CN108251352B - 一种血管内皮干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：第一步、制备血管内皮干细胞；第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞。本发明利用消化法制备了血管内皮干细胞，并建立了三种气体(氧气、氮气、二氧化碳)培养体系培养扩增血管内皮干细胞。该技术具有高效、经济、便捷等优点，可促使血管内皮干细胞增殖速度、状态较常规的二氧化碳培养法更佳。

Description

一种血管内皮干细胞的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种血管内皮干细胞的培养方法。
背景技术
血管内皮干细胞(endothelial stem cells，ESC)是一类具有强大促进血管生成功能的干细胞。大量实验显示，血管内皮干细胞具有极低的免疫原性，同种异体ESC在人体内不诱导针对其干细胞的免疫应答；ESC还能在体内抑制炎性细胞因子如TNF-ɑ、IFN-Y的产生，同时促进抗炎性因子如IL-4的产生，以及促进T调节细胞(Tregulatory cells)的产生等。并且ESC可以诱导分化成各种细胞组织包括血管、神经、肌肉、骨骼和多种内脏器官等。
现有的培养技术，ESC细胞培养所使用的培养基成分较多，且价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化现象，增殖效率降低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其干性与稳定性不利，影响干细胞储存与研究质量。同时，氧气的浓度对于细胞的培养起着至关重要的作用，氧气浓度是决定细胞命运的一个关键因素，并可调节应激反应标志物的表达。有实验发现，氧气浓度的改变对细胞的生长状态也将发生改变。机体内的干细胞总是集中于氧气相对少的地方。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种血管内皮干细胞的培养方法，该方法尤其适用于脐带血管内皮干细胞的培养。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：
第一步、制备血管内皮干细胞；
a、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；
b、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：
①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；
②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；
③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6-10min；
④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；
⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；
c、配制培养液；
d、培养液重悬细胞；
第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：
a、培养血管内皮干细胞；
通过充入氮气，调整O2浓度为5％、20％，CO2浓度设置为5％，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80-90％；
b、细胞消化传代；
步骤b所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；
第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；
取血管内皮干细胞，以1X103个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔；其中第一组置于5％CO2的条件下，第二组置于5％O2、5％CO2的条件下、第三组置于20％O2、5％CO2的条件下分别培养；培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；
第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞；
收集P9代细胞，离心并再悬浮于1X PBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1X PBS，立即采用流式细胞仪检测。
上述方案中，相关内容解释如下：
1、上述方案中，所述传染五项包括甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和艾滋病。
2、上述方案中，所述步骤②中，用30ml的注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔。
3、上述方案中，所述第四步中，所有样品，CD34小于5％。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明利用消化法制备了血管内皮干细胞，并建立了三种气体(氧气、氮气、二氧化碳)培养体系培养扩增血管内皮干细胞。该技术具有高效、经济、便捷等优点，可促使血管内皮干细胞增殖速度、状态较常规的二氧化碳培养法更佳。
附图说明
图1是分离血管内皮干细胞培养第一天图，在10×镜下直接观察了增殖过程中细胞的形态学特征。所有集落均呈现出CFU-F形态学特征，并具有极其强大的生长活力(倍增时间约为26h)；
图2是分离血管内皮干细胞培养第一天图，在100×镜下观察图；
图3是分离血管内皮干细胞培养第七天图；
图4是不同氧气浓度条件下，细胞增殖曲线图；
图5是用5％O2+5％CO2条件培养的血管内皮干细胞中干细胞的鉴定结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例：
一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：
第一步、制备血管内皮干细胞；
a、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；
b、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：
①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；
②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；
③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6-10min；
④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；
⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；
c、配制培养液；
名称 浓度
DME/F12培养基 100％
FBS 10％
青-链霉素 1％
两性霉素B 0.1％
d、培养液重悬细胞；
第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：
a、培养血管内皮干细胞；
通过充入氮气，调整O2浓度为5％、20％，CO2浓度设置为5％，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80-90％；
b、细胞消化传代；
步骤b所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；
第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；
取血管内皮干细胞，以1X103个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔；其中第一组置于5％CO2的条件下，第二组置于5％O2、5％CO2的条件下、第三组置于20％O2、5％CO2的条件下分别培养；培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；
第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞；
收集P9代细胞，离心并再悬浮于1X PBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1X PBS，立即采用流式细胞仪检测。
所述传染五项包括甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和艾滋病。
所述步骤②中，用30ml的注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔。
所述第四步中，所有样品，CD34小于5％。
本发明在培养过程中的图纸示意如图1至图5所示，本发明利用消化法制备了血管内皮干细胞，并建立了三种气体(氧气、氮气、二氧化碳)培养体系培养扩增血管内皮干细胞。本发明技术具有高效、经济、便捷等优点，可促使血管内皮干细胞增殖速度、状态较常规的二氧化碳培养法更佳。
在此描述并且要求保护的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (4)

1.一种血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步、制备血管内皮干细胞；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：
①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；
②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；
③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶6-8ml，放入37℃ Cord Buffer中保温6-10min；
④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；
⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；
Figure DEST_PATH_IMAGE006
、配制培养液；
Figure DEST_PATH_IMAGE008
、培养液重选细胞；
第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：
Figure 390194DEST_PATH_IMAGE002
、培养血管内皮干细胞；
通过充入氮气，调整O2浓度为5%、20%，CO2浓度设置为5%，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80-90%；
Figure 307335DEST_PATH_IMAGE004
、细胞消化传代；
步骤2所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；
第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；
取血管内皮干细胞，以1X103个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔；其中第一组置于5%CO2的条件下，第二组置于5% O2、5%CO2的条件下、第三组置于20% O2、5%CO2的条件下分别培养；培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；
第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞；
收集P9代细胞，离心并再悬浮于1X PBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、 CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1X PBS，立即采用流式细胞仪检测。
2.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述传染五项包括甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和艾滋病。
3.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤② 中，用30ml的注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔。
4.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述第四步中，所有样品，CD34小于5%。
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