JP2010509922A - 腫瘍と関連している遺伝的変異 - Google Patents
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Abstract
腫瘍に関連するヌクレオチド及びアミノ酸変異が提供される。変異を検出するための方法及び腫瘍を診断及び治療するための方法が提供される。
【選択図】図１−１
【選択図】図１−１
Description
（関連出願との相互参照）
本出願は、２００６年１１月１６日に提出された米国仮特許出願番号６０／８６６，１０３及び２００７年７月１０日に提出された米国仮特許出願番号第６０／９４８，８１８号の優先権を主張するものであり、その明細書の全文を参照することによりここに援用される。
本出願は、２００６年１１月１６日に提出された米国仮特許出願番号６０／８６６，１０３及び２００７年７月１０日に提出された米国仮特許出願番号第６０／９４８，８１８号の優先権を主張するものであり、その明細書の全文を参照することによりここに援用される。
（技術分野）
本発明は、一般的に、腫瘍と関連している遺伝的変異に関する。
本発明は、一般的に、腫瘍と関連している遺伝的変異に関する。
（背景）
細胞が、増殖のアドバンテージを最終的に与える体細胞変異を蓄積すると、癌が発生する場合がある。体細胞変異は、例えば、ヌクレオチド塩基の置換、欠失、挿入、増幅及び再配列を含む。癌で起こる体細胞変異の同定は、癌の発達に関して、有益な情報を提供する。この種の情報は、癌の診断マーカー及び治療上の標的の同定のためにも有用である。（Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358.参照）。したがって、癌で起こる体細胞変異を同定するという継続的なニーズが存在する。
生殖系列の変異又は多型は、生物のゲノムに存在する遺伝性変異である。多型は、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）及び一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含む。生殖系列変異は癌を含む特定の疾患の羅患率と関連している場合がある。（Vierimaa et al. (2006) Science 312:1228-1230; Landi et al. (2006) Science 313:521-522; Zhu et al. (2004) Cancer Research 64:2251-2257.参照）。したがって、癌と関連している多型を同定するという継続的なニーズが存在する。
癌と関連している体細胞変異の同定は、例えば特定の治療に応答する患者集団を識別する際など、臨床設定において有益であることが判明した。（Lynch et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2129-2139; O'Hare (2004) Blood 104:2532-2539.参照）。
本願明細書において記載される本発明は、上記のニーズを満たし、また他の利点を提供する。
細胞が、増殖のアドバンテージを最終的に与える体細胞変異を蓄積すると、癌が発生する場合がある。体細胞変異は、例えば、ヌクレオチド塩基の置換、欠失、挿入、増幅及び再配列を含む。癌で起こる体細胞変異の同定は、癌の発達に関して、有益な情報を提供する。この種の情報は、癌の診断マーカー及び治療上の標的の同定のためにも有用である。（Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358.参照）。したがって、癌で起こる体細胞変異を同定するという継続的なニーズが存在する。
生殖系列の変異又は多型は、生物のゲノムに存在する遺伝性変異である。多型は、制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）及び一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含む。生殖系列変異は癌を含む特定の疾患の羅患率と関連している場合がある。（Vierimaa et al. (2006) Science 312:1228-1230; Landi et al. (2006) Science 313:521-522; Zhu et al. (2004) Cancer Research 64:2251-2257.参照）。したがって、癌と関連している多型を同定するという継続的なニーズが存在する。
癌と関連している体細胞変異の同定は、例えば特定の治療に応答する患者集団を識別する際など、臨床設定において有益であることが判明した。（Lynch et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2129-2139; O'Hare (2004) Blood 104:2532-2539.参照）。
本願明細書において記載される本発明は、上記のニーズを満たし、また他の利点を提供する。
（概要）
本発明の組成物及び方法は、部分的に、腫瘍サンプルに由来するポリヌクレオチドの新しい変異の発見に基づく。
一つの態様では、（ａ）図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置にヌクレオチド変異を含むＰＲＯポリヌクレオチド又は少なくとも約１０ヌクレオチド長のその断片、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、配列番号：１−３７で起こる。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、プライマーである。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドである。
本発明の組成物及び方法は、部分的に、腫瘍サンプルに由来するポリヌクレオチドの新しい変異の発見に基づく。
一つの態様では、（ａ）図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置にヌクレオチド変異を含むＰＲＯポリヌクレオチド又は少なくとも約１０ヌクレオチド長のその断片、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、配列番号：１−３７で起こる。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、プライマーである。他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドである。
別の態様においては、（ａ）図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置でヌクレオチド変異を含んでいるＰＲＯポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズするアレル特異的なオリゴヌクレオチド又は（ｂ）（ａ）の相補鎖であるオリゴヌクレオチドが提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の実施形態では、アレル特異的なオリゴヌクレオチドは、アレル特異的なプライマーである。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド及び少なくとも一つの酵素を含むキットが提供される。そのような実施態様において、少なくとも一つの酵素は、ポリメラーゼである。別の実施態様において、少なくとも一つの酵素は、リガーゼである。さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイが提供される。
別の態様においては、アレル特異的オリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションに適したコンディションの下で、ヌクレオチド変異に特異的なアレル特異的オリゴヌクレオチドとヌクレオチド変異を含むと推測される核酸を接触させる工程；及び（ｂ）アレル特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出する工程を含む、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置でヌクレオチド変異の有無を検出する方法が提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は体細胞変異である。他の実施態様では、ヌクレオチド変異は生殖系列多型である。
もう一つの態様において、核酸を、ヌクレオチド変異の３’配列にハイブリダイズするプライマーと接触させる工程、及び（ｂ）ヌクレオチド変異を含んでいる増幅産物を生成するために、プライマーを伸長する工程を含む、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置でヌクレオチド変異を含んでいる核酸を増幅する方法が提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は体細胞変異である。他の実施態様では、ヌクレオチド変異は生殖系列多型である。
他の実施形態では、生体試料に由来する核酸材料において、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置でヌクレオチド変異の有無を検出することを含む、哺乳動物生体試料の遺伝子型を決定する方法が提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の実施形態では、生体試料は、腫瘍細胞を含むと推測される。他の実施形態では、生体試料は、腫瘍である。他の一実施態様において、腫瘍は肺腫瘍である。そのような実施態様において、腫瘍は非小細胞肺癌である。他の一実施態様では、検出には、プライマー伸長アッセイ；アレル特異的プライマー伸長アッセイ；アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションアッセイ； ５’ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを使用したアッセイ；及びオリゴヌクレオチド・ライゲーションアッセイから選択される工程を実行することが含まれる。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は体細胞変異である。他の実施態様では、ヌクレオチド変異は生殖系列多型である。
別の態様において、哺乳動物に由来し、腫瘍細胞を含むことが知られている、又は推測される生体試料におけるＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドの変異の存在を検出することを含む、哺乳動物の腫瘍を分類する方法が提供される。一実施態様において、腫瘍細胞は肺腫瘍細胞である。そのような実施態様において、腫瘍細胞は非小細胞肺癌細胞である。他の一実施態様では、変異は、ヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。他の一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、検出には、プライマー伸長アッセイ；アレル特異的プライマー伸長アッセイ；アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションアッセイ； ５’ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを使用したアッセイ；及びオリゴヌクレオチド・ライゲーションアッセイから選択される工程を実行することが含まれる。他の一実施態様では、ヌクレオチド変異は体細胞変異である。他の実施態様では、ヌクレオチド変異は生殖系列多型である。他の一実施態様では、変異は、アミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯの機能的ドメインに存在する。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様において、変異はＦＢＸＷ７におけるアミノ酸変異である。そのような実施態様において、ＦＢＸＷ７におけるアミノ酸変異はＷＤ４０ドメインにおけるアミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異はＧ３４３、Ｒ３９９及びＹ４２９から選択されるアミノ酸位置におけるアミノ酸変異である。他の一実施態様において、変異はＦＢＸＷ７ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異はＷＤ４０ドメインをコード化するＦＢＸＷ７ポリヌクレオチドの領域におけるヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は第４染色体のＣ１５３６０７１１６、Ｃ１５３６０４９７１及びＴ１５３６０４８８１から選択されるヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変化である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異はＣ１５３６０７１１６Ｔ、Ｃ１５３６０４９７１Ｔ及びＴ１５３６０４８８１Ａから選択されるヌクレオチド変化である。
別の態様においては、腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドを標的とする治療薬に応答するかどうか予測する方法が提供され、前記方法は腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドの変異を含むかどうかについて決定することを含み、変異の存在は腫瘍が治療薬に応答することを示すものである。一実施態様において、腫瘍は肺腫瘍である。他の一実施態様では、肺腫瘍は非小細胞肺癌である。他の一実施態様では、変異は、ヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は体細胞変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は生殖系列多型である。他の一実施態様では、変異はアミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯ機能的ドメイン中に存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。
これら及び更なる実施態様は、以下の明細書において記載される。
これら及び更なる実施態様は、以下の明細書において記載される。
（実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
この明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適当な場合はいつでも、単数形で用いられる語は複数形を含み、その逆もまた同様である。下に記載する定義がここで援用される文献と矛盾する場合、下に記載される定義は調製する。
Ｉ．定義
この明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適当な場合はいつでも、単数形で用いられる語は複数形を含み、その逆もまた同様である。下に記載する定義がここで援用される文献と矛盾する場合、下に記載される定義は調製する。
ここで交換可能に用いる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合化(「アセンブリ」とも言う)の前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識成分との結合によりさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(一又は複数)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１−２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」とは、短く、少なくとも７ヌクレオチド長であって約２００未満のヌクレオチド長の一本鎖ヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
「プライマー」は、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離した３'-ＯＨ基を供給することにより、相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する一本鎖ポリヌクレオチドである。
「プライマー」は、核酸にハイブリダイズし、一般に遊離した３'-ＯＨ基を供給することにより、相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する一本鎖ポリヌクレオチドである。
「ＰＲＯ」は、図１ないし３に記載される遺伝子の何れかによりコード化されるタンパク質を意味し、野生型及びその変異型を含む。そのような型には、特に示されない限り、ＰＲＯのプロセシングされていない型である「完全長」；細胞のプロセシングにより生じるＰＲＯ型；例えば選択的スプライシング、アレル変異又は自然突然変異により生じるＰＲＯなどの自然に発生するＰＲＯ変異体、；少なくとも一つのＰＲＯの生物学的活性を保持する天然ＰＲＯの断片又は変異体が含まれる。
「ＰＲＯポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯをコード化する核酸」は、特に示されない限り、ＰＲＯをコード化する遺伝子又はコード化配列（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡコード配列）を意味する。
「ＰＲＯポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯをコード化する核酸」は、特に示されない限り、ＰＲＯをコード化する遺伝子又はコード化配列（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡコード配列）を意味する。
「ヌクレオチド変異」は、基準配列（例えば野生型配列）と比較したヌクレオチド配列における変化（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）のような、一以上のヌクレオチドの挿入、欠失、逆位又は置換）を意味する。その用語は、特に示されない限り、そのヌクレオチド配列の相補鎖における対応する変化も含む。ヌクレオチド変異は、体細胞変異又は生殖系列多型であってもよい。
「アミノ酸変異」は、基準配列（例えば野生型配列）と比較したアミノ酸配列における変化（例えば、内部欠失又はＮ末端もしくはＣ末端の切断のような、一以上のアミノ酸の挿入、置換又は欠失）を意味する。
「変異」は、ヌクレオチド変異又はアミノ酸変異を意味する。
「図＃＃＃から選択されるヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１ないし３の第５列に記載されるヌクレオチド位置のいずれかにおけるＰＲＯヌクレオチドのヌクレオチド変異を意味するが、図１ないし３の第５列に記載される特定のヌクレオチド変異に限定されるものではない。例示及び例証のために、図１の第５列、第１行目を参照すると、ＡＢＬポリヌクレオチドのヌクレオチド位置１３０７９０１３６でのヌクレオチド変異は、特定のヌクレオチド変化、つまり第５列に示されるＧ／Ｔ置換を含むがこれに限定されるものではなく、そのヌクレオチド位置でのあらゆる変化を含む。その用語は、特に示されない限り、そのヌクレオチド配列の相補鎖における対応する変化も含む。
「アミノ酸変異」は、基準配列（例えば野生型配列）と比較したアミノ酸配列における変化（例えば、内部欠失又はＮ末端もしくはＣ末端の切断のような、一以上のアミノ酸の挿入、置換又は欠失）を意味する。
「変異」は、ヌクレオチド変異又はアミノ酸変異を意味する。
「図＃＃＃から選択されるヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１ないし３の第５列に記載されるヌクレオチド位置のいずれかにおけるＰＲＯヌクレオチドのヌクレオチド変異を意味するが、図１ないし３の第５列に記載される特定のヌクレオチド変異に限定されるものではない。例示及び例証のために、図１の第５列、第１行目を参照すると、ＡＢＬポリヌクレオチドのヌクレオチド位置１３０７９０１３６でのヌクレオチド変異は、特定のヌクレオチド変化、つまり第５列に示されるＧ／Ｔ置換を含むがこれに限定されるものではなく、そのヌクレオチド位置でのあらゆる変化を含む。その用語は、特に示されない限り、そのヌクレオチド配列の相補鎖における対応する変化も含む。
「図＃＃＃から選択されるヌクレオチド変化」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１ないし３の第５列に記載される特定のヌクレオチド変化のいずれかを意味する。例証のための、図１から選択されるヌクレオチド変化の例は、図１の第５列、第１行目に示されるように、ＡＢＬポリヌクレオチドのヌクレオチド位置１３０７９０１３６におけるＧ／Ｔ置換である。
「図＃＃＃から選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸変異」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１又は３の第６列に記載される特定のアミノ酸変化を含むがこれに限定されるものではなく、図１又は３の第６列に記載されるアミノ酸位置のいずれかでのＰＲＯアミノ酸配列におけるアミノ酸変異を意味する。例示及び例証のために、図１の第６列、第１行目を参照すると、ＡＢＬのアミノ酸位置９６９でのアミノ酸変異は、特定のアミノ酸変化、つまり第６列に示されるＡ＞Ｓ置換を含むがこれに限定されるものではなく、そのアミノ酸位置でのあらゆる変化を含む。
「図＃＃＃から選択されるアミノ酸変化」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１又は３の第６列に記載される特定のアミノ酸変化のいずれかを意味する。例証のための、図１から選択されるアミノ酸変化の例は、図１の第６列、第１行目に示されるように、ＡＢＬのアミノ酸位置９６９におけるＡ＞Ｓ置換である。
「図＃＃＃から選択されるアミノ酸位置でのアミノ酸変異」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１又は３の第６列に記載される特定のアミノ酸変化を含むがこれに限定されるものではなく、図１又は３の第６列に記載されるアミノ酸位置のいずれかでのＰＲＯアミノ酸配列におけるアミノ酸変異を意味する。例示及び例証のために、図１の第６列、第１行目を参照すると、ＡＢＬのアミノ酸位置９６９でのアミノ酸変異は、特定のアミノ酸変化、つまり第６列に示されるＡ＞Ｓ置換を含むがこれに限定されるものではなく、そのアミノ酸位置でのあらゆる変化を含む。
「図＃＃＃から選択されるアミノ酸変化」及びその文法的に変形したもの（図＃＃＃は図１ないし３の何れかを意味する）は、図１又は３の第６列に記載される特定のアミノ酸変化のいずれかを意味する。例証のための、図１から選択されるアミノ酸変化の例は、図１の第６列、第１行目に示されるように、ＡＢＬのアミノ酸位置９６９におけるＡ＞Ｓ置換である。
「ＰＲＯの機能ドメイン」は、図２の第５列に記載されるタンパク質ドメインのいずれかを意味する。
「活性化変異」は、野生型ポリペプチドと比較して、コード化されたポリペプチドのより活性化された型を生じる遺伝子又はコード配列の変異を意味する。
「活性化変異」は、野生型ポリペプチドと比較して、コード化されたポリペプチドのより活性化された型を生じる遺伝子又はコード配列の変異を意味する。
「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、基質上でのハイブリダイズ可能なアレイ成分、好ましくはポリヌクレオチドプローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の規則正しい整列を意味する。基質は、スライドグラスなどの固体基質、又はニトロセルロースメンブレンなどの半固体基質であってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は何れかのその並べ換えでありうる。
「増幅」は、基準核酸配列又はその相補鎖の一又は複数のコピーを製造する過程を意味する。増幅は、一次関数的、又は指数関数的（例えばＰＣＲ）であり得る。「コピー」は、鋳型配列に対して必ずしも完全に相補的又は同一な配列を意味するものではない。例えば、コピーは、例えばデオキシイノシンなどのヌクレオチド類似体、意図的配列変化(鋳型に完全に相補的ではないがハイブリダイズすることができる配列を含むプライマーにより導入された配列変化など)及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含みうる。
「アレル特異的オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド変異（一般的に置換）を含む標的核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。「アレル特異的ハイブリダイゼーション」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズした場合に、アレル特異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが特異的にヌクレオチド変異に塩基対合することを意味する。特定のヌクレオチド変異にアレル特異的ハイブリダイゼーション可能なアレル特異的オリゴヌクレオチドは、変異に「特異的」であるという。
「アレル特異的プライマー」は、プライマーであるアレル特異的オリゴヌクレオチドを意味する。
「アレル特異的プライマー」は、プライマーであるアレル特異的オリゴヌクレオチドを意味する。
「プライマー伸長アッセイ」は、ヌクレオチドが核酸に付加され、より長い核酸又は「伸長産物」を生じるアッセイで、直接的又は間接的に検出されるものを意味する。
「アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ」は、（ａ）プライマーがヌクレオチド変異の３’の領域で標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ポリメラーゼにより伸長されることにより、ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる、プライマー伸長アッセイを意味する。
「アレル特異的プライマー伸長アッセイ」は、アレル特異的プライマーが標的核酸にハイブリダイズして伸長する、プライマー伸長アッセイを意味する。
「アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ」は、（ａ）アレル特異的オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ハイブリダイゼーションが直接的又は間接的に検出される、アッセイを意味する。
「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイゼーションプローブの核酸分解切断を可能にし、検出可能なシグナルを生じる、アッセイを意味する。
「分子ビーコンを用いたアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、遊離オリゴヌクレオチドから出される検出シグナルレベルよりも高い検出シグナルレベルを生じる、アッセイを意味する。
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが互いに隣接して標的核酸にハイブリダイズし、共に結合し（ヌクレオチドを介在して直接的又は間接的に）、結合産物が直接的又は間接的に検出されるアッセイを意味する。
「アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ」は、（ａ）プライマーがヌクレオチド変異の３’の領域で標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ポリメラーゼにより伸長されることにより、ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる、プライマー伸長アッセイを意味する。
「アレル特異的プライマー伸長アッセイ」は、アレル特異的プライマーが標的核酸にハイブリダイズして伸長する、プライマー伸長アッセイを意味する。
「アレル特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ」は、（ａ）アレル特異的オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、（ｂ）ハイブリダイゼーションが直接的又は間接的に検出される、アッセイを意味する。
「５’ヌクレアーゼアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、ハイブリダイゼーションプローブの核酸分解切断を可能にし、検出可能なシグナルを生じる、アッセイを意味する。
「分子ビーコンを用いたアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、遊離オリゴヌクレオチドから出される検出シグナルレベルよりも高い検出シグナルレベルを生じる、アッセイを意味する。
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」は、アレル特異的オリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが互いに隣接して標的核酸にハイブリダイズし、共に結合し（ヌクレオチドを介在して直接的又は間接的に）、結合産物が直接的又は間接的に検出されるアッセイを意味する。
「標的配列」、「標的核酸」又は「標的核酸配列」は、一般的に、ヌクレオチド変異が存在すると推測される、又は知られている対象のポリヌクレオチドを意味し、増幅により生成される標的核酸などのコピーも含む。
「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
本明細書中で用いる「診断」なる用語は、分子の、又は病理学的状態、疾患、状況の同定又は分類を意味する。例えば「診断」は、例えば肺癌などの特定の癌種の同定であってもよい。「診断」は、例えば組織学により（例えば非小細胞肺癌）、分子特徴により（例えば特定の遺伝子又はタンパク質におけるヌクレオチド又はアミノ酸変異により特徴付けられる肺癌）、又はその両方により特定の癌種の分類であってもよい。
「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
本明細書中で用いる「診断」なる用語は、分子の、又は病理学的状態、疾患、状況の同定又は分類を意味する。例えば「診断」は、例えば肺癌などの特定の癌種の同定であってもよい。「診断」は、例えば組織学により（例えば非小細胞肺癌）、分子特徴により（例えば特定の遺伝子又はタンパク質におけるヌクレオチド又はアミノ酸変異により特徴付けられる肺癌）、又はその両方により特定の癌種の分類であってもよい。
本明細書中で用いる「予後」なる用語は、癌のような腫瘍性疾患の再発、転移拡散、及び薬剤耐性を含む癌に起因し得る死又は進行の可能性の予測を意味する。
本明細書中で用いる「予測」なる用語は、患者が薬剤又は一連の薬剤に対して有利又は不利に応答する可能性を意味する。一実施態様では、予測はその応答の程度に関する。他の一実施態様では、予測は、例えば特定の治療的薬剤による治療及び／又は原発性腫瘍の外科的切除、及び／又は癌の再発を伴わない一定期間の化学療法などの治療の後に患者が生存しているか改善しているかどうか、及び／又はその可能性に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も好適な治療様式を選択することによって、治療決定を臨床的に行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、治療投薬計画、例えば特定の治療剤や組み合わせの投与、外科的介入、化学療法などを含む特定の治療投薬計画に有利に応答するかどうか、又は治療投薬計画の後に患者が長期に生存しているかどうかを予測する際の有用なツールである。
本明細書中で用いる「予測」なる用語は、患者が薬剤又は一連の薬剤に対して有利又は不利に応答する可能性を意味する。一実施態様では、予測はその応答の程度に関する。他の一実施態様では、予測は、例えば特定の治療的薬剤による治療及び／又は原発性腫瘍の外科的切除、及び／又は癌の再発を伴わない一定期間の化学療法などの治療の後に患者が生存しているか改善しているかどうか、及び／又はその可能性に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も好適な治療様式を選択することによって、治療決定を臨床的に行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、治療投薬計画、例えば特定の治療剤や組み合わせの投与、外科的介入、化学療法などを含む特定の治療投薬計画に有利に応答するかどうか、又は治療投薬計画の後に患者が長期に生存しているかどうかを予測する際の有用なツールである。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」は、無視できない程の異常な細胞増殖に関連した疾患を意味する。一実施態様において、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中で用いる「腫瘍」なる用語は、悪性、良性を問わず全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、ここで述べられるように、相互に排他的ではない。
「癌」及び「癌性」は、一般的に、無秩序な細胞成長及び増殖により特徴付けられる哺乳動物の生理的状況を意味する。癌の例には、これに限定されないが、カルシノーマ、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む。癌のより詳細な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、腎細胞癌、消化管癌、胃癌、食道癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、メラノーマ、白血病及び他のリンパ球増殖性疾患、及び様々な型の頭部癌及び頸部癌が含まれる。
本明細書中で用いる「腫瘍」なる用語は、悪性、良性を問わず全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、ここで述べられるように、相互に排他的ではない。
「癌」及び「癌性」は、一般的に、無秩序な細胞成長及び増殖により特徴付けられる哺乳動物の生理的状況を意味する。癌の例には、これに限定されないが、カルシノーマ、リンパ腫（例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫及び白血病を含む。癌のより詳細な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、腎細胞癌、消化管癌、胃癌、食道癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、メラノーマ、白血病及び他のリンパ球増殖性疾患、及び様々な型の頭部癌及び頸部癌が含まれる。
「肺腫瘍」には、これに限定されないが、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含む任意の肺の腫瘍を意味し、後者はこれに限定されないが、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌及び大細胞癌が含まれる。
「新生物」又は「腫瘍性細胞」は、対応する正常組織又は細胞よりも激しく増殖する、又は増殖を惹起する刺激の除去後にも増殖し続ける異常な組織又は細胞を意味する。
「肺腫瘍細胞」は、インビボあるいはインビトロの肺腫瘍細胞を意味し、肺腫瘍細胞由来の細胞株を含む。
「新生物」又は「腫瘍性細胞」は、対応する正常組織又は細胞よりも激しく増殖する、又は増殖を惹起する刺激の除去後にも増殖し続ける異常な組織又は細胞を意味する。
「肺腫瘍細胞」は、インビボあるいはインビトロの肺腫瘍細胞を意味し、肺腫瘍細胞由来の細胞株を含む。
ここで使用される「治療」（及び「治療する」又は「治療している」などの変形）とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。
「個体」は脊椎動物である。特定の実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、これに限定されないが、家畜(例えばウシ)、スポーツ用動物、愛玩動物（例えばネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）が含まれる。特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
個体に所望する反応を引き出すための本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量を含む。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
個体に所望する反応を引き出すための本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を、治療的に有益な効果が上回る量を含む。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるために、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
本明細書中で用いる「長期の」生存なる用語は、治療的治療の後、少なくとも１年、５年、８年又は１０年の生存を指す。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「耐性の増加」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味する。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「感受性の減少」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味し、この応答の減少は薬剤の用量や治療の強度を増やすことによって、(少なくとも部分的に)補われうるものである。
「患者応答」は、限定するものではないが以下のものを含む患者に利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる。（１）緩徐化又は完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）近接する末梢器官及び／又は組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（６）必ずではないが腫瘍の退縮又は拒絶が生じ得る抗腫瘍免疫応答の亢進、（７）腫瘍と関連する一又は複数の症状の、ある程度の軽減、（８）治療後の生存期間の増加、及び／又は（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「耐性の増加」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味する。
本発明に従って用いられる場合、特定の治療薬又は治療選択に対する「感受性の減少」なる用語は、薬剤の標準的な用量又は標準的な治療手順に対する応答の減少を意味し、この応答の減少は薬剤の用量や治療の強度を増やすことによって、(少なくとも部分的に)補われうるものである。
「患者応答」は、限定するものではないが以下のものを含む患者に利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる。（１）緩徐化又は完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）近接する末梢器官及び／又は組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（６）必ずではないが腫瘍の退縮又は拒絶が生じ得る抗腫瘍免疫応答の亢進、（７）腫瘍と関連する一又は複数の症状の、ある程度の軽減、（８）治療後の生存期間の増加、及び／又は（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少。
「アンタゴニスト」は最も広い意味で用いられ、ＰＲＯのようなポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻害又は中和する、もしくはポリペプチドをコード化する核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に阻害するあらゆる分子が含まれる。典型的なアンタゴニスト分子には、これに限定されないが、アンタゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びアンチセンス核酸が含まれる。
「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、ＰＲＯのようなポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に模倣する、もしくはポリペプチドをコード化する核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に増加するあらゆる分子が含まれる。典型的なアゴニスト分子には、これに限定されないが、アゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びＰＲＯポリヌクレオチド、ＰＲＯポリペプチド及びＰＲＯ−Ｆｃ融合物が含まれる。
「アゴニスト」は最も広い意味で用いられ、ＰＲＯのようなポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に模倣する、もしくはポリペプチドをコード化する核酸の転写又は翻訳を部分的又は完全に増加するあらゆる分子が含まれる。典型的なアゴニスト分子には、これに限定されないが、アゴニスト抗体、ポリペプチド断片、オリゴペプチド、有機分子（小分子を含む）及びＰＲＯポリヌクレオチド、ＰＲＯポリペプチド及びＰＲＯ−Ｆｃ融合物が含まれる。
「ＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドを標的とする治療薬」は、ＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドの発現又は活性に影響する任意の薬剤を意味し、当業者に既知の治療薬及び後に開発される治療薬を含む、ここで述べられるＰＲＯアゴニスト又はアンタゴニストを含むが、これに限定されるものではない。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位元素(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な影響を有する任意の物質である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine)(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を促進するホルモンの影響を調節、低減、遮断又は阻害するように働く抗ホルモン剤で、多くの場合全身性の治療の形態のものがある。それらはそれ自体がホルモンであり、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ＥＶＩＳＴＡ(登録商標)ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方制御(ＥＲＤ)、卵巣を抑制又は停止させる機能を有する薬剤、例えば、ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標)等の黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、リュープロリド酢酸塩、ゴセレリン酢酸塩、ブセレリン酢酸塩及びトリプトレリン；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミド等のその他抗アンドロゲン；及び副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾールを含む。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロン酸等のビスホスホネート(例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標)、ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標)エチドロン酸、ＮＥ-５８０９５、ＺＯＭＥＴＡ(登録商標)ゾレドロン酸／ゾレドロン酸、ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標)アレンドロン酸、ＡＲＥＤＩＡ(登録商標)パミドロン酸、ＳＫＥＬＩＤ(登録商標)チルドロン酸、又はＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標)リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に付着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｌｆ、Ｈ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体(ＥＧＦ−Ｒ)；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブditosylate(GW572016としても知られるＥｒｂＢ−２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)及び上記のものの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体を含む。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞(例えばＰＲＯを発現する細胞)の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＴＡＴ２２６を発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
本明細書中で用いられているように、「ＥＧＦＲ阻害剤」なる用語は、ＥＧＦＲと結合するか、さもなければ直接相互に作用して、そのシグナル伝達活性を予防又は低減する化合物を指しており、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」として称されることもある。このような薬剤の例には、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子が含まれる。ＥＧＦＲに結合する抗体の例には、ＭＡｂ５７９(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６)、ＭＡｂ４５５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７)、ＭＡｂ２２５(ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５０８)、ＭＡｂ５２８(ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５０９)(米国特許第４９４３５３３号、Mendelsohn et al.参照)、及びその変異体、例えばキメラ化２２５(Ｃ２２５又はセツキシマブ；ERBUTIX(登録商標))及び、再構築されたヒト２２５(Ｈ２２５)(国際公開第９６／４０２１０号、Imclone Systems Inc.参照)；ＩＭＣ-１１Ｆ８、完全なヒトの、ＥＧＦＲターゲティング抗体(Imclone)；タイプII変異体ＥＧＦＲを結合する抗体(米国特許第５２１２２９０号)；米国特許第５８９１９９６号に記載の、ＥＧＦＲを結合する、ヒト化及びキメラの抗体；及び、ＥＧＦＲを結合するヒト抗体、例として、ＡＢＸ-ＥＧＦ又はパニツムマブ(国際公開第９８／５０４３３号、Abgenix/Amgen参照)；ＥＭＤ５５９００ (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996))；ＥＧＦＲ結合に関してＥＧＦとＴＧＦ-αの両方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体であるＥＭＤ７２００(マツズマブ(matuzumab))(EMD/Merck)；ヒトＥＧＦＲ抗体、ＨｕＭａｘ-ＥＧＦＲ(GenMab)；Ｅ１.１、Ｅ２.4、Ｅ２.５、Ｅ６.２、Ｅ６.４、Ｅ２.１１、Ｅ６.３及びＥ７.６. ３として知られていて、米国特許第６２３５８８３号に記載の完全なヒト抗体、ＭＤＸ-４４７(Medarex Inc)；及び、ｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６(Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004))が含まれる。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害性剤とコンジュゲートして、免疫コンジュゲートを生成してもよい(例として欧州特許第659,439号Ａ2、Merck Patent GmbHを参照)。ＥＧＦＲアンタゴニストには、小分子、例えば米国特許第５６１６５８２号、同第５４５７１０５号、同第５４７５００１号、同第５６５４３０７号、同第５６７９６８３号、同第６０８４０９５号、同第６２６５４１０号、同第６４５５５３４号、同第６５２１６２０号、同第６５９６７２６号、同第６７１３４８４号、同第５７７０５９９号、同第６１４０３３２号、同第５８６６５７２号、同第６３９９６０２号、同第６３４４４５９号、同第６６０２８６３号、同第６３９１８７４号、同第６３４４４５５号、同第５７６００４１号、同第６００２００８号及び同第５７４７４９８号、並びにＰＣＴ公報：国際公開第９８／１４４５１号、同第９８／５００３８号、同第９９／０９０１６号及び同第９９／２４０３７号に記載の化合物が含まれる。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストにはＯＳＩ-774(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ、TARCEVA(登録商標) Genentech/OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ１０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]−、ジヒドロクロライド、Pfizer Inc.)；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ(ＩＲＥＳＳＡＪ) ４(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、AstraZeneca)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ-１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ-１６６((Ｒ)４-[４[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ-３８７７８５(Ｎ-[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；ＥＫＢ-５６９(Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミン]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キノリンイル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)(Wyeth)；ＡＧ１４７８(Pfizer)；ＡＧ１５７１(ＳＵ５２７１；Pfizer)；二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えばラパチニブ(ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６又はＮ-[３-クロロ-４-[(３フルオロフェニル)メトキシ]フェニル]６[５[[[2メチルスルホニル)エチル]アミノ]メチル]-２-フラニル]-４-キナゾリンアミン、Glaxo-SmithKline)。
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ＨＥＲレセプターなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を阻害する分子である。このような阻害剤の例には、前段落に記載のＥＧＦＲターゲティング薬剤；小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えばTakedaから入手可能なＴＡＫ１６５；ＥｒｂＢ２レセプターチロシンキナーゼの経口選択的阻害剤であるＣＰ-７２４７１４(Pfizer and OSI)；二重ＨＥＲ阻害剤、例えばＥＫＢ-５６９(Wyethから入手可能)、これは優先的にＥＧＦＲを結合するが、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲを過剰発現している細胞を阻害する；経口ＨＥＲ２及びＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるラパチニブ(ＧＳＫ５７２０１６、Glaxo-SmithKlineから入手可能)；ＰＫＩ-１６６(Novartisから入手可能)；ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤、例えばカネルチニブ(canertinib)(ＣＩ-１０３３；Pharmacia)；Ｒａｆ-１阻害剤、例えばISIS Pharmaceuticalsから入手可能なＲａｆ-１シグナル伝達を阻害するアンチセンス薬剤ＩＳＩＳ-５１３２；非ＨＥＲターゲティングＴＫ阻害剤、例えばGlaxo-SmithKlineから入手可能なイマチニブメシレート(GLEEVACTM)；マルチターゲティングチロシンキナーゼ阻害剤、例えばPfizerから入手可能なスニチニブ(Sutent (登録商標))；ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばバタラニブ(vatalanib)(Novartis/Schering AGから入手可能なＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４)；ＭＡＰＫ細胞外調節キナーゼI阻害剤ＣＩ-１０４０(Pharmaciaから入手可能)；キナゾリン、例として、ＰＤ１５３０３５,４-(３-クロロアニリノ)キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリミジン、例えばＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１及びＣＧＰ６２７０６；ピラゾロピリミジン、４(フェニルアミノ)-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン；クルクミン(ジフェルロイルメタン、４,５-ビス(４-フルオロアニリノ)フタルイミド)；ニトロチオフェン成分を含有するチロホスチン；ＰＤ-０１８３８０５(Warner-Lamber)；アンチセンス分子(例えばＨＥＲコード化核酸と結合するもの)；キノキサリン(米国特許第５８０４３９６号)；チロホスチン(米国特許第５８０４３９６号)；ＺＤ６４７４(Astra Zeneca)；ＰＴＫ-７８７(Novartis/Schering AG)；ＣＩ-１０３３などのｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤(Pfizer)；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ(ＩＳＩＳ３５２１；Isis/Lilly)；イマチニブメシレート(Gleevac)；ＰＫＩ１６６(Novartis)；ＧＷ２０１６(Glaxo SmithKline)；ＣＩ-１０３３(Pfizer)；ＥＫＢ-５６９(Wyeth)；セマキシニブ(Semaxinib)(Sugen)；ＺＤ６４７４(AstraZeneca)；ＰＴＫ-７８７(Novartis/Schering AG)；ＩＮＣ-１Ｃ１１(Imclone)；又は以下のいずれかの特許公報に記載のもの：米国特許第５８０４３９６号；国際公開第９９／０９０１６号(American Cyanamid)；国際公開第９８／４３９６０号(American Cyanamid)；国際公開第９７／３８９８３号(Warner Lambert)；国際公開第９９／０６３７８号(Warner Lambert)；国際公開第９９／０６３９６号(Warner Lambert)；国際公開第９６／３０３４７号(Pfizer, Inc)；国際公開第９６／３３９７８号(Zeneca)；国際公開第９６／３３９７号(Zeneca)；及び国際公開第９６／３３９８０号(Zeneca)が含まれる。
「抗体」(Ａｂ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質を意味する。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「抗ＰＲＯ抗体」又は「ＰＲＯに結合する抗体」は、抗体がＰＲＯをターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＰＲＯを結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＰＲＯでないタンパク質への抗ＰＲＯ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＰＲＯへの抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＰＲＯに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＰＲＯ抗体は、異なる種のＰＲＯ間で保存されるＰＲＯのエピトープに結合する。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、実質的にインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は完全な抗体の一部を含んでなるものであり、好ましくはその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「抗体断片」は完全な抗体の一部を含んでなるものであり、好ましくはその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ'）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。集合的に、Ｆｖの６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。集合的に、Ｆｖの６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ'）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling et al.: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee et al., J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks et al., Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。そのような技術には、ファージディスプレイのようなヒト由来組み合わせライブラリーのスクリーニング（Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株の使用(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)参照)；及び内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるモノクローナル抗体の生成(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照)が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じさせる、その一又は複数のＣＤＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks et al., Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas et al., Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al., Gene, 169：147-155(1995)；Yelton et al., J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al., J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins et al., J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「阻止(ブロック)抗体」又は「アンタゴニスト抗体」は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、部分的又は完全に阻害する。
「小分子」又は「有機小分子」は、本明細書において５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子と定義される。
「小分子」又は「有機小分子」は、本明細書において５００ダルトン以下の分子量を有する有機分子と定義される。
「ＰＲＯ結合オリゴペプチド」又は「ＰＲＯに結合するオリゴペプチド」は、ＰＲＯを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＰＲＯと十分な親和性で結合可能なオリゴペプチドである。ある実施態様では、関連のない非ＰＯＲタンパク質へのＰＲＯ結合オリゴペプチドの結合の程度は、ＰＲＯへのＰＲＯ結合オリゴペプチドの結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＰＲＯ結合オリゴペプチドは、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「ＰＲＯ結合有機分子」又は「ＰＲＯに結合する有機分子」は、ＰＲＯを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＰＲＯと十分な親和性で結合可能な有機分子である。ある実施態様では、関連のない非ＰＯＲタンパク質へのＰＲＯ結合有機分子の結合の程度は、ＰＲＯへのＰＲＯ結合有機分子の結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＰＲＯ結合有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
「ＰＲＯ結合有機分子」又は「ＰＲＯに結合する有機分子」は、ＰＲＯを標的とした診断薬及び／又は治療薬として有用な程度にＰＲＯと十分な親和性で結合可能な有機分子である。ある実施態様では、関連のない非ＰＯＲタンパク質へのＰＲＯ結合有機分子の結合の程度は、ＰＲＯへのＰＲＯ結合有機分子の結合の約１０％より低く、その程度は例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより測定される。ある実施態様では、ＰＲＯ結合有機分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。
標的ポリペプチドに結合する任意の分子の解離定数（Ｋｄ）は、便宜上表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定され得る。そのようなアッセイは、２５℃で、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した標的ポリペプチドＣＭ５チップと共に、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００又はＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いてもよい。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。標的ポリペプチドを１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。標的ポリペプチドの注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈した結合分子(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。Chen, Y. et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる抗体の結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
「リポソーム」は、例えば薬剤などの剤を哺乳動物に送達するのに有用な、様々な型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から成る小さいベシクルである。リポソームの成分は、通常生体膜における脂質の配置と同様に、二重層構造に配置される。
本明細書で用いられる単語「標識」は、検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自体（例えば放射性同位元素標識又は蛍光標識）が検出可能であってもよく、酵素的な標識においては検出可能な生成物を生じる基質化合物又は組成物の触媒化学変化であってもよい。検出可能な標識としての機能を果たす放射性核種には、例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２及びＰｄ−１０９が含まれる。
核酸、ポリペプチド又は抗体のような「単離された」生物学的分子は、少なくとも１つの自然環境の構成成分から同定及び分離、及び／又は回収されたものである。
核酸、ポリペプチド又は抗体のような「単離された」生物学的分子は、少なくとも１つの自然環境の構成成分から同定及び分離、及び／又は回収されたものである。
ＩＩ． 特定の実施態様の説明
腫瘍と関連しているヌクレオチド及びアミノ酸変異がここに提供される。これらの変異は、癌に対するバイオマーカーを提供する、及び／又は腫瘍形成もしくは腫瘍促進の素因となる、又は寄与する。したがって、ここに開示される変異は、例えば癌の診断及び治療に関する方法及び組成物など、種々の設定において有用である。
腫瘍と関連しているヌクレオチド及びアミノ酸変異がここに提供される。これらの変異は、癌に対するバイオマーカーを提供する、及び／又は腫瘍形成もしくは腫瘍促進の素因となる、又は寄与する。したがって、ここに開示される変異は、例えば癌の診断及び治療に関する方法及び組成物など、種々の設定において有用である。
Ａ．変異
変異は、２５の異なるヒト肺腫瘍（非小細胞肺癌）標本由来の１００の遺伝子において同定された。それらの変異は、図１、２及び３に示される表に記載される。
１．ＭＲＤにより同定により同定された変異
実施例Ａにおいて更に記載されるように、変異がＭＲＤにより同定された。それらの変異は図１に記載される。図１において、表の第１列（「変異体ID」）は、各変異の識別番号を記載する。第２列（「UNQ ID」）は、更なる遺伝子特異的な識別番号を記載する。第３列（「遺伝子名 (Ensembl)」）は、変異が起こっている遺伝子を記載する。遺伝子名は、Ensembl命名法に従っている。（Ensemblプロジェクトは、Hubbard et al. (2006) Nucleic Acids Res. Database issue:D1-D8.において記載されている。）第４列（「遺伝子の概要」）は、第４列に記載される各遺伝子のEnsemblからの、簡単な説明を提供する。第５列（「NT変化」）は、染色体位置によりヌクレオチド変化を記載する。例えば、第５列の第１行における記号「9:130790136: G/T」は、ABL1ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変化が第９染色体のヌクレオチド130790136で起こることを示し、ヌクレオチド変化はその位置におけるＧのＴへの置換である。図１において、ヌクレオチド変化は、全ての単一のヌクレオチド置換である。図１において同定される全てのヌクレオチド置換は、示された遺伝子のコード領域で起こっており、全て非同義変異又はナンセンス変異である。さらに、図１において同定される全てのヌクレオチド置換は、体細胞性の変異であった（すなわち、腫瘍試料だけに発見され、患者が一致した正常試料においては発見されなかった）。図１の表の第６列（「AA CHANGE）は、前の列において記載されるヌクレオチド置換から生じるアミノ酸変化を記載する。第６列に示されるアミノ酸位置は、下記の表１において提供されるＰＲＯアミノ酸配列を意味し、それは対応するＰＲＯｃＤＮＡ配列の翻訳であり、それもまた表１に提供される。表１において提供されるアミノ酸及びｃＤＮＡ配列は、Ensemblデータベース由来である。第６列に示されたアミノ酸位置は、ＰＲＯ（例えばアレル変異体、又はスプライスバリアント）の変異体又は断片の対応するアミノ酸位置をも意味し、それは配列決定アラインメント又は類似した技術を用いて、通常同定することができる。ヌクレオチド置換が終止コドンにおいて起こった場合（すなわちナンセンス変異）、対応するアミノ酸変化は第６列に「Ｏ」と示される（例えば、変異体ID10015を参照、「1170Q→Ｏ」のアミノ酸変化を示す）。第７列（「ドメイン」）は、いくつかの変異について、アミノ酸変化が起こるタンパク質ドメインを示している。タンパク質ドメインは、Pfam命名法によって示される。（Bateman et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(1): D138-141.参照）。
表１
変異は、２５の異なるヒト肺腫瘍（非小細胞肺癌）標本由来の１００の遺伝子において同定された。それらの変異は、図１、２及び３に示される表に記載される。
１．ＭＲＤにより同定により同定された変異
実施例Ａにおいて更に記載されるように、変異がＭＲＤにより同定された。それらの変異は図１に記載される。図１において、表の第１列（「変異体ID」）は、各変異の識別番号を記載する。第２列（「UNQ ID」）は、更なる遺伝子特異的な識別番号を記載する。第３列（「遺伝子名 (Ensembl)」）は、変異が起こっている遺伝子を記載する。遺伝子名は、Ensembl命名法に従っている。（Ensemblプロジェクトは、Hubbard et al. (2006) Nucleic Acids Res. Database issue:D1-D8.において記載されている。）第４列（「遺伝子の概要」）は、第４列に記載される各遺伝子のEnsemblからの、簡単な説明を提供する。第５列（「NT変化」）は、染色体位置によりヌクレオチド変化を記載する。例えば、第５列の第１行における記号「9:130790136: G/T」は、ABL1ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変化が第９染色体のヌクレオチド130790136で起こることを示し、ヌクレオチド変化はその位置におけるＧのＴへの置換である。図１において、ヌクレオチド変化は、全ての単一のヌクレオチド置換である。図１において同定される全てのヌクレオチド置換は、示された遺伝子のコード領域で起こっており、全て非同義変異又はナンセンス変異である。さらに、図１において同定される全てのヌクレオチド置換は、体細胞性の変異であった（すなわち、腫瘍試料だけに発見され、患者が一致した正常試料においては発見されなかった）。図１の表の第６列（「AA CHANGE）は、前の列において記載されるヌクレオチド置換から生じるアミノ酸変化を記載する。第６列に示されるアミノ酸位置は、下記の表１において提供されるＰＲＯアミノ酸配列を意味し、それは対応するＰＲＯｃＤＮＡ配列の翻訳であり、それもまた表１に提供される。表１において提供されるアミノ酸及びｃＤＮＡ配列は、Ensemblデータベース由来である。第６列に示されたアミノ酸位置は、ＰＲＯ（例えばアレル変異体、又はスプライスバリアント）の変異体又は断片の対応するアミノ酸位置をも意味し、それは配列決定アラインメント又は類似した技術を用いて、通常同定することができる。ヌクレオチド置換が終止コドンにおいて起こった場合（すなわちナンセンス変異）、対応するアミノ酸変化は第６列に「Ｏ」と示される（例えば、変異体ID10015を参照、「1170Q→Ｏ」のアミノ酸変化を示す）。第７列（「ドメイン」）は、いくつかの変異について、アミノ酸変化が起こるタンパク質ドメインを示している。タンパク質ドメインは、Pfam命名法によって示される。（Bateman et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(1): D138-141.参照）。
表１
図２は、６つの遺伝子のコンセンサススプライスサイト領域に位置した体細胞性ヌクレオチド変異を記載する。図２において、表の第１列（「変異体ID」）には、各変異に指定された識別番号を記載する。第２列（「UNQID」）は、更なる遺伝子特異的な識別番号を提供する。第３列（「遺伝子」）には、変異が起こっている遺伝子を記載する。遺伝子名は、Ensembl命名法に従っている。第４列（「遺伝子の概要」）は、第４列において同定された各遺伝子のEnsemblの簡単な説明を提供する。第５列（「NT変化」）は、ヌクレオチド変化を意味しＭＲＤによって同定された。第６列（「頻度」）は、特定の変異が見出された回数を示す。第７列（「影響を受けたエクソン」）は、コンセンサス・スプライスサイト変異と関連しているエキソンを意味する。第８列（「スプライスサイト」）は、変異がコンセンサス・スプライスサイトのどこに起こったかを詳細に記載する。第９列（「タンパク質への影響」）は、変異がフレーム内又はフレーム外のどちらで起こったかを示している。第１０列（「ドメイン」）には、変異のうちの２つに影響を受けるタンパク質ドメインが示されている。最後の列（「スキップの状態」）は、コンセンサス・スプライスサイト変異と関連しているエキソンがｍＲＮＡスプライシングにおいてスキップされたかどうかを示す。図２に記載される特定の遺伝子によってコード化されるアミノ酸配列は、以下表２に提供される：
表２
表２
２．サンガーの配列決定による変異の同定
更に実施例Ｂにおいて記載されるように、変異はサンガーの配列決定によって同定された。それらの変異は、図３に記載される。表の第１列（「変異体ID」）には、各変異に指定された識別番号を記載する。第２列（「UNQID」）は、更なる遺伝子特異的な識別番号を記載する。第３列（「遺伝子名（ＨＵＧＯ））は、変異が起こっている遺伝子を記載する。遺伝子名は、ヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）命名法に従っている。Wain et al. (2002) Genomics 79:464-470を参照。第４列（「遺伝子の概要」）は、第３列において同定された各遺伝子のＨＵＧＯの簡単な説明を提供する。第５列（「NT_CHGE」）は、各遺伝子において見出されたヌクレオチド変化を記載する。この研究において、ヌクレオチド変化は、全ての単一のヌクレオチド置換であった。第５列における用語「HETSUB」は、「ヘテロ接合型の置換」を表し、示された変異及び野生型アレルが腫瘍試料において検出されたことを意味する。用語「HOMSUB」は、「ホモ接合型の置換」を表し、示された変異は腫瘍試料において検出され、野生型アレルは腫瘍試料において検出されなかったことを意味する。これは、例えば腫瘍がヘテロ接合性損失を有する場合に起こり得る（例えば、ある遺伝子の1つのコピーが変異を含み、他のコピーが対応する遺伝子の欠失を含む場合）。ヌクレオチド番号は、示された遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチド位置を意味する。例えば、変異体ＩＤ９１２は、「２６６７Ａ＞Ｇ」と指定されたヘテロ接合型置換であり、ＰＴＣＨ遺伝子の１つのコピーにおいて、ＰＴＣＨ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号：３２）のヌクレオチド２６６７に対応するゲノム位置で「Ａ」が「Ｇ」に置換されていることを示している。図３において記載される各遺伝子について、下記の表３に示すように、対応するｃＤＮＡ配列及び翻訳物が配列表として提供される。
表３
更に実施例Ｂにおいて記載されるように、変異はサンガーの配列決定によって同定された。それらの変異は、図３に記載される。表の第１列（「変異体ID」）には、各変異に指定された識別番号を記載する。第２列（「UNQID」）は、更なる遺伝子特異的な識別番号を記載する。第３列（「遺伝子名（ＨＵＧＯ））は、変異が起こっている遺伝子を記載する。遺伝子名は、ヒト遺伝子解析機構（ＨＵＧＯ）命名法に従っている。Wain et al. (2002) Genomics 79:464-470を参照。第４列（「遺伝子の概要」）は、第３列において同定された各遺伝子のＨＵＧＯの簡単な説明を提供する。第５列（「NT_CHGE」）は、各遺伝子において見出されたヌクレオチド変化を記載する。この研究において、ヌクレオチド変化は、全ての単一のヌクレオチド置換であった。第５列における用語「HETSUB」は、「ヘテロ接合型の置換」を表し、示された変異及び野生型アレルが腫瘍試料において検出されたことを意味する。用語「HOMSUB」は、「ホモ接合型の置換」を表し、示された変異は腫瘍試料において検出され、野生型アレルは腫瘍試料において検出されなかったことを意味する。これは、例えば腫瘍がヘテロ接合性損失を有する場合に起こり得る（例えば、ある遺伝子の1つのコピーが変異を含み、他のコピーが対応する遺伝子の欠失を含む場合）。ヌクレオチド番号は、示された遺伝子に対応するｃＤＮＡ配列におけるヌクレオチド位置を意味する。例えば、変異体ＩＤ９１２は、「２６６７Ａ＞Ｇ」と指定されたヘテロ接合型置換であり、ＰＴＣＨ遺伝子の１つのコピーにおいて、ＰＴＣＨ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号：３２）のヌクレオチド２６６７に対応するゲノム位置で「Ａ」が「Ｇ」に置換されていることを示している。図３において記載される各遺伝子について、下記の表３に示すように、対応するｃＤＮＡ配列及び翻訳物が配列表として提供される。
表３
図３において同定された全てのヌクレオチド置換は、示された遺伝子のコード領域において起こっていた。さらに、この研究において同定された全てのヌクレオチド置換は、変異が最初に発見された腫瘍試料由来のＤＮＡを再度配列決定することによって確証された（すなわち、確立された）。
図３における表の第６列（「AA_CHGE」）は、前の列において記載されるヌクレオチド置換により生じるアミノ酸変化を記載する。アミノ酸は、翻訳されたｃＤＮＡ配列の位置に従って番号をつけられる。ヌクレオチド置換が終止コドンにおいて起こった場合（すなわちナンセンス変異）、対応するアミノ酸変化は「Ｏ」と示される（例えば、変異体ＩＤ４３５６を参照、「６１Ｃ＞Ｏ」のアミノ酸変化を示す）。第７列（「効果」）は、変異が非同義（「Nonsyn.」）アミノ酸置換を生じるか、あるいはナンセンス変異（「Nonsense」）変異を生じるかを示している。第８列（「ドメイン」）は、いくつかの変異について、アミノ酸変化が起こるタンパク質ドメインを示している。タンパク質ドメインは、Pfam命名法によって示される。（Bateman et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(1): D138-141.参照）。第９列（「体細胞性又は生殖系列」）は、ある変異が腫瘍試料においてのみ見出され、同じ患者の正常な試料においては見出されない（すなわち体細胞変異）、もしくは、腫瘍試料及び同じ患者の正常試料の両方において見出された（すなわち生殖系列の多型）ことを示している。特定の変異は、多数の腫瘍試料において見出された。そのような場合、同じ患者の少なくとも１つの試料で変異が見られなかった場合は、変異は体細胞変異であると分類された。同様に、同じ患者の少なくとも１つの試料で変異が存在した場合は、変異は生殖系列の多型であると分類された。
図３における表の第６列（「AA_CHGE」）は、前の列において記載されるヌクレオチド置換により生じるアミノ酸変化を記載する。アミノ酸は、翻訳されたｃＤＮＡ配列の位置に従って番号をつけられる。ヌクレオチド置換が終止コドンにおいて起こった場合（すなわちナンセンス変異）、対応するアミノ酸変化は「Ｏ」と示される（例えば、変異体ＩＤ４３５６を参照、「６１Ｃ＞Ｏ」のアミノ酸変化を示す）。第７列（「効果」）は、変異が非同義（「Nonsyn.」）アミノ酸置換を生じるか、あるいはナンセンス変異（「Nonsense」）変異を生じるかを示している。第８列（「ドメイン」）は、いくつかの変異について、アミノ酸変化が起こるタンパク質ドメインを示している。タンパク質ドメインは、Pfam命名法によって示される。（Bateman et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(1): D138-141.参照）。第９列（「体細胞性又は生殖系列」）は、ある変異が腫瘍試料においてのみ見出され、同じ患者の正常な試料においては見出されない（すなわち体細胞変異）、もしくは、腫瘍試料及び同じ患者の正常試料の両方において見出された（すなわち生殖系列の多型）ことを示している。特定の変異は、多数の腫瘍試料において見出された。そのような場合、同じ患者の少なくとも１つの試料で変異が見られなかった場合は、変異は体細胞変異であると分類された。同様に、同じ患者の少なくとも１つの試料で変異が存在した場合は、変異は生殖系列の多型であると分類された。
３．腫瘍型及びタンパク質ファミリー
図１、２及び３に記載される変異は、非小細胞肺癌において同定された。日常的なスクリーニングが、変異が癌の他の型において起こるかどうか決定するために用いられ得る。組成物及び本発明の方法は、示された遺伝子および／またはコード化されたポリペチドにおける変異を含む任意の癌に対して適用できる。
変異は、種々のタンパク質ファミリーのタンパク質をコード化する遺伝子において見出された。例えば、変異は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を含む多くのキナーゼをコード化する遺伝子において見出された。一般にキナーゼの活性化は、細胞増殖及び腫瘍促進と多くの場合関連している。したがって、キナーゼをコード化する遺伝子の変異は、キナーゼ活性を増大する「機能の獲得」変異である場合がある。この種の変異が検出される腫瘍は、したがって、キナーゼ・アンタゴニストに応答する場合がある。種々のキナーゼ・アンタゴニストは、現在従来技術において周知である。この種のキナーゼ・アンタゴニストは、例えば、3-[2,4-ジメチルピロル-5-イル）メチリデン]-インドリン-2-オン（SU5416）；イマチニブ(imatinib)（Gleevec（登録商標））、2-フェニルアミノピリミジン；1-tert-ブチル-3-[6（3,5-ジメトキシ-フェニル）-2（4-ジエチルアミノ-ブチルアミノ）-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-ウレア（PD173074）（Moffa et al. (2004) Mol. Cancer Res. 2: 643-652参照）；及び3-[3-(2-カルボキシエチル）-4-メチルピロル-2-メチルイデニル]-2-インドリノン（SU5402）などのインドリノン（Bernard-Pierrot (2004) Oncogene 23:9201-9211参照）などのアンタゴニスト抗体及び小分子アンタゴニストを含むが、これに限定されるものではない。
変異は、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ５３及び網膜芽細胞腫）においても見出された。一般に腫瘍抑制機能の損失は、細胞増殖及び腫瘍促進と多くの場合関連している。したがって、腫瘍抑制遺伝子をコード化する遺伝子の変異は、腫瘍抑制機能を減少させる完全に、もしくは部分的に機能を損失させる変異である場合がある。この種の変異が検出される腫瘍は、腫瘍抑制アゴニストに応答する場合がある。腫瘍抑制アゴニストは、例えば、アゴニスト抗体、腫瘍抑制遺伝子をコード化しているポリヌクレオチド、腫瘍抑制因子自体又は腫瘍抑制因子−Ｆｃ融合体である。
図１、２及び３に記載される変異は、非小細胞肺癌において同定された。日常的なスクリーニングが、変異が癌の他の型において起こるかどうか決定するために用いられ得る。組成物及び本発明の方法は、示された遺伝子および／またはコード化されたポリペチドにおける変異を含む任意の癌に対して適用できる。
変異は、種々のタンパク質ファミリーのタンパク質をコード化する遺伝子において見出された。例えば、変異は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を含む多くのキナーゼをコード化する遺伝子において見出された。一般にキナーゼの活性化は、細胞増殖及び腫瘍促進と多くの場合関連している。したがって、キナーゼをコード化する遺伝子の変異は、キナーゼ活性を増大する「機能の獲得」変異である場合がある。この種の変異が検出される腫瘍は、したがって、キナーゼ・アンタゴニストに応答する場合がある。種々のキナーゼ・アンタゴニストは、現在従来技術において周知である。この種のキナーゼ・アンタゴニストは、例えば、3-[2,4-ジメチルピロル-5-イル）メチリデン]-インドリン-2-オン（SU5416）；イマチニブ(imatinib)（Gleevec（登録商標））、2-フェニルアミノピリミジン；1-tert-ブチル-3-[6（3,5-ジメトキシ-フェニル）-2（4-ジエチルアミノ-ブチルアミノ）-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル]-ウレア（PD173074）（Moffa et al. (2004) Mol. Cancer Res. 2: 643-652参照）；及び3-[3-(2-カルボキシエチル）-4-メチルピロル-2-メチルイデニル]-2-インドリノン（SU5402）などのインドリノン（Bernard-Pierrot (2004) Oncogene 23:9201-9211参照）などのアンタゴニスト抗体及び小分子アンタゴニストを含むが、これに限定されるものではない。
変異は、腫瘍サプレッサー遺伝子（例えばｐ５３及び網膜芽細胞腫）においても見出された。一般に腫瘍抑制機能の損失は、細胞増殖及び腫瘍促進と多くの場合関連している。したがって、腫瘍抑制遺伝子をコード化する遺伝子の変異は、腫瘍抑制機能を減少させる完全に、もしくは部分的に機能を損失させる変異である場合がある。この種の変異が検出される腫瘍は、腫瘍抑制アゴニストに応答する場合がある。腫瘍抑制アゴニストは、例えば、アゴニスト抗体、腫瘍抑制遺伝子をコード化しているポリヌクレオチド、腫瘍抑制因子自体又は腫瘍抑制因子−Ｆｃ融合体である。
Ｂ．組成物
一つの態様では、少なくともＰＲＯポリヌクレオチドの断片を含んでいる単離されたポリヌクレオチドが提供され、断片はヌクレオチド変異を含む。一実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様において、ＰＲＯポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長、あるいはおよそ完全長コード化配列の長さである。これに関連して、用語「約」は、その引用された長さのプラス・マイナス１０％のヌクレオチド配列長を意味する。他の一実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：１−３７から選択されるポリヌクレオチド配列又はその断片におけるヌクレオチド変異を含む。他の実施形態では、上記ポリヌクレオチドのいずれかの相補鎖が提供される。他の一実施態様において、上記ポリヌクレオチドのいずれかにコード化されるＰＲＯが提供される。
一つの態様では、少なくともＰＲＯポリヌクレオチドの断片を含んでいる単離されたポリヌクレオチドが提供され、断片はヌクレオチド変異を含む。一実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様において、ＰＲＯポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２０ヌクレオチド長、あるいは、あるいは少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約５００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約７００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約８００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１０００ヌクレオチド長、あるいはおよそ完全長コード化配列の長さである。これに関連して、用語「約」は、その引用された長さのプラス・マイナス１０％のヌクレオチド配列長を意味する。他の一実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号：１−３７から選択されるポリヌクレオチド配列又はその断片におけるヌクレオチド変異を含む。他の実施形態では、上記ポリヌクレオチドのいずれかの相補鎖が提供される。他の一実施態様において、上記ポリヌクレオチドのいずれかにコード化されるＰＲＯが提供される。
一実施態様において、ここに提供される単離されたポリヌクレオチドは、例えばラジオアイソトープ、蛍光剤又は発色剤によって検出可能に標識化されている。他の一実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、プライマーである。他の一実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは、例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドである。他の一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、７−６０ヌクレオチド長、９−４５ヌクレオチド長、１５−３０ヌクレオチド長又は１８−２５ヌクレオチド長である。他の一実施態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＮＡ、モルホリノ−アミド亜リン酸エステル、ＬＮＡ又は２’−アルコキシアルコキシである。ここに提供されるオリゴヌクレオチドは、例えばヌクレオチド変異の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。
他の一実施態様において、ヌクレオチド変異（例えば置換）を含んでいるＰＲＯポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドが提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。アレル特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＲＯポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズされる場合、ヌクレオチド変異に塩基対合するヌクレオチドを含む。他の一実施態様において、アレル特異的オリゴヌクレオチドの相補鎖が、提供される。他の一実施態様において、マイクロアレイは、アレル特異的オリゴヌクレオチド又はその相補鎖を含む。他の一実施態様において、アレル特異的オリゴヌクレオチド又はその相補鎖は、アレル特異的プライマーである。
アレル特異的オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド変異に特異的に塩基対合するヌクレオチドが野生型ＰＲＯポリヌクレオチドに存在する対応するヌクレオチドに塩基対合するヌクレオチドに交換された点を除いてアレル特異的オリゴヌクレオチドに同一なコントロールオリゴヌクレオチドと共に用いることができる。この種のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがヌクレオチド変異を含んでいるＰＲＯポリヌクレオチド及び対応する野生型ヌクレオチドを含んでいるＰＲＯポリヌクレオチドとを区別することができるハイブリダイゼーション条件の下で、競合結合測定において用いられ得る。例えば、オリゴヌクレオチドの長さ及び塩基組成に基づいて通常の方法を用いると、当業者は、（ａ）アレル特異的オリゴヌクレオチドが野生型ＰＲＯポリヌクレオチドと比較してヌクレオチド変異を含んでいるＰＲＯポリヌクレオチドに優先して結合し、（ｂ）コントロールオリゴヌクレオチドがヌクレオチド変異を含んでいるＰＲＯポリヌクレオチドと比較して野生型ＰＲＯポリヌクレオチドに優先して結合するのに適したハイブリダイゼーション条件に達することができる。例示的な条件は、例えば５５℃での５×標準食塩リン酸塩ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）及び０．５％ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ））に続いて５５℃又は室温で２×ＳＳＰＥ及び０．１％ＳＤＳで洗浄するというハイブリダイゼーション条件など、高いストリンジェンシー条件を含む。
別の態様においては、野生型ＰＲＯと比較して、アミノ酸変異を含むＰＲＯに優先して結合する結合剤が提供される。一実施態様において、アミノ酸変異が、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、結合剤は抗体である。
別の態様においては、診断キットが提供される。一実施例において、キットは、前述のポリヌクレオチド及び酵素のいずれかを含む。一実施態様において、酵素は、ヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼから選択される少なくとも一つの酵素である。
別の態様においては、診断キットが提供される。一実施例において、キットは、前述のポリヌクレオチド及び酵素のいずれかを含む。一実施態様において、酵素は、ヌクレアーゼ、リガーゼ及びポリメラーゼから選択される少なくとも一つの酵素である。
Ｃ．方法
一つの態様では、生体試料に由来されるＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異を検出することを含む腫瘍の存在を検出する方法が提供される。一実施態様において、生体試料は、腫瘍を有すると推測される哺乳動物から得られる。
別の態様においては、ヌクレオチド変異が生体試料に由来されるＰＲＯポリヌクレオチドに存在するかどうか検出することを含む生体試料の遺伝子型を決定する方法が提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、生体試料は、腫瘍細胞を含むと推測される。他の一実施態様において、生体試料は、例えば不死化細胞株などの細胞株である。他の一実施態様では、生体試料は腫瘍である。そのような実施態様において、腫瘍の遺伝子型は、腫瘍を分類するための基礎を提供する。
一つの態様では、生体試料に由来されるＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異を検出することを含む腫瘍の存在を検出する方法が提供される。一実施態様において、生体試料は、腫瘍を有すると推測される哺乳動物から得られる。
別の態様においては、ヌクレオチド変異が生体試料に由来されるＰＲＯポリヌクレオチドに存在するかどうか検出することを含む生体試料の遺伝子型を決定する方法が提供される。一実施態様において、ヌクレオチド変異が、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、生体試料は、腫瘍細胞を含むと推測される。他の一実施態様において、生体試料は、例えば不死化細胞株などの細胞株である。他の一実施態様では、生体試料は腫瘍である。そのような実施態様において、腫瘍の遺伝子型は、腫瘍を分類するための基礎を提供する。
別の態様においては、生体試料に由来するＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異を検出することを含む哺乳動物からの生体試料における腫瘍細胞を同定する方法が提供される。一実施態様において、変異はヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、変異はアミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯ機能的ドメインに存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、生体試料は、例えば癌性であると推測される細胞を含んでいる組織サンプルなどの生検である。
別の態様においては、哺乳動物から得た生体試料に由来するＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異の存在を検出することを含む哺乳動物の腫瘍を診断する方法が提供され、その生体試料は腫瘍細胞を含むことが知られている又は推測される生体試料である。一実施態様において、変異は、ヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、変異はアミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯ機能的ドメインに存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位で存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、前記方法は、例えば腫瘍が特定のＰＲＯポリヌクレオチド又はＰＲＯにおけるヌクレオチド又はアミノ酸の変異により特徴づけられるように、腫瘍を分類する方法である。
別の態様においては、哺乳動物からの腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドを目標とする治療薬に応答するかどうかを予測するための方法が提供され、前記方法は腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯヌクレオチドにおける変異を含むかどうかについて決定することを含み、ＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異の存在が腫瘍が治療薬に応答することを示す方法である。一実施態様において、変異はヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３からの選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３からの選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、変異はアミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯ機能的ドメインに存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、ＰＲＯは、例えばＲＴＫなどのチロシンキナーゼのようなキナーゼである。他の一実施態様では、ＰＲＯは腫瘍抑制因子である。
別の態様においては、ＰＲＯをコード化している核酸のヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変異の有無を検出する方法が提供され、その方法は、（ａ）核酸を前述のポリヌクレオチド（セクションＩＩ．Ｂ）のいずれかと、核酸とポリヌクレオチドがハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件下で接触させ、（ｂ）ポリヌクレオチドが前記のヌクレオチド位置で核酸と特異的に塩基対合するかどうかを検出することを含む方法である。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。
別の態様においては、ＰＲＯをコード化している核酸のヌクレオチド変異の有無を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）アレル特異的オリゴヌクレオチドが核酸へハイブリダイズするのに適した条件下で、ヌクレオチド変異に特異的なアレル特異的オリゴヌクレオチドを核酸に接触させ、（ｂ）アレル特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出することを含む方法である。一実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、アレル特異的なオリゴヌクレオチドは、アレル特異的なプライマーである。
別の態様においては、ヌクレオチド変異を含むＰＲＯポリヌクレオチド又はその断片を含む核酸を増幅する方法が提供され、その方法は（ａ）ヌクレオチド変異の３’配列にハイブリダイズするプライマーを核酸を接触させ、（ｂ）ヌクレオチド変異を含む増幅産物を生成するためにプライマーを伸長することを含む方法である。一実施形態において、その方法は、ヌクレオチド変異の３’配列にハイブリダイズする第２のプライマーに増幅産物を接触させ、第２の増幅産物を生成するために第２のプライマーを伸長することを更に含む。そのような実施態様において、その方法は、増幅産物及び第２の増幅産物を、例えばＰＣＲによって増幅することを更に含む。前記実施態様のいずれかにおいて、ヌクレオチド変異は図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。前記実施態様のいずれかにおいて、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。
別の態様においては、（ａ）ＰＲＯの活性を測定し、（ｂ）野生型ＰＲＯの活性とＰＲＯの活性を比較することを含む、アミノ酸変異を含むＰＲＯの活性を評価する方法が提供される。一実施態様において、活性はキナーゼ活性である。他の一実施態様では、活性は腫瘍抑制活性である。他の一実施態様では、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯの機能的ドメインに存在する。他の一実施態様では、アミノ酸変異が、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。他の一実施態様では、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。
別の態様においては、腫瘍の治療のための薬剤を同定する方法が提供され、その方法は、（ａ）アミノ酸変異を含むＰＲＯを試験剤と接触させ、（ｂ）試験剤がある場合のＰＲＯの活性を、試験剤がない場合のＰＲＯの活性を用いて評価することを含み、試験剤が存在する場合にＰＲＯの活性が増減することが、試験剤が腫瘍の治療のための薬剤であることを示す方法である。一実施形態において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯの機能的ドメインに存在する。他の一実施態様では、アミノ酸変異が、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。他の一実施態様では、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、ＰＲＯは、例えばＲＴＫなどのチロシンキナーゼのようなキナーゼであり、試験剤が存在する場合にキナーゼの活性が減少することは、試験剤が腫瘍の治療のための剤であることを示す。他の一実施態様では、ＰＲＯは腫瘍抑制因子であり、試験剤が存在する場合における腫瘍抑制因子の活性増大は、試験剤が腫瘍の治療のための剤であることを示す。
別の態様においては、活性化変異を有するＰＲＯを含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供され、その方法はＰＲＯのアンタゴニストに腫瘍細胞を暴露することを含む。一実施形態において、ＰＲＯは、例えば受容体チロシンキナーゼなどのキナーゼである。
別の態様においては、ＰＲＯの活性を減少させる変異をＰＲＯ内に含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供され、その方法はＰＲＯのアゴニストに腫瘍細胞を暴露することを含む。一実施形態において、アゴニストは、ＰＲＯポリヌクレオチド又はＰＲＯを含む。他の一実施態様では、ＰＲＯは、腫瘍抑制因子である。
別の態様においては、ＰＲＯの活性を減少させる変異をＰＲＯ内に含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供され、その方法はＰＲＯのアゴニストに腫瘍細胞を暴露することを含む。一実施形態において、アゴニストは、ＰＲＯポリヌクレオチド又はＰＲＯを含む。他の一実施態様では、ＰＲＯは、腫瘍抑制因子である。
別の態様においては、ＰＲＯ内に変異を含んでいる腫瘍を治療する方法が提供され、その方法は腫瘍を有する哺乳動物にＰＲＯのアンタゴニスト又はアゴニストを含む製剤の有効量を投与することを含む。一実施形態において、変異は、ヌクレオチド変異である。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する。そのような実施態様において、ヌクレオチド変異は、図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である。他の一実施態様では、変異は、アミノ酸変異である。そのような実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるＰＲＯの機能的ドメインに存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸位に存在する。別の実施態様において、アミノ酸変異は、図１又は３から選択されるアミノ酸変化である。他の一実施態様では、ＰＲＯは、例えばＲＴＫなどのチロシンキナーゼのようなキナーゼである。他の一実施態様では、ＰＲＯは、腫瘍抑制因子である。
上記方法のいずれかによると、腫瘍は、肺腫瘍（特に非小細胞肺癌腫）、乳房腫瘍、結腸腫瘍、腎臓腫瘍、肝腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍、皮膚腫瘍（メラノーマ及び非メラノーマ皮膚癌を含む）及びリンパ腫から選択される腫瘍であってもよい。一実施形態において、腫瘍は例えば非小細胞肺癌などの肺腫瘍である。
上記方法のいずれかによると、ヌクレオチド変異は体細胞変異又は生殖系列多型であってもよい。
上記方法のいずれかによると、ヌクレオチド変異は体細胞変異又は生殖系列多型であってもよい。
Ｄ．一般的な技術
上記方法のいずれかによると、核酸は、ゲノムＤＮＡ；ゲノムＤＮＡから転写されるＲＮＡ；又はＲＮＡから生成されるｃＤＮＡであってもよい。核酸は、脊椎動物（例えば哺乳動物）に由来してもよい。核酸は、その供給源から直接得られる場合、又はそれがその供給源において見出される核酸のコピーである場合、特定の供給源に「由来する」という。
上記方法のいずれかによると、核酸は、ゲノムＤＮＡ；ゲノムＤＮＡから転写されるＲＮＡ；又はＲＮＡから生成されるｃＤＮＡであってもよい。核酸は、脊椎動物（例えば哺乳動物）に由来してもよい。核酸は、その供給源から直接得られる場合、又はそれがその供給源において見出される核酸のコピーである場合、特定の供給源に「由来する」という。
核酸は、核酸のコピー（例えば増幅により生じるコピー）を含む。例えば、変異を検出するための材料の所望の量を得るために、場合により増幅が望ましいことがある。例えば、ＰＲＯポリヌクレオチド又はその一部は、核酸材料から増幅され得る。変異がアンプリコン内に存在するかどうか決定するために、アンプリコンを、後述するような変異検査法に供してもよい。
変異は、特定の周知の方法によって検出され得る。この種の方法は、ＤＮＡ塩基配列決定、アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ及びアレル特異的プライマー伸長アッセイ（例えばアレル特異的ＰＣＲ、アレル特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）及びｇａｐ−ＬＣＲ）を含むプライマー伸長アッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーション検定法（例えばオリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ）；切断剤からの保護を核酸デュプレックスのミスマッチ塩基を検出するために用いる切断保護アッセイ； ＭｕｔＳタンパク質結合の分析；変異体及び野生型核酸分子の可動性を比較する電気泳動的解析;、変性こう配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ、例えばMyers et al. (1985) Nature 313:495に記載）;ミスマッチ塩基対のＲＮアーゼ切断の分析；ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的又は酵素による切断の分析；マススペクトル分析（例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）；遺伝子のビット分析（ＧＢＡ）；５’ヌクレアーゼ・アッセイ（例えばTaqMan（登録商標））；及び分子ビーコンを用いたアッセイを含むが、これに限定されるものではない。これらの方法のいくつかは、以下でより詳細に検討される。
標的核酸変異の検出は、その分野で公知の技術を用いて、標的核酸分子クローニング及び配列決定により達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような増幅技術を、腫瘍組織のゲノムＤＮＡ標本から直接標的核酸配列を増幅するために用いることができる。増幅された配列の核酸配列が決定され、変異が同定される。増幅技術はその分野で公知であり、例えば、ＰＣＲはSaiki et al., Science 239:487, 1988；米国特許番号４，６８３，２０３及び４，６８３，１９５において記載される。
その分野で公知であるリガーゼ連鎖反応もまた、標的核酸配列を増幅するために用いることができる。Wu et al., Genomics 4:560-569 (1989)参照。さらにアレル特異的ＰＣＲとして公知の技術もまた、変異（例えば置換）を検出するために用いることができる。Ruano and Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17:8392; McClay et al. (2002) Analytical Biochem. 301:200-206参照。この技術のある実施態様において、アレル特異的プライマーを用いることができ、そのプライマーの３’末端ヌクレオチドは標的核酸における特定の変異に相補的である（すなわち、特異的に塩基対合できる）。特定の変異がない場合、増幅産物は観察されない。Amplification Refractory Mutation System（ＡＲＭＳ）もまた、変異（例えば置換）を検出するために用いることができる。ＡＲＭＳは、例えば、ヨーロッパ特許出願公開番号０３３２４３５及びNewton et al., Nucleic Acids Research, 17:7, 1989において記載される。
変異（例えば置換）を検出するために有用な他の方法は（1）単一塩基伸長アッセイなどのアレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ（Chen et al. (2000) Genome Res. 10: 549-557；Fan et al. (2000) Genome Res. 10: 853-860；Pastinen et al. (1997) Genome Res. 7: 606-614；及びYe et al. (2001) Hum. Mut. 17: 305-316)参照）；（2）アレル特異的ＰＣＲを含むアレル特異的プライマー伸長アッセイ（Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17: 305-316；及びShen et al. Genetic Engineering News, vol. 23, Mar. 15, 2003参照）；（3）５’ヌクレアーゼアッセイ（De La Vega et al. (2002) BioTechniques 32：S48-S54（TaqMan（登録商標）アッセイを記載）； Ranade et al. (2001) Genome Res. 11: 1262-1268；及びShi (2001) Clin. Chem. 47:164-172参照)；（4）分子ビーコンを用いるアッセイ（Tyagi et al. (1998) Nature Biotech. 16:49-53；及びMhlanga et al. (2001) Methods 25:463-71参照）；及び、（5）オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（Grossman et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22: 4527-4534；米国特許出願公開番号ＵＳ２００３／０１１９００４ Ａ１；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０１／９２５７９ Ａ２；及び米国特許番号６，０２７，８８９参照）を含むが、これに限定されるものではない。
変異は、ミスマッチ検出法によってもまた検出され得る。ミスマッチは、１００％相補的でないハイブリダイズされた二本鎖核酸である。完全な相補性の欠如は、欠失、挿入、逆転又は置換に起因している場合がある。ミスマッチ検出法の１つの例は、例えば、Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005)及びFaham et al., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001)において記載されるMismatch Repair Detection（ＭＲＤ）アッセイである。他のミスマッチ切断技術の例は、ＲＮアーゼ保護法であり、Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575, 1985及びMyers et al., Science 230:1242, 1985においてその詳細が記載される。例えば、本発明の方法は、ヒト野生型標的核酸に相補的な標識化されたリボプローブを用いてもよい。組織サンプルの由来される標的核酸及びリボプローブは、共にアニール（ハイブリダイズ）され、二本鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出することが可能な酵素ＲＮアーゼＡによってその後消化される。ミスマッチがＲＮアーゼＡによって検出されると、ミスマッチの部位で切断される。したがって、アニールされたＲＮＡ標本が電気泳動的ゲルマトリックスに分離され、ミスマッチが検出されてＲＮアーゼＡによって切断された場合、リボプローブ及びｍＲＮＡもしくはＤＮＡに対して全長二本鎖ＲＮＡより小さいＲＮＡ産物が確認される。リボプローブは、標的核酸の完全長である必要はなく、それが変異を有すると推測される位置を含むならば標的核酸の一部であってもよい。
これと同様の方法で、例えば酵素的もしくは化学的な切断を通して、ミスマッチを検出するためにＤＮＡプローブを用いることができる。Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397, 1988；及びShenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:989, 1975参照。あるいは、ミスマッチは、マッチする二本鎖と比較して、ミスマッチ二本鎖の電気泳動易動度の変動によって検出することができる。Cariello, Human Genetics, 42:726, 1988参照。変異を含むと推測される標的核酸は、リボプローブ又はＤＮＡプローブのいずれかにより、ハイブリダイゼーションの前に増幅されてもよい。特に標的核酸の変化が、大きな再配列（例えば欠失及び挿入）である場合、その変化はサザンハイブリダイゼーションを用いても検出できる。
標的核酸又は周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長多形性（ＲＦＬＰ）プローブを、変異（例えば挿入又は欠失）の検出に用いることができる。挿入及び欠失を、標的核酸のクローニング、配列決定及び増幅により検出することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析もまた、アレルの塩基変化変異体の検出に用いることができる。Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989及びGenomics, 5:874-879, 1989参照。
本発明は、本発明の方法を行うのに適した種々の組成物をも提供する。例えば、本発明は、この種の方法で用いられるアレイを提供する。一実施形態において、本発明のアレイは、本発明の変異を検出するために有用な、個人の核酸分子又は核酸分子のコレクションを含む。例えば、本発明のアレイは、一連の別々に配置された個々のアレル特異的オリゴヌクレオチド又はアレル特異的オリゴヌクレオチドのセットを含んでもよい。固体基質（例えばスライドグラス）に核酸を結合させるためのいくつかの技術は、その分野において周知である。１つの方法は、固体基質（例えばアミン基、アミン基の誘導体又は正電荷を有する他のグループ）に給合可能な反応性成分を含む修飾塩基又はアナログを、合成される核酸分子に組み込むことである。それから、合成された産物を、固体基質（例えばアルデヒド又は他の反応基を有するコーティング付きスライドグラス）に接触させる。アルデヒド又は他の反応基は、増幅された産物上で反応性成分と共有結合を形成し、スライドグラスに共有結合する。アミノプロピルシリカ(amino propryl silican)界面化学を用いるような他の方法もまた公知技術である。
上記の方法のいずれかによると、生体試料は当業者に周知である特定の方法を用いて得られる。生体試料は、脊椎動物、特に哺乳動物から得られてもよい。組織生検は、腫瘍組織の典型的な試験片を得るために、たびたび用いられる。あるいは、腫瘍細胞は、公知の、又は興味がある腫瘍細胞を含むと考えられる組織又は体液の形で間接的に得られることができる。例えば、肺癌病変の試料は、切除、気管支鏡検査法、微細な針穿刺吸引、気管支擦過法によるか、痰肋膜体液又は血液から、得られてもよい。標的核酸（又はコード化されたポリペプチド）の変異は、腫瘍試料又は他の体試料（例えば尿、痰又は血清）から検出され得る。（癌細胞は、腫瘍から脱落し、この種の体試料に出現する。）
この種の体試料のスクリーニングにより、疾患（例えば癌）の簡潔な早期診断が達成される。さらに、治療の進捗は、標的核酸（又はコード化されたポリペプチド）における変異について、この種の体試料を検査することによって、より容易にモニターすることができる。さらに腫瘍細胞の組織標本を拡充するための方法は、この分野において公知である。例えば、組織は、パラフィン又はクリオスタット切片から単離されてもよい。癌細胞は、フローサイトメトリー又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより正常細胞から分離され得る。
この種の体試料のスクリーニングにより、疾患（例えば癌）の簡潔な早期診断が達成される。さらに、治療の進捗は、標的核酸（又はコード化されたポリペプチド）における変異について、この種の体試料を検査することによって、より容易にモニターすることができる。さらに腫瘍細胞の組織標本を拡充するための方法は、この分野において公知である。例えば、組織は、パラフィン又はクリオスタット切片から単離されてもよい。癌細胞は、フローサイトメトリー又はレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにより正常細胞から分離され得る。
ＩＩＩ．実施例
２５のヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）標本は、商業的な供給源から得られた。標本は、充分な腫瘍含有量（すなわち７５％を超える腫瘍細胞）を確保するために、病理検査にかけられた。以下に記載するように、１００の遺伝子がミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）を用いて変異について分析され、それらの遺伝子の一部が独立してサンガーの配列決定を用いて分析された。１００の選択された遺伝子のうちのいくつかは、癌における役割を担っていることが既知もしくはその疑いがあったもので、いくつかは以前は腫瘍形成又は腫瘍増殖に関与するとされていなかった。
２５のヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）標本は、商業的な供給源から得られた。標本は、充分な腫瘍含有量（すなわち７５％を超える腫瘍細胞）を確保するために、病理検査にかけられた。以下に記載するように、１００の遺伝子がミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）を用いて変異について分析され、それらの遺伝子の一部が独立してサンガーの配列決定を用いて分析された。１００の選択された遺伝子のうちのいくつかは、癌における役割を担っていることが既知もしくはその疑いがあったもので、いくつかは以前は腫瘍形成又は腫瘍増殖に関与するとされていなかった。
Ａ．MRDによる変異の同定
ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）は、選択された遺伝子におけるヌクレオチド変異を同定するために用いられた。ＭＲＤ法の詳細は、Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005)及びFaham et al., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001)に記載される。簡潔に、ＰＣＲプライマーは、興味がある各エキソンについて設計された。各フォワードＰＣＲプライマの５’末端に、２５のヌクレオチド配列が付加された。２１のヌクレオチドは、各アンプリコンに特異的なタグ配列を構成し、残りの４塩基対はＨａｅＩＩＩ制限酵素消化サイトを形成しており、それはアレイ検出ステップの前にゲノム配列からタグを切り離すために最終的に用いられた。
ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）は、選択された遺伝子におけるヌクレオチド変異を同定するために用いられた。ＭＲＤ法の詳細は、Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005)及びFaham et al., Hum. Mol. Genet. 10:1657-1664 (2001)に記載される。簡潔に、ＰＣＲプライマーは、興味がある各エキソンについて設計された。各フォワードＰＣＲプライマの５’末端に、２５のヌクレオチド配列が付加された。２１のヌクレオチドは、各アンプリコンに特異的なタグ配列を構成し、残りの４塩基対はＨａｅＩＩＩ制限酵素消化サイトを形成しており、それはアレイ検出ステップの前にゲノム配列からタグを切り離すために最終的に用いられた。
ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてホモ接合型基準ゲノム（胞状奇胎(hydatiform mole)）を用いた各プライマ一対と共に実行された。全てのアンプリコンは、基準配列を作製するために、プールされ、プラスミドにクローニングされた。共通のＳＮＰを有する配列に対して、各々の２つのアレルに対応する２つの標準（２つの異なるタグ配列を伴う）を構築することが試みられた。同じＰＣＲプライマーは、腫瘍及び対象正常ＤＮＡの各対に対して、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）を用いた複合ＰＣＲのために利用された。腫瘍及び対象正常試料からのＰＣＲ産物は、標準配列のセット（同じく、ゲノム配列を欠いている対照ベクター）にハイブリダイズされ、それによって標準ゲノムの対象領域の鎖及び試験試料からの鎖を伴うヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子が形成された。
ヘテロニ重鎖分子は、一斉にミューテーションソーター(Mutation Sorter)大腸菌株に形質転換した。基準及び試験ＤＮＡ間のミスマッチを修復するバクテリアが修復を行わないバクテリアとは異なる抗生物質抵抗性表現型を有するように、ミューテーションソーター菌株は設計される。（Faham et al., (2001) supra.を参照）。形質転換後、細菌培養は、変異及び非変異断片を選択するために２つの異なる培地で行われた。２つの選択された細菌培養から得られるミニプレップＤＮＡは、ベクター配列に相補的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ産物はタグ配列を残りのゲノム配列から分離するためにＨａｅＩＩＩで消化され、２つのプール由来のタグは混合され、二色アッセイ(two-color assay)においてアレイ上へハイブリダイズされた。基準試料と同一の断片は主に非変異体プールにおいてシグナルを発生したが、標準試料と異なる断片は主に変異体プールにおいてシグナルを有しており、ヘテロ接合型断片は両方のプールにおいてシグナルを発生した。Nelson et al., Genome Res. 14: 1664-1668に記載されるように、ＭＲＤによって同定される。
ヌクレオチド変異は、代替マススペクトロメトリーを基とする手法を用いて腫瘍及び対応正常試料の遺伝子型を同定することにより体細胞変異であると決定された。体細胞性であることを確認されたヌクレオチド変異は癌における体細胞変異のカタログ(ＣＯＳＭＩＣ)データベースの体細胞変異と比較された（Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358を参照）。１２の体細胞性ヌクレオチド変異は、COSMICデータベースにおいて見出されており、ここでは報告されていない。
ＭＲＤによって同定された新規なヌクレオチド変異が、図１に示される。図１は、非同義又はナンセンス変異である体細胞性ヌクレオチド変異を記載する。図２は、コンセンサス・スプライスサイト領域に位置する体細胞性ヌクレオチド変異を記載する。図１及び２は、実施態様の上記の詳細な説明において、より詳細に記載される。
ＭＲＤがＦＢＸＷ７遺伝子のＷＤ４０ドメインにおける３つの体細胞変異を同定したことが示される（変異体ID No. 10007、10008及び10009を参照）。ＦＢＸＷ７は、損傷した場合に結腸直腸腫瘍において染色体不安定性を誘導することが示されている既知の腫瘍抑制遺伝子である。Rajagopalan, H. et al. (2004) Nature 428:77-81を参照。ＷＤ４０ドメインは、ＦＢＸＷ７及びサイクリンＥ間の相互作用において重要であり（Orlicky, S. et al. (2003) Cell 112:243-256を参照）、結直腸癌において変異していることが見出された。Rajagopalan, supraを参照。ＦＢＸＷ７は更に６１のＮＳＣＬＣ腫瘍において配列決定されたが、更なる変異は同定されなかった。発明者の知識によると、ＦＢＸＷ７の変異は、ＮＳＣＬＣでは報告されていない。
ＭＲＤがＦＢＸＷ７遺伝子のＷＤ４０ドメインにおける３つの体細胞変異を同定したことが示される（変異体ID No. 10007、10008及び10009を参照）。ＦＢＸＷ７は、損傷した場合に結腸直腸腫瘍において染色体不安定性を誘導することが示されている既知の腫瘍抑制遺伝子である。Rajagopalan, H. et al. (2004) Nature 428:77-81を参照。ＷＤ４０ドメインは、ＦＢＸＷ７及びサイクリンＥ間の相互作用において重要であり（Orlicky, S. et al. (2003) Cell 112:243-256を参照）、結直腸癌において変異していることが見出された。Rajagopalan, supraを参照。ＦＢＸＷ７は更に６１のＮＳＣＬＣ腫瘍において配列決定されたが、更なる変異は同定されなかった。発明者の知識によると、ＦＢＸＷ７の変異は、ＮＳＣＬＣでは報告されていない。
Ｂ．サンガー配列決定による変異の同定
サンガー配列決定は、最初に選択された１００の遺伝子のうちの５２の遺伝子においてヌクレオチド変異を同定するために用いられた。特に、ＰＣＲは、腫瘍ゲノムＤＮＡ由来のそれらの遺伝子のエキソンを増幅するために用いられた。アンプリコンは標準サンガー配列決定を用いて配列決定され、配列は変異を同定するために対応する野生型配列と比較された。変異は、以下のデータベースに存在しない変異を同定するために、ＮＣＢＩ「ｄｂＳＮＰ」データベースの一塩基変異多型（Sherry et al. (1999) Genome Res. 9: 677-679を参照）及び癌における体細胞変異のカタログ(ＣＯＳＭＩＣ)データベースの体細胞変異（Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358を参照）と比較され、新規であると決定された。変異は、オリジナルの腫瘍試料由来のエキソンを再増幅及び再配列決定することにより、確証された（すなわち、確認された）。同じ患者の正常試料のゲノムＤＮＡは、変異が体細胞変異又は生殖系列多型であるかを決定するために用いられた。同定されたヌクレオチド変異の表を含め、前述の分析結果を図３に示す。図３は、上記実施態様の詳細な説明において、より詳細に記載される。図３に特定されるいくつかの変異は、ＭＲＤによってもまた同定されたが、重複を避けるために図１（ＭＲＤにより同定された変異を記載する）から除かれた。
サンガー配列決定は、最初に選択された１００の遺伝子のうちの５２の遺伝子においてヌクレオチド変異を同定するために用いられた。特に、ＰＣＲは、腫瘍ゲノムＤＮＡ由来のそれらの遺伝子のエキソンを増幅するために用いられた。アンプリコンは標準サンガー配列決定を用いて配列決定され、配列は変異を同定するために対応する野生型配列と比較された。変異は、以下のデータベースに存在しない変異を同定するために、ＮＣＢＩ「ｄｂＳＮＰ」データベースの一塩基変異多型（Sherry et al. (1999) Genome Res. 9: 677-679を参照）及び癌における体細胞変異のカタログ(ＣＯＳＭＩＣ)データベースの体細胞変異（Bamford et al. (2004) British Journal of Cancer 91:355-358を参照）と比較され、新規であると決定された。変異は、オリジナルの腫瘍試料由来のエキソンを再増幅及び再配列決定することにより、確証された（すなわち、確認された）。同じ患者の正常試料のゲノムＤＮＡは、変異が体細胞変異又は生殖系列多型であるかを決定するために用いられた。同定されたヌクレオチド変異の表を含め、前述の分析結果を図３に示す。図３は、上記実施態様の詳細な説明において、より詳細に記載される。図３に特定されるいくつかの変異は、ＭＲＤによってもまた同定されたが、重複を避けるために図１（ＭＲＤにより同定された変異を記載する）から除かれた。
前述の本発明が理解の明快さのために図と例とをあげて詳細に記載されているが、記載及び例は本発明の範囲を制限するように解釈されてはならない。ここに引用される全ての特許文献及び科学文献の開示は、その全てを参照することにより明確に援用される。
Claims (61)
- （ａ）図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置にヌクレオチド変異を有するＰＲＯポリヌクレオチドもしくは少なくとも約１０ヌクレオチド長のその断片、又は
（ｂ）（ａ）の相補鎖
を含む単離されたポリヌクレオチド。 - ヌクレオチド変異が配列番号：１−３７において起こる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 単離されたポリヌクレオチドがプライマーである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 単離されたポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- （ａ）図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置にヌクレオチド変異を含むＰＲＯポリヌクレオチドの領域にハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチド、又は
（ｂ）その相補鎖
であるオリゴヌクレオチド。 - ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
- アレル特異的オリゴヌクレオチドがアレル特異的プライマーである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項６に記載のオリゴヌクレオチド及び少なくとも一つの酵素を含むキット。
- 少なくとも一つの酵素がポリメラーゼである、請求項９に記載のキット。
- 少なくとも一つの酵素がリガーゼである、請求項９に記載のキット。
- 請求項６に記載のオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
- （ａ）ヌクレオチド変異を含むと推測される核酸を、ヌクレオチド変異に特異的なアレル特異的オリゴヌクレオチドと、アレル特異的オリゴヌクレオチドが前記核酸にハイブリダイズするのに適した条件下で接触させ；及び
（ｂ）アレル特異的なハイブリダイゼーションの有無を検出する
ことを含む、図１から選択されるヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変異の有無を検出する方法。 - ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項１３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が体細胞変異である、請求項１３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が生殖系列多型である、請求項１３に記載の方法。
- 図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置にヌクレオチド変異を含む核酸を増幅する方法であって、
（ａ）該核酸を、該核酸のヌクレオチド変異の３’配列にハイブリダイズするプライマーと接触させ、及び
（ｂ）ヌクレオチド変異を含む増幅産物を生成するために該プライマーを伸長する
ことを含む方法。 - ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項１７に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が体細胞変異である、請求項１７に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が生殖系列多型である、請求項１７に記載の方法。
- 生体試料に由来する核酸材料における、図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置でのヌクレオチド変異の有無を検出することを含む、哺乳動物から得られた生体試料の遺伝子型を決定する方法。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項２１に記載の方法。
- 生体試料が腫瘍細胞を含むと推測される、請求項２１に記載の方法。
- 生体試料が腫瘍である、請求項２１に記載の方法。
- 腫瘍が肺腫瘍である、請求項２４に記載の方法。
- 肺腫瘍が非小細胞肺癌である、請求項２５に記載の方法。
- 検出が、プライマー伸長アッセイ；アレル特異的プライマー伸長アッセイ；アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションアッセイ；５’ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを使用したアッセイ；及びオリゴヌクレオチド・ライゲーションアッセイから選択される工程を実行することを含む、請求項２１に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が体細胞変異である、請求項２１に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が生殖系列多型である、請求項２１に記載の方法。
- 腫瘍細胞を含むことが知られている、又は推測される、哺乳動物に由来する生体試料におけるＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドの変異の存在を検出することを含む、哺乳動物における腫瘍を分類する方法。
- 腫瘍細胞が肺腫瘍細胞である、請求項３０に記載の方法。
- 肺腫瘍細胞が非小細胞肺癌細胞である、請求項３１に記載の方法。
- 変異がヌクレオチド変異である、請求項２４に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する、請求項３３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項３３に記載の方法。
- 検出が、プライマー伸長アッセイ；アレル特異的プライマー伸長アッセイ；アレル特異的ヌクレオチド取り込みアッセイ；アレル特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションアッセイ；５’ヌクレアーゼアッセイ；分子ビーコンを使用したアッセイ；及びオリゴヌクレオチド・ライゲーションアッセイから選択される工程を実行することを含む、請求項３３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が体細胞変異である、請求項３３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が生殖系列多型である、請求項３３に記載の方法。
- 変異がアミノ酸変異である、請求項３０に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるＰＲＯの機能ドメインに存在する、請求項３９に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるアミノ酸位置に存在する、請求項３９に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるアミノ酸変化である、請求項４１に記載の方法。
- 変異がＦＢＸＷ７におけるアミノ酸変異である、請求項３２に記載の方法。
- ＦＢＸＷ７におけるアミノ酸変異がＷＤ４０ドメイン内に存在する、請求項４３に記載の方法。
- アミノ酸変異がＧ３４３、Ｒ３９９及びＹ４２９から選択されるアミノ酸位置に存在する、請求項４４に記載の方法。
- 変異がＦＢＸＷ７ヌクレオチドにおけるヌクレオチド変異である、請求項３２に記載の方法。
- ヌクレオチド変異がＷＤ４０をコード化するＦＢＸＷ７ポリヌクレオチドの領域内に存在する、請求項４６に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が第４染色体のＣ１５３６０７１１６、Ｃ１５３６０４９７１及びＴ１５３６０４８８１から選択されるヌクレオチド位置におけるヌクレオチド変化である、請求項４７に記載の方法。
- ヌクレオチド変異がＣ１５３６０７１１６Ｔ、Ｃ１５３６０４９７１Ｔ及びＴ１５３６０４８８１Ａから選択されるヌクレオチド変化である、請求項４８に記載の方法。
- 腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドを標的とする治療薬に応答するかどうかを予測する方法であって、該腫瘍がＰＲＯ又はＰＲＯポリヌクレオチドにおける変異を含むかどうかを決定することを含み、変異の存在が該腫瘍が治療剤に応答するであろうことを示す、方法。
- 腫瘍が肺腫瘍である、請求項５０に記載の方法。
- 肺腫瘍が非小細胞肺癌である、請求項５１に記載の方法。
- 変異がヌクレオチド変異である、請求項５０に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド位置に存在する、請求項５３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が図１ないし３から選択されるヌクレオチド変化である、請求項５４に記載の方法。
- 変異がアミノ酸変異である、請求項５０に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるＰＲＯの機能ドメインに存在する、請求項５６に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるアミノ酸位置に存在する、請求項５６に記載の方法。
- アミノ酸変異が図１又は３から選択されるアミノ酸変化である、請求項５７に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が体細胞変異である、請求項５３に記載の方法。
- ヌクレオチド変異が生殖系列多型である、請求項５３に記載の方法。
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