JP2018148909A - 単離した腎細胞およびその使用 - Google Patents

単離した腎細胞およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】慢性腎疾患（ＣＫＤ）の患者集団において進行を遅延させて生活の質を向上させ、医療システムの年間費用負担を軽減するための、次世代治療の選択肢を提供する。【解決手段】腎臓疾患を治療する方法における使用のための、単離された、濃縮されたヒト腎細胞集団であって、（ａ）腎尿細管細胞、および／または（ｂ）内分泌細胞、血管細胞、および糸球体細胞を含む細胞集団。該ヒト腎細胞集団は、腎尿細管細胞、内分泌細胞、血管細胞、および糸球体細胞について濃縮されている。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００８年１１月１２日に出願された米国仮出願第６１／１１４，０２５号、２００８年１１月１２日に出願された第６１／１１４，０３０号、２００８年１２月５日に出願された第６１／２０１，０５６号、２００８年１２月８日に出願された第６１／２０１，３０５号、および２００８年１２月１０日に出願された第６１／１２１，３１１号の優先権を主張するものであり、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。本出願の対象は、２００９年１１月１２日に出願された米国仮出願第６１／２６０，８３３号に関連し、参照によりその開示が本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、腎臓の尿細管細胞集団およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞集団を含む単離された腎細胞、ならびにそれを単離および培養する方法、また、該細胞集団を用いて必要としている対象を治療する方法を対象とする。
背景技術
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、米国で１９００万人以上に発症しており、肥満、糖尿病、および高血圧に関与する代謝疾患の結果であることが多い。デ−タの検証により、増加率は、それ自体も世界中で増加の一途をたどる２つの疾病ある高血圧およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に二次的に発症する腎不全に起因することが明らかになっている（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｓｔｓ ｏｆ ＣＫＤ ａｎｄ ＥＳＲＤ． ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２００７ ｐｐ ２２３−２３８）。肥満、高血圧、および血糖管理不良はみな、腎障害の独立した危険因子であることが明らかになっており、糸球体および尿細管の病変を引き起こし、タンパク尿、および腎臓のろ過機能における他の全身的に検出可能な変化をもたらす（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ， ２６： ２９５−３００， ２００８、Ａｍａｎｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， １３： １９５８−６６， １９９８）。進行の１〜３期にあるＣＫＤ患者は、生活様式の変化および根底にある病態（複数可）を制御することを目的とした薬理学的介入によって管理され、一方、４〜５期の患者は、透析、ならびに通常、降圧剤、赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）、鉄およびビタミンＤの補給を含む投薬計画によって管理される。米国腎臓デ−タサ−ビス（ＵＳＲＤＳ）によれば、平均的な末期腎疾患（ＥＳＲＤ）患者は、注射用赤血球造血刺激因子製剤（ＥＳＡ）、ビタミンＤ補給剤、および鉄補給剤に、１ヶ月あたり６００ドル超を費やしている（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｃｏｓｔｓ ｏｆ ＣＫＤ ａｎｄ ＥＳＲＤ． ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２００７ ｐｐ ２２３−２３８）。透析の年間平均コスト（６５，４０５ドル）と合わせると、患者１人の維持にかかる医療費は、年間に７２，０００ドル超にまで上るが（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｃｏｓｔｓ ｏｆ ＣＫＤ ａｎｄ ＥＳＲＤ． ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２００７ ｐｐ ２２３−２３８）、この数字は、標準的な処置の費用のみを反映するものであり、他の合併症の治療、応急処置、または透析のアクセスのための血管移植片の設置等の補助的な処置は含まれていない。２００５年のＣＫＤおよびＥＳＲＤを合わせた医療費は総額６２０億ドルであり、その年の医療費総額の１９％を占める（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｒｅｎａｌ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍ： Ｃｏｓｔｓ ｏｆ ＣＫＤ ａｎｄ ＥＳＲＤ． ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， ２００７ ｐｐ ２２３−２３８）。４〜５期の患者にとって、透析を避けるための先制手段として、または病態を管理するのに透析がもはや十分ではない場合に、腎臓移植は有効な選択肢であるが、米国における全腎移植の恩恵を受け得るステ−ジ５のＣＫＤ患者数（４００，０００人以上）は、任意の所与の年に利用可能な好適なドナ−腎臓の数（約１６，０００個）を遥かに上回っている（Ｐｏｗｅ， ＮＲ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ， ５３： Ｓ３７−４５，２００９）。よって、透析への依存を遅延させるかまたは減少させて、ドナ−腎臓の不足による隙間を埋めるための、新しい治療パラダイムが必要とされている。
進行性の腎疾患は、最初の病害（例えば、高血圧）と、その病害に対するその後の不適応な腎臓反応の組み合わせによって生じる。かかる反応には、炎症促進性および線維性促進サイトカイン、ならびに成長因子の産生を含む。したがって、ＣＫＤの進行を遅延させる１つの方策は、炎症反応および線維応答を改善させ、腎組織の修復および／または再生によって、腎臓の変性を軽減するかまたは逆行させることである。
慢性腎不全は、ヒトだけでなく一部の家畜にも蔓延している。腎不全に罹患する患者は、腎機能の損失（尿毒症）を経験するだけでなく、赤血球生成によって十分な数の赤血球（ＲＢＣ）を産生する骨髄の能力が低下するために、貧血も発症する。赤血球恒常性は、腎臓に存在する特殊な間質線維芽細胞によるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の産生、および骨髄中の標的とする赤血球前駆細胞のＥＰＯに反応してより多くのＲＢＣを生成する能力の両方に依存する。腎不全の貧血は、腎臓におけるＥＰＯ産生量の低下、および尿毒症因子が骨髄中のＥＰＯの作用に与える悪影響の両方に起因する。
これまでの慢性腎不全の治療に対する臨床的アプロ−チは、腎臓ろ過の回復および尿の産生のための透析および腎臓移植、ならびに赤血球質量を回復するための組替え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体の全身送達を伴う。透析は、中期から後期ステ−ジの腎不全患者にとって生存率の向上をもたらすが、深刻な生活の質の問題の原因となる。腎臓移植は、後期腎不全患者にとって非常に望ましい選択肢である（そして、唯一の選択肢であることが多い）が、高品質のドナ−腎臓の供給が、腎不全集団の需要に満たない。貧血を治療するための組換え型ＥＰＯを用いたボ−ラス投与は、今では深刻な下流の健康リスクと関連づけられており、該薬剤に関するＦＤＡからの黒枠警告に至っており、この集団において赤血球恒常性を回復するための代替治療をさらに検討する必要がある。前臨床調査で、遺伝子治療法によって生成されたＥＰＯを産生する細胞のインビボでの有効性および安全性を調べた。これらの研究により、ＥＰＯを産生する細胞のインビボ送達によって、赤血球生成およびＲＢＣ数を一時的に刺激することができることが分かった。しかしながら、これまでに、これらのアプロ−チのうちで、赤血球恒常性の調節または長期にわたるインビボでの機能性をもたらしたものはない。そのため、ＨＣＴおよびＲＢＣの数が正常値を超えて増加することが多く、真性多血症および他の合併症を引き起こす。治療的意義があり、組換え型ＥＰＯの送達に勝る利点をもたらすＥＰＯを産生する細胞の送達は、ＨＣＴを増加させるのみならず、正および負の制御機構の両方を損なうことなく、赤血球恒常性を回復させなければならない。ＥＰＯ欠乏による貧血は、腎臓疾患に罹患する患者に多く見られるが、心不全、多臓器系不全、および他の慢性疾患を含む他の病態の結果としても発症し得ることに留意することが重要である。
腎臓は、多くの異なる（１０を超える）特殊な細胞型から構成される独特の器官であり、それらの細胞型の全ては、発達上は中間中胚葉から生じるが、成熟すると、形態学的および機能的に異なる区画、ならびに血液のろ過、尿の産生、酸−塩基の調節、および電解質平衡、またエリスロポエチン（Ｅｐｏ）、ビタミンＤ、レニン、およびアンジオテンシンの産生等の内分泌機能の調節を提供するように協調して作用する解剖学的単位を形成する。以下の例によって明らかにされるように、腎臓の細胞内区画は、恒常性維持機能のために大きく相互依存している。輸入細動脈の細胞は、ヘンレ係蹄の太い上行脚の特殊な尿細管細胞（緻密斑）と協調して作用し、糸球体を通る血流を調節する（Ｃａｓｔｒｏｐ， Ｈ． Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ （Ｏｘｆ），１８９：３−１４，２００７）。腎臓によるタンパク質処理は、受容体介在性エンドサイト−シスおよび特別な近位尿細管細胞による糸球体ろ液からのタンパク質再吸収と合わせて、糸球体の有窓内皮細胞、有足細胞、および基底膜によって調整される（Ｊａｒａｄ， Ｇ ＆ Ｍｉｎｅｒ， ＪＨ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ，１８：２２６−３２，２００９）。尿細管細胞による活性ビタミンＤの産生は、細胞外マトリックスの沈積、間質細胞から筋線維芽細胞への変換、および上皮間葉転換を制御する直接的および間接的な機構によって、間質細胞の恒常性を調節する（Ｔａｎ，Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１０３：４９１−６，２００７）。それらの具体的な例に関わらず、腎臓における全ての細胞間相互作用は、空間的および構造的な関係に少なくとも一部依存する。細胞レベルでは、ＣＫＤの進行は、細胞の機能不全または恒常性を維持する細胞間相互作用の損失に起因して、特定の細胞型の損失または１つ以上の細胞型の機能の損失を伴う可能性がある。よって、ＣＫＤの治療への良好な再生アプロ−チは、ある程度、細胞の組織化および細胞間コミュニケ−ションの回復を通じて、恒常性を再確立しなくてはならない。
罹患率およびＣＫＤの進行に伴う死亡率を減少させる目的で、尿細管輸送またはＥｐｏの産生等の特定の腎機能の増強が企図されている。細胞に基づく腎臓疾患の治療アプロ−チの大半は、幹細胞型または前駆細胞型を用いた急性腎不全（ＡＲＦ）の治療的介入に焦点を当ててきた（Ｈｏｐｋｉｎｓ， Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，２１７：２６５−８１，２００９）。ＭＳＣ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ ＢＤ ＆ Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ ＪＶ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ２００８，５９：３１１−３２５）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）（Ｃｈａｄｅ ＡＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００９，１１９：５４７−５５７，Ｐａｔｓｃｈａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００６，６：１７６−１８３）、および胎児細胞または組織の原基（Ｈａｍｍｅｒｍａｎ ＭＲ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２００１， １０：１３−１７、Ｋｉｍ ＳＳ， ｅｔ ａｌ， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００７， ２５：１３９３−１４０１、Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００７， ９２：２６３−２７１、Ｙｏｋｏｏ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６， １７：１０２６−１０３４）を含む種々の細胞型を、ＡＲＦ誘導の直前または直後に腎内送達または全身送達することを伴う、多くの前臨床研究が行われている。ヒトにおけるＡＲＦを治療するための従来の透析の補助として、腎臓の尿細管細胞を含有する体外中空糸ろ過デバイスがテストされた（Ｄｉｎｇ， Ｆ ＆ Ｈｕｍｅｓ， ＨＤ．Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １０９：ｅ１１８−２２， ２００８， Ｈｕｍｅｓ， ＨＤ， ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ６６： １５７８−８８， ２００４， Ｈｕｍｅｓ， ＨＤ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １７： ４５１−５，１９９９）。腎動脈を介した間葉系幹細胞の移植についても、心血管手術処置に続発するＡＲＦエピソ−ドの危険性が高い患者集団において臨床的にテストされている（Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒ， Ｃ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ， ＬＡ，２００９）。ＣＫＤの細胞に基づく治療的介入に対応する限定的な前臨床研究が行われている（Ｃｈａｄｅ， ＡＲ， ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１９：５４７−５７，２００９，Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ，ｅｔ ａｌ．．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ，１７：１５７６−８４，２００６，Ｋｕｃｉｃ，Ｔ，ｅｔ ａｌ．．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９５：Ｆ４８８−９６，２００８）。胎児腎臓の原基＋／−間葉系幹細胞の組み合わせが、げっ歯類において調査されており（Ｙｏｋｏｏ， Ｔ， ｅｔ ａｌ．． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ８５： １６５４−８， ２００８， Ｙｏｋｏｏ， Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １７： １０２６−３４， ２００６）、網等の適切な環境に移植された胎児の全腎組織は、限定的な機能を有する腎臓構造へと発達することができることが明らかである。しかしながら、胎児組織の原基の成分としてのＭＳＣの治療的役割は不明瞭であり、ヒト胎児腎組織を治療目的のために供給することは、運用上および倫理的な課題をもたらす。他の研究では、糸球体腎炎、タンパク質喪失、および線維症を伴うアルポ−ト症候群のモデルである放射線照射ＣＯＬ４Ａ３（−／−）マウスに正常ドナ−骨髄に由来する細胞を移植したところ、漏出性糸球体足細胞をコラ−ゲン遺伝子の変異を持たない正常細胞と交換することによって、該モデルにおける進行が部分的に遅延された（Ｐｒｏｄｒｏｍｉｄｉ， ＥＩ， ｅｔ ａｌ．． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， ２４： ２４４８−５５， ２００６， Ｓｕｇｉｍｏｔｏ， Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， １０３： ７３２１−６， ２００６）。細胞移植は、ｓＣＲＥＡＴ、ＢＵＮ、およびナトリウムレベルの安定化で高い評価を得ていたが、研究２４における比較のための未処置／腎障害の対照は提示されていなかった。Ｃｈａｄｅらは、片側性腎動脈狭窄のブタモデルを用いて、受傷後６週間で腎臓内に送達された自己ＥＰＣの効果を調べた（Ｃｈａｄｅ ＡＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００９， １１９：５４７−５５７）。ＥＰＣは、尿細管間質性線維症をいくらか改善し、糸球体硬化症を有意に改善し、腎臓の血流を改善したものの、該治療による血圧の変化は観察されなかった（Ｃｈａｄｅ ＡＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００９， １１９：５４７−５５７）。これまで、細胞に基づくＣＫＤ治療のインビボでの有効性を調べた研究は、一過性および／または部分的な効果をもたらしてきたが、全身性および組織学的な機能の証拠の両方を集めた研究はほとんどない。ＣＫＤの進行モデルにおける介入後、臨床的意義のある利点の証拠を提供する研究の数が限られているため、細胞に基づく治療が完全に腎機能を回復する可能性について疑問の声が上がっている。しかしながら、腎機能を安定化し、進行を遅延させる再生療法は、この患者集団内でまだ満たされていない医療上の必要性に対応することができる。
進行性ＣＫＤの再現性のあるインビボモデル（複数可）は、候補療法の治療的可能性の評価に不可欠である。ＡＲＦのモデルは非常に多く、化学的に誘発されるか、または虚血／再灌流によって誘発される種々の尿細管障害を含むが、有意な介入を行わない進行性および末期のＣＫＤのモデルはほとんど存在しない。ラットにおける２段階の５／６腎摘出手技は、腎不全の末期および進行性の状態を再現性よく生成し、高血圧、糸球体ろ過率（ＧＦＲ）の低下、血清クレアチニン（ｓＣＲＥＡＴ）およびＢＵＮの上昇、糸球体間質性および尿細管間質性の線維症、高脂血症、高リン血症、ならびに貧血を含むＣＫＤの幾つかの重要な特徴を伴う、全身的および組織学的に検出可能な疾病をもたらす（Ｋａｕｆｍａｎ，ＪＭ，ｅｔ ａｌ．． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ６： １０−７， １９７４２２，Ｐｌａｔｔ，Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ （Ｌｏｎｄ）， １１： ２１７−３１，１９５２，Ｏｒｍｒｏｄ，Ｄ＆Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｎｅｐｈｒｏｎ，２６：２４９−５４，１９８０，Ｂｒｅｎｎｅｒ，ＢＭ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２４９：Ｆ３２４−３７，１９８５）。これらの臨床的に意義のある特徴の存在は、技術的再現性および商業的利用可能性と相まって、本明細書に記載される研究のためにこのモデルを選択することの根拠を提供した。
よって、この患者集団において進行を遅延さて生活の質を向上させ、医療システムの年間費用負担を軽減するための、実質的かつ耐久性のある腎機能の増強を提供する新しい治療パラダイムが必要とされる。再生医療技術は、ＣＫＤに次世代治療の選択肢を提供することができる。
一態様において、本発明は、第１の細胞集団、Ｂ２、および第２の細胞集団を含むヒト腎細胞の混合物を提供し、Ｂ２は尿細管細胞の単離、濃縮された集団を含み、第２の細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む。幾つかの実施形態において、混合物は第３の細胞集団をさらに含む。一実施形態において、Ｂ２細胞集団は集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態において、Ｂ２細胞集団は低酸素耐性である。一実施形態において、Ｂ２細胞集団は、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素−２）の発現を介して、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができる。別の実施形態において、Ｂ２細胞集団はイオジキサノ−ル耐性である。特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する。さらなる実施形態において、第２の細胞集団はＢ４細胞集団である。一実施形態において、Ｂ４細胞集団は、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する。他の特定の実施形態において、第２の細胞集団はＢ３細胞集団である。一実施形態において、Ｂ３細胞集団は、約１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有する。またさらなる実施形態において、混合物はＢ２およびＢ３細胞集団の両方を含む。
さらなる実施形態において、混合物は不活性または所望されない成分が除去されている。一実施形態において、混合物はＢ１細胞集団を含まない、またはそれが除去されている。一実施形態において、Ｂ１細胞集団は、約１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含む。他の特定の実施形態において、混合物は、Ｂ５細胞集団をを含まない、またはそれが除去されている。一実施形態において、混合物は、約１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。
特定の実施形態において、細胞の混合物は、腎機能の安定化および／または改善および／または再生成を提供する。一実施形態において、混合物は、受容体介在性のアルブミン取り込みの能力を有する。他の実施形態において、細胞の混合物は、酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現の能力を有する。さらに他の実施形態において、混合物は、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができるＨＡＳ−２を発現する細胞を含有する。一実施形態において、混合物は、インビボで送達の際、再生刺激を提供することができる。他の実施形態において、混合物は、インビボで送達の際、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる。
全ての実施形態において、第１のおよび第２の細胞集団は、腎臓組織または培養された腎臓細胞に由来し得る。一実施形態において、Ｂ２は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする。別の実施形態において、Ｂ２は、集合管マ−カ−アクアポリン−４（Ａｑｐ４）マ−カ−の発現をさらに特徴とする。
全ての実施形態において、Ｂ４は、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａからなる群から選択される血管マ−カ−の発現を特徴とすることができる。他の特定の実施形態において、Ｂ４は、糸球体マ−カ−ポドシン（Ｐｏｄｎ）またはネフリン（Ｎｅｐｈ）の発現を特徴とすることができる。別の実施形態において、Ｂ４は未分画（ＵＮＦＸ）、Ｂ２、およびＢ３細胞集団と比べて酸素調節可能なＥＰＯ濃縮された集団を特徴とすることができる。別の実施形態において、Ｂ４は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチ−フ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体タイプＢ（Ｅｄｎｒｂ）、コラ−ゲン、タイプＶ、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノ−ゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンギオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナ−ゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌されたタンパク質、酸性、システインに富む（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダ−ゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、ウィルムス腫瘍１（Ｗｔ１）、無羽タイプＭＭＴＶ統合部位ファミリ−、メンバ−４（Ｗｎｔ４）、Ｇ−タンパク質シグナリング４（Ｒｇｓ４）の制御因子、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）からなる群から選択されるマ−カ−の発現を特徴とする。
全ての実施形態において、Ｂ３は、アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−２（Ｆｘｙｄ２）、溶質輸送体ファミリ−１７（リン酸ナトリウム）、メンバ−３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質輸送体ファミリ−３、メンバ−１（Ｓｌｃ３ａ１）、クロ−ディン２（Ｃｌｄｎ２）、ナプシンＡアスパラギン酸ペプチダ−ゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質輸送体ファミリ−２（促進性グルコ−ス輸送体）、メンバ−２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダ−ゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシルＣｏＡ合成酵素中鎖ファミリ−メンバ−２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダ−ゼ３（Ｇｐｘ３）、フルクト−ス−１，６−ビスホスファタ−ゼ１（Ｆｂｐ１）、およびアラニンアミノ基転移酵素２（Ａｇｘｔ２）からなる群から選択されるマ−カ−の発現を特徴とすることができる。他の特定の実施形態において、Ｂ３は、血管発現マ−カ−血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マ−カ−ポドシン（Ｐｏｄｎ）を特徴とする。
一態様において、本発明は第１の細胞集団、Ｂ２、および第２の細胞集団を含むヒト腎細胞の混合物を提供し、Ｂ２は尿細管細胞の単離、濃縮された集団を含み、第２の細胞集団は、血管発現マ−カ−血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マ−カ−ポドシン（Ｐｏｄｎ）を発現する１つ以上の細胞集団を含む。
別の態様において、本発明は、Ｂ２細胞集団を含むヒト腎細胞の単離、濃縮された集団を提供し、Ｂ２は尿細管細胞の単離、濃縮された集団を含む。一実施形態において、Ｂ２細胞集団は、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素−２）の発現を介して、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができる。特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、約１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団を含まない。別の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、約１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含むＢ３細胞集団を含まない。さらに別の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団を含まない。また別の実施形態において、Ｂ２細胞集団は、約１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない。
別の態様において、本発明は、ａ）濃縮されない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を低酸素培養条件に曝すことと、ｂ）Ｂ２細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含むヒトＢ２細胞集団を調製する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法で得たＢ２細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比べた際に、より大きな割合の尿細管細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む。別の実施形態において、方法は、ステップａ）とステップｂ）との間に、１つ以上の細胞分画を分離するために、細胞懸濁液を密度勾配に接触させることを含むステップをさらに含み、第１の細胞分画は、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後の勾配中に存在する。
また別の態様において、本発明は、ａ）濃縮されない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を低酸素培養条件に曝すことと、ｂ）Ｂ４細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含むヒトＢ４細胞集団を調製する方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法で得たＢ４細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比べた場合、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞、非血管細胞、および非糸球体細胞を含む。別の実施形態において、方法は、ステップａ）とステップｂ）との間に、１つ以上の細胞分画を分離するために、細胞懸濁液を密度勾配に接触させることを含むステップをさらに含み、第１の細胞分画は、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後の勾配中に存在する。
また別の態様において、本発明は、ａ）濃縮されない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を低酸素培養条件に曝すことと、ｂ）Ｂ３細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含むヒトＢ３細胞集団を調製する方法を提供する。別の実施形態において、方法は、ステップａ）とステップｂ）との間に、１つ以上の細胞分画を分離するために、細胞懸濁液を密度勾配に接触させることを含むステップをさらに含み、第１の細胞分画は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後の勾配中に存在する。
本発明は、別の態様において、ａ）濃縮されない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を低酸素培養条件に曝すことと、ｂ）細胞懸濁液を、細胞集団内の１つ以上の個々の細胞において、前方散乱および側方散乱の同時測定ができるフロ−サイトメトリ−機器に適用することと、ｃ）細胞集団から細胞の亜集団を選択することと、ｄ）細胞集団から細胞の亜集団を選別することと、ｅ）細胞集団からＢ４細胞の亜集団を単離することと、を含むＢ２細胞調製物を生成する方法も提供し、Ｂ２細胞の亜集団は、集団の大部分と比較して高い前方散乱および高い側方散乱を特徴とする。
別の態様において、本発明は、ａ）濃縮されない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を低酸素培養条件に曝すことと、ｂ）細胞懸濁液を、細胞集団内の１つ以上の個々の細胞において、前方散乱および側方散乱の同時測定ができるフロ−サイトメトリ−機器に適用することと、ｃ）細胞集団から細胞の亜集団を選択することと、ｄ）細胞集団から細胞の亜集団を選別することと、ｅ）細胞集団からＢ４細胞の亜集団を単離することと、を含むＢ４細胞調製物を生成する方法を提供し、Ｂ４細胞の亜集団は、集団の大部分と比較して低い前方散乱および低い側方散乱を特徴とする。全ての実施形態において、前方散乱は細胞の大きさに対応する。全ての実施形態において、側方散乱は細胞の粒度に対応する。
さらに別の態様において、本発明は、必要としている対象へ安定したおよび／または改善した腎機能を提供するために移植可能な構造体を提供し、ａ）１つ以上の生体適合性合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料と、ｂ）前記生体材料に被覆された、その上もしくは中に沈積された、その中に捕捉された、その中に懸濁された、その中に包埋された、および／または別様にそれと組み合わせた第１の細胞集団、Ｂ２、および第２の細胞集団を含む哺乳動物腎細胞の混合物と、を含む。一実施形態において、生体材料に被覆された、その上もしくは中に沈積された、その中に捕捉された、その中に懸濁された、その中に包埋された、および／または別様にそれと組み合わせた第２の細胞集団はＢ４である。別の実施形態において、生体材料に被覆された、その上もしくは中に沈積された、その中に捕捉された、その中に懸濁された、その中に包埋された、および／または別様にそれと組み合わせた第２の細胞集団はＢ３である。さらに別の実施形態において、生体材料に被覆された、その上もしくは中に沈積された、その中に捕捉された、その中に懸濁された、その中に包埋された、および／または別様にそれと組み合わせた混合物は、第３の細胞集団をさらに含む。特定の実施形態において、生体材料に被覆された、その上もしくは中に沈積された、その中に捕捉された、その中に懸濁された、その中に包埋された、および／または別様にそれと組み合わせた混合物は、Ｂ３およびＢ４を含む。全ての実施形態において、混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養された腎臓細胞に由来し得る。一実施形態において、構造体は、混合物の捕捉および／または付着に適した三次元（３−Ｄ）の多孔性生体材料として構成される生体材料を含む。別の実施形態において、構造体は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、懸濁させる、または被覆するために適した液体または半流動体ゲルとして構成される生体材料を含む。さらに別の実施形態において、構造体は、ハイドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）の主に高分子量の種を含む生体材料を含む。別の実施形態において、構造体は、多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸の主に高分子量の種を含む生体材料を含む。また別の実施形態において、構造体は、５．１ｋＤＡ〜２ｘ１０６ｋＤａ超のサイズの範囲のＨＡ分子を含む生体材料を含む。さらに別の実施形態において、構造体は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの細孔を有するポリ乳酸系の発泡体を含む生体材料を含む。また別の実施形態において、構造体は、自己腎臓試料に由来する１つ以上の細胞集団を含む。一実施形態において、腎臓試料は腎生検である。さらなる実施形態において、構造体は、非自己腎臓試料に由来する１つ以上の細胞集団を含む。一実施形態において、構造体は赤血球恒常性を提供する。
また別の態様において、本発明は、必要としている対象の腎臓疾患の治療方法を提供し、ａ）第１の細胞集団、Ｂ２、および第２の細胞集団を含む哺乳動物腎細胞の混合物を含む組成物を対象へ投与することと、ｂ）腎機能の指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを対象からの試験試料において決定することと、を含み、指標レベルの差異は、対象の１つ以上の腎機能の低下の減少、安定化、または改善を示す。特定の実施形態において、方法は、第３の細胞集団を含む細胞の混合物を含む。一実施形態において、第２の細胞集団はＢ４またはＢ３である。別の実施形態において、第３の細胞集団はＢ４またはＢ３である。特定の実施形態において、本発明の方法で治療される腎臓疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏症を伴う。特定の実施形態において、ＥＰＯ欠乏症は貧血である。幾つかの実施形態において、ＥＰＯ欠乏症または貧血は、対象に腎不全に二次的に発生する。幾つかの他の実施形態において、ＥＰＯ欠乏症または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏症、化学療法もしくは抗ウイルス治療、非骨髄癌、ＨＩＶ感染、肝臓疾患、心不全、リウマチ性関節炎、または多臓器系不全からなる群から選択される疾患に二次的に発生する。特定の実施形態において、方法で使用する組成物は、１つ以上の生体適合性合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料をさらに含み、混合物は、生体材料に被覆され、その上もしくは中に沈積され、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および／または別様にそれと組み合わされる。
さらに別の態様において、本発明は、細胞調製およびその混合物、または必要とする対象の腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症の処置に有用な薬物の調製に対する本発明の移植可能な構造体の使用を提供する。
一態様において、本発明は、約１２〜約２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって分離可能である、腎細胞の選択された集団を提供し、細胞集団は、（ｉ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後の勾配中に保持され、（ｉｉ）少なくとも１つの尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする腎臓の尿細管の細胞集団を含み、（ｉｉｉ）受容体介在性アルブミン輸送ができる腎臓の尿細管細胞の亜集団を含み、（ｉｖ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができる。
さらに別の態様において、本発明は、約１２時間〜約２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって分離可能である、腎細胞の選択された集団を提供し、細胞集団は、（ｉ）１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後の勾配中に保持され、（ｉｉ）酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）を発現する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含み、（ｉｉｉ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができ、（ｉｖ）同時投与の際に、請求項６５に記載の腎細胞の集団によって１つ以上の腎機能の調節を増強することができる。
また別の態様において、本発明は、腎細胞の集団を提供し、細胞は、ｉ）２４〜７２時間の期間３７℃および２１％の酸素で、５％のウシ胎仔血清で、高グルコ−スＤＭＥＭと完全に補充されたＫＳＦＭとの１：１の混合物からなる培地に、２５，０００細胞／ｃｍ２の初期の密度で標準の組織−培養−処理したプラスチック皿上の接着培養へ配置され；ｉｉ）同じ培地との５０〜１００％の培地変更に曝され、３７℃および２％の酸素で１８〜２４時間培養され；ｉｉｉ）トリプシン処理を介して収集され、再懸濁され、無血清のＫＳＦＭ培地またはＰＢＳを用いて洗浄され；ｉｖ）調製された密度勾配へ負荷され、該勾配は１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの規定の密度の層を含有し、より大きい密度の少なくとも１つの層およびより少ない密度の少なくとも１つの層を含有し、それによって勾配が少なくとも５、多くて１４ｍＬの液体の総容積で１５ｍＬの円錐管に調製され、勾配に負荷される細胞数は、少なくとも５０００万であるが、１億を超えない、ｖ）制動なしに２０〜３０分間８００ｘＧで遠心分離による勾配を断行され；１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度で分割され；および／またはメガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、カルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、およびアクアポリン−４（Ａｑｐ４）マ−カ−からなる群から選択されるマ−カ−を特徴とし；および／または腎臓疾患を患う免疫適合性の対象の１つ以上の腎機能を安定化させるか、その低下を減少させるか、または改善することができる。
また別の態様において、本発明は、腎細胞の集団を提供し、細胞は、ｉ）２４〜７２時間の期間３７℃および２１％の酸素で、５％のウシ胎仔血清で、高グルコ−スＤＭＥＭと完全に補充されたＫＳＦＭとの１：１の混合物からなる培地に、２５，０００細胞／ｃｍ２の初期の密度で標準の組織−培養−処理したプラスチック皿上の接着培養へ配置され；ｉｉ）同じ培地との５０〜１００％の培地変更に曝され、３７℃および２％の酸素で１８〜２４時間培養され；ｉｉｉ）トリプシン処理を介して収集され、再懸濁され、無血清のＫＳＦＭ培地またはＰＢＳを用いて洗浄され；ｉｖ）調製された密度勾配へ負荷され、該勾配は１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの規定の密度の層を含有し、より大きい密度の少なくとも１つの層およびより少ない密度の少なくとも１つの層を含有し、それによって勾配が少なくとも５、多くて１４ｍＬの液体の総容積で１５ｍＬの円錐管に調製され、勾配に負荷される細胞数は、少なくとも５０００万であるが、１億を超えない、；ｖ）制動なしに２０〜３０分間８００ｘＧで遠心分離による勾配を断行され；１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度で分割され；および／またはＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン（Ｐｏｄｎ）もしくはネフリン（Ｎｅｐｈ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチ−フ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体タイプＢ（Ｅｄｎｒｂ）、コラ−ゲン、タイプＶ、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノ−ゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンギオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナ−ゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌されたタンパク質、酸性、システインに富む（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダ−ゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、ウィルムス腫瘍１（Ｗｔ１）、無羽タイプＭＭＴＶ統合部位ファミリ−、メンバ−４（Ｗｎｔ４）、Ｇ−タンパク質シグナリング４（Ｒｇｓ４）の制御因子、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）からなる群から選択されるマ−カ−を特徴とし；および／または腎臓疾患を患う免疫適合性の対象の１つ以上の腎機能を安定化させるか、その低下を減少させるか、または改善することができる。
一態様において、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する腎臓細胞の単離された集団を提供する。一実施形態において、集団は、ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞の単離、濃縮された集団である。別の実施形態において、集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する哺乳動物細胞を含有する濃縮されない集団より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞を含む、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する哺乳動物細胞の単離、濃縮された集団である。
集団は、腎臓組織または培養された腎臓細胞に由来し得る。集団は、対象から得た腎臓試料に由来し得る。試料は、対象から得た腎臓試料に由来する腎臓組織または培養された腎臓細胞であることができる。別の実施形態において、細胞集団は、ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞を含有する濃縮されない集団より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞を含有する。ある他の実施形態において、細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する哺乳動物細胞を含有する濃縮されない集団より小さな割合の腎臓尿細管細胞を含有する。
全ての実施形態において、細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮することができる。全ての実施形態において、細胞集団は、ＥＰＯを産生しない細胞に対して濃縮することができる。全ての実施形態において、細胞集団は、腎臓尿細管細胞に対して濃縮することができる。
別の態様において、本発明は、特定の培養条件下で生物応答するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞の細胞集団を提供する。ある他の実施形態において、生物応答性は、非低酸素条件下で培養された細胞集団と比較した場合の、細胞集団が低酸素条件下で培養される際の、ＥＰＯ発現の誘導である。さらに別の実施形態において、生物応答性は、非低酸素条件下で培養された細胞集団と比較した場合の、細胞集団が低酸素条件下で培養される際の、ＥＰＯ発現の増加である。幾つかの実施形態において、低酸素培養条件は、限定されないが、細胞集団に対して、酸素レベルが低減されない条件下で培養された細胞集団と比べて培養系の利用可能な酸素レベルを低下させることを含む。ある他の実施形態において、利用可能な酸素レベルの低下は約５％未満であり、酸素レベルが低減しない条件は大気中の酸素レベル（約２１％）である。別の実施形態において、ＥＰＯの発現の増加を、２１％以上のレベルで試験された培養と比べた際に、大気中（２１％）よりも低い酸素レベルで認めることができる。別の実施形態において、誘導のレベルおよび／または増加した発現を大気中の酸素レベル（約２１％）、すなわち非低酸素培養条件で培養された細胞と比較して、ＥＰＯ発現の誘導および／または増加したＥＰＯ発現を、約５％未満の酸素、すなわち低酸素培養条件で細胞を培養する際に認めることができる。一実施形態において、低酸素条件に対して生物応答するＥＰＯ発現を、低酸素誘導因子ＨＩＦによって制御する。別の実施形態において、低酸素条件に対して生物応答するＥＰＯ発現を、ＨＩＦ１αによって制御する。さらに別の実施形態において、低酸素条件に対して生物応答するＥＰＯ発現を、低酸素誘導因子ＨＩＦ２αによって制御する。
一実施形態において、生物応答性は、灌流を介して培養されない細胞集団と比べた際、細胞集団を、灌流を介して培養した際の、ＥＰＯ発現の誘導である。別の実施形態において、生物応答性は、灌流を介して培養されない細胞集団と比べた際の、ＥＰＯの発現の増加である。幾つかの実施形態において、灌流条件は、限定されないが、動力を、液体の流れを介した細胞に伝達するように、液体の一過性、間欠性または継続的な循環または撹拌を含む。別の実施形態において、灌流培養条件を、細胞集団を三次元の構造の形成を可能にするフレ−ムワ−クおよび／または空間を提供する材料中またはその上で培養するように、保持する。
もう１つの態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞集団を含有する腎臓細胞の混合物または組み合わせを提供する。一実施形態において、細胞混合物は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮される第１の細胞集団およびＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない第２の細胞集団を含む。ある他の実施形態において、第２の細胞集団は、以下のうちの１つ以上を含むことができる腎臓由来の細胞のうちの１つ以上のタイプを含有することができる： 尿細管由来の細胞、糸球体由来の細胞、間質由来の細胞、集合管由来の細胞、結合組織由来の細胞、血液由来の細胞、または血管由来の細胞。別の実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮される。
全ての実施形態において、本明細書に記載される腎臓の尿細管細胞は、以下のうちの１つ以上を、含むことができるが、これらに限定されない、尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とすることができる：ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ＣＹＰ２Ｄ２５（ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ）、メガリン、キュビリン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、アクアポリン−１、アクアポリン−２、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。
一態様において、本発明は、単離、濃縮された哺乳動物の腎臓の尿細管の細胞集団を提供する。一実施形態において、単離された細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮され、少なくとも幾つかのＥＰＯを産生する哺乳動物細胞を含有する。別の実施形態において、細胞集団は、尿細管細胞を含有する濃縮されない集団より大きな割合の尿細管細胞を有する。ある他の実施形態において、哺乳動物の腎臓の尿細管細胞の単離、濃縮された集団は、尿細管細胞および少なくとも幾つかのＥＰＯを産生する哺乳動物細胞を含有する濃縮されない集団より大きな割合の尿細管細胞を含有する。別の実施形態において、濃縮された哺乳動物の腎臓の尿細管の細胞集団は、未分画、不均一な混合物と比べて、またはＥＰＯを産生する細胞の濃縮された集団と比べて、比較的にＥＰＯを産生する細胞が除去されている。
全ての実施形態において、腎臓の細胞集団または本明細書に記載される腎臓の細胞集団の混合物由来の供給源のタイプは、自己もしくは同種、同系（自律性または同系移植）、およびそれらの任意の組み合わせであることができる。例えば、幾つかの実施形態において、細胞の混合物は、（ｉ）自己の供給源に由来する第１の細胞集団および自己の供給源に由来する第２の細胞集団、または（ｉｉ）自己の供給源に由来する第１の細胞集団および同種の供給源に由来する第２の細胞集団を含有することができる。
別の態様において、本発明は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された細胞集団を生成する方法を提供する。一実施形態において、方法は、ａ）濃縮されない不均一なげっ歯類の腎臓の細胞集団を有する細胞懸濁液を機械的に解離されたまたは酵素的に消化された哺乳動物腎臓組織から調製する、ｂ）浮遊密度を基に１つ以上の細胞分画を分離するために細胞懸濁液と密度勾配とを接触させる、ｃ）１つ以上の細胞分画を定義するために、ステップｂ）の細胞懸濁液を遠心分離する、およびｄ）濃縮された細胞集団を含有する第１の細胞分画を抽出するステップを含み、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比べた際に、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞およびより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞を有する。ある他の実施形態において、密度勾配は、約１．０２５ｇ／ｍＬ〜約１．０３５ｇ／ｍＬの間、または約１．０４５ｇ／ｍＬ未満の特定の密度の層を含む。別の実施形態において、ステップｄ）の第１の細胞分画は、約１．０２５ｇ／ｍＬ〜約１．０３５ｇ／ｍＬの間、または約１．０４５ｇ／ｍＬ未満の特定の密度で遠心分離後、勾配中に存在する。ある他の実施形態において、ステップ（ｃ）の遠心分離は、該濃縮されたＥＰＯを産生する細胞集団に対して濃縮されない少なくとも１つの追加細胞分画をさらに生成する。別の実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加細胞分画を抽出するステップｅ）をさらに含む。ある他の実施形態において、密度勾配は約１．０６２ｇ／ｍＬ〜約１．０８８ｇ／ｍＬの間の特定の密度の層を含む。別の実施形態において、追加の細胞分画は、約１．０６２ｇ／ｍＬ〜約１．０８８ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後、勾配中に存在する。
別の実施形態において、方法は、ａ）少なくとも幾つかのＥＰＯを発現するまたは発現できる細胞を含む培養された濃縮されない不均一な哺乳動物細胞の集団から細胞懸濁液を調製する、ｂ）浮遊密度を基に１つ以上の細胞分画を分離するために細胞懸濁液と密度勾配を接触させる、ｃ）１つ以上の細胞分画を定義するためにステップｂ）の細胞懸濁液を遠心分離する、およびｄ）濃縮された細胞集団を含有する第１の細胞分画を抽出するステップを含み、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比べた際に、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞およびより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞を有する。一実施形態において、ステップａ）の細胞懸濁液を、培養された非、濃縮された不均一なげっ歯類の細胞の集団から得る。かかる実施形態において、密度勾配は、約１．０７３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度の層を含む。一実施形態において、ステップｄ）の第１の細胞分画は、約１．０７３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後、勾配中に存在する。ある他の実施形態において、ステップ（ｃ）の遠心分離は、該濃縮されたＥＰＯを産生する細胞集団に対して濃縮されない少なくとも１つの追加細胞分画をさらに生成する。別の実施形態において、方法は、少なくとも１つの追加細胞分画を抽出するステップｅ）をさらに含む。ある他の実施形態において、密度勾配は約１．０４１ｇ／ｍＬ〜約１．０６２ｇ／ｍＬの間の特定の密度の層を含む。別の実施形態において、追加の細胞分画は、約１．０４１ｇ／ｍＬ〜約１．０６２ｇ／ｍＬの間の特定の密度で遠心分離後、勾配中に存在する。
幾つかの実施形態において、濃縮された細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮され、ＥＰＯを産生しない細胞が除去される。他の実施形態において、濃縮された細胞集団は、間質性線維芽細胞に対して濃縮され、尿細管細胞および集合管細胞が除去される。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、ステップ（ｃ）の遠心分離は、該濃縮された細胞集団に対して濃縮されない少なくとも１つの追加の細胞分画をさらに生成する。幾つかの実施形態において、追加の細胞分画は、濃縮されない細胞集団と比べた際に、より大きな割合のＥＰＯを産生しない細胞およびより小さな割合のＥＰＯを産生する細胞を含有する。一実施形態において、少なくとも１つの追加の細胞分画は、第１の細胞分画と比べた際に、より小さな割合のＥＰＯを産生する細胞を有する。別の実施形態において、追加の細胞分画は、第１の細胞分画と比べた際に、より大きな割合の腎臓の尿細管細胞を含有する。
幾つかの実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された細胞集団を生成する方法で使用する密度勾配は、イオジキサノ−ルの密度勾配である。
別の態様において、本発明は、フロ−サイトメトリ−法を使用してエリスロポエチンＥＰＯを産生する細胞の濃縮された集団を生成する方法を提供する。一実施形態において、方法は、ａ）濃縮されない不均一の腎臓の細胞集団を含む細胞懸濁液を機械的に解離されたまたは酵素的に消化された哺乳動物腎臓組織から調製する、ｂ）細胞集団内の１つ以上の個々の細胞の前方散乱および側方散乱の同時測定ができるフロ−サイトメトリ−機器へ細胞懸濁液を適用する、ｃ）細胞集団から細胞亜集団を選択する、ｄ）細胞集団から細胞亜集団を選別する、ｅ）細胞集団から細胞亜集団を単離するステップを含み、細胞亜集団は、全集団と比べて低い前方散乱および低い側方散乱を特徴とする。
別の実施形態において、方法は、ａ）少なくとも幾つかのＥＰＯを発現するまたは発現できる細胞を含む培養された哺乳動物細胞の集団から細胞懸濁液を調製する、ｂ）細胞集団内の１つ以上の個々の細胞における前方散乱および側方散乱の同時測定ができるフロ−サイトメトリ−機器へ細胞懸濁液を提供する、ｃ）細胞集団から細胞亜集団を選択する、ｄ）細胞集団から細胞亜集団を選別する、ｅ）細胞集団から細胞亜集団を単離するステップを含み、細胞亜集団は、全集団と比べて低い前方散乱および低い側方散乱を特徴とする。
さらに別の実施形態において、前方散乱は細胞の大きさに対応する。一実施形態において、側方散乱は細胞の粒度に対応する。本発明の他の実施形態は、ｉ）ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮され、ＥＰＯを産生しない細胞が除去された、またはｉｉ）ＥＰＯを産生する特定の間質性皮質線維芽細胞に対して濃縮され、上皮細胞が除去された、濃縮された細胞分画を提供する。ある他の実施形態において、選択ステップｃ）は、該細胞集団に対して濃縮されない少なくとも１つの追加画分を生成することを含む。別の実施形態において、追加の画分は、ＥＰＯを濃縮された画分と比べて、より小さな割合のＥＰＯを産生する細胞を含有する。
本発明のさらなる態様において、方法は、インビトロでの培養のステップをさらに含む。一実施形態において、濃縮された細胞集団を単離後にインビトロで培養する。別の実施形態において、培養ステップは、該細胞集団の成長および／または維持を支えるために適した培地の哺乳動物細胞の培養に適したガラスまたはプラスチックの表面上の二次元の単層培養の使用を含む。他の実施形態において、培養ステップは、細胞の維持および／または成長に適した三次元の（３Ｄ）足場上で細胞を培養することを含む。ある他の実施形態において、足場は、１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する。別の実施形態において、足場は、哺乳動物細胞を捕捉するまたは付着するために適した多孔性の足場として構成される。他の実施形態において、足場は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、または被覆することに適したゲルとして構成される。
別の態様において、本発明は、灌流条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一実施形態において、灌流条件は、限定されないが、動力を、液体の流れを介した細胞に伝達するように、液体の一過性、間欠性または継続的な循環または撹拌を含む。別の実施形態において、灌流培養条件を、細胞集団を三次元の構造の形成を可能にするフレ−ムワ−クおよび／または空間を提供する材料中またはその上で培養するように、保持する。
別の態様において、本発明は、低酸素条件下で培養するステップを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、低酸素培養条件は、限定されないが、細胞集団に対して、酸素レベルが低減されない条件下で培養された細胞集団と比べて培養系の利用可能な酸素レベルを低下させることを含む。ある他の実施形態において、利用可能な酸素レベルの低下は約５％未満であり、酸素レベルが縮小しない条件は大気中の酸素レベル（約２１％）である。別の実施形態において、低減された酸素の条件は、２１％（大気中）未満の酸素レベルによって表される。
もう１つの追加態様において、本発明は、細胞集団のＥＰＯ発現を測定するステップを含む方法を提供する。全ての実施形態において、ＥＰＯ発現は、ＥＰＯｍＲＮＡ発現である。全ての実施形態において、ＥＰＯ発現は検出可能である、および／または検出される。別の実施形態において、ＥＰＯ発現は、灌流を介して培養されない細胞集団と比べた際に、灌流を介して培養された細胞集団において誘発される。他の実施形態において、ＥＰＯ発現は、非低酸素条件下で培養された細胞集団と比べた際に、低酸素条件下で培養された細胞集団において誘発される。別の実施形態において、検出可能なＥＰＯ発現は、灌流を介して培養されない細胞集団と比べた際に、灌流を介して培養された細胞集団よりも多い。追加の実施形態において、検出可能なＥＰＯ発現は、非低酸素条件下で培養された細胞集団と比べた際、低酸素条件下で培養された細胞集団により多い。ある他の実施形態において、ＥＰＯ発現の誘導および／または増加したＥＰＯ発現は、誘導のレベルおよび／または増加した発現を大気中の酸素レベル（約２１％）、すなわち非低酸素培養条件で培養された細胞と比較して、約５％未満の酸素、すなわち低酸素培養条件で細胞を培養する際に認めることができる。別の実施形態において、増加したＥＰＯ発現を、２１％の酸素（大気中）条件よりも、少ない細胞を培養する際に認めることができる。
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載される１つ以上の細胞集団を含有する移植可能な構造体を提供する。一実施形態において、本発明は、必要な対象に対してエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞集団を提供するための移植可能な構造体を提供し、その構造体は、ａ）１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する足場、およびｂ）足場の表面内、またはその上に沈積されたＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団を含む。
別の実施形態において、本発明は、必要とする対象へエリスロポエチン ＥＰＯを産生する細胞集団を提供するための移植可能な構造体を提供し、構造体は、ａ）１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する多孔性の足場、およびｂ）ｉ）ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団、およびｉｉ）ＥＰＯを産生しない細胞に対して濃縮された第２の細胞集団を含有する細胞の混合物を含み、細胞の混合物は、足場の表面上および／または細孔内に沈積される。幾つかの実施形態において、ＥＰＯ発現は、第２の細胞集団と比べて第１の細胞集団より多い。ある他の実施形態において、第２の細胞集団は、以下のうちの１つ以上を、限定されないが、含むことができる１つ以上の腎臓由来の細胞タイプを含有することができる：尿細管由来の細胞、糸球体由来の細胞、間質由来の細胞、結合組織由来の細胞、集合管由来の細胞、血液由来の細胞、または血管由来の細胞。別の実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮される。本発明の幾つかの実施形態において、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない、尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする腎臓の尿細管細胞に対して濃縮された集団を提供する：メガリン、キュビリン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、アクアポリン−１、およびアクアポリン−２。
一実施形態において、本発明によって提供される腎臓細胞の混合物は、本明細書に記載される通り、腎臓組織の供給源のタイプに由来する細胞集団を含むことができる。他の実施形態において、第１の細胞集団および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養された腎臓細胞に由来する。別の実施形態において、第１の細胞集団は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する哺乳動物細胞を含有する濃縮されない集団より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞を含有する。別の実施形態において、第１の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に加えて糸球体細胞および血管細胞を含有する。さらに別の実施形態において、第１の細胞集団は、第２の細胞集団より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞を含有する。本発明のさらなる実施形態は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する哺乳動物細胞の濃縮されない集団より小さな割合の腎臓の尿細管細胞を含有する第１の細胞集団を含む。他の実施形態において、第１の細胞集団は、第２の細胞集団より小さな割合の腎臓の尿細管細胞を含有する。幾つかの実施形態において、細胞を生体材料と組みあわす。一実施形態において、足場または生体材料は、三次元（３−Ｄ）の多孔性の足場として構成される。別の実施形態において、３−Ｄの多孔性の足場は、哺乳動物細胞の捕捉または付着に適している。さらに別の実施形態において、足場または生体材料は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、または被覆するために適した液体または半流動体ゲルとして構成される。一実施形態において、本発明の構造体で使用することに適した細胞集団は、自己または非自己の腎臓試料に由来する。ある他の実施形態において、試料は腎生検である。
もう１つの他の態様において、本発明は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された細胞集団を必要とする対象の治療の方法を提供する。一実施形態において、方法は、必要とする対象のエリスロポエチン （ＥＰＯ）欠乏症の治療に対してであり、ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与するステップを含む。別の実施形態において、第１の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮される。一実施形態において、ＥＰＯ欠乏症は貧血である。別の実施形態において、ＥＰＯ欠乏症または貧血は、対象の腎不全に二次的に発生する。ある他の実施形態において、ＥＰＯ欠乏症または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏症、化学療法もしくは抗ウイルス治療、非骨髄癌、ＨＩＶ感染、肝臓疾患、心不全、リウマチ性関節炎、または多臓器系不全からなる群から選択される疾患に二次的に発生する。
別の実施形態において、方法は、必要とする対象の腎臓の疾病の治療に対してであり、ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与するステップを含む。別の実施形態において、第１の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮される。
幾つかの実施形態において、必要とする対象へ投与される組成物は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない第２の腎臓の細胞集団をさらに含有する。他の実施形態において、組成物は、１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する多孔性の足場をさらに含み、第１の細胞集団は、足場の表面および／または細孔内に沈積される。追加の実施形態において、組成物は、１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する多孔性の足場をさらに含み、第１の細胞集団および第２の細胞集団は、足場の表面および／または細孔内に沈積される。別の実施形態において、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団は、哺乳動物腎臓組織または培養された哺乳動物腎臓細胞に由来する。他の実施形態において、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団は、自己または非自己の腎臓試料に由来する。一実施形態において、試料は腎生検である。
一実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、腎臓の尿細管細胞は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない、尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする：メガリン、キュビリン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、アクアポリン−１、およびアクアポリン−２。
全ての実施形態において、第２の細胞集団は、尿細管由来の細胞、糸球体由来の細胞、間質由来の細胞、集合管由来の細胞、結合組織由来の細胞、血液由来の細胞、または血管由来の細胞からなる群から選択される１つ以上の腎臓由来の細胞タイプを含む。全ての実施形態において、第２の細胞集団は、不均一な未分画の集団または第１の細胞集団と比べて、比較的に糸球体細胞、血管細胞、および酸素応答性のＥＰＯを産生する細胞が除去されている。
別の態様において、本発明は、必要とする対象に赤血球恒常性を提供する方法を含む。一実施形態において、方法は、ａ）ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与する、およびｂ）赤血球生成機能指標のレベルが、照の指標のレベルと比べて異なることを対象からの試験試料において測定するステップを含み、指標レベルの差は、対象における赤血球恒常性を示す。
別の実施形態において、方法は、ａ）ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮される第１の細胞集団およびＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない第２の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与する、およびｂ）赤血球生成機能指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを対象からの試験試料において測定するステップを含み、指標レベルの差は、対象における赤血球恒常性を示す。
別の態様において、本発明は、必要とする対象の腎機能を改善する方法を含む。ある他の実施形態において、方法は、ａ）ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮される第１の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与する、およびｂ）腎機能指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを対象からの試験試料において測定するステップを含み、指標レベルの差は、対象における腎機能の改善を示す。別の実施形態において、組成物は、１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する多孔性の足場をさらに含み、第１の細胞集団は、足場の表面および／または細孔内に沈積される。
別の実施形態において、方法は、ａ）ＥＰＯを産生する哺乳動物細胞に対して濃縮された第１の細胞集団およびＥＰＯを産生する細胞を濃縮されない第２の細胞集団を含有する組成物を対象へ投与する、およびｂ）腎機能の指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを対象からの試験試料において測定するステップを含み、指標レベルの差は、対象の改善した腎機能を示す。別の実施形態において、組成物は、１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含有する多孔性の足場をさらに含み、第１の細胞集団および第２の細胞集団は、足場の表面および／または細孔内に沈積される。
他の実施形態において、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団は、哺乳動物腎臓組織または培養された哺乳動物腎臓細胞に由来する。別の実施形態において、第１の細胞集団および／または第２の細胞集団は、自己または非自己の腎臓試料に由来する。ある他の実施形態において、試料は腎生検である。
一実施形態において、第１の細胞集団は、低酸素応答性のＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、第１の細胞集団は、低酸素応答性のｅｐｏを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮される。
一実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、腎臓の尿細管細胞は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない、尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする；ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ＣＹＰ２Ｄ２５（ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ）、メガリン、キュビリン、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、アクアポリン−１、アクアポリン−２およびアクアポリン−４。別の実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮され、集合管の上皮細胞を含有する。別の実施形態において、第２の細胞集団は、尿細管細胞に対して比較的に濃縮され、集合管上皮細胞を含有し、低酸素応答性のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞が比較的に減少する。
正常な腎臓組織と比較した、疾病した腎臓組織の線維症を強調するゴモリトリクロ−ム染色を示す。 慢性腎臓疾患を患うブタからの細胞中のエリスロポエチン遺伝子の酸素制御発現を示す。 増殖培養物の尿細管の様構造を表す。 培養された機能性尿細管細胞による、アルブミンの受容体介在性取り込みを表す。 初期のヒト腎臓組織中よりも相対的により多い単離後のＥＰＯ発現を示す。 ヒト腎臓からの培養細胞中のＥＰＯ遺伝子発現の保持を示す。 大気中（２１％）酸素レベルでの、３次元で動的培養された（＋）ＥＰＯ発現の結果を表す。 低い（２％）酸素レベルでの、３次元で動的培養された（＋）ＥＰＯ発現を示す。 遷延培養物中の動的培養された（＋）尿細管遺伝子発現を表す。 低酸素培養物中のＥＰＯ発現対正常酸素圧培養物中のＥＰＯ発現を示す。 インビトロでの動的３次元培養による、ＥＰＯ発現の刺激を表す。 ２次元および３次元培養物より収集した、細胞可溶化液（上のパネル）および条件培地（下のパネル）の双方中の定量化された標的タンパク質のＥＬＩＳＡ結果を表す。 標準的方法を使用して１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した、Ｈ＆Ｅ染色し、播種したＯＰＬＡおよびＣｏｌ１足場（灌流または静的培養の７日後に染色した）を示す。Ｈ＆Ｅ染色を、細胞の存在および形態を検討するために行った。細胞充実性は、静的足場に対してより灌流において優れており、ＯＰＬＡ足場と比べて、Ｃｏｌ１足場においてより顕著であった。より際立っていたことは、静的Ｃｏｌ１足場と比べて、灌流Ｃｏｌ１足場において細胞組織が存在していたことである。 培養の（７）日後のＯＰＬＡおよびＣｏｌ１足場のＳＥＭを表す（静的および灌流）。静的よりも灌流においてより優れた細胞充実性、ならびに静的条件よりもＣｏｌ１灌流中におけるその優れた細胞組織および相互接続性に留意されたい。 溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）の添加によって、足場または２次元培養物より単離したｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。３次元足場の場合、ＲＮＡの完全な溶解および遊離を保証するため、電気均質化（ポリトロン）を使用した。精製したｍＲＮＡを、目的の標的遺伝子に特異的なイントロンスパンプライマ−を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析に供した。（レ−ン１−７：種々の３次元立体配置（灌流された）／５日間培養、レ−ン８〜１０：種々の２次元立体配置／５日間培養、レ−ン１１〜１７：種々の初期の細胞集団（播種前）、レ−ン１８〜１９：２次元培養物／４日間培養、レ−ン２１：肉眼的に解剖した新鮮な組織）。 ３つの異なる播種された足場の代謝活性を表す。 一次腎臓細胞の灌流および静的３次元培養物による、グルコ−スおよびグルタミンの消費を示す。 処置後のげっ歯類の平均生存時間（日）を表す。 研究の間のげっ歯類の体重を示す。 処置前から屠殺までの体重増加を図表で表す。 週平均の血清ＢＵＮ濃度を表す。 週平均の血清クレアチニン濃度を示す。 中間点／個々のラットデ−タでの相対ＢＵＮを表す。 中間点／個々のラットデ−タでの相対血清クレアチニンを示す。 中間点（個々のラットデ−タ）でのＨＣＴと比べた週平均のＨＣＴを示す。 中間点（個々のラットデ−タ）での相対的ＨＣＴ表す。 腎摘除術後の血清クレアチニンを示す。 腎摘除術後のヘマトクリットを示す。 週平均のＲＢＣ＃を示す。 中間点／個々のラットデ−タでの相対的ＲＢＣ＃表す。 終末血清電解質濃度を表す。 相対血清亜リン酸（最終）／個々のラットデ−タを示す。 終末血清タンパク質濃度を表す。 相対血清アルブミン＆総タンパク質（最終）／個々のラットデ−タを示す。 終末血清肝臓機能を表す。 終末血清コレステロ−ル、トリグリセリド、およびグルコ−スを示す。 相対血清コレステロ−ル、トリグリセリド、グルコ−ス（最終）／個々のラットデ−タを示す。 終末Ｈｂ、ＭＣＨ、＆ＭＣＨＣを表す。 終末相対［Ｈｂ］／個々のラットデ−タを示す。 終末白血球数を表す。 終末白血球組成物を示す。 終末網状赤血球を表す。 終末血小板デ−タを示す。 水泳試験結果を示す。 各試験群からの骨髄の代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的切片を表す。上のパネルは、対照と比べて、ＮＸ＋細胞注入骨髄細胞充実性および骨髄と赤血球の比率が等しく現れることを示す。対照的に、ＮＸ＋構造体および無処置の動物のその骨髄は、中等度および顕著であり、減少した骨髄細胞充実性、それぞれ（拡大率２００ｘ）、を示した。下のパネルは、上のパネル中の囲まれた図の拡大図を示す（拡大率不明）。 各試験群からの脾臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的切片を示す。上のパネルは、いずれの主要な組織の差異または変化も、対照およびＮＸ＋細胞注入群間において、観察されなかったことを示す。対照的に、ＮＸ＋構造体および無処置の動物における即時の嚢下赤脾髄空間は中等度および顕著な、成人赤血球（ＲＢＣ）およびＲＢＣ前駆物質（拡大率２００ｘ）における減少をそれぞれ示した。下のパネルは、上のパネル（拡大率不明）中の囲まれた図の拡大図を示す。 各試験群からの肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的切片を示す。いずれの感知可能な変化も、対照群と比べた場合、肝実質および／またはＮＸ＋構造体または無処置のＮＸ動物の門脈三管において観察されなかった。対照的に、類洞造血発生（円）の焦点領域を、ＮＸ＋細胞注入群中に記した（拡大率２００ｘ）。下のパネルは、上のパネル中に示された門脈三管の拡大図を示す（拡大率不明）。 各試験群からの腎臓の代表的なＨ＆Ｅ染色された組織学的切片を表す（拡大率1ｘ）。上のパネルは、対照と比べ、他の３つの群の腎臓切片が、乏しいヘモジデリン色素、および多発性尿細管再生によって特徴付けられる、全ての群において、構造の損失を伴う進行性糸球体および尿細管変性を示したことを示す（拡大率２００ｘ）。矢印は構造体処置部位を指す。下のパネルは、その上のパネル中の囲まれた図の拡大図を示す（拡大率不明）。 個々のラットデ−タ／ＨＣＴ％と血清クレアチニンとの対比を示す。群５＝黒丸、群６＝丸数字「３」、群４＝丸数字「１」、群１＝丸数字「４」、群２＝丸数字「２」。 多層状のステップ勾配技術（左のパネル）または単層混合する勾配技術を使用する、新鮮に解離された腎臓組織からのＥＰＯを産生する細胞分画の濃縮を示す。双方の方法は、１．０２５ｇ／ｍＬおよび１．０３５ｇ／ｍＬ間に現れる、ｅｐｏバンドからのＥＰＯを産生しない細胞成分（主に尿細管細胞）の部分的除去をもたらす。 Ｅカドヘリン発現を確認する、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴＰＣＲ）結果を示す。 密度ステップ勾配を使用し、Ｅｐｏ濃縮を確認する定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴＰＣＲ）結果を示す。 単離時での、培養物中のステップ勾配分画の相対的遺伝子発現を図表で表す。パネル（ａ）および（ｂ）は、組織解離後即時に密度勾配分画に供する、一次腎臓細胞の２つの別個のバッチを示す。エリスロポエチン（Ｅｐｏ）ｍＲＮＡ発現は、双方のバッチ中のステップ勾配のバンド１において再現性よく濃縮される。全ての試料中のＥｐｏの発現は、新鮮に消化された不均一の腎臓細胞集団に対して正規化された。パネル（ｃ）は、バンド１が、ｅｐｏ発現に対する濃縮に加えて、尿細管マ−カ−、Ｎカドヘリン、Ｅカドヘリン、アクアポリン１および２の低発現によって示されるように、尿細管細胞が相対的に除去されていることを明白に示す。対照的に、尿細管マ−カ−を、バンド２および３において濃縮させ、ステップ勾配の追加の特徴を強調する−尿細管細胞分画の併用濃縮。 アクアポリン−１、尿細管細胞マ−カ−のウエスタンブロット分析を示す。分画２＆３の尿細管細胞濃縮のさらなる支持において、パネル（ｄ）、図２で説明されるように、このウエスタンブロットは、バンド２＆３において、アクアポリン１タンパク質の明白および特異的な濃縮を示す。 処置後１６週目でのヘマトクリットレベルを示す。 処置後１２週目でのヘモグロビンレベルを示す。 対照群および無処置群と比べて、ｒＥＰＯの２つの異なる用量で処置された腎摘出されたラットの５／６における、経時的ヘマトクリットレベルを示す。 尿細管濃縮した細胞およびｒＥＰＯと比べて、ＥＰＯ濃縮した細胞の高用量および低用量で処置された腎摘出されたラットの５／６における、経時的ヘマトクリットレベルを示す。 ａおよびｂは、処置後１６週目での血清クレアチニン濃度およびクレアチニンを、処置前〜処置後１６週目の対照に対するパ−セントとして表す。 処置後１２週目での水泳耐久性結果を示す。 初期の体重のパ−セントとして、処置後１６週目での体重増加を示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラット間の健常対照に対するパ−セントとして血清クレアチニンを表す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、処置後１２週目でのアルブミン／グロブリン比を示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、リン：カルシウム比を示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、血清トリグリセリドレベルを示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、血清コレステロ−ルレベルを示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、血清ヘモグロビンレベルを示す。 無処置尿毒症ラット、およびＥＰＯ濃縮した細胞（原型＃２）または尿細管濃縮した細胞（原型＃４）の高用量で処置された尿毒症ラットにおける、血清ヘマトクリットレベルを示す。 機能性げっ歯類腎臓尿細管細胞による、ロ−ダミン抱合アルブミン取り込みを表す。 無処置尿毒症ラットと比べた、ネオ腎臓細胞（不均一なＥＰＯを産生する細胞）処置された尿毒症ラット中の正常なレベルに近いレベルでの血清クレアチニン（腎臓機能指標）の維持を示す。 尿細管、および正常なヒト腎臓から単離、かつ増殖した糸球体細胞の表現型特質の維持を表す。 ３次元動的培養物中で培養された尿細管枯渇した集団と比べた、尿細管マ−カ−であるカドヘリンの、尿細管濃縮した集団の増加した発現を表す。 フロ−サイトメトリ−を通して、ＥＰＯを産生する細胞の分離を示す。 別々に収集され、同一のステップ勾配ステップ勾配に並んで供された、「正常酸素圧」（２１％の酸素）および「低酸素」（２％の酸素）げっ歯類培養物のステップ勾配を示す。 別々に収集され、同一のステップ勾配ステップ勾配に並んで適用された、「正常酸素圧」（２１％の酸素）および「低酸素」（２％の酸素）イヌ培養物のステップ勾配を示す。 Ｂ４における遺伝子発現への低酸素培養効果を表す。 Ｂ２およびＢ４亜分画の組成物分析の結果を表す。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）を、Ｂ２およびＢ４亜分画において、腎臓細胞型特異的遺伝子の発現を評価するために使用した。（ａ、ｂ）Ｂ４および全ての他の亜分画と比べてビタミンＤヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｒ１）およびキュビリンの相対的発現に基づいて、亜分画Ｂ２を近位尿細管細胞に対して濃縮した。（ｃ）また、その遠位尿細管マ−カ−であるＥカドヘリンを、Ｂ４に比べて、亜分画Ｂ２において濃縮した。（ｅ、ｆ）その糸球体マ−カ−であるネフリンおよびポドシンを亜分画Ｂ４において濃縮し、血管マ−カ−であるｋｄｒ（ｄ）も濃縮した。（ｇ、ｈ）また、その酸素制御間質性マ−カ−であるＨｉｆ２αおよびＥｐｏを、Ｂ４において濃縮した。（ｉ）結果は、Ｂ２およびＢ４に対して定量的に示される。（ｊ）Ｂ２による、近位（Ｎ−カドヘリン／緑色）および遠位（Ｅ−カドヘリン／赤色）尿細管マ−カ−の頑健な発現を、亜分画後に培養された細胞への免疫細胞化学を通して確認した、（ｊ）対照的に、Ｅ−カドヘリン−またはＮ−カドヘリン−陽性細胞は、Ｂ４培養物中においてまれであった。 Ｂ２およびＢ４亜分画の機能性特質を表す。（ａ）Ｂ２およびＢ４細胞を継代培養し、キュビリン発現および受容体介在性アルブミン取り込みに対して評価した。パネルは、ｉ．キュビリンに対してイソタイプ一致ＩｇＧ対照抗体で染色されたＢ２細胞；ｉｉ．競合的阻害剤、ＲＡＰで前処置されたＢ２細胞、ロ−ダミン抱合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ロ−ダミン）を用いて１５分間（１０μｇ／ｍｌ）パルスした；ｉｉｉ．ＨＳＡ−ロ−ダミンを用いて１５分間（１０μｇ／ｍｌ）パルスし（赤色）、抗キュビリン抗体（緑色）で標識したＢ２細胞；ｉｖ．ＨＳＡ−ロ−ダミン（赤色）の取り込みを用いて、キュビリン＋細胞（緑色）の共局在を示す（ｉｉｉ）の表面を覆う画像；ｖ．（ｉｉｉ／ｉｖ）と同じであるが、非常に少ないキュビリン＋細胞（緑色）、および皆無かそれに近いアルブミン取り込み（赤色）を示すＢ４細胞、を表す。全ての条件において、核をＨｏｅｃｈｓｔ（青色）を用いて対比染色した。（ｂ）Ｅｐｏの発現を各分画（Ｂ１〜Ｂ４）において検討し、大気中（２１％）または低（２％）酸素分圧（双方３７°Ｃ）に暴露２４時間後、産生した。酸素分圧の低下に応答して、Ｅｐｏ上方制御できるＥｐｏ発現細胞のその相対的比率は、亜分画Ｂ４において最大である。Ｂ２およびＢ４での、Ｅｐｏの相対発現における、図１（ｉ）に説明される結果との一貫性に留意されたい。 尿毒症／貧血性ラットにおける生存時間、体重、および心臓の重量への、Ｂ２およびＢ４のインビボでの移植の効果を示す。（ａ）生存の割合を、研究継続時間（腎摘除術後３０週間、処置後６ヶ月）にわたる、各対照および処置群に対して表す。処置群間で、Ｂ２処置されたラットのみ、健常対照と等しい１００％の生存を有した。（ｂ）経時的体重の変化％を、各ラットに対して、（（屠殺時の体重）−（研究開始時の体重））／（研究開始時の体重）として、個々に算出した。Ｎｘ対照動物の体重の５％損失と比べて、Ｂ２処置された動物の体重の１４．３％の増加は、非常に有意であるとみなされた（Ｐ値○<．０００１）。また、Ｂ４（Ｐ値＝０．０２３９）および媒体（Ｐ値＝０．０１２５）は、Ｎｘ動物よりも有意に高い体重増加を示した。（ｃ）相対的心臓の重量を、剖検の時、体重の％として算出した。無処置のＮｘラットは、剖検の時、有意に肥大した心臓ｗｐ有した（健常対照の１５０％）。Ｂ２は、Ｎｘ動物と比べて、６ヶ月処置後（図３ｃ）の相対的心臓の重量において２５％増加のみを示した（Ｐ値○<０．０００１）。また、Ｂ４（Ｐ値＝０．０００２）および媒体（Ｐ値○<０．０００１）も、Ｎｘ対照より、統計学的に有意であった。 ろ過および赤血球生成への処置効果の時間的および統計的評価を表す。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ （Ｃａｒｙ， ＮＣ）からのＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０を使用して、全ての１０〜２０週間のデ−タからの血清化学結果に行った。（ａ、ｂ、ｃ）赤血球生成の有意な差異を、処置群（ＨＣＴ、ｐ＝０．０００５；ＲＢＣ、ｐ＝０．００２９）間に観察した、Ｂ２およびＢ４処置されたラットは、無処置Ｎｘ、ＵＮＦＸ処置、およびｒＥＰＯ処置よりも最も優れた改善を示している。（ｄ、ｅ、ｆ）ろ過機能における有意な差異を、処置群（ｓＣＲＥＡＴ、ｐ○<０．０００１）；ＢＵＮ、ｐ○<０．０００１）間に観察し、Ｂ２処置の効果は最も有意であり、Ｂ４が後に続く。 研究中間点（Ｗｋ１２〜１４）の臨床評価の結果を示す。血液を、研究中間点（１２〜１４週目）で、臨床化学のために収集し、健常対照およびＮｘ、またはＮｘ対Ｂ２−、Ｂ４−、またはＵＮＦＸ処置間の差異を強調するパラメ−タを、パネル（ａ）において示す。Ｂ２処置に独特である２つの有意な効果は、（ｂ）Ｂ２とＮｘとの対比における血清アルブミン（ｓＡＬＢ）およびアルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）比の増加によって示されるように、タンパク質の保持の増強（ｐ○<０．００１）、および（ｃ）Ｂ２とＮｘとの対比における血清トリグリセリドおよびコレステロ−ルの低下（ｐ○<０．００１）、であった。 腎臓腫瘤が腎臓機能と相関することを示す。腎臓の重量（右）を剖検時に収集した。（ａ）Ｂ２処置された腎臓の片腎臓腫瘤は、健常対照と同等であった。倍検時に収集された血清中のｓＣＲＥＡＴの試験は、腎臓腫瘤とｓＣＲＥＡＴ（パネルａ、第２軸）間の明白な逆相関を明らかにした。（ｂ）研究における全てのラットの腎臓腫瘤およびｓＣＲＥＡＴの直線回帰分析は、腎臓体重および腎機能の有意な逆相関を確認した（ｒ２＝．３８、Ｐ値○<０．００１）。 ＳＲＹに対するプロ−ブを用いたＰＣＲに基づくＤＮＡ分析を表す。 腎臓および骨髄の病理組織分析を示す。（ａ）偽対照および残腎臓（マッソントリクロ−ム染色およびＰＡＳ染色）の代表的光学マイクロ写真。偽（対照）腎臓は、境界の明瞭な皮質延髄接合部および尿細管または糸球体障害の不在によって特徴付けられた、正常な実質構造を有する。Ｎｘ無処置の動物は、中等度から顕著な尿細管間質性線維症および糸球体硬化（マッソントリクロ−ム染色によって青色に染色）、および管腔円柱（ＰＡＳによる好酸球染色）による尿細管拡張、ならびに減少した骨髄細胞充実性（骨髄と赤血球の比率）から成る進行性糸球体および尿細管変性を示した。Ｎｘ動物とは対照的に、Ｂ２処置されたラットは、尿細管間質性線維症および糸球体硬化の低下、ならびに健常対照と同等の骨髄と赤血球の比率を伴う正常に近い骨髄細胞充実性によって特徴付けられる、処置効果の証拠を示した。（ｂ）Ｈ＆Ｅ染色された骨髄は、無処置Ｎｘラットにおける、突出した破骨細胞および骨侵食に伴う裂孔の形成を伴う、骨吸収の十分な証拠を明らかにした。健常対照の様に、Ｂ２処置されたラットの骨内膜表面は滑らかであり、いずれの破骨細胞、裂孔、または骨侵食の証拠も伴わなかった。（ｃ）終末血清亜リン酸（ｍｇ／ｄｌ）、およびカルシウム（ｍｇ／ｄｌ、総タンパク質［Ｃａ］−０．４［ＴＰ］＋３．３に対して補正した）は、モデルにおける骨吸収およびＢ２処置を用いた再吸収の寛解の組織学的観察のための全身性補助を提供する。 処置後１２週間にわたる生存を示す。 処置後２５週間にわたる生存を示す。 初期の体重から屠殺までの総体重を示す。 送達系の細胞集団で処置された、げっ歯類の初期の体重から屠殺までのパ−セント体重変化を示す。 全ての処置群の１２週にわたる血清クレアチニンレベルを示す。 ＮＸ、健常対照、および擬似Ｎｘと共に、Ｂ２およびＢ４処置群の１２週にわたる血清クレアチニンレベルを示す。 全ての時点にわたる血清クレアチニンの一元配置分散分析を表す。 血液尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを示す。 全ての処置群の１２週間をにわたるＨＣＴパ−セントを示す。 ＮＸ、健常対照、および擬似Ｎｘと共に、Ｂ２およびＢ４処置群の１２週間にわたるＨＣＴパ−セントを示す。 全ての時点にわたるＨＣＴパ−セントの一元配置分散分析を表す。 心臓の重量を総体重のパ−セントとして示す。 研究終点での総血清タンパク質レベルを示す。 ３ヶ月目時点での組織学的評価を示す。 処置後１２週間目での生存デ−タを示す。 処置前から処置後１２週間目までの体重のパ−セント変化を表す。 １２週目での血清クレアチニンレベルを示す。 １２週目での血清ＢＵＮレベルを示す。 健常対照と比較した、発現された尿タンパク質レベルを表す。 処置後６週間での血清Ａ／Ｇ比を示す。 １２週目でのＨＣＴパ−セントを示す。 １２週目でのＲＢＣ数を示す。 処置後６および２週間での平均全身血圧を表す。 ３〜５ヶ月時点での組織学的評価を表す。 血清クレアチニンレベルに作用する原型の効果を示す。 血清クレアチニンレベルに作用しない原型の効果を示す。 血清クレアチニンレベルへのＢ３およびＢ２／Ｂ４の効果を表す。 尿タンパク質レベルへのＢ２、Ｂ２／Ｂ４およびＢ２／Ｂ３の効果を示す。 血圧へのＢ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３およびＢ３／Ｂ４の効果を表す。 クレアチニンレベルのベ−スラインと研究の終了時間の差異を示す。 ＢＵＮレベルのベ−スラインと研究の終了時間の差異を表す。 ＡＬＢレベルのベ−スラインと研究の終了間時の差異を表す。 ＴＰＲＯレベルのベ−スラインと研究の終了時間の差異を示す。 ＰＨＯＳレベルのベ−スラインと研究の終了時間の差異を表す。 総タンパク質に対して補正したカルシウムレベルのベ−スラインと研究の終了時間の差異を表す。 イヌ腎臓細胞成長を示す。 ブタ腎臓細胞成長を示す。 ヒト腎臓細胞成長を示す。 ヒト生検からの細胞増殖結果を表す。 細胞への免疫細胞化学の結果を表す。 ラット培養物中に含有されるＥＰＯ発現している細胞が近位および遠位尿細管細胞の双方とは異なったことを示す（図１２０ａ、ｂ）、フロ−サイトメトリ−の結果を示す。培養物中のキュビリン陽性近位尿細管細胞の機能性を、蛍光抱合アルブミンの取り込みを通して評価し、取り込みの特異性を、競合的阻害剤、ＲＡＰの添加によって確認した（図１２０ｃ〜ｆ）。 ろ過機能の月々の監視を示す（ｓＣＲＥＡＴは（ａ）に示され、ＨＣＴは（ｂ）に示され、比較臨床化学結果が（ｃ）に示される）。 腎臓および骨髄の双方の組織レベル効果を特定するために行われた組織学的分析を表す。 ブタおよびヒト双方の非ＣＫＤ腎臓試料の組織学的特徴と比べた、ＣＫＤ試料の病理組織学的特徴を示す。 ＣＫＤと非ＣＫＤ由来培養物間の拡張容量を示し（ａ）；樹立された培養物中で、キュビリン陽性細胞の一部においてアルブミンの受容体介在性取り込みを観察することによって確認した、尿細管細胞機能（ｂ〜ｄ）を示す。 ＣＫＤと非ＣＫＤ組織試料との対比におけるＥＰＯ ｍＲＮＡ発現を示す（ａ）。これらの試料の等電点電気泳動およびウエスタンブロット分析は、遺伝子発現パタ−ンが概してタンパク質レベルで概括されたことが確認され、（ｂ）；ＣＫＤおよび非ＣＫＤ腎臓試料双方から樹立されたＥＰＯ発現細胞培養物が、低酸素刺激に、刺激の２４時間以内にＥＰＯ遺伝子転写の可変性の上方制御で応答した（ｃ）。 げっ歯類成体ステップ勾配の細胞バンドを表す。 成体げっ歯類細胞調物中のエリスロポエチン、ネフリン、ポドシン、キュビリン、およびＣｙｐの遺伝子発現パタ−ンを表す。 疾病を有する成体げっ歯類腎臓から単離した細胞調製物を表す（５Ｘ）。 末期腎不全を有する成体ラットから単離した、細胞中のＢ４特異的遺伝子の発現を示す。 若年および成体Ｂ２細胞調製物中のクレアチニン値の直接比較を表す。 若年および成体Ｂ２細胞調製物中の血清ＢＵＮ値の直接比較を表す。 Ｂ２およびＢ４細胞調製物中のＨａｓ−２の発現を示す。 ＨＡＳ ｍＲＮＡ（ｑＲＴＰＣＲ、下のグラフ）およびタンパク質（上の図、ウエスタンブロット）のインビボでの発現を示す。
本発明は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する腎臓細胞を含む単離された腎細胞ならびにそれを単離、および培養する方法、ならびに濃縮された尿細管およびＥＰＯを産生する細胞集団を含む生理活性腎細胞で、必要とする対象を治療する方法を対象とする。
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用する技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。（Ｒ Ｌａｎｚａ、Ｒ Ｌａｎｇｅｒ、＆ Ｊ Ｖａｃａｎｔｉ編）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄ．， ２００７は、本出願で使用する多くの用語に対する一般的な指針を当業者へ提供する。当業者は、本発明の実施に使用することができ得る、本明細書に記載する多くの方法および材料と同様または同等のものを理解するであろう。実際に、本発明は、記載する方法および材料に決して限定されない。
本明細書で使用する「細胞集団」は、大抵、哺乳動物からの適した組織供給源からの直接単離によって得られる多くの細胞を指す。単離された細胞集団を、後にインビトロで培養することができる。当業者は、本発明と使用するための細胞集団を単離、および培養する様々な方法ならびに本発明での使用に適した細胞集団の様々な数の細胞を理解するであろう。細胞集団は、腎臓由来の未分画、不均一な細胞集団であることができる。例えば、不均一な細胞集団を、腎生検からまたは全腎臓組織から単離することができる。あるいは、不均一な細胞集団は、哺乳動物細胞のインビトロ培養から生じる、腎臓生検または全腎臓組織から確立することができる。未分画の不均一な細胞集団は、濃縮されない細胞集団として称されることもできる。
本明細書で使用する「混合物」という用語は、未分画、不均一な細胞集団から生じる２つ以上の単離、濃縮された細胞集団の組み合わせを指す。特定の実施形態によると、本発明の細胞集団は、腎臓の細胞集団である。
「濃縮された」細胞集団または調製物は、開始集団の特定の細胞型の割合よりも大きい割合のその細胞型を含有する開始腎臓細胞集団（例えば、未分画、不均一な細胞集団）から生じる細胞集団を指す。例えば、開始腎臓細胞集団を、第１の、第２の、第３の、第４の、第５等の、対象の細胞集団に対して濃縮することができる。本明細書で使用する「細胞集団」、「細胞調製物」、および「細胞の原型」は、互換的に使用される。
一態様において、本明細書で使用する「濃縮された」細胞集団は、開始集団のＥＰＯを産生することが可能な細胞の割合よりも大きい、ＥＰＯを産生することが可能な細胞の割合を含有する開始腎臓細胞集団（例えば、腎生検からの細胞懸濁液または培養された哺乳動物腎臓細胞）から生じる細胞集団を指す。例えば、「Ｂ４」は、開始集団と比較して、より大きい割合のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する開始腎臓細胞集団から生じる細胞集団である。本発明の細胞集団は、１つ以上の細胞型に対して濃縮され、１つ以上の他の細胞型を除去することができる。例えば、濃縮されたＥＰＯを産生する細胞集団は、間質性線維芽細胞に対して濃縮され、濃縮されない細胞集団、すなわち濃縮された細胞集団が由来した開始細胞集団の、間質性線維芽細胞および尿細管細胞と比べて、尿細管細胞および集合管上皮細胞を除去することができる。ＥＰＯを濃縮されたまたは「Ｂ４」集団を引用する全ての実施形態において、濃縮された細胞集団は、内在性天然ＥＰＯ遺伝子からの酸素調節可能なＥＰＯ発現によって示されるように、酸素を制御された様式でＥＰＯを産生することができる細胞を含有する細胞の不均一な集団である。
別の態様において、濃縮された細胞集団は、開始集団の１つ以上の尿細管細胞マ−カ−を発現する細胞の割合よりも大きい１つ以上の尿細管細胞マ−カ−を発現する細胞の割合を含有する、上記の開始腎臓 細胞集団から生じる細胞集団を指すこともできる。例えば、「Ｂ２」は、開始集団と比較して、より大きい割合の尿細管細胞を含有する開始腎臓細胞集団から生じる細胞集団を指す。さらに、１つ以上の尿細管細胞マ−カ−（または「Ｂ２」）を発現する細胞に対して濃縮された細胞集団は、集合管系から幾つかの上皮細胞を含むことができる。１つ以上の尿細管細胞マ−カ−を発現する細胞に対して濃縮された細胞集団（または「Ｂ２」）は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞が比較的に除去されるが、濃縮された集団は、開始集団と比べてより少ない割合のこれらの細胞（ＥＰＯを産生する、糸球体、および血管）を含有することができる。一般的に、不均一な細胞集団は、除去された細胞集団が除去前の不均一な細胞集団に含有された細胞型の割合と比べてより小さな割合の細胞型を含有するように、１つ以上の細胞型が除去される。除去することができる細胞型は、腎臓細胞の任意の型である。例えば、特定の実施形態において、除去することができる細胞型は、「Ｂ１」として称される約１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大きな粒度を含む細胞を含む。他の特定の実施形態において、除去することができる細胞型は、「Ｂ５」として称される、約１．０９５ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含む。幾つかの実施形態において、尿細管細胞に対して濃縮される細胞集団は、以下の全てが比較的に除去される：「Ｂ１」、「Ｂ５」、酸素調節可能なＥＰＯを発現する細胞、糸球体細胞、および血管細胞。
本明細書で使用する「低酸素」培養条件という用語は、細胞が大気中の酸素レベル（約２１％）で培養される標準培養条件と比較して培養系の利用可能な酸素レベルが低下する細胞の培養条件を指す。非低酸素条件は、本明細書で正常または正常酸素圧の培養条件と称される。
本明細書で使用する「酸素調節可能な」という用語は、細胞で利用可能な酸素量を基に、遺伝子発現（増加または減少）を調節する細胞の能力を指す。「低酸素誘導性」は、（誘導前または酸素分圧の開始の関係なく）酸素分圧の低下に応じた遺伝子発現の上方制御を指す。
本明細書で使用する「生体材料」は、生体組織への導入に適した天然または合成の生体適合性材料を指す。天然の生体材料は、生体系によって作製される材料である。合成生体材料は、生体系によって作製されない材料である。本明細書で開示する生体材料は、天然および合成の生体適合性材料の組み合わせであることができる。本明細書で使用される生体材料は、例えば、ポリマ−マトリックスおよび足場を含む。当業者は、生体材料が、様々な形態、例えば、液体ヒドロゲル懸濁液、多孔性発泡体として構成することができ、１つ以上の天然または合成の生体適合性材料を含むことができることを理解するであろう。
本明細書で使用する「貧血」という用語は、対象のＥＰＯを産生する細胞による機能的なＥＰＯタンパク質の不適切な産生、および／または全身性循環へＥＰＯタンパク質の不適切な放出、および／または骨髄の赤芽球のＥＰＯタンパク質に対する反応不能による赤血球数および／またはヘモグロビンレベルの不足を指す。貧血の対象は、赤血球恒常性を維持することができない。一般的に、貧血は、腎機能（例えば、慢性腎不全）の減少または損失、関連ＥＰＯ欠乏症に付随した貧血、うっ血性心不全に付随した貧血、化学療法または抗ウイルス治療（例えば、ＡＺＴ）等の骨髄抑制性治療に付随した貧血、非骨髄癌に付随した貧血、ＨＩＶ等のウイルス感染に付随した貧血、および自己免疫疾病（例えば、リウマチ性関節炎）等の慢性疾病の貧血、肝臓疾患、および多臓器系不全と共に発生する。
「ＥＰＯ欠乏症」という用語は、貧血を含む、エリスロポエチン受容体刺激薬（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で治療可能である任意の条件または疾患を指す。
本明細書で使用する「腎臓疾患」という用語は、血液ろ過ならびに過剰な液体、電解質、および血液の廃棄物の除去の機能を行う腎臓の能力の不足を引き起こす急性または慢性腎不全の任意の段階または度合いに付随する疾患を指す。腎臓疾患は、貧血（エリスロポエチン欠乏症）等の内分泌機能異常およびミネラルの不均衡（ビタミンＤ欠乏症）も含む。腎臓疾患は、腎臓で始まり得る、または心不全、高血圧、糖尿病、自己免疫疾病、または肝臓疾患を含むがこれらに限定されない様々な条件に二次的であり得る。
「処置」という用語は、腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送の欠乏症、または糸球体ろ過の欠乏症に対する治療処置および予防的なまたは防止的な手段の両方を指し、目的は、標的疾患を逆転する、防止する、または遅らせる（減らす）ためである。処置を必要とするものは、腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送の欠乏症、もしくは糸球体ろ過の欠乏症を既に有するもの、ならびに腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送の欠乏症、もしくは糸球体ろ過の欠乏症を有する傾向があるもの、または腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送の欠乏症、もしくは糸球体ろ過の欠乏症が防止されるものを含む。本明細書で使用する「処置」という用語は、腎機能の安定化および／または改善を含む。
「構造体」という用語は、１つ以上の合成または自然発生の生体適合性材料で構成される足場またはマトリックスの表面上または内に沈積された１つ以上の細胞集団を指す。１つ以上の細胞集団を、１つ以上の合成または自然発生の生体適合性ポリマ−、タンパク質、またはペプチドで構成される生体材料に被覆する、それに沈積する、その中に包埋する、それに付着する、またはその中に捕捉することができる。１つ以上の細胞集団は、インビトロおよびインビボで、生体材料または足場またはマトリックスと組み合わせることができる。一般的に、足場／生体材料を形作るために使用される１つ以上の生体適合性材料は、それに沈積される少なくとも１つの多細胞、三次元の、細胞集団の組織化の形成を方向付ける、容易にする、または可能にするために選択される。構造体を生成するために使用される１つ以上の生体材料は、構造体の分散 および／または統合または内在性宿主巣組織を含む構造体の細胞成分を方向付ける、容易にする、または可能にする、あるいは、構造体もしくは構造体の細胞成分の生存、生着、耐性、もしくは機能的な能力を方向付ける、容易にする、もしくは可能にする。
「対象」という用語は、治療に適する、腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症の１つ以上の兆候、症状、または他の指標を経験しているか、または経験したことがある、患者を含む任意の単一のヒト対象を意味するものとする。かかる対象には、原因を問わず、腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症を新たに診断されたか、以前に診断されており、現在再発または再燃を経験しているか、あるいはその恐れのある対象が含まれるが、それらに限定されない。対象は、腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症について以前に治療されていてもよく、あるいはそのように治療されていなくてもよい。
「患者」という用語は、処置が所望される、任意の単一の動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類等の非ヒト動物を含む）を指す。より好ましくは、本明細書における患者はヒトである。
「試料」、または「患者試料」、または「生体試料」という用語は、概して、対象もしくは患者、体液、体内組織、細胞系、組織培養物、または他の供給源から得られた任意の生体試料を意味するものとする。この用語には、例えば、腎生検等の組織生検が含まれる。この用語には、例えば、培養された哺乳動物腎臓細胞等の培養細胞が含まれる。哺乳動物から組織生検および培養細胞を得るための方法は、当該技術分野においてよく知られている。「試料」という用語が単独で使用される場合、その「試料」が「生体試料」または「患者試料」であることを依然として意味するものとし、すなわち、これらの用語は互換的に使用される。
「試験試料」という用語は、本発明の方法によって処理された対象からの試料を指す。試験試料は、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織等を含むが、これらに限定されない、哺乳動物対象中の様々な源を起源としてもよい。
「対照」または「対照試料」という用語は、負または正の結果が試験試料の結果の相互の関連付けを補助することが予測される負または正の対照を指す。本発明に好適である対照には、正常な赤血球恒常性を特徴とする指標を示すことが知られる試料、貧血を特徴とする指標を示すことが知られる試料、貧血症ではないことが知られている対象から得られた試料、および貧血症であることが知られている対象から得られた試料が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法において使用するために好適なさらなる対照には、赤血球生成を調節することが知られている薬理学的薬剤（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で治療されたことがある対象に由来する試料が含まれるが、これらに限定されない。さらに、対照は、本発明の方法によって治療される前の対象から得られた試料であってもよい。さらなる好適な対照は、任意の種類または段階の腎臓疾患を有することが知られている対象から得られた試験試料、ならびに任意の種類または段階の腎臓疾患を有していないことが知られている対象からの試料であってもよい。対照は、健常な対応対照であってもよい。当業者は、本発明における使用に好適な他の対象を理解するであろう。
細胞集団
本発明は、腎臓疾患の治療における使用のために、特定の生理活性成分もしくは細胞型に対して濃縮された、および／または特定の不活性もしくは所望されない成分もしくは細胞型が枯渇した、単離された、不均一な腎細胞の集団およびその混合物を提供する、すなわち、腎機能の安定化および／または改善および／または再生を提供する。
生理活性を示す細胞集団
一態様において、本発明は、生理活性成分に対して濃縮され、不活性または所望されない成分が除去された不均一な腎細胞の集団の特定の亜分画が、出発集団よりも優れた治療結果および再生結果をもたらすという意外な発見に基づくものである。例えば、不活性または所望されない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が除去された本発明の生理活性成分、例えば、Ｂ２、Ｂ４、およびＢ３は、単独でまたは混合されると、予期しなかった腎機能の安定化および／または改善および／または再生をもたらす。好ましい実施形態において、生理活性を示す細胞集団はＢ２である。特定の実施形態において、Ｂ２細胞集団はＢ４と混合される。他の実施形態において、Ｂ２細胞集団はＢ３と混合される。
Ｂ２細胞集団は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−、および集合管マ−カ−アクアポリン−４（Ａｑｐ４）の発現を特徴とし、Ｂ３および／またはＢ４よりも大きく、さらに粒状であるため、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬ（げっ歯類）、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬ（ヒト）、および約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５８ｇ／ｍＬ（イヌ）の浮遊密度を有する。
Ｂ３細胞集団は、血管マ−カ−、糸球体マ−カ−、および近位尿細管マ−カ−の発現、およびいくらかのＥＰＯを産生する細胞によって特徴付けられ、Ｂ２とＢ４と比較して、中程度のサイズと粒状であるため、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０７３ｇ／ｍＬ（げっ歯類）、約１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬ（ヒト）、および約１．０５８ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬ（イヌ）の浮遊密度を有する。Ｂ３は、以下のうちの１つ以上からなる群から選択されるマ−カ−の発現を特徴とする：アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−２（Ｆｘｙｄ２）、溶質輸送体ファミリ−１７（リン酸ナトリウム）、メンバ−３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質輸送体ファミリ−３、メンバ−１（Ｓｌｃ３ａ１）、クロ−ディン２（Ｃｌｄｎ２）、ナプシンＡアスパラギン酸ペプチダ−ゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質輸送体ファミリ−２（促進性グルコ−ス輸送体）、メンバ−２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダ−ゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシルＣｏＡ合成酵素中鎖ファミリ−メンバ−２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダ−ゼ３（Ｇｐｘ３）、フルクト−ス−１，６−ビスホスファタ−ゼ１（Ｆｂｐ１）、およびアラニンアミノ基転移酵素２（Ａｇｘｔ２）。Ｂ３は、血管発現マ−カ−である血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マ−カ−であるポドシン（Ｐｏｄｎ）も特徴とする。
Ｂ４細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａのうちの１つ以上を含有する血管マ−カ−セット、ポドシン（Ｐｏｄｎ）、およびネフリン（Ｎｅｐｈ）のうちの１つ以上を含有する糸球体マ−カ−セット、ならびに未分画（ＵＮＦＸ）、Ｂ２、およびＢ３と比較して酸素調節可能なＥＰＯ濃縮された集団を特徴とする。Ｂ４は、以下のマ−カ−のうちの１つ以上の発現も特徴とする：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチ−フ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体タイプＢ（Ｅｄｎｒｂ）、コラ−ゲン、タイプＶ、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノ−ゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンギオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナ−ゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌されたタンパク質、酸性、システインに富む（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダ−ゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、ウィルムス腫瘍１（Ｗｔ１）、無羽タイプＭＭＴＶ統合部位ファミリ−、メンバ−４（Ｗｎｔ４）、Ｇ−タンパク質シグナリング４（Ｒｇｓ４）の制御因子、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）。Ｂ４は、Ｂ２またはＢ３のいずれと比較しても、より小さく、あまり粒状ではないことも特徴とし、約１．０７３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒトおよびイヌ）の浮遊密度である。
Ｂ２およびＢ４によるヒアルロン酸産生
ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロネ−トとも称される）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、非硫酸化二糖単位、特に、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の規則的な反復配列から構成される。その分子量は、４００ダルトン（二糖）から１００万ダルトンを超える範囲であり得る。成獣の皮膚、軟骨、および目等の全ての組織、ならびに全てではないにしてもほとんどの体液において、種々の量で見られる。それは初期胚において得に豊富である。ヒアルロナン、実際にはＧＡＧ全般によって形成される空間は、細胞移動、細胞付着、創傷修復の間、器官形成、免疫細胞の接着、細胞内シグナル伝達の活性化、および腫瘍転移において、ヒアルロナンが役割を担うことを可能にする。それらの役割は、ヒアルロナンに結合する特定のタンパク質およびプロテオグリカンによって媒介される。細胞運動および免疫細胞の接着は、細胞表面受容体ＲＨＡＭＭ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｈｙａｌｕｒｏｎａｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ；Ｈａｒｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２）およびＣＤ４４（Ｊａｌｋｅｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｍｉｙａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）によって媒介される。ヒアルロナンは、細胞表面の内膜で直接合成され、成長ポリマ−は、合成されると膜を通って細胞の外側に押し出される。合成は、遺伝子ファミリ−が少なくとも３つのメンバ−から構成される単一のタンパク質酵素、ヒアルロナン合成酵素（ＨＡＳ）によって媒介される。
ヒアルロン酸はＣＤ４４と相互作用し、かかる相互作用は、他の作用の中でも特に損傷した腎組織に非常在細胞（間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等）を動員し、腎臓の再生を促進することができる（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００７）７２，４３０−４４１）ことが最近明らかになった。
意外なことに、Ｂ２およびＢ４細胞調製物は、Ｂ２細胞集団においてより特異的に濃縮されるマ−カ−であるヒアルロン酸合成酵素−２（ＨＡＳ−２）の作用を介して、インビトロおよびインビボの両方でヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を発現することができることが分かった。５／６ＮｘモデルにおけるＢ２を用いた処置は、インビボでの強いＨＡＳ−２の発現、および処置された組織内における高分子量ＨＡの予想された産生と同時に、線維症を縮小することが示された。とりわけ、未処置のままの５／６Ｎｘモデルは、ＨＡＳ−２がわずかに検出された線維症をきたし、高分子量ＨＡはほとんど産生されなかった。理論に束縛されるものではないが、主にＢ２によって（および、ある程度はＢ４によって）産生される、この抗炎症性のＨＡの高分子量種は、腎線維症の減少および腎臓再生の補助において細胞調製物と相乗的に作用するという仮説が立てられる。したがって、本発明は、ヒアルロン酸を含む生体材料における本発明の細胞の原型の送達を含む。また、移植細胞による直接的な産生または産生の刺激を介した再生刺激の生体材料成分の提供も、本発明によって企図される。
一態様において、本発明は、必要とする対象における腎臓疾患、貧血、および／またはＥＰＯ欠乏症の治療に使用するための、ＥＰＯ産生腎細胞の単離された不均一な集団を提供する。一実施形態において、細胞集団は腎生検に由来する。別の実施形態において、細胞集団は全腎臓組織に由来する。ある他の実施形態において、細胞集団は、腎臓生検または全腎臓組織から確立された哺乳動物の腎細胞のインビトロ培養に由来する。全ての実施形態において、これらの集団は未分画の細胞集団であり、本明細書において濃縮されない細胞集団とも称される。
別の態様において、本発明は、出発または初期細胞集団におけるＥＰＯを産生する細胞の比率と比較して、濃縮された亜集団におけるＥＰＯを産生する細胞の比率がより高くなるように、さらに濃縮されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎細胞の単離された集団を提供する。一実施形態において、濃縮されたＥＰＯを産生する細胞分画は、濃縮されない初期集団に含有される間質性線維芽細胞および尿細管細胞と比較して、より高い比率の間質性線維芽細胞およびより低い比率の尿細管細胞を含有する。特定の実施形態において、濃縮されたＥＰＯを産生する細胞分画は、濃縮されない初期集団に含有される糸球体細胞、血管細胞、および集合管細胞と比較して、より高い比率の糸球体細胞および血管細胞、ならびに、より低い比率の集合管細胞を含有する。かかる実施形態において、これらの集団は、本明細書において「Ｂ４」細胞集団と称される。
別の態様において、本発明は、１つ以上の追加の腎細胞集団と混合されたＥＰＯ産生腎細胞集団を提供する。一実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮される第１の細胞集団、例えばＢ４である。別の実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない第１の細胞集団、例えばＢ２である。別の実施形態において、第１の細胞集団は、第２の腎細胞集団と混合される。幾つかの実施形態において、第２の細胞集団は尿細管細胞に対して濃縮され、尿細管細胞の表現型の存在によって示され得る。別の実施形態において、尿細管細胞の表現型は、尿細管細胞マ−カ−の存在によって示され得る。別の実施形態において、尿細管細胞の表現型は、１つ以上の尿細管細胞マ−カ−の存在によって示され得る。尿細管細胞マ−カ−は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）を含むが、これに限定されない。別の実施形態において、第１の細胞集団は、間質由来の細胞、尿細管細胞、集合管由来の細胞、糸球体由来の細胞、および／または血液もしくは血管由来の細胞を含むが、これに限定されない、腎細胞の幾つかの型のうちの少なくとも１つと混合される。
一態様において、本発明のＥＰＯ産生腎細胞集団は、培養系の酸素分圧の低下がＥＰＯの発現における誘導をもたらすように、ＥＰＯ発現および酸素に対する生物学的応答を特徴とする。一実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮される。一実施形態において、細胞集団が、標準大気レベル（約２１％）の利用可能な酸素で培養される細胞集団と比較して、細胞が培養系において利用可能な酸素レベルの低下に曝される条件下で培養されたときに、ＥＰＯの発現が誘導される。一実施形態において、より低い酸素条件で培養されるＥＰＯを産生する細胞は、標準酸素条件で培養されるＥＰＯを産生する細胞と比較して、より高いレベルのＥＰＯを発現する。一般に、より低い利用可能な酸素レベル（低酸素培養条件とも称される）で細胞を培養することは、低下した酸素レベルが、標準大気レベルの利用可能な酸素（標準または正常酸素圧培養条件とも称される）での細胞培養と比較して低いことを意味する。一実施形態において、低酸素細胞培養条件は、約１％未満の酸素、約２％未満の酸素、約３％未満の酸素、約４％未満の酸素、または約５％未満の酸素で細胞を培養することを含む。別の実施形態において、標準または正常酸素圧培養条件は、約１０％の酸素、約１２％の酸素、約１３％の酸素、約１４％の酸素、約１５％の酸素、約１６％の酸素、約１７％の酸素、約１８％の酸素、約１９％の酸素、約２０％の酸素、または約２１％の酸素で細胞を培養することを含む。
ある他の実施形態において、約５％未満の利用可能な酸素で細胞を培養し、ＥＰＯの発現レベルを大気中の（約２１％）酸素で培養した細胞と比較することによって、ＥＰＯの誘導または発現増加が得られ、観察することができる。別の実施形態において、ＥＰＯの誘導は、細胞の培養物が大気中の酸素（約２１％）でいくらかの期間にわたって培養される第１の培養段階と、利用可能な酸素レベルが減少され、同細胞が約５％未満の利用可能な酸素で培養される第２の培養段階と、を含む方法によって、ＥＰＯを発現することができる細胞の培養において得られる。別の実施形態において、低酸素条件に対して応答性であるＥＰＯの発現は、ＨＩＦ１αによって制御される。当業者は、当該技術分野において既知である他の酸素操作による培養条件が、本明細書に記載される細胞に使用され得ることを理解するであろう。
一態様において、ＥＰＯ産生哺乳動物細胞の濃縮された集団は、灌流状態に対する生物応答性（例えば、ＥＰＯの発現）を特徴とする。一実施形態において、灌流条件は、一過性、間欠性、または連続的な流体流れ（灌流）を含む。一実施形態において、細胞が培養される培地が、流れを介して動力が細胞に伝達される様式で間欠的または連続的に循環または撹拌される際に、ＥＰＯの発現が機械的に誘導される。一実施形態において、一過性、間欠性、または連続的な流体流れに曝される細胞は、三次元構造が形成するためのフレ−ムワ−クおよび／または空間を提供する、材料中または材料上のかかる三次元構造としてそれらが表される様式において培養される。一実施形態において、細胞は多孔性ビ−ズ上で培養され、揺動プラットフォ−ム、軌道プラットフォ−ム、またはスピナ−フラスコによって、間欠的または連続的な流体流れに曝される。別の実施形態において、細胞は三次元の足場上で培養されてデバイス内に設置され、それによって、足場が固定され、流体が足場を通ってまたは横切って一方向に流れる。当業者は、当該技術分野において既知である他の灌流培養条件が、本明細書に記載される細胞に使用され得ることを理解するであろう。
不活性細胞集団
本明細書に記載されるように、本発明は、生理活性成分に対して濃縮され、不活性または所望されない成分が除去された、不均一な腎細胞の集団の特定の亜分画が、出発集団よりも優れた治療結果および再生結果をもたらすという意外な発見に一部基づいている。好ましい実施形態において、本発明の細胞集団は、Ｂ１および／またはＢ５細胞集団が除去されている。
Ｂ１細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな顆粒細胞を含み、該集団の細胞は、約１．０４５ｇ／ｍ未満の浮遊密度を有する。Ｂ５細胞集団は、残骸と、粒度および生存率の低い小細胞とから構成され、約１．０９１ｇ／ｍＬ超の浮遊密度を有する。
細胞集団を単離および培養する方法
一態様において、本発明は、腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送欠乏症、および糸球体ろ過欠乏症の治療を含む治療的使用のために、腎細胞成分、例えば、濃縮された細胞集団を分離および単離するための方法を提供する。一実施形態において、細胞集団は、新しく消化された、すなわち、機械的もしくは酵素的に消化された腎組織から、または哺乳動物の腎細胞の不均一なインビトロ培養物から単離される。
密度勾配上で分離する前に、低酸素培養条件において腎細胞の不均一な混合物を培養することは、Ｂ４およびＢ２両方の分画において細胞の分布よび組成の強化をもたらすことが予想外に発見された。罹患した腎臓および罹患していない腎臓の両方から単離された腎細胞について、Ｂ２からのＢ４の酸素依存性細胞の濃縮が観察された。理論に束縛されるものではないが、これは、以下の現象のうちの１つ以上に起因する可能性がある。１）低酸素培養期間中の、特定の細胞成分の選択的な生存、死、または増殖、２）低酸素培養に応じた細胞粒度および／またはサイズの変更、それによって、浮遊密度およびそれに続く密度勾配分離の間の局在化における変更を達成すること、３）低酸素培養期間に応答した細胞の遺伝子／タンパク質の発現における変更、それによって、勾配の任意の所与の分画内の細胞の分化特性をもたらすこと。よって、一実施形態において、尿細管細胞に対して濃縮された細胞集団、例えばＢ２は、低酸素耐性である。
本発明の細胞集団を分離および単離するための例示的な技術は、該当する集団内に含有される異なる細胞型の異なる比重に基づく密度勾配上の分離を含む。任意の所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度の程度、水の細胞内容積、および他の要因によって影響を受け得る。一態様において、本発明は、ヒト、イヌ、およびげっ歯類を含むが、これに限定されない複数の種にわたって、本発明の細胞調製物、例えば、Ｂ２およびＢ４の単離のための最適な勾配条件を提供する。好ましい実施形態において、密度勾配は、不均一な腎細胞の集団に由来する、尿細管細胞分画の新規の濃縮された集団、すなわち、Ｂ２細胞集団を得るために使用される。一実施形態において、密度勾配は、不均一な腎細胞の集団に由来する、ＥＰＯを産生する細胞分画の新規の濃縮された集団、すなわち、Ｂ４細胞集団を得るために使用される。他の実施形態において、密度勾配は、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、および内皮細胞の濃縮された亜集団を得るために使用される。一実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞および尿細管細胞の両方が、赤血球および細胞の残骸から分離される。一実施形態において、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞は、他の細胞型ならびに赤血球および細胞の残骸から分離され、尿細管細胞および集合管細胞の亜集団は、他の細胞型ならびに赤血球および細胞の残骸から同時に分離される。
本発明は、後に記載する特定の重要な特徴に基づいて、６０％非イオン性のヨ−ド化化合物イオジキサノ−ルを水中に含むＯＰＴＩＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配培地を一部使用することによって、新規の細胞集団を生成した。しかしながら、当業者は、任意の密度勾配、または本発明の細胞集団を単離するための必要な特徴を備える他の手段、例えば、当該技術分野において既知である細胞面マ−カ−を使用する免疫学的分離が、本発明に従って使用されてもよいことを理解するであろう。密度勾配による細胞亜集団の分離に寄与する同じ細胞特性（サイズおよび粒度）は、フロ−サイトメトリ−によって細胞亜集団を分離するために利用され得ることも、当業者には理解されるべきである（前方散乱＝フロ−サイトメトリ−によるサイズの反映、および側方散乱＝粒度の反映）。重要なのは、密度勾配培地が、該当する特定の細胞に対して低い毒性を有するべきであるということである。密度勾配培地が該当する特定の細胞に対して低い毒性を有するべきである一方で、本発明は、該当する細胞の選択プロセスにおいて役割を果たす勾配培地の使用を企図する。理論に束縛されるものではないが、負荷ステップと回収ステップの間に相当の細胞損失が見られ、勾配の条件下でのイオジキサノ−ルへの曝露が特定の細胞の除去を引き起こすことを示唆しているため、イオジキサノ−ルを含む勾配によって回収される本発明の細胞集団は、イオジキサノ−ル耐性であると考えられる。イオジキサノ−ル勾配後に特定の帯に現れる細胞は、イオジキサノ−ルおよび／または密度勾配への曝露の任意の悪影響に対する耐性がある。したがって、本発明は、本発明の細胞集団の単離および／または選択において軽度から中程度の腎毒素である追加の造影剤の使用も企図する。さらに、密度勾配培地もヒト血漿中のタンパク質に結合するべきではなく、そうしなければ、該当する細胞の重要な機能に有害な影響を与える。
別の態様において、本発明は、腎細胞集団を三次元培養する方法を提供する。一態様において、本発明は、連続的灌流によって細胞集団を培養する方法を提供する。一実施形態において、三次元培養および連続的灌流によって培養される細胞集団は、静的に培養される細胞集団と比較した場合に、より高い細胞充実性および相互結合性を示す。別の実施形態において、三次元培養および連続的灌流によって培養される細胞集団は、かかる細胞集団の静的培養物と比較した場合に、より高いＥＰＯの発現、ならびにカドヘリン等の腎臓の尿細管関連遺伝子の発現の増強を示す。
さらに別の実施形態において、連続的灌流によって培養される細胞集団は、静的に培養される細胞集団と比較した場合に、より高いレベルのグルコ−スおよびグルタミンの消費を示す。
当業者は、当該技術分野において既知である他の単離および培養の方法が、本明細書に記載される細胞に使用されてもよいことを理解するであろう。
生体材料（ポリマ−マトリックスまたは足場）
Ｂｅｒｔｒａｍらの米国特許出願公開第２００７０２７６５０７号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ポリマ−マトリックスまたは足場は、任意の数の全体的なシステム、形状、または空間の制約を満足させるように、任意の数の望ましい構成に成形されてもよい。一実施形態において、本発明のマトリックスまたは足場は、三次元であってもよく、器官または組織構造の寸法および形状に適合するように成形されてもよい。例えば、腎臓疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏症、尿細管輸送欠乏症、または糸球体ろ過欠乏症を治療するためのポリマ−足場の使用において、三次元（３Ｄ）マトリックスが使用されてもよい。種々の異なる形状の３Ｄ足場が使用されてもよい。当然、ポリマ−マトリックスは、異なるサイズの患者に適合するように、異なるサイズおよび形状に成形されてもよい。ポリマ−マトリックスはまた、患者の特別な必要性に対応するように、他の様式で成形されてもよい。別の実施形態において、ポリマ−マトリックスまたは足場は、生体適合性、多孔性のポリマ−足場であってもよい。足場は、オ−プンセル構造ポリ乳酸（ＯＰＬＡ（登録商標））、セルロ−スエ−テル、セルロ−ス、セルロ−スエステル、フッ素化ポリエチレン、フェノ−ル類、ポリ−４−ポリメチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレ−ト、ポリベンゾオキサゾ−ル、ポリカ−ボネ−ト、ポリシアノアリ−ルエ−テル、ポリエステル、ポリエステルカ−ボネ−ト、ポリエ−テル、ポリエ−テルエ−テルケトン、ポリエ−テルイミド、ポリエ−テルケトン、ポリエ−テルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾ−ル、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエ−テル、ポリトリアゾ−ル、ポリウレタン、ポリビニル、フッ化ポリビニリデン、再生セルロ−ス、シリコ−ン、尿素ホルムアルデヒド、コラ−ゲン、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギネ−ト、ヒアルロン酸、アガロ−ス、またはそのポリマ−もしくは物理的ブレンドを含むが、これに限定されない、種々の合成または自然発生材料から形成されてもよい。足場構成は、ヒドロゲル懸濁液から、軟性の多孔性足場、硬性の形状を維持する多孔性足場まで及んでもよい。
ヒドロゲルは、種々のポリマ−材料から形成されてもよく、種々の生物医学的用途において有用である。ヒドロゲルは、親水性ポリマ−の三次元ネットワ−クとして物理的に説明することができる。ヒドロゲルの種類によって、様々な割合を水を含有するが、全体として水には溶解しない。ヒドロゲルは、含水量が高いにも関わらず、親水性残基の存在に起因して、大量の液体にさらに結合することができる。ヒドロゲルは、そのゼラチン状の構造を変化させずに、大規模に膨張する。ヒドロゲルの基本的な物理特性は、使用されるポリマ−の性質および製品の追加の特殊な機器によって特定的に改変することができる。
好ましくは、ヒドロゲルは、生物学的に不活性であり、哺乳動物組織に生理学的に適合する、ポリマ−、生物学的に生じる材料、合成的に誘導される材料、またはその組み合わせで作られる。ヒドロゲル材料は、好ましくは、炎症反応を誘発しない。ヒドロゲルを形成するために使用することができる他の材料の例は、（ａ）修飾されたアルギネ−ト、（ｂ）一価カチオンに曝露することによってゲル化する多糖類（例えば、ジェランガムおよびカラゲナン）、（ｃ）非常に粘性の高い液体であるか、またはチキソトロピ−性であり、構造が徐々に発達することによって経時的にゲルを形成する多糖類（例えば、ヒアルロン酸）、ならびに（ｄ）ポリマ−ヒドロゲル前駆体（例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコ−ルブロックコポリマ−およびタンパク質）を含む。米国特許第６，２２４，８９３ Ｂ１号は、本発明に従ってヒドロゲルを作製するために好適な種々のポリマ−、およびかかるポリマ−の化学特性についての詳細な記載を提供している。
足場または生体材料の特性は、細胞が足場または生体材料に付着して相互作用できるようにすることができる、かつ／または、細胞が捕捉され得る多孔性の空間を提供することができる。一実施形態において、本発明の多孔性の足場または生体材料は、１つ以上の細胞集団または混合物が、多孔性の足場（例えば、細胞の付着による）および／または足場の細孔（例えば、細胞の捕捉による）として構成される生体材料上に付加または沈積することを可能にする。別の実施形態において、足場または生体材料は、足場内での細胞：細胞および／または細胞：生体材料の相互作用を可能にするかまたは促進して、本明細書に記載される構造体を形成する。
一実施形態において、本発明に従って使用される生体材料は、ハイドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）を含み、５．１ｋＤＡ〜２×１０６ｋＤａ超のサイズのＨＡ分子を含有する。別の実施形態において、本発明に従って使用される生体材料は、多孔性発泡体のヒアルロン酸を含み、同様に５．１ｋＤＡ〜２×１０６ｋＤａ超のサイズのＨＡ分子を含有する。さらに別の実施形態において、本発明に従って使用される生体材料は、開放多孔性構造および約５０ミクロン〜約３００ミクロンの細孔サイズを有する、ポリ乳酸（ＰＬＡ）系発泡体を含む。さらに別の実施形態において、特定の細胞集団（優先的にはＢ２であるがＢ４でもある）は、特に、腎内移植後に、ヒアルロン酸合成酵素−２（ＨＡＳ−２）による高分子量ヒアルロン酸の直接的および／または同時の合成を提供する。
当業者は、当該技術分野で既知である他の種類の合成材料または自然発生材料が、本明細書に記載されるような足場を形成するために使用されてもよいことを理解するであろう。
一態様において、本発明は、上で言及した足場または生体材料から作られる本明細書に記載されるような構造体を提供する。
構造体
一態様において、本発明は、必要とする対象における腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症を治療するための、本明細書に記載される細胞集団のうちの１つ以上を有する移植可能な構造体を提供する。一実施形態において、構造体は、生体適合性材料または生体材料、１つ以上の合成または自然発生の生体適合性材料を含む足場またはマトリックス、ならびに、付着および／または捕捉によって足場の表面に沈積されたまたは包埋された本明細書に記載される１つ以上の細胞集団または細胞の混合物で構成される。特定の実施形態において、構造体は、生体材料と、生体材料成分（複数可）に被覆された、生体材料成分（複数可）上に沈積された、生体材料成分（複数可）中に沈積された、生体材料成分（複数可）に付着した、生体材料成分（複数可）に捕捉された、生体材料成分（複数可）に包埋された、生体材料成分（複数可）と組み合わせた、本明細書に記載される１つ以上の細胞集団または細胞の混合物とから構成される。別の実施形態において、構造体の沈積された細胞集団または細胞成分は、酸素調節可能なＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された、第１の腎細胞集団である。別の実施形態において、第１の腎細胞集団は、酸素調節可能なＥＰＯを産生する細胞に加えて、糸球体細胞および血管細胞を含有する。ある他の実施形態において、構造体の沈積された細胞集団または細胞成分（複数可）は、第１の濃縮された腎細胞集団および第２の腎細胞集団の両方を含む。幾つかの実施形態において、第２の細胞集団は、酸素調節可能なＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない。別の実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、第２の細胞集団は、腎臓の尿細管細胞に対して濃縮され、集合管上皮細胞を含有する。他の実施形態において、腎臓の尿細管細胞は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）を含むが、これに限定されない、１つ以上の尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする。
一実施形態において、本発明の構造体を形成するように生体材料もしくは足場上に沈積されたかまたは組み合わせた細胞集団は、自己、同種、または同系（自律性もしくは同系移植）供給源等の種々の供給源から生じる。
当業者は、細胞集団を生体材料に沈積させるか、または別の方法で組み合わせて、構造体を形成するための幾つかの好適な方法が存在することを理解するであろう。
一態様において、本発明の構造体は、本明細書に記載される使用方法における使用に好適である。一実施形態において、構造体は、任意の原因の腎臓疾患、貧血、または任意の原因のＥＰＯ欠乏症の治療を必要とする対象への投与に好適である。他の実施形態において、構造体は、赤血球恒常性における改善またはその回復を必要とする対象への投与に好適である。別の実施形態において、構造体は、腎機能の改善を必要とする対象への投与に好適である。
使用方法
一態様において、本発明は、本明細書に記載される腎細胞集団および腎細胞の混合物を用いて、必要とする対象における腎臓疾患、貧血、またはＥＰ欠乏症を治療するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された第１の腎細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態において、第１の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮される。別の実施形態において、組成物は、１つ以上の追加の腎細胞集団をさらに含んでもよい。一実施形態において、追加の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない第２の細胞集団である。別の実施形態において、追加の細胞集団は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、または血管細胞に対して濃縮されない第２の細胞集団である。別の実施形態において、組成物は、本明細書に記載される疾病または疾患の治療のために、本明細書に記載されるような移植可能な構造体を形成するように、生体材料中に沈積された、生体材料上に沈積された、生体材料に包埋された、生体材料で被覆された、または生体材料成分（複数可）中に補足された、腎細胞集団または腎細胞の混合物も含む。一実施形態において、細胞集団は、急性または慢性の病態における再生を刺激するために、単独で、あるいは他の細胞または生体材料、例えば、ヒドロゲル、多孔性の足場、または天然もしくは合成のペプチドもしくはタンパク質と組み合わせて使用される。
別の態様において、本発明の方法を用いた対象における腎臓疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏症の有効な治療は、赤血球生成および／または腎機能の種々の指標によって観察することができる。一実施形態において、赤血球恒常性の指標は、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、赤血球数（ＲＢＣ）、網状赤血球数、網状赤血球の割合、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）を含むが、これに限定されない。ある他の実施形態において、腎機能機能の指標は、血清アルブミン、アルブミン対グロブリン比（Ａ／Ｇ比）、血清リン、血清ナトリウム、腎臓サイズ（超音波で測定可能）、血清カルシウム、リン／カルシウム比、血清カリウム、タンパク尿、尿クレアチン、血清クレアチン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、コレステロ−ルレベル、トリグリセリドレベル、および糸球体ろ過量（ＧＦＲ）を含むが、これに限定されない。さらに、相対的な健康および福祉の幾つかの指標は、体重の増加または減少、生存率、血圧（平均全身血圧、拡張期血圧、もしくは収縮期血圧）、および身体持久能力を含むが、これに限定されない。
別の実施形態において、有効な治療は、腎機能の１つ以上の指標の安定化によって明らかになる。腎機能の安定化は、本発明の方法を用いて治療されていない対象における同じ指標と比較したときの、本発明の方法を用いて治療された対象における指標の変化の観察によって明らかになる。あるいは、腎機能の安定化は、治療前の同じ対象における同じ指標と比較したときの、本発明の方法を用いて治療された対象における指標の変化の観察によって明らかになる。第１の指標における変化は、値の増加または減少であり得る。一実施形態において、本発明によって提供される治療は、対象における血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの安定化を含んでもよく、対象において観察されるＢＵＮレベルは、本発明の方法を用いて治療されていない同様の病態を有する対象と比較して低い。ある他の実施形態において、治療は、対照における血清クレアチンレベルの安定化を含んでもよく、対象において観察される血清クレアチンレベルは、本発明の方法を用いて治療されていない同様の病態を有する対象と比較して低い。別の実施形態において、治療は、対象におけるヘマトクリット（ＨＣＴ）レベルの安定化を含んでもよく、対象において観察されるＨＣＴレベルは、本発明の方法を用いて治療されていない同様の病態を有する対象と比較して高い。別の実施形態において、治療は、対象における赤血球（ＲＢＣ）レベルの安定化を含んでもよく、対象において観察されるＲＢＣレベルは、本発明の方法を用いて治療されていない同様の病態を有する対象と比較して高い。当業者は、本明細書に記載されるか、または当該技術分野において既知である１つ以上の追加の指標が、対象における腎臓疾患の有効な治療を決定するために測定されてもよいことを理解するであろう。
別の態様において、本発明は、必要とする対象に赤血球恒常性を提供する方法に関する。一実施形態において、方法は、（ａ）本明細書に記載されるような腎細胞集団、例えば、Ｂ２もしくはＢ４、または腎細胞の混合物、例えば、Ｂ２／Ｂ４および／もしくはＢ２／Ｂ３を対象に投与するステップと、（ｂ）赤血球生成の指標のレベルが対照の指標レベルと比較して異なることを、対象からの生体試料において判定するステップと、を含み、指標レベルにおける差異は、（ｉ）対象が投与するステップ（ａ）に応答性であることを示すか、または、（ｉｉ）対象における赤血球恒常性を示す。別の実施形態において、方法は、（ａ）本明細書に記載されるような腎細胞集団または腎細胞の混合物を含む組成物を対象に投与するステップと、（ｂ）赤血球生成の指標のレベルが対照の指標レベルと比較して異なることを、対象からの生体試料において判定するステップと、を含み、指標レベルにおける差異は、（ｉ）対象が投与するステップ（ａ）に応答性であることを示すか、または、（ｉｉ）対象における赤血球恒常性を示す。別の実施形態において、方法は、（ａ）生体材料または生体適合性ポリマ−の足場を提供するステップと、（ｂ）移植可能な構造体を形成するために、本明細書に記載される様式で、本発明の腎細胞集団または腎細胞の混合物を生体材料または足場の上または中に沈積させるステップと、（ｃ）構造体を対象内に移植するステップと、（ｄ）赤血球生成の指標のレベルが対照の指標レベルと比較して異なることを、対象からの生体試料において判定するステップと、を含み、指標レベルにおける差異は、（ｉ）対象が投与するステップ（ａ）に応答性であることを示すか、または、（ｉｉ）対象における赤血球恒常性を示す。
別の態様において、本発明は、腎機能の安定化および赤血球恒常性の回復の両方を必要とする対象に提供する方法に関し、上記対象は、腎機能の障害ならびに貧血および／またはＥＰＯ欠乏症の両方を有する。一実施形態において、方法は、以下の細胞型のうちの少なくとも１つを含有する、本明細書に記載されるような腎細胞集団または腎細胞の混合物投与するステップを含む：尿細管由来の細胞、糸球体由来の細胞、間質由来の細胞、集合管由来の細胞、ストロ−マ組織由来の細胞、または脈管構造に由来する細胞。別の実施形態において、集団または混合物は、ＥＰＯを産生する細胞および尿細管上皮細胞の両方を含有し、尿細管細胞は、以下のマ−カ−のうちの少なくとも１つによって同定されている：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３），およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。この実施形態において、対象の治療は、未治療の対象または対象の前治療指標のいずれかと比較して、腎機能の少なくとも１つの指標の改善と同時に、赤血球生成の少なくとも１つの指標の改善によって示される。
一態様において、本発明は、本明細書に記載されるＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された腎細胞集団、またはＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮された細胞集団を含有する腎細胞の混合物を投与することによって、（ｉ）腎臓疾患、貧血、もしくはＥＰＯ欠乏症を治療する方法、（ｉｉ）腎機能を安定化する方法、（ｉｉｉ）赤血球恒常性を回復させる方法、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを提供し、投与の有益な効果は、ＥＰＯを産生する細胞に対して濃縮されない細胞集団を投与する効果よりも大きい。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）をもたらす。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、血清中のタンパク質保持の改善をもたらす。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、改善されたレベルの血清コレステロ−ルおよび／またはトリグリセリドレベルをもたらす。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、改善されたレベルのビタミンＤをもたらす。一実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたリン：カルシウム比をもたらす。別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルのヘモグロビンをもたらす。さらなる実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルの血清クレアチンをもたらす。さらに別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルのヘマトクリットをもたらす。さらなる実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルの赤血球数（ＲＢＣ数）をもたらす。一実施形態において、改善されたレベルのヘマトクリットは、９５％正常な健常レベルまで回復される。さらなる実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善された網状赤血球数をもたらす。他の実施形態において、濃縮した細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善された網状赤血球の割合をもたらす。さらに他の実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルの赤血球容積分布幅（ＲＤＷ）をもたらす。さらに別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、濃縮されない細胞集団と比較して改善されたレベルのヘモグロビンをもたらす。さらに別の実施形態において、濃縮された細胞集団は、骨髄の細胞充実性がほぼ正常であり、骨髄：赤血球比がほぼ正常となるように、骨髄における赤血球造血反応をもたらす。
別の態様において、本発明は、濃縮された細胞集団を投与することによって、（ｉ）腎臓疾患、貧血、もしくはＥＰＯ欠乏症を治療する方法、（ｉｉ）腎機能を安定化する方法、（ｉｉｉ）赤血球恒常性を回復させる方法、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを提供し、本明細書に記載される腎細胞集団または腎細胞集団の混合物を投与することの投与の有益な効果は、組換え型ＥＰＯ（ｒＥＰＯ）を投与することによって提供される有益な効果と比較した場合に、赤血球恒常性の改善によって特徴付けられる。一実施形態において、集団または混合物は、必要とする対象に投与されると、組換え型ＥＰＯタンパク質の投与と比較した場合に、赤血球恒常性の改善（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ数によって判定される）をもたらす。一実施形態において、集団または混合物は、投与されると、対照のヘマトクリットよりも約１０％以下低いかまたは高い、組換え型ＥＰＯと比較して改善されたレベルのヘマトクリット、ＲＢＣ、またはヘモグロビンを提供する。さらなる実施形態において、集団または混合物の単回用量または送達は、投与されると、組換え型ＥＰＯタンパク質の単回用量または送達が赤血球恒常性の改善をもたらす期間を有意に超える期間の間、治療された対象に赤血球恒常性の改善（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ数の増加によって判定される）をもたらす。別の実施形態において、集団または混合物は、本明細書に記載される用量で投与されると、対応する健常対照の正常レベルの約１１０％超えるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ数を生じない。さらなる実施形態において、集団または混合物は、本明細書に記載される用量で投与されると、本明細書に記載される用量で送達される組換え型ＥＰＯタンパク質と比較して、優れた赤血球恒常性（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ数によって判定される）を提供する。別の実施形態において、組換え型ＥＰＯは、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、または約５００ＩＵ／ｋｇの用量で送達される。当業者は、当該技術分野において既知である組換え型ＥＰＯの他の投与量が好適であり得ることを理解するであろう。
本発明の別の実施形態は、必要とする対象における腎臓疾患、貧血、もしくはＥＰＯ欠乏症の治療、必要とする対象への赤血球恒常性の提供、または必要とする対象における腎機能の改善において有用な薬物の調製のための、少なくとも１つの本明細書に記載される細胞集団または本明細書に記載される移植可能な構造体の使用を対象とする。
本発明の別の実施形態は、特定の検証された治療特性に基づく特定の細胞亜集団の選択に基づいた、特定の原因の腎臓疾患の治療のための、特定の濃縮された細胞集団（複数可）（本明細書に記載される）の使用を対象とする。
投与方法および経路
本発明の細胞調製物は、単独で、または他の生理活性成分と組み合わせて投与することができる。
本明細書に記載される腎細胞集団または腎細胞集団の混合物の治療的有効量は、対象によって安全に受容される細胞の最大数から、腎臓疾患の治療、例えば、１つ以上の腎機能の安定化、減少率の低下、または改善に必要な細胞の最小数まで及び得る。特定の実施形態において、本発明の方法は、約１０，０００細胞／ｋｇ、約２０，０００細胞／ｋｇ、約３０，０００細胞／ｋｇ、約４０，０００細胞／ｋｇ、約５０，０００細胞／ｋｇ、約１００，０００細胞／ｋｇ、約２００，０００細胞／ｋｇ、約３００，０００細胞／ｋｇ、約４００，０００細胞／ｋｇ、約５００，０００細胞／ｋｇ、約６００，０００細胞／ｋｇ、約７００，０００細胞／ｋｇ、約８００，０００細胞／ｋｇ、約９００，０００細胞／ｋｇ、約１．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または約５ｘ１０６細胞／ｋｇの投与量で、本明細書に記載される腎細胞集団または腎細胞集団の混合物の投与を提供する。別の実施形態において、対象への細胞の投与量は、単回投与量、または単回投与量および追加の投与量であってもよい。他の実施形態において、投与量は、本明細書に記載される構造体によって提供されてもよい。他の実施形態において、対象への細胞の投与量は、推定腎臓質量または機能的な腎臓質量に基づいて計算されてもよい。
治療的に有効な量の本明細書に記載される腎細胞集団またはその混合物は、薬学的に許容される担体または賦形剤中に懸濁することができる。かかる担体は、１％血清アルブミンを足した塩基性培地、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、コラ−ゲン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、フィブリン糊、ポリエチレングリコ−ル、ポリビニルアルコ−ル、カルボキシメチルセルロ−ス、およびそれらの組み合わせを含むがこれに限定されない。剤形は、投与様式に適合するべきである。したがって、本発明は、対象における腎疾患を治療するための薬物を製造するための、腎細胞集団またはその混合物（例えば、Ｂ２細胞集団単独、またはＢ３および／もしくはＢ４細胞集団と混合された）の使用を提供する。幾つかの実施形態において、薬物は、成長因子、ケモカイン、またはサイトカイン等の組換え型ポリペプチドをさらに含む。さらなる実施形態において、薬物は、ヒト腎臓由来の細胞集団を含む。薬物を製造するために使用される細胞は、本明細書に記載される方法に提供される変形例のうちのいずれかを使用して、単離、誘導、または濃縮することができる。
腎細胞調製物（複数可）、またはその混合物、または組成物は、ヒトへの投与に適用される医薬組成物としての日常的手順に従って配合される。通常、例えば、静脈内投与、動脈内投与、または腎臓カプセル内の投与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、注射部位における任意の疼痛を和らげるための局所麻酔を含むこともできる。一般に、成分は、別個にまたは単位剤形中に一緒に、例えば、活性剤の量を示すアンプル等の密封容器中の凍結保存した濃縮物として供給される。組成物が点滴によって投与される場合は、医薬品グレ−ドの滅菌した水または生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて分注することができる。組成物が注射によって投与される場合は、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供されてもよい。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、また該組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、多種多様な好適な医薬組成物の剤形が存在する（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｌｆｏｎｓｏ Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００３を参照のこと）。医薬組成物は、通常、米国食品医薬品局の医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則（ＧＭＰ）の全てに完全に準拠して、無菌で実質的に等張性として配合される。
本発明の一態様は、例えば、Ｂ２細胞調製物のみ、またはＢ３および／もしくはＢ４細胞調製物と組み合わせた、本発明の腎細胞調製物と、薬学的に許容される担体と、を含む医薬製剤をさらに提供する。幾つかの実施形態において、該製剤は、１０４〜１０９個の哺乳動物腎臓由来の細胞を含む。
一態様において、本発明は、必要とする対象に、混合物を含む本明細書に記載される細胞集団のうちの１つ以上を提供する方法を提供する。一実施形態において、細胞集団（複数可）の供給源は、自己、または同種、同系（自律性もしくは同系移植）、およびそれらの任意の組み合わせであってもよい。自己供給源ではない場合、方法は、免疫抑制剤の投与を含んでもよい。好適な免疫抑制薬は、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス水和物、クロラムブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オ−ラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、バイオシンソルブ、ムロモナブ、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノ−ル酸モフェチル、レフルノミド、バシリキシマブ、ドルナ−ゼα、ビンダリド（ｂｉｎｄａｒｉｄ）、クラドリビン、ピメクロリムス、イロデカキン、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス、ガビリモマブ、ファラリモマブ、クロファラビン、ラパマイシン、シプリズマブ、柴苓湯、ＬＤＰ−０３、ＣＤ４、ＳＲ−４３５５１、ＳＫ＆Ｆ−１０６６１５、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１３１、ＦＴＹ−７２０、ＴＳＫ−２０４、ＬＦ−０８０２９９、Ａ−８６２８１、Ａ−８０２７１５、ＧＶＨ−３１３、ＨＭＲ−１２７９、ＺＤ−７３４９、ＩＰＬ−４２３３２３、ＣＢＰ−１０１１、ＭＴ−１３４５、ＣＮＩ−１４９３、ＣＢＰ−２０１１、Ｊ−６９５、ＬＪＰ−９２０、Ｌ−７３２５３１、ＡＢＸ−ＲＢ２、ＡＰ−１９０３、ＩＤＰＳ、ＢＭＳ−２０５８２０、ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４−１ｇ、ＥＲ−４９８９０、ＥＲ−３８９２５、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＲＤＰ−５８、ＰＮＵ−１５６８０４、ＬＪＰ−１０８２、ＴＭＣ−９５Ａ、ＴＶ−４７１０、ＰＴＲ−２６２−ＭＧ、およびＡＧＩ−１０９６を含むが、これに限定されない（米国特許第７，５６３，８２２号を参照のこと）。当業者は、他の好適な免疫よく製薬を認識するであろう。
本発明の治療方法は、単離された腎細胞集団またはその混合物を個体に送達することを含む。一実施形態において、利益を意図する部位に細胞を直接投与することが好ましい。一実施形態において、本発明の細胞調製物またはその混合物は、送達ビヒクルにおいて個体に送達される。
細胞を対象に投与するための種々の手段は、本明細書を考慮すると当業者には明らかであろう。かかる方法は、対象の標的部位に細胞を注射することを含む。対象への注射または移植によって導入を促進する送達デバイスまたはビヒクル内に細胞を挿入することができる。特定の実施形態において、送達ビヒクルは、天然材料を含むことができる。他の特定の実施形態において、送達ビヒクルは、合成材料を含むことができる。一実施形態において、送達ビヒクルは、器官の構造を模倣するか、または該構造内に適切に適合する構造を提供する。他の実施形態において、送達ビヒクルは、液体様の性質を有する。かかる送達デバイスは、受容する対象の身体内に細胞および液体を注射するために、カテ−テル等の管を含むことができる。好ましい実施形態において、管はさらに、本発明の細胞を対象の所望の位置に導入することができる針、例えば注射器等を有する。幾つかの実施形態において、哺乳動物の腎臓に由来する細胞集団は、カテ−テルを通して血管内に投与するために配合される（用語「カテ−テル」は、血管に物質を送達するための種々の管様システムのいずれをも含むことが意図される）。あるいは、細胞は、織物、編物、組物、メッシュ、および不織布等の繊維、有孔フィルム、スポンジおよび発泡体、ならびに多孔性ビ−ズ、微粒子、ナノ粒子等のビ−ズを含むが、これに限定されない生体材料もしくは足場の中または上に挿入されてもよい。細胞は、送達のために種々の異なる形態で調製することができる。例えば、細胞は、溶液またはゲルに懸濁されてもよい。細胞は、本発明の細胞が生存可能な状態を維持する薬学的に許容される担体または希釈剤と混合されてもよい。薬学的に許容される担体および希釈剤は、生理食塩水、緩衝水溶液、溶媒、および／または分散媒を含む。かかる担体および希釈剤の使用は、当該技術分野において周知である。溶液は、好ましくは無菌および流体であり、等張性であることも多い。好ましくは、溶液は、製造および保存条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノ−ル、フェノ−ル、アスコルビン酸、チメロサ−ル等の使用によって、細菌およびカビ等の微生物の汚染作用に対して保護される。当業者は、本発明の細胞集団およびその混合物の送達において使用される送達ビヒクルは、上記特性の組み合わせを含むことができることを理解するであろう。
例えば、Ｂ２細胞集団単独のまたはＢ４および／もしくはＢ３と混合された、単離された腎細胞集団（複数可）の投与様式は、全身性、腎内（例えば、実質）、静脈内、または動脈内注射、および意図する活性部位の組織への直接的な注射を含むが、これに限定されない。本発明に従って使用される追加の投与形式は、直接開腹術による、直接腹腔鏡検査による、経腹的、もしくは経皮的な、単回または頻回注射（複数可）を含む。本発明に従って使用されるさらに追加の投与形式は、例えば、逆行注入および腎盂尿管注入を含む。外科的な投与の手段は、腎部分摘出および構造体移植、腎部摘出、腎盂部分切除（ｐａｒｔｉａｌ ｐｙｅｌｅｃｔｏｍｙ）、網±腹膜を用いた血管新生、多病巣の生検針追跡、円錐形またはピラミッド形から円筒形、および腎極状の置換を含む１ステップ手技、ならびに、例えば、再移植用のオルガノイド−体内バイオリアクタ−を含む２ステップ手技等を含むが、これに限定されない。一実施形態において、細胞の混合物は、同時に同じ経路を通って送達される。別の実施形態において、制御された混合物を含む細胞組成物の各々は、本明細書に記載される方法のうちの１つ以上によって、同時にまたは一時的に制御された様式のいずれかにおいて、特定の位置に別々に送達されるか、または特定の方法によって送達される。
ヒトにおける適切な細胞移植の投与量は、細胞の活動、例えばＥＰＯの産生に関する既存の情報から決定することができるか、または前臨床試験において実施された用量試験から推定することができる。インビトロ培養およびインビボ動物実験から、細胞の量を定量化して、移植材料の適切な投与量を算出するのに用いることができる。また、追加の移植を行うことができるか、またはそれに応じて移植材料が減少されるかを決定するために、患者を監視することができる。
当該技術分野で既知であるコラ−ゲンもしくはヒアルロン酸のうちの１つ以上の種類等の選択された細胞外マトリックス成分、および／または成長因子、多血小板血漿、ならびに薬剤を含む１つ以上の他の成分が、本発明の細胞集団およびその混合物に加えられてもよい。
本明細書に列挙される全ての特許、特許出願、および参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、例示目的のみのために提示されるのであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１−腎不全に罹患する成熟ブタからの生体反応性腎細胞の単離および特性の決定
年齢一致正常ブタ腎組織との直接比較による細胞構成の評価および特性決定のために、オスの成熟ブタ（イノシシ）における貧血を伴う突発性の進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）の症例から、新鮮な病変腎組織が提供された。
採取時の腎組織の組織学的検査により、多発性線維症を伴う重度のびまん性の慢性間質性線維症および半月体形成性糸球体腎炎によって特徴付けられる腎疾患が確認された。臨床化学により、高窒素血症（血中尿素窒素および血清クレアチニンの上昇）および軽度の貧血（ヘマトクリットの軽度の低下およびヘモグロビンレベルの低下）が確認された。病変腎組織および正常腎組織の両方から細胞を単離し、増殖して特性決定した。
図１は、正常腎組織と比較した、ゴモリトリクロ−ム染色により明らかにされた病変腎組織の線維症（矢印で示された青色の染色）を示す。キュビリン：メガリンを発現し、受容体介在性アルブミン輸送ができる機能的な尿細管細胞を、正常腎組織および病変腎組織の両方から繁殖させた。培養物中にはエリスロポエチン（ＥＰＯ）を発現する細胞も存在し、複数継代および凍結融解サイクルを通して保持した。さらに、分子解析により、正常組織および病変組織の両方に由来するＥＰＯを発現する細胞が、ＨＩＦ１αによるＥＰＯの誘発およびｖＥＧＦを含む他の低酸素制御した遺伝子標的を用いたインビトロでの低酸素条件に応答したことが確認された。
コラゲナ−ゼ＋ディスパ−ゼを用いた酵素消化によりブタ腎組織から細胞を単離し、また、単純な機械的消化および移植片培養を行うことにより、別の実験においても単離した。継代２で、ＥＰＯを発現する細胞を含有する移植片由来の細胞培養を、大気中（２１％）および様々な低酸素（○<５％）の両方の培養条件に曝露し、低酸素への曝露がＥＰＯ遺伝子発現の上方制御に至るかどうかを判定した。げっ歯類の培養物について述べるように（実施例３を参照のこと）、正常なブタは、酸素依存性の発現およびＥＰＯ遺伝子の制御を示した。意外なことに、ＣＫＤブタの尿毒症／貧血の状態（ヘマトクリット○<３４、クレアチニン＞９．０）にも関わらず、ＥＰＯを発現する細胞が組織から容易に単離および繁殖され、図２に示すようにＥＰＯ遺伝子の発現を低酸素制御下に維持した。
図３に示すように、繁殖させた培養物中の細胞は、自己組織化して尿細管様構造になる能力を示した。
図４に示すように、培養細胞によるＦＩＴＣ共役アルブミンの受容体介在性取り込みを観察することによって、培養物（継代３）中に機能的な尿細管細胞が存在することが確認された。緑色の点（細い白色の矢印で示される）は、尿細管細胞に特異的な受容体であるメガリンおよびキュビリンによって介在されるフルオレセイン共役アルブミンが取り込まれたことを表しており、機能的な尿細管細胞によるタンパク質再吸収を示唆するものである。青色の染色（太い白色の矢印によって示される）は、ヘキスト染色された核である。
総合すると、これらのデ−タは、たとえＣＫＤによる重度の障害がある腎組織であっても、機能的な尿細管および内分泌細胞をブタ腎組織から単離および繁殖することができることを示している。さらに、これらの所見は、ＣＫＤの治療のための自己細胞に基づく治療薬の進展を支持するものである。
実施例２−ヒト腎臓からの生体反応性ＥＰＯ細胞の単離
正常な成人ヒト腎臓からＥＰＯを産生する細胞を（上記実施例１に記載されるように）酵素的に単離した。図５に示すように、単離手順により、最初の組織よりも多い相対的なＥＰＯ発現が単離後にもたらされた。図６に示すように、ＥＰＯ遺伝子発現を保持した状態で、ヒトＥＰＯを産生する細胞を培養物中に維持することが可能である。ヒト細胞を、未処理の組織培養処理済プラスチック、または、例えば、フィブロネクチンもしくはコラ−ゲン等の特定の細胞外マトリックスで被覆されたプラスチック上で培養／繁殖させたところ、全てが経時的にＥＰＯの発現を支持することが分かった。
実施例３−げっ歯類の腎臓からの生体反応性のＥＰＯを発現する細胞および尿細管細胞の培養
この試験では、Ｌｅｗｉｓラットから単離した初代腎細胞を使用して、低酸素およびせん断力に応答するインビトロでのＥＰＯの発現および尿細管マ−カ−の発現を分析した。
マウスから適用した標準的な方法を使用してＬｅｗｉｓラットから初代腎細胞を単離し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；２６（４）：２９５−３００）、低酸素／高酸素または静的／動的な３Ｄ培養において繁殖させた。
ＥＰＯを産生する細胞の酸素依存性を、大気中の「正常酸素圧」培養条件下（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２に平衡化した３７°Ｃのインキュベ−タ）で細胞を培養し、次いでＥＰＯの低酸素依存性の遺伝子転写を活性化させるために、酸素圧を低酸素培養まで下げる（２％Ｏ２、５％ＣＯ２に平衡化した３７°Ｃのインキュベ−タ）ことによって判定した。最終的に正常酸素圧条件に切り換えることで、低酸素条件下で生じる遺伝子転写を阻害することとなる。細胞を付着させるために、正常酸素圧下で、２次元（２Ｄ）プレ−トおよび３Ｄ（下記のＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅの例を参照のこと）構造体上の両方で、初代腎細胞を培養した（通常４８時間）。次いで、付着した細胞を低酸素インキュベ−タに移し、４８時間の期間にわたって培養させた。４８時間の低酸素培養の最後の時点の後で、細胞を正常酸素圧培養に戻した。３プレ−トの複製からの細胞を、最初は正常酸素圧下、続いて低酸素培養下で、それぞれ所定の時点で採取し、最後に正常酸素圧培養に戻した。採取した試料を液体窒素中で瞬間冷凍し、分析前に−８０°Ｃで保存した。各複製から全ｍＲＮＡを単離し、全ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成することにより遺伝子発現解析を行い、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）を使用して相対的な遺伝子発現を判定した。３プレ−トの複製のほかに、ｑｒｔｐｃｒを用いて２つの技術的複製を分析し、各培養条件の時点毎に合計６つの複製を得た。
Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ−Ｓゼラチンマイクロキャリアビ−ズ
標準的方法を使用して、幼若ラットから初代腎細胞を単離した。約２００，０００個の細胞を、低付着性６ウェルプレ−ト上の滅菌Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒｅ−Ｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ９０４３）マクロ多孔性ゼラチンマイクロキャリアビ−ズ（１３０−３８０μｍ）の５０％（ｖ／ｖ）スラリ−２００μｌを含む培養物中に配置した。静的条件下（細胞を収容するプレ−トは、実験の間中いずれの動きも受けない）または動的条件下（常時動いている）で、２％または２１％いずれかの酸素チャンバ内に細胞を配置した。試験中（７日間）、定期的に各条件から試料を回収した。各条件から１日あたり３つの試料を回収した。全ての試料の遺伝子発現を、最初の単離からの初代細胞の未分画細胞懸濁液である出発材料に正規化した。ＱＲＴＰＣＲを行って、尿細管の発現、ならびに内分泌細胞マ−カ−、Ｅ−カドヘリン、およびＥＰＯをそれぞれ調べた。
結果：培養した内分泌細胞におけるＥＰＯ発現は、静的培養とは異なり動的培養によって、および／または低酸素によって上方制御された。大気中の（２１％）酸素レベルで３Ｄで動的培養した（＋）ＥＰＯ発現の結果を図７に示す。図８は、低酸素レベル（２％）、３Ｄで動的培養した（＋）ＥＰＯ発現を表す。図９も、長期培養において動的培養した（＋）尿細管遺伝子の発現を示す。低酸素および動的３Ｄ培養の両方が、それぞれ、高酸素および静的培養と比較して有意に（ｐ○<０．０５）ＥＰＯ発現を増加させた。図１０は、正常酸素圧培養と対比する、低酸素培養におけるＥＰＯ発現を示す。図１１は、インビトロでの動的３Ｄ培養によるＥＰＯ発現の刺激を示す。ＥＰＯの発現増加は、常に、その制御因子であるＨＩＦ１α、およびＶＥＧＦ等の他のＨＩＦ１α標的遺伝子の発現増加を伴っていた。したがって、培養した新腎細胞におけるＥＰＯ発現が、ＨＩＦ１αを介して酸素レベルによって制御されたことが明らかである。上記結果は、酸素および機械的に遺伝子導入したＥＰＯ発現の制御を保持する生体反応性の初代げっ歯類腎細胞は、インビトロで単離および繁殖させることができることを示している。
実施例４−３Ｄ構造体および比較培養
細胞、足場、および培地を含む新組織／新器官構成のインビボ機能性（治療可能性等）のインビトロでの最良の適応を判定するために、多数の三次元培養構成を設計した。新組織／新器官構成は、以下のように設計した：初代腎細胞培養物（ＥＰＯを産生する細胞および腎臓の尿細管細胞の両方を含有する）を、直径５ｍｍおよび高さ５ｍｍの多孔性の円柱状足場に播種した。５０万〜１００万個／足場の密度で細胞を播種し、プロトタイプのマルチウェル灌流システム（ＭＰＳ、ＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養し、実験の間中、連続的な一方向性の流体流れを提供した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（培地Ａ）またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳのいずれかおよびＫＳＦＭ培地の１：１混合物（培地Ｂ）を含んだ。これらの実験で評価した足場は、オ−プンセル構造ポリ乳酸（ＯＰＬＡ）およびコラ−ゲン１の足場（どちらもＢＤより）、ならびに標準的な方法を使用して製造したポリグリコ−ル酸系足場（ＰＧＡ）を含んだ。
含めた特性：液体が細胞−足場複合体を通って流れることを可能にするのに十分な細孔サイズおよび構造；細胞−足場間および細胞−細胞間の相互作用を許容する微小環境を提供する足場の構造および組成；腎臓再生および／または恒常性に関与するタンパク質および／または分子を発現および／または産生および／または輸送するか、あるいは発現して産生および／または輸送する潜在性とを有する細胞の存在。
例えば、オ−プンセル構造ポリ乳酸（ＯＰＬＡ）を含む好ましい３Ｄの足場を哺乳動物の腎細胞で播種し、足場全体にに培養培地の連続的な灌流を提供するバイオリアクタ−装置において、インビトロ培養に供した。インビトロで調節した足場＋細胞の複合体を以下のように特性決定した：生存可能な、代謝的に活性である細胞の存在；細胞−細胞間および細胞−材料間の相互作用；メガリン、γ−グルタミルトランスフェラ−ゼ（ＧＧＴ）、Ｅ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンを含むが、これに限定されない腎臓の尿細管マ−カ−の発現；ならびにエリスロポエチンを含むが、これに限定されない腎臓の内分泌マ−カ−の発現。
結果：記載したように、２Ｄおよび３Ｄ培養から、調節した培地および全てのタンパク質溶解物を回収した。細胞溶解物（図１２の上のパネル）および調節した培地（図１２の下のパネル）の両方において、標的タンパク質を定量化するためにＥＬＩＳＡ分析を行った。
７日間の灌流培養または静的培養の後、標準的な技術を用いて、播種したＯＰＬＡおよびＣｏｌ１足場を１０％緩衝ホルマリンに固定し、パラフィン包理した。ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色を行って、細胞の存在および形態を調べた。細胞充実性は、静的培養よりも灌流培養において高く、細胞の分布は、Ｃｏｌ１足場と比較するとＯＰＬＡ足場のほうが足場全体に行き渡っていた（図１３を参照のこと）。
図１４は、７日間の（静的および灌流）培養後のＯＰＬＡおよびＣｏｌ１足場の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像の結果を示す。灌流培養は、静的培養よりも高い細胞充実性および細胞の組織化を示した。
溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）の添加によって、足場または２Ｄ培養物からｍＲＮＡを単離し、また、溶解緩衝液中での電気的な均質化（ポリトロン）によって、３Ｄ足場からｍＲＮＡを単離した。該当する標的遺伝子に特異的なイントロンスパニングプライマ−を用いてＲＴ−ＰＣＲ解析に供した精製ｍＲＮＡは、調べた３Ｄ構成のうちの３／７が、培養した５日間にわたって標的遺伝子（すなわち、ＥＰＯ）を発現したことを示した。
対照的に、２Ｄ構成（図１５のレ−ン８〜１０）には、５日間で検出可能な標的遺伝子のｍＲＮＡは見られなかった。図１５のレ−ン１は、標的遺伝子（レ−ン２１）を発現することが分かっている肉眼的に解剖した新鮮な組織中に見られるレベルに近づいている発現レベルに、５日間で達する３Ｄ構成を表している。
図１６は、足場における代謝活性を評価するために使用したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）の結果（レサズリン代謝）を示す。足場構成Ｃからは、灌流および静的条件の両方において最良の代謝反応が得られ、それぞれ足場Ｂおよび足場Ａがそれに続いた。全ての足場構成で、灌流培養はレサズリン代謝に関して静的培養よりも優れていた。
初代腎細胞の灌流および静的３Ｄ培養によるグルコ−スおよびグルタミンの消費を調べるために、調節した培地を回収し、Ｎｏｖａ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）４００で分析した。グルコ−スの消費は、静的条件よりも灌流条件において顕著に促進された．グルタミンは、全ての３Ｄ条件においてある程度消費され、灌流条件において静的条件よりもわずかに高い消費が見られた。グルタミン代謝の副産物であるグルタミン酸塩の産生は、検査した全ての足場構成において静的条件よりも灌流条件において高く、また、グルコ−スの副産物である乳酸塩の産生についても同様であった（図１７を参照のこと）。
実施例５−腎細胞の未分画混合物の不均一な集団の単離（被験物質Ｎｏ．１）
主に尿細管細胞を含むが、集合管、糸球体、内分泌、血管、および他の細胞型の小さな亜集団も含む腎細胞の未分画混合物（ＵＮＦＸ）の濃縮した集団を、以下のように全腎臓から単離した：
細胞ドナ−：２週齢Ｌｅｗｉｓラットのオス２０匹を屠殺して、腎臓を採取した。新たに切除した腎臓を、冷却した（４℃）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）５０ｍＬを含有する５０ｍＬ円錐管（管当たり１０個の腎臓）上に配置し、氷上で維持した。翌日、腎臓を含有する管を７０％エタノ−ルですすぎ、処理のために生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内に配置した。
腎細胞単離プロセス：５０ｕｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する１Ｘ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で腎臓をすすぎ、鉗子およびメスを使用して結合組織および腎杯を手で除去した。滅菌した鉗子およびメスを使用して腎臓を細かく刻み、細胞／組織スラリ−にした。
細胞／組織の調製物を、ディスパ−ゼ（４Ｕ／ｍＬ）（Ｎｏ．０７１９３、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）＋５ｍＭのＣａＣｌ２＋コラゲナ−ゼＩＶ型（３００Ｕ／ｍＬ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）を含有するクレブス緩衝液中、揺動プラットフォ−ム上で３０分間３７℃で酵素的に消化した。次いで、得られた細胞懸濁液を、７０μｍの細孔を有するセルストレ−ナ−（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を通してろ過し、５０：５０腎細胞成長培地を含有する滅菌した円錐形の５０ｍＬポリプロピレン管に入れた（１：１高グルコ−スＤＭＥＭ： ＫＳＦＭ）。次いで、懸濁液を５分間３００×ｇで遠心分離し、１０ｍＬの５０：５０腎細胞成長培地に再懸濁した。
細胞懸濁液１０ｍＬを２つの１５円錐管（それぞれ５ｍＬ）に等分した。５ｍｌｓの３０％ｗ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を各管に加え、６回反転させた。混合後、１ミリの１Ｘ ＰＢＳを、各懸濁液の上に注意深く載せて層を形成した。間断なく１５分間８００×ｇで管を遠心分離した（室温）。滅菌した１０ｍＬピペットにより細胞バンド（生存可能な新腎細胞原型Ｎｏ．１を含有する）を除去し、５０：５０腎細胞成長培地（低グルコ−スＤＭＥＭで作製）で５倍に希釈し、３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を注意深く除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの５０：５０（低グルコ−ス）腎細胞成長培地に再懸濁して数えた。遺伝子発現検査のために５０万個の細胞の試料を採取した。生細胞の合計収率は２３０×１０６（生存率９４％）であった。
合計４６．８×１０６個の細胞（プレ−ト当たり１．１７×１０６個の細胞）を、５０：５０（低グルコ−ス）培地中の４０個のｐ１００組織培養処理済ポリスチレンプレ−ト（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）に配置し、標準的なＣＯ２インキュベ−タ（２１％Ｏ２）に入れた。４８時間後、５０：５０（低グルコ−ス）培地を用いて培養物の培地を１００％交換し、３７℃の２％Ｏ２環境に配置した。２４時間後、移植のために２％Ｏ２細胞を採取した。各プレ−トを滅菌ＰＢＳで１回洗浄し、続いて、加温した０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ ｗ／ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）５．０ｍＬを添加し、５〜７分間３７℃に戻した。成長培地を各プレ−トに加え（５．０ｍＬ）、細胞懸濁液を除去して滅菌した円錐形の５０ｍＬポリプロピレン管に貯蔵した。３００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット状にし、滅菌ＰＢＳ中で２回洗浄し、冷却した（４℃）ＰＢＳに再懸濁して、ヘマサイトメ−タを用いて数えた。冷却した滅菌ＰＢＳ中で、１０×１０６細胞／１００μＬのアリコ−トを調製した。培養後の生細胞の収率は、９１×１０６ （生存率９０％）であった。増殖倍数（播種→採取）は３．９１倍であった。
実施例６−腎細胞の未分画混合物の不均一な集団の単離および足場播種（被験物質Ｎｏ．２）
細胞ドナ−：２週齢のＬｅｗｉｓラットのオス１０匹を屠殺して、腎臓を採取した。新たに切除した腎臓を、冷却した（４℃）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）５０ｍＬを含有する５０ｍＬ円錐管（管当たり１０個の腎臓）上に配置し、氷上で維持した。翌日、腎臓を含有する管を７０％エタノ−ルですすぎ、プロセスのために生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内に配置した。
腎細胞単離プロセス：５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する１Ｘ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で腎臓をすすぎ、鉗子およびメスを使用して結合組織を手で除去した。滅菌した鉗子およびメスを使用して腎臓を細かく刻み、細胞／組織スラリ−にした。
細胞／組織の調製物を、ディスパ−ゼ（４Ｕ／ｍＬ）（Ｎｏ．０７１９３、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）＋５ｍＭのＣａＣｌ２＋コラゲナ−ゼＩＶ型（３００ Ｕ／ｍＬ）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗａｒｋ，ＮＪ）を含有するクレブス緩衝液中、揺動プラットフォ−ム上で３０分間３７℃で酵素的に消化した。次いで、得られた細胞懸濁液を７０μｍの細孔を有するセルストレ−ナ−（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を通してろ過し、５０：５０腎細胞成長培地を含有する滅菌した円錐形の５０ｍＬポリプロピレン管に入れた（１：１高グルコ−スＤＭＥＭ：ＫＳＦＭ）。次いで、細胞懸濁液を５分間３００×ｇで遠心分離し、５０：５０腎細胞成長培地１０ｍＬに再懸濁した。
細胞懸濁液１０ｍＬを２つの１５円錐管（それぞれ５ｍＬ）に等分した。５ｍＬの３０％ｗ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を各管に加え、６回反転させた。混合後、１Ｘ ＰＢＳ１ミリを、各懸濁液の上に注意深く載せて層を形成した。間断なく１５分間８００×ｇで管を遠心分離した（室温）。滅菌した１０ｍＬピペットにより細胞バンド（生存可能な新腎細胞原型Ｎｏ．１を含有する）を除去し、５０：５０腎細胞成長培地（低グルコ−スＤＭＥＭで作製）で５倍に希釈し、３００×ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を注意深く除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの５０：５０（低グルコ−ス）腎細胞成長培地に懸濁して数えた。生細胞の合計収率は７１×１０６ （生存率９７％）であった。
滅菌包装された２４個のオ−プンセル構造ポリ乳酸（Ｏｐｅｎ−Ｃｅｌｌ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ：ＯＰＬＡ（登録商標））足場（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を５０：５０（低グルコ−ス）培地で予め湿らせ、５０μＬの５０：５０（低グルコ−ス）培地中で、各足場に１×１０６ ＲＫ４２新腎細胞原型Ｎｏ．１を播種した。足場を３７℃／２１％Ｏ２で２時間気候順化させ、次いで、充填したＭＰＳ（マルチウェル灌流システム）ユニット（ＢＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＲＴＰ ＮＣ）に移し、５０：５０（低グルコ−ス）培地において２％Ｏ２の連続流で５日間維持した。培地は２日毎に交換した（容積の５０％を交換）。５日目に、足場をＭＰＳから注意深く除去し、滅菌ＰＢＳ中ですすぎ、移植用に調製するために輸送されるため、周囲温度で約２時間維持した。
実施例７−腎不全および貧血のラットモデルへの腎細胞の未分画混合物の移植
ＥＰＯを産生する間質性線維芽細胞を含む細胞の不均一な混合物を含有する新腎細胞原型Ｎｏ．１（ＵＮＦＸ）の治療上の可能性および安全性を評価するために、近位および遠位尿細管上皮細胞、糸球体細胞、および内皮細胞を上述のようにラット腎臓から単離し、新腎細胞原型Ｎｏ．１が腎不全および／または貧血を遅延または逆行させる能力を、外科的に腎摘出したげっ歯類において評価した。試験デザインを下の表１に示す。非限定的な成功因子は以下を含む：
１） ＨＣＴ数および／またはＲＢＣ数への有意な好ましい効果
２） 血清ＢＵＮおよび／またはクレアチニンの有意な低下
３） 赤血球刺激の組織学的証拠
４） 腎臓再生の組織学的証拠
５） 生体レベルの改善（体重増加、生存期間）
試験デザインに従って、２４匹の成熟Ｌｅｗｉｓラットのメス（８〜１０週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から調達し、下の表１に示すレシピエントとして試験に割り当てた。毎日の健康評価、ならびに毎週の血清学および細胞学的検査によって、病態の発症について各群のサブセットを監視した。全てのレシピエント動物が、新腎臓の原型で治療される前に貧血／尿毒症の病態に達した。試験開始前に、２週間連続した、腎摘出ラットにおける血清クレアチニンの上昇（対照レベルの２倍）が必要とされた。腎摘出ラットを、４つある群のうちの１つに割り当てた（下の表１を参照のこと）。群１のラットに、滅菌ＰＢＳに懸濁され、腎臓の皮髄領域に直接注射によって送達される１０００万個の新腎細胞原型Ｎｏ．１（被験物質１）を投与した。群２のラットに、残腎の遠位極に新腎臓構造体原型Ｎｏ．１（１×１０６個の新腎臓原型Ｎｏ．１細胞を播種し、４日間培養したＯＰＬＡ足場）を付着させることによって処置した。群３のラットは、残腎の遠位極に空のＯＰＬＡ足場を付着させることによって処理した。群４のラットには何も処理を行わなかった。未操作の年齢一致対照ラットを群５とし、偽腎摘出を受けたが、さらなる操作を行わなかった年齢一致対照を群６とした。
腎機能（クレアチニンおよびＢＵＮ）ならびに赤血球生成（ＨＣＴ、ＲＢＣ、および有核ＲＢＣ（ｎＲＢＣ））の評価のために、毎週、全ての動物の尾静脈から採血した（５００μＬ）。試験期間中、毎週、健康状態の観察が行われ、体重を測定した。試験の終わり（８４日目）に、生存するラットを水泳耐久性試験に供した。剖検時に、大腿、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、および肺を採取し、秤量して、組織学的検査のためにホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）によって処理した。腎臓の一部をＯＣＴ培地に包埋し、冷凍して、凍結切片を用いてプロセスした。ＦＦＰＥ組織を処理してＨＥ染色した。
表1: 試験デザイン
時点
第０日目、１回目の腎摘出（５０％）
第７日目、２回目の腎部分摘出（残りの腎臓の２／３を除去）
第４３日目、１回目の採血／血清学／血液学の日
第８３〜９１日目、処置日
第１７０日目、屠殺／試験終了日
被験物質：
被験物質Ｎｏ．１−実施例３で上述のように単離した、ＥＰＯを産生する細胞の亜集団を含有する培養腎細胞の不均一な混合物を含む、新腎細胞原型Ｎｏ．１（ＵＮＦＸ）。
被験物質Ｎｏ．２−実施例４で上述のように、ＥＰＯを産生する細胞の亜集団を含有する培養腎細胞の不均一な混合物と共に播種されたＯＰＬＡ（登録商標）足場を含む、新腎臓構造体原型Ｎｏ．１。
被験物質Ｎｏ．３−ＯＰＬＡ（登録商標）足場
レシピエント５／６腎摘出Ｌｅｗｉｓラットのメス：１３匹のＬｅｗｉｓラットのメス（８〜１０週齢）を、上述のように、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）で２段階の外科的５／６腎臓摘出に供した。
簡潔に言うと、手技の第１相の間に、腹部に対する腹側正中線切開を行い、滅菌ドレ−プを適用した。腸を外側に後退させて右腎を露出した。腎臓を周辺組織から切り離した。縫合糸の１／３の位置で、腎臓の各極の周囲に巻いた。腎臓の周囲で縫合糸を緩やかに結んだ。各端部上で１／３の腎臓を、結紮糸をちょうど超えたところで切除した。縫合糸および創傷クリップで腹部切開を閉じた。手技の第２相の間、かつ第１のステップの１週間後に、動物を麻酔して、前述したように準備した。腰部領域の背側を剃毛した。胸郭のすぐ下に頭蓋末端が来るように、動物の脊椎の左側に頭尾方向の皮膚切開を行った。腹腔に進入した。腎臓を周辺組織から切り離し、切開からそっと引き離した。結合組織および脂肪によって腎臓の前極に緩く付着された副腎を、該付着部を剥がすことによりそっと切り離し、腹腔内に戻した。腎血管および尿管を焼灼した。次いで、焼灼部のすぐ遠位の血管および尿管を切除することによって腎臓を除去した。縫合糸および創傷クリップで切開を閉じた。
対照としては、６匹の年齢一致対照に偽腎摘出を行った（両方の手技に対しても手術用麻酔、開腹、および閉腹）さらに、５匹の年齢一致未操作対象を得た。回収後、全てのラットを５日間隔離した。各ラットを群に割り当てて数字の識別子を与え、試験番号、ベンダ−、および試験監督者と共にケ−ジカ−ドに記入した。ケ−ジ当たり１匹ずつのラットを収容し、Ｐｕｒｉｎａ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒ Ｒｏｄｅｎｔ ＣｈｏｗのＮｏ．５００２を給餌した。水は自由に与えた。
臨床パラメ−タの生存評価：較正した化学天秤を使用して、毎週、体重を観察および記録した．
血液学／臨床化学：４３日目から開始して、毎週、Ａｎｔｅｃｈに血液および血清を回収して、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、赤血球数（ＲＢＣ）、有核赤血球数（ｎＲＢＣ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、および血中尿素窒素（ＢＵＮ）を測定した。尾または伏在静脈から血液を無菌的に採取し、血液または血清採取管に入れた（両方ともＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。日内変動を制御するために、午前８：００ＡＭ〜午後１２：００の間に採血した。
外科的処置手技：
麻酔／鎮静／鎮痛：２６ゲ−ジ針（ＩＰ）に装着した注射器で０．０５ｃｃ（０．３ｍｇ／ｍＬ）のブプレノルフィン（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）を最初に与えることによって、手術準備の前にラットを沈静させた。次いで、最初に４〜５％のイソフルランチャンバ内に配置し、次いでノ−ズコ−ンを介して手技の間中イソフルラン吸入薬（３％）で麻酔を維持することにより、ラットをイソフルラン吸入麻酔で麻酔した。術後、各ラットに２回目のブプレネックスを投与し、翌日に３回目の投与を行った。
手術準備：適切な麻酔レベルに達成した後（足指をつまんで評価）、動物を背臥位にし、５番クリッパ−を使用して、ベタジン（３回）およびエタノ−ル（４回）を同心円状に塗布して右背外側領域を剃毛した。呼吸の正確な監視を可能にするために、滅菌した透明な接着ドレ−プを使用して、該領域を無菌手術のために準備した。
新腎細胞原型Ｎｏ．１の直接注入（被験物質Ｎｏ．１、またはＵＮＦＸ）：右背外側領域を縦方向に切開し、腹膜腔を露出した。残った右腎を単離し、滅菌ガ−ゼおよび先がとがっていない手術用鉗子を使用して腹膜腔から部分的に引き出した。新腎細胞原型Ｎｏ．１（ｐｒｅｐ ＲＫ４０、被験物質１）を穏やかに再懸濁し、滅菌した１ｃｃ注射器（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）１本に充填し、次いで２３Ｇ針を装着した。皮髄境界部を標的とするように、針を通して細胞懸濁液１００μＬ（１０００万個の細胞）を徐々に腎実質内に送達した。各動物毎に新しい滅菌２３Ｇ針を使用した。針が引き出されると、出血を緩和するためにコラ−ゲンディスク（ＧｅｌＦｏａｍ、２ｍｍ×２ｍｍ）を注射部位に配置した。腎臓を腹腔内に戻し、水分を供給するために加温した滅菌生理食塩水１ｍＬを加えた。４．０Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸を使用して筋肉壁を閉じ、創傷クリップを使用して皮膚を閉じた（両アイテムともＥｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）。術後に酸素を投与し（吸入／ノ−ズコ−ンを介して）、覚醒して意識のある状態になるまで動物を監視した。
足場に基づく被験物質（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）の外科的送達：右背外側領域を縦方向に切開し、腹膜腔を露出した。残った右腎を単離し、滅菌ガ−ゼおよび鈍的な手術用鉗子を使用して腹膜腔から部分的に引き出した。右腎遠位極の位置を確認し、先のとがっていない外科技法または鉗子を用いて、暗赤色の腎組織が観察されるまで癒着した腹部脂肪を該領域から裂いた。Ｓｋｌａｒ社製Ｎｏ．１０メス（Ｓｋｌａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して腎臓を露出し、約４×４ｍｍの腎実質領域が露出されて少量の出血が見られるまで該メスで創面切除した。単一の新腎臓構造体原型Ｎｏ．１（被験物質Ｎｏ．２）または足場のみ（被験物質Ｎｏ．３）を二分し（露出した腎実質との大きく平坦な接着点を提供するため）、フィブリン糊（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｅ，ＮＪ）で創面切除した領域に（切除面が創面切除領域の上になるように）付着した。腹部脂肪を足場の上に折り重ね、さらにフィブリン糊を用いて該脂肪を腎表面に密閉することにより、付着した足場に補助的な血液供給をもたらした。次いで、出血の兆候がないか約１分間腎臓を観察し、出血がある場合はフィブリン糊で止血し、次いで、足場を付着した残腎を腹腔内の中立的な位置に戻した。次いで、１．０ｍＬの加温した滅菌生理食塩水を腹腔に加え、水和を補助した。４．０Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸を使用して筋肉壁を閉じ、創傷クリップを使用して皮膚を閉じた（両アイテムともＥｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）。術後に酸素を投与し（吸入／ノ−ズコ−ンを介して）、覚醒して意識のある状態になるまで動物を監視した。
術後の回復：術後、動物を、加温パッド上に設置された吸収パッド（固定されない床敷なし）を収容するケ−ジを備えた手術室で回復させた。ラットが覚醒して動くようになると、個別ケ−ジに戻され、その日の残りおよび翌日一番に観察された。
剖検前手順：
水泳耐久性試験：大きな円形の金属製の桶（直径１４０ｃｍ、深さ４５ｃｍ）１つに水を充填し、３２℃に維持した。ラット（１匹ずつ）を、タンクの側面を向くように静かに水の中に入れて放した。ストップウォッチを用いて、解放時から、ラットが泳ぐことを止め、水面上に留まることができなくなる時までを測定して記録した。綿タオルを使用してラットを乾かし、ケ−ジに戻す前に加温パッド上で回復させた。各動物の試験毎に、プ−ルから排泄物を取り除き、温度を確認して記録した。
最終体重：動物を剖検室に移した。化学天秤を使用して最終体重を測定し、グラムで記録した。
安楽死：ラットをＣＯ２チャンバ内に配置した。深部痛による反射および眼の検査により死亡を確認した。
剖検手順：
心穿刺／採血：安楽死させたラットを剖検台に載せ、血清および血液採取管内に直接採血した。血清試料を回転させ、全血清化学パネルのために血清を回収した。血液学パネルのために血液試料を回収した。
組織採取：残腎（または対照および疑処理のものについては全右腎）を注意深く除去し、秤量して、縦方向に二分した。片方を１０％緩衝ホルマリンに入れ、パラフィン包埋およびＨＥ染色のために処理した。ドライアイス上で事前に冷却した、ＯＣＴ包埋培地を含む型にもう片方を入れて冷凍した。冷凍した腎臓の半片をドライアイス上に維持し、冷凍切片がＹ染色体分析できる状態になるまで−８０°Ｃで保存した。剖検では、脾臓、肝臓、心臓、および肺を除去し、秤量し、それぞれに小さな切り込みを入れて、パラフィン包埋およびＨＥ染色のために１０％緩衝ホルマリンに入れた。最後に大腿を除去し、付随する間質組織を除去した。近位顆をメスの刃で削り、骨髄および全大腿を露出し、次いで、パラフィン包埋およびＨＥ染色手順の前に１０％緩衝ホルマリンに入れた。
結果
生存率：腎摘出ラットの大半は、試験期間終了時まで生存できなかった。群１、５、および６は、８４日目の屠殺まで生存した。群４の未処理の腎摘出ラットの平均生存時間（日数）は４８．２５±２９．８日であった。足場のみを投与された腎摘出ラット（群３）は、処置後２５日生存した。新腎臓構造体原型Ｎｏ．１を投与されたラット（群２）は、平均５７．５±１４．３日間、または、未処理の腎摘出ラットよりも９．２５日間長く生存した。新腎細胞原型Ｎｏ．１で処理した群１のラットは試験期間中生存し、８４日目（矢印）に群５および６と共に屠殺された（図１８）。
体重：試験開始（１４日目）から屠殺（１７０日目）まで毎週体重を測定した。各群毎の体重デ−タ（ｇ）を図１９に示す。群５（対照）のラットは、試験期間を通して平均５６％（±５．５％）増加し、群６（擬似手術）ラットは平均３０．３％（±５．３％）増加した。全ての腎摘出ラット（群１〜４）は、試験期間にわたって有意に低い割合の体重増加を示し、群１（新腎細胞原型Ｎｏ．１）は平均１３．５％増、群２（新腎臓構造体原型Ｎｏ．１）は平均１３．３％増、群３（空の足場）は７．８％増、および群４（未処理）は１３．７％増であった。処理時と屠殺時または死亡時との間の体重増加を調べると、群間での差異はより一層顕著である（図２０）。処理期間中（８３日目〜１７０日目）、群５および６のラットが１１．９％および８．８％体重が増加したのに対し、未処理のままの腎摘出ラット（群４）は平均４．８％の体重が減少した。新腎細胞原型Ｎｏ．１、構造体、または足場のみ（群１、２、および３）を投与されたラットも処理期間中に体重が減少したが、群４の未処理の腎摘出ラットほどではなかった。
腎機能（ＢＵＮおよびクレアチニン）の週間評価：試験の間中、４週目に開始して１７０日目の屠殺まで、血清からＢＵＮおよびクレアチニン両方の測定を毎週行った。個々のラットの平均デ−タを下の表２および３に示す。図２１および２２は、それぞれ、ＢＵＮおよびクレアチニンの群間の経時的測定値を週平均として示す。対照および擬似手術を受けたもの［ＢＵＮ］は、試験を通して平均１９．１±１．９であった。移植時には（グラフ上７および８週目、矢印）、全ての腎摘出ラットにおいて血清ＢＵＮが上昇し、腎摘出ラット間の平均［ＢＵＮ］は５３．３±１９．９であった。試験期間を通じて、群４の未処理の腎摘出ラットは、持続的に上昇する［ＢＵＮ］を示し、死亡前の値は１００超に達した。新腎細胞原型Ｎｏ．１で処理した後、群１のラットは１４週目まで血清［ＢＵＮ］の安定化を示し、その時点から１９週目の屠殺時まで［ＢＵＮ］が上昇した。新腎臓構造体原型Ｎｏ．１を投与された群２のラットは、群４よりも低い血清［ＢＵＮ］を示したが、群１と同程度の安定化は示さなかった。足場のみを投与された群３のラットは、急速に上昇した［ＢＵＮ］および１０週目の死亡によって示されるように、手技後、急速に減少しただけであった。
各群の血清クレアチニンの結果は、［ＢＵＮ］について記載したのと同じ治療効果の傾向を示した（図２２）。試験の間中（７週目〜１９週目）、群５の対照動物および群６の擬似手術動物の血清［クレアチニン］は、０．４±０．５で安定していた。対照的に、群４の未処理の腎摘出ラットは、７週目に１．３８±０．７５の平均［クレアチニン］で試験を開始し、最大値２．７に到達し、死亡時には平均２．６±０．１５であった。足場を播種した動物の平均［クレアチニン］は、死亡時には２．３（ｓｔｄ．０．９２）であり、群４における軽度の改善を表している。興味深いことに、新腎臓細胞原型Ｎｏ．１（群１）を投与された腎摘出ラットは、細胞を移植した時（７週目）の０．８±０．０から１５週目の１．０±０．０まで、安定した［クレアチニン］レベルを維持し、試験の終盤にかけて（１６−１９週目）、平均１．３±０．１８でやや上昇したのみであった。
それぞれ別個のラットのデ−タが（対照＋擬似手術−群５および６）の割合として表される試験の中間時点（１２週目および１３週目）でのＢＵＮおよびクレアチニン値の検討が、各群におけるラット間の変動を検討する手段を提供する（図２３および２４）。１２週目および１３週目の両方に、群２の新腎臓構造体原型Ｎｏ．１ラットの３／５が、群４の未処理の腎摘出ラットよりも有意に低いＢＵＮおよびクレアチニンを示した。両方の（２／２）群１の新腎細胞で処理したラットは、群２または４よりも有意に低いＢＵＮおよびクレアチニンを示した。
赤血球生成（ＨＣＴ、ＲＢＣ、ｎＲＢＣ）の週間評価：全てのデ−タを下の表４および５に示す。７週目（処理時）から１９週目（試験終了時）まで、群５の対照および群６の擬似手術の平均ＨＣＴは、それぞれ４６．９±０．８および４６．２±１．２であった。対照的に、処理を受けなかった群４の腎摘出動物は、７週目の平均ＨＣＴ４０±２．６を示し、それ以降、罹患のために屠殺されるまで急速に減少し、屠殺時の平均ＨＣＴは３５．６±１．８であった。群２の新腎臓構造体原型Ｎｏ．１動物の死亡時の平均ＨＣＴは３８．４±４．３であり、群４と比べて改善を示したが、群５の対照のＨＣＴには達しなかった。興味深いことに、新腎細胞原型Ｎｏ．１を投与された群１の動物は、移植前平均（７週目）４２．８±０．２から１４週目（４８．９±０．４）の群５および６に等しい値になるまでＨＣＴの改善を示した。群１のＨＣＴ値は、１５〜１９週目から徐々に減少し、屠殺時には平均３６．８±７．１に達した。週間平均デ−タを図２５に示す。別個の処理群におけるラット間の変動は時折高かったので、個々のラットデ−タを評価できるように、追加の形式でＨＣＴデ−タを見ることが有用である。図２６ａは、対照に対する割合（％）として表される、１２および１３週目の全ての処理群からのデ−タを提供する（対照＝これらの日の全ての対照および擬似手術動物からの平均値）。
ＲＢＣおよび有核ＲＢＣ（ｎＲＢＣ）も毎週測定した。有核ＲＢＣは、試験を通して検出されなかったため、図式化しなかった。平均デ−タを下の表５に示す。７週目（処置時）から１９週目（試験終了時）まで、群５の対照および群６の擬似手術の平均ＲＢＣ数は８．３２±０．２であった。処理を受けなかった腎摘出ラットは、７週目の始めの平均ＲＢＣ数は７．５８±０．５８であり、死亡するまで急速に減少し、死亡時の平均ＲＢＣ数は６．５±０．５であった。群２の新腎臓構造体原型Ｎｏ．１動物は、死亡時の平均ＲＢＣ数は６．９４±０．７であった。新腎細胞原型Ｎｏ．１を投与された群１の動物は、８週目の６．７１±２．５３から１８週目の８．０３±０．３２まで、安定した一貫性のあるＲＢＣ数の改善を示した。１９週目（試験終了時）のＲＢＣ数における急激な減少（６．６±１．１５）がみられた。概して、週間平均ＲＢＣ数は、ＨＣＴで追跡した（図２７）。同様に、種々の処理群における動物間の変動は、中間時点のグラフを追加することを有用にし、それによって個々の動物のＲＢＣ数（１２〜１３週目）が対照に対する割合（％）として表される（図２８）。
屠殺時の血液学および臨床化学
電解質バランス：カルシウム、カリウム、塩素、およびリンの血清レベルを屠殺時に測定した（動物が死亡していて血液を採取できない場合は例外とした）。全てのデ−タを下の表７ａ〜７ｃに示す。結果を図２９にまとめた。測定した各パラメ−タの正常範囲を、グラフ上の二重点線によって示す（参考正常範囲は、Ｇａｄ（ｅｄ．），Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００８），Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＳＡ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照した）。腎不全は、通常、カリウム、ナトリウム、およびリンの上昇、ならびにカルシウムおよび塩素レベルの低下を伴う。群４の腎摘出ラットは、対照と比較すると、ナトリウムおよびリン（カリウムではない）の上昇、ならびに塩素レベルの低下を示した。腎摘出ラットにおける最も一貫性のある電解質の変化は、塩素レベルの低下とリンレベルの上昇であった。新腎細胞原型Ｎｏ．１（群１）による処理は、群４と比較して、リンおよびカルシウムの低下、ならびに塩素におけるわずかな上昇をもたらした。（図３０を参照のこと）。
分析したラットにおける血清リンレベルを個別に考慮した場合、２／４のラットが群５および６の対照および擬似手術、ならびに群１の新腎細胞で処理したラットと同じくらい低いリンレベルを示しており、ＢＵＮ、クレアチニン、ＨＣＴ、およびＲＢＣ値と同様に、群２のラットの応答が不均一であることは明白である。
血清タンパク：ラットが死亡していて血液を採取できなかった場合を除いて、屠殺時に全てのラットにおいて血清総タンパク、血清アルブミン、および血清グロブリンのレベルを測定した。群５および６の対照および擬似手術のラットついては、血清アルブミンおよびグロブリンは正常範囲であった。群４の未処理の腎摘出ラットは、対照および擬似手術と比較して、血清アルブミンおよび総タンパクが有意に低かった。新腎細胞原型Ｎｏ．１（群１）による処置は、血清アルブミンおよび血清総タンパクに軽度の回復をもたらした（図３１）。新腎臓構造体原型Ｎｏ．１による処置（群２）も、血清総タンパクに軽度の回復をもたらした。血清アルブミンおよび総タンパクの個々のラットのデ−タを図３２において対照に対する割合（％）として表す。
肝機能：ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、およびＡＬＰを測定することによって肝機能を評価した。．これらのテストの全てのデ−タを表７ａ〜７ｃに示す。平均血清ＡＳＴは、群６の擬似手術および群１のＮｘ＋新腎臓胞原型Ｎｏ．１で処理したラットにおいて報告された正常範囲を上回っていた（図３３）。群５の対照は正常範囲内であり、群４および２も同様であったが、変動の程度は高かった。群２（新腎臓構造体原型Ｎｏ．１）を例外として、全ての群が、報告されたラットの正常範囲よりも高い平均血清ＡＬＴおよびＡＬＰを示した。ビリルビンレベルは、報告された正常範囲内であり、処理群間での差異は見られなかった。
脂質および糖：屠殺時に動物から回収した血清中のコレステロ−ル、トリグリセリド、およびグルコ−スも測定した。添付資料Ｆに全てのデ−タを表形式で表す。処置の種類に関わらず、腎摘出群（１、２、および４）において、平均血清コレステロ−ルおよびトリグリセリドの両方のレベルが有意に上昇した。群１の新腎細胞原型Ｎｏ．１で処置したトリグリセリドの平均値が、対照および擬似手術（群５および６）よりも有意に高かったが、同時に群４および２よりも高かったことに留意されたい（図３４）。平均血清グルコ−スレベルは、全てのグル−プについて報告された正常範囲よりも高かった。群１の新腎細胞処理ラットは、対照および擬似手術と同等の血清［グルコ−ス］を示したのに対し、群４および群２のラットは、やや低い血清［グルコ−ス］を示した。各群におけるラット間の変動を理解できるように、対照＋擬似手術に対する割合で表した個別のラットのデ−タを図３５に示す。
屠殺時の血液学
ヘモグロビン：屠殺時に血液を採取して、ヘモグロビン（Ｈｂ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）を測定するために使用した。全てのデ−タを表７ａ〜７ｃに示す。群４の腎摘出した未処理ラットは、対照および擬似手術と比較して有意に低い［Ｈｂ］を示し（図３６）、予想されたように、群４のにおいてＨＣＴおよびＲＢＣ数の両方の低下が見られた。群１および群２の平均［Ｈｂ］は両方とも高く、多くのラットは正常範囲に戻った（図３７の個別デ−タを参照のこと）。ＭＣＨは全てのラットで比較的等しく、ＲＢＣ当たりのヘモグロビン濃度は処理間で類似していることを示唆した。新腎細胞原型Ｎｏ．１または新腎臓構造体原型Ｎｏ．１で処置した群１および群２のラットにおいて［Ｈｂ］増加が観察されたことは、これらのラットにおいてＲＢＣ数およびヘマトクリットの増加が観察されたことと一致していた。総合すると、このデ−タは、処置されたラットにおける赤血球生成および酸素運搬脳の刺激を示唆するものである。
ＷＢＣ数およびＲＢＣ数と組成：ラットが死亡していて血液を採取できなかった場合を除いて、白血球数（ＷＢＣ）および赤血球数（ＲＢＣ）を屠殺時に全てのラットから測定した。全ての血液学的デ−タを表７ａ〜７ｃに表す。さらに、各ラットからのＷＢＣ集団の合計を、リンパ球、単球、好塩基球、好中球、好酸球、および染色されない大細胞（ＬＵＣ）の相対的割合（％）について評価した。図３８に示すように、ＷＢＣが減少した群４の腎摘出未した処理ラットを除く全ての群で、平均ＷＢＣは正常範囲であった。図３９は、群間でのＷＢＣの組成物における差異を明らかにしている。新腎臓構造体原型Ｎｏ．１を投与された群４の腎摘出した未処理ラットおよび群２の腎摘出ラットにおける、相対的に低いリンパ球の割合（％）および相対的に高い好中球の割合（％）に留意されたい。
赤血球集団に関しては、最終採血において網状赤血球の数および割合（％）を測定した（図４０を参照のこと）。ＲＢＣおよびＨＣＴについては既に報告している（図２６〜２９を参照のこと）。群４の腎摘出した未処理ラットにおける網状赤血球の数および割合（％）は、群５および６の対照および擬似手術と比較して減少した。両方の処理群（１および２）において、群４と比べてやや改善が見られたが、差異は統計的に有意ではなかった。ＲＤＷ（ＲＢＣ幅の変動を測定）およびＭＣＶ（平均赤血球容積）を測定したが、群間での有意な差異は見られなかった（デ−タは示さず）。全ての血液学的デ−タを表７ａ〜７ｃに示す。
血小板：血小板数および平均血小板容積（ＭＰＶ）を屠殺時採取した血液において測定した。血小板数は、全ての群において報告された正常範囲よりやや上であった。血小板数またはＭＰＶにおいて、処理群間の有意な差異は見られなかった（図４１を参照のこと）。
水泳耐久性：８４日目の屠殺直前の試験終了時に、方法の項目で述べたように残りのラットを水泳耐久性試験に供した。群１の新腎細胞処理ラットと対象および擬似手術（群５および６）との間で水泳試験を実施した。図４２に示すように、健常ラットは平均２分１２秒泳ぎ、ラット間で妥当な程度の変動（±３３秒）が見られた。また、この試験により、群１の新腎細胞処理ラットの機能レベルが対照群と等しいことが確認された。
病理組織学
検査した各組織の代表的な写真を図４３〜４６に見ることが出来る。群間における各組織についての所見の概要を以下に提供する。
肝臓：群５および６の対照および擬似手術と比較して、群４（Ｎｘ）または群２（Ｎｘ＋Ｎｅｏ−腎臓構造体）の肝実質および／または門脈三管において特記すべき変化は観察されなかった。対照的に、群１（Ｎｘ＋Ｎｅｏ−腎細胞）のラットにおいて類洞内の造血の局所的領域が見られた。
腎臓：群５および６と比較すると、全ての他の試験群が、皮質と髄質の間の境界不明瞭、嚢胞空間、傍糸球体線維症、無血管性ガラス様材料による糸球体係蹄の置換、ヘモジデリン色素沈積、および多巣性尿細管再生によって特徴付けられる構造の損失を伴う、腎臓の糸球体および尿細管の進行性変性を示した。
脾臓：群５および６の対照および擬似手術と群１（Ｎｘ＋Ｎｅｏ−腎細胞注入）の間に大きな組織学的差異または変化は観察されなかった。群２および４の動物における被膜直下の色の髄空の検査で、成獣の赤血球（ＲＢＣ）およびＲＢＣ前駆細胞において、それぞれ、中程度および著しい低下が示された。
骨髄：群５および６の対照および擬似手術と比較して、群１のラットの骨髄の細胞充実性および骨髄対赤血球の比率が等しいと思われた。対照的に、群２および群４の動物の骨髄は、それぞれ、骨髄の細胞充実性における中程度および著しい低下が特徴であった。図２６に示すように、尿毒症／貧血ラットに新腎細胞をインビボで送達することにより、骨髄、特に赤血球集団に、刺激作用が与えられた。図２６はさらに、尿毒症／貧血ラットに新腎細胞をインビボで送達することにより、全体的な細胞充実性も刺激されたことを示し、それは、送達後少なくとも３ヶ月間は持続していた。
上で示したように、単独でまたは３Ｄ足場において送達された新腎細胞原型Ｎｏ．１（ＵＮＦＸ）は、ＲＢＣ数およびＨＣＴの時間的解析によって判定されるように、また、他のパラメ−タ（Ｈｂ、ＭＨＣ、網状赤血球）による最終的な血液検査によって確認されるように、外科的な５／６腎摘出モデルにおいて赤血球生成および赤血球恒常性に再生効果をもたらした。動物間で、特に群５の新腎臓構造体原型Ｎｏ．１で処理したラットにおいて、幾分効果にばらつきが見られ、それは、腎臓による足場の保持の変動に起因するか、または腎実質内における不明な足場崩壊を併発したことに起因する可能性がある。重要なのは、いかなる所与の各ラットにおいても、ＨＣＴまたはクレアチニンの改善が、ＲＢＣ数およびＢＵＮの値の改善へと移行し、全体的な好ましい効果をもたらしたという観察を裏付けたことである。図４７は、各ラットの血清［クレアチニン］に対してＨＣＴデ−タをプロットしたものである。全ての群５および６の対照および擬似手術が、より高いＨＣＴおよびより低いクレアチニンを意味する右上４分の１に群がっている。群１および群２のラットの２／２および２／５が、群５および６と共に右上４分の１に離れている。群２の処理済ラットの１／３が、群４と比較してクレアチニンの改善を示したが、ＨＣＴの改善は見られなかったため、右上４分の１に表示されている。残り２匹の群２のラットは、いずれのパラメ−タにおいても改善がほとんど見られないか、または全く見られず、したがって、群４のラットと共に左下４分の１に群がっている（高クレアチニン、低ＨＣＴ）。
結論として、上記結果は、新腎細胞の移植（群１）が、５／６腎摘出ラットの生存率を改善したことを示す。２／２の群１のラットは、処置後３ヶ月の時点に達し、対照および擬似手術と一緒に８４日目に屠殺した。新腎細胞の移植（群１）は、ＨＣＴおよびＲＢＣが正常値の範囲に戻ったことからも明らかなように、このモデルにおいて約１２週間の期間貧血を逆転させた。さらに、図４７は、尿毒症／貧血ラットに新腎細胞原型Ｎｏ．１をインビボで送達することにより、ヘマトクリットを正常レベルに回復させ、未処理の尿毒症／貧血ラットの生存率を超えるところまで生存を促した。また、上に示したように、貧血を過度に補正して真性多血症を引き起こすという処置の失敗からも明らかなように、新腎細胞の移植は、１２週間の期間、赤血球恒常性を調節した。興味深いことに、治療時から１２週目までの血清ＢＵＮおよびＣＲＥＡの安定化からも明らかなように、新腎細胞の移植は、腎機能の安定化をもたらした。新腎臓構造体原型Ｎｏ．１は、試験の中間時点で、２／５のラットにおいてＨＣＴおよび腎機能の安定化の両方に改善をもたらした。罹患に起因するラットの死亡時には、腎機能および赤血球の機能は、群４の腎摘出未処理ラットが罹患に起因して死亡した時の値よりもある程度良好であった。これらの実験に使用した培養新腎細胞に不均一な性質が観察されたことは、移植後に明らかな治療効果が観察されたことと合わせて、治療効果をもたらす原因となる集団内の特定の細胞成分（複数可）の同定を容易にした。
また上記結果は、新腎細胞原型Ｎｏ．１（２／２）および新腎臓構造体原型Ｎｏ．１（３／５）が送達されると、ＨＣＴ数およびＲＢＣ数に明確および有意な好ましい効果が観察されたことを示している。新腎細胞原型Ｎｏ．１の好ましい効果は迅速であり（処理から１週間以内）、処理後３ヶ月まで持続した。この試験はまた、新腎細胞原型Ｎｏ．１（２／２）および新腎臓構造体原型Ｎｏ．１（３／５）が、未処理のままの腎摘出ラットと比較して腎機能の安定化をもたらし、疾病の進行を遅延させることを示している。さらに、明確な組織学的証拠は、新腎臓胞原型Ｎｏ．１（２／２）が、正常な細胞充実性および屠殺時（処理後３ヶ月）のＭ：Ｅ比をもたらすのに十分な骨髄における赤芽球の刺激を提供したことを示唆している。その上、新腎臓構造体原型Ｎｏ．１（群２）ラットは、屠殺時に正常な骨髄組織学を示さなかったが、細胞充実性および赤血球造血細胞の存在は、群４の未処理腎摘出ラットよりも優れていた。この試験で得られた組織学的証拠はまた、移植部位付近の尿細管の小嚢の再生によって判定されるように、群２の新腎細胞が、腎臓のある側面における軽度の組織学的改善を刺激したことを示唆している。しかしながら、これらの変化は軽度であり、腎臓全体に広がっているわけではない。理論に束縛されるものではないが、腎機能において全身的に見られる任意の改善は、群２のラットにおける個々の細胞レベルでの作用に起因するものであり、組織レベルでは組織学的には十分に感知されない可能性があるという仮説が立てられる。最後に、新腎細胞原型Ｎｏ．１で処理したラットが試験期間中（３ヶ月）生存したことを踏まえて、上記試験は、新腎細胞原型Ｎｏ．１および新腎臓構造体原型Ｎｏ．１が寿命を延長することを示している。腎摘出ラットの全ての群で、処置日と屠殺日の間に体重を増加できなかったが、新腎細胞原型Ｎｏ．１で処理した群では、体重の減少がより少なかった。
実施例８−不均一な細胞集団からの腎細胞の単離および特定の生物反応性腎細胞の濃縮
腎細胞の単離：簡潔に言うと、１０バッチの２週齢Ｌｅｗｉｓラット腎臓を商業供給者（Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌｓ Ｉｎｃ．）から得、Ｖｉａｓｐａｎ保存培地中、約４℃の温度で一晩かけて輸送した。ここに記載される全てのステップは、滅菌製を維持するために生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内で実行した。腎臓をＨａｎｋ’ｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で３回洗浄して、Ｖｉａｓｐａｎ保存培地をすすぎ流した。３回目の洗浄後、残りの腎臓カプセルおよび残りの任意の間質組織を除去した。微細解剖技術を使用して大腎杯も除去した。次いで、滅菌したメスを使用して、腎臓を細かく刻んでスラリ−にした。次いで、スラリ−を５０ｍＬの円錐形の遠心分離管に移し、秤量した。ＲＮＡ用に少量の試料を回収して、ＲＮＡｓｅを含まない滅菌した１．５ｍＬ微小遠心管に入れ、液体窒素中で瞬間冷凍した。冷凍してから、次いで、分析まで−８０度のフリ−ザ−に移した。１０個の幼若腎臓の組織重量は、約１グラムに等しかった。バッチの重量に基づいて、組織１グラムあたり２０ｍＬの消化培地を送達するように消化培地を調整した。この手順のための消化緩衝液は、ＨＢＳＳ中に４ユニットのディスパ−ゼ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ）、５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を含む３００ユニット／ｍＬのＩＶ型コラゲナ−ゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含有していた。
適切な容積の事前に加温した消化緩衝液を管に加え、次いで密封し、３７℃のインキュベ−タ内の揺動機に２０分間配置した。この最初の消化ステップは、多くの赤血球を除去し、残りの組織の消化を促進する。２０分後、管を除去し、ＢＳＣ内に配置した。管の底に組織を沈殿させ、次いで上清を除去した。次いで、残りの組織に、出発容積と等しい新しい消化緩衝液を補充した。再び、３７℃のインキュベ−タ内の揺動機上に管をさらに３０分間配置した。
３０分後、消化混合物をピペットで７０μｍセルストレ−ナ−（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に通して、等しい容積の中和緩衝液（ＤＭＥＭ ｗ／１０％ＦＢＳ）中に入れ、消化反応を停止した。次いで、細胞懸濁液を、３００×ｇで５分間遠心分離することにより洗浄した。遠心分離後、トリパンブル−色素排除法を用いて、ペレットを２０ｍＬのＫＳＦＭ培地および細胞数および生存率評価のために取得した試料に再懸濁した。細胞数を数えてから、ＲＮＡのために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で瞬間冷凍した。ＫＳＦＭ培地で残りの細胞懸濁液を５０ｍＬにし、３００×ｇで５分間遠心分離することにより再度洗浄した。洗浄後、ＫＳＦＭ１ｍＬあたり１５００万個の細胞濃度で細胞ペレットを再懸濁した。
次いで、５ミリリットルの腎細胞懸濁液を、１５ｍＬの円錐形遠心分離管（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）内の３０％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）５ｍＬに加え、６回反転させて混合した。こうして、１５％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の最終混合物を形成した。反転後、ＰＢＳ１ｍＬを用いて、注意深く管に層を形成した。間断なく１５分間８００×ｇで管を遠心分離した．遠心分離後、管を除去し、混合勾配の上に細胞バンドを形成した。赤血球、死亡細胞、ならびに特定の小さいあまり粒状ではない細胞、特定のＥＰＯを産生する細胞、特定の尿細管細胞、および特定の内皮細胞を含む生細胞の小集団を含有するペレットもあった。ピペットを使用してバンドを注意深く除去し、別の１５ｍＬ円錐管に移した。次いで、吸引により勾配培地を除去し、１ＬのＫＳＦＭに再懸濁することによってペレットを回収した。次いで、バンド細胞とペレット細胞を再結合させ、ＫＳＦＭを用いて回収したバンド容積の少なくとも３倍希釈液に再懸濁し、３００×ｇで５分間遠心分離することにより洗浄した。洗浄後、２０ｍＬのＫＳＦＭに細胞を再懸濁し、細胞数のための試料を回収した。トリパンブル−色素排除法を用いて細胞数を数えてから、ＲＮＡ試料のために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で瞬間冷凍した。
密度勾配分離を用いた生存率および特定の生理活性を示す腎細胞の培養能力を高めるための培養前「清浄化」：培養のための清浄な生存可能な細胞集団を得るために、最初に、上記「腎細胞の単離」で述べたように細胞懸濁液を生成した。選択的ステップとして、また最初の調製物を清浄化する手段として、滅菌等張緩衝液に懸濁した合計最大１億個の細胞を、６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノ−ルの原液から室温で調製した等しい容積の３０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（したがって、最終的に１５％ｗ／ｖ Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液が生じる）と１：１で徹底的に混合し、６回反転させて徹底的に混合した。混合後、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液を混合した細胞懸濁液の上に注意深く載せて層を形成した。次いで、適切な平衡が保たれていることを確認しながら、勾配管を注意深く遠心分離機内に装填した。勾配管を８００×ｇで１５分間、２５℃で間断なく遠心分離した。清浄化した細胞集団（生存可能な機能的な集合管細胞、尿細管細胞、内分泌細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する）を、１．０２５〜１．０４５ｇ／ｍＬの密度に応じて６％および８％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に分割した。他の細胞および残骸は、管の底でペレット状になった。
腎細胞の培養：次いで、抗菌剤／抗真菌剤と共に５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇのＥＧＦ、２５ｍｇのＢＰＥ、１Ｘ ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地補充物）を含有するＤＭＥＭ（高グルコ−ス）／ＫＳＦＭの５０：５０混合物１５０ｍＬ中、１ｃｍ２あたり３０，０００個の細胞濃度で、組織培養処理済トリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ Ｔ５００）または同等物に、合わせた細胞バンドとペレットを播種した。加湿した５％ＣＯ２インキュベ−タ内で、２１％の大気中酸素レベルを細胞に提供しながら２〜３日間細胞を培養した。２日後、培地を交換し、ＣＯ２／窒素ガスのマルチガス加湿インキュベ−タ（Ｓａｎｙｏ）によって提供された２％酸素レベル環境に、培養物を２４時間配置した。２４時間のインキュベ−ション後、６０ｍＬの１ＸＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで４０ｍＬの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して除去した。除去後、１０％ＦＢＳを含有する等しい容積のＫＳＦＭで細胞懸濁液を中和した。次いで、３００×ｇで１０分間遠心分離することによって細胞を洗浄した。洗浄後、２０ｍＬのＫＳＦＭに細胞を再懸濁し、５０ｍＬ円錐管に移し、細胞カウントのために試料を回収した。トリパンブル−色素除去法を用いて生細胞数を判定してから、１００万個の細胞をＲＮＡ試料のために回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で瞬間冷凍した。細胞を再度ＰＢＳ中で洗浄し、３００×ｇで５分間遠心分離して回収した。洗浄した細胞ペレットを、３７５０万個の細胞／ｍＬの濃度でＫＳＦＭに再懸濁した。
ステップ密度勾配分離を用いた特定の生理活性を示す腎細胞の濃縮：
主に腎臓の尿細管細胞を含むが、他の細胞型（集合管、糸球体、血管、および内分泌）の小さな亜集団も含有する培養した腎細胞を、多重濃度ｗ／ｖのイオジキサノ−ル（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から作製したステップ密度勾配を用いて、それらの成分の亜集団に分離した。培養物を採取して勾配に適用する前に、低酸素環境に最長２４時間配置した。滅菌した１５ｍＬ円錐管内で、４つの密度の異なる培地を互いの上に層形成することによって（最も密度の高い溶液を底にして、密度のより低い溶液を上にして層を形成した）、ステップ勾配を作製した。ステップ勾配の上部に細胞を適用して遠心分離することで、サイズおよび粒度に基づいて集団を複数のバンドに分離した。
簡潔に言うと、ＫＦＳＭ培地を希釈剤として使用して、７、１１、１３、および１６％密度のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（６０％ｗ／ｖイオジキサノ−ル）を作製した。例えば、：５０ｍＬの７％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に対して、５．８３ｍＬの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノ−ル原液を４４．１７ｍＬのＫＳＦＭ培地に加え、反転させることによって十分に混合した。毛細管に接続された滅菌したＴｙｇｏｎのＬ／Ｓ１６管を装填した蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ Ｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ）を、１分あたり２ｍＬの流量に設定し、４つの溶液のそれぞれ２ｍＬを、１６％溶液から始めて、その後１３％溶液、１１％溶液、および７％溶液を、滅菌した１５ｍＬ円錐管に充填した。最後に、７５００万個の培養げっ歯類腎細胞を含有する細胞懸濁液２ｍＬを、ステップ勾配の上部に充填した（懸濁液は、「腎細胞の培養」で上述のように生成した）。重要なことは、ポンプが勾配溶液を管に送達し始めると、勾配の各層の間に適切な界面が形成されるよう、液体が４５°の角度で管の側面を徐々に流れるように注意を払ったことである。細胞を充填したステップ勾配を、次いで、８００×ｇで２０分間、間断なく遠心分離した。遠心分離後、各界面を崩さないように管を除注意深く除去した。５つの異なる細胞分画を得た（バンド４つおよびペレット１つ）（Ｂ１−Ｂ４、＋ペレット）（図４８、左の円錐管を参照のこと）。滅菌した使い捨てバルブピペットまたは５ｍＬピペットのいずれかを使用して各分画を回収し、表現型でおよび機能的に特性を決定した（実施例１０を参照のこと）。げっ歯類の腎胞懸濁液が単離直後にステップ勾配分画に供される場合は、尿細管細胞に対して濃縮された（および集合管由来の特定の細胞を含有する）分画は１．０６２〜１．０８８ｇ／ｍＬの密度で分離する。対照的に、密度勾配分離が生体外培養後に行われた場合、尿細管細胞に対して濃縮された（および集合管由来の特定の細胞を含有する）分画は１．０５１〜１．０６２ｇ／ｍＬの密度で分離した。同様に、げっ歯類の腎胞懸濁液が単離直後にステップ勾配分画に供される場合は、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）に濃縮された分画は、１．０２５〜１．０３５ｇ／ｍＬの密度で分離する。対照的に、密度勾配分離が生体外培養後に行われた場合、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）に濃縮された分画は、１．０７３〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度で分離した。重要なのは、低酸素培養環境に（約１時間から約２４時間の期間の間）曝露することにより、「Ｂ２」および「Ｂ４」両方の分画への培養後の細胞分布が促進されたということである（低酸素とは、採取およびステップ勾配手順の前の○<２１％（大気中の）酸素レベルとして定義される（バンド分布に与える低酸素効果についてのさらなる詳細は実施例９に提供される）。
３倍の容積のＫＳＦＭで希釈することによって各バンドを洗浄し、十分に混合し、５分間３００×ｇで遠心分離した。２ｍＬのＫＳＦＭにペレットを再懸濁し、トリパンブル−色素排除法およびヘマサイトメ−タを用いて生細胞を数えた。ＲＮＡ試料のために１００万個の細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、液体窒素中で瞬間冷凍した。Ｂ２およびＢ４からの細胞を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおける２段階の５／６腎摘出手技によって生成した、尿毒症および貧血のメスラットへの移植試験に使用した。定量的リアルタイムＰＣＲによって、エリスロポエチンおよびｖＥＧＦの酸素制御による発現、糸球体マ−カ−（ネフリン、ポドシン）の発現、ならびに血管マ−カ−（ＰＥＣＡＭ）の発現を含むＢ４の特性を確認した。Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、およびアクアポリン−２の発現によって、「Ｂ２」分画の表現型を確認した。図４９ａおよび４９ｂを参照のこと。
このように、ステップ勾配ストラテジ−の使用は、ＥＰＯを産生する細胞の珍しい集団（Ｂ４）の濃縮を可能にするだけではなく、機能的な尿細管細胞（Ｂ２）の比較的濃縮された分画を生成する手段も可能にする（図５０および５１を参照のこと）。ステップ勾配ストラテジ−はまた、ＥＰＯを産生する細胞および尿細管細胞が、赤血球、細胞の残骸、ならびに、大細胞凝集体および特定の型の免疫細胞等の、他の潜在的に望ましくない細胞型から分離されることを可能にする。
ステップ勾配手順は、細胞成分の良好な分離を提供するために用いられる特定の密度に関する微調整を必要とする可能性がある。勾配を微調整するための好ましいアプロ−チは、１｝勾配底部の高密度（例えば、１６〜２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から勾配上部の比較的低密度（例えば、５〜１０％）までの連続的な密度勾配を形成することを含む。連続的な勾配は、標準的な方法（Ａｘｉｓ Ｓｈｉｅｌｄ）に従って、任意の標準的な密度勾配溶液（フィコ−ル、パ−コ−ル、スクロ−ス、イオジキサノ−ル）を用いて調製することができる。対象とする細胞を連続勾配上に充填し、８００×Ｇで２０分間、間断なく遠心分離する。類似するサイズおよび粒度の細胞は、勾配中に一緒に分離する傾向があるため、勾配中の相対的な位置を測定することができ、その位置にある溶液の比重も測定される。したがって、その結果として、特定の条件下で密度勾配を横切る能力に基づいて、特定の細胞集団の単離に焦点を当てた規定のステップ勾配を抽出することができる。かかる最適化は、正常組織ではなく非正常組織から細胞を単離する場合、または異なる種から細胞を単離する場合に用いられる必要があるかもしれない。例えば、ラットにおいて同定された特定のＢ２およびＢ４亜集団が、他の種から確実に分離可能であるように、イヌおよびヒト両方の腎細胞の培養物に対して最適化を行った。げっ歯類のＢ２およびＢ４の亜集団の単離に最適な勾配は、７％、１１％、１３％、および１６％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐから構成される。イヌのＢ２およびＢ４の亜集団の単離に最適な勾配は、７％、１０％、１１％、および１６％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐから構成される。ヒトのＢ２およびＢ４の亜集団の単離に最適な勾配は、７％、９％、１１％、１６％（ｗ／ｖ）から構成される。このように、培養したげっ歯類、イヌ、およびヒトの腎細胞からＢ２およびＢ４を局在化するための密度範囲を表８に提供する。
実施例９−勾配前の低酸素培養はバンド分布、組成、および遺伝子発現に影響を与える
酸素条件の原型Ｂ２およびＢ４の分布および組成に与える影響を判定するために、異なる種に由来する新腎細胞調製物を、勾配ステップの前に異なる酸素条件に曝した。
上述のように、ラット細胞の単離および培養開始の標準的手順を用いて、げっ歯類の新腎臓強化（ＮＫＡ）細胞調製物（ＲＫ０６９）を確立した。全てのフラスコを２〜３日間２１％（大気中の）酸素条件で培養した。培地を交換し、次いで、フラスコの半分を２％酸素に設定された酸素制御インキュベ−タに移し、残りのフラスコを２１％酸素条件でさらに２４時間維持した。上述の標準的な酵素的採取手順を用いて、各セットの条件から細胞を採取した。標準的な手順に従ってステップ勾配を調製し、「正常酸素圧」（酸素２１％）および「低酸素」（酸素２％）の培養物を別個に採取し、同一のステップ勾配に隣り合わせて適用した（Ｆｉｇｕｒｅ ７１）。両方の条件で４つのバンドと１つのペレットを生成したが、勾配全体にわたる細胞分布は、２１％および２％酸素培養バッチにおいて異なっていた（表１）。具体的には、低酸素によりＢ２の収率が増加し、Ｂ３では同時に減少が見られた。さらに、低酸素培養細胞から生成されて得られた勾配において、Ｂ４特異的遺伝子（エリスロポエチン等）の発現が促進された（図７３）。
上述のように、イヌ細胞単離および培養の標準的手順（げっ歯類の単離および培養手順に類似）を用いてイヌＮＫＡ細胞調製物（ＤＫ００８）を確立した。全てのフラスコを４日間２１％（大気中の）酸素条件で培養し、次いで、フラスコのサブセットを低酸素（２％）に２４時間移し、フラスコのサブセットを２１％で維持した。続いて、各セットのフラスコを採取し、同一のステップ勾配に供した（図７２）。ラットの結果と同様に（実施例１）、低酸素で培養したイヌ細胞は、大気中の酸素で培養したイヌ細胞とは異なり、勾配の全体にわたって分布した（表９）。この場合も同様に、勾配前の低酸素曝露によりＢ２の収率が増加し、Ｂ３では同時に分布の減少が見られた。
表９
上記デ−タは、勾配前の低酸素への曝露が、Ｂ２の組成および特定の特殊な細胞（エリスロポエチンを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞）のＢ４内への分布を促進したことを示している。このように、低酸素培養、それに続く上述のような密度−勾配分離は、異なる種にわたって「Ｂ２」および「Ｂ４」の細胞集団を生成するために効果的な方法である。
実施例１０−腎不全および貧血ラットモデルへの新腎臓原型の移植
天然組織からのＥＰＯを産生する細胞の単離および繁殖は、マウス腎細胞の初代培養がＥｐｏ ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現することが明らかになったときに、２００８年に最初に記載された（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ， Ｔ， ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ， ２６： ２９５−３００， ２００８）。その後、同様の細胞単離および培養方法がラット、ブタ、およびヒトの腎臓組織に適用され、検査した全ての種に由来する培養物は、Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂらによって記載されたＥｐｏを発現する細胞の小さい亜集団を含むが、主に尿細管細胞を含む、ならびに糸球体細胞、集合管細胞、および血管細胞の集団を含む、種々の細胞型を含むことが分かった。予備実験は、不均一な細胞培養物を尿毒症／貧血ラットにインビボで移植することにより、腎臓ろ過が安定し、赤血球恒常性が回復され、全体的な生存率が向上されたことを示した。これらのデ−タを総合すると、生理活性を示す細胞成分（複数可）が不均一な初代腎臓培養物内に存在し、有意な治療効果を送達することができることを示唆している。
本試験の目的は、インビトロでの特殊な機能特性およびインビボでの翻訳的証拠の両方に基づいて、不均一な腎細胞培養物に含有される生理活性を示す細胞成分を同定することであった。尿細管に濃縮した亜分画（Ｂ２）と、酸素制御したＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含有する亜分画（Ｂ４）の両方が、ろ過、赤血球生成、および生体レベルの機能を評価する様々な臨床パラメ−タにわたって、不均一な混合物（ＵＮＦＸ）よりも効果的かつ耐久性があることが分かった。各亜分画の特定のインビトロ特性およびインビボ性能を本明細書に示す。
新腎細胞の不均一な集団の特定の成分の特殊な効果を判定するために、Ｂ４（ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞に対して濃縮された）ならびにＢ２（尿細管細胞に対して濃縮され、ＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞が除去されている）の分画を生成し、腎不全および貧血のラットモデルに移植した。試験計画を、下の表１０に示す。
組織の調達と初代細胞培養
Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｌａｂｓより購入したドナ−Ｌｅｗｉｓラットのオスから、初代腎細胞培養を確立した。Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中、４°Ｃで検体を輸送し、採取してから２４時間以内に受領した。以前に公開された方法に従って初代腎細胞を単離し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ，Ｔ， ｅｔ ａｌ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ， ２６：２９５−３００， ２００８）、大気中の酸素条件下（酸素２１％）、３７℃の加湿した５％ＣＯ２中で、５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇのＥＧＦ、２５ｍｇのＢＰＥ、１Ｘ ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地補充物）、抗菌剤／抗真菌剤（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）を含有する高グルコ−スＤＭＥＭの５０：５０混合物中、１ｃｍ２あたり３０，０００個の細胞濃度で、組織培養処理済ポリスチレンフラスコまたは皿上で培養した。分析のために細胞を採取する前に、低酸素への曝露を伴う実験のために、培養物を３７°Ｃの低酸素（２％）条件に２４時間移した。採取または連続継代のために、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで培養細胞を剥離した。遺伝子発現解析のために採取した試料を液体窒素中で瞬間冷凍し、ＲＮＡ単離の前に−８０°Ｃで保存した。尿細管、血管、集合管、糸球体、および酸素制御したＥＰＯを産生する細胞を含む特定の腎細胞型に対して濃縮された亜分画を生成するために、標準的な密度勾配技術を用いて培養後の細胞を分画した（１４、２８、３６）。簡潔に言うと、イオジキサノ−ル（ＯｐｔｉｐｒｅｐＴＭ）を使用して、滅菌等張性緩衝液中７〜１６％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、複数ステップの勾配を調製した。低酸素に曝露した細胞を、ステップ勾配の上に載せて層を形成し、８００×ｇで２０分間２５°Ｃで間断なく遠心分離した。細胞分画（遠心分離後の勾配においてバンドとして明白であった）上（Ｂ１）から下（Ｂ４）まで順番に回収した。トリパンブル−色素排除法を用いて生存率を評価し、ヘマサイトメ−タを用いて手で数を数えた。
被験物質：腎臓に送達した細胞の原型を以下に列挙する。亜集団Ｂ２およびＢ４の用量は、上記実施例７において試験した細胞の不均一な混合物に対する相対的な定量的分布に基づいて選択した。
ＵＮＦＸは、解離および腎組織のインビトロ培養によって生成された腎細胞の未分画、不均一な混合物を含む。単離および培養条件は、主に尿細管細胞を含むが、集合管、糸球体、内分泌、血管、および他の細胞型のより小さな亜集団も含有する細胞株の確立に有利に働く。
Ｂ２は、比較的豊富なＵＮＦＸの亜集団であり、インビトロでのロバストなアルブミン取り込みが可能な近位尿細管細胞を含有し、特定の遠位尿細管および集合管上皮細胞、ならびにごく微量の他の細胞型の量を含有する。
Ｂ４は、微量のＵＮＦＸの亜集団であり、低酸素応答性のＥＰＯを発現する細胞、また糸球体足細胞、特殊な血管細胞、ならびに、Ｂ２またはＵＮＦＸと比較して、低い前方散乱および側方散乱（サイズおよび粒度）であることを特徴とする細胞集団に対して濃縮される。
免疫細胞化学
Ｂ２およびＢ４からの細胞を勾配後に継代培養し、免疫細胞化学を用いて、遠位および近位尿細管マ−カ−の発現によって特性決定した。９６ウェル組織培養処理済プレ−ト（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ３５３２１９）に１０，０００細胞／ウェルの密度で細胞を播種し、８５％コンフルエンスになるまで培養し、次いで、氷冷したアセトン／メタノ−ルの１：１混合物中、室温で１０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で２回洗浄し、０．５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で１０分間ブロックした。ブロックした細胞を、Ｎ−カドヘリンＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６１０９２１）およびＥ−カドヘリンＩｇＧ２ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６１０１８２）に対する一次マウスモノクロ−ナル抗体で同時に共標識した（両方とも３μｇ／ｍＬ／４°Ｃ／一晩）。アイソタイプ一致対照（それぞれ、マウス骨髄腫ＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ ０２−６１００）およびマウス骨髄腫ＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ ０２−６２００））も、３μｇ／ｍＬ／４°Ｃ／一晩で適用した。一次標識された細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｌｅｘａ４８８（分子プロ−ブＡ２１１２１）およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ Ａｌｅｘａ６４７（分子プロ−ブＡ２１２４１）で、両方とも１μｇ／ｍＬの濃度で標識し、３０分間室温で光から保護した。細胞をＰＢＳ中で３回の洗浄に供し、ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ ８５５ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して画像化した。
遺伝子発現
ＡＢＩのカタログに掲載されたＴａｑｍａｎプロ−ブおよびプライマ−セット、ならびにＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａ）を使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）によって、標的遺伝子の発現レベルを調べた。豊富に発現される遺伝子に対する内在性対照として１８ｓ ｒＲＮＡを用い、少ない量で存在する転写物を正規化するためにペプチジルプロリルイソメラ−ゼＢ（ＰＰＩＢ）を使用した。標的転写物の相対量を比較するために、全腎臓組織、およびＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入したＯｒｉｇｅｎｅ腎臓ｃＤＮＡを含む複数の標準物質を使用した。以下のＴａｑｍａｎプライマ−およびプロ−ブのセットをＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ）から購入した。エリスロポエチン、Ｒｎ０１４８１３７６＿ｍ１；低酸素誘導因子２アルファ（ＨＩＦ２α）Ｒｎ００５７６５１５＿ｍ１；Ｋｄｒ、Ｒｎ００５６４９８６＿ｍ１；Ｅ−カドヘリン、Ｒｎ００５８０１０９＿ｍ１；キュビリン、Ｒｎ００５８４２００＿ｍ１；ＣＹＰ２Ｒ１、Ｒｎ０１４２３１５０＿ｍ１；ネフリン、Ｒｎ００５７５２３５＿ｍ１；ポドシン、Ｒｎ００７０９８３４＿ｍ１；Ｃｕｓｔｏｍ ＳＲＹ：順方向ＡＡＧＣＧＣＣＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣ：逆方向プライマ−ＡＧＣＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＣＴＣＴＣＴ：プロ−ブＴＴＴＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＣＣＧＴＧ−ＭＧＢ。
外科手術およびインビボ分析
二段階５／６腎摘除術（５／６Ｎｘ）に供したメスのＬｅｗｉｓラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （ＣＲＬ）から購入し、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （ＲＴＩ）に輸送した、そこでラットを収容し、監視し、種々の処置手順に供した（処置群および詳細については表１０を参照されたい）。外科手術後に、尿毒症を、毎週の血清学的分析を通して、処置前に確認した。動物の福祉は、ＣＲＬおよびＲＴＩのそれぞれのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ （ＩＡＣＵＣ）によってそれぞれの施設で扱われる間、管理された。イソフルランチャンバ（４〜５％）における麻酔前にラットを鎮静し、ノ−ズコ−ンを通して投与されるイソフルラン吸入剤（３％）下の外科手術の間中、維持した。細胞を、右背側切開を介して、腎臓残遺物に直接送達した。細胞（５ｘ１０６ ＵＮＦＸまたはＢ２；１ｘ１０６ Ｂ４）を、２３Ｇ ｎｅｅｄｌｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）と適合した無菌の１ｃｃのシリンジを通して、無菌食塩水の１００μＬの容積において実質内に移植し、移植後最大６ヶ月にわたって追跡した。細胞送達後、１ｍｌの温かい無菌食塩水を、水和のため腹腔内空洞に添加し、その筋層を４．０Ｖｉｃｒｙｌ縫合を使用して閉じ、その皮膚を創傷クリップを使用して閉じた（双方の物品もＥｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．， Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＮＪ）。酸素を手術後（吸入／ノ−ズコ−ンを通して）投与し、その動物が覚醒し、意識がある状態になるまで監視した。ラットは、０．５ｃｃの（０．３ｍｇ／ｍｌ）のブプレノルフィン（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）を腹腔内に、手術後即時に受取した。次の日、ラットに、疼痛管理のため、０．６ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のトラマド−ルを投与した（経口経管栄養を通して）。組換え型ヒトＥｐｏ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を受取するラットに、１００ＩＵ／ｋｇまたは５００ＩＵ／ｋｇのいずれかを腹腔内注入を介して、週２回投薬した。研究の間、血清学的および血液学的分析のために毎週尾静脈または眼窩出血を通して、採血した。ベ−スライン（処置前）、研究中間点（１２〜１４週間）、および倍検時に、完全な血清および血液学パネルを行うと同時に、ＢＵＮ、ｓＣＲＥＡＴ、ＨＣＴ、およびＲＢＣ＃を毎週追跡した。剖検時に、腎臓（複数可）、心臓、肝臓、および脾臓を秤量し、凍結した、およびホルマリン固定／パラフィン包埋切片に利用した。また、固定化前にその髄を暴露するように注意して、病理組織学的分析のために大腿および胸骨を収集した。体重を毎週収集した。
以下のラット番号で群１ＲＫ６８ラットにおいて、手術／採血を行った：６６、３６、５９、４６、６３、３４、３２、７９、５４、４３、６７、５２、７６、５１、７８、４４、６２、４８、６９、７１、７４、３３、７７、８１、８２、８３、８６および８７。以下のラット番号で群２ＲＫ６９ラットにおいて、手術／採血を行った：６８、３８、７０＊、３７、３１、６５、４５、４１、６４、４２、５０、３５、５８、８０、５６、５７、７２、７５、４９、６１、３９、５５、８４、８５、８８、８９および９０。以下のラット番号においてＲＫ７０手術を行った：７０および６５。
腎臓および骨の組織病理学的評価。
剖検に続き、その残腎臓を秤量し、長軸方向に二分した。一半分を凍結切片の調製ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離に利用し、他の半分を１０％緩衝したホルマリンに２４時間配置した、次いで、病理組織研究室に輸送するため（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、７０％のエタノ−ルに伝達した。組織を脱水し、パラフィンに包埋し、５ミクロン切片にカットし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、マッソントリクロ−ム染色、および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した、全ては、標準的研究室手順に従っている。その左大腿を収集し、上述の手順を使用して組織学的検査のために提出し、Ｈ＆Ｅで染色した。糸球体障害は、糸球体間質マトリックスの増加から糸球体係蹄の癒着および／またはボ−マン嚢の肥厚を伴う分節糸球体間質硬化および／またはヒアリン症によって、特徴付けされた。尿細管傷害は、尿細管萎縮症、拡張、リンパ球の蓄積、腔内タンパク質円柱の蓄積、尿細管壊死、および間質性線維症によって特徴付けされた。Ｈ＆Ｅ染色を使用して、大腿切片の微視的評価を行った。切片を、骨髄細胞充実性および骨髄と赤血球の比率におけるいずれの増加／減少に対して、２００ｘおよび４００ｘの元の拡大率で検査した。
測定：動物を毎週秤量した。隔週の血清学的および血液学的分析は、移植前後の腎機能（ＢＵＮ＆ＣＲＥＡＴ）および赤血球生成（ＨＣＴ＆ＲＢＣ）の生存中の評価を提供した。完全な血清および血液学パネルを、ベ−スライン、６週目、１２週目、および剖検前に行った。剖検時、臓器（腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺）を秤量し、組織学的検査のために収集した。大腿骨髄を組織学的検査および骨髄スメア分析のために収集した。
表１０．研究計画
結果
候補生理活性細胞集団（Ｂ２＆Ｂ４）の産生および区画の特徴付け
インビボでのパイロット研究は、培養された腎臓細胞の不均一な集団（ＵＮＦＸ）内に含有される、腎臓機能を増強する能力がある生理活性細胞を明白に示唆した（実施例７を参照されたい）。先の研究においてＵＮＦＸ集団の送達によって影響される臨床パラメ−タに基づき、腎臓恒常性に影響させるための理論的候補細胞集団は、機能的な尿細管細胞（クレアチニン排出およびタンパク質保持の改善に基づく）、糸球体細胞（タンパク質保持の改善に基づく）、および皮髄境界部の非常に特殊化した酸素応答性ＥＰＯを産生する細胞（赤血球生成の比率に基づく）である（Ｍａｘｗｅｌｌ， ＰＨ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ５２： ７１５−２４， １９９７， Ｏｂａｒａ， Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ， １１１： ５２２３−３２， ２００８）。尿細管、糸球体、およびＥＰＯを産生する細胞の存在を、ラットならびに他の種から確立し、増殖した腎臓培養物中に確認した。密度勾配方法（Ｑｉ， Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ （Ｃａｒｌｔｏｎ）， １２： １５５−９， ２００７， Ｇｅｓｅｋ， ＦＡ， ｅｔ ａｌ．． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２５３： Ｆ３５８−６５， １９８７， ＭｃＬａｒｅｎ， Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ， １４： ９１６−２２， １９９５）は、ＵＮＦＸ不均一な細胞集団の樹立された培養物からの、異なる細胞亜分画（Ｂ１〜Ｂ４）の再現可能な産生を可能とするように順応、かつ最適化した。その亜分画を相互から区別、かつ機能的、分子的、および表現型特徴に基づくＵＮＦＸから区別し、２つの亜分画（Ｂ２＆Ｂ４）を、さらなるインビトロおよびインビボ研究のために、生理活性候補として選択した。
ＵＮＦＸ混合物の際立った（約２０％〜約５０％）成分を表す亜分画Ｂ２を、尿細管細胞（確立され、拡張した培養物中の主なＵＮＦＸの細胞型）に対して相対濃縮に基づき、選択した。標的遺伝子発現解析を行い、亜分画Ｂ２およびＢ４との腎臓の主要な細胞区画の相対寄与を評価した。亜分画Ｂ２は、血管細胞（ｋｄｒ＋）、糸球体細胞（ネフリン＋、ポドシン＋）、およびＥＰＯを産生する細胞（図７４ｄ〜ｈ）が相対的に除去されていた。臨床的に関連する尿細管細胞機能と関係する２つの近位尿細管マ−カ−が、Ｂ２において大幅に濃縮されていた：ビタミンＤヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２１Ｒ（４．３ｘ濃縮）、およびキュビリン（３．０ｘ濃縮）。遠位尿細管細胞（Ｅカドヘリン＋）および集合管細胞（Ｄ．ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ＋、アクアポリン−２＋）のその大部分（＞７５％）は、亜分画Ｂ１に局在したが、それは、これらの研究において、アルブミン輸送キュビリン＋細胞の相対的不在および他の所望されない特徴の存在のため、さらなる評価のために選択しなかった。しかしながら、遠位尿細管マ−カ−の発現、Ｅカドヘリンは、Ｂ４と比べて、Ｂ２（１．６ｘ）において相対的に濃縮されていた（図７４ｃ）。
定量識別的遺伝子発現デ−タを、表形態で示す（図７４ｉ）。Ｂ２およびＢ４の近位および遠位細胞成分の相対分布を、Ｎ−カドヘリン（近位）およびＥ−カドヘリン（遠位）に対する免疫蛍光染色を通して、タンパク質レベルで質的に確認した（図７４ｊ、ｋ）。近位尿細管細胞と関係する鍵となる機能は、糸球体濾液からのアルブミンの受容体介在性再吸収であり、したがって、タンパク尿を低下し、血清タンパク質恒常性に寄与する（７）。キュビリン／メガリン媒介アルブミン取り込みを捕らえるための機能的なアッセイを（４５）し、Ｂ２亜分画のキュビリン発現する細胞中で頑健なタンパク質輸送活性を確認するために適合させた（図７５ａ）。対照的に、キュビリンタンパク質発現およびアルブミン取り込みはＢ４亜分画においてあまり頻繁に検出されず（図７５ａ）、遺伝子発現レベルで観察したＢ２およびＢ４の細胞組成物差異を確認した。尿細管細胞によるアルブミンの受容体介在性輸送は、能動輸送の体温下降阻害によって有意に低下し（デ−タは示されていない）、取り込みの特異性を、キュビリン／メガリン媒介エンドサイト−シスを競合的阻害剤、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）で遮断することによって（３０）、確認した（図７５ａ）。
そのＢ４亜分画は、未分画（ＵＮＦＸ）細胞集団（○<１０％）の微量な成分を成し、幾つかの特殊な細胞型から成り、その全ては、インビトロで特徴に基づいて明白な理論上の治療上の的価値を有した。そのＢ４亜分画を、低酸素応答性ＥＰＯを産生する細胞、糸球体有足細胞、および血管起源の細胞の相対濃縮に基づき、選択した（図７４〜７６）。ＵＮＦＸ集団のフロ−サイトメトリ−解析は、Ｅｐｏ発現細胞がＵＮＦＸ集団中の尿細管細胞とは異なったことを以前にに示しており、低粒度（低側方散乱）を有する小細胞（低前方散乱）としてさらに特徴付けた（３４）。そのＢ４亜分画を、低酸素刺激に応答して、Ｅｐｏ発現を有意に上方制御した小さい、低粒度細胞（図７４ｇ、ｈ、ｉ、図７５ｂ）に対して、約１５ｘ濃縮した。また、そのＢ４亜分画を、糸球体有足細胞（ネフリンおよびポドシン）に対して約２００ｘ濃縮し、血管細胞（Ｋｄｒ）に対して約１５ｘ約２００ｘ濃縮した（図７４ｉ）。
進行性腎不全を患うラットのＢ２およびＢ４の比較インビボ機能
生存および体重増加。
ＵＮＦＸ細胞の腎臓内移植を含むパイロット研究は、ＵＮＦＸ集団は、同所性移植後３ヶ月間、ろ過／尿産生の安定化ができ、赤血球恒常性の回復ができる生理活細胞を含有したことを示唆した。Ｂ２（アルブミン取り込み）およびＢ４（酸素制御Ｅｐｏ産生）の細胞組成物および機能的な特質により、その双方が、ＵＮＦＸ集団の生理活性成分として、さらなる調査のための論理にかなった亜分画の候補となり、それらは、それぞれ、改善されたろ過および増強された赤血球生成の観察されたインビボ効果の可能な原因である。メス尿毒症／貧血性ラットを、二段階５／６腎摘除術を介して産生し、進行性疾病状態が確立した後（傷害後５〜６週間で、腎摘出したラットの血清クレアチニンレベルが既に健常対照の２５０％超（０．７６±０．０２対０．３±０．００）となり、そのヘマトクリットが８％低減した（４１．８±０．６７対４５．６±０．７０）ていた）、同系オス細胞を同所性送達した。先の研究のようにＵＮＦＸ細胞を送達し、そのＢ２およびＢ４亜分画を、ＵＮＦＸ集団へのそれらの相対的な寄与量に近い用量で送達した：５ｘ１０６／ラットでＢ２および１ｘ１０６／ラットでＢ４。追加の対照は送達媒体のみ（ＰＢＳ）、および１００ＩＵ／ｋｇおよび５００ＩＵ／ｋｇでの組換え型ヒトＥｐｏタンパク質（ｒＥｐｏ）を用いた週２回の投薬を含んだ。全ての処置されていない健常対照および擬似Ｎｘラットは、研究の継続時間を生存した（腎摘除術後３０週間）。先の研究により予測されたように、無処置Ｎｘラットの１００％が、腎摘除術手順の２２週間以内に死んだ（図７６ａ）。処置群間では、Ｂ２処置されたラットの１００％は処置後６ヶ月生存した、Ｂ４処置されたおよびＵＮＦＸ処置された群の６ヶ月の生存は、それぞれ２０％および０％であった。１００ＩＵ／ｋｇ ｒＥｐｏで処置されたラットは、処置後６ヶ月で２５％の生存率を有した、Ｂ４（ＥＰＯを産生する細胞分画）を用いた処置と同様であった。対照的に、５００ＩＵ／ｋｇ ｒＥＰＯを用いた処置は加速した死をもたらした；処置されたラットの１００％は、投与計画開始の１４週間以内に死亡し、大抵が死亡時に重篤な貧血を患っていた。具体的に、低用量（１００ＩＵ／ｋｇ）ｒＥＰＯが１ヶ月にわたって高い正常範囲内にＨＣＴおよびＲＢＣを維持し、後に、３ヶ月までにラットの７５％に貧血をもたらしたが、高用量（５００ＩＵ／ｋｇ）ｒＥＰＯは、１ヶ月にわたってＨＣＴおよびＲＢＣを健常対照の１２５％超レベルにまで上昇し、後に深刻な貧血および死をもたらした。（図５３〜５５を参照されたい）。また、組換え型ＥＰＯは、反復投与の４週間を越えて、６／８ラットの赤血球生成を補助することに失敗したことに留意されるべきである。ｒＥｐｏ処置後の乏しい生存は、骨髄枯渇およびｒＥｐｏに対する抗体の発達の組み合わせのためであり得、ヒトＥｐｏに対する先で説明された免疫と一致した（Ｃａｍｐｅａｕ， ＰＭ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， １７： ３６９−７２， ２００９）。
図５２で示すように、ＥＰＯ濃縮した（Ｂ４）細胞は、２つの異なる用量（高および低、それぞれ１Ｍおよび０．１Ｍ）で行い、１６週目で組換え型ＥＰＯア−ムを越えた。具体的に、また下の表１１にも示されるように、そのヘマトクリットは、ＥＰＯ濃縮した細胞によって、９５％の健常レベルまで回復した。さらに、組換え型ＥＰＯタンパク質に比べて、ＥＰＯ濃縮した細胞が送達された場合、その結果において非常に小さな可変性が存在したことを見出された。
また、処置後１６週間で測定された体重増加も、ＥＰＯ濃縮処置群において、非ＥＰＯ濃縮処置群よりも改善した（図５８を参照されたい）。健常対照群および擬似Ｎｘラットは研究全体にわたり、平均で３０％の体重増加を示したが、無処置Ｎｘラットは、初期の体重の平均５％を死亡時に失った（図７６ｂ）。対照的に、Ｂ２処置されたラットは、処置後６ヶ月間で、平均で１４．３％の体重増加を示し（ｐ○<０．０００１）（図７６ｂ）、給餌および一般的福祉における有意な生物レベルでの改善を示唆した。また、Ｂ４および媒体は、Ｎｘ動物よりも有意に高い体重増加を示した（Ｂ４：ｐ＝０．０２３９、媒体：ｐ＝０．０１２５）。慢性高血圧はＣＫＤの原因および影響の双方であり得、病因にかわらず、遷延全身性高血圧は、心臓に過剰負荷をかけ、大幅な左心室肥大（ＬＶＨ）による相対的心肥大をもたらす（Ｆｏｌｅｙ， ＲＮ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ４７： １８６−９２， １９９５）。高血圧およびＬＶＨは、腎摘除術のげっ歯類モデルにおいて確認されている（Ａｍａｎｎ， Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， １３： １９５８−６６， １９９８）。本研究において、心臓の重量および体重デ−タを剖検で収集し、心肥大／ＬＶＨがＬｅｗｉｓラットにおける二段階５／６腎摘除術誘発腎不全の特徴であるかを決定し、いずれかの処置（複数可）がこの肥大性応答を低減、あるいは除去するかを決定した。Ｂ２で処置されたラットが、処置後６ヶ月の相対心臓の重量が２５％のみの増加を示したのに対して、正常な動物と比べて、心臓の重量は、Ｎｘラットにおいて５０％増加した（Ｐ○<０．０００１）（図７６ｃ）。Ｂ２の処置効果の様に目立ちはしないが、Ｂ４および媒体処置の双方は、無処置Ｎｘ対照よりも有意に少ない心臓重量をもたらした。まとめると、これらのデ−タは、腎臓制御心臓血管機能の処置依存性増強を支持する。
尿毒症および貧血の進行。
上述のように、二段階５／６腎摘除術を受けたラットは、種々の処置が送達された時、腎摘除術後５〜６週間で尿毒症および貧血性であった。ベ−スライン（移植前）および研究の間毎週、尿毒症をｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮを通して評価し、赤血球生成をＨＣＴおよびＲＢＣ＃を通して評価した。
十分な数のラットが各群より生存しており、頑健な比較が可能であった場合、群間の能力の統計的評価を、処置後１０〜２０週間からの全てのデ−タを用いて行った。一元配置分散分析を、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ （Ｃａｒｙ， ＮＣ）からのＪＭＰ ｖｅｒｓｉｏｎ ７．０を使用して、１０〜２０週目の試料の血清化学結果において行った。この時間範囲において、有意な差異を処置群間で観察した：上部パネル、ＢＵＮ（ｐ○<０．０００１）；（図７７ｄ）、クレアチニン（ｐ○<０．０００１）（図７７ｅ）。ＢＵＮおよびＣＲＥＡＴレベルの１０〜２０週間の測定の分散分析は、Ｂ２およびＢ４細胞で処置したＮｘラットが、Ｎｘ単体およびＮｘ＋Ｕｎｆｘ細胞と比べて、腎臓ろ過の安定化ならびに低ＢＵＮおよびＣＲＥＡＴレベルを示し、その処置の一般的腎保護効果を示唆していることを示した。また、Ｂ２およびＢ４原型で処置されたＮｘラットは、血液学的パラメ−タにおける改善を示した。この時間範囲において、有意な差異を処置群間で観察した：ＲＢＣ（ｐ○<０．００２９）（図７７ａ）、ＨＣＴ（ｐ＝０．０００５）（図７７ｂ）。そのデ−タは、Ｂ２処置されたラットが、ＮｘおよびＵＮＦＸと比べて、高い平均ＨＣＴおよびＲＢＣ数（図７７ａ〜ｃ）および低い平均ＣＲＥＡＴおよびＢＵＮレベル（図７７ｄ〜ｆ）を有したことを明白に示し、Ｂ２がＵＮＦＸの強力な生理活性成分であり、Ｂ２亜分画（ＵＮＦＸの他の成分なし）の送達が、処置反応の規模および耐久性の双方を拡張したことを示唆している。この生物観察は、他の群において観察されなかった、Ｂ２処置された動物における未変性様の糸球体、尿細管、およびネフロン構造の組織学的証拠によって支持された。Ｂ４はろ過機能に有意に影響を与えなかったが、ＲＢＣ＃およびＨＣＴの有意増強によって例証されるように、赤血球生成をＢ４処置によって刺激した（図７７ａ〜ｃ）。組換え型Ｅｐｏの定期投薬は、初期の赤血球増加症と共に、赤血球生成の短期刺激をもたらし、後に、その薬物を受取したラットの大部分（７／８）において、重篤な貧血、最終的に死をもたらした。この研究における組換え型ＥＰＯのその乏しい全体の能力は、免疫適格性ラット中のヒトＥＰＯタンパク質に対する抗体の発達のためであり得る。
図５７で示されるように、処置後１２週間での水泳耐久性試験に供した際、腎摘出された（ＮＸ）ラットは、健常ラットよりも平均で短い時間泳いだ。濃縮していないネオ腎臓細胞で処置されたラットは、ＮＸラットよりも平均で長い時間泳いだが、多量の可変性を伴った。一方、高用量Ｂ４細胞で処置されたラットは、対照群と同時間近く泳ぎ、処置群間で最も低い可変性を伴った。全ての処置された群の生存は、腎摘出された、無処置ラットよりも優れている。
表１１．処置後１２〜１４週間での健常対照群に対する％としての臨床値。
処置されたラット対無処置尿毒症ラットにおいて増強された尿細管関連機能
タンパク質処理および脂質代謝。
総合臨床化学分析が研究中間点（処置後１２〜１４週間）で完了し、大部分のラットが未だ生存しており、試料収集に利用可能である時、処置群間で追加の比較を行った（図７８ａ）。図７８で示されるように、Ｂ２処置は、進行性腎不全の５／６Ｎｘモデルにおいて、腎臓によってタンパク質処理を増強し、脂質異常症を寛解する。擬似ＮＸ、ＮＸ、ＮＸ＋ＶＥＨ、ＮＸ＋ＵＮＦＸ、ＮＸ＋Ｂ２、およびＮＸ＋Ｂ４を、健常対照に対して正規化し、１２〜１４週間で比較した（上の表１１を参照されたい）。血清アルブミンおよびアルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）比は、健常対照と比べて無処置Ｎｘラットにおいて、それぞれ３０％および３４％低下した、有意タンパク質損失がＣＫＤの５／６Ｎｘモデルの特徴であることを示している（図７８）。Ｂ２での処置は、血清アルブミンレベルを有意に増加した（ｐ○<０．０５）、尿細管上皮による、糸球体ろ過機構の改善した完全性および／またはアルブミンの増強した再吸収を示唆している（図７８ａ、ｂ）。この観察を、Ｂ２処置された動物対Ｎｘ動物の血清Ａ／Ｇ比における有意増加によって（ｐ○<０．００１）、さらに確認した（図７８ａ、ｂ）。興味深いことに、Ｂ２処置と関連するこれらのインビボ観察は、Ｂ２の鍵となるインビトロ特徴（すなわち、タンパク質輸送受容体（キュビリン／メガリン）および頑健な受容体介在性アルブミン取り込み（図７５ａで説明された）の強い発現）と連携している。
高脂血症は、ヒトＣＫＤ（２３）およびＣＫＤのラット５／６腎摘除術モデルにおいても十分に裏付けされた特徴である（Ｋａｓｉｓｋｅ， ＢＬ， ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， ６２： ３６７−７４， １９８８）（図７８ａ、ｃ）。中間点臨床化学は、Ｂ２処置は、血清トリグリセリド中のＮｘ誘発上昇を寛解したことを示し、レベルを正常まで戻す（図７８ａ、ｃ）。また、血清コレステロ−ルをＢ２処置されたラットにおいて低下し、Ｎｘ群の健常対照の＞２５０％と比べて、健常対照の１５０％でのレベルを達成する（図７８ａ、ｃ）。血清コレステロ−ルの改善は、Ｂ２処置を用いた腎臓ろ過機能の改善を通して、コレステロ−ルのより大きな除去に間接的に起因し得る。その中間点臨床分析は、Ｂ２が、尿産生（ｓＣＲＥＡＴ、ＢＵＮ、血清アルブミン、Ａ：Ｇ比）、赤血球生成（ＨＣＴ、ＲＢＣ＃）、ミネラルバランス（カルシウム：亜リン酸）、および脂質代謝（トリグリセリド、コレステロ−ル）と関係するものを含む、広範な関連する臨床パラメ−タにわたる腎機能の改善に関して、生理活性であるという観察を支持する。
また、図５９〜６１は、その研究中間点で、細胞の原型＃４（Ｂ２）（尿細管濃縮した細胞）で処置された尿毒症ラットが、経時的に改善した血清クレアチニン、安定化した血清アルブミンおよびリン：無処置尿毒症ラットと比べて正常に近いカルシウム比、を示したことを示す。図６１は、また、細胞の原型＃２（１Ｍ用量のＥＰＯ濃縮した細胞）で処置された尿毒症ラットがリン：正常に近いカルシウム比を示したことを示した。図６２〜６３は、処置されたラット対無処置尿毒症ラットの脂質代謝の改善を示す。図１１は、細胞の原型＃２（Ｂ４ ＨＩＧＨ）および＃４（Ｂ２）で処置された尿毒症ラットが、低い血清コレステロ−ルおよび低い血清トリグリセリドを有したことを示す（図６２〜６３を参照されたい）。図６４および６５は、細胞の原型＃２（Ｂ４ ＨＩＧＨ）および＃４（Ｂ２）で処置された尿毒症ラットにおいて、９５％の正常なラットよりも増加したヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルを示し、赤血球刺激の全身的な証拠を示す。
腎臓腫瘤は腎臓機能と相関する。
腎臓へのＢ２細胞送達の長期的利点は、処置後６ヶ月間の全身性および組織学的分析によって明白であった（図７６〜７９）、細胞が修復および／または再生成を直接的または間接的に提供することができ、機能的な腎臓腫瘤の保存および／または新生をもたらすことを示唆する。ＳＲＹ（Ｙ染色体に局在する遺伝子）に対するプロ−ブを用いたＰＣＲに基づくＤＮＡ分析を用いることにより、収集時（処置後６ヶ月）で、メス腎臓組織中のオスＢ２ドナ−細胞の保持を確認し、この時点でこの方法によって推定された、宿主腎臓へのオス細胞の寄与は比較的低かった（約１％）（図８０を参照されたい）。死後の腎臓重量を、残遺物（Ｎｘ、Ｂ２、Ｂ４、およびＵＮＦＸ）または無傷（健常対照および擬似Ｎｘ）の右腎臓より収集した。無処置Ｎｘ腎臓残遺物は、擬似対照と比べて腎臓質量において平均４３％の低下を有したが、Ｂ２細胞を同所性に受取した腎臓残遺物が偽対照と等しい平均腎臓質量を有した（図７９ａ）。興味深いことに、各群のその平均腎臓質量は、その群の平均血清クレアチニン値に反比例した（図７９ａ）。腎臓重量および血清クレアチニン間の相互関係輸送を、各ラットの２つのパラメ−タ間の有意（Ｒ２＝０．３８）な逆相関を示す、直線回帰分析によって、さらに検証した（図７９ｂ）。これらのデ−タは、腎臓質量および腎臓機能間の直接的関係を説明し、Ｂ４およびＵＮＦＸを上回るＢ２の明らかな治療上の利点を再度強調する。
組織学的評価。
げっ歯類においてその５／６腎摘除術手順は、所定の位置に残腎臓を残し、それは初期に肥大性応答を受け、新しいネフロンを形成するよりは、既存のネフロンの代償性肥大を通して腎臓質量を部分的に回復する（Ｂｒｅｎｎｅｒ， ＢＭ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２４９： Ｆ３２４−３７， １９８５， Ｋａｕｆｍａｎ、ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ６： １０−７， １９７４）。初期の肥大性応答にも関わらず、腎臓腫瘤の損失と関連する腎臓血行動態の変化は、高血圧、尿毒症、貧血、および腎臓組織構造の慢性形態崩壊を最終的にもたらす。標準的組織学的技術および染色（Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、およびマッソントリクロ−ム染色）を用いて、Ｂ２処置されたラットの腎臓、骨髄、および骨内膜表面に具体的焦点をおき、擬似Ｎｘ、ＮｘおよびＢ２処置を比べた（図８１ａ、ｂ、ｃ）。無処置５／６Ｎｘラット腎臓で観察された病理組織学的変化は、中等度から顕著な糸球体尿細管傷害を含み、その傷害は分節から全体的糸球体硬化を伴う多発性からびまん性糸球体肥大から成り、糸球体マトリックスの均一好酸球性物質（タンパク質）との置換および中等度の糸球体間質増殖によって特徴付けされた。Ｎｘ動物と関連する多発性糸球体房癒着および局所性糸球体萎縮症が存在した。さらに、そのＮｘラット腎臓は、多発性炎症と共に軽度から中等度の尿細管間質性線維症を有した。多発性尿細管肥大および過形成が主に近位尿細管において観察され、びまん性尿細管拡張は近位および遠位尿細管の双方に影響を与えた。最も拡張した尿細管は、腔内タンパク質蓄積を示唆するヒアリン円柱を含有する、多くの尿細管と共に、弱毒上皮および肥厚した基底膜を示した。
外科的モデルで観察された全体的形態崩壊に比べて、Ｂ２処置された腎臓の比較微小解剖特徴は、健常対照群腎臓とより形態学的に一致した。具体的に、Ｂ２で処置された腎臓は、比例的により健常な糸球体、尿細管およびネフロン構造、尿細管拡張の減少、尿細管ヒアリン円柱の低下、尿細管間質性線維症および最小の糸球体硬化の減少を有した（図８１ａ）。Ｂ２処置された動物は、実質内で明らかである損傷した腎臓組織の偶然の病巣を有するが、その主な形態は健常対照のそれと一致していた。反対に、Ｂ４処置された腎臓は、Ｎｘ動物よりも、比例的により健常な糸球体およびより少ない糸球体硬化を有するが、拡張および尿細管円柱含む尿細管病変は、無処置のＮｘ対照と同様であった。さらに，Ｂ４処置された腎臓は、無処置Ｎｘラットと比べてわずかに改善するが、健常対照には近づかない、損傷の主な領域によって特徴付けされた。
健常な擬似Ｎｘラットの大腿骨および髄を、有意組織学的変化なしで、正常であるとみなした。２つの組織学的特徴が無処置Ｎｘラットの髄および骨において存在した：１）赤血球の不足および増加した骨髄：赤血球比率（図８１ｂ）を伴う髄の低下した全体の細胞充実性、および２）広く認められる破骨細胞および裂孔の形成を伴う、骨内膜表面の薄切りにより特徴付けられた中等度の骨吸収（図８１ｂ）。Ｎｘ動物において、骨減少症を示唆する皮質および海綿骨の菲薄化が存在した。Ｎｘ群の骨髄と比べて、Ｂ２処置された動物の髄は、より遊離な赤血球、恒常性骨髄：赤血球比率、および骨吸収の組織学的証拠の不在（Ｂ２）を有した。Ｂ２処置への骨髄応答の規模は、処置群間で最も突出しており、健常対照のものに近い骨髄組成物および形態を有した。
Ｂ２処置されたラットにおけるこの現象の明白な欠如と組み合わせたＮｘラットにおける骨侵食の組織学的観察は、血清カルシウムおよびリン酸レベルの追加の評価へと導いた。末期腎臓疾患（３７）の説明された骨異栄養症と一致して、高リン血症および低カルシウム血症をＮｘ動物において観察した（図８１ｃ）。骨内膜表面の病理組織学的観察によって予測されるように、Ｂ２処置された動物は、健常対照と等しいリンおよびカルシウムレベルを有し、これらのミネラルの全身性および恒常性制御を示唆した（図８１ｃ）。まとめると、その組織学的観察は、進行性腎不全のげっ歯類モデルにおいて、Ｂ２が腎臓ろ過機能を増強し、赤血球恒常性を回復する、全身性指標の確証を提供する。
考察
インビトロでの特異的な機能特質と共に、選択された腎臓由来の細胞の正位移植によって開始される再生刺激は、ＣＫＤのげっ歯類モデルにおいてインビボで、死亡率を低下し、機能を増加し、疾病進行を緩徐した。本明細書で示されるそのデ−タは、不均一な腎臓細胞集団の特定の細胞亜分画が、臨床的に関連するより範囲の広い様々な利点を提供し、特定の臨床パラメ−タに関してより効果的であり、未分画の不均一な混合物と比べた時、少なくとも５０％臨床効果の耐久性を拡張する、全身性および組織学的証拠を提供する。これらの研究で比較的に試験されたその２つの細胞亜分画（Ｂ２およびＢ４）を、インビトロでの増殖後、分画によって産生し、ろ過（Ｂ２）および赤血球生成（Ｂ４）に関連する特有の組成上および機能的な特質を保有することを示した。近位および遠位腎臓尿細管細胞（約９０％）、ならびに幾つかの集合管細胞（約１０％）を含んだ亜分画Ｂ２は、アルブミンの頑健な受容体介在性エンドサイト−シスの能力がある、特定化キュビリン＋／メガリン＋近位尿細管細胞に対して濃縮されていた。Ｂ２の細胞組成物および機能的な特質を考えると、この亜分画が、血清クレアチニンおよびＢＵＮの安定化、タンパク質の再吸収、および電解質バランス等の効果を通して、ネフロン全体の機能を増加したことを観察することは、驚くべきことではなかった。Ｂ２の腎臓恒常性効果は、拡張した生存時間、改善された体重増加、正常な血中脂質プロファイル、および骨の異化の低下等の、有意な全生物レベルの利点を伴った。まとめると、本明細書に示されるその生理学的デ−タは、Ｂ２細胞亜分画の移植を通して、ＣＫＤの末端モデルにおける腎機能の広域であり、関連する安定化を反映する。
安定化した腎機能の生理学的証拠を、６ヶ月目で、病理組織学的分析によって支持し、Ｂ２で処置されたラットの残腎臓において、未変性に近い尿細管および糸球体形態を示した。Ｂ２処置による腎臓腫瘤の回復（図７９）は、Ｂ２処置された腎臓対無処置Ｎｘ腎臓において、糸球体硬化、尿細管間質性線維症、および腔内タンパク質沈着物が弱毒化され、その骨髄にいて赤血球生成反応が健常対照と類似した（図８１）、組織学的証拠を伴った。あまり顕著ではないが、Ｂ４処置は、骨髄における糸球体硬化の低下および赤血球恒常性の回復を含む、幾つかの明白な組織レベルの改善を提供した。同系オスドナ−／メスレシピエントアプロ−チは、屠殺時のレシピエントメス腎臓のゲノムＤＮＡ中のオス細胞（ＳＲＹ）の検出を通して、組織キメラの評価を可能とした。移植後６ヶ月においてもなお、オス細胞は、約１％の頻度で、この方法によってメス腎臓中で検出可能であった。１グラムの組織中に約１億個の細胞が存在するという歴史推定、および移植時に、その残腎臓が約０．８グラムの重さであるという推定を使用すると、腎臓（５百万）に送達されるＢ２細胞の用量は、残腎臓の約６．２５％を表した。Ｂ２細胞細分画は、今まで、長期的移植幹細胞または前駆細胞として特徴付けられていない、機能的に成熟した細胞を主に含むため、移植された細胞の１００％が、６ヶ月にわたりインビボで保持されることは期待され得ず、腎臓中の細胞回転の中等度の比率が推測される。Ｂ２細胞の疾病弱毒化効果は、機能的な細胞（サルベ−ジ）を伴う宿主ネフロンの再増殖、宿主細胞（調節）への移植された細胞の細胞保護または再生効果、移植されたドナ−細胞および補充宿主細胞（ネフロン発生）の組合せ作用を介した新しいネフロンの再生成、またはこれらの機構の１つ以上の組み合わせにより得る。また、Ｂ２の未だに同定されていない成分が、観察された治療効果に寄与することも可能である。例えば、組織特異的マクロファ−ジ等の免疫調節性細胞の存在または不在は、特に線維症の機構および組織再構築に関連するため、腎臓における病変形成を調節し得る。さらに、腎臓特異的な幹細胞または前駆細胞は、上で熟考される再生機構等のネフロン発生を実行可能に促進することができる。処置された腎臓組織の分子および細胞成分のよく調整された時間的研究が、Ｂ２およびＢ４の機構（複数可）の完全なる理解を発達させるために必要とされている。
本研究の成功の第一の測定値は生存時間であった。Ｂ２細胞は、生存時間を、処置後約６ヶ月（腎摘除術後３０週間）、または全てが腎摘除術後２２週間で腎不全のため死亡した無処置Ｎｘラットにおける平均の生存時間よりも３ヶ月長く延長させた。Ｂ２処置で観察された生存の継続時間は、腎不全に対する他の発表されている、細胞に基づいた療法において観察された処置後の生存時間よりも長いものであった（Ｋｉｍ， ＳＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ ｗｉｔｈ ｆｅｔａｌ ｋｉｄｎｅｙ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ８３： １２４９−５８， ２００７， Ｃｈｏｉ， Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ， １８： ５２１−９， ２００９， Ｚｅｉｓｂｅｒｇ， Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２８５： Ｆ１０６０−７， ２００３， Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ， Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １７： １５７６−８４， ２００６）。Ｂ２処置ア−ムにおいて遷延した生存時間は、送達された、または移植された細胞によって誘発された腎臓機能への陽性効果により得た：ろ過（ｓＣｒｅａ、ＢＵＮ）、尿細管再吸収（タンパク質）、電解質バランス（カルシウム、リン）、および内分泌（Ｖｉｔ Ｄ、Ｅｐｏ）。Ｂ２細胞が、腎臓の複数の細胞区画に有意に影響を与えるという仮説は、さらに以下によって支持される：１）処置されていない年齢の一致する対照ラットからの単一の健常腎臓と等しい、質量に達するＢ２処置された腎臓の重量となる、腎臓重量の観察された増加（図７９）；および２）低下した尿細管間質性線維症、低下した糸球体硬化、および尿細管内腔中のタンパク質蓄積の低下を伴う尿細管再生成の焦点証拠（図８１）を含み、改善されたタンパク質再吸収の全身的な証拠（図７８）を確証し、Ｂ２細胞中の頑健なタンパク質取り込み機能のインビトロでの証拠と認識的に組み合わさる（図７５ａ）、Ｂ２処置された腎臓の緩徐な疾病進行の明白な組織学的証拠。したがって、Ｂ２による腎臓機能の安定化は、尿毒症および５／６腎摘除術モデルと関連する消耗を低下し、処置された動物が、栄養への代謝および生理学的応答（体重の有意な増加により例証された、図７６ｂ）、正常な血液酸素化（赤血球生成；図７７ａ〜ｃ、図７８ａ）、および廃棄物の除去（機能的なネフロン；図７７ｄ〜ｆ、図７８）を介して、生存、かつ成長することを可能とした。
５／６腎摘除術モデルのＣＫＤは、糸球体および尿細管間質性空間において硬化性病変の進行をさらに悪化させる複数の合併症を伴う。尿毒症の発症と共に、循環するホルモンの産生および制御に含まれる臓器系は、度々機能不全に陥る。腎臓において、尿毒症は、ビタミンＤ活性化および産生ならびに骨髄中の赤血球前駆体へのＥｐｏの送達等の、腎臓の正常な内分泌機能を乱す。血清および骨の正常なミネラル化は、副甲状腺ホルモンフィ−ドバックで平衡した、腎臓制御ビタミンＤ活性化を必要とする。Ｎｘラットで観察された骨侵食（図８１ｂ）、高リン血症（図８１ｃ）、および低カルシウム血症（図８１ｃ）は、骨異栄養症および末期の腎臓疾患の二次性副甲状腺機能亢進と一致した（Ｒｉｔｚ， Ｅ． Ｊ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １８： ２２１−８， ２００５）。この研究でＢ２処置によって提示される多数の利点と一致して、正常な血清カルシウム／亜リン酸バランスが確立され、それは処置後満６ヶ月間、健常対照と等しく、Ｂ２の長期的安定化する治療効果を強調する。貧血は、ヒトＣＫＤおよび５／６腎摘除術モデルにおいて、進行と関連する別の内分泌機能異常である。Ｂ４は、遺伝子発現プロファイルおよびインビトロでの機能特徴（図７４、７５）に基づき、貧血への最大の効果を有することが予測されるが、Ｂ４およびＢ２の双方は積極的に腎臓のＥｐｏ依存性内分泌機能に影響した（図７７、７８、８１）。興味深いことに、Ｂ２処置は、研究結果が全体として考慮される場合、Ｂ４よりも赤血球生成をより安定に耐久的に補助した。Ｂ２が赤血球生成に影響する機構（複数可）は未だに理解されていなが、これらの結果を、局在Ｅｐｏ産生が重篤なＣＫＤを患うヒトの腎臓で頑健であるという我々の先の観察と組み合わせると、Ｂ２処置を用いた腎臓で観察された恒常性組織構造の回復が、皮質線維芽細胞から血流へのＥｐｏの効果的放出に必要とされる微小環境要素を提供する付属的利点を有することは可能性のあることである。
文献で報告され、この研究で観察されるように、５／６腎摘除術手順に供するラットは脂質異常症になる（Ｋａｓｉｓｋｅ， ＢＬ， ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， ６２： ３６７−７４， １９８８）。予想外に、正常な血清脂質プロファイル（コレステロ−ルおよびトリグリセリド）を、Ｂ２処置された動物において観察した。Ｂ２が血清トリグリセリドおよびコレステロ−ルレベルを改善した細胞機構（複数可）は理解されていないが、改善した食事タンパク質処理（図８０）は、食事コレステロ−ル、トリグリセリド、および遊離脂肪酸を排出するネフロンの能力に直接的に影響し得る。これらのデ−タは、Ｂ２または組織恒常性を回復する他の細胞に基づく療法が、ＣＫＤ患者集団における脂質管理に対する薬学的治療介入の必要性を、潜在的に低下または除外し得ることを示唆する（Ｋａｓｉｓｋｅ， ＢＬ， ｅｔ ａｌ． Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ， ６２： ３６７−７４， １９８８）。
第一次または本態性高血圧の病変形成は、多くの場合腎臓疾患に関連する（Ｂｒｅｎｎｅｒ， ＢＭ， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ， １： ３３５−４７， １９８８， Ｈｏｙ， ＷＥ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ， １６： ２５５７−６４， ２００５， Ｓｉｌｂｅｒｂｅｒｇ， ＪＳ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ３６： ２８６−９０， １９８９）。５／６腎摘除術モデルにおいて、腎臓切除直後に起こる高血圧の進行性形成は、高い代償性糸球体毛細血管圧（Ｋａｕｆｍａｎ， ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ６： １０−７， １９７４）およびレニン−アンギオテンシンＩＩ−アルドステロン軸の崩壊に関連する（Ｇｒｅｅｎｅ， ＥＬ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ９８： １０６３−８， １９９６）。慢性高血圧を患う患者の腎臓は、正常血圧対照よりも少ない糸球体を有することを示す（Ｋｅｌｌｅｒ， Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３４８： １０１−８， ２００３）。５／６残腎臓のネフロン損失は、糸球体ろ過ラットにおける増加を含む、腎臓血行動態の変化（Ｋａｕｆｍａｎ， ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ， ６： １０−７， １９７４）ならびに糸球体および尿細管肥大と関連する（Ｂｒｅｎｎｅｒ， ＢＭ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ， ２４９： Ｆ３２４−３７， １９８５）。ＣＫＤおよびその引き起こされる高血圧は、大抵ＬＶＨへと導き（Ｚｏｌｔｙ， Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ， ８： ２２１９−２４， ２００８）、順応は、うっ血性心不全へと最終的に進行し得る。ＣＫＤの心合併症は、増加した末梢血管抵抗または高血圧を克服するのに必要とされる、代償性左心室内圧によって引き起こされる。Ｂ２を用いた腎機能の増強は、無処置の腎摘出された対照および未分画細胞で処置されたものと比べて、心肥大の発達を有意に弱めた（図７６ｃ）。これらのデ−タは、薬学的治療介入への依存性、この場合対照血圧への（すなわち、ＡＣＥ阻害剤またはＡＲＢ）、が潜在的に選択的細胞に基づく再生療法によって低下し得る、別の例を提供する。
機能的な結果は、このモデルにおける進行性腎臓疾患の防止のみを反映するのではなく、ネフロンにおける解剖学的改善と組合された場合、また、Ｂ２分画が正常な腎臓区画（例えば、糸球体および尿細管）の再生成を促進したことも示唆する。これらの研究は、Ｂ２原型が、腎臓の主要な区画（例えば、尿細管、糸球体、および間質性区画）と関連する、正常な細胞および組織機能を保護、回復する潜在性を有することを示している。Ｂ２細胞が再生結果を促した潜在的分子および細胞機構は、現在、調査中である。まとめると、これらのデ−タは、インビトロでの機能的な特質と共に特定の腎細胞は、恒常性組織構造および細胞環境を、末期、進行性ＣＫＤの進行を防止または遅延するために、回復することができることを示唆する。本研究によって企図される細胞に基づく再生医学アプロ−チは、明白な進行性疾病状態の確立後ではあるが、腎不全が透析または全臓器移植を必要とする末期の疾病に進行する前の、ＣＫＤ患者への治療と類似する。これらの結果は、再生戦略が、ＣＫＤ患者集団において、透析および薬物への依存を低下し、ＣＫＤに対する治療パラダイムを、緩和から根治へと最終的に移行し得るという、概念証明を提供する。
実施例１１−インビトロおよびインビボでの尿細管機能特質によって特徴付けられるげっ歯類ネオ腎臓細胞の単離
上述のように単離した細胞を、ＯＰＬＡ足場で播種し、培養し、インビトロで５日にわたり、灌流した。
また、尿細管細胞機能の鍵となる特徴を維持する尿細管細胞も単離した。図１で見られるように、これらの機能的な特徴を、三次元の培養系によってインビトロで増強し、その細胞は相互作用し、尿細管の様な構造を形成した。また、図６６は、ロ−ダミン抱合アルブミンを、呼応する２個の受容体との特定の相互作用を通して、近位尿細管細胞によって取り込むことを示す：メガリンおよびキュビリン。アルブミン取り込みの特異性を、競合的阻害剤、ＲＡＰタンパク質の添加によって確認した、それは、ロ−ダミン抱合アルブミンが取り込みまれることを防止した。
培養した尿細管細胞の、インビボで腎臓機能を安定化する能力を、図６７で示し、それは、血清クレアチニン、腎臓機能指標を、無処置尿毒症ラットと比べて、ネオ腎臓細胞で処置された尿毒症ラットにおいて、正常なレベルに近いレベルで維持したことを示す。６２％の無処置ラットは、１６週目時点前に死亡した。
実施例１２−ヒト腎臓からの尿細管／糸球体細胞の単離
尿細管および糸球体細胞を、本書を通して説明される酵素単離方法によって、正常なヒト腎臓組織から単離し、増殖した。上述の勾配方法によって、尿細管細胞分画を、エクスビボおよび培養後に濃縮した。図６８で示されるように、表現型特質を単離および増殖において維持した。また、標識アルブミンの取り込みを通して評価される尿細管細胞機能も、反復される継代および凍結保存後保持される。図６９は、尿細管濃縮した集団および尿細管枯渇した集団を３次元動的培養物中に培養した時、尿細管マ−カ−（カドヘリン）の発現の顕著な増加を、尿細管濃縮した集団中に発現したことを示す。これは、尿細管細胞の濃縮が、細胞を３次元動的環境中に培養する時、初期の濃縮を越えて維持され得ることを確認する。
実施例１３−フロ−サイトメトリ−を介したＥＰＯを産生する細胞のさらなる分離
実施例８で上述の腎臓細胞の同一の培養集団は、フロ−サイトメトリ−分析に供じ、前方散乱および側方散乱を検討した。小さな、そこまで顆粒ではないＥＰＯを産生する細胞集団は識別可能であり（８．１５％）、かつそれを、フロ−サイトメトリ−の選別する能力を使用して、その小さな、そこまで顆粒ではない顆粒集団の陽性選択を介して、分離した（図７０を参照されたい）。
実施例１４−貧血を患う腎不全のラットモデルにおける、送達系におけるネオ腎臓（ＮＫ）細胞原型Ｂ２およびＢ４の効果
多様な生体材料に基づく送達系における、ネオ腎臓（ＮＫ）Ｂ２およびＢ４細胞原型の効果を決定するため、Ｂ２およびＢ４原型を、３つの送達系原型（ＣＰ１、ＣＰ２、またはＣＰ３）の内の１つにおける、疾病したげっ歯類腎臓実質に、送達した。樹立した腎臓疾患を患うラットにおける腎不全および／または貧血の進行を緩徐または逆転する、３つの送達系原型の内の１つにおいて送達される細胞原型の比較能力を、移植後３ヶ月にわたって検討し、ＣＲＥＡＴ、ＢＵＮ、ＨＣＴ、ＲＢＣ＃、血清タンパク質、体重、および相対的心臓重量を含む、複数の全身性および組織学的パラメ−タにわたって評価した。
非限定的成功要因は、以下を含んだ：
１） 原型は、赤血球生成を維持し／増強し、恒常性ＨＣＴおよび／またはＲＢＣをもたらす。
２） 原型は、赤血球刺激の組織学的証拠をもたらす。
３） 原型は、ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮによって評価されるように、腎臓機能（複数可）の測定可能な改善または安定化を提供する。
４） 原型は、腎臓における修復および／または再生成の組織学的証拠をもたらし、以下を含む（しかし、限定されない）：
ａ． 糸球体修復、再生成、糸球体新生
ｂ． 尿細管修復、尿細管再生成、細管形成、またはネフロン発生
ｃ． 集合管系の修復、再生成、または形態形成
５） 原型は、１つ以上の腎臓機能の改善に関連する、生物レベルの改善（体重増加、生存時間）を提供する。
６） 原型は、複数の関連するパラメ−タにわたった総合利点を提供し、全ての試験された原型の治療上の特徴の併用平板状定量評価が、原型が、全ての試験された結果に対して有益あるいは中性かを同定する。
細胞：第一次腎臓細胞培養物を、オスドナ−Ｌｅｗｉｓラットから確立し、標準的方法を使用して拡張した。移植前、Ｂ２およびＢ４細胞原型立体配置を、上記に説明される集団分画方法を使用して、産生した。
送達系：３つの構造体原型（ＣＰ）送達系を本研究において評価した。ＣＰ１はヒドロゲル形態にヒアルロン酸（ＨＡ）を含んだ。ＣＰ２は多孔性発泡形態にヒアルロン酸を含んだ。ＣＰ３はＯＰＬＡ形態を含んだ。
試験物質：試験物質は、細胞、または細胞＋生体材料送達系から成る。そのＢ２細胞の原型は、特定の尿細管細胞および他の腎臓細胞型の非常に小さな分画の混合物を含有した。そのＢ４細胞の原型は、ｅｐｏ発現細胞、糸球体細胞、および特定の尿細管細胞を含有した。Ｂ４／ＣＰ１およびＢ２／ＣＰ１に対して、細胞を、移植２〜４時間前に、ＣＰ１と組み合わせた。Ｂ４／ＣＰ２およびＢ２／ＣＰ２に対して、細胞を、移植２４時間前に、発泡足場に播種した。Ｂ４／ＣＰ３およびＢ２／ＣＰ３に対して、細胞を、移植２４時間前に、発泡足場に播種した。
試験に使用した動物モデル：成体のメスＬｅｗｉｓラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ， Ｐｏｒｔａｇｅ， ＭＩ）より得た、それらの大部分は二段階５／６腎摘除術（ＮＸ）を受けた（処置群および詳細については、表１２を参照されたい）。研究群に無造作に割り当てられたラットを、処置前に５〜８週間にわたって収容し、監視した。その動物モデルおよび行われた外科手術は、実施例７および９で説明された、利用されたものと同一であった。先の研究におけるように、ラットを、腎摘除術後、移植前に５〜８週間にわたって維持し、尿毒症を毎週の血清学的分析を通して確認した。原型を、疾病した腎臓実質に送達し、移植後３ヶ月にわたって追跡した。この継続時間を選択したことにより、再生成を観察するのに最適時に組織の組織学的検討を可能とし、大部分の処置されたラットが、未だ生存している間に比較全身性分析を可能とした。
手術：細胞および細胞／ＣＰ原型を、Ｂ２、Ｂ４、Ｂ２／ＣＰ１、およびＢ４／ＣＰ１の注入を介して、疾病した腎臓実質に送達した。Ｂ４／ＣＰ２、Ｂ４／ＣＰ３、Ｂ２／ＣＰ２、およびＢ４／ＣＰ３を、残腎臓の遠心極に外科的に移植し、腹部脂肪の小片で包んだ。
測定：動物を毎週秤量した。血清学的および血液学的分析は、移植前後での、腎機能（血清ＢＵＮ＆血清クレアチニン（ｓＣＲＥＡＴ））および赤血球生成（ＨＣＴ＆ＲＢＣ＃）の寿命評価を提供した。完全な血清および血液学パネルを、ベ−スライン、移植後６週間、移植後１２週間、および剖検前（瀕死時か、あるいは研究終了時に屠殺された）で行った。剖検時、臓器（腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺）を、組織学的検査のため秤量し、収集した。大腿骨髄を組織学的検査のために収集した。
結果
レシピエント動物は、５／６腎摘除術手順の４週間以内で、尿毒症の疾態に達した。無処置ＮＸ動物は、実験の時間枠以内に全て死亡した（移植後３ヶ月）。ＮＸラットのこの群における貧血は、ＨＣＴの○<１０％降下を産生し、ＲＢＣ＃においてはいずれの有意な低下も産生しなかった。ＮＸラットに比べて、細胞または細胞／ＣＰ原型で処置されたラットは、より長く生存した。研究にわたって収集された血清学的デ−タは、Ｂ２原型が腎臓ろ過機能の安定化に関して、他の全ての処置よりも優れていることを示し、その研究は、わずか０．７８±０．１３の平均血清ＣＲＥＡＴ（無処置ＮＸの１．７７±０．７と比べて）、およびわずか３４±３．６のＢＵＮ（無処置ＮＸの６４±１７と比べて）と共に終了した。全ての処置に対するＣＲＥＡＴおよびＢＵＮレベルは、下の表１３に示される。これらのＮＸラットの産生された貧血は軽度であったが、３つの原型（Ｂ２、Ｂ４／ＣＰ１、およびＢ４／ＣＰ２）は、健常対照と等しいレベルまで、ＨＣＴ％を回復した。全てのパラメ−タおよび時点を考慮すると、研究の継続時間にわたって、Ｂ２原型は、最大の総合的な治療上の利点を提供した（下の表１３を参照されたい）。
Ｂ２、Ｂ４／ＣＰ１、およびＢ４／ＣＰ３を用いた処置は、１００％の生存時間Ｔ０から→処置後３ヶ月、を結果として生じさせた（図８２を参照されたい）。先の研究で予想されたように、１００％の無処置ＮＸラットが移植の１２週間以内に死亡した。実施例１０のように、Ｂ２細胞の原型で処置された１００％のラットは、健常対照がそうであったように、研究終点まで生存した（３ヶ月）。１匹の擬似Ｎｘラットが、４週目に、不明の原因により自然死した。５０％のＢ４細胞の原型で処置されたラットは、３ヶ月生存した。Ｂ２原型で処置されたラットの生存時間は、細胞が単独で送達された時、最大であった（１００％）、後にＢ２／ＣＰ３（８０％）、Ｂ２／ＣＰ１（６６％）、およびＢ２／ＣＰ２（６０％）が続いた。対照的に、Ｂ４原型で処置されたラットの生存時間（５０％）は、試験された全ての３つの生体材料送達系によって増強され、Ｂ４／ＣＰ１およびＢ４／ＣＰ３において６０％まで、Ｂ４／ＣＰ２において１００％まで増加された生存時間を伴った。
図８３で示されるように、研究の間にわたって、Ｂ２処置は体重損失を低下し、体重増加を促進した（図８３ａ、ｂ）。体重を全てのラットに対して毎週測定した（パネル８３ａ）。体重増加／損失を、処置前体重と死亡時の体重との比較を通して、各ラットに対して別々に算出した（パネル８３ｂ）。健常対照および擬似Ｎｘラットにおいて記されるその体重増加は、健常Ｌｅｗｉｓメスラットの、先の研究において記される３ヶ月の体重増加と一致する。無処置ＮＸラットに対して記された体重損失（約５％）は、経時的体重損失が典型である二段階５／６腎摘除術モデルと一致する。健常対照、擬似Ｎｘ、およびＮＸ＋Ｂ２処置された群のみが、本研究において経時的体重増加を示した。他の群の体重は、無処置ＮＸラットと一致した。
図８４〜８７で説明されるように、腎臓機能は、血清クレアチニンおよび血液尿素窒素（ＢＵＮ）に基づく、腎臓尿細管機能の安定化に基づき、Ｂ２処置で安定化した。健常対照群および擬似Ｎｘラットの双方は、研究の間にわたって、低い可変性と共に、血清クレアチニンレベル約０．４を維持した（８４〜８６）。無処置ＮＸラットの平均血清クレアチニンは、１．２超（増加３００％）まで上昇し、その時点後、ラットは瀕死状態になり、研究獣医より屠殺指令が出た。全てのＢ２処置されたラットは研究を生存し、安定した血清クレアチニンレベルを研究の間にわたって維持した、処置前平均０．６８±０．０５〜研究終了（３ヶ月処置後）での平均０．７８±０．１３であった（図８４〜８５を参照されたい）。図８４に全ての処置群が示されるが、Ｂ２およびＢ４処置群を、さらなる明確さのため、図８５中にＮＸ、健常対照、および擬似Ｎｘと共に示す。エラ−バ−は標準偏差を表す。送達系原型（ＣＰ１、ＣＰ２、またはＣＰ３）のいずれも、血清クレアチニンの安定化に関する、Ｂ２またはＢ４細胞の原型の能力を改善しなかった。しかしながら、その大部分の原型は無処置ＮＸ群よりも優れていた。全ての時点からのデ−タを各処置群に対して合併し、一元配置分散分析に供した（図８６）。期待されるように、そのＢ２処置（丸）は、血清クレアチニンの安定化に対して、他の処置よりも優れていた、無処置ＮＸならびに他の原型の大抵よりも明白な改善を提供した。Ｂ２およびＢ４細胞の原型の双方を、本研究および実施例１０において同様の様式で行った。また、血清ＢＵＮを、全ての試験群において研究の間にわたり監視した、これらの結果は、経時的最低の血清ＢＵＮ値によって特徴付けられるＢ２原型と共に、処置群間の能力の同様のパタ−ンを示すことによって、クレアチニンデ−タを支持する（図８７）。
図８８〜９０は、赤血球生成が、ＨＣＴの回復に基づいて、驚くべきことに、Ｂ２原型によって改善したことを示す。ＨＣＴ（％）の軽度の減少が無処置ＮＸラットにおいて記された、このモデルにおいて腎不全の次に、貧血が発生することを示す。しかしながら、ラットのこのコホ−トにおける貧血は、軽度および一過性であったことを記した、先の研究においてよりも目立たない効果を産生した。ＨＣＴ（健常対照％として反映）は全ての処置群（図８８）に対して示され、パネルの擬似Ｎｘ、Ｂ２、Ｂ４、およびＮＸのみが（図８９）、明確さのために示される。全てのデ−タが一元配置分散分析でまとめて考慮される場合（図９０）、ＨＣＴは、Ｂ２原型において、健常ラット（擬似Ｎｘ）により類似していたことを記した（図８９を参照されたい、丸）。興味深いことに、また、３ヶ月時点での１００％の生存によって特徴付けられた、Ｂ４／ＣＰ２原型は、ＨＣＴの改善を表示した（図８８および９０を参照されたい）。
図９１で示されるように、Ｂ２原型を用いた処置は、有意に低い相対的心臓重量へと導いた。５／６腎摘除術モデルは、体重と比べた心臓の重量の増加によって特徴付けられる。死亡時の総括的観察の際、左心室壁肥大がＮＸラットにおいて感知可能であり、その心臓の平均重量は、１．２２±０．０７ｇであった（健常対照の１．１３±０．０７ｇと比べた）。５／６腎摘除術手順に供した全てのラットは、健常対照および擬似Ｎｘラットと比べて、有意に高い心臓の重量／体重比を有した（ｐ○<０．０５、グラフ上の縞模様棒）。Ｂ２原型で処置されたラットは、無処置ＮＸラットと比べて、有意に低下した心臓の重量／体重比を有した（ｐ○<０．０５＊）。この観察は、実施例１０で示される先の結果と一致した。全ての他の原型は、無処置ＮＸと比べて、心臓の重量／体重の低下を有したにも関わらず、いずれも統計学的に有意ではなかった。
図９２は、Ｂ２およびＢ４原型処置されたラット中のタンパク質保持の傾向を示す。総血清タンパク質、アルブミン、およびアルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）比の有意な低下は、５／６腎摘除術モデルの特徴である。期待されるように、腎摘除術手順を受取する全てのラットは、総血清タンパク質の有意な低下を有した（縞模様棒、ｐ○<０．０５）。先の研究において、血清タンパク質濃度が、Ｂ２原型を用いた処置際、わずかに増加したことが記された。改善されたタンパク質保持への傾向は、Ｂ２で処置されたラットにおいて記され、いずれも統計学的に有意ではなかったが、Ｂ４およびＢ２／ＣＰ２原型で処置されたラットは生存した。
図９３で示されるように、３ヶ月時点での組織学的評価は、Ｂ２およびＢ４処置されたラットの増強された尿細管＆糸球体健康の証拠を提供する。５／６腎摘除術手順を受けた全てのラットは、死亡または屠殺時に、進行性糸球体および尿細管傷害によって特徴付けられる腎臓を有した。尿細管がタンパク質性円柱の蓄積で拡張され（図７で、ＰＡＳ染色によって強調された）、尿細管萎縮症および尿細管間質性線維症が存在した（図７で、マッソントリクロ−ム染色によって強調された）。モデルにおける糸球体障害証拠は、傍糸球体線維症、糸球体間質増殖、糸球体肥大、および幾つかの糸球体萎縮症を含んだ。ＮＸおよびＮＸ＋Ｂ４と比べて、ＮＸ＋Ｂ２で処置された腎臓は、より重篤ではない糸球体障害、より少ない尿細管拡張およびタンパク質蓄積、顕著に低下した尿細管間質性線維症によって特徴付けられた。また、Ｂ４を用いた処置は、尿細管拡張および円柱蓄積の幾つかの改善を提供したが、効果は、Ｂ２原型で処置された腎臓と比較して、よりはっきりしないものであった。また、Ｂ４処置は低下した糸球体障害をもたらした。
原型の複数のパラメ−タの比較は、全体で最良の原型の選択を可能とする（下の表１３を参照されたい）。各主要なパラメ−タ（生存時間、体重変化、ＨＣＴ、ＣＲＥＡＴ、ＢＵＮ、および心臓重量）を、各処置群の全てのラットから収集される最終測定からの平板状形態に表示する。擬似Ｎｘラットが研究中に死亡したため、８０％またはそれ以上での生存時間を健康であるとみなした。健常対照と等しい値はボ−ルド体である。ＮＸと等しい、あるいはそれよりも悪い値はイタリック体である。健常対照の平均レベルに達しないが、明白にＮＸよりも優れている値を、改善したと考慮し、ボ−ルド体および下線によって強調した。まとめると、そのデ−タは、ＣＫＤに対する再生療法の成分として、Ｂ２細胞原型の使用へのさらなる調査の起動力を提供する。この研究および実施例１０で説明される研究の双方において、Ｂ４細胞原型は、限定されるが、有意な治療上の利点をもたらした。興味深いことに、生体材料に基づく送達系中のＢ４細胞原型の移植は、生存時間を含む、複数のパラメ−タにわたるＢ４の効果を増強した。
末端および寿命血清学的／血液学的デ−タに基づき、Ｂ２原型（ＮＸ＋Ｂ２）は、１００％の生存を顕著に提示し、実施例１０で得られたＢ２原型に対する結果と一致した。また、ＮＸ＋Ｂ４／ＣＰ２も、単体で送達されるＢ４の５０％の生存と比べて、１００％の生存を提示し、ＣＰ２送達系が、Ｂ４細胞原型に特異的である再生成および／または修復を増強する環境を提供することが示唆された。全体で、上記のデ−タは、全ての原型が、３ヶ月目で、ＮＸラットよりもより高い生存％をもたたらしたことを示す。
以下の原型は擬似Ｎｘに近いレベルまでＨＣＴを改善した：Ｂ２、Ｂ４／ＣＰ１、およびＢ４／ＣＰ２、かつこれらの観察を骨髄の組織学的分析によって確認した。細胞がＣＰ１またはＣＰ２中に送達された場合、Ｂ４の赤血球生成効果を増強した−その双方はヒアルロン酸を含む、したがってＢ４の赤血球生成効果が、臓器形成中に腎臓を発達させる環境を部分的に反復する細胞外環境を組み込むことによって、増強し得ることを示唆する。
先の研究に比べて、腎摘出したラットのこのバッチ中のＨＣＴ応答は軽度であったにも関わらず（ＨＣＴの○<１０％低下）、３つの原型Ｂ２、Ｂ４／ＣＰ１、およびＢ４／ＣＰ２が、赤血球生成をよく補助していることは未だに明白であり、それは骨髄の組織学的分析によって確認された。対照的に、２つの原型（Ｂ２／ＣＰ３およびＢ２／ＣＰ２）は、他の処置群と比べた場合、ＨＣＴの低下をもたらし、Ｂ２が、単体で送達された場合、細胞がＣＰ３およびＣＰ２に送達される時、阻害されたという赤血球恒常性効果を示唆した。興味深いことに、ＣＰ３およびＣＰ２原型の双方は多孔質発泡体であり、Ｂ２単体およびＢ２／ＣＰ１（半固体状ゲルであるＣＰ１）の双方が腎臓全体に分布されるにも関わらず、それは腎臓全体には分布されず、腎臓全体への分布および／または腎臓中の他の細胞型との密接な接触に一部依存し得るとこを示唆し−それらの双方を、固定された固体足場の使用によって低下あるいは防止した。
以下の原型は、ｓＣＲＥＡＴによって決定されるように（順位序列）、腎臓機能の安定化の幾つかのレベルを提供した：Ｂ２＞Ｂ２／ＣＰ１＞Ｂ４／ＣＰ３＞Ｂ４／ＣＰ１＞Ｂ２／ＣＰ２＞Ｂ４；しかし、これら間で、Ｂ２原型が、最も一貫性のある安定（研究終了時、ＣＲＥＡＴ０．７８±０．１３）を提供し、処置後３ヶ月間の１００％生存を提供した、この群におじぇる唯一の原型であったことが留意されるべきである。
Ｂ２原型を用いた処置は、ＮＸ無処置群と比べて、処置されたラットの相対的心臓の重量を低下した。これは、実施例１０における観察と一致しており、血圧対照に関する能力の幾つかのレベルを示唆し得る。
実施例１０で得られた結果と一致する、以下の傾向は、Ｂ２およびＢ４処置と共に記された（しかし、統計学的に有意ではない）：血清コレステロ−ルおよびトリグリセリドの低下、血清総タンパク質＆アルブミンの増加、血清亜リン酸の低下。
デ−タを試験された複数のパラメ−タにわたって考慮すると（表１３を参照されたい）、そのＢ２細胞原型は、単体で送達される際、大抵のパラメ−タにわたって有意であり再現可能な利点を提供し、本研究において試験される、いずれの３つの送達系中への送達によっても、有意に増強されない。Ｂ４細胞原型は、有意な生存時間利点（５０％）ならびに赤血球恒常性および糸球体修復の補助を提供する。Ｂ４の能力は、生体材料に基づく送達系の追加によって、ほとんどのパラメ−タにわたって増強され、ヒアルロン酸に基づく物質（ＣＰ１およびＣＰ２）が、さらなる調査の最大の対照となる。
要約すると、Ｂ２細胞原型は、腎臓ろ過および赤血球生成の双方にわたる一貫する陽性利点を提示する。興味深いことに、また、Ｂ４原型も、鍵と成る領域で実質的改善を提供し、これは、細胞が生体材料に基づく送達系中に送達される場合、増強される。したがって、実験は、細胞および送達系原型の組み合わせ（複数可）を試験することを含むことができる、治療上の利点を最大化することに向けられた。
実施例１５−貧血を伴う腎不全のラットモデルのネオ腎臓細胞原型の組み合わせの効果
６つのネオ腎臓（ＮＫ）細胞の組み合わせ原型（Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３、Ｂ３／Ｂ４、およびＢ１／Ｂ５）の、ラットの腎不全および／または貧血の進行を遅らせるか、または逆行させる相対的能力を評価するため、確立した腎臓疾患を有するラットの腎臓内に６つの組み合わせ原型を送達した。研究計画は下記の表１４に示す。限定されない成功要因は下記を含んだ。
１）原型は、恒常性のＨＣＴ／ＲＢＣ数をもたらす赤血球生成を維持／増強する。
２）原型は、赤血球刺激の組織学的証拠をもたらす。
３）原型は、ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮにより評価される際、腎機能の測定可能な改善または安定化を提供する。
４）原型は、腎臓内の修復および／または再生成の組織学的証拠をもたらす。
５） 原型は、生物レベルの改善をもたらす（例えば、生存、体重増加、血圧）。
６）組み合わせ原型は、（Ｂ２）単独により提供されるもの以上の便益を提供する。
細胞：上で説明したように、一次腎臓細胞培養物をオスのドナ−Ｌｅｗｉｓラットから確立し、拡張した。下記に説明するように、移植前に６つの細胞原型構造を単離し、組み合わせた（被験物質）。
被験物質：被験物質は、培養された一次細胞からなり、拡張し、増殖し、上で説明される分画／濃縮方法に供して、特定の細胞亜集団を確立した。それらの表現型を確認するため、移植前に特定の分画を分子的および機能的に特徴付けた。各分画は、次のように特徴付けられる。
Ｂ２：堅調なアルブミンの取り込みができる近位尿細管細胞を主として含む、尿細管細胞を主に含み、幾つかの遠位尿細管および集合管細胞が存在した。他の確認された細胞型（内分泌、糸球体、血管）は、微量でのみ存在する。
Ｂ４：本質的に主として近位の内分泌、血管、および糸球体細胞からなり、しかし、幾つかの小さな尿細管細胞も含んだ。この分画内の幾つかの細胞は、腎臓幹または前駆体細胞集団に一致する特性も持つ（すなわち、低側方散乱および前方散乱、ならびに腎臓の発達に関連するマ−カ−の発現）。
Ｂ１：遠位尿細管および集合管細胞を主に含み、微量の他の細胞型が存在した。
Ｂ３：近位尿細管細胞を主に含み、少量の内分泌、血管、糸球体、および前駆体様細胞（特定の発達に関連するマ−カ−の発現、およびフロ−サイトメトリ−による低い側方散乱および前方散乱集団の存在により定義される）も存在した。
Ｂ５：本質的に極小の細胞、内分泌、血管、および、前駆体様細胞を含み、この分画は低生存率の細胞も含有し、集団全体の極少量に相当した。
細胞は、通常の健康な腎臓で自然発生するの混合物に基づく割合（互いに対して）で試験するために組み合わせた。
Ｂ２：この分画が腎機能、特に尿細管細胞区画の修復に関連する機能の優れた生存および安定化を提供することを実証する前記の実験に基づき、単独で試験した。
Ｂ３：Ｂ２の尿細管の機能的な特性を共有し、ならびにＢ４の幾つかの内分泌、糸球体、および前駆体様細胞を含有し、故に双方の集団の利点の混合物を提供する可能性があるという前提に基づき単独で試験した。
Ｂ２／Ｂ４：本組み合わせは、前記の研究でＢ２より提供された腎臓のろ過機能の実質的効果、およびＢ４処置（糸球体、改善、内分泌機能）で述べられたあまり明白でない（しかし有意な）効果を、より包括的な治療効果を提供するため、組み合わせる可能性があるという前提に基づき試験した。
Ｂ２／Ｂ３：本組み合わせは前記の研究におけるＢ２の過去の性能、およびＢ３の共有したＢ２およびＢ４の特性に基づき試験した。
Ｂ３／Ｂ４：本組み合わせは、より大きな関連用量の前駆体様細胞、内分泌機能、および糸球体細胞を送達することが治療的価値を増強するか否かを判定するため試験した。
Ｂ１／Ｂ５：本組み合わせは集合管細胞および小さな前駆体様細胞の混合物、内分泌、ならびに血管細胞が腎臓の様々な試験した機能（本混合物内に、機能的な尿細管細胞はほとんど存在しない）にわたって治療効果を提供するかを判定するため少数のラットで試験した。
試験に使用した動物モデル：成体のメスのＬｅｗｉｓラットをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＲＬ，Ｐｏｒｔａｇｅ，ＭＩ）から取得し、過半数は輸送の前に２ステップの５／６の腎摘除（ＮＸ）を受けた。（処置集団および詳細のため、下記の表１４を参照されたい）。本研究のため、半腎摘除の対照を加え、５／６の腎摘除のラットの生成を用いる同一の全腎臓摘出術を使用して、ＣＲＬで生成した。全腎摘除のラットおよび対照をＲＴＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）へ送達し、収容し、処置の前に略５週間観察した。動物モデルおよび業者で実施された外科手術は、実施例７および実施例９で利用されたものと同一であった。前記の研究のように、ラットを、週１回の血清学的分析を通して重大で持続性のある尿毒症を確認するため、移植前の５から８週間、腎摘除後に維持した。原型を、疾病した腎臓実質へ送達し、移植後３ヶ月間経過観察した。本研究を、移植後６ヶ月まで継続したため、様々な組み合わせ原型の耐久性での違いを識別することが可能であった。
手術：細胞原型を、到達される皮髄境界部を標的として、残りの腎臓の遠位の極を通して腎臓実質へ送達した。
測定：動物は、週１回、体重を量った。隔週の血清学的および血液学的解析は、ベ−スラインの前処置から研究期間の間中の腎機能（ＢＵＮおよびＣＲＥＡＴ）および赤血球生成（ＨＣＴおよびＲＢＣ）の生存中の評価を提供している。包括的な血清および血液学的パネルは、ベ−スライン（処置の前週）、処置後６週間目、処置後１２週間目に行われ、研究期間の６週間の間隔で繰り返し行われた。血圧の測定は、尾部のカフを通して、６週間目、１２週間目、および本研究の残りの期間の間中、６週間毎に行った。検尿もまた１０から１１週間目に行い、本研究の間中、１０から１１週間の間隔で行った。部検の際、臓器（腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺）は、組織診断のため体重を量り、採取した。大腿部の骨髄は、赤血球生成を評価するための組織診断のために採取した。
結果
受容動物は、血清クレアチニンの二倍化、ＢＵＮの大幅な増加、およびＨＣＴの緩やかな減少で確認されるように、５／６の腎摘除術の５週以内に尿毒症の疾病状態になった。処置後１２週間目で、Ｂ２、Ｂ２／４、Ｂ３、およびＢ１／Ｂ５の集団は１００％の生存率を有した。血清学的および血液学的デ−タは、全ての細胞処置集団は、ＮＸが未処置であるか、またはＮＸ媒体により処置されたラットと比較して、平均より低いＣＲＥＡＴおよびＢＵＮおよび高いＨＣＴを有したことを示した。いずれの与えられたパラメ−タへの異なる組み合わせの中で変化は持続するが、Ｂ２／Ｂ４の組み合わせは、生存（未処置で、１００％に対し２５％）、体重増加（未処置で、１１％に対し−３．５％）、ろ過機能（ＣＲＥＡＴおよびＢＵＮの安定化）、タンパク質保持（尿および血清タンパク質レベルにより確認された）、赤血球生成（健康な対照と等しいＨＣＴ％）、および高血圧（平均全身血圧は、未処置での３０％の増加と比較して、１０％のみ健康な対照を上回る。）に対する実証された治療効果を提案するデ−タを有する最も包括的な効果を提供した。３Ｍおよびタ−ミナル血液生化学検査後、病理組織診断、検尿、ならびに血圧測定は、全てのパラメ−タにわたってＢ２／Ｂ４の組み合わせの最適な性能を示し、３〜５Ｍ観察を支持する。
下記の表１５に示すように、Ｂ２／Ｂ４の原型は２０週の間、１００％の生存を促進し、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ２／Ｂ３の原型は処置後２０週間目で、８０％の生存率を有した。全てのＮＸラットが２０週目まで生存しなかった。Ｂ２の原型のこれらの結果は、実施例９および実施例１３に示す前記の観察と一致する。
図９５は、多数の原型が１２週の時点で体重増加を促進したことを示す。各ラットの体重増加（％変化として）は、ベ−スライン（処置前）からラットらが瀕死状態になるまでか、または１２週の時点まで、それぞれ算出した。体重増加は、Ｂ２の原型での処置における前記の研究に示されており、当該の研究の１２週目の時点で再度見られ、Ｂ２の処置を有する実施例１４における３ヶ月の時点での％増量に沿っている。前記の実験と異なって、未処置のＮＸラットはベ−スライン（処理前）と１２週時点の間、平均して５．８１％増量しているが、たった１匹のラットのみ１２週間目まで生存した（図９４を参照されたい）。興味深いことに、ＮＸ集団の３分の２のラットは、切開部腫瘍をＣｌｖａｍｏｘで処置し、故に、ラットは腎摘除術後の腎臓損傷の回復期段階の間、抗生物質に曝された。当該の理由で、媒体で処置した（すなわち、無細胞の偽処置）ＮＸラットは、当該の研究で、より信頼性のある対照であると見なされ得る。ＮＸ＋ＶＥＨラットで見られる体重の減少は、前記の研究で見られる、未処置または偽処置されたラットでの体重の減少と類似していた。３つの原型、Ｂ３、Ｂ２／Ｂ４、およびＢ２／Ｂ３は、治療されたラットでＢ２より優れた体重増加を生成させ、Ｂ３およびＢ２／Ｂ４の原型の双方は１００％の生存をも生成した（図９４を参照されたい）。
腎臓のろ過機能を１２週目の間中、Ｂ２／Ｂ４およびＢ１／Ｂ５原型により安定化した（図９６〜９７）。前記の研究はＢ２細胞の原型での処置において、時間をかけて腎機能（ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮ）の安定化を実証した。処置後１２週の時点で、Ｂ２の原型で処置したラットの集団は、ＮＸ＋ＶＥＨおよびＮＸ対照と比べて、低いｓＣＲＥＡＴ（３ａ）およびＢＵＮ（３ｂ）を示した（これらの双方の対照集団の１２週時点の生存は縮小したが）。１２週目で１００％の生存した群は、緑のバ−で表示し、１００％未満生存した群は黒のバ−で表示する。エラ−バ−＝標準偏差。Ｂ２／Ｂ４およびＢ１／Ｂ５の組み合わせ原型の双方は、他の原型（例えば、Ｂ３／Ｂ４）が十分に機能しなかったのに対し、Ｂ２の原型よりわずかに優れていた。
タンパク質保持も、処置後１１週の間中、原型Ｂ２／Ｂ４で、大幅に増強した（図９８を参照されたい）。Ｂ２での処置における前記の研究で、血清総タンパクおよびアルブミンレベルの改善が示され、それほど多くはないが、Ｂ４の原型の改善を示した。過去の研究と一致して、処置されたラットでの血清総タンパク、アルブミン、およびＡ／Ｇの割合は、ＮＸおよびＮＸ＋ＶＥＨと比べてわずかに増加したが、その違いは統計的に大きくはなかった。。１６時間の蓄尿を、全てのラットで処置後１１週目に行い、尿は、尿タンパク質（ｕＰＲＯ）の測定および他のパラメ−タのため検尿に曝された。全てのＮＸラットが、ＳＨＡＭ ＮＸおよびＨＥＭＩ ＮＸ（ｐ○<０．０１）と比べて大幅に高いｕＰＲＯを有し、幾つかの原型がｕＰＲＯの低下傾向を示したのに対し、Ｂ２／Ｂ４の原型で処置されたラットのみが、未処置のＮＸラットと比べて、ｕＰＲＯの大幅な低下を有した（ｐ○<０．０５）。注釈：ＮＸ＋ＶＥＨのラットは、それらの蓄尿が他の全ての群より（４）週早く完了したためグラフに示さない。全ての検尿デ−タは、ＨＥＡＬＴＨＹ ＣＯＮＴＲＯＬＳへ正常化した。統計的に大幅ではないが、処置後６週間目に測定した処置群の血清Ａ／Ｇの割合は、ｕＰＲＯのレベルの反比例する様式に従った（各群の図９８および図９９を比較されたい）。Ｂ２／Ｂ４の処置群において、処置におけるタンパク質排泄の低下は、血清内のそのタンパク質の保持を伴う。
図１００〜１０１に示すように、赤血球生成は、１２週の間中、Ｂ１／Ｂ５およびＢ２／Ｂ４の原型で支持する。実施例１４に示すように、続発性貧血は腎摘除されたラットのコホ−トで軽度である。黒のバ−は、１２週目で、１００％の生存に満たない群を表現し、一方、緑のバ−は１２週目で１００％の生存がある群を表す。示されるデ−タは群平均＋／−ＳＤＥＶである。Ｂ１／Ｂ５およびＢ２／Ｂ４の原型は、１２週目で最も強い赤血球生成の支持を提供した。Ｂ５およびＢ４の細胞分画で、ＥＰＯを産生する細胞の関連濃縮が与えられることは当然である。ＨＣＴ（５ａ）より明白ではないが、ＲＢＣ数は、様々な処置群でＨＣＴに酷似している（５ｂ）。
高血圧は、腎不全の５／６の腎摘除モデルの測定可能な特徴であり、部分的にＢ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３、およびＢ１／Ｂ５の原型により調節される（図１０２を参照されたい）。５／６の腎摘除を受けたラットの中で、心臓肥大を縮小した幾つかの処置である、実施例９および１３の総括的観察に基づいて、当該の研究で、血圧（ＢＰ）の評価を約６週間の間隔で導入した。収縮期および拡張期の血圧は、ＣＯＤＡ ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ ＢＰ ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｋｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。一時点において、１匹のラットにつき少なくとも１０回のソフトウェア確認測定が行われた。時点中のＢＰの傾向を比較するため、各時点での各ラットのデ−タを健康な対照のその時点での平均値へ較正した。本研究の中間点（１２週）で、３つの原型（Ｂ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３、およびＢ１／Ｂ５）は、ＮＸ対照と比べて低い平均ＢＰの（統計的に大きくない）傾向を示した。興味深いことに、２つの原型（Ｂ２／Ｂ３およびＢ１／Ｂ５）は、実際に６週から１２週の時点で、ＢＰが縮小していることに関する幾つかのエビデンスを示した（図１０２のグラフの矢印を参照されたい）。
表１５
図１０３に示すように、３〜５ヶ月時点での組織学的評価は、Ｎｘ未処置の動物と際立って対照的に、Ｂ２／Ｂ４の処置されたラットで、より少ない線維症、より健康な尿細管、より少ないタンパク円柱の蓄積、および縮小した糸球体硬化のエビデンスを提供した。１つの腎臓を除去することに関連する腎臓肥大を、図１０３の最上部パネル内に全体的に強調し、図１０３の底部のパネル内に組織学的（半腎摘除）に強調している。Ｎｘの未処置の同物と際立って対照的に（１６週までに１００％が腎不全で死亡した）、少ない線維症、より健康な尿細管、より少ないタンパク円柱の蓄積、および縮小した糸球体硬化がある。図１０３に示される染色は、青で強調しているＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅである。
処置後１２週間の観察
処置後１２週間目に、実施例１０および実施例１４での当該の細胞原型の性能と一致して、１００％のＮＸ＋Ｂ２ラットが生存した。１２週間時点での１００％の生存は健康な対照、ＮＸ＋Ｂ２／Ｂ４、ＮＸ＋Ｂ３、およびＮＸ＋Ｂ１／Ｂ５でも達成した。処置後１２週間目で最も低い生存は、ＮＸ＋ＶＥＨ（２５％）およびＮＸ（未処置）（６６％）であった。全ての他の原型は、１００％に満たなかったが、ＮＸおよびＮＸ＋ＶＥＨよりも多かった。
実施例を通して示されるように、時間をかけた体重増加は、生存に関連しており、健康全般の良い指標である。本即時の研究での１２週の時点で、全ての群（ＮＸ＋ＶＥＨを除く）は、幾らか体重を増加させたが、ＮＸ＋Ｂ２／Ｂ４は、１１．３％の増加（健康な対照での２１％と比較して）で、全ての処置された群の中で最も高い比率の体重増加を有した。
処置後１２週間目で、赤血球生成は、ＮＸ＋Ｂ２、Ｂ２／Ｂ４、およびＢ１／Ｂ５群で、健康な（ＳＨＡＭ ＮＸ）に最も近かった。全体的な腎臓のろ過機能の安定化（ｓＣＲＥＡＴで進行する減少の除去により判定されるように）は、ＮＸ＋Ｂ２、Ｂ２／Ｂ４、およびＢ１／Ｂ５で達成した。
未処置のＮＸまたはＮＸ＋ＶＥＨラットは、１３７ｍｍＨｇの平均全身性血圧を示した（健康な対照での１０５と比較して）。平均全身性血圧の低下の傾向（ＮＸ対照と比較して）は、原型Ｂ２／Ｂ４、Ｂ２／Ｂ３、およびＢ１／Ｂ５の原型で処置されたＮＸラットで示された。
検尿および血液生化学検査を通したタンパク質の処理の評価は以下を明らかにした：１）尿の排出されたタンパク質の量と血清アルブミン／グロブリン（Ａ／Ｇ）割合の間に強い逆相関性があり、２）Ｂ２／Ｂ４の原型での処置は、血清Ａ／Ｇ割合での随伴性の上昇を伴う尿タンパク質排出で、大幅な低下をもたらし、腎臓によるタンパク質の取り扱いは当該の処置で向上することを示唆する。
全てのパラメ−タを考慮すると、Ｂ２／Ｂ４の組み合わせは最も強い効果を提供し、ほとんどのパラメ−タにわたってＢ２および他の原型より優れていた。
上記のデ−タは、作用している原型と作用していない原型の間の重要な違いを強調する。全体的に、作用している原型は、作用していない原型よりも腎機能を安定化させる。具体的に、作用している原型は、１９週目で１００％の生存、より低いＣＲＥＡＴおよびＢＵＮ、５０％のタンパク尿の低下、当量の赤血球生成、およびより低い全身性血圧を提供した。例えば、図１０４は、１９週の間中、作用している原型で向上した血清クレアチニンレベルを示す。対照として、図１０５は、１９週の間中、作用していない原型で血清クレアチニンレベルを示す（ＰＰＴを参照されたい）。図１０６はさらに、作用している原型と作用していない原型の間の違いを示す。作用している原型はまた、作用していない原型よりもタンパク尿を減少させることを示す。減少したタンパク尿は、アルブミンを輸送する尿細管細胞の存在と相互に関係し、Ｂ４の成分（糸球体、血管）との組み合わせで最適となる（図１０７を参照されたい）。作用している原型はまた、作用していない原型よりも血圧を維持することを示した（図１０８を参照されたい）。
倫理に拘束されることを望むものではないが、縮小した線維症（糸球体および間質性）で明らかなように、ネオ腎臓増大原型は、抗線維性経路の培地を通して一部において機能すると思われる。ネオ腎臓増大原型は、腎形成の支持に関連するＨＡの型である高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）の合成に関与する、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素２）の発現が増加したから証明するように、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）環境（構造的柔軟性）を調節することができるとも思われる。開示されたネオ腎臓増大原型は、白血球浸潤が負傷したモデル内で観察されているように、マクロファ−ジ活性化を通して免疫系を調節することができるとも思われる。ネオ腎臓増大原型は、原始構造が幾つかの処置された組織で観察されたように、発達プログラム、すなわち腎形成の再開を再開するか、または刺激することができるとも思われる。さらに、ネオ腎臓増大原型は、腎臓組織の再生成を刺激するか、または引き起こすことに関与することが可能な組織特異性の前駆細胞を含有するか、または再活性化し得ると思われる。
研究終点の観察
前記の研究と一致して、特定の生理活性亜集団および／または試験されたこれらの亜集団の特定の細胞／細胞の組み合わせは、尿細管、糸球体および／または内分泌機能に対して明らかな治療効果を示した。次のデ−タは、ベ−スライン値と比較した研究終点の臨床化学の群の平均を表す。
図１０９に示すように、研究終点の血清クレアチニンは、Ｎｘ対照と比べて、細胞／細胞の組み合わせのＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４およびＢ２／Ｂ３で、大幅に向上するか、または安定化した。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
研究終点のＢＵＮ（血中尿素窒素）は、Ｎｘ対照と比較して、細胞／細胞の組み合わであるＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４およびＮｘ＋Ｂ２／Ｂ３で大幅に向上するか、安定化した（図１１０を参照されたい）。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
研究終点の血清アルブミン（ＡＬＢ）は、Ｎｘ対照と比較して、細胞／細胞の組み合わせであるＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４およびＮｘ＋Ｂ２／Ｂ３で大幅に向上し、安定化した（図１１１を参照されたい）。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
図１１２に示されるように、研究終点の血清総タンパク質（ＴＰＲＯ）は、Ｎｘ対照と比較して、細胞／細胞の組み合わせであるＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４およびＮｘ＋Ｂ２／Ｂ３で大幅に向上し、安定化した。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
研究終点の血清リン（ＰＨＯＳ）は、Ｎｘ対照と比較して、細胞／細胞の組み合わせであるＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４およびＮｘ＋Ｂ２／Ｂ３で大幅に向上し、安定化した（図１１３を参照されたい）。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
図１１４に示すように、研究終点の血清カルシウム（補正した総タンパク量［Ｃａ］−０．４［ＴＰ］＋３．３＝補正したタンパク量）は、Ｎｘ対照と比較して、細胞／細胞の組み合わせであるＮｘ＋Ｂ２／Ｂ４で大幅に向上し、安定化した。ベ−スライン値は、個々の動物の研究終点の測定から差し引き、次に各処置群の全体に平均化した。選択された研究群の平均誤差および標準誤差を示す。
本明細書で説明される研究全体の試験された原型の機能的な成果を、下記の表１６に示す。表１６に示すように、Ｂ２／Ｂ４およびＢ２／Ｂ３の細胞／細胞の組み合わせはＢ２単独により提供されたものに加えてさらなる効果を提供した。
表１６
結論として、上記のデ−タは腎臓の腎臓ろ過（糸球体）および再吸収（尿細管）機能（ｓＣＲＥＡＴ、ＢＵＮ、タンパク質保持、カルシウム平衡）への大幅な改善を強調した。重要なことに、Ｂ２／Ｂ４およびＢ２／Ｂ３の細胞／細胞の組み合わせのインビボでの治療活性は、インビボでの再生成果を増強するように相乗的に作用した。これらの組み合わせの原型はＢ２単独により提供されたものに加えてさらなる効果を提供した。
実施例１６−疾病したヒト腎生検からの腎細胞の単離および増殖
当該の研究の目的は、疾病したヒト腎臓の小さな生検からの細胞収率、生存率、および増殖の技術的限度を判定するものであった。
腎臓組織の獲得：腎臓（右）が、外科外植手術の略１９時間後に、宅配業者を通してＮＤＲＩから到着した。梱包を開き、７０％のエタノ−ルおよびＢａｃＤｏｗｎ洗剤で外部をよく洗浄し、腎臓を収容している容器は、組織培養フ−ドに配置した。
腎生検の採取：腎臓被膜を無傷で残して、脂肪および結合組織を腎臓から除去した。腎臓から生検（ｎ＝８）を採取するために滅菌生検パンチを使用した（デ−タ示さず）。生検の明白な腎杯および被膜を整え、計量した。各生検を、滅菌の１５ｍＬの円錐管へ入れ、カルシウムなしのＰＢＳ（生検１〜４）またはカルシウムを含有するＰＢＳ（生検５〜８）のいずれか一方で、３７℃で１０分間洗い流し液に曝した。結果、ＰＢＳ洗い流し液は、吸引によって廃棄し、生検は消化施術を受けた。
生検の消化：各生検を、３ｍＬの消化緩衝液（ＨＢＳＳで、４Ｕｎｉｔ ｏｆ Ｄｉｓｐａｓｅ １（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を有する３００ Ｕｎｉｔ／ｍＬのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ））に浸し、水浴で３７℃で、２０分間の穏やかな撹拌でインキュベ−トした。２ｍＬの消化上清は、新鮮な管へ除去され、培地と組み合わせ、５分間／１，１００ＲＰＭで、回転するバケツ遠心分離機でペレット細胞へ遠心分離した。「消化１」の間に遊離した細胞は、各生検および数を記録するためにそれぞれ数えあげた。細胞は次に培地（１培）で洗浄され、１ｍＬの培地で再懸濁し、標識されたＴ２５組織培養物の処置されたフラスコへ入れた。１ｍＬの新鮮な酵素消化緩衝液を各生検の残りへ加え、組織の残りは、付加的に滅菌ばさみで刻み、生体組織は、穏やかな撹拌の振動する水浴で、さらに４０分間、３７℃で消化した（「消化２」）。消化混合物は、１００μｍフィルタを通して、清潔な滅菌の１５ｍＬの円錐管へろ過し、５ｍＬの培地と組み合わせた。細胞を遠心分離および洗浄した（２倍）後、培地で再懸濁し、数えあげた。当該のステップでの生存率は、１０％容積のトリパンブル−を加えて評価した。細胞数および％の生存率を記録した。
プレ−ティング：各生検から遊離した全ての細胞（消化１および消化２）は、共に単一のＴ２５フラスコでプレ−ティングした。培養物を１００％の培地に変更し、プレ−ティングのの４８時間後に顕微鏡写真を撮影した。
結果
患者情報／疾病状態の確認。ＨＫ００１９の腎臓は、２型糖尿病および腎不全の病歴を有する、８５ｋｇ、５２歳の女性（白人）のドナ−から回収した。死因は、心血管不全に二次的に起こった無酸素症だった。死亡の際、貧血を伴う腎不全の明らかな全身性の証拠があった（表１７）。注目すべきは、高いＢＵＮおよびクレアチニン、低い血清タンパク質と組合わさる尿内の高いタンパク質、低い血清カルシウムおよび高い血清リン、および重度の貧血（低いヘマトクリット、ＲＢＣ、およびヘモグロビン）である。明らかに正常範囲外にあるパラメ−タは、表１７に太字で示す。
腎臓、全体の観察全体の観察で、腎臓は、正常の大きさであったが、線維症の明らかな領域は青白く見えた。二分において（下記の写真を参照されたい）、組織は皮質と髄質の間の不良の分界で十分に灌流せず青白く見えた。腎臓の腎杯に侵入する大量の腎周囲の脂肪もあった。
生検結果（収率および生存率）初期の体重、消化１の収率、消化２の収率、および最終の生存率％を各生検のため記録した（表１８）。生検は、主に単細胞を含む懸濁液を生成する傾向があるカルシウムなしの洗い流しステップを用いて、処理し、一方で生検は主に３〜７細胞の大きさの細胞クラスタ−を主に含む懸濁液を生成するカルシウムを含有する洗い流しステップを用いて処理した。全体の収率はわずかにカルシウムを含有する洗い流しの方が多かったが、全体の生存率はカルシウムなしの洗い流しの方が多かった。全ての生検からの細胞収率の平均は、７，６０４±８０７細胞／ｍｇ組織であった。８／８の生検（１００％）は、６日間にわたって、確立し（デ−タ示さず）、拡張した培養物をもたらした。
収率結果の増殖各（８）つの生検から惹起したｐ０培養物は、トリプシン処理で回収し、Ｎｅｘｃｅｌｌｏｍ ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用して数えあげた。生存率もまた算出された（表１９を参照されたい）。ほとんどの生検によって開始された培養物（７／８）は、大幅な増殖（平均６．０の畳込み）を５日間にわたって経て、培養後、１回の生検につき１１８万の平均生細胞収率をもたらした（図示せず）。
表１９．増殖後収率（ｐ０）
要約として、ＨＫ０１９のヒトドナ−腎臓は、腎不全および貧血を明らかに有する患者から獲得した。上に示すように、０．０２ｇほどの軽量で、皮質／皮髄境界部／髄質組織を含み、しかし腎杯および被膜を除く、疾病したヒト腎臓の生検から培養物を確立することができる。疾病したヒト組織からの腎臓の生検の酵素消化後の平均収率は、７，６０４＋／−８０７細胞／ｍｇ組織であった。酵素消化前のカルシウムなしの洗い流しステップは、生存率を向上させ、単細胞を主に含む懸濁液へ導出した。わずかに収率を向上させる酵素消化前のカルシウムを含有する洗い流しステップは、全体の生存率を縮小させ、細胞クラスタ−を主に含む懸濁液へ導出した。ＨＫ００１９から惹起した全て（８／８）の生検は、生存可能な培養物を生成した。生検を惹起する培養物の大多数（７／８）は、５日間の培養の間に平均６．０の畳込み拡張を伴って、時間経過と共に大幅に拡張した。
実施例１７−多数の種からの単離、培養、および腎細胞の拡張
当該の解析の目的は、鍵となる単離、特徴付け、およびげっ歯類、イヌ、ブタ、ヒトの腎臓の検体から生成される腎細胞の単離の拡張（ＩＣＥ）性能特性を検査し、比較することであった。
腎臓組織の獲得：全ての腎臓組織は、研究のためのヒトまたは哺乳動物の使用において、ＦＤＡおよび組織のガイドラインに従って採取し、提供した。全てのヒトの種は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＤＲＩ）により、提供された。ブタの検体（ＰＫ０１およびＰＫ０２）および（２）つのイヌの検体（ＤＫ０１およびＤＫ０２）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ ＣｈａｐｅｌのＤｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｎｉｃｈｏｌｓにより提供された。ＤＫ０３は、正常なビ−グル犬から供給された（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
細胞単離および培養
入手した組織を計量し、解離した。幾つかの実験において、最小の組織要件は、様々な大きさの生検針の使用を通して評価した。他の実験において、今後の実験に使用し得る細胞の凍結保存のストックを生成するため、最大量の組織候補を解離した。組織は、ｐ０の一次培養物を確立するため酵素消化法または外植培養受けた。確立した培養物は、次に、継代および／または凍結保存した。
結果
収率／特性の比較
平均の１グラム組織あたりの収率を各カテゴリ毎に算出した（下記の表２０を参照されたい）。若年のげっ歯類の組織およびＣＫＤヒト組織を例外として、ほとんどの収率は１７００〜２５００万細胞／グラムの範囲内に下落した。拡張は、同様に全ての種で達成し（図１１５〜１１７）、げっ歯類に由来する培養物は例外として、継代し、凍結保存からの培養の再確立を達成した。特定の亜集団への培養された細胞の分画もまた、全ての種にわたって達成した。ＥＰＯ遺伝子発現の検出は、疾病した腎臓組織から単離された細胞を含む全ての種からの培養された細胞において信頼性があった。ＥＰＯ発現の低酸素で刺激する誘導は、正常な成体のラット（疾病した成体のラットの培養物は低酸素刺激を示した）および正常なイヌを例外として、全ての種で観察された。尿細管細胞の存在／機能は、特定の尿細管マ−カ−（アクアポリン、ビタミンＤ、ヒドロキシラ−ゼ、キュビリン、メガリン）の検出および機能的なアルブミン取り込みアッセイによりアッセイした。イヌ、ブタ、およびヒトの成長動態の実施例は、（図１１５〜１１７）示す。図１１８は、ＨＫ０１９からのヒト細胞の成長動態、重量０．０２〜０．０３ｇの間の重量の疾病した組織の生検から生成されたＣＫＤ腎臓培養の実施例である（上記の実施例１６の付加の詳細を参照されたい）。図１１８において、ＢＰ３が、最も低い収率の生検（合計８から）を表す一方で、ＢＰ５は、最も高い収率の生検を表す。
表２０．腎臓細胞ＩＣＥの種別比較
結論として、腎細胞単離／拡張は、げっ歯類、イヌ、ブタ、およびヒトの腎臓組織から達成し得る。腎細胞単離／拡張は、確認されたＣＫＤの事例からも達成し得る。重さが０．０２ｇほどの軽量の小さな組織部分は腎細胞の繁殖可能な培養物を生じさせ得る。機能的な尿細管細胞および低酸素応答性ｅｐｏ発現細胞は、単離し、拡張した腎細胞の培養物の成分である。
実施例１８−治療の可能性を有する細胞は、正常および慢性的に疾病した腎臓から単離し、繁殖し得る。
本研究は、先に説明したＥＰＯを産生する細胞（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｂ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ．２００８年８月（４）：２９５−３００．Ｅｐｕｂ ２００８年７月８日）を含む、培養された群の腎細胞が、進行型および末期型の腎不全で、疾病状態が確立した後に送達された場合、全身性の利点を送達することが可能か否かを判定する。げっ歯類で行なったパイロット研究は、群内に含有される、細胞の明らかな多因子治療の可能性を示し、培養された細胞の不均一な性質を強調し、培養された細胞は、明らかに機能的な特質を有する顕著な尿細管細胞および内分泌細胞の群、ならびに他の細胞型（糸球体、血管、および集合管）を含有した。ＣＫＤの可能性のある処置において自己再生医療のアプロ−チが、考慮される際、治療の可能性を有する特定の細胞成分は、疾病が進行した際に、保持するか、または失うか否かを判定することが必要である。故に、全腎臓組織は、機能的な尿細管および内分泌細胞が、組織に存在し、成功的に単離され増殖され得たかどうかを判定するため、確立されたＣＫＤを有するヒトの臓器ドナ−から採取された。本明細書で提示されるデ−タは、１）機能的な尿細管および内分泌細胞を含む、単離し、増殖した細胞培養物が進行性の腎臓疾患のげっ歯類モデルで臨床的に大いに意義のある効果を提供し、２）類似の細胞は保持され、単離され重症な事例のＣＫＤから増殖され得る、という証拠を提供する。総合すると、これらのデ−タは、ＣＫＤ処置への自己細胞に基づいたアプロ−チへのさらなる調査を支持する。
材料および方法
細胞単離および培養
初期の組織解離は、マウスの腎臓組織から不均一な細胞懸濁液を生成するため、上記に説明されたように実施された（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ ２００８，２６：２９５−３００，Ｊｏｒａｋｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，４７：１２９−１３３）。簡単に説明すると、ラット、イノシシ属の動物、またはヒトの腎臓はＨａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ）で洗浄し、消化技術を用い前に皮髄境界部の組織を選択するため、肉眼的解剖を行った（Ｊｏｒａｋｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９，４７：１２９−１３３）。肉眼的に解剖した組織を刻み、計量し、Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ）での４Ｕｎｉｔｓ ｏｆ Ｄｉｓｐａｓｅ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ）、３００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのコラゲナ−ゼＩＶ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ ＮＪ）に５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）を加えた緩衝液で解離した。結果として生じた細胞懸濁液を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）および１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）で中和し、洗浄し、無血清、無補充のＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｍｅｄｉａ（ＫＦＳＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再懸濁した。細胞懸濁液は、次に、１５％（ｗ／ｖ）のイオジキサノ−ル（ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標），Ｓｉｇｍａ匂配に曝し、組織培養での培養の惹起の前に、赤血球および残骸を処置される除去するため、ポリスチレンフラスコまたは皿を５％の（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ：ＫＳＦＭの１：１の高グルコ−ス（４．５ｇ／Ｌ）混合物、２．５μｇのヒト組換え型上皮増殖因子１−５３（ｒＥＧＦ１−５３）、２５ｍｇのＢｏｖｉｎｅ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ）、１Ｘ ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／セレニウム）、および１Ｘ抗生物質／抗真菌薬（全てインビトロゲンから）で１ｃｍ２あたり、２５，０００細胞の電荷密度で処置した。幾つかの例で、代替えの細胞単離法が用いられ、外植片培養物を腎臓組織から確立し、本方法は、小さな（０．０１ｇ〜０．０２ｇ）皮髄境界部組織核の組織培養処置のポリスチレン皿への付着、その次に続く３７℃／５％のＣＯ２で、上記に説明される培地と同じ培養培地でのインキュベ−ションを含んだ。７〜１４日以内に、外植された組織は、酵素的に消化された組織から確立された培養と同じ方法で継代培養された繁殖可能な細胞培養物を生じさせた。細胞を、ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する０．２５％のトリプシンで回収または継代のため脱離した。生存率は、トリパンブル−排除を通して評価され、数を、血球計数器を使用してか、または自動のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（商標）集計システム（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＭＡ）を使用して、手動で数えあげた。
げっ歯類のパイロット研究
げっ歯類ドナ−の培養物は、上記の２５および２６に説明されるように、オスのＬｅｗｉｓラット（Ｈｉｌｌｔｏｐ）から確立された。単層の培養は、組織培養処置のポリスチレンフラスコで、高グルコ−スＤＭＥＭおよび補充されたＫＳＦＭが１：１の（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）混合物で維持した。移植前に、細胞は、０．２５％のトリプシンおよびＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で回収し、血清および培地成分を除去するため、滅菌のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３回洗浄した。回収したネオ腎臓細胞（ＮＫ−ＣＥＬＬＳ）を、再懸濁し、滅菌のＰＢＳで、ｐＨ７．４で、１０００万細胞／１２０μＬ濃度で無菌の管に分注した。レシピエントラットは、供給業者で２ステップの５／６の腎摘除を受けた後に、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｒｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ラットの全ての処理、触診、および世話は、ＲＴＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）で、実験動物の使用に関するＩＡＣＵＣおよびＮＩＨのポリシ−に従って行った。適合した年齢の未処置のメスのラットが、健康な対照（ＨＥＡＬＴＨＹ，ｎ＝５）として届けられた。付加的な対照は、切開は行ったが腎臓の損傷または組織の除去は行っていない（ＳＨＡＭ ＮＸ，ｎ＝５）偽腎摘除術を行うことにより発生した。１系列において、（２）匹のラットは細胞移植を受け（１０６ＮＫ−ＣＥＬＬＳを１０個）、（４）匹の腎摘除されたラットを未処置の対照として維持した（ＮＸ）。２系列において、（５）匹のラットが細胞移植を受け（１０６ＮＫ−ＣＥＬＬＳを５個）、（４）匹のラットを未処置の対照として維持した（ＮＸ）。ＮＫ−ＣＥＬＬＳを受けたラットを、外科的な調製の前に、０．３ｍｇ／ｋｇのｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ（商標）Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＶＡ）を腹腔内注射して送達することで、鎮静した。イソフルランチャンバ内に配置することで麻酔を惹起し、施術の間中、ノ−ズコ−ンを通して維持した。右背面部分を剪毛し、残りの腎臓を曝すための背面の少しの切断の前にｂｅｔａｄｉｎｅおよびエタノ−ルで清浄した。ＮＫ−ＣＥＬＬＳ懸濁液を腎臓実質へ、２３Ｇ針を装着した滅菌の１．０ｃｃのシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）を通して直接的に送達した。筋層は、４−０Ｖｉｃｒｙｌで閉じ、皮膚は、創傷クリップ（共にＥｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ ＮＪ）を用いて閉じた。動物に酸素を投与し、手術後、起きて覚醒するまで、モニタリングした。全てのラットは、手術後に、付加的に０．３ｍｇ／ｋｇ量のＢｕｐｒｅｎｅｘ（商標）を受けた。血液は、本研究の間中、血清ＢＵＮおよびＣＲＥＡＴ、ＨＣＴおよびＲＢＣ数をモニタリングするため、尾部の静脈または眼窩出血を通して週に一度抜いた。全ての血清学的検査および血液学的検査はＡｎｔｅｃｈ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）で行った。研究の最後に動物が屠殺されたか、瀕死状態になった場合、体と臓器の重量を採取し、組織学的解析のため組織試料（腎臓、大腿および胸骨）は、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。
ブタおよびヒトの組織獲得
ブタの組織は、寛大にも、Ｄｒ．Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｎｉｃｈｏｌｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により提供された。ＣＫＤおよび非ＣＫＤのブタ腎臓組織を、実験動物の使用を管理する、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌで設定されている全ての施設の方針に従って成体のオスのブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）の屠殺時に獲得した。試料ＰＫ００１は、重症の腎臓障害で屠殺され瀕死状態になるまで、増加するｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮ値を伴う６ヶ月以上の持続している特発性腎症にかかった成体のオスの種畜のブタから獲得した。試料ＰＫ００２は、腎臓疾患のない成体のオスのブタから獲得した。ＣＫＤおよび非ＣＫＤのヒト腎臓組織は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＤＲＩ）により、研究目的のためのヒト組織の使用を管理している全てのＮＩＨガイドラインに従って提供された。各試料の年齢、性別、疾病の原因、および死因を表２１に提示する。ＨＫ０１８は６年間の血管透析の経緯を有する血管ドナ−から獲得した。ＨＫ０１９は、透析および不従順な薬物処方を行っていない２３年間のＮＩＤＤＭおよび８年以上の腎不全の病歴を有するドナ−から獲得した。ＨＫ０２０は、８年未満の腹膜透析の経緯を有するドナ−から獲得した。検体は、４℃の氷の上で、Ｖｉａｓｐａｎ（商標）臓器保存溶液（ＤｕＰｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ ＤＥ）（ヒト）または、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡ）（イノシシ属の組織）中のいずれか一方で輸送し、Ｔｅｎｇｉｏｎ Ｌａｂｓで収集の２４時間以内に受けとられた。
組織学的解析
獲得された組織学的分析の全ての組織は、１０％の緩衝されたホルマリン中に２４〜２８時間置き、その後にＰｒｅｍｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｏｎｇｍｏｎｔ，ＣＯ）へ輸送するため、パラフィン包埋し染色するために７０％のエタノ−ルへ入れた。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、過ヨウ素酸シッフ反応（ＰＡＳ）、ならびにＭａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を標準の手順に従って行った。画像は、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｇｈｔ（ＤＳ−Ｕ１）カメラを装着した１００ｘ、４００ｘ、１０００ｘ、および２０００ｘでＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ５０ｉ顕微鏡で撮影した。組織は、糸球体硬化、尿細管間質線維症間質性、尿細管細胞内腔のタンパク円柱、および基本の区画組織の程度を評価するため、獣医学の病理学者および組織病理学者により評価された。
遺伝子発現分析
ＲＮＡは、以下のように腎臓組織および細胞培養物の試料から単離した。組織または細胞は、ＱＩＡ ｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して均質化し、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｉｓｏｌａｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。分光光度分析を通してＲＮＡの統合性を検証し、試料を定量化した。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｖｉｌｏ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ＣＡＤ）、Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ＣＡＤ）、キュビリン（ＣＵＢ）、１アルファ、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２４−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２４）、アクアポリン−１（ＡＯＰ−１）、アクアポリン−２（ＡＱＰ−２）、ネフリン（ＮＥＰＨ）、ポドシン（ＰＯＤＯ）、血管内皮増殖因子（ｖＥＧＦ）、ＣＤ３１、およびｖＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）の発現を定量リアルタイムＰＣＲを通して、カタログにあるＡｐｐｉｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）社製のＴｅｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔおよびＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ ７３００ リアルタイムＰＣＲシステムを用いて検査した。試料は、内在性１８ｓ ｒＲＮＡ（大量発現のヒトまたはげっ歯類の遺伝子のための）、ペプチジルプロリン異性化酵素Ｂ（ＰＰＩＢ）（中間的な量の発現のげっ歯類遺伝子のための）、またはペプチジルプロリン異性化酵素Ａ（ＰＰＩＡ）（中間的な量の発現のヒト遺伝子のための）から増幅されるｃＤＮＡに対して正規化し、供給源の腎臓組織に対して較正するかまたはＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した同一の種の腎臓に対して較正した。
免疫性分析
細胞懸濁液は、接着培養物の初期の組織解離またはトリプシン処理から生成するか、または細胞成分を同定し定量化するためフロ−サイトメトリ−により解析した。用いられた抗体は、尿細管マ−カ−、Ｅ−ＣＡＤ、Ｎ−ＣＡＤ（双方ともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｃｕｂｉｌｉｎ（ＣＵＢ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＡ）ＡＯＰ−１、およびＡＯＰ−２（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）を含んだ。糸球体細胞は、ネフリン（ＮＥＰＨ）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）で標識した。血管マ−カ−ＣＤ３１（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）は、内皮細胞を同定するために使用した。ＥＰＯを産生する細胞は、単クロ−ンＥＰＯ抗体および標準の間接的な細胞内染色技術を使用して同定した。集合管細胞は、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎ（ＤＢＡ）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の結合を通して同定した。抗体試薬の中の種特異性抗体の欠如および低い交差反応性は、ラットおよびブタに由来する細胞への全てのマ−カ−の適用を防止した。イソ型特異性一次抗体の負の対照は、全ての実験で使用した。標識された細胞は、ＦＡＣＳｒｉａ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で解析した。適切なイソ型に適合する対照を、負の群をゲ−トするため使用した。多パラメ−タ分析を、間接的な細胞内染色を使用して、関連尿細管およびＥＰＯ陽性細胞の割合を判定するために使用した。表面の尿細管マ−カ−で細胞を標識した後、細胞は次に、透過処理／遮断緩衝液（０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１０％のヤギ血清を含有するＰＢＳ）を使用して６０分間透過処理し、沈渣し、ＥＰＯ（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）への一次抗体を含有する透過処理／染色緩衝液（０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２％のヤギ血清を含有するＰＢＳ）中で、１μｇ／ｍＬ／１Ｘ１０６細胞の濃度で再懸濁した。４℃での一晩のインキュベ−トの後、細胞を沈渣し、トリトン緩衝液（ＰＢＳ中に０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ａ６４７へ抱合する二次抗体ヤギ抗体マウスＩｇＧ２Ａを含有する、１ｍＬの透過処理／染色緩衝液中で再懸濁し、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）付加的に３０分間インキュベ−トした。細胞は、次に洗浄し、１ｍＬのＰＢＳ中で、製造者の使用説明により、ＦＡＣＳＡｒｉａおよびＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、分析のため再懸濁した。負の対照のように、細胞は同一の蛍光色素へ抱合するイソ型に適合する単クロ−ン抗体細胞で並行して、インキュベ−トした。幾つかの実験において、単層の培養も、上記に挙げられた抗体で染色し、さらに培養群内の特定の細胞の生存および関連する分布を確認するため、蛍光顕微鏡で視覚化した。細胞は、９６ウェルの組織培養で処置されたプレ−ト（ＢＤ ｆａｌＣｏｎ）で、１ウェルにつき１０，０００細胞の密度で、約８５％のコンフルエンスへ培養し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で１時間固定した。固定された細胞はＰＢＳ中で洗浄し、次に０．５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）の入ったＰＢＳ中で１０分間遮断した。遮断された細胞は４℃の３μｇ／μｌ一次抗体または適合するイソ型対照（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）で一晩標識した。標識した細胞はＰＢＳ中で洗浄し、Ａｌｅｘａ ４８８またはＡｌｅｘａ Ａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ抱合するイソ型に適合する二次抗体で、光から保護した室温で、３０分間、１μｇ／ｍｌの濃度で標識した。細胞はＰＢＳ中で洗浄し、ＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ ８５５ Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて撮像した。
ＥＰＯの検出のための等電点電気泳動法および＆ウエスタンブロット法
最適切削温度（ＯＣＴ）凍結培地に包埋された凍結された全腎臓組織は、タンパク質試料の採取のため利用された。腎臓（包囲している被膜、皮質、髄質、腎杯）の非連続の１０−ミクロン切片（７〜８）は、１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管へプ−ルし、４℃へ解凍し、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。残留のＯＣＴ培地を除去し、組織は５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ４０、プロテア−ゼ阻害混合物（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｉｌｉｅｄ Ｓｃｉｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）からなる緩衝液中で溶解した。溶解は１０分間、室温で、２分間毎に間欠性ボルテックスで進行させた。試料は、１３，０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、可溶化液上清は新鮮な管へ伝達した。タンパク質の濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを通して標準のようにＢＳＡを使用して判定し、試料は溶解緩衝液で最小濃度に対して正規化した。可溶化液もまた培養されたＨｅｐＧ２細胞（ＥＰＯを発現することで既知のヒト肝臓株化細胞）およびＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞（負の対照）から調製した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、ｐＨ３−１０ＩＥＦ Ｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各ウェルへ１つの試料につき４０μｇのタンパク質を加えることにより実行した。ジェルは、ｐＨ３〜１０陰極およびアノ−ド緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１００Ｖで１時間、次に２００Ｖで１時間、最終的に５００Ｖで３０分間電気泳動した。タンパク質を次に、製造者の使用説明に従って、Ｉ−Ｂｉｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、ニトロセルロ−ス膜へ伝達し、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）の入ったＴｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｄ Ｓａｌｉｎｅ中で、約２時間室温で振動させながら溶解した３０ｍＬの４％ｗ／ｖ低脂肪牛乳で遮断した。膜は、室温で、抗ヒトＥＰＯ単クロ−ンＩｇＧ２ａ Ｍａｂ２８７１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）で、５ｍＬのＴＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０）と２％ｗ／ｖ低脂肪牛乳を１：６００の希釈で、一晩プロ−ブした。膜を、ＴＢＳ−Ｔで、１０分間毎に３回洗浄し、次にＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｏ ＣＡ）で、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０）と２％ｗ／ｖ低脂肪牛乳を１：５０，０００の希釈で、１．５時間、室温で振動させながらプロ−ブした。膜は、それぞれＴＢＳ−Ｔ中で１０分間毎に３回洗浄し、次にｄｉＨ２０中で１０分間の洗浄を２回行った。ブロットを、製造者の使用説明に従って、ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を使用して、現像した。
アルブミンの取り込みアッセイ
腎臓近位の尿細管細胞機能は、Ｚｈａｉ ｅｔ ａｌ ２７により説明されるように、特定の近位の尿細管受容体、メガリン、およびキュビリンにより媒介されたアルブミンエンドサイト−シスの活性化および阻害により評価した。ヒトおよびブタの腎臓細胞を、９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内で、標準の培養培地（上記に説明した全ての補充物の入ったＤＭＥＭ：ＫＳＦＭが１：１の高グルコ−ス（４．５ｇ／Ｌ）の混合物）で、１ウェルにつき５，０００および１０，０００細胞の密度でそれぞれ播種するか、１ウェルにつき２５，０００および４０，０００細胞（ラット）で播種した。細胞は、３７℃／５％のＣＯ２でインキュベ−トし、アッセイを行う前に約８５％の培養密度へ成長させた。成長培地は、アッセイ惹起の１８〜２４時間前に、１培の抗生物質／抗真菌薬および２ｍＭのグルタミンを含有する無フェノ−ルレッドで無血清の低グルコ−ス（１ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭで置換した（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）。アッセイの日、細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した無フェノ−ルレッドで無血清の低グルコ−スＤＭＥＭからなるアッセイ緩衝液で２回洗浄し、３０分間、加湿したチャンバ内で、３７℃／５％のＣＯ２で、アッセイ緩衝液で補助因子への適切な曝露を確実にするためインキュベ−トした。細胞を次に、２５μｇ／ｍＬの最終濃度のフルオレセインを抱合したもしくはロ−ダミン抱合したウシアルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはヒト血清アルブミン（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．）に、３０分間３７℃／５％のＣＯ２で曝した。ウェルは氷冷ＰＢＳでエンドサイト−シスを中止するため、３回洗浄し、すぐに１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する２％のＰＦＡで固定した。阻害研究において、メガリン：キュビリンで媒介したアルブミン取り込み２７の特定の競合的阻害剤である組換え型Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＡＰ）（Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ ＧＡ）は、反応の特異性を実証するため使用した。培養物は、上記に説明されるように調製され、１μＭのＲＡＰおよび１２．５〜２５μｇ／ｍＬの蛍光抱合したアルブミンでインキュベ−トした。さらなる実験において、受容体介在性のアルブミンの取り込みは、４℃までアッセイのインキュベ−ションの温度を下げることで部分的に阻害した。全ての事例において、細胞は視覚化し、画像はＢＤ Ｐａｔｈｗａｙ ８５５ Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ ＢｉｏＩｍａｇｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、顕微鏡を通じて撮影された。
結果
機能性の尿細管およびＥＰＯ発現細胞は腎不全のげっ歯類モデルにおいて治療効果を提供する
一次腎臓細胞培養は、マウスに関するＡｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌによって説明される方法（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ Ｔ ，ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｕｒｏｌ ２００８，２６：２９５−３００２５）に従って、オスのＬｅｗｉｓラットから成功裏に単離し、培養内の細胞によるＥＰＯ遺伝子の酸素制御の発現を確認するため特徴付けした（図１２５ｃに含まれる）。さらに、多数の確立された培養物の免疫細胞化学的な特徴付けは、主な細胞表現型は尿細管（近位または遠位）であったが、糸球体、集合管、および血管細胞の特徴付けもまた存在したことを示した（図１１９）。多数の調製にわたる流動細胞数測定解析は、近位または遠位の尿細管細胞の双方の関連頻度がそれぞれ２０〜３５％、糸球体細胞１０〜１５％、５％未満の血管細胞、１０〜１５％の集合管細胞、１０％未満のＥＰＯを産生する内分泌細胞になるように確立した。Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌにより高固有間質性線維芽細胞として同定されている腎臓内の負のＥＰＯを産生する細胞は、皮髄境界部の尿細管周囲の領域２８で濃縮した。インビボでの研究は、重度の低酸素条件の下で、ＥＰＯを発現する間質性線維芽細胞数は増加している（Ｅｃｋａｒｄｔ ＫＵ，ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ １９９３，４３：８１５−８２３）ことを示し、ＥＰＯの発現は塩化コバルトへの曝露で、尿細管細胞で同様に実証されている（Ｍｕｊａｉｓ ＳＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ １９９９，３０：１５３−１６６）。多パラメ−タのフロ−サイトメトリ−を、ラットの培養物中に含有されるＥＰＯを発現する細胞が、近位および遠位尿細管細胞の双方と異なることを実証するために使用した（図１２０ａ、１２０ｂ）。培養物でのキュビリン陽性の近位尿細管細胞の機能性は、蛍光抱合したアルブミンの取り込みを通じて評価し、取り込みの特異性は競合的阻害薬、ＲＡＰの追加により確認した（図１２０ｃ〜ｆ）。故に、げっ歯類の培養物は、有望な治療に関連する機能を有する少なくとも２つの細胞型である、低酸素応答性のＥＰＯを発現する細胞およびタンパク質の取り込みを可能にする尿細管細胞を含んだ。
業者で２ステップの５／６の腎摘除へ曝されているメスのＬｅｗｉｓラットが、ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮを通じて腎臓のろ過機能を、ＨＣＴおよびＲＢＣを通じて赤血球生成を評価するため週毎に採血を受けた。腎摘除術の４週間以内に、ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮはほぼ２倍になり、ＨＣＴは腎摘除術を受けていないか、または偽腎摘除術を有した健康な適合する対照と比べると減少した。腎摘除術を受けたラットの１００％（１５／１５）が腎不全の状態へ進行し、自発性の回復は観察されなかった。腎摘除術の７〜８週間後、幾つかのラットは内部的に急速投与量の培養したオスのＮＫ−ＣＥＬＬＳを受けた。ラットの２次群は処置を受けなかった。ラットは、週毎のｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮ（図１２１ａに示されるｓＣＲＥＡＴ）を通じてのろ過機能ならびにＨＣＴおよびＲＢＣ番号（図１２１ｂにしめされるＨＣＴ）を通じての赤血球生成のモニタリングを伴って、処置後３ヶ月まで経時観察した。当該の研究において、全ての未処置のラットは腎摘除術の１２〜１６週間以内に死亡した（処置の時間を過ぎて４〜８週間）。対照的に、全てのＮＫ−ＣＥＬＬで治療されたラットは研究の終了点（処置後３ヶ月）まで生存した。終結時に、細胞処置の有望な治療効果（図１２１ｃ）を同定するため比較臨床化学検査が行われ、組織学的解析が腎臓および骨髄の双方で組織レベルの効果を同定するため行われた（図１２２）。小ない試料数にも関わらず、統計学的に大幅な改善は、腎機能、（ｓＣＲＥＡＴおよびＢＵＮ）、および内分泌／赤血球生成機能（ＨＣＴ）に関してのＮＫ−ＣＥＬＬ処置に関連した。図１２１ｃは、血清ＢＵＮ、ｓＣＲＥＡＴ、および血清亜リン酸（ｓＰＨＯＳ）の大幅な増加ならびにＨＣＴ、ＲＢＣ＃、ヘモグロビン（ＨＢ）、血清アルブミン（ｓＡＬＢ）、および血清総タンパク（ＴＲＰＯ）の大幅な低下を含む、５／６のＮｘモデルの鍵となる臨床的特性を強調する。重要なことにＮＫ−ＣＥＬＬＳでの処置は未処置のＮＸラットよりも大幅に低い血清ＢＵＮ、ｓＣＲＥＡＴ、およびｓＰＨＯＳレベルを導出し、ＨＣＴ、ＲＢＣ数、ｓＡＬＢ、およびＴＰＲＯの大幅な増強を提供した（図１２１ｃ）。さらに、腎臓実質の比較組織学的検討は、腎摘除した未処置の腎臓と比較した際に、限局的な領域で糸球体症のわずかな減少ならびに限局的な尿細管の再生成およびタンパク円柱のわずかな低下を示した。研究にわたる赤血球生成で示された全身性の陽性効果（ＨＣＴおよびＲＢＣ）は、骨髄の近位の大腿および胸骨の検査で組織学的に確認され、未処置のラットと比較した際に、明らかにＮＫ−ＣＥＬＬで処置されたラットの方が、より赤血球細胞の存在が多い（図１２２）ことを示した。屠殺時のメスの宿主腎臓でのオスのドナ−細胞の存在は、宿主腎臓のゲノムＤＮＡでのｙ染色体特異性ＳＲＹ遺伝子の検出により確認した（デ−タ示さず）。まとめると、これらの予備的なインビボでの観察は、全体的な生存、腎臓ろ過機能の安定化、血清タンパク質の保持、血清亜リン酸の低下、および赤血球の恒常性の修復の増強をもたらし（図１２１ｃ）、ＮＫ−ＣＥＬＬＳはインビボで、慢性進行性腎不全の５／６の腎摘出モデルで治療的効果を提供することができるということを示す。
ＣＫＤを有するブタおよびヒトへの機能的な腎細胞単離物の成功した翻訳
治療効果は培養した腎臓の細胞集団に由来したということを示すＡｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌ の研究およびげっ歯類のパイロット研究の結果に基づいて、次に、１）類似の細胞当量は、大きな哺乳類動物種から単離し、増殖し得るか否か、および、２）類似の細胞当量は、ＣＫＤを有する対象の腎臓から確立された培養物中に存在するか否か、を判定するために探究する。（２）つのブタおよび（５）つのヒト腎臓検体は、材料および方法に従って使用した。腎不全は、血清学的検査および組織学的検査を通じて、ヒト（ＨＫ０１８，ＨＫ０１９，ＨＫ０２０）およびブタ（ＰＫ００１）ＣＫＤ検体で確認された。表２１は、死亡時にＣＫＤおよび非ＣＫＤ検体で測定された易感染性の腎機能に関連する鍵となる、全身性パラメ−タを要約し、ブタおよびヒトＣＫＤ対象内のＢＵＮおよびｓＣＲＥＡＴの上昇を強調する。さらに、典型的に進行期の腎不全を伴う貧血を指し示し、ＨＣＴおよび／またはヘモグロビンＨＢでの軽度から中度の欠損が、ＣＫＤ対象内で示された。ＣＫＤ検体の病理組織学的機能は図１２３に掲示し、ブタおよびヒトの双方からの非ＣＫＤ腎臓の検体の組織学的特性と対比した。非ＣＫＤ組織と比較したＣＫＤ組織でのタンパク円柱を有する線維症、糸球体硬化症、および尿細管の拡大の特徴を示す。３つのヒトＣＫＤ検体は疾病の重症度および原因の範囲を表す。ＨＫ０１８およびＨＫ０１９の対象の双方は、腎不全の次にインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）および高血圧を有し、ＨＫ０１８は、死亡時に６年未満の血管透析の経緯を有した従順な患者を表現し、一方でＨＫ０１９は、透析を受けていなかったか、または確実に薬物投与を受けていなかった非従順な薬物処方患者を表現した。ＨＫ０２０は自己免疫疾病に二次的な腎不全の経緯を有し、８年未満の腹膜透析の経緯を有した従順な患者であった。興味深いことに、ＨＫ０１８およびＨＫ０１９と違って、ＨＫ０２０の腎臓は、非常に小振り（縦方向に３インチ未満）であり、全体的に青白く線維性で、中度に嚢胞性に見えた。図１２３は、生存可能な尿細管または糸球体存在を有するＨＫ０２０での組織学的疾病の重度を強調した。
機能的な尿細管細胞の単離および増殖
多細胞型がげっ歯類の培養で検出された一方で（図１１９および表２２を参照されたい）、主な表現型は本質的に尿細管であり、げっ歯類のパイロット研究からの全身性および組織学的デ−タは、げっ歯類の腎細胞培養物のインビボでの移植において尿細管区画での治療効果を支持する。故に、ブタおよびヒト組織からの機能的な尿細管細胞単離および増殖の可能性を判定するべく探究した。一次細胞培養物は、非ＣＫＤ組織を開始材料として使用する確立された方法により、ブタおよびヒトＣＫＤ組織から惹起した。疾病状態（非ＣＫＤまたはＣＫＤ）または種（ブタまたはヒト）に関わらず、主に尿細管の上皮細胞を含む培養は酵素消化法または小さな（０．０２ｇ未満）の組織の一部を使用する非酵素外植法のいずれか一方で確立し、増殖した。増殖の能力に関する直接的な対比において、ＣＫＤと非ＣＫＤに由来する培養物の間の大幅な違いは示されなかった（図１２４ａ）。尿細管細胞機能は、キュビリン陽性細胞の一部でアルブミンの受容体介在性の取り込みを観察することによって、確立された培養物中で確認された（図１２４ｂ〜ｄ，および表２２）。ブタおよびヒトＣＫＤ組織から培養された一次細胞は、連続継代の後、（ｐ４を通して）尿細管マ−カ−の発現およびアルブミン取り込み機能を保持した。確立された培養物中の尿細管、糸球体、集合管、血管および内分泌マ−カ−の存在および関連発現は、ブタおよびヒト培養のリアルタイムＰＣＲを定量化することで評価し、げっ歯類と比較した（表２２）。
酸素応答性のＥＰＯを発現する細胞の単離および増殖
ＥＰＯを発現する細胞は定量的リアルタイムＰＣＲを通じた受け取りにおいてＣＫＤおよび非ＣＫＤ組織で確認された。組織獲得時のＣＫＤ対象での全身性貧血にも関わらず（表１を参照されたい）、ＥＰＯ ｍＲＮＡは、受け取りで、ＣＫＤに対する非ＣＫＤ組織の検体でより大量に発現した（代表的な試料を図１２５ａに示す）。これらの試料の等電点電気泳動およびウエスタンブロット解析は、遺伝子発現型は、タンパク質レベルで概して再現されたということを確認した（図１２５ｂ）。全てのＣＫＤおよび非ＣＫＤの腎臓組織は、ＥＰＯを生成する細胞を含有する増殖可能な培養物を生成した。酸素応答性は、赤血球恒常性の維持のため、インビボでＥＰＯを発現する細胞に求められる鍵となる特性である。故に、転写の上方制御に伴う低酸素刺激へ応答するため、培養したＥＰＯを発現する細胞の能力を検査した。ＣＫＤおよび非ＣＫＤ腎臓の検体の双方から確立されたＥＰＯを発現する細胞培養物は、刺激の２４時間以内に、ＥＰＯ遺伝子転写の可変性上方制御に伴う低酸素刺激へ応答した（図１２５ｃ）。上方制御の特異性は、ハウスキ−ピングまたは尿細管のどちらも低酸素刺激によって誘発されなかったことを観察によって確認した（図示せず）。ＣＫＤおよび非ＣＫＤヒトならびにブタ組織の双方から確立し、増殖した培養物は、ＥＰＯを発現する細胞を、多継代、ならびに凍結保存および培養の再惹起後にわたって保持した。
下の表２１に示されるように、ブタの腎臓（ＰＫ００１およびＰＫ００２）、ヒト腎臓（ＨＫ０１６〜ＨＫ０２０）、およびラットの腎臓はＣＫＤおよび非ＣＫＤ患者から採取された。＊ラットのデ−タは採取され、進行性の腎不全を誘発するため、２ステップの５／６の腎摘出術を受けたメスのＬｅｗｉｓラットの群から平均し、比較のため健康で年齢の適合する対象を示した。太字の数は、研究室の標準値に従って、正常範囲外の値を表す。
下記の表２２に示すように、培養物は、材料および方法に従って、ブタ（ＰＫ００１およびＰＫ００２）、ヒト（ＨＫ０１６〜ＨＫ０２０）、およびラット（Ｌｅｗｉｓ）の腎臓から確立した。腎臓の主な細胞区画（尿細管、糸球体、小管、血管、および内分泌）を表現している確立された培養物内の細胞の存在は、定量的リアルタイムＰＣＲによって確認された。ヒト特異性プロ−ブの有効性はヒト試料の定量性および示量性の解析をより可能にした。各遺伝子の発現は、内在性の対象へ正常化し、種の適合する新鮮な全腎臓組織へ較正した。
ＥＰＯの発現は、２１％のＯ２および２％のＯ２の双方で検査し、示されている値は、２１％のＯ２発現レベルを表し、（Ｒ）は、上方制御は２％のＯ２条件下で観察されたことを指摘した。アルブミンの取り込み（ＡＬＢ−Ｕ）もまた多継代で各培養において評価した（ｐ０〜ｐ４はブタおよびヒト、ｐ０〜ｐ１はラット）。異なる低側方散乱／低前方散乱（ＳＳＣ／ＦＳＣ）亜集団の存在は、フロ−サイトメトリ−解析により判定した際に、各培養で確認された。
考察
進行性および末期型の腎不全への不均一なげっ歯類のＮＫ−ＣＥＬＬＳの腎臓内の送達は、研究持続時間に処置したラットの１００％の生存を可能にし（疾病発症後２０週間）、一方で全ての未処置のラットは疾病発症後１６週間以内に死亡した。ＮＫ−ＣＥＬＬＳは、５／６の腎摘出術の８週間後、ラットが血清クリアチニンおよびＢＵＮで大幅な上昇を有した際に送達し、腎摘出術後寿命の中間点であった。ＮＫ−ＣＥＬＬＳの送達は明らかに腎臓のろ過機能の安定化および赤血球生成の改善をもたらし、いずれか一方または双方がモデルでの全体の生存に影響した可能性があった。移植された細胞の部分的な特徴付けは、特定の治療に関連する特質（アルブミンは、尿細管細胞を輸送し、酸素はＥＰＯを産生する細胞を制御する）を有する成分細胞は、群内に存在し、故に、げっ歯類のパイロット研究で観察された疾病進行の安定化に貢献するための機会を有したということを実証した。
ヒトおよび２ステップ５／６の腎摘出等のげっ歯類モデルのＣＫＤは、腎機能の悪化、線維症、糸球体および尿細管腫瘤の減少、および尿中のタンパク質の減少（ｄｅ Ｚｅｅｕｗ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００４，６５：２３０９−２３２０）により特徴付けられる。タンパク質の減少は、２つの機構によって腎臓で制御される：有足細胞および糸球体基底膜の完全性がどのくらいの量のタンパク質が尿濾液へ沈積されるかを判定する糸球体のレベルで、：および尿細管細胞が濾液からタンパク質を取り込み、循環へ返す腎臓尿細管のレベルで、制御される（Ｂｉｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００６，６９：４４０−４４９）。．受容体介在性のタンパク質取り込み機能は、インビトロで、培養されたＮＫ細胞の尿細管成分で確認され、またＮＫ−ＣＥＬＬＳでインビボでの処置において５／６のＮｘラットで向上した特性でもあった。故に、特定の倫理に拘束されることを望むものではないが、ＮＫ−ＣＥＬＬＳ混合物内のタンパク質取り込みの形質転換受容性の細胞は、部分的にタンパク質保持で観察されたインビボでの改善に関与していると思われる。ＮＫ−ＣＥＬＬＳ培養物は糸球体細胞の比率も同様に含むため、細胞回復および／または再生成の幾つかのレベルが糸球体のレベルで発生したことももっともらしい。腎臓を処置したＮＫ−ＣＥＬＬＳの組織学的評価は、尿細管の限局的な領域で縮小した腔内のタンパク円柱および穏やかに縮小した糸球体症の観察を通して、当該の仮説のための付加的な支持を提供した。
赤血球恒常性の回復もまた、健康な対照に達し、研究の持続期間（３ヶ月）、正常に近いＨＢレベルを維持しているＨＣＴおよびＲＢＣレベルで、ＮＫ−ＣＥＬＬＳで処置されたラットで観察された。ラットのＲＢＣの長い半減期のため（約１４日）（Ｇａｎｏｚｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９７１，５０：１３７３−１３７８）、ＨＣＴ、ＲＢＣ、およびＨＢに示された陽性の全身性効果は、ＮＫ−ＣＥＬＬ送達時での短期の赤血球系の刺激だけによるものであったという可能性を除外することが重要である。短期の急速投与の効果は、末梢性の測定に長期の影響を有し得た、しかし骨髄での効果は一過性のものであった。重要なことに、３ヶ月時点でのＮＫ細胞で処置されたラットでの骨髄の頑強な外観は、ＥＰＯを産生するＮＫ細胞の送達に関連する急速投与の効果に対する証拠を提供した。げっ歯類へ送達された単量の組換え型ＥＰＯの研究は、２１日目までに投与前のレベルに戻りながら、ＲＢＣの末梢性の刺激は約６日でピ−クとなる一方で、骨髄での効果は約４８時間続くということを示した（Ｂｕｇｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２００８，２５：３６９−３７８）；Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００６，３１９：１２９７−１３０６）。
パラクリン効果は、腎不全（Ｔｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００７，２９２：Ｆ１６２６−１６３５）を含む、急性の損傷条件へ移植された細胞のための作用の機構として説明されているが（Ｇｎｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ２００８，１０３：１２０４−１２１９）、これらの研究で試験されたげっ歯類のＮＫ−ＣＥＬＬＳは、少なくとも部分的に腎臓のろ過機能の直接的な増強および赤血球生成の刺激によって作用したと思われる。外植された腎臓の残りの３ヶ月目の分子解析は、観察された全身性の改善は、移植された細胞の初期の直接的な効果の組み合わせおよび、宿主細胞および／または組織の微小環境での同時発生的および続発する間接的な効果によるものであり得ることを示唆しながらメスのレシピエント腎臓でのオスのドナ−細胞の持続性の存在を明らかにしたが、頻度は低くなると推定した（１０％未満）。付加的な研究は、観察された特定の細胞成分へのインビボでの結果に起因すること、およびＮＫ−ＣＥＬＬＳの送達において進行を遅らせていることに関与する細胞および分子の機構を正確に識別することが求められる。
自己細胞の発達および送達または再生医学の治療において、多くの内在の実践的挑戦がある。しかしながら、自己のアプロ−チは、免疫性の抑制を必要とせず、病原体に関する幾つかの懸念を回避し得るため、臨床的に魅力的なままである。自己の戦略は、疾病機構の一部としての破壊、１型糖尿病でインスリンを再生するベ−タ細胞の減少（Ｐｉｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｑ Ｂｒａｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌ ２００８，５２：１５６−１６５）、より治療的関心の細胞が患者から取得できない場合、または生検を通じた細胞の取得で患者へのリスクが大きすぎる場合、実現できない可能性がある。これらの限定は多くの戦略を探究するため大きくなり、それにより治療に関連する細胞は自己の異所性の部位からの単離によって生成され、内皮細胞または平滑筋細胞等の共通の細胞型の誘導へ関連する。別のアプロ−チは、起源の組織以外の部位から単離した幹細胞または前駆細胞の分化へ向けられている。これらのアプロ−チは、関心の細胞が高く特殊化した組織特異性の細胞である場合、分化の過程での無効性、未分化の細胞が再生成の過程で果たし得る役割の不確実性、および未分化の細胞の移植の方々に持ち上がる安全上の懸念があるため前進が遅れている（Ｈｅｎｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００９年９月１２日）。故に、自己／相同のアプロ−チのためのいかなる与えられた標的の疾病は所望され、治療的有望性を有する細胞が関心の組織から単離し得るか否かを判定することは強制的である。
全ての主要な細胞型の存在および機能（尿細管、ＥＰＯ産生物、糸球体、集合管、および血管細胞）をＣＫＤ患者に由来する全体のブタおよびヒトの腎臓組織、ならびにこれらの組織から確立し、増殖した細胞培養物で調査した。興味深いことに、尿細管マ−カ−に陽性で、受容体介在性のアルブミンの取り込みが可能な細胞は、疾病状態の原因または重度に関わらず存在し、全てのヒトおよびブタの腎臓から増殖した。低酸素への応答するＥＰＯを産生する細胞は、種または疾病の原因に関わらず、全ての慢性的に疾病した腎臓から単離し、増殖した。興味深いことに、糸球体細胞は、採取している集合管細胞および少ない数の血管細胞のように、他の全ての培養物中に存在したが、ＨＫ２０の極度に進行した自己免疫糸球体腎炎の事例から単離せず、増殖しなかった。
慢性腎不全に二次的な貧血が起こる機構に関して、多くの仮説が提案されている。概して、腎不全の貧血は、血清のＥＰＯレベルは、貧血の程度と比較して減少する際、絶対的または関連ＥＰＯの欠乏症によるものあるということが承認されている（Ｎａｎｇａｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００６，２６：２６１−２６８）。腎臓のＥＰＯを産生する細胞は、疾病が進行する際に減少し得るか、腎臓内に存在したままであるが、細胞内の局所性の酸素負荷と対照の機構の関係は、撹乱するため、産生信号に適切に応答することに失敗しているということが仮定されている（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２００３，１４：２７１２−２７２２）。疾病の進行の一部として、脈管構造の線維症および破壊は、腎臓で産生されるＥＰＯタンパク質が循環に効果的に送達されるための性能を限定するということも仮定されている。ＣＫＤ尿の毒症性の環境もまた、ＲＢＣの半減期を短縮することに関係している血漿中の尿毒症性の溶質を伴って貧血に貢献する、（Ｎａｎｇａｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ２００６，２６：２６１−２６８）。失血に二次的な尿毒症の慢性の炎症および鉄分欠乏症または透析も、ＣＫＤの貧血に貢献し得る。当デ−タは腎臓でＥＰＯを発現する細胞は、ｍＲＮＡおよびタンパク質が明らかに組織に存在する際に、破壊されること、および制御されたＥＰＯ機能を発現する細胞は全てのＣＫＤおよび非ＣＫＤの腎臓の腫から増殖されたという仮説に対する証拠を提供する自己免疫性の糸球体腎炎（ＨＫ２０）を有するヒトＣＫＤの種は、組織レベルで大幅に低いＥＰＯ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を有し、培養物中で全体的に弱い発現も示したことに注目すべきである。培養物中での糸球体細胞の非存在を総合すれば、自己免疫疾病に二次的に発達するＣＫＤは、成分として糸球体または内分泌細胞を必要とする自己の細胞に基づく治療のために良い標的の疾病状態ではない可能性がある。
要約すると、これらの研究は治療に有効な細胞を、腎機能を安定化し、ＣＫＤの末期モデルでの進行を遅らせるために、単離し、拡張し、および慢性的に損傷される腎臓実質へ移植することを提案する。大きな動物およびヒトＣＫＤ種へのＮＫ−ＣＥＬＬ単離の成功した適用は、当該のアプロ−チの翻訳可能な性質を強調した。進行型の線維症および複合の基礎代謝疾病に関わらず、ＣＫＤの処置のための自己の再生医薬の戦略を確立するために必要とされ得る「構成要素」へのアクセスを提供しながら、尿細管のポケット、内分泌、集合管、および糸球体細胞は、ＣＫＤに由来する組織内に存続した。これらの研究によって熟考される再生医薬の治療は、腎臓機能を保存し、長期の透析の合併症を患うＣＫＤを有する多くの患者の寿命を延ばし、臓器提供の不足および遅延に対処するために有望である。
実施例１９−機能的なＮＫＡ原型の単離は、年齢に依存しない。
当該の研究は、ネオ腎臓の増大細胞原型が、成体のげっ歯類の腎臓から取得され得るか否かを判定した。
成体のげっ歯類ＮＫＡ細胞調製（ＲＫ１０２、ＲＫ１０５）は、成体のラット腎臓（年齢３ヶ月以上）から、ラット細胞単離および培養の惹起のための標準の施術を用いて確立した。全てのフラスコを３日間培養した。２１％（大気中の）酸素条件での最初の２日の後に、培地を変更し、フラスコは、追加で２４時間、２％の酸素に設定した酸素で制御されるインキュベ−タに再配置した。細胞は次に標準の酸素を収集する施術を使用して収集した。ステップ勾配は、標準の施術に従って調製し、培養物を、収集し、ステップ勾配に加えた。結果生じたバンドは年齢２週間（若年）の腎臓組織か生成される調製と分布および頻度において類似していた（図１２６、表２３を参照されたい）。遺伝子の発現様式は、成体に由来するＮＫＡ原型と若年に由来するＮＫＡ原型間でどうとうであり、エリスロポエチン、ネフリン、ポドシン、キュビリン、およびＣｙｐの遺伝子の発現様式を検査して、Ｂ２特異性およびＢ４特異性の細胞型の予期された濃縮があった（図１２７を参照されたい）。
ＲＫ０９１のＮＫＡ細胞調製は、ラット細胞の単離および培養の惹起のための標準の施術を使用して、末期の慢性的に疾病した（５／６の腎摘出の）成体のげっ歯類の腎臓レムナントから生成した。２１％（大気中の）酸素条件での最初の２日の後に、フラスコを追加で２４時間、２％の酸素に設定された酸素で制御されるインキュベ−タに再配置した（図１２８）。細胞は、次に標準の酵素収集施術を使用して収集した。密度のステップ勾配は、当該の培養に適用されなかったが、特定の「Ｂ２」および「Ｂ４」遺伝子の発現（Ｃｙｐ、ＥＰＯ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン、およびＶＥＧＦＡ等）は、既知のＢ２およびＢ４の特定の細胞型が培養物中で単離し、増殖したことを実証した。（図１２９）
ＮＫＡの細胞調製は、並行して、若年（年齢２週間）または成体（年齢３．５ヶ月）のオスのＬｅｗｉｓラットから調製した。標準の培養物養生およびステップ勾配の施術の後、各調製から単離した「Ｂ２」分画を貧血性／尿毒症性の（２ステップ５／６の腎摘出術によりＣＲＬで生成される）メスのＬｅｗｉｓラットに移植した。クリアチニンおよびＢＵＮのベ−スライン値は、移植の前週、および処置後１６週間、２週間おきに測定した（図１３０および１３１を参照されたい）。
上の結果は、成体のげっ歯類の腎臓で、若年の腎臓に由来する培養物を用いる同一の培養戦略およびステップ勾配技術を使用して、「Ｂ２」で発見された尿細管細胞を「Ｂ４」細胞集団で発見された特定の特殊化した細胞（エリスロポエチンを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞）から分離することができることを示す。「Ｂ４」の特定の特殊化した細胞（ＥＰＯを産生物、血管、および糸球体）は、成体のげっ歯類「Ｂ４」バンドで、予測された密度で存在した。上記に示されるように、末期の動物から取得された成体のげっ歯類の腎臓からＮＫＡ細胞（尿細管およびＥＰＯ産生物）を取得することができる。若年および成体に由来するＮＫＡ「Ｂ２」細胞の双方は、疾病の発症後、尿毒症の確立されたモデルへ移植した際に（２ステップの５／６のＮｘ）、腎機能の安定化を送達した。
実施例２０−治療に関連する腎臓の生理活性細胞集団の遺伝子の特性
腎臓組織から単離し、拡張した腎細胞の特定の亜集団の不偏の遺伝子型の組成物を判定するため、遺伝子整列および定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）解析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）を、細胞の細分画の中で、差分次的な細胞型の特異性および経路の特異性遺伝子発現様式を同定するために用いた。
腎細胞未分画の不均一な混合物の単離および一次的培養は、上記に説明した（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ ｅｔ ａｌ．，２００８）続いて、標準の密度の勾配方法論、細胞の細分画を生成するために使用し、次に特定の生物学的な活性および表現型の特性に基づいて特徴付けた。最終的に、「Ｂ２」および「Ｂ４」と名付けられる２つの特定の細分画が、メスのＬｅｗｉｓラットで２ステップの５／６のＮｘ術により生成されるＣＫＤの進行性のモデルの腎臓内に移植した場合、単体および組み合わせで特定の治療価値があることを実証した。
細胞および細胞培養物の条件：
オスのＬｅｗｉｓラットの腎臓細胞で確立された不均一な培養物は、実施例８に従って分画した。勾配の分画前に、腎細胞は５％のＦＢＳ、２．５μｇのＥＧＦ、２５ｍｇのＢＰＥ（ウシ下垂体抽出物）、１培のＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／ナトリウム亜セレン酸塩培地補充）、抗生物質／抗真菌薬（ＭＦＲ）を含む、５０：５０の高グルコ−スで培養し、３７℃で、湿度および酸素分圧の標準化された条件の下、培養した。結果として生じた細分画（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、およびペレット）は、発現解析のためＲＮＡを取得するため採取し、次にインビボで生物学的機能を評価するため、尿毒症性のラットへ移植した。
材料および方法：
マイクロアレイプラットフォ−ム：Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｒａｔ Ｇｅｎｏｍｅ ２３０ ２．０ Ａｒｒａｙ；契約した施設：Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ；検証方法：ＡＢＩ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ７３００定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）解析：ＲＮＡ単離：Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ｃＤＮＡ合成：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｖｉｌｏ ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ；プライマ−およびプロ−ブ：ＡＢＩ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑｍａｎ ａｓｓａｙｓ（プライマ−およびプロ−ブのセットを「一覧にした」）
手順：
・細画分施術後、すぐに細胞の細分画からＲＮＡを単離し定量化する（表２４〜２５）。
正規化（２μｇ）したＲＮＡ試料のＡｆｆｙｍａｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ ａｒｒａｙ 解析を行う（デ−タ示さず）。
・ｐ値および倍数変化の有意性に基づいて、差次的に発現した遺伝子を選択する（デ−タ示さず）。
・差次的に発現した遺伝子を分類するために、Ｄａｖｉｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ割当（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を使用する（デ−タ示さず）。
・定量的リアルタイムＰＣＲで特定の細分画のマイクロアレイを検証するため、Ｌｅｗｉｓラットの細胞調製、正常なヒト腎臓の細胞調製、およびヒト慢性腎臓疾患の細胞調製から生成される遺伝子を選択する。（表２７）
表２４．培養条件および勾配の負荷
結果：
分画（Ｂ１〜Ｂ４）および／または勾配前の間の差次的な発現は、次の厳密な条件の下で判定した。：有意性の双方の判断基準に合う、表に収載された遺伝子：ｐ値が０．０５未満で畳み変化が−０．５より小さいか、０．５より大きい。未だ割り当てられていない遺伝子アレイオリゴヌクレオチド（オリゴ）に相当する遺伝子名／説明なしの、プロ−ブのセットＩＤ（以前：１３９５８１０＿で｜−−−｜−−−）。これらのオリゴは、Ａｆｆｙｍａｔｒｉｘの「Ｎｅｔａｆｆｘ」のウェブペ−ジｈｔｔｐｓ：／ｗｗｗ．ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／ｎｅｔａｆｆｘを通して選択され、遺伝子割当のための確率を取得するためにＮＣＢＩゲノムデ−タベ−スに対してブラストした。
勾配前と勾配後（Ｂ１〜Ｂ４）の間で差次的に発現した（上／下）遺伝子の要約を、下記の表２６に示す。遺伝子発現の違いを判定するための選択判断基準：細胞集団で、０．５以上の絶対倍数変化で、Ｔテストｐ値が、０．０５以下である。例えば、下記の表２６に示すように、勾配前とＢ１の違いは、勾配前から、１６５個の差次的に発現された遺伝子があり、３２個はＢ１で上昇し、１３３個はＢ１で下がったことである。これらの細胞集団の間での発現の違いを表す遺伝子を判定した。
討論
本報告は、密度勾配の単離によって当該の事例で生成される特定の生理活性の腎細胞の亜集団の遺伝子の特性について説明する。マイクロアレイ解析は、別の試料と比べる１つの試料で、正常化された信号強度の発現レベルを判定するための不偏のアプロ−チを表す（デ−タ示さず）。クラスタ−解析およびＴｒｅｅｖｉｅｗ 処理はさらに、多数の試料のわたる遺伝子発現の強度および様式の視覚化を可能にする（デ−タ示さず）。本報告書で検査された細胞分画は、インビボで広範に研究されている（Ｌｅｗｉｓラットのオスのドナ−をＬｅｗｉｓラットのメスのＣＫＤレシピエントへ（Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００９））。全体の生命体の改善（すなわち、生存、体重増加）、血清学的特性、および組織学的エビデンスは、単体で疾病した腎臓へ移植された際、分画Ｂ４がインビボで提供される治療効果は限定されるが、最高の治療的関連性を有する細胞分画として圧倒的にＢ２を支持する。
経過観察の部分的要因のインビボ研究は、Ｂ２およびＢ４の組み合わせは、Ｂ２単体の利点を上回るということを示した。本マイクロアレイ研究は、Ｄａｖｉｄ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ フリ−ウェアを通した遺伝子分類を含むＢ２とＢ４の違いを強調して全ての細胞分画間の違いを発見した（デ−タ示さず）。興味深いことに、Ｂ２およびＢ４間で異なって発現した遺伝子は、これらの群の中から、大きなｐ値を伴って（０．０５以下のｐｖ）、３３個の異なる機能的な群および１３６個のアノテ−ションを表現した。アレイは、７つの異なるＤａｖｉｄ（Ｇｏ）遺伝子アノテ−ション分類を表す選択された遺伝子のパネルを使用して、定量的リアルタイムＰＣＲによって検証された（デ−タ示さず）。著しいことに、げっ歯類を検証するために選択された遺伝子は、正常なヒトおよびヒトＣＫＤの双方へ翻訳した（表２７を参照されたい）。遺伝子アレイ解析では典型的であるが、細分画の全ての意図されるマ−カ−がタンパク質レベルで検証されるまで、解釈には慎重にならなければならない。さらに、いずれの珍しい細分画の成分も遺伝子解析を使用して検出されないようであり、細胞あたりの基盤で識別する方法を用いて、独立的に探究されなければならない。
結論として、マイクロアレイ解析は、特定の機能および特性を有する腎細胞を細分画へ分離する有効な方法として密度勾配の分離を検証した。階層的クラスタ−解析は、各細分画は、他の全てのものおよび細胞集団を開始する勾配前と異なっていることを実証した。上記に示すように、未分画細胞の発現様式は、Ｂ２細分画で最も多く発見され、不均一な培養物ならびにＢ２の細分画を含む尿細管および集合管細胞の高い頻度（約８０％）によるものであり得る。また、予期されるように、遺伝子発現での大きな違いは、密度勾配の第１と最後の分画間で発生する（Ｂ１対Ｂ４）。
全ての群間のクラスタ−解析（多数の群の比較に基づいて、Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌａｃｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）およびＴ−ｔｅｓｔ比較は、勾配で分画Ｂ１〜Ｂ２はＢ３〜Ｂ４から分離するということを提案するＢ２の分画は、主に不均一な培養での最も豊富な細胞からなり（尿細管および集合管）、Ｂ４の画分が成長および発達、特に血管の発達を制御する因子で重度に濃縮される一方で、他の細胞型のトレ−ス量だけが、当該の画分に存在する。特に、Ｂ１およびＢ３の分画は、Ｂ２分画の治療価値を相殺し得る免疫性／炎症性の要素を含む。Ｂ２とＢ４間で観察されるマイクロアレイの遺伝子発現の違いは、１３／１３のげっ歯類のマ−カ−によって検証された。げっ歯類の細胞分画および遺伝子発現は、試験された９０％を越えるマ−カ−で、正常およびＣＫＤのヒトの種へ強く翻訳する。上記のデ−タは、ヒトのＣＫＤ組織が構築上欠乏しているという提案を支持するが、ほとんどの細胞型生存可能に存在し、エクスビボで繁殖可能である。
実施例２１−Ｂ２によるヒアルロン酸合成
驚くことに、ＨＡＳ−２（高分子ヒアルロン酸（ＨＡ）の合成に関与するヒアルロン酸合成酵素の種）は、移植前にインビトロで、Ｂ２の細胞調製によって産生され、より低い程度でＢ４の細胞調製によって産生された。図１３２は、Ｂ２およびＢ４によるＨＡＳのインビトロでの発現を示す。図１３２に示されるように、インビトロでのヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ）の優勢の発現は、Ｂ４細胞調製中に検出可能な発現もあったが、Ｂ２細胞調製中であった。
ＨＡＳ ｍＲＮＡおよびタンパク質のインビボでの発現は、図１３３に示す。図１３３に示すように、５／６のＮｘの慢性腎不全のげっ歯類へのＢ２細胞の移植は、ＨＡＳ−２の上方制御を遺伝子レベル（定量的リアルタイムＰＣＲ、底部のグラフ）およびタンパク質レベル（最上部の図、ウエスタンブロット）で、Ｎｘの未処置の組織と比較される処置された組織で生成した。
実施例２２−代謝疾病のモデルでのネオ腎臓増大の評価のための研究計画
本研究の目的は、慢性進行性腎不全を有するＺＳＦ１の代謝疾病のげっ歯類モデルで、ネオ腎臓（ＮＫ）原型（すなわち、細胞調製または細胞集団）を評価することである。肥満のＺＳＦ１ラット種は、メタボリックシンドロ−ムの幅広く使用されたモデルを表現し、多数の関連疾患を特徴とする。多数の関連疾患は、過食症、肥満症、高血圧、重度の脂質異常症、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、左室機能不全、および二次進行性腎症を含む。肥満のＺＳＦ１ラットは、約５０％の１年間内の死亡率および末期の腎臓疾患およびうっ血性心不全による典型的な死亡を有する。肥満のＺＳＦ１種は、痩せたＺＤＦｘＳＨＨＦ−ｆａ／ｆａｃｐＦ１子孫（ＺＳＦ１）を生成するため、痩せたオスの自発的ＨＴＮ（高血圧）心不全（ＳＨＨＦ／Ｍｃｃ−ｆａｃｐ、＋／ｆａ）のラットと交配される痩せたメスのズッカ−糖尿病肥満（ＺＤＦ＋／ｆａ）のラットに由来する；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ＺＳＦ１−Ｌｅｐｒｆａ ＬｅｐｒＣｐ。各親種は、異なるレプチン受容体変異を有した（ｆａおよびｆａｃｐ；ｃｐ，「肥満型」遺伝子の変異）。ＺＳＦ１の子孫は、複合型の子孫を優れた移植にし、ヒト細胞および組織移植で適合する生体関連のドナ−シナリオに類似する、同一のＭＨＣ二型ハプロタイプを有する。
ＺＳＦ１を含む、ズッカ−に由来する動物種は、広範囲にわたって研究されており、（Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６５：２２５−３２；Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９３：Ｆ１６０５−１３；Ｈａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４８：１９９５−２０００；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２９９：９７８−８７；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１３５−４２；Ｒａｆｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．５７：１４３４−４４；Ｒｅｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｆｕｎｄａｍ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８：４３７−４７；Ｔｏｆｏｖｉｃ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，２００３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．８６：２９−４６；Ｔｏｆｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ Ｒｅｎ Ｆａｉｌ．２３：１５９−７３；Ｕｈｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｋｉｄｎｅｙ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓ Ｒｅｓ．２５：７１−９．）の文献にて詳細に説明される。ＺＳＦ１種は、肥満症およびＮＩＤＤＭを含む腎臓疾患の危険因子を評価するために前臨床研究で使用されている。
ＺＳＦ１ラットへのＮＫ原型の送達のための提案された戦略は、次の細胞単離および送達の戦略に基づく。簡単に説明すると、ラットは、試験モデルを提供するために２ステップの５／６の腎摘出術を通じて、尿毒症および貧血症を与えられる。ＮＫＡ細胞の原型に由来する痩せたまたは肥満症のどちらか一方のＺＳＦ１ドナ−ラットは、送達培養液および送達された腎臓内で、懸濁される。動物の手術前後の評価は、それらが施術から回復する時点中に行われる。健康な機能および腎臓機能は、半ヶ月毎に、血清化学的検査、検尿、血圧、生存、および体重増加を通して、送達時から（年齢約３ヶ月）１歳までモニタリングされる。測定されるパラメ−タは、血清クレアチニン、血中尿素窒素、総タンパク、ならびにＡ／Ｇ割合、コレステロ−ルおよびトリグリセリド、血清ナトリウム、亜リン酸およびカルシウム、ならびにヘマトクリットを含む。屠殺時（移植後６〜９ヶ月）に、腎臓、骨髄、肝臓、肺、脾臓および心臓の病理組織学的な解析が行われる。低タンパク質食事制限および標準治療の薬理的療法（血圧調節、グルコ−ス長調節）は、ヒトおよび実験動物（ズッカ−に由来するラット種）で、代謝疾病に二次的な腎不全の進行を遅らせ得ることが示されるように、他の研究はこれらの対症的な処置の間、ＮＫＡの原型＋／−の性能の検査を行い得る。付加的な研究の手順は、生命および生存の動物の質を拡張するため食事性および／または薬理学性の介入を用いるか、用いない以後の処置介入（再介入）を評価し得る。
代謝疾病のラット種（ズッカ−、ＺＤＦ、およびＳＨＨＦ）に関して、ＺＳＦ１モデルは、時宜に即して（ＮＫＡ原型送達の約６ヶ月後）、ＮＫＡ治療の評価を可能にするために十分重度である疾病状態（Ｔｏｆｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｒｅｎ Ｆａｉｌ．２２：３８７−４０６；Ｖｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．７：１１３−７）を伴って、ヒトの肥満症およびＮＩＤＤＭに共通する特性を示す。ＺＳＦ１ラットは、インスリン抵抗および結果としての高血糖症、肥満症、重度の脂質異常症、血圧の大幅な上昇、末期の腎不全、心肥大ならびに寿命の短縮（Ｔｏｆｏｖｉｃ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ，２００３ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．８６：２９−４６）を含む、顕著な症状を発達させた。ＺＳＦ１前駆体のラット種の疾病特性は、表２８に収載する（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）。
ＺＳＦ１ラット種は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ（ＣＲＬ）を通して商業的に入手可能である。時間をかけて疾病の進行を評価するため、出版されたＺＳＦ１研究（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７（上記を参照）、Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９（上記を参照）、Ｒａｆｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．， ２００８（上記を参照）、Ｔｏｆｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， ２００１ａ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２９９：９７３−７．、Ｔｏｆｏｖｉｃ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ， ２００３（上記を参照）、Ｔｏｆｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， ２００１ｂ（上記を参照）、Ｔｏｆｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， ２０００ Ｒｅｎ Ｆａｉｌ． ２２：３８７−４０６）を通して調査を行った（ＺＳＦ１の年齢２〜４７週間）。１２週間目の５匹のＺＳＦ１ラットの最近の血液解析も、鍵と成る疾病パラメ−タの年齢に依存する進行を確認するために行った。末期の疾病および死亡へ進行は比較的にゆっくりであったが（約１年）、２０週間目までに腎機能は大幅に減少する（血清クレアチニンは、年齢８週間で０．７７ｍｇ／ｄｌから２０週間で１．４７ｍｇ／ｄｌへ２倍以上となる （Ｔｏｆｏｖｉｃ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ， ２００３（上記を参照））。
幾つかの限定が存在するが、他の代謝疾病のモデルは考慮され得る。肥満性のズッカ−モデルは多くの糖尿病の症状を示し、しかしながら、これらのラットは正常圧であり、より重要なことに、免疫抑制的な治療の随伴的な使用なしで、移植モデルとして適さない可能性のある非近交種である。ズッカ−に由来するＺＤＦモデルは、ＮＩＤＤＭのインスリン抵抗および高血糖にしばしば関連する腎症および軽度の高血圧等の症状を含む糖尿病疾病をより多く表す近交種のモデルである。しかしながら、当該のモデルは自発性の重度の水腎症の高い発生率により腎臓内移植の戦略のために適していない可能性がある （Ｖｏｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９６（上記を参照））。自然発症高血圧心不全（ＳＨＨＦ）：当該のラット種はＺＳＦ１と類似の代謝状態を有する。しかしながら、ＳＨＨＦは、比較的に軽度な腎症を特徴とし、ＺＳＦ１複合型と比較して、末期の腎不全へ穏やかな進行をもたらす。
腎臓疾患のＺＳＦ１の代謝モデルは、次の理由によって腎不全のインビボ研究に好適である。：モデルに関する前例の文献、モデルが商業的に入手可能であることおよびその再現性、ならびに同形ドナ−のアプロ−チへのモデルの適合性。加えて、このモデルは、ＳＨＨＦが糖尿病を発達させず、ＺＤＦのモデルは重度の水腎症傾向を示すため、ＳＨＨＦおよびＺＤＦの親種よりも有利である。腎臓疾患の重度はまた親種と比較して肥満症のＺＳＦ１でより大きい。現在の治療では腎臓移植以外には、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を治癒し得るものがない。既存の治療の全て（食事制限調整、薬理学的介入）の治療は、不可逆性の腎臓障害によって定義される、有限の期間で対症的である。本手順は、メタボリックシンドロ−ムに二次的なヒトＣＫＤの実験的なモデルでの細ＮＫＡ胞原型の評価を可能にする。一次の目的は、腎臓疾患の進行中に、ＮＫＡの送達を試験するものである（軽度、中度、および重度のＣＫＤ）。
付加的な研究によって、初回の処置効果の耐久性を拡張する可能性のある以後の付加的な腎細胞移植術を考慮し得る。腎細胞の移植を伴う再介入は、食事調整および薬理学的介入を伴う可能性がある。自己原因の戦略は、ＺＳＦモデルでの今後の研究で考慮され得る。双方のＺＳＦの近交親種または、ＺＤＦを生じていた非近交種への生成に戻った理論において、ズッカ−ラットは、進行型のＣＫＤまたは末期の腎臓疾患（ＥＳＲＤ）を有するＺＳＦ１への腎臓組織の同種のドナ−供給源として使用され得る。
標準治療投与計画および／または低カロリ−（脂質、タンパク質、糖分）、低塩の食事制限は、本研究および／または経過観察の研究手順中に生命体が後期の腎臓疾患（すなわちＥＳＲＤ）に突入した際に、ＺＳＦ１モデルでＮＫＡの評価を伴う可能性がある。
アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）およびアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（カプトプリルまたはペリンドプリル等）を含むレニンアンジオテンシン系（ＲＡＳ）治療は、ヒトで定期的に使用され、ズッカ−ラットで有効であることを示している降圧薬の類を表す ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA （Ｄｕａｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９（上記を参照）、Ｔｏｆｏｖｉｃ ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ， ２００３（上記を参照）、Ｕｈｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２（上記を参照））。ＲｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅまたはＴｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ等のインスリン感作薬を、ヒトでのインスリン媒介の細胞グルコ−スの取り込みを向上させるために定期的に使用し、ズッカ−ラットで有効であることを示している （Ｈａｒｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９（上記を参照）、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５（上記を参照））。コレステロ−ル合成を制御するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であるスタチンは、脂質異常症を治療するために使用される薬剤の多岐にわたって使用される類である （Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９９（上記を参照））。表２９は、患者の服薬順守とつり合う食事性のスペクトルおよび薬理的療法にわたって管理される代表的なマトリックスされた痩せたラットに由来するＮＫＡ細胞および肥満症のラットに由来するＮＫＡ細胞の双方を試験するために提案されるアプロ−チを説明する。
実施例２３−免疫抑制の研究計画
免疫抑制の研究計画を使用して、非自己供給源からインビボで性能するＮＫＡ原型を評価し得る。経管栄養による毎日のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、経管栄養（２番目の選択）による毎日のタクロリムス（Ｔａｃ）（０．２ｍｇ／ｋｇ）、経管栄養（一番目に選択）による毎日のラパマイシン（Ｒａｐａ）（１ｍｇ／ｋｇ）、および経管栄養による毎日のミコフェノ−ル酸モフェチル（ＭＭＦ）（１０ｍｇ／ｋｇ）を含む様々な免疫抑制療法を利用可能である。（Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００３年５月１８日 Ｓｕｐｐｌ１：ｉ１６−２０）。耐性基盤の免疫抑制療法も、耐性に対しトレンドへ移植する１２日前にドナ−の特定の輸血が行われる際に実行し得る（小柴 Ｔ，Ｌｉ Ｙ，竹村 Ｍ，Ｗｕ Ｙ，坂口 Ｓ，湊 Ｎ，Ｗｏｏｄ ＫＪ，羽賀 Ｈ，上田 Ｍ，上本 Ｓ．Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｍｍｕｎｔｏｌ ２００７年２月１７日（２）９４−７；Ｊｏｖａｎｏｖｉｃ Ｖ，Ｌａｉｒ Ｄ，Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ ＪＰ，Ｂｒｏｕａｒｄ Ｓ． Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ．２００８年３月２１日（３）１９９−２０６．Ｅｐｕｂ ２００７年１２月５日 Ｒｅｖｉｅｗ）。
ＮＫＡ原型の投与には幾つかのラットモデルが使用可能である。１つのモデルは、ラット種Ｗｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈ（ＷＦ）（強い組織適合性）への近交系ラット種ＤＡ（ｄはｄ血液群、Ａはアグ−チ）ドナ−を使用する同種移植するモデルである。
１．ＭＨＣの互換性の対：Ｌｅｗｉｓラット種（ＬＥＷ）へのＦｉｓｈｅｒラット種（Ｆ３４４）
２．ＺＳＦラット：
ａ．自然発症高血圧ｓｈｈｆ（重度の高血圧および心不全）ラット および ズッカ−糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットの第１の生成（Ｆ１）子孫から生成される。
ｉ．肥満性、糖尿病性、高血圧性のタンパク尿。
ｉｉ．ＺＤＦおよびＳＨＨＦの子孫は同腹仔で同系である
半分の子孫は肥満症および疾病を有し、他の半分は痩せている
ｉｉｉ．Ｆ１子孫は、親ＳＨＨＦおよびＺＤＦ種から移植を受けることができる。
３．同種のドナ−選択肢
ａ．本来の痩せたズッカ−糖尿病肥満ラット（ＺＦ）−非近交種
ｂ．ＺＦの親種−Ｗｉｓｔａｒ
４．ＲＴ１．ＢおよびＲＴ１．Ｄで試験するＺＳＦ１およびＳＨＨＦ（Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏ Ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｌａｓｓ ＩＩ アッセイ）
ａ．ＺＳＦ１−−Ｌ／Ｋハプロタイプ
ｂ．ＳＨＨＦ−Ｋハプロタイプ
実験デザイン
方法論−注射可能な細胞
１．対照および自己のア−ム
ａ．ＺＳＦ移植なし；免疫抑制なし（ｎ＝３）−純粋な対照
ｂ．ＺＳＦ移植なし；免疫抑制あり（ｎ＝３）−中度の効果
ｃ．空の媒体を有するＺＳＦ：免疫抑制あり（ｎ＝３）−中度の効果および媒体影響
ｄ．ＺＳＦからＺＳＦ；免疫抑制なし（ｎ＝５）−細胞効果、中間成分なし
ｅ．ＺＳＦからＺＳＦ；免疫抑制あり（ｎ＝５）−施術に中度の効果
２．同種移植の実験
ａ．ＷｉｓｔａｒからＺＳＦ（または痩せたズッカ−からＺＳＦ）；免疫抑制あり（ｎ＝５）−同種移植モデルに中度の効果
ｂ．１つ以上の次の免疫抑制療法は、同種細胞の送達と共に実行された：
ｉ．経管栄養による毎日のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（１０ｍｇ／ｋｇ）
ｉｉ．経管栄養（２番目の選択）による毎日のタクロリムス（Ｔａｃ）（０．２ｍｇ／ｋｇ）
ｉｉｉ．経管栄養（一番目に選択）による毎日のラパマイシン（Ｒａｐａ）（１ｍｇ／ｋｇ）
ｉｖ．経管栄養による毎日のミコフェノ−ル酸モフェチル（ＭＭＦ）（１０ｍｇ／ｋｇ）
実験デザイン
方法論−注射可能な細胞
１．対照および自己のア−ム
ａ．ＺＳＦ移植なし；免疫抑制なし（ｎ＝３）−純粋な対照
ｂ．ＺＳＦ移植なし；免疫抑制あり（ｎ＝３）−中度の効果
ｃ．空の媒体を有するＺＳＦ：免疫抑制あり（ｎ＝３）−中度の効果および媒体影響
ｄ．ＺＳＦからＺＳＦ；免疫抑制なし（ｎ＝５）−細胞効果、中間成分なし
ｅ．ＺＳＦからＺＳＦ；免疫抑制あり（ｎ＝５）−施術に中度の効果
２．同種移植の実験
ａ．ＷｉｓｔａｒからＺＳＦ（または痩せたズッカ−からＺＳＦ）；免疫抑制あり（ｎ＝５）−同種移植モデルに中度の効果
ｂ．１つ以上の次の免疫抑制療法は、同種細胞の送達と共に実行された：
ｉ．経管栄養による毎日のシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（１０ｍｇ／ｋｇ）
ｉｉ．経管栄養（２番目の選択）による毎日のタクロリムス（Ｔａｃ）（０．２ｍｇ／ｋｇ）
ｉｉｉ．経管栄養（一番目に選択）による毎日のラパマイシン（Ｒａｐａ）（１ｍｇ／ｋｇ）
ｉｖ．経管栄養による毎日のミコフェノ−ル酸モフェチル（ＭＭＦ）（１０ｍｇ／ｋｇ）
＜本発明の更なる実施態様＞
［実施態様１］
１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む、第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、ヒト腎細胞の混合物であって、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、混合物。
［実施態様２］
Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様３］
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様４］
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様５］
前記細胞の混合物は、受容体介在性のアルブミン取り込みができる、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様６］
前記細胞の混合物は、酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ができる、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様７］
前記混合物は、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生するおよび／またはその産生を刺激することができるＨＡＳ−２を発現する細胞を含有する、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様８］
前記混合物は、インビボでの送達の際、再生刺激を提供することができる、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様９］
前記混合物は、インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様１０］
前記第１および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様１１］
Ｂ２は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、実施態様１に記載の混合物。
［実施態様１２］
Ｂ２細胞集団を含むヒト腎細胞の単離された、濃縮された集団であって、Ｂ２は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含み、濃縮された集団は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含むＢ４細胞集団を含まない、単離された、濃縮された集団。
［実施態様１３］
前記Ｂ２細胞集団は、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素−２）の発現を介して、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができる、実施態様１に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１４］
集合管上皮細胞をさらに含む、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１５］
受容体介在性のアルブミン取り込みができる、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１６］
インビボでの送達の際に、再生刺激を提供することができる、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１７］
インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１８］
腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様１９］
メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様２０］
約１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む前記Ｂ３細胞集団を含まない、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様２１］
約１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、実施態様１２に記載のＢ２細胞集団。
［実施態様２２］
ヒトＢ２細胞集団を調製する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
ｃ）前記Ｂ２細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
［実施態様２３］
前記Ｂ２細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合の尿細管細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
ヒトＢ４細胞集団を調製する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
ｃ）前記Ｂ４細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
［実施態様２５］
前記Ｂ４細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞、非血管細胞、および非糸球体細胞を含む、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
Ｂ４細胞調製物を生成する方法であって、
ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
ｂ）前記細胞懸濁液をフロ−サイトメトリ−機器に適用することと、
ｃ）血管、糸球体、および内分泌細胞マ−カ−を使用して、前記細胞集団から細胞の亜集団を選択することと、
ｄ）前記細胞集団から細胞の亜集団を選別することと、
ｅ）前記細胞集団から前記Ｂ４細胞の亜集団を単離することと、を含み、
前記Ｂ４細胞の亜集団は、前記集団の大部分と比較して、前記血管、前記糸球体、および前記内分泌細胞マ−カ−の発現を特徴とする、方法。
［実施態様２７］
腎機能の改善を必要としている対象に移植するための構造体であって、
ａ）１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料と、
ｂ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、哺乳動物腎細胞の混合物と、を含み、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、構造体。
［実施態様２８］
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様２９］
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３０］
前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３１］
前記生体材料は、前記混合物の捕捉および／または付着に適した三次元（３−Ｄ）の多孔性生体材料として構成される、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３２］
前記生体材料は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、懸濁させる、または被覆することに適した液体または半流動体ゲルとして構成される、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３３］
前記生体材料は、ハイドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）の主に高分子量の種を含む、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３４］
前記生体材料は、多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸の主に高分子量の種を含む、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３５］
前記生体材料は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの細孔を有するポリ乳酸系の発泡体を含む、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３６］
前記細胞集団は、自己腎臓試料に由来する、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３７］
前記試料は腎生検である、実施態様３６に記載の構造体。
［実施態様３８］
前記細胞集団は、非自己腎臓試料に由来する、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様３９］
前記改善された腎機能は赤血球恒常性である、実施態様２７に記載の構造体。
［実施態様４０］
必要としている対象における腎臓疾患の治療に使用するための組成物であって、
ａ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む哺乳動物腎細胞の混合物を含む組成物を、前記対象に投与することであって、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、投与することと、
ｂ）腎機能の指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを、前記対象からの試験試料において判定することであって、指標レベルの前記差異は、前記対象の１つ以上の腎機能の低下の減少、安定化、または改善を示すことと、を含む、方法。
［実施態様４１］
前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様４２］
前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様４３］
前記腎臓疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏症を伴う、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様４４］
前記ＥＰＯ欠乏症は貧血である、実施態様４３に記載の組成物。
［実施態様４５］
前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は前記対象において腎不全に二次的に発生する、実施態様４３に記載の組成物。
［実施態様４６］
前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏症、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄癌、ＨＩＶ感染、肝臓疾患、心不全、リウマチ性関節炎、または多臓器系不全からなる群から選択される疾患に二次的に発生する、実施態様４３に記載の組成物。
［実施態様４７］
前記組成物は、１つ以上の生体適合性合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料をさらに含み、前記混合物は、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様４８］
前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養された哺乳動物腎臓細胞に由来する、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様４９］
前記混合物は自己腎臓試料に由来する、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様５０］
前記試料は腎生検である、実施態様４９に記載の組成物。
［実施態様５１］
前記混合物は非自己腎臓試料に由来する、実施態様４０に記載の組成物。
［実施態様５２］
１２〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）少なくとも１つの尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする腎臓の尿細管の細胞集団を含み、（ｉｉｉ）受容体介在性アルブミン輸送ができる腎臓の尿細管細胞の亜集団を含み、（ｉｖ）１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、（ｖ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができる、腎細胞の選択された集団。
［実施態様５３］
１２時間〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）を発現する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含み、（ｉｉｉ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができ、（ｉｖ）同時投与の際に、実施態様５２に記載の腎細胞の集団によって１つ以上の腎機能の前記調節を増強することができる、腎細胞の選択された集団。

Claims (53)

  1. １．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む、第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、ヒト腎細胞の混合物であって、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、混合物。
  2. Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む、請求項１に記載の混合物。
  3. 前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項１に記載の混合物。
  4. 前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項１に記載の混合物。
  5. 前記細胞の混合物は、受容体介在性のアルブミン取り込みができる、請求項１に記載の混合物。
  6. 前記細胞の混合物は、酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ができる、請求項１に記載の混合物。
  7. 前記混合物は、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生するおよび／またはその産生を刺激することができるＨＡＳ−２を発現する細胞を含有する、請求項１に記載の混合物。
  8. 前記混合物は、インビボでの送達の際、再生刺激を提供することができる、請求項１に記載の混合物。
  9. 前記混合物は、インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、請求項１に記載の混合物。
  10. 前記第１および第２の細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項１に記載の混合物。
  11. Ｂ２は、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、請求項１に記載の混合物。
  12. Ｂ２細胞集団を含むヒト腎細胞の単離された、濃縮された集団であって、Ｂ２は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含み、濃縮された集団は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含むＢ４細胞集団を含まない、単離された、濃縮された集団。
  13. 前記Ｂ２細胞集団は、ＨＡＳ−２（ヒアルロン酸合成酵素−２）の発現を介して、インビトロおよびインビボの双方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種を産生する、および／またはその産生を刺激することができる、請求項１に記載のＢ２細胞集団。
  14. 集合管上皮細胞をさらに含む、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  15. 受容体介在性のアルブミン取り込みができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  16. インビボでの送達の際に、再生刺激を提供することができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  17. インビボでの送達の際に、糸球体ろ過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減少させるか、安定化させるか、または改善することができる、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  18. 腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  19. メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３ ２５−ヒドロキシラ−ゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、メンバ−ＲＡＳ癌遺伝子ファミリ−（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤ領域を含有するイオン輸送レギュレ−タ−４（Ｆｘｙｄ４）、溶質輸送体ファミリ−９（ナトリウム／水素交換体）、メンバ−４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリ−、メンバ−Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリ−、メンバ−Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）からなる群から選択される尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  20. 約１．０５２ｇ／ｍＬ〜約１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む前記Ｂ３細胞集団を含まない、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  21. 約１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、請求項１２に記載のＢ２細胞集団。
  22. ヒトＢ２細胞集団を調製する方法であって、
    ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
    ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
    ｃ）前記Ｂ２細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
  23. 前記Ｂ２細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合の尿細管細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ヒトＢ４細胞集団を調製する方法であって、
    ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
    ｂ）１つ以上の細胞分画を分離するために、前記細胞懸濁液を密度勾配に接触させることであって、第１の細胞分画は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの間の特定の密度で、遠心分離後の前記勾配中に存在する、接触させることと、
    ｃ）前記Ｂ４細胞集団を含む第１の細胞分画を抽出することと、を含む、方法。
  25. 前記Ｂ４細胞集団は、濃縮されていない細胞集団と比べた場合、より大きな割合のＥＰＯを産生する細胞、血管細胞、および糸球体細胞、ならびにより小さな割合のＥＰＯを産生しない細胞、非血管細胞、および非糸球体細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. Ｂ４細胞調製物を生成する方法であって、
    ａ）濃縮されていない不均一の腎臓細胞集団を含む細胞懸濁液を、低酸素培養条件に曝すことと、
    ｂ）前記細胞懸濁液をフロ−サイトメトリ−機器に適用することと、
    ｃ）血管、糸球体、および内分泌細胞マ−カ−を使用して、前記細胞集団から細胞の亜集団を選択することと、
    ｄ）前記細胞集団から細胞の亜集団を選別することと、
    ｅ）前記細胞集団から前記Ｂ４細胞の亜集団を単離することと、を含み、
    前記Ｂ４細胞の亜集団は、前記集団の大部分と比較して、前記血管、前記糸球体、および前記内分泌細胞マ−カ−の発現を特徴とする、方法。
  27. 腎機能の改善を必要としている対象に移植するための構造体であって、
    ａ）１つ以上の生体適合性の合成ポリマ−または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料と、
    ｂ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む、哺乳動物腎細胞の混合物と、を含み、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、構造体。
  28. 前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項２７に記載の構造体。
  29. 前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項２７に記載の構造体。
  30. 前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養腎臓細胞に由来する、請求項２７に記載の構造体。
  31. 前記生体材料は、前記混合物の捕捉および／または付着に適した三次元（３−Ｄ）の多孔性生体材料として構成される、請求項２７に記載の構造体。
  32. 前記生体材料は、哺乳動物細胞を包埋する、付着する、懸濁させる、または被覆することに適した液体または半流動体ゲルとして構成される、請求項２７に記載の構造体。
  33. 前記生体材料は、ハイドロゲル形態のヒアルロン酸（ＨＡ）の主に高分子量の種を含む、請求項２７に記載の構造体。
  34. 前記生体材料は、多孔性発泡体の形態のヒアルロン酸の主に高分子量の種を含む、請求項２７に記載の構造体。
  35. 前記生体材料は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの細孔を有するポリ乳酸系の発泡体を含む、請求項２７に記載の構造体。
  36. 前記細胞集団は、自己腎臓試料に由来する、請求項２７に記載の構造体。
  37. 前記試料は腎生検である、請求項３６に記載の構造体。
  38. 前記細胞集団は、非自己腎臓試料に由来する、請求項２７に記載の構造体。
  39. 前記改善された腎機能は赤血球恒常性である、請求項２７に記載の構造体。
  40. 必要としている対象における腎臓疾患の治療に使用するための組成物であって、
    ａ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する尿細管細胞の単離された、濃縮された集団を含む第１の細胞集団、Ｂ２と、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む第２の細胞集団と、を含む哺乳動物腎細胞の混合物を含む組成物を、前記対象に投与することであって、前記混合物は、１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まない、投与することと、
    ｂ）腎機能の指標のレベルが対照の指標レベルと比べて異なることを、前記対象からの試験試料において判定することであって、指標レベルの前記差異は、前記対象の１つ以上の腎機能の低下の減少、安定化、または改善を示すことと、を含む、方法。
  41. 前記第２の細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記第２の細胞集団は、１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項４０に記載の組成物。
  43. 前記腎臓疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏症を伴う、請求項４０に記載の組成物。
  44. 前記ＥＰＯ欠乏症は貧血である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は前記対象において腎不全に二次的に発生する、請求項４３に記載の組成物。
  46. 前記ＥＰＯ欠乏症または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏症、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄癌、ＨＩＶ感染、肝臓疾患、心不全、リウマチ性関節炎、または多臓器系不全からなる群から選択される疾患に二次的に発生する、請求項４３に記載の組成物。
  47. 前記組成物は、１つ以上の生体適合性合成ポリマ−および／または自然発生タンパク質もしくはペプチドを含む生体材料をさらに含み、前記混合物は、前記生体材料に被覆される、その上もしくは中に沈積される、その中に捕捉される、その中に懸濁される、その中に包埋される、および／または別様にそれと組み合わされる、請求項４０に記載の組成物。
  48. 前記混合物は、哺乳動物腎臓組織または培養された哺乳動物腎臓細胞に由来する、請求項４０に記載の組成物。
  49. 前記混合物は自己腎臓試料に由来する、請求項４０に記載の組成物。
  50. 前記試料は腎生検である、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記混合物は非自己腎臓試料に由来する、請求項４０に記載の組成物。
  52. １２〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）少なくとも１つの尿細管細胞マ−カ−の発現を特徴とする腎臓の尿細管の細胞集団を含み、（ｉｉｉ）受容体介在性アルブミン輸送ができる腎臓の尿細管細胞の亜集団を含み、（ｉｖ）１．０４５ｇ／ｍＬ未満の密度を有する集合管および尿細管系の大型顆粒細胞を含むＢ１細胞集団、または１．０９１ｇ／ｍＬを超える密度を有する低粒度および生存率の残骸および小細胞を含むＢ５細胞集団を含まず、（ｖ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができる、腎細胞の選択された集団。
  53. １２時間〜２４時間約１％〜約５％の酸素レベルに曝された後、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の部分を含む勾配を用いた密度勾配による遠心分離によって単離可能である、腎細胞の選択された集団であって、前記細胞集団は、（ｉ）１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度で遠心分離後に前記勾配中に保持され、（ｉｉ）酸素調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）を発現する細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含み、（ｉｉｉ）腎臓疾患の恐れのあるまたはそれを有する対象へ送達された時に、１つ以上の腎機能を調節することができ、（ｉｖ）同時投与の際に、請求項５２に記載の腎細胞の集団によって１つ以上の腎機能の前記調節を増強することができる、腎細胞の選択された集団。
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