory(Longmont，CO)，用于石蜡包埋和染色。按照标准方案进行苏木精和伊红(H&E)、过碘酸希夫(PAS)和Masson Trichrome染色。用配备有Digital Sight(DS-U1)镜头的NikonEclipse 50i显微镜以100倍、400倍、1000倍和2000倍捕获图像。由兽医病理学家和组织病理学家评价组织，从而评价肾小球硬化、肾小管间质纤维化、肾小管内腔蛋白质管型和基本区室组织的程度。
基因表达分析
如下自肾组织和细胞培养物样本分离RNA：使用QIAshredder(Qiagen，Valencia CA)将组织或细胞均质化，并使用RNeasy Plus Mini isolation kit(Qiagen)分离RNA。验证RNA完整性并通过分光光度分析法定量样本。使用
Figure BDA0000073731760001331
Vilo cDNA合成试剂盒(Invitrogen)来合成cDNA。通过定量实时PCR，使用来自Applied Biosystems(Foster City，CA)的编目Taqman探针和引物组以及ABI-Prism 7300实时PCR系统检测促红细胞生成素(EPO)、上皮钙黏着蛋白(E-CAD)、神经钙黏着蛋白(N-CAD)、Cubilin(CUB)、1α25-二羟维生素D3-24-羟化酶(CYP24)、水通道蛋白-1(AQP-1)、水通道蛋白-2(AQP-2)、肾病蛋白(Nephrin)(NEPH)、Podocin(PODO)、血管内皮生长因子(vEGF)、CD31和vEGF受体(KDR)的表达。将样本标准化为cDNA，其扩增自18s rRNA(用于大量表达的人或啮齿动物基因)、肽酰脯氨酰异构酶B(PPIB)(用于中等表达的啮齿动物基因)或肽酰脯氨酰异构酶A(PPIA)(用于中等表达的人基因)，并根据源肾组织或根据购自OriGene Technologies(Rockville，MD)的相同物种的肾cDNA校准。
免疫学分析
细胞悬液产生自初始组织分离或附着培养物的胰蛋白酶化并通过流式细胞术分析以鉴定和定量细胞组分。采用的抗体包括肾小管标记物E-CAD、N-CAD(都购自Becton Dickinson)、Cubilin(CUB)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz CA)、AQP-1和AQP-2(Abcam，Inc.，Cambridge MA)。用Nephrin(NEPH)(Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco CA)标记肾小球细胞。使用血管标记物CD31(Becton Dickinson)来鉴定内皮细胞。使用单克隆EPO抗体(US Biological，Swampscott MA)和标准间接细胞内染色技术鉴定EPO生成细胞。通过二花豆凝集素(DBA)(Zymed Laboratories，Inc.)的结合鉴定集合管细胞。物种特异性抗体的缺乏和在抗体制剂之间弱的交叉反应性阻止了所有标记物到源自大鼠和猪的细胞的应用。将同种型特异的一抗阴性对照组用于所有实验。用FACSAria流式细胞仪(Becton Dickinson)和FlowJo软件(Treestar，Inc.)分析标记的细胞。使用合适的同种型匹配对照组对阴性群体进行门控。使用多参数分析确定使用细胞内间接染色的肾小管和EPO阳性细胞的相对百分比。用表面肾小管标记物标记细胞后，然后使用透化作用/阻滞缓冲液(含有0.2％Triton X-100和10％山羊血清的PBS)将细胞透化60分钟，沉淀，并在渗透/染色缓冲液(含有0.2％Triton X-100和2％山羊血清的PBS)中再悬浮，该渗透/染色缓冲液包含浓度为1μg/mL/1×106个细胞的EPO一抗(USBiological)。在4℃孵育过夜后，使细胞沉淀，用Triton缓冲液(PBS中的0.2％Triton X-100)洗涤两次，在1mL渗透/染色缓冲液中再悬浮，该渗透/染色缓冲液含有与荧光染料Alexa A647(Invitrogen)缀合的二抗山羊抗小鼠IgG2A，并另外孵育30分钟。然后将细胞洗涤并在1mL PBS中再悬浮，以按照每个生产者的说明，使用FACSAria和FlowJo软件进行分析。作为阴性对照组，将细胞与相同荧光染料缀合的同种型匹配单克隆抗体平行孵育。在一些实验中，也用上述所列的抗体为单层培养物染色并用荧光显微镜观察以进一步验证特定细胞在培养群体内的存在和相对分布。将细胞在96孔组织培养处理的平板(BD Falcon 353219)内培养，密度为10,000个细胞每孔至～85％聚集，并在室温下于4％多聚甲醛(PFA)中固定1小时。将固定的细胞在PBS中洗涤，然后在含有0.5％BSA(Sigma)的PBS中封闭10分钟。然后将封闭的细胞用3μg/μl的一抗或匹配的同种型对照(Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco CA)在4℃下标记过夜。将标记的细胞在PBS中洗涤并用与Alexa 488或Alexa 647(Invitrogen)缀合的同种型匹配的二抗以1μg/ml的浓度在室温避光标记30分钟。在PBS中洗涤细胞并使用BD Pathway 855高容量生物成像仪(Becton Dickinson)成像。
用于检测EPO的等电聚焦和蛋白免疫印迹
使用包埋在Optimum Cutting Temperature(OCT)冷冻介质中的冷冻的整个肾组织用于蛋白质样本收集。将肾的不连续10微米切片(7-8)(包括包膜、皮质、髓质和肾盏)合并放入1.5mL聚丙烯微量离心管中，使融解到4℃，并在13,000RPM下离心1分钟。移除剩余的OCT介质，并在含有50mM Tris(pH 8.0)、150mM NaCl、0.5％NP40和蛋白酶抑制剂混合物(Roche AppliedScience，Indianapolis IN)的缓冲液中裂解组织。在室温下以每2分钟间歇涡旋处理裂解物10分钟。将样本在13,000RPM下离心1分钟并且将裂解上清液转移到新管中。通过Bio-Rad Quick Start Bradford Assay，使用BSA作为标准品确定蛋白质的浓度，并且用裂解缓冲液将样本标准化至浓度最小的样本。也从培养的HepG2细胞(已知表达EPO的人肝细胞系)和NIH3T3小鼠成纤维细胞(阴性对照)制备裂解物。通过添加40μg/样本到每个pH 3-10IEF Gels(Invitrogen)的孔进行等电聚焦(IEF)。在pH为3-10的阴极和阳极缓冲液(Invitrogen)中，使凝胶在100V下电泳1小时，然后在200V下电泳1小时，最后在500V下电泳30分钟。然后按照生产商说明，使用I-Blot系统(Invitrogen)将蛋白质转移至硝化纤维素膜，并在室温下，用溶解于具有0.1％Tween-20(TBS-T)的Tris缓冲盐溶液(Sigma，St.Louis，MO)中的30mL 4％w/v低脂牛奶封闭2小时，同时进行摇动。采用以1∶600稀释于具有2％w/v低脂牛奶的5mL TBS-T(0.1％Tween 20)中的抗人EPO单克隆IgG2a MAb 2871(R&D Systems，Minneapolis MN)将膜在室温下探测过夜。每次用TBS-T将膜洗涤3次/10分钟，然后用以1∶50,000稀释于具有2％w/v低脂牛奶的TBS-T中的HRP缀合的兔抗鼠IgG(Zymed，San Francisco CA)在室温下探测1.5小时，同时进行摇动。将膜每次用TBS-T洗涤3次/10分钟，然后在diH2O中洗涤两次，每次10分钟。按照生产商说明，使用ECL Advance化学发光试剂(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway NJ)形成印迹。
白蛋白吸收测定
通过活化和抑制特异性近端肾小管受体、巨蛋白和Cubilin介导的白蛋白内吞来对肾近端肾小管细胞功能进行评估，正如Zhai等27所述。在标准培养基(含有前述所有补充剂的1∶1高糖(4.5g/L)DMEM∶KSFM混合物)中的96孔板(OptiplateTM，Becton Dickinson)上，将人和猪肾细胞分别以每孔5,000个细胞和10,000个细胞的密度接种，或以每孔25,000个细胞和40,000个细胞(大鼠)的密度接种。将细胞在37℃/5％CO2下进行孵育并生长至～85％的汇合度，然后进行测定。开始测定18-24小时前，用不含酚红、不含血清的低糖(1g/L)DMEM(含1X抗生素/抗霉菌素和2mM谷氨酰胺)更换生长培养基(所有材料均得自Invitrogen)。测定当天，用由不含酚红的低糖DMEM(补充有10mM HEPES、2mM谷氨酰胺、1.8mM CaCl2和1mM MgCl2)组成的测定缓冲液将细胞洗涤两次，并将其在37℃/5％CO2下的加湿室中用测定缓冲液孵育30分钟，以充分暴露在辅因子中。然后将细胞在37℃/5％CO2下在终浓度为25μg/mL的荧光素缀合的或罗丹明缀合的牛白蛋白(Invitrogen)或人血清白蛋白(Abcam，Inc.)中暴露30分钟。将孔用冰冷的PBS洗涤三次以阻止内吞，并立即用包含10μg/mL Hoechst核染料的2％PFA(Invitrogen)固定。为进行抑制研究，利用重组受体相关的蛋白质(RAP)(Ray Biotech，Inc.，Norcross GA)(巨蛋白：Cubilin介导的白蛋白吸收的特异性竞争抑制剂27)来证明反应特异性。将培养物按照上述进行制备，并用1μMRAP和12.5-25μg/mL荧光缀合的白蛋白进行孵育。在进一步的实验中，通过将测定的孵育温度降低至4℃来部分抑制受体介导的白蛋白吸收。在所有情况下，对细胞进行目测检验，并经由BD Pathway 855高容量内容物生物成像仪(B ecton Dickinson)捕获图像。
结果
功能性肾小管细胞和epo表达细胞
在肾功能不全的啮齿动物模型中提供治疗有益效果
根据Aboushwareb等针小鼠所述的方法从雄性路易大鼠中成功分离原代肾细胞培养物(Aboushwareb T等，World J Urol 2008，26：295-30025)，并将其进行表征以确认培养物内的细胞对EPO基因的氧调节表达(图125c中示出)。多种构建的培养物的进一步免疫细胞化学特性表明主要的细胞表型为肾小管(近端或远端)细胞，但也存在肾小球细胞、集合管细胞和血管细胞(图119)。对多种制剂进行的流式细胞分析确认的相对频率为近端和远端肾小管细胞各为20-35％、肾小球细胞为10-15％、血管细胞小于5％、集合管细胞为10-15％以及epo生成内分泌细胞小于10％。Maxwell等将肾中的原生epo生成细胞鉴定为高度特化的间质成纤维细胞，富集在皮髓交界的特定区域28。体内研究已证实，在严重低氧的条件下，表达EPO的间质成纤维细胞数量增加(Eckardt KU等，Kidney Int 1993，43：815-823)，并且已证实在氯化钴中暴露后肾小管细胞中也存在EPO表达(Mujais SK，等，Cell BiochemBiophys 1999，30：153-166)。利用多参数流式细胞术证明证实大鼠培养物中所含的EPO表达细胞与近端和远端肾小管细胞(图120a、图120b)截然不同。经由荧光缀合的白蛋白的吸收评价培养物中cubilin阳性近端肾小管细胞的功能性，并且吸收的特异性通过添加竞争性抑制剂RAP(图120c-f)来确定。因此，啮齿动物培养物包含至少两种细胞类型，这些细胞类型具有潜在的治疗相关功能-低氧应答EPO表达细胞和能够进行蛋白质吸收的肾小管细胞。
对在供应商进行两步5/6肾切除术的雌性Lewis大鼠每周进行血液抽取，以经由sCREAT和BUN评估肾滤过功能，且经由HCT和RBC评估红细胞生成。在肾切除术后的4周内，相比未接受肾切除术或进行肾切除假手术的健康匹配对照组而言，sCREAT和BUN增加了接近一倍，并且HCT下降。接受肾切除手术的100％(15/15)大鼠发展为肾衰竭病状，并未观察到自然恢复。肾切除术后的7-8周期间，一些鼠经由肾内接受单次剂量的培养的雄性NK-细胞。第二组大鼠未接受干预。治疗后跟踪这些大鼠达3个月，每周经由sCREAT和BUN对滤过功能进行监测(图121a示出sCREAT)，及经由HCT和RBC数量对红细胞生成进行监测(图121b中示出HCT)。在此研究中，所有未治疗的大鼠在肾切除手术后的12-16周(超过治疗时间4-8周)内死亡。相反，所有NK细胞治疗的大鼠存活至研究结束(治疗后3个月)。在结束时，进行比较临床化学以确定细胞治疗的其它潜在治疗效果(图121c)，并进行组织学分析以鉴定肾和骨髓在组织水平上的效果(图122)。虽然样本数量较少，但对于肾功能(sCREAT、BUN)和内分泌/红细胞生成功能(HCT)而言，统计学上的显著改善与NK细胞治疗相关。图121c突出了5/6Nx模型的关键临床特征，包括HCT、RBC#、血红蛋白(HB)，血清白蛋白(sALB)和血清总蛋白(TPRO)的显著减少以及血清BUN、sCREAT和血清磷(sPHOS)的显著增加。重要的是，用NK细胞治疗使血清BUN、sCREAT和sPHOS水平显著低于未治疗的NX大鼠，并且还使HCT、RBC#，sALB和TPRO显著提高(图121c)。此外，肾实质的比较组织学检查表明，与肾切除的未治疗肾相比，局灶区域中肾小球病以及局灶性肾小管再生略微减轻，并且蛋白管型略微减少。通过对近端股骨和胸骨的骨髓进行检查，在组织学上证实了整个研究中观察到的对红细胞生成的全身积极效果(HCT和RBC)，这清楚地表明，相对于未治疗的大鼠，NK-细胞治疗的大鼠的骨髓具有更多的细胞，其中存在大量的红系细胞(图122)。通过检测宿主肾的基因组DNA中的y染色体特异性SRY基因(未示出数据)来证实处死时雌性宿主肾中雄性供体细胞的存在。合在一起，这些初步体内观察表明NK细胞能够为患有慢性进行性肾衰竭的5/6肾切除术模型提供治疗价值，使得整体存活率增强、肾滤过功能稳定、血清蛋白保留、血清磷减少以及红细胞稳态恢复(图121c)。
对患有CKD的猪和人成功地进行功能性肾细胞分离
根据Aboushwareb等的工作和啮齿动物实验性研究的结果(其表明治疗有益效果来源于培养的肾细胞群的移植)，我们可进一步确定：1)是否类似的细胞等同物能从大型哺乳动物物种中分离和增殖；和2)是否类似的细胞等同物存在于由患有CKD的受试者肾而构建的培养物中。根据材料和方法使用总共(2)个猪和(5)个人肾样本。通过血清学和组织病理学检查来确定人(HK018、HK019和HK020)以及猪(PK001)CKD样本的肾衰竭。表21总结了在死亡时测量的CKD和非CKD样本中与受损肾功能有关的关键全身性参数，并且突出了猪和人CKD受试者中的BUN和sCREAT的升高。此外，注意到在CKD受试者中存在HCT和/或血红蛋白HB的轻度至中度缺乏，这表明存在伴随晚期肾衰竭的贫血。图123中呈现了CKD样本的组织病理学特征，并对猪和人的非CKD肾样本的组织学特征进行了对比。相比非CKD组织，注意到CKD组织中存在具有蛋白管型的标记纤维化、肾小球硬化症和肾小管扩张。三个人CKD样本代表疾病严重性和病因范围。HK018和HK019受试者具有继发于非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和高血压的肾衰竭；HK018代表在死亡时具有6年以上的血管渗析历史的依从性患者，而HK019代表未经受渗析或接受稳定药物治疗的非依从性患者。HK020具有继发于自身免疫疾病的肾衰竭历史并且依从有8年以上的腹膜渗析历史。有趣的是，与HK018和HK019不同，HK020肾尺寸严重减小(纵向＜3英寸)并且极度呈现苍白色、纤维化和中度囊性。图123突出显示了HK020中组织学疾病的严重性，几乎没有活的肾小管或肾小球存在。
功能性肾小管细胞的分离和增殖。
虽然在啮齿动物培养物中检测到(见图119和表22)多种细胞类型，但主要的表现型实质上是管状的，并且来自啮齿动物实验性研究的全身性和组织学数据支持体内移植啮齿动物肾细胞培养物后在肾小管区室中的治疗有益效果。因此，我们试图确定从猪和人的组织中分离和增殖功能性肾小管细胞的可行性。通过使用非CKD组织作为起始物来确定的方法，由猪和人的CKD组织开始原代细胞培养。不论疾病状况(非CKD或CKD)或物种(猪或人)如何，使用小片组织(＜0.02g)通过酶消化方法或非酶外植体方法构建和增殖了主要含有肾小管上皮细胞的培养物。在直接比较中，未注意到在源自CKD与源自非CKD的培养物的之间存在扩增能力的显著差异(图124a)。通过观察在部分cubilin阳性细胞(图124b-d和表22)中受体介导的白蛋白吸收来确定构建培养物中的肾小管细胞功能。来自猪和人CKD和非CKD组织的培养的原代细胞在连续传代(直到第4代)之后保留了肾小管标记表达和白蛋白吸收功能。通过猪和人培养物中的定量实时PCR以及与啮齿动物对比，评估构建的培养物中肾小管、肾小球、集合管、血管和内分泌标记物的存在和相对表达(表22)。
氧应答EPO表达细胞的分离和增殖。
在通过qRTPCR接受后，确定CKD和非CKD组织中存在EPO表达细胞。尽管在组织取得时CKD受试者中存在的全身性贫血(见表1)，但在接受之后，相对非CKD组织样本，EPO mRNA在CKD中更充分的表达(图125a中所示代表性样本)。这些样本的等电聚焦和蛋白质印迹分析证实在蛋白水平上重现基因表达模式(图125b)。所有CKD和非CKD肾组织均可产出含有EPO表达细胞的可增殖培养物。氧应答是体内EPO表达细胞用于维持红细胞稳态所需的关键特征。因此，我们检验了培养的EPO表达细胞通过上调EPO转录来应答低氧刺激的能力。由CKD和非CKD肾样本构建的EPO表达细胞培养物在刺激的24小时内通过EPO基因转录的可变上调来应答低氧刺激(图125c)。通过观察看家(housekeeping)基因和肾小管基因都不通过低氧刺激诱导(未示出)，从而确定了上调的特异性。由CKD和非CKD的人和猪组织构建和增殖的培养物在多次传代中和在深低温保藏和培养再引发之后仍保留了EPO表达细胞。
如下表21所示，从CKD和非CKD患者中收集猪肾(PK001和PK002)、人肾(HK016-HK020)和大鼠肾。从一组雌性Lewis大鼠中收集*大鼠数据并计算平均值，这些Lewis大鼠接受了两步5/6肾切除手术以诱导进行性肾衰竭；示出了健康年龄相一致的对照以便比较。粗体数字代表在根据实验室标准值的正常范围以外的值。
如下表22所示，根据材料和方法由猪(PK001和PK002)、人(HK016-HK020)和大鼠(Lewis)的肾构建培养物。通过qRTPCR确定了在代表肾的主要细胞区室(肾小管、肾小球、导管、血管和内分泌)的构建培养物内存在细胞。人特异性探针的有效性使得可以进行更定量和更广泛的人样本分析。将各个基因的表达标准化为内源性对照，并且校准为物种相一致的新鲜完整肾组织。在21％的O2和2％的O2下，检验EPO的表达；所示值代表21％O2表达水平并且(R)表明在2％的O2条件下观察到上调。也以多个传代(猪和人的p0-p4，大鼠的p0-p1)在各培养物中评估了白蛋白吸收(ALB-U)。如通过流式细胞术分析确定，在各培养物中确定了明显的低侧向散射/低前向散射(SSC/FSC)亚群的存在。
表21.死亡或处死时的肾功能
Figure BDA0000073731760001401
*死亡或处死时所有分组动物的平均值
表22.培养的人、猪和大鼠肾细胞的区室分析
Figure BDA0000073731760001402
Figure BDA0000073731760001411
讨论
将异质性啮齿动物NK细胞肾内递送到进行性和晚期肾衰竭模型，使得100％的接受治疗的大鼠在研究期间存活(疾病发作后20周)，而所有未治疗大鼠在疾病发作16周内死亡。在5/6肾切除手术8周后、当大鼠的血清肌酸酐和BUN显著提高时、以及在其肾切除后存活时间的中期递送NK细胞。NK-CELL递送明确地引起肾滤过功能的稳定和红细胞生成的提高，其中一者或两者均可能对模型中的总存活率产生影响。移植细胞的部分特征表明，具有特异性治疗相关特性的组分细胞(运输白蛋白的肾小管细胞和氧介导的EPO生成细胞)存在于群内，因此有可能对啮齿动物实验性研究中对所观察的疾病进展的稳定有所帮助。
在人和啮齿动物模型(例如两步5/6肾切除)中的CKD通过进行性肾功能恶化、纤维化、肾小球和肾小管的质量损失以及尿液中的蛋白质流失(deZeeuw等，Kidney Int 2004，65：2309-2320)来表征。通过两种机制来控制肾内的蛋白质流失：在肾小球水平上，其中足细胞和肾小球基底膜的完整性决定有多少蛋白沉积到尿滤液中；和在肾小管水平上，其中肾小管细胞从滤液吸收蛋白质并将其返回循环(Birn等，Kidney Int 2006，69：440-449)。受体介导的蛋白吸收功能在体外的培养NK细胞的肾小管组分中得到了确定，并且也是在用NK细胞进行体内治疗后5/6Nx大鼠中所改善的特征。因此，不希望受具体理论的束缚，NK细胞混合物中的蛋白质吸收能力细胞可能对所观察的体内蛋白质保留提高起到部分作用。因为NK细胞培养物也含有一定比例的肾小球细胞，因此在肾小球水平上发生的一定程度的细胞修复和/或再生也是合理的。通过观察肾小管聚焦区域内缓解的腔内蛋白管型和轻度缓解的肾小球病，对NK细胞治疗的肾的组织学评估为该假设提供了额外的支持。
还在NK细胞治疗的大鼠中观察到了红细胞稳态的恢复，其中HCT和RBC水平达到健康对照组的水平并且在研究期间(3个月)将HB水平维持在接近正常水平。因为RBC在大鼠中的半寿期较长(月14天)(Ganzoni等，J Clin Invest 1971，50：1373-1378)，所以重要的是，排除仅因为在NK细胞递送时对红细胞系的短期刺激所致的注意到的针对HCT、RBC和HB的阳性全身效应的可能性。短期填充物效应可能对外周测量产生长期影响，但仅对骨髓有瞬态效应。重要的是，在NK细胞治疗的大鼠中3个月时间点时的骨髓的稳固外观提供了与递送EPO生成NK细胞有关的填充物效应的证据。对递送给啮齿动物的单剂量重组EPO的研究已表明，在骨髓中的效应持续了大约48小时，而RBC峰的外周刺激为约6天，回到了21天前的给药前水平(Bugelski等，Pharm Res 2008，25：369-378)；Woo等，J Pharmacol ExpTher 2006，319：1297-1306)。
虽然已将旁分泌效应描述为移植到急性损伤条件的细胞作用的机制(Gnecchi等，Circ Res 2008，103：1204-1219)，包括肾衰竭(Togel等，AmJ Physiol Renal Physiol 2005，289：F31-42；Togel等，Am J Physiol RenalPhysiol 2007，292：F1626-1635)，似乎这些研究所测试的啮齿动物NK细胞至少部分地通过直接增强肾滤过功能并且刺激红细胞生成来起作用。在3个月时对外植残肾的分子分析显示，雌性受体肾中持续存在雄性供体细胞，但估计频率低于(＜10％)，这表明所观察的全身性改善有可能是由于移植细胞的早期直接效应和对宿主细胞和/或组织微环境的同时和随后间接效应的组合。将需要其他研究，以将所观察的体内结果归因于具体细胞组分，以及精确识别涉及在NK细胞递送后减缓进展的细胞和分子机制。
在研发和递送自体细胞或再生的药物治疗剂中，存在许多固有的实际挑战。然而，自体方法在临床上仍然存在吸引力，因为其不需要免疫抑制并且可避免一些与病原体有关的问题。当一种或多种治疗目标细胞不能从患者上获得时，自体策略可能不实用，因为它们的破坏是疾病机制一部分，如在1型糖尿病中的胰岛素产生β细胞的流失(Pirot等，Arq Bras EndocrinolMetabol 2008，52：156-165)，或因为通过活组织检查获得细胞时对患者的风险过大。这些限制已使得许多人追求用于通过从自体异位位点上分离来产生治疗相关细胞的策略，这与普通细胞类型(例如内皮细胞或平滑肌细胞)的衍生相关。另一方法已引导了从除起源组织以外的部位分离的干细胞或祖细胞的分化；但当目标细胞是高度特化的组织特异性细胞时，这些方法进展缓慢，原因是分化过程无效、未分化细胞在再生过程中可能起到的作用的不确定性、以及围绕未分化细胞的移植而产生的安全问题(Hentze等，Stem Cell Res.2009年2月12日)。因此，对于需要自体/同源方法的任何给定的目标疾病，必须确认具有治疗潜力的细胞是否可从一种或多种目标组织上分离。
在整个猪和来自CKD患者的人肾组织中以及在由这些组织构建并且增殖的细胞培养物中研究所有主要细胞类型(肾小管细胞、EPO生成细胞、肾小球细胞、集合管细胞和血管细胞)的存在和功能。有趣的是，无论病因或者病情的严重性如何，对肾小管标记物呈阳性并且可进行受体介导的白蛋白吸收的细胞均存在，并且由人肾和猪肾增殖。无论何种物种或病因，也分离了对低氧应答的EPO生成细胞并且从所有患有慢性疾病的肾中增殖。有趣的是，肾小球细胞并不从HK20(非常晚期的自身免疫性肾小球肾炎病例)中分离并增殖，尽管肾小球细胞存在于其它所有的培养物中，同时集合管细胞和少量的血管细胞也是如此。
已经提出了与继发于慢性肾衰竭的贫血的机制有关的多种假设。一般情况下，可以接受的是肾衰竭的贫血是由于一种绝对或相对的EPO缺乏，这是因为血清中EPO的水平相对于贫血的程度而降低(Nangaku等，SeminNephrol 2006，26：261-268)。已经假设，随着疾病的进展，可损失肾的EPO生成细胞，或者，EPO生成细胞仍存在于肾中，但是由于细胞中局部氧化与控制机制之间的关系受到干扰，无法对生成信号作出合适的反应(Maxwell等，J Am Soc Nephrol 2003，14：2712-2722)。还可能合理的是，作为疾病发展一部分的脉管系统的纤维化和破坏限制了肾中产生的EPO蛋白的能力，以有效递送到循环中。CKD的尿毒症环境也促使了贫血，并且血浆中的尿毒症溶质与缩短RBC半衰期有关(Nangaku等，Semin Nephrol 2006，26：261-268)。尿毒症的慢性炎症以及继发于失血或者透析的铁缺乏也可能会促使CKD的贫血。我们的数据提出了与以下假设相对的证据，肾中的EPO表达细胞受到破坏，这是因为mRNA和蛋白质均明显存在于组织中，并且表达受调节的EPO功能的细胞从所有CKD和非CKD肾样本中增殖。需要注意的是，患有自身免疫性肾小球性肾炎(HK20)的人CKD样本具有组织水平上显著较低的EPO mRNA和蛋白质表达以及培养物中表现出的整体性弱表达。综合培养物中不存在肾小球细胞的情况，可能表明继发于自身免疫性疾病的CKD对于需要肾小球或者内分泌细胞作为组分的自体细胞基治疗而言，并非良好的目标病情。
总之，这些研究表明，可对具有治疗活性的细胞进行分离、扩大以及移植到慢性损伤的实质中，以稳定肾功能以及延迟末期CKD模型的进展。NK-细胞分离策略在大型动物和人的CKD样本中的成功应用突出了这种方式的可转化特性。尽管存在有晚期纤维化和复杂的潜在代谢疾病，但是肾小管、内分泌、集合管和肾小球细胞的囊存留在源自CKD的组织中，进而能通向“构建单元(building blocks)”，这对于构建自体再生医学策略以用于CKD的治疗而言，可能是必须的。这些研究所设想的此再生医学策略具有这样的潜力，即，其可维持肾功能并可延长许多CKD患者的寿命，这些患者深受长期透析的并发症之苦并面临着器官捐献缺点和延误。
实施例19-功能性NKA原型的分离不依赖于年龄。
进行本研究是为了确定新肾增加细胞原型是否是得自成年啮齿动物的肾。
成年啮齿动物的NKA细胞制剂(RK102，RK105)可采用大鼠细胞分离和培养启动的标准工序由成年大鼠肾中构建(年龄＞3个月)。所有烧瓶均总共培养3天。在前两天之后，21％(大气)氧条件之下，更换培养基并且将烧瓶重新定位在设定为2％氧的氧控培养箱中放置另外24小时。然后，采用标准的酶收集程序收集细胞。根据标准程序来制备分级梯度，收集培养物并对其施加分级梯度。得到的条带的分布和频率(见图126，表23)均与由2周大的(未成年)肾组织产生的制剂类似。源自成年NKA原型与源自未成年NKA原型之间的基因表达模式相当，其中B2-特定细胞类型和B4-特定细胞类型的预期富集通过检查促红细胞生成素、nephrin、podocin、cubilin和Cyp的基因表达模式来确定(见图127)。
表23.相对频率/带分布
Figure BDA0000073731760001441
采用大鼠细胞分离和培养启动的标准程序，由晚期慢性疾病(5/6肾切除)的成年啮齿动物残肾产生RK091NKA细胞群。在前两天之后，21％(大气)氧条件之下，将烧瓶重新定位在设定为2％氧的氧控培养箱中放置另外24小时(图128)。然后，采用标准的酶收集程序收集细胞。尽管密度分级梯度未施加到该培养物中，但是特定“B2和B4”基因(例如，Cyp、EPO、HIF1a、Podocin和VEGFA)的基因表达表明，对已知的B2-特定细胞类型和B4-特定细胞类型进行分离并且在培养物中增殖(图129)。
由未成年(2周大)或者成年(3.5个月大)的雄性Lewis大鼠并行制备NKA细胞制剂。在标准培养方法和分级梯度步骤之后，将从各制剂中分离的“B2”组分移植入患有贫血/尿毒症的雌性Lewis大鼠中(通过两步5/6肾切除手术于CRL产生)。肌酸酐和BUN的初期值在移植一周前进行测定，并且在治疗后16周每隔两周进行(见图130和图131)。
上面的结果示出了，采用与源自幼鼠肾的培养物相同的培养策略和分级梯度技术，将“B2”中发现的肾小管细胞与“B4”细胞群中发现的特异性特化细胞(例如促红细胞生成素生成细胞、血管细胞和肾小球细胞)进行分离是可行的。在预期密度下，“B4”-特异性特化细胞(epo-生成细胞、血管细胞和肾小球细胞)存在于成年啮齿动物的“B4”带中。如上所示，从来自晚期动物的患病成年啮齿动物肾中获得NKA细胞(肾小管细胞和EPO生成细胞)也是可行的。发病之后，源自未成年和成年的NKA“B2”细胞在移植入尿毒症的已建模型(两步5/6Nx)时实现稳定的肾功能。
实施例20-治疗相关的肾生物活性细胞群的遗传识别
为了确定从肾组织上分离并扩大的肾细胞的特定亚群的无偏基因组成，采用基因阵列和定量实时PCR(qrtpcr)分析(Brunskill等，2008)来识别细胞亚组分中存在差异的细胞类型特异性和通路特异性基因表达模式。肾细胞的未分化的异质性混合物的分离和原始培养之前已进行过描述(Aboushwareb等，2008)。其后，采用标准密度梯度方法来生产细胞亚组分，随后基于特定的生物活性和表型特征对细胞亚组分进行表征。最后，当通过肾内移植单独或联合移植到由在雌性Lewis大鼠中进行两步5/6Nx步骤而产生的进行性CKD模型时，两种被称为“B2”和“B4”的特定细胞亚组分被证实均具有特定的治疗价值。
细胞和细胞培养条件：
根据实施例8，对雄性Lewis大鼠肾细胞的已建异质性培养物进行分级分离。在梯度分级分离之前，将肾细胞于50∶50混合物中进行培养，该混合物包括含有5％(v/v)FBS的高糖DMEM、2.5μgEGF、25mgBPE(牛脑垂体提取物)、1XITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂))和抗生素/抗真菌药(MFR)，并且在37℃下于标准湿度和氧张力条件下进行培养。对得到的亚组分(B1、B2、B3、B4和小球)采样，以获得用于表达分析的RNA，并且随后将亚组分移植入患有尿毒症的大鼠中以评估体内生物功能。
材料和方法
微阵列平台：Affymatrix GeneChip大鼠基因组2302.0阵列；收缩设备：Wake Forest大学健康科学，微阵列核心设备；确认方法：ABI/Invitrogen 7300定量实时PCR(qrtpcr)分析；RNA分离：Qiagen RNA分离试剂盒；cDNA合成：Invitrogen Vilo上标cDNA分离试剂盒；引物和探针：ABI/InvitrogenTaqman分析(“库存”引物和探针组)
步骤
在亚组分分级分离步骤之后，立即从细胞亚组分中分离RNA并对其进行定量(表24-25)
进行Affymatrix基因阵列分析，以标准化2μg)RNA样本(未示出数据)
基于p值和倍数变化显著性，差异性地选择表达基因(未示出数据)
采用David annotation assignment(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)对差异表达的基因进行分类(未示出数据)
选择基因，以通过对特定亚组分进行qrtpcr来证实微阵列，这些特定亚组分由Lewis大鼠细胞制剂、正常的人肾细胞制剂以及人慢性肾病细胞制剂产生。(表27)
表24.培养条件和梯度负荷
Figure BDA0000073731760001461
表25.RNA浓度和标准化
Figure BDA0000073731760001471
结果
按照下列严格的条件确定组分(B1-B4)之间和/或梯度前(PreG)的差异表达：列出的基因满足显著性标准：p值＜0.05，并且倍数变化＜-0.5或者＞0.5。没有基因名称/描述的探针装置的ID(例如：1395810 at|---|---)对应于还没有被指定的基因阵列寡核苷酸(oligo)。这些oligos可通过Affymetrix“Netaffx”网页https://www.affymetrix.com/analysis/netaffx进行选择并且相对于NCBI基因组数据库而被破坏，进而获得基因定位的可能性。
下表26示出了在梯度前和梯度后(B1-B4)细胞群之间基因差异表达(上升/下降)的概述。确定基因表达中差异的选择标准：细胞群之间，t-检验p值≤0.05，同时绝对倍数变化≥0.5。例如，如下表26所示，梯度前和B1之间的差异：在165个差异表达的基因中，32个在B1中为上升，以及133个在B1中从梯度前下降。对代表这些细胞群之间表达差异的基因进行确定。
表26.梯度前和梯度后(B1-B4)细胞群之间表达上升/下降的基因概述
表27
Figure BDA0000073731760001482
讨论
本报告描述了特定生物活性肾细胞亚群的遗传识别，在这种情形下，这些亚群是通过密度梯度分离法生成的。微阵列分析说明了一种无偏方法，其用于相对于一个样本来确定另一个样本中标准化信号强度的表达水平(数据未示出)。应用聚类分析和树状视图可进一步在跨越多个样本的情况下，可使基因表达的强度和模式可视化。本报告中进行检验的细胞组分已被广泛地用于体内研究(从Lewis雄性供体到Lewis雌性CKD受体(Kelley等，2009))。整个机体的改善(即，存活率、体重增加)、血清学定位以及组织学证据极大地支持了作为细胞组分的B2在单独地移植入患病的肾内时具有最大的治疗相关性，尽管组分B4确实限定了体内的治疗有益效果。
后续部分因素的体内研究表明，B2和B4结合的有益效果超过了单独B2的有益效果。本微阵列研究揭示了所有细胞组分间的差异，同时强调了B2与B4之间的差异，其包括通过David Annotation免费软件进行的基因分类(数据未示出)。有趣的是，在B2和B4之间差异表达的基因代表33个不同的功能组和这些具有显著p值(pv≤0.05)的组中的163个注解。采用代表7种不同David(Go)基因注解类别的基因的选定面板，通过进行artpcr来验证阵列(数据未示出)。值得一提的是将选择来验证啮齿动物的阵列的基因转移到正常人和人CKD患者(见表27)。由于对于基因阵列分析而言具有典型性，因此在解释的时候应当慎重，直到亚组分的所有声称的标记物可在蛋白质水平上进行核实。此外，使用基因表达分析不可能检测到任何一个亚组分的稀有组分，并且必须采用基于每个细胞而进行区别的方法来独立地进行追踪。
综上所述，微阵列分析表明密度梯度分离是一种将肾细胞分离为具有特定功能和特征的亚组分的有效方式。层序聚类分析法表明每种亚组分都与其它亚组分不同，并且也显著区别于梯度前起始细胞群。如上所示，未分离细胞的表达模式与B2亚组分中发现的表达模式最为接近，这可能是因为肾小管细胞或集合管细胞包含异质性培养物和B2亚组分的频率相对较高(大约80％)。而且如预期那样，基因表达的最大区别发生在密度梯度的第一亚组分和最后亚组分之间(B1和B4)。
各组细胞的聚类分析(基于多组比较，Kruskal Wallace significance)和T检验比较均表明，在梯度中，B1和B2组分梯度中与B3和B4组分分离。B2组分主要包括异质性培养物(肾小管和集合管)中的大量细胞，在该组分中存在衡量的其它细胞类型，而B4组分则大量富集调节生长和发育的因子，特别是调节血管生长的因子。值得一提的是，B1和B3组分包含能够抵消B2组分的治疗效应的免疫/炎性因子。通过13/13啮齿动物标记物验证所观察到的B2和B4组分的微列阵基因表达之间的区别。啮齿动物细胞分级和基因表达能够很明显地转化到正常和CKD人样本，该样本具有大于90％测试标记物。上述数据表明支持人CKD肾具有结构缺陷但大多数细胞类型在体内存活并繁殖的命题。
实施例21-通过B2合成透明质酸
非常意外的是，B2细胞制剂能够产生HAS-2(负责高分子量透明质酸(HA)合成的透明质酸合酶)，并且B4细胞制剂在移植之前在体外也能够产生少量这种合酶。图132示出B2和B4的体外HAS-2表达。如图132所示，透明质酸合酶(HAS)的体外表达主要在B2细胞制剂之中，但是，也能够在B4细胞制剂检测到这种合酶表达。
图133示出HAS mRNA和蛋白质的体内表达。如图133所示，与未进行治疗的Nx组织相比，把B2细胞移植到5/6Nx慢性肾衰竭啮齿动物体内使得HAS-2在基因水平(qRTPCR，下图)和蛋白质水平(上图，蛋白质印迹)上调。
实施例22-代谢性疾病模型中新肾增强评估的研究计划
该项研究的目的是对患有伴随慢性进行性肾衰竭的代谢性疾病的ZSF1啮齿动物模型中的新肾(NK)原型(即，细胞制剂或细胞群)加以评估。肥胖ZSF1大鼠品系代表应用广泛的代谢综合症模型，并通过多种相关疾病进行表征，包括食欲过盛、肥胖、高血压、重度血脂异常、非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、左心室功能紊乱和继发进行性肾病。肥胖ZSF1大鼠年死亡率为大约50％，且通常因晚期肾病和充血性心力衰竭而死亡。肥胖ZSF1大鼠品系来自瘦型雌性Zucker糖尿病多脂(ZDF+/fa)大鼠和瘦型雄性天生HTN(高血压)心衰竭(SHHF/Mcc-facp，+/fa)大鼠的杂交，产生出肥胖ZDFxSHHF-fa/facpF1后代(ZSF1)；根据Charles Rivers实验室命名法，命名为ZSF1-Leprfa Leprcp。每种亲本品系具有不同的瘦素受体突变(fa和facp；cp，“肥胖”基因突变)。ZSF1杂交后代有相同的MHC II单体型，使得这种杂交后代是很好的移植模型，这与人细胞和组织移植中的活体相关供体的情形相似。
已经对源自Zucker的动物品系(包括ZSF1)进行了广泛的研究，并且充分描述在文献中(Duarte等，1999Eur J Pharmacol.365：225-32；Griffin等，2007Am JPhysiol Renal Physiol.293：F1605-13；Harmon等，1999Diabetes.48：1995-2000；Jackson等，2001JPharmacol Exp Ther.299：978-87；Joshi等，2009J Cardiovasc Pharmacol.Jul；54(1)：72-81.；Khan等，2005Am J PhysiolRenal Physiol.289：F442-50；Mizuno等，2006Cardiovasc Pharmacol.48：135-42；Rafikova等，2008 Metabolism.57：1434-44；Renaud等，2004 Fundam ClinPharmacol.18：437-47；Tofovic和Jackson，2003Methods Mol Med.86：29-46；Tofovic等，2001b Ren Fail.23：159-73；Uhlenius等，2002，Kidney BloodPress Res.25：71-9.)。ZDF1品系用在临床前研究中以评估与肾病的风险因子，包括肥胖和NIDDM。
所提议的将NK原型递送到ZSF1大鼠的策略则是基于下面的细胞分离和递送策略。简单地讲，通过两步5/6肾切除术使大鼠患上尿毒症和贫血，以此来提供实验模型。将源自瘦型或肥胖ZSF1供体大鼠的NKA细胞原型悬浮于递送介质中，然后通过肾内递送。然后在手术恢复过程中将对动物进行围手术期评估。从递送时间(大约三月大)到一年大，每隔半月，通过血清化学、尿液分析、血压、存活率和体重增加来监测健康情况和肾脏功能。所测量的参数将包括血清肌酸酐、血液尿素氮、血清白蛋白、总蛋白，和A/G比率、胆固醇和三酸甘油酯、血清钠、血清磷和血清钙、尿蛋白和血细胞比容。在大鼠处死(移植后6-9个月)时，对肾脏、骨髓、肝、肺、脾和心脏进行全组织病理学分析。从实验中可以得出，低蛋白饮食方法和标准护理药理方案(血压控制、葡萄糖控制)都能够延缓人和实验动物(包括源自Zucker的大鼠品系)继发于代谢性疾病的肾衰竭的发展，可进行其它研究以检查这些姑息治疗过程中的NKA原型+/-的表现。通过使用或不使用饮食和/或药理干预，另外的研究方案可对后续治疗干预(再干预)加以评估，以提高动物生命质量并延长存活时间。
在代谢大鼠品系(包括Zucker、ZDF和SHHF)中，ZSF1模型表现出与人肥胖和NIDDM共同的特征，病情极为严重(Tofovic等，2000 RenFail.22：387-406；Vora等，1996J Am Soc Nephrol.7：113-7)，使得及时地对NKA治疗进行评估(大约在NKA原型递送后6个月)。ZSF1大鼠发展有NIDDM的标志性症状，包括胰岛素抗性和继发高血糖症、肥胖症、重度异常血脂症、血压显著升高、晚期肾衰竭、心脏肥大和寿命缩短(ofovic和Jackson，2003 Methods Mol Med.86：29-46)。将ZSF1前体大鼠品系的疾病特征列在表28中(Charles River)。
表28.市售代谢大鼠品系
Figure BDA0000073731760001521
+＝表现出特征；-＝未表现出特征
I＝近亲杂交；O＝远亲杂交；H＝杂种
1＝肾盂积水；2＝很少发现肾盂积水
从Charles Rivers Laboratories(CRL)商购获得ZSF1大鼠品系。根据已经公开的ZSF 1研究(Griffin等，2007 supra；Joshi等，2009 supra；Rafikova等，2008 supra；Tofovic等，2001a J Pharmacol Exp Ther.299：973-7.；Tofovic和Jackson，2003supra；Tofovic等，2001b supra；Tofovic等，2000Ren Fail.22：387-406)进行调查研究，以评估随时间的疾病发展((ZSF12-47周大)。最近，对5只12周大的ZSF1大鼠也进行了血液分析以确认若干疾病参数的年龄依赖性发展。尽管到疾病晚期和死亡的发展相对较慢(大约为1年)，但是在第20周时肾脏功能显著下降(血清肌酸酐从第8周的0.77mg/dl到第20周的1.47mg/dl，含量几乎翻倍)(Tofovic和Jackson，2003supra)。
尽管存在一些限制，但是还可以考虑其它代谢模型。肥胖Zucker模型表现许多糖尿病的症状；然而这些大鼠血压正常，而且更重要的是，若不伴随使用免疫抑制疗法，则远亲杂交品系可能不适于用作移植模型。源自Zucker的ZDF模型是较好代表糖尿病的近亲杂交模型(与肥胖Zucker大鼠相比)，糖尿病包括诸如肾病和轻度高血压的症状，这些症状通常都与NIDDM的胰岛素抗性和高血糖症有关。但是，由于自发性重度肾盂积水的概率较高，所以这种模型可能不适于用于内肾移植策略(Vora等，1996supra)。自发性高血压心里衰竭(SHHF)：该品系大鼠具有与ZSF1类似代谢状况。但是，与ZSF1杂交品系相比，SHHF通过相对轻的肾病来表征，从而导致到晚期肾衰竭的发展缓慢。
肾病ZSF1代谢模型适合于肾衰竭的体内研究，主要是基于以下考虑：模型的文献参考性；模型的商业获得性和可再现性；以及模型适合同源供体方法。此外，这种模型相比SHHF和ZDF亲本品系也有优越性，因为SHHF不发展为糖尿病，而且ZDF表现重度肾盂积水的倾向。与亲本品系相比，肥胖ZSF1中的肾病严重性也比较高。目前，除肾移植外，没有可治疗慢性肾病(CKD)的疗法。所有现行治疗方法(饮食控制和药理干预)都在一定时间内减轻疾病症状，受到明显的且不可逆的肾衰竭的限制。本方案使得可以在继发于代谢综合症的人CKD试验模型中对NKA细胞原型进行评估。主要目的是在肾疾病恶化过程(轻微、中度和重度CKD)中对NKA的递送加以检测。
其它研究可考虑另外的后续肾细胞移植治疗程序(再干预治疗)，其可能延长初期治疗效果的持久性。用肾细胞移植的再干预可伴随饮食控制和药理干预。在以后使用ZSF1模型的研究中，还可能会考虑自体源策略。从理论上讲，不管是ZSF1得近亲杂交亲本品系同系，还是用于产生ZDF的上一代远亲杂交品系，Zucker大鼠都可以用作患有晚期CKD或晚期肾病(ESRD)的ZSF1肾脏组织的异体供体源。
在本研究中和/或后续研究方案过程中，当有机体肾病发展到疾病晚期(即ESRD)时，标准护理药物治疗方案和/或低热量(脂肪、蛋白质和糖)低盐饮食可以在ZSF1模型的NKA评估过程中一同使用。
包括血管紧张素受体阻断剂(RAB)和血管紧张素-转化酶(ACE)抑制剂(比如卡托普利(captopril)或培哚普利(perindopril))的肾素-血管紧张素系统(RAS)疗法代表通常用于人的一类抗高血压药物，并且已显示在Zucker大鼠中也有效(Duarte等，1999supra；Tofovic and Jackson，2003 supra；Uhlenius等，2002supra)。已证明通常用于改善人体中胰岛素介导的细胞葡萄糖吸收的胰岛素增敏剂药物，比如罗格列酮(Rosiglitazone)或曲格列酮(Troglitazone)在Zucker大鼠中也有效(Harmon等，1999supra；Khan等，2005supra)。他汀类药物(调节胆固醇合成的HMG CoA还原酶酵素的抑制剂)是用于治疗血脂异常的一类被广泛使用的药物(Yoshimura等，1999supra)。表29描述了所提出的用于检验大鼠中源自瘦型和肥胖大鼠NKA细胞的代表性基质方法，通过一系列模仿患者依从性的饮食和药理方案对这些大鼠进行管理。
表29.用于治疗雄性肥胖ZSF1大鼠的研究组
Figure BDA0000073731760001541
实施例23-免疫抑制研究计划
可使用免疫抑制研究计划对非自体来源的NKA原型的体内作用效果加以评估。多种免疫抑制方案是可行的，包括每日环孢霉素A(CsA)(10mg/kg)强饲法；每日他克莫司(Tac)(0.2mg/kg)强饲法(第二选择)；每日雷帕霉素(Rapa)(1mg/kg)强饲法(首选)；和每日霉酚酸酯(MMF)(10mg/kg)强饲法(Yang，H.C.，Nephrol Dial Transplant.2003 May；18 Suppl 1：i16-20)。如果移植前12天进行了供体特异性输血趋于耐受性，那么也可以实施基于耐受性的免疫抑制疗法(Koshiba T，Li Y，Takemura M，Wu Y，Sakaguchi S，Minato N，Wood KJ，Haga H，Ueda M，Uemoto S.Transpl Immunol.2007Feb；17(2)：94-7；Jovanovic V，Lair D，Soulillou JP，Brouard S.Transpl Int.2008Mar；21(3)：199-206.Epub 2007Dec 5.Review.)。
若干用于NKA原型施用的大鼠模型是可能的。其中一种模型是异体移植模型，其中使用近亲杂交大鼠品系DA(d＝d血型，A＝刺鼠)供体对大鼠品系Wistar-Furth(WF)(强组织相容性)。
1：MHC共存配对组：Fisher大鼠品系(F344)对Lewis大鼠品系(LEW)
2：ZSF大鼠
a.来自自发性高血压SHHF(重度高血压和心力衰竭)大鼠(F1代)×Zucker糖尿病多脂(ZDF)大鼠的第一代。
i.肥胖症、糖尿病、高血压；蛋白尿
ii ZDF×SHHF的后代为同基因后代
1.一半后代表现肥胖+病症，另一半表现为瘦型
iii.F1代能够接受来自亲本SHHF和ZDF品系的移植
3.异体供体选择
a.初始瘦型Zucker多脂大鼠(ZF)-远亲杂交品系
b.ZF的亲本-Wistar大鼠
4.使用RT1.B和RT1.D检验ZSF1和SHHF(主要组织相容性二类分析法)
a.ZSF1--L/K原型
b.SHHF-K原型
实验设计
方法-可注射细胞
1.对照和自体组
a.ZSF，无移植；无免疫抑制治疗(n＝3)-纯对照组
b.ZSF，无移植；施以免疫治疗(n＝3)药物效果
c.空载体ZSF；施以免疫治疗(n＝3)-药物效果和载体影响
d.ZSF至ZSF；无免疫抑制治疗(n＝5)-细胞效果；无药物组分
e.ZSF至ZSF；施以免疫治疗(n＝5)-施以手术程序的药物效果
2.异体移植物实验
a.Wistar移植到ZSF(或瘦型Zucker移植到ZSF；施以免疫治疗(n＝5)-异体移植模型的药物效果
b.可实施与异体细胞递送联用的一种或多种下列免疫抑制方案：
i.每日环孢菌素(CsA)(10mg/kg)强饲法
ii每日(0.2mg/kg)他克莫司(Tacrolimus)强饲法(第二选择)
iii.每日雷帕霉素(Rapamycin)(1mg/kg)强饲法(首选)
iv.每日霉酚酸酯(10mg/kg)强饲法
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，所述B2包括密度介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的分离的肾小管细胞富集群，所述第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，其中所述混合物不包括密度小于1.045g/ml的B1细胞群或密度大于1.091g/ml的B5细胞群，所述B1细胞群包括集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
2.根据权利要求1所述的混合物，其中B2还包括集合管上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为密度介于1.063g/mL和1.091g/mL之间的B4细胞群。
4.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为密度介于1.052g/mL和1.063g/mL之间的B3细胞群。
5.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够摄取受体介导的白蛋白。
6.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。
7.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。
8.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够提供再生刺激。
9.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
10.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第一和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。
11.根据权利要求1所述的混合物，其中B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
12.一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括密度介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的分离的肾小管细胞富集群，其中所述富集群不包括密度小于1.045g/mL的B1细胞群或密度密度介于1.063g/mL和1.091g/mL之间的B4细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B4细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
13.根据权利要求1所述的B2细胞群，其中所述B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。
14.根据权利要求12所述的B2细胞群，还包括集合管上皮细胞。
15.根据权利要求12所述的B2细胞群，其能够摄取受体介导的白蛋白。
16.根据权利要求12所述的B2细胞群，其在体内递送后能够提供再生刺激。
17.根据权利要求12所述的B2细胞群，其在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
18.根据权利要求12所述的B2细胞群，其源自肾组织或培养的肾细胞。
19.根据权利要求12所述的B2细胞群，其通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
20.根据权利要求12所述的B2细胞群，其不包括密度介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间的B3细胞群，所述B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
21.根据权利要求12所述的B2细胞群，其不包括密度大于～1.091g/mL的B5细胞群，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
22.一种制备人B2细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；
b)将所述细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的梯度中；和
c)提取包含所述B2细胞群的第一细胞组分。
23.根据权利要求22所述的方法，其中相比所述非富集细胞群，所述B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
24.一种制备人B4细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；
b)将所述细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于1.063g/mL和1.091g/mL之间的梯度中；和
c)提取包含所述B4细胞群的第一细胞组分。
25.根据权利要求24所述的方法，其中相比所述非富集细胞群，所述B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。
26.一种产生B4细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；
b)将所述细胞悬液施加到流式细胞仪中；
c)使用血管细胞标记物、肾小球细胞标记物和内分泌细胞标记物从所述细胞群中选出细胞亚群；
d)分选来自所述细胞群的细胞亚群；和
e)将所述B4细胞亚群与所述细胞群分离，
其中相对于所述细胞群的大部分而言，所述B4细胞亚群通过所述血管细胞标记物、所述肾小球细胞标记物和所述内分泌细胞标记物的表达来表征。
27.一种用于植入需要改善的肾功能的受试者的构建体，包括：
a)生物材料，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和
b)哺乳动物肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，所述B2包括密度介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的分离的肾小管细胞富集群，所述第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，其中所述混合物不包括密度小于1.045g/ml的B1细胞群或密度大于1.091g/mL的B5细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞，所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
28.根据权利要求27所述的构建体，其中所述第二细胞群为密度介于1.063g/mL和1.091g/mL之间的B4细胞群。
29.根据权利要求27所述的构建体，其中所述第二细胞群为密度介于1.052g/mL和1.063g/mL之间的B3细胞群。
30.根据权利要求27所述的构建体，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。
31.根据权利要求27所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于截留和/或附着所述混合物的三维(3-D)多孔生物材料。
32.根据权利要求27所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。
33.根据权利要求27所述的构建体，其中所述生物材料由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成。
34.根据权利要求27所述的构建体，其中所述生物材料由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成。
35.根据权利要求27所述的构建体，其中所述生物材料由具有介于约50微米至约300微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成。
36.根据权利要求27所述的构建体，其中所述细胞群源自自体肾样本。
37.根据权利要求36所述的构建体，其中所述样本为肾活组织检查样本。
38.根据权利要求27所述的构建体，其中所述细胞群源自非自体肾样本。
39.根据权利要求27所述的构建体，其中所述改善的肾功能为红细胞稳态。
40.一种用于治疗有需要的受试者的肾病的组合物，包括：
a)对所述受试者施用组合物，所述组合物包括哺乳动物肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，所述B2包括密度介于1.045g/mL和1.052g/mL之间的分离的肾小管细胞富集群，所述第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，其中所述混合物不包括密度小于1.045g/ml的B1细胞群或密度大于1.091g/mL的B5细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞；以及
b)确定来所述自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中所述指标水平的差值指示所述受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第二细胞群为密度介于1.063g/mL和1.091g/mL之间的B4细胞群。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述第二细胞群为密度介于1.052g/mL和1.063g/mL之间的B3细胞群。
43.根据权利要求40所述的组合物，其中所述肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述EPO缺乏为贫血。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述EPO缺乏或贫血继发于所述受试者的肾衰竭。
46.根据权利要求43所述的组合物，其中所述EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病：慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。
47.根据权利要求40所述的组合物，其中所述组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。
49.根据权利要求40所述的组合物，其中所述混合物源自自体肾样本。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述样本为肾活组织检查样本。
51.根据权利要求40所述的组合物，其中所述混合物源自非自体肾样本。
52.一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露12至24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为1.045g/mL至1.052g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的梯度中；(ii)包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)不包括密度小于1.045g/mL的B1细胞群或密度大于1.091g/mL的B5细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞；(v)当递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时能够调节一种或多种肾功能。
53.一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露12至24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为1.063g/mL至1.091g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.063g/mL至1.091g/mL之间的梯度中；(ii)包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求52所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。

Claims (66)

1.一种人肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群，并且其中所述第二细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
2.根据权利要求1所述的混合物，其中B2还包括集合管上皮细胞。
3.根据权利要求1所述的混合物，其中所述B2细胞群的密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间。
4.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为B4细胞群。
5.根据权利要求3所述的混合物，其中所述B4细胞群的密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间。
6.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第二细胞群为B3细胞群。
7.根据权利要求4所述的混合物，其中所述B3细胞群的密度介于约1.052g/ml和约1.063g/ml之间。
8.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物不包括密度小于～1.045g/mL的B1细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。
9.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物不包括密度大于～1.091g/mL的B5细胞群，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
10.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够摄取受体介导的白蛋白。
11.根据权利要求1所述的混合物，其中所述细胞混合物能够表达氧可调促红细胞生成素(EPO)。
12.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物含有能够在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)的HAS-2表达细胞。
13.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够提供再生刺激。
14.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
15.根据权利要求1所述的混合物，其中所述第一和第二细胞群源自肾组织或培养的肾细胞。
16.根据权利要求1所述的混合物，其中B2通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
17.一种分离的人肾细胞富集群，其包括B2细胞群，其中B2包括分离的肾小管细胞富集群。
18.根据权利要求1所述的B2细胞群，其中所述B2细胞群能够通过HAS-2(透明质酸合酶-2)的表达在体外和体内生成和/或刺激生成高分子量类型的透明质酸(HA)。
19.根据权利要求17所述的B2细胞群，还包括集合管上皮细胞。
20.根据权利要求17所述的B2细胞群，其密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间。
21.根据权利要求17所述的B2细胞群，其能够摄取受体介导的白蛋白。
22.根据权利要求17所述的B2细胞群，其在体内递送后能够提供再生刺激。
23.根据权利要求17所述的B2细胞群，其在体内递送后能够减轻肾小球滤过、肾小管重吸收、尿液生成和/或内分泌功能的衰退，使这些功能稳定或改善。
24.根据权利要求17所述的B2细胞群，其源自肾组织或培养的肾细胞。
25.根据权利要求17所述的B2细胞群，其通过选自下列各项的肾小管细胞标记物的表达来表征：巨蛋白、cubilin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、神经钙黏着蛋白(Ncad)、上皮钙黏着蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节子4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换剂)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)、醛脱氢酶1家族成员A3(Aldh1a3)和钙蛋白酶-8(Capn8)。
26.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度小于～1.045g/mL的B1细胞群，所述B1细胞群包括所述集合管和肾小管系统的大颗粒细胞。
27.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度介于约1.052g/mL和约1.063g/mL之间的B3细胞群，所述B3细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
28.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的B4细胞群，所述B4细胞群包括促红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
29.根据权利要求17所述的B2细胞群，其不包括密度大于～1.091g/mL的B5细胞群，所述B5细胞群包括低颗粒度和低成活力的细胞碎片和小细胞。
30.一种制备人B2细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；知
b)提取包含所述B2细胞群的第一细胞组分。
31.根据权利要求30所述的方法，其中相比所述非富集细胞群，所述B2细胞群包括较大比例的肾小管细胞以及较小比例的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。
32.根据权利要求30所述的方法，还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，所述步骤包括：将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.045g/mL和约1.052g/mL之间的梯度中。
33.一种制备人B4细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；知
b)提取包含所述B4细胞群的第一细胞组分。
34.根据权利要求33所述的方法，其中相比非富集细胞群，所述B4细胞群包括较大比例的EPO生成细胞、血管细胞和肾小球细胞以及较小比例的非EPO生成细胞、非血管细胞和非肾小球细胞。
35.根据权利要求33所述的方法，还包括步骤a)和步骤b)之间的步骤，所述步骤包括：将细胞悬液与密度梯度接触以分离一种或多种细胞组分，其中所述第一细胞组分在离心后存在于比密度介于约1.063g/mL和约1.091g/mL之间的梯度中。
36.一种产生B2细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；
b)将所述细胞悬液施加到流式细胞仪中，所述流式细胞仪能够同时测量所述细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；
c)从所述细胞群中选出细胞亚群；
d)分选来自所述细胞群的细胞亚群；和
e)将所述B2细胞亚群与所述细胞群分离，
其中相对于所述细胞群的大部分而言，所述B2细胞亚群通过高前向散射和高侧向散射来表征。
37.一种产生B4细胞群的方法，包括：
a)将包含非富集异质性肾细胞群的细胞悬液暴露在低氧培养条件下；
b)将所述细胞悬液施加到流式细胞仪中，所述流式细胞仪能够同时测量所述细胞群内一个或多个单个细胞的前向散射和侧向散射；
c)从所述细胞群中选出细胞亚群；
d)分选来自所述细胞群的细胞亚群；和
e)将所述B4细胞亚群与所述细胞群分离，
其中相对于所述细胞群的大部分而言，所述B4细胞亚群通过低前向散射和低侧向散射来表征。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述前向散射对应于细胞尺寸。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述侧向散射对应于细胞颗粒度。
40.一种用于向有需要的受试者提供改善的肾功能的可植入构建体，包括：
a)生物材料，其包含一种或多种生物相容性的合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽；和
b)哺乳动物肾细胞混合物，其包括第一细胞群、B2和第二细胞群，
所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
41.根据权利要求40所述的可植入构建体，其中所述第二细胞群为B4。
42.根据权利要求40所述的可植入构建体，其中所述第二细胞群为B3。
43.根据权利要求40所述的构建体，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。
44.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于截留和/或附着所述混合物的三维(3-D)多孔生物材料。
45.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料被构建为适于包埋、附着、悬浮或包覆哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶。
46.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由呈水凝胶形式的主要为高分子量类型的透明质酸(HA)构成。
47.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由呈多孔泡沫形式的主要为高分子量类型的透明质酸构成。
48.根据权利要求40所述的构建体，其中所述生物材料由具有介于约50微米至约300微米之间的孔的聚乳酸基泡沫构成。
49.根据权利要求40所述的构建体，其中所述细胞群源自自体肾样本。
50.根据权利要求49所述的构建体，其中所述样本为肾活组织检查样本。
51.根据权利要求40所述的构建体，其中所述细胞群源自非自体肾样本。
52.根据权利要求40所述的构建体，其中所述改善的肾功能为红细胞稳态。
53.一种治疗有需要的受试者的肾病的方法，包括：
a)对所述受试者施用包含哺乳动物肾细胞混合物的组合物，所述哺乳动物肾细胞混合物包括第一细胞群、B2和第二细胞群；以及
b)确定来所述自受试者的试样的肾功能指标水平与对照组的指标水平不同，其中所述指标水平的差值指示所述受试者的一种或多种肾功能衰退的减轻、稳定或改善。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二细胞群为B4。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述第二细胞群为B3。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述肾病伴随有促红细胞生成素(EPO)缺乏。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏为贫血。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏或贫血继发于所述受试者的肾衰竭。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述EPO缺乏或贫血继发于选自下列的疾病：慢性肾衰竭、原发性EPO缺乏、化学疗法或抗病毒疗法、非骨髓癌、HIV感染、肝病、心力衰竭、类风湿性关节炎或多器官系统衰竭。
60.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物还包括包含一种或多种生物相容性的合成聚合物和/或天然存在的蛋白质或肽的生物材料，其中所述混合物用所述生物材料包覆、沉积在其上或其中、截留于其中、悬浮于其中、包埋于其中和/或以其它方式与其结合。
61.根据权利要求34所述的方法，其中所述混合物源自哺乳动物肾组织或培养的哺乳动物肾细胞。
62.根据权利要求34所述的方法，其中所述混合物源自自体肾样本。
63.根据权利要求46所述的方法，其中所述样本为肾活组织检查样本。
64.根据权利要求53所述的方法，其中所述混合物源自非自体肾样本。
65.一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.045g/mL至约1.052g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于1.045g/mL至约1.052g/mL之间的梯度中；(ii)包括肾小管细胞群，其通过至少一种肾小管细胞标记物的表达来表征；(iii)包括肾小管细胞亚群，其能够转运受体介导的白蛋白；(iv)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能。
66.一种选定的肾细胞群，其在约1％至约5％的氧含量下暴露约12至约24小时后可通过密度梯度离心来分离，所述梯度包括密度为约1.063g/mL至约1.091g/mL的部分，其中所述细胞群(i)在离心后保留于密度介于约1.063g/mL至约1.091g/mL之间的梯度中；(ii)包括氧可调促红细胞生成素(EPO)表达细胞、肾小球细胞和血管细胞；(iii)能够在递送至有患肾病风险或患有肾病的受试者时调节一种或多种肾功能；和(iv)能够在联合施用时通过权利要求65所述的肾细胞群增强对一种或多种肾功能的调节。
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