KR102332989B1

KR102332989B1 - 누룩 발효물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102332989B1
Application number: KR1020210068944A
Authority: KR
Inventors: 김지혜; 염현숙; 이혜자; 함경만; 박진오; 장경희; 신대현; 이효정; 김아랑
Original assignee: 대봉엘에스 주식회사; 주식회사 코스모코스
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2021-12-01
Also published as: US20220378691A1

Abstract

본 발명은 누룩 발효물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 곡물을 누룩곰팡이(Aspergillus)로 발효시킨 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진, 항산화 효능, 보습 효능 및 노화예방 효과가 있는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

누룩 발효물을 포함하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING FERMENTED NURUK}

본 발명은 누룩을 발효시킨 누룩 발효물을 적용한 화장료 조성물에 관한 것이다.

누룩이란 술을 만드는 효소를 지닌 곰팡이를 곡류에 번식시킨 전통발효제로서, 밀, 보리, 쌀, 조 등의 술의 주원료가 되는 전분질 중심의 곡물을 갈아서 물로 반죽하여 덩이를 만들어 띄워서 곰팡이와 효모를 자연스럽게 번식시킨 것으로 녹말질의 당화제와 발효제로 사용된다.

예로부터 술 담그는 사람의 손이 희고 곱다는데 착용하여 민간요법에서는 곡물을 발효시킨 전통누룩이나 술지게미(주박)을 이용한 피부관리가 애용되어 왔으며, 최근 천연 누룩 및 이러한 천연 누룩으로 만들어지는 발효 성분을 이용하여 화장품 원료로의 적용 사례가 증가하고 있다.

뽕잎, 연잎, 두충 또는 작약과 같이 천연물을 누룩을 발효원으로 사용하여 발효한 화장료 조성물에 대하여는 여러 문헌에 개시되어 있으나, 누룩자체를 발효한 성분을 화장료 조성물에 적용한 사례는 전무한 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은, 누룩 자체를 발효한 발효물을 포함한 화장료 조성물을 제공하는 것으로, 전통 누룩에 다량 함유된 효소와 효모를 비롯한 미생물과 누룩의 원재료인 곡물 자체에 함유되어 있는 다양한 성분들을 활용하여, 피부미용에 도움이 되는 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따른 피부 개선용 화장료 조성물은, 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하며, 상기 누룩 발효물은 곡물에 누룩곰팡이(Aspergillus)을 증식한 누룩을 발효시킨 것이다.

상기 누룩은 밀누룩, 보리누룩, 쌀누룩, 녹두누룩 등일 수 있으나, 바람직하게는 밀누룩일 수 있다.

상기 밀누룩의 밀은 종류에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 앉은뱅이밀(Triticum aestivum　 L.)을 사용할 수 있다.

상기 누룩 발효물은 황누룩곰팡이(A. oryzae)를 포함하는 누룩곰팡이(Aspergillus)에 의해 발효된 것일 수 있다.

상기 누룩 발효물은 30 내지 50℃에서 발효된 것일 수 있다.

상기 누룩 발효물은 몰질량이 5 kDa이하인 저분자 펩타이드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 몰질량이 2 kDa 이하인 저분자 펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.

그리고, 상기 누룩발효물은 피부 주름 및 탄력 개선, 피부 진정, 피부 장벽 강화, 또는 피부 항산화 중 어느 하나 이상의 용도일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물 제조방법은 누룩 발효물을 2 kDa 여과막으로 여과하는 단계를 포함한다.

이때, 상기 여과 단계 이전에 누룩을 30 내지 50℃에서 발효하여 누룩 발효물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 누룩 발효물은 몰질량이 2 kDa 이하인 펩타이드를 포함하며, 밀누룩을 침지발효하여 제조된 것이다.

본 발명의 일 측면에 따른 누룩 발효물 제조방법은 밀누룩을 30 내지 50℃에서 3 내지 5일동안 침지발효하여 누룩 발효물을 제조하는 단계; 및 상기 누룩 발효물을 2 kDa 여과막으로 여과하는 단계;를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부에 흡수되어 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진하고, 자유라디칼 소거활성 증가를 통한 항산화 효능을 나타낼 수 있으며, 아쿠아포린 3 및 필라그린의 생성량을 증가시켜 보습 효능을 나타낼 수 있고, 일산화질소 생성을 억제할 수 있는바, 인체에 안전하면서도 피부 상태의 개선에 효과적인 화장료 조성물로 활용될 수 있다.

도 1은 누룩의 발효 전(Before fermentation, 비교예 1)과 발효 후(After fermentation, 실시예 1)의 처리농도에 따른 프로콜라겐 합성 효과(PIP 생성량, pro-Collagen production, %)를 비교 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 누룩의 발효 전(Before fermentation, 비교예 1)과 발효 후(After fermentation, 실시예 1)의 처리농도에 따른 DPPH 라디칼소거활성(DPPH Radical Scavenging Activity, %)을 비교 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 누룩의 발효 전(Before fermentation, 비교예 1), 발효 후(After fermentation, 실시예 1) 및 발효와 여과처리 후(< 2kDa, 실시예 2)의 처리농도에 따른 아쿠아포린3 생성량(AQP3 Production)을 비교 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 누룩의 발효 후(After fermentation, 실시예 1)와 발효와 여과처리 후(< 2kDa, 실시예 2)의 처리농도에 따른 필라그린 생성량(FLG Production)을 비교 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 누룩의 발효 후(After fermentation, 실시예 1) 및 발효와 여과처리 후(< 2kDa, 실시예 2)의 처리농도에 따른 일산화질소 생성량(NO production)을 비교 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명에서 '누룩'이란 곡물에 누룩곰팡이(Aspergillus)을 배양 및 증식시킨 것을 의미한다.

본 발명에서'발효'란 누룩을 물에서 액체 발효하는 단계로, 곡물 내 유기물을 미생물 즉, 누룩곰팡이에 의해 분해하는 과정을 의미한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예 및 도면에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 누룩을 발효시킨 누룩발효물을 유효성분으로 포함한다.

상기 화장료 조성물은, 콜라겐 합성 효과를 통한 피부 상태 개선, 자유라디칼 소거 활성을 통한 항산화 효과, 피부 수분을 잡아주는 아쿠아포린 3(AQP3) 및 필라그린(PLG) 증가에 의한 피부 보습 증가 및 피부 노화의 원인이 되는 일산화질소 생성을 억제하는 효능이 우수할 뿐 아니라 천연물질을 유효성분으로 포함하여, 내성이나 안전성과 관련된 문제가 발생되지 않는, 항노화 및 피부진정, 피부장벽 강화, 주름 개선 등 효과가 우수하여 피부상태 개선에 유용하며, 피부 주름 및 탄력 개선용, 피부 진정용, 피부 장벽 강화용 및 피부 항산화용 중 하나 이상의 용도의 화장료 조성물로 사용되는 등 다양한 화장품 제조에 널리 사용될 수 있다.

본 발명의 누룩 발효물은 누룩 자체를 활용하여 제조한 발효물로서, 누룩의 원재료인 밀에 함유되어 있는 전분과 미네랄 등 전통적인 누룩 속에 함유된 피부미용에 유용한 천연물질뿐만 아니라 전통적인 누룩에 다량 함유된 효소와 효모를 비롯한 천연의 미생물과 이 미생물에 의해 발효된 발효물을 포함하여 피부 개선에 우수한 효능이 있다.

상기 누룩은 곡물을 자연 발효시켜 제조하는 전통적인 제법뿐 아니라, 곡물을 분쇄한 뒤 적정량의 수분과 함께 누룩곰팡이(Aspergillus)를 혼합하고 이를 누룩고리에 넣고 성형하거나, 손으로 뭉쳐 성형하거나 또는 자루나 가마니 등에 넣고 주둥이를 묶은 뒤 적정 온도와 습도가 유지되는 누룩방(발효실)에서 발효시킨 뒤 숙성 건조시키는 등 모든 유형의 누룩 생산방식에 의해 제조될 수 있다.

그리고 상기 누룩은 쌀, 찹쌀, 보리, 밀, 밀기울, 현미, 귀리, 차조, 기장, 율무, 메밀, 수수, 녹두 및 팥으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이들 중 2종 이상의 혼합물을 원료로 하는 누룩일 수 있으며, 바람직하게는 밀 일수 있으며, 보다 바람직하게는 타 품종에 비하여 단백질 함량은 높으며, 아토피 등의 피부 트러블을 일으킬 수 있는 글루텐 함량이 일반 밀에 비해 낮은 우리나라 고유 토종 품종인 앉은뱅이밀(Triticum aestivum　L.)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 누룩발효물은 누룩곰팡이속(Aspergillus)에 포함된 곰팡이에 의해 발효되며, 예를 들어, 검은곰팡이(A. niger), 백국균(A. luchuensis), 황누룩곰팡이(A. oryzae) 및 흑누룩곰팡이(A. awamori)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 하기 실시예에서는 앉은뱅이밀 누룩에서 배양된 누룩곰팡이를 사용하였으며, 배양된 누룩곰팡이에는 일반적으로 황누룩곰팡이(A. oryzae)가 가장 많이 분포하고 있다.

상기 누룩 발효물은 누룩곰팡이(Aspergillus)가 가장 활성화할 수 있는 30 내지 50℃, 바람직하게는 32 내지 37℃의 온도에서 발효된 것일 수 있다. 발효온도가 30℃ 미만이면, 누룩의 발효가 제대로 이루어지지 않고, 50℃를 초과하면 과발효되어 충분한 효능을 나타내지 못할 수 있다.

상기 누룩 발효물은 저분자량인 펩타이드를 포함하는 경우 피부 개선 효과가 더욱 우수할 수 있으며, 바람직하게는 펩타이드의 몰질량이 5 kDa 이하일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 펩타이드의 몰질량이 3 kDa 이하일 수 있으며, 가장 바람직하게는 펩타이드의 몰질량이 2 kDa 이하인 경우 더욱 피부 개선 효과가 우수할 수 있다. 펩타이드 크기가 5 kDa을 초과하면 피부 침투율이 낮아서 충분한 효과를 발휘하지 못할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은, 누룩 발효물의 제조방법이다.

본 발명의 누룩 발효물은 누룩을 수중에서 발효시키는 것으로 침지 발효라고도 하며, 고체발효와 달리 미생물을 액체 환경에서 성장시킴으로서 제조된다.

상기 누룩발효물은 밀 등의 곡물에 자연적으로 누룩곰팡이를 증식시키는 전통 누룩 제조방식에 의해 제조된 누룩 또는 밀과 누룩곰팡이균을 혼합 및 배양하여 제조된 누룩을 수중(정제수)에서 발효과정을 수행하여 제조할 수도 있고, 밀 분말과 별도의 누룩곰팡이균을 정제수에서 직접 혼합 및 발효하여 제조할 수 도 있다.

상기 발효에서는 온도, 시간, pH, 교반 정도, 산소 농도 등을 제어함으로써, 미생물 전체에 균등하게 영양소를 공급하여 미생물의 성장 및 발효를 촉진 할 수 있다.

발효온도는 누룩곰팡이(Aspergillus)가 가장 활성화할 수 있는 30 내지 50℃, 바람직하게는 32 내지 37℃ 일 수 있다. 발효온도가 30℃ 미만이면, 발효가 제대로 이루어지지 않고, 50℃를 초과하면 과발효되어 충분한 효능을 나타내지 못한다.

발효기간은 3 내지 10일이며, 바람직하게는 5 내지 7일 일 수 있으나, 발효 온도에 따라 적절히 조절할 수 있다. 발효기간이 너무 짧은 경우 발효가 제대로 이루어지지 않고, 발효기간이 너무 긴 경우에는 과발효되어 피부상태에 오히려 악영향을 미칠 수 있다.

상기 누룩 발효물은 원심분리 및/또는 여과막을 이용한 여과과정을 통하여 펩타이드의 크기를 조절함으로써 효과를 더욱 향상 시킬 수 있는데, 상기 여과막의 기공사이즈(pore size)가 5 kDa 이하인 여과막으로 여과할 수 있으며, 바람직하게는 3 kDa 이하, 더욱 바람직하게는 2 kDa 이하로 여과할 수 있다. 상기 여과막 기공 사이즈가 5 kDa을 초과하면 펩타이드의 피부 침투율이 낮아서 충분한 효과를 발휘하지 못할 수 있다.

본 발명에 따른 누룩 발효물은 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 촉진시킬 수 있고, 자유라디칼 소거활성 증가를 통한 항산화 효능을 나타낼 수 있으며, 아쿠아포린 3 및 필라그린의 생성량을 증가시켜 보습 효능을 나타낼 수 있으며, 일산화질소 생성을 억제하여 피부 노화를 억제할 수 있는, 인체에 안전하면서도 항염 및 항산화, 보습, 항노화 및 피부진정, 피부장벽 강화, 주름 개선등에 효과적인 피부 외용제 조성물로 활용될 수 있다. 따라서 상기와 같은 방법으로 누룩 발효물을 제조하고, 제조된 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하여 피부 개선용 화장료 조성물을 제조할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[제조예: 누룩 발효물 제조]

(실시예 1)

누룩 발효물을 제조하기 위하여, 앉은뱅이밀 누룩(진주시 곡자공업연구소 구입)에 상기 누룩 중량 대비 10 배 중량의 정제수를 넣은 후 37℃의 온도에서 5 내지 7 일간 발효시켜 누룩 발효물을 제조한다. 제조된 누룩 발효물을 상기 누룩 발효물 대비 3배 중량의 정제수에 현탁하였으며, 현탁액을 5 ㎛ 필터로 여과하였다.

이어서, 여과액을 10 Brix(브릭스)가 될 때까지 감압 농축한 후, 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 누룩 발효물을 수득하였다.

(실시예 2)

실시예 1에서 수득된 농축된 누룩 발효물에 상기 농축된 누룩 발효물 대비 3배 중량의 에탄올을 혼합하여 4℃에서 24 시간 반응시켰다.

이후 에탄올을 제거하기 위해 10 brix(브릭스)가 될 때까지 감압 농축하였다.

이어서, 2 kDa의 필터로 UF(UltraFiltration)를 사용하여 3000 x g(gravity)에서 70 분 간 원심분리하였다.

원심분리 후 2kDa 이하의 하층 시료를 분리하여 1N의 NaOH를 첨가하여 pH를 6.00으로 조정한 후, 구연산을 첨가하여 pH 3.99가 되도록 한 후, 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 2 kDa 이하의 펩타이드를 포함하는 누룩 발효물(실시예 2)을 수득하였다.

(비교예 1)

누룩 발효물과의 비교를 위하여, 앉은뱅이밀 누룩(진주시 곡자공업연구소 구입)을 누룩 중량 대비 10 배 중량의 정제수를 넣은 후 37℃의 온도에서 1 내지 3 시간 동안 추출과정을 진행하여 누룩 추출물을 수득하였다.

이후 수득된 누룩 추출물을 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 하여 추가적인 발효과정이 없는 누룩 추출물(비교예 1)을 수득하였다.

[실험예 1 : 세포배양]

이하 실험예 2 내지 7에서 사용된 세포에 대하여 하기와 같은 배양 방법을 통하여 세포배양 후 사용하였다.

(피부 각질 형성세포 배양)

피부 각질 형성세포인 HaCaT 세포는 Cell Line service GmbH. (Germany)로부터 분양 받아 사용하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃ 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 2 내지 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.

(피부섬유아세포 배양)

피부섬유아세포인 Normal Human Dermal Fibroblasts(NHDF) 세포는 Lonza(Lonza Walkersville, Inc)로부터 분양 받아 사용하였다.

0.1% hFGF-B, 인슐린, GA-1000 및 2% 소태아혈정이 함유된 FBM(Fibroblast Basal Medium) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 항온기에서 배양하였으며, 2 내지 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.

(대식세포 배양)

대식세포인 RAW264.7 세포는 American Type Cell Culture (ATCC)로부터 분양 받아 사용하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10% 소태아 혈정(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 사용하여 37℃ 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 2 내지 3일 간격으로 계대 배양을 시행하였다.

[실험예 2 : 대식세포에 대한 세포 독성 평가]

Ez-cytox assay는 water solution tetrazolium salt(WST)가 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogensase)와 반응하여 주황색의 수용성 Formazan을 형성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

세포에서의 독성을 확인하기 위하여 RAW264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 배양 DMEM 배지를 이용하여 1.5Х10⁴ cells/mL로 96 well plate에 분주하고, 37℃ 5% CO₂ 조건에서 18 시간 동안 배양하였다.

배양된 세포를 무혈청 DMEM 배지로 교환하여, 제조된 누룩 발효물(실시예 1)의 농도가 각각 0.025%, 0.05% (v/v)가 되도록 처리하였다. 이후 EZ-cytox를 각 well에 첨가하여 37℃ 5% CO₂ 조건에서 30 분 동안 반응시킨 후, microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 무처리군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.

그리고, 누룩 추출물(비교예 1)의 농도가 각각 0.025%, 0.05%(v/v)가 되도록 처리하였고, 실시예1 및 2에 대해서도 같은 실험 방법으로 동일하게 흡광도 값을 구하였다.

구분	세포독성
구분	처리농도(%)	RAW264.7 세포생장률(%)
무처리군	-	94.0 ± 1.5
자극제(LPS)	1 μg/mL	100.0 ± 3.3
비교예 1	0.025	93.9 ± 6.0
비교예 1	0.05	95.9 ± 2.7
실시예 1	0.025	105.3 ± 3.5
실시예 1	0.05	107.1 ± 3.0
실시예 2	0.025	104.3 ± 6.9
실시예 2	0.05	111.5 ± 2.3

상기 표 1을 참조하면, 시험에 사용된 모든 시료는 대식세포에서 세포독성이 관찰되지 않았다.

[실험예 3 : 콜라겐 합성 효과 확인]

NHDF 섬유아세포를 24-well plate에 well당 2.0×10⁴개로 분주한 다음, 세포 배양조건에서 24 시간 동안 배양하였다.

배양된 세포의 배지를 무혈청 FBM 배지로 교환한 후 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 시료를 각각 0.1, 0.5 v/v%의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.

이후 각 실험군(실시예 1 및 비교예 1)의 상층액을 취하여 배지 중 유리된 프로콜라겐(procollagen)의 양을 측정하였다. 상기 프로콜라겐 양의 측정은 procollagen type I peptide (PIP) EIA kit (Takara Biomedical Co.)를 이용하였으며, 제조사에서 제공한 방법에 따라 진행하였다. 누룩 발효물(실시예 1) 및 누룩추출물(비교예 1)의 처리에 따른 프로콜라겐 제1형 펩타이드 생성량 정량 결과를 표 2와 도 1에 나타냈다.

구분	처리농도(%)	PIP 생성량(%)
무처리군	-	100±1.44
비교예 1	0.1	106.43±6.13
비교예 1	0.5	112.56±1.56
실시예 1	0.1	152.35±0.4
실시예 1	0.5	170.55±0.23

상기 표 2와 도 1을 참조하면, 누룩을 발효 시키지 않고 추출한 비교예 1(Before Fermentation)보다 실시예 1(After fermentation)의 PIP 생성량 수치가 높아 본 발명의 누룩 발효물의 콜라겐 합성 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

[실험예 4 : 항산화 효과 측정]

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 517 nm에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용하여, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 옅은 노란색이 될수록, 즉, 자유라디칼 소거율이 증가될수록, 상기 517 nm파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여, 하기와 같은 검정시험 방법에 의해 진행하였다.

먼저, 누룩 발효물(실시예 1)의 농도가 각각 0.25% 및 0.5%가 되도록 메탄올로 희석하여 누룩 발효물 희석액을 제조하였다. 상기 누룩 발효물 희석액 1ml 및 0.1 mM의 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical(DPPH, Sigma)용액 1 ml를 혼합하여 시료를 준비하였다. 제조된 시료를 실온에서 15 분간 방치한 후, microplate reader를 이용하여 파장 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그리고, 누룩 추출물(비교예 1)의 농도가 각각 0.25% 및 0.5%가 되도록 메탄올로 희석한 것을 사용한 것을 제외하고는 실시예에 대한 실험 방법과 동일하게 흡광도를 측정하였다.

또한 음성 대조군은 DPPH 1ml 및 메탄올 1ml를 혼합한 용액을 사용하였고, 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정 값을 얻기 위한 blank 시료는 메탄올 1ml 및 시료 1ml을 혼합한 용액을 사용하였다. 또한 본 실험예의 양성 대조군은 메탄올에 희석된 ascorbic acid(10ppm) 용액 1ml 및 DPPH 1ml를 혼합하여 제조하였다.

구분	처리농도(%)	DPPF 라디칼소거활성 (%)
무처리군	-	0 ± 2.4
비교예 1	0.25	28.66±2.04
비교예 1	0.5	53.51±1.01
실시예 1	0.25	73.51±2.15
실시예 1	0.5	94.61±0.11
Ascorbic acid	0.0005	91.36±0.13

상기 표 3을 참조하면, 항산화 효과 측정 결과, 누룩 발효물인 실시예 1의 경우, 비교예 1보다 월등한 라디칼 소거활성 효과가 있음을 확인할 수 있고, 누룩 발효물의 농도가 증가함에 따라 라디칼 소거활성이 증가하는 결과를 확인할 수 있다. 상기 표 3에서 비교예 1과 실시예 1에 대한 처리농도에 따른 DPPH 라디칼소거활성(%)을 도 2에 나타냈다.

[실험예 5 : 보습인자 Aquaporin 3(AQP3) 생성량 증가효과 확인]

HaCaT 세포를 24 well plate에 1.0×10⁵ cells/mL로 분주하여, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 18 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교환하고, 누룩 발효물(실시예 1)을 각각 0.1%, 0.25%(v/v)가 되도록 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 또한 단백질 크기로 분류한 실시예 2(2 kDa 이하만 포함)의 누룩 발효물 처리농도가 각각 0.25%(v/v)가 되도록 하여 24 시간 동안 배양하였다.

이후 각 군의 세포를 용해시킨 후 단백질을 취하여 배양액 추출물의 아쿠아포린 3(Aquaporin 3) 생성량을 측정하였다.

아쿠아포린 3 생성량 측정은 AQP3-ELISA kit(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.

그리고, 누룩 추출물(비교예 1)의 농도가 각각 0.10%, 0.25%(v/v)가 되도록 처리한 것을 사용하였다. 또한 음성 대조군은 어떠한 추출물도 처리하지 않았다(무처리군).

실험예 5의 결과를 표 4및 도 3에 나타냈다.

구분	처리농도(%)	AQP3 생성량 (%)
무처리군	-	100±0.21
비교예1	0.25	108.47±0.04
실시예1	0.25	121.14±0.46
실시예2	0.25	145.43±0.12

상기 표 4 및 도 3을 참조하면, 피부 보습인자인 AQP3의 생성량 측정 결과, 누룩 발효물인 실시예의 경우, 비교예보다 우수한 보습인자 생성량을 나타내는 것을 확인할 수 있고, 누룩 및 밭벼 발효 추출물의 농도가 증가함에 따라 AQP3의 생성량이 증가하는 결과를 확인할 수 있다.

또한 실시예 1의 누룩 발효물을 원심분리 및 여과과정을 통하여 2 kDa 이하의 단백질로만 구성되게 한 실시예 2의 누룩 발효물은 농도가 0.25%인 경우 AQP3의 생성량이 가장 우수하게 나타났다.

[실험예 6 : 보습인자 Filaggrin(FLG) 생성량 증가효과 확인]

HaCaT 세포를 24 well plate에 1.0 Х 10⁵ cells/well로 분주하여 37℃ 5% CO₂ 조건에서 18시간 동안 배양하였다.

배양된 세포의 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교환한 후 상기 제조예에서 제조된 실시예 1 내지 2를 각각 0.05, 0.25 v/v%의 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.

이후 각 실험군의 세포를 용해시킨 후 단백질을 취하여 배양액 추출물의 필라그린(Filaggrin) 생성량을 측정하였다. 대조군은 레티놀산(retinoic acid)을 10 μM의 농도로 처리하였다.

상기 필라그린 생성량 측정은 Filaggrin-ELISA kit (Cusabio Biotechnology Co.,Ltd)를 이용하였으며, 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다. 누룩 발효물의 여과 처리에 따른 필라그린 생성량 측정 결과를 표 5 및 도 4에 나타내었다.

구분	처리농도(%)	FLG 생성량 (%)
대조군	-	100±0.17
실시예 1	0.05	93.48±0.11
실시예 1	0.25	102.58±0.22
실시예 2	0.05	101.49±0.28
실시예 2	0.25	114.76±0.12

표 5 및 도 4를 참조하면, 실시예 2의 필라그린 생성량 증가율이 실시예 1보다 우수한 것을 알 수 있다.

[실험예 7 : 일산화질소(NO) 생성 억제 활성 확인]

RAW264.7 세포를 24 well plate에 1.5 Х 10⁵ cells/well로 분주하여 37℃ 5% CO₂ 조건에서 18 시간 동안 배양하였다.

배양된 세포의 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교환한 후 상기 제조예에서 제조된 실시예 1 내지 2 및 비교예 1을 각각 0.025, 0.05 v/v%의 농도로 처리하고, 24 시간 동안 배양하였다.

96 well plate에 각 실험군의 상층액 100 uL를 회수하고 griess 시약 100 uL를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 이후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 제조예에서 제조된 실시예 1 내지 2 및 비교예 1의 처리에 따른 NO 생성량에 대해 자극제(LPS)의 NO 생성량을 기준으로 상대적인 결과를 측정하여 표 6 및 도 5에 나타내었다.

구분	처리농도(%)	일산화질소 생성량(%)
자극제(LPS)	1 μg/mL	100±4.24
비교예 1	0.025	91.57±6
비교예 1	0.05	73.73±1.99
실시예 1	0.025	69.21±0.93
실시예 1	0.05	60.85±3.67
실시예 2	0.03	63.12±0.54
실시예 2	0.05	54.56±0.78

표 6 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 비교예 1보다 실시예 1이 NO 생성을 더욱 억제시키는 것을 확인하였고, 2kDa 미만의 저분자로 이루어진 누룩 발효물(실시예 2)이 NO 생성을 더욱 억제시키는 것을 확인하였다.

종합적으로 본 발명자들은 누룩곰팡이를 이용하여 발효시킨 누룩 발효물을 제조하고, 상기 누룩 발효물이 세포독성이 없을 뿐만 아니라 콜라겐 합성 효과, 항산화 효과, 보습인자 생성량 증가 효과 및 일산화질소 생성 억제 효과가 있음을 확인하였다. 이는 항산화, 피부 보습 및 주름 개선 효과가 우수하다는 것을 의미하는 바, 본 발명의 누룩 발효 추출물은 피부 상태 개선을 위한 화장료, 식품 등의 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예 및 실험예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

30 내지 50℃에서 침지발효된 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하며,
피부 주름 및 탄력 개선, 피부 진정, 피부 장벽 강화 및 피부 항산화 중 하나 이상을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 누룩은 밀누룩인, 피부 개선용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 밀누룩의 밀은 앉은뱅이밀(Triticum aestivum　L.)인, 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 누룩 발효물은 황누룩곰팡이(A. oryzae)을 포함하는 누룩곰팡이(Aspergillus)에 의해 발효된, 피부 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 누룩 발효물은 몰질량이 5 kDa 이하인 펩타이드를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 누룩 발효물은 몰질량이 2 kDa 이하인 펩타이드를 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
30 내지 50℃에서 침지발효된 누룩 발효물을 2 kDa 여과막으로 여과하는 단계;를 포함하며,
피부 주름 및 탄력 개선, 피부 진정, 피부 장벽 강화 및 피부 항산화 중 하나 이상을 포함하는, 누룩 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 개선용 화장료 조성물 제조방법.
삭제
몰질량이 2 kDa 이하인 펩타이드를 포함하며, 30 내지 50℃에서 밀누룩을 침지발효하여 제조된, 누룩 발효물.
누룩을 30 내지 50℃에서 3 내지 5일동안 침지발효하여 누룩 발효물을 제조하는 단계; 및
상기 누룩 발효물을 2 kDa 여과막으로 여과하는 단계;를 포함하는,누룩 발효물 제조방법.