KR102205633B1

KR102205633B1 - 융합 단백질

Info

Publication number: KR102205633B1
Application number: KR1020167010006A
Authority: KR
Inventors: 시몬 웨스트브룩
Original assignee: 르비셉트 리미티드
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2021-01-20
Also published as: GB201316592D0; IL244588B; SG11201602068QA; BR112016006113A2; KR20160058872A; WO2015040398A1; EP3046934B1; JP2020062011A; HRP20190434T1; CA2924410A1; CY1121347T1; TR201903490T4; MX2016003530A; CA2924410C; RS58463B1; ES2714694T3; AU2014322842B2; LT3046934T; JP2016531590A; IL244588A0

Abstract

본 발명은 p75NTR(NBP) 부분과 면역글로불린 부분을 포함하는 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질에 관한 것이다. 특정 구현예에서, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 통증 및/또는 통증의 증후의 치료에 사용된다.

Description

융합 단백질{FUSION PROTEIN}

본 발명은 통증 및/또는 통증 증후의 치료에서의 사용을 위한 p75NTR(NBP) 부분과 면역글로불린 부분을 포함하는 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질에 관한 것이다.

뉴로트로핀, 신경영양성장인자(neurotrophic growth factor(NGF)), 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor (BDNF)), 뉴로트로핀 3(NT-3) 및 뉴로트로핀 4/5(NT-4/5)는 4개의 수용체를 통해 작용한다: 저 친화성 p75 신경영양인자(p75NTR), 및 고 친화성 티로신 키나아제 수용체; TrkA, TrkB 및 TrkC. 저 친화성 수용체 p75NTR은 4개의 뉴로트로핀 전부에 의해 결합하고 활성화되며 다른 수용체로부터 독립적으로 기능하는 것이 보고되어 있다. 그렇지만, Trk 수용체는 더 선택적으로 활성화된다. 즉 NGF는 TrkA에 대한 선택적 리간드이고, BDNF는 TrkB에 대한 리간드이고, NT-3, 4/5는 TrkC에 대한 리간드이다. 또한 p75NTR과 Trk 단백질이 공동발현되었을 때, 그들은 복합체를 형성하고, 이는 양 수용체의 시그널링(signaling)을 변경하는 것이 보고되어 있다(Huang and Reichardt, 2003, Annu Rev Biochem. 72:609-42). 사실, p75NTR은 그들 각각의 Trk 수용체에 대해 각각의 뉴로트로핀의 선택성을 촉진하는 것이 제시되어 있다.

p75NTR은 종양괴사인자 수퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily(TNFR-SF))의 구성원이고, 완전하게 특징지어진 이 수퍼패밀리의 첫 번째 구성원이다. 수퍼패밀리(인간의 일부 30개 유전자에 의해 엔코드된)는 p75NTR에서 첫 번째로 동정된 40 아미노산 시스테인-풍부 도메인(CRD)의 반복체가 하나 이상(전형적으로 4개)으로 구성된 리간드-결합 도메인으로 규정된다(Johnson et al., 1986 Cell 47:545-554; Radeke et al., 1987 Nature 325:593-597). 대조적으로, 시퀀스 모티프(sequence motif)는 모든 TNFR-SF 패밀리 멤버의 세포내 도메인에 의해 공유되지 않는다. 결론적으로, TNFR-SF 단백질의 시그널링 메카니즘은 상당히 다양하다.

트랜스멤브레인 도메인 내에서 시스테인 잔기(cysteinyl residues)를 통해 형성된 p75NTR 구조의 특이한 특징은 디설파이드-연결 p75NTR 다이머의 존재이다. 이 디설파이드 결합은 p75NTR에 의해 효과적인 뉴로트로핀-의존 시그널링을 위해 요구되며 세포내 및 세포외 도메인의 형성에서 중요한 역할을 한다(Vilar et al., 2009 Neuron 62:72-83). 뉴로트로핀은 생리학적으로 다이머와 비공유결합으로 연결된 채 존재하며(Bothwell and Shooter, 1977 J Biol Chem. 252(23):8532-6) 대략 5분의 분포 반감기(distribution half-life)를 가진다(Tria et al., 1994 Exp Neurol. 127(2):178-83). 뉴로트로핀-의존 p75NTR 활성은 p75NTR 다이머의 두 개의 세포외 도메인의 CRDs 2-4를 가지는 뉴로트로핀 다이머의 연계(association)를 수반한다(He and Garcia, 2004 Science 304:870-875). 디설파이드 결합 중심에서 세포내 도메인을 달패이용 집게 같은 동작으로 서로 벌어지게 강제하고 시그널링 어댑터 단백질, NRIF 및 TRAF6로 세포내 도메인의 연계를 허용하는 최근 연구는 뉴로트로핀 결합이 p75NTR 다이머의 두 개의 세포외 도메인이 서로 더 가깝게 이동하도록 한다는 모델을 지지한다(Vilar et al., 2009 J Cell Sci 122:3351-3357, Vilar et al., 2009 Neuron 62:72-83). 예를 들어 p75NTR에 존재하는 것과 같은 인트라-트랜스맴브레인 도메인 디설파이드 결합은 다른 TNFR-SF 패밀리 구성원에서 또는 어떠한 다른 멤브레인 단백질에서 이전에 언급된 적이 없다.

p75NTR은 α-세크레타아제와 γ-세크레타아제 활성과 그것의 세포내 도메인(intracellular domain(ICD))을 세포질 내로 방출하는 기질 단백질분해효소(matrix metalloproteinases(MMPs))에 의해, 노치와 β-아밀로이드 전구체 단백질의 절단-의존성 시그널링 경로와 유사한 방식으로 연속적 단백질분해 절단(sequential proteolytic cleavage)을 수행한다(Jung et al., 2003 J Biol Chem 278:42161-42169; Kanning et al., 2003 J Neuro- sci 23:5425-5436). 이 경로에 의한 p75NTR ICD의 세포질 방출은 연결된 NRIF에 의해 시그널링을 촉진한다(Kenchappa et al., 2006 Neuron 50:219-232). α-세크레타아제와 γ-세크레타아제 활성과 MMPs에 의한 단백질 분해 절단 후, p75NTR의 세포외 도메인의 역할은 완전하게 이해되어 있지 않다.

NGF와 다른 뉴로트로핀(BDNF, NT-3 및 NT-4/5)은 골관절염, 췌장염, 류마티스 관절염, 건선, 소양증 및 다발성 경화증에 기인하는 통증 병리학에서 매우 중요한 역할을 한다(Watanabe et al., 2008 J Neurosci Res. 86(16):3566-74; Raychaudhuri et al., 2011 Arthritis Rheum. 63(11):3243-52; Barthel et al., 2009 Arthritis Res Ther. 11(3):R82; Truzzi et al., 2011 Cell Death Differ.18:948-58; McDonald et al., 2011 Curr Med Chem. 18:234-44; Yamaoka et al., 2007 J Dermatol Sci. 46(1):41-51). 뉴로트로핀 중 어느 것이나 선택적 항체가 입증되었다; NGF 또는 BDNF, NT-3 및 NT-4/5는 통증을 현저하게 감소시킨다. 게다가, 뉴로트로핀 수용체 p75NTR, TrkA, TrkB 또는 TrkC에 직결된 항체는 또한 통증 모델에 효과적인 것으로 입증되었다(Orita S et al., 2010 J Orthop Res. 28:1614-20; Svensson P et al., 2010 Pain. 148:473-80; Iwakura et al., 2010 J Hand Surg Am. 35:267-73; Cirilio et al., 2010 Cell Mol Neurobiol. 30:51-62; Pezet et al., 2010 Pain. 90:113-25; Hayashi et al., 2011 J Pain. 12:1059-68; Chu et al., 2011 Pain. 152:1832-7; Ueda et al., 2010 J Pharmacol Sci.;112:438-43; Ghilardi et al., 2010 Bone. 48:389-98; Fukui et al., 2010 J Orthop Res. 2010; 28:279-83). 통증 모델(좌골 신경 크러쉬 후에 나타나는 기계적 이질통)에서 후쿠이 등(Fukui et al.,)(2010)은 항-p75NTR 항체로 치료 후 통증 관련 종점에서 상당한 효능을 입증하였다. 이 연구로부터 p75NTR 저해 항체로 하는 치료가 통증의 상당한 감소를 가져오게 하여 CGRP와 p75NTR 발현을 감소시켰다고 결론지었다.

본 발명은 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(neurotrophin binding protein) (NBP)-Fc 융합 단백질에 관련된다. 그러한 분자의 친화도 및 인비보 키네틱, 뿐만아니라 동물 모델에서 통증의 치료시 효능을 설명한다. p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 통증과 건선, 습진, 류마티스 관절염, 방광염, 자궁내막증 및 골관절염과 같은 병리학에 관련된 다른 신경영양 인자의 치료에서의 용도가 발견된다.

본 발명의 제1측면에 따르면, (a) p75NTR(NBP) 단백질; 및 (b) 면역글로불린 Fc 부분(Fc portion)을 포함하는 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질이 제공된다.

바람직하게, p75NTR(NBP) 및 Fc 부분은 링커를 통해 연결된다. 더 바람직하게, 링커는 식 Gx(x는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다)의 펩티드를 포함한다.

본 발명에 따른 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질의 특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 인간(human) p75NTR(NBP)이다. 본 발명에 따른 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질의 다른 바람직한 구현예에서, Fc는 인간 Fc(human Fc)이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO.3으로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질이 SEQ ID NO.15로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함한다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 결합 친화도(K_d)가 약 0.01 nM에서 약 50 nM인 NGF, BNDF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 하나에 결합한다.

본 발명의 제2측면에 따르면, 본 발명의 어느 하나의 측면에 따라 설명된 바와 같이 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 통증 또는 통증의 증후의 치료에 사용하기 위해 제공된다.

본 발명의 제3측면에 따르면, 선택적으로 신호 서열을 엔코딩하는 것을 더 포함하는, 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 제공된다.

본 발명의 제4측면에 따르면, 세포, 선택적으로 포유류 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터가 제공되며, 상기 벡터는 본 발명의 제3측면에 따른 핵산 분자를 포함한다.

바람직하게, 복제가능한 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.

본 발명의 제5측면에 따르면, 본 발명의 제3측면에 따른 핵산 분자를 보유한 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 제6측면에 따르면, 본 발명의 제3측면에 따른 핵산 분자 또는 본 발명의 제4측면에 따른 벡터는 통증 또는 통증의 증후의 치료에 사용된다.

통증 또는 통증의 증후는 하기 예를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 급성 통증; 만성 통증; 염증성 통증; 침해성 통증(nociceptive pain); 신경병성 통증; 통각과민(hyperalgesia); 이질통; 중추성 통증; 암 통증; 수술후 통증; 내장 통증; 근골격계 통증; 심장 또는 혈관 통증; 편두통을 포함하는 두통; 치통을 포함하는 구강 안면 통증; 및 허리 통증. 통증의 치료(처치)는 통증 및/또는 통증의 증후를 예방, 완화, 제어, 발생 감소 또는 발전 또는 진전의 지연을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 제7측면에 따르면, 본 발명의 제1 또는 제2측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 또는 제4측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터가 제공되며, 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 핵산 분자 또는 벡터는 제2의 약리학적 활성 화합물과 결합되는 조합에서 개별적, 연속적 또는 동시에 사용된다.

본 발명의 제8측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 및 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 약학적 조성물은 통증 및/또는 통증 증후의 예방, 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연 중 어느 하나 이상의 용도를 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (a) 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터, 또는 제8측면에 따른 약학적 조성물; 및 (b) 개체(individual)에게 통증 및/또는 통증 증후의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상을 위한 또는 통증 및/또는 통증 증후의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연을 위한 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 관한 지시서를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 본 발명의 어느 하나의 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터의 치료학적으로 유효한 양을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체, 또는 본 발명의 제8측면에 따른 약학적 조성물을 더 포함하는 개체의 통증 및/또는 통증 증후의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다.

본 발명에 따르면, 통증 또는 통증의 증후의 치료에 사용하기 위한 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질이 제공된다.

본 발명에 따르면, 통증 또는 통증의 증후의 치료에 사용하기 위한 선택적으로 신호 서열을 엔코딩하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 제공된다.

본 발명에 따르면, 통증 또는 통증의 증후의 치료에 사용하기 위한 세포, 선택적으로 포유류 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터가 제공된다

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 핵산 분자를 보유한 숙주 세포가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 핵산 분자 또는 벡터 및 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 통증 및/또는 통증 증후의 예방, 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연 중 어느 하나 이상의 용도를 위한 것이다.

본 발명에 따르면, (a) 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 핵산 분자 또는 벡터, 또는 약학적 조성물; 및 (b) 개체(individual)에게 통증 및/또는 통증 증후의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상을 위한 또는 통증 및/또는 통증 증후의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연을 위한 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 관한 지시서를 포함하는 키트가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 핵산 분자 또는 벡터의 치료학적으로 유효한 양을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체, 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 더 포함하는 개체의 통증 및/또는 통증 증후의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID No.1)을 나타낸 것이다. 알파 및 감마 세크레타제 절단 사이트가 볼드(bold) 타입으로 나타나 있다. IgG1 Fc 부분은 이탤릭체로 나타나 있다.
도 2는 도 4에 제시한 핵산 서열(SEQ ID No.4)의 시작 코돈(start codon)에서 종결 코돈(stop codon) 번역 산물(SEQ ID No.2)을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 바람직한 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID No.3). IgG1 Fc 부분은 이탤릭체로 나타나 있다. p75NTR(NBP)와 Fc 부분 사이의 링커는 밑줄이 그어져 있다.
도 4는 5' 클로닝 사이트에서 3' 클로닝 사이트까지 전체 산물 유전자(full product gene)의 핵산 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID No. 4).
도 5는 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 변형체: 1: p75_NTR - p75-NTR 서열(SEQ ID No. 6); 2: 상업적으로 이용가능한 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No.7); 3: p75_Fc - IgG1za의 론자 불변부(Lonza constant region)에 변형된 Fc 서열을 가지는 상업적으로 이용가능한 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SED ID No.8); 4: p75_Fc_C222S - IgG1za의 론자 불변부(Lonza constant region)에 변형된 Fc 서열을 가지고 또 위치 222에서 세린 변이된 부가 시스테인을 가지는 상업적으로 이용가능한 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 9); 5: p75_Fc-G4x1 - 변형체 1, 4개의 잔기 글리신 링커를 가지는 제안된 p75NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 10); 6: p75_Fc_G4Sx1 - 변형체 2, 단일 테트라-글리신 세린 링커를 가지는 제안된 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 11); 7: p75_Fc_G4Sx2 - 변형체 3, 두 개의 테트라-글리신 세린 링커를 가지는 제안된 p75-NTR-Fc 융합 단백질(SEQ ID No. 12); 8: IgG1za의 론자 불변부(SEQ ID No. 13)을 나타낸 것이다.
이 정렬에서 스킴 포멧팅(formatting scheme)을 추정적 수용체, Fc-융합 단백질과 Fc 불변부 사이의 유상성 영역을 강조하기 위해 사용한다: 박스 타입은 변형 단백질과 p75-NTR 사이의 동일 서열 여역을 나타내기 위해 사용하고; 단일 하선은 모든 Fc-융합 단백질과 론자 IgG1za Fc 사이의 동일 서열 영역을 나타내기 위해 사용하고; 이탤릭체는 p75-NTR과 Fc 불변부의 접합에서 링커 영역을 나타내기 위해 사용하며; 이중 하선과 볼드 타입은 부모(parental) p75-NTR Fc-융합 단백질에서 222에 동등한 위치에서, 비-동일 서열 외측 링커 영역의 위치를 나타내기 위해 사용한다.
도 6은 p75NTR_Fc가 OA의 MIA-유발된 설치류 모델에서 통증을 상당하게 감소시키는 것을 나타낸다. *P<0.1 및 **P<0.05
도 7은 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID No.15)을 나타낸 것이다. IgG1 Fc 부분은 이탤릭체로 나타나 있다. p75NTR(NBP)와 Fc 부분 사이의 링커는 밑줄이 그어져 있다.

본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 특히 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)는 인간(human) p75NTR(NBP)이다. 본 발명에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 다른 바람직한 구현예에서, Fc는 인간 Fc(human Fc)이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 SEQ ID No.3으로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질이 SEQ ID No.15에 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함한다.

바람직하게 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질, p75NTR(NBP)는 페길화되어 있고, 더 바람직하게는 글리코실화되어 있다.

본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 바람직하게 약 0.01 nM에서 약 50 nM 사이의 결합 친화도(binding affinity)(K_d)를 가지는 NGF, BNDF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 하나 이상에 결합된다. 일부 바람직한 구현예에서, 결합 친화도(K_d)는 여기에서 바람직하게 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 것으로 설명된 바와 같이 NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5에 대한 인비트로 결합 분석(in vitro binding assay)에서 측정된 약 0.01 nM과 약 0.1nM, 0.2 nM, 0.5 nM, 1 nM, 1.5 nM, 2 nM, 2.5 nM, 3 nM, 3.5 nM, 4 nM, 4.5 nM, 5 nM, 5.5 nM, 6 nM, 6.5 nM, 7 nM, 7.5 nM, 8 nM, 8.5 nM, 9 nM, 9.5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM, 40 nM, 45 nM 또는 50 nM 중 어느 것과의 사이이다. 또 다른 일부 바람직한 구현예에서, 결합 친화도(K_d)는 여기에서 바람직하게 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 것으로 설명된 바와 같이 뉴로트로핀을 가지는 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질에 대한 인비트로 결합 분석(in vitro binding assay)에서 측정된 약 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 950 pM 또는 1 nM이거나 또는 어느 하나 값의 미만이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 결합 친화도(K_d)는 여기에서 바람직하게 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 것으로 설명된 바와 같이 뉴로트로핀을 가지는 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질에 대한 인비트로 결합 분석(in vitro binding assay)에서 측정된 약 0.3 nM 또는 약 1 nM이다.

바람직하게, 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 통증 또는 통증의 증후의 치료 용도를 위한 것이다. 임의의 특정 이론에 얽매이게 되는 바램 없이, 본 발명자들은 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질이 상기한 뉴로트로핀(뉴로트로핀의 기능적 활성을 조정하거나 또는 상향 또는 하향 제어하는 것으로 규정된) NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5의 기능적 활성 작용, 예를 들어 그들의 각각의 수용체와 그들의 상호작용으로부터 얻어지는 상기한 뉴로트로핀의 기능적 활성에 의해 통증 또는 통증의 증후의 치료에서 효능을 달성하는 것을 믿는다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 뉴런 및 시냅스의 성장 및 분화, 신경 세포에서 생존 및 분화, Trk 시그널링, 인비트로 또는 인비보(in vivo) 축색돌기 가지(axon outgrowth)의 자극 중 어느 것에 기능적 분석에 의해 평가된 바와 같이 BDNF의 기능적 활성에 영향을 미친다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은, 고전적 뉴런 생존 분석(Cowan et al. Annu . Rev. Neurosci . 2001;24:551-600에서 제공된 것과 같이)에서 증명된대로, TrkA에 결합하는 NGF 및 TrkA의 활성 측정에 의해 평가된 바와 같이 NGF의 기능성 활성에 영향을 미친다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은, Trk 수용체 인산화(phosphorylation), 미토젠-활성화된 단백질 키나아제 인산화 리포터 분석 또는 세포 생존 및 신경돌기 신장 분석(neurite extension assays)에서 증명된 대로, 내생적 TrkA 수용체에 결합하는 NT3 및 내생적 TrkA 수용체 활성의 측정에 의해 평가된 바와 같이 NT3의 기능성 활성에 영향을 미친다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은, 예를 들어 수초 염기성 단백질(myelin basic protein(MBP)) 인산화 분석 또는 대안적으로 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor(VEGF))의 인비보 마트리겔 앤지오제네시스 분석(Matrigel angiogenesis assays)/염기성 섬유아세포 성장 인자-유도된 앤지오제네시스(basic fibroblast growth factor-induced angiogenesis)에서 NT4/5 인비트로 또는 인비보 인산화 및 활성 분석 측정에 의해 평가된 바와 같이 NT4/5의 기능적 활성에 영향을 미친다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 히 앤드 가르시아(He and Garcia (2001) Science, 301, 870 - 805쪽)에 나타난 바와 같이 뉴로트로핀 NGF, NT3, BDNF 및 NT4/5 중 하나 이상의 접촉 잔기(contact residues)에 결합한다.

바람직하게, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 가용성이고, 바람직하게 수용액에서 가용성이며, 바람직하게 혈청(serum), 혈장(plasma), 혈액과 같은 생물학적 유체에서 가용성이다.

여기서 사용된 용어, "Fc" 또는 "면역글로불린 Fc" 또는 "Ig Fc"는 면역글로불린 사슬 불변부, 바람직하게 면역글로불린 중사슬 불변부 또는 그들의 부분의 카복실-말단부(terminal portion)를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 1) 선택적으로 면역글로불린 힌지 영역(hinge region)을 가지는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 2) 선택적으로 면역글로불린 힌지 영역을 가지는 CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) 선택적으로 면역글로불린 힌지 영역을 가지는 CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) 선택적으로 면역글로불린 힌지 영역을 가지는 CH2 도메인 및 CH3 도메인 또는 5) 선택적으로 면역글로불린 힌지 영역을 가지는 CH1, CH2 및 CH3로부터 선택되나 이에 제한되지 않는 두 개 이상의 도메인의 조합을 포함한다. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 최소한 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 선택적으로 CH1 도메인을 포함한다. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 더 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, sIgA, 더욱 더 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 가장 바람직하게는 IgG1을 포함하나 이에 한정되지 않는 면역글로불린 아이소타입(isotype)의 Fc 또는 Fc 부분으로 구성되거나 포함한다. 선택적으로 면역글로불린 Fc는 또한 보체 결합(complement fixation) 또는 항체-의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 최소화하기 위해 또는 Fc 수용체에 결합하는 친화도를 개선하기 위해 제공되는 아미노산 변이(mutations), 결실(deletions), 치환(substitutions) 또는 화학적 수정(chemical modifications)을 포함한다.

더 바람직하게 면역글로불린 Fc는 (a) CH2 도메인 또는 그의 부분 및 CH3 도메인 또는 그의 부분, (b) CH2 도메인 또는 그의 부분, 또는 (c) CH3 도메인 또는 그의 부분, 여기서 면역글로불린 Fc 또는 그의 부분은 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 더 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, sIgA, 더욱 더 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 가장 바람직하게는 IgG1을 포함하나 이에 한정되지 않는 아이소타입이다.

바람직하게 면역글로불린 Fc는 면역글로불린 중사슬의 카복시 말단 영역으로 구성되거나 포함하며 IgG, IgA 또는 IgD 항체 아이소타입 유래 CH2 및/또는 CH3 도메인, 또는 그들의 일부분, 또는 IgM 또는 IgE 유래 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인, 또는 그들의 일부분을 포함할 수 있다. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 면역글로불린의 펩신 분해(pepsin digestion)에 의해 유도될 수 있는, 주로 CH3 및 CH2의 작은 부분을 포함하는 Fc의 단편(fragment)으로 구성되거나 포함한다. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 CH2 및 CH3를 포함하며, 추가적으로 온전한 면역글로불린에서 CH1 및 CH2를 연결하는 중사슬의 짧은 분절(segment)인 힌지 영역에 연결되는 전체 Fc 영역으로 구성되거나 포함하며, 면역글로불린의 파파인 분해에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게 면역글로불린 힌지 영역은 IgG, 바람직하게 인간 IgG, 더 바람직하게 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택되나 이에 제한되지 않는 것, 또는 가장 바람직하게 IgG1으로부터 유래된 힌지 영역 또는 힌지 영역의 일부로 구성되거나 포함하거나 또는 대안적으로 앞선 힌지 영역 구현예의 종류 또는 대립 유전자 변형체이다. 힌지 영역 또는 면역글로불린 힌지 영역의 일부가 Fc 영역의 C 또는 N-터미널 단부(end)에, 바람직하게 N-터미널 단부에 위치할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 면역글로불린 Fc는 바람직하게 Fc 이펙터(effector) 기능을 감소시키는 CH2 영역에서 와일드 타입 서열의 아미노산 변이를 하나 이상 포함하는 면역글로불린의 Fc 또는 Fc의 부분으로 구성되거나 포함한다. 바람직하게 이들 변이는 A330, P331에서 S330, S331(와일드 타입 IgG1 서열을 참조한 아미노산 번호)이고, 여기서 CH2 영역은 인간 중사슬 IgG1 불변부이다:[Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]. 바람직하게 면역글로불린 Fc는 글리코실화되어 있고 생리학적 pH에서 높게 충전되어 p75NTR(NBP)의 용해를 돕는다. Fc 영역은 또한 예를 들어 진단 목적에서 항-Fc ELISA에 의해 p75NTR(NBP)의 검출을 가능하게 한다. 본 발명의 p75NTR(NBP)는 바람직하게 정상 글리코실레이션 사이트에서 Ig Fc를 글리코실화하는 세포에서 합성된다.

바람직하게 면역글로불린 Fc는 인간 면역글로불린 Fc 영역으로 구성되거나 포함한다.

본 발명에 따르면, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 바람직하게 p75NTR(NBP)의 개선된 용해도 및/또는 p75NTR(NBP)의 안정성 및/또는 p75NTR(NBP)의 개선된 혈청 반감기의 유리한 생물학적 특성을 입증한다. 개선된 용해도는 p75NTR(NBP)의 생물학적 이용가능성을 투여시 최대화하고 p75NTR(NBP)의 정확한 복용량을 결정하고 실행할 수 있게 하는 점에서 바람직하다. 개선된 용해도는 인비보 전달시 통증을 유발하고 잠재적 염증을 유발하는 바람직하지 않은 문제점들을 극복하기에 유리하다. 개선된 혈청 반감기는 전달된 p75NTR(NBP)의 치료학적 효과와 동등 또는 유지를 달성하기 위해 치료를 위한 사용 동안 요구 용량의 감소된 레벨 또는 감소된 빈도를 용이하게 하는 장점이 있다. 혈액 또는 혈청에서 연장된 반감기 및 높은 안정도는 더 낮은 빈도의 복용 및/또는 더 낮은 복용 레벨의 투여 요법을 허용하여 잠재적 인비보 독성 또는 부작용을 감소시키는 장점을 가진다. 이 경우에, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 그의 치료학적 효과에서 더 강력하거나/강력하고 순환시 더 안정적이다. 결과적인 더 낮은 또는 더 적은 빈도의 복용량은 p75NTR(NBP) 투여와 연관되는 임의의 잠재적 독성 효과 또는 부작용을 최소하는 장점이 있다. p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 분자량은 또한 p75NTR(NBP) 단독인 경우를 넘어 증가되며, 이는 분자가 바람직하지 않은 위치, 예를 들면 중추신경계에 대한 침투의 위험을 줄이고 목표 조직에서 보유 또는 농도에 적합한 분자를 만드는 정맥주사로 투여된 때에 혈액 순환시에 잘 보유되게 할 것이라는 장점이 있다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 p75NTR(NBP)의 개선된 용해도 및/또는 p75NTR(NBP)의 개선된 안정도 및/또는 p75NTR(NBP) 단독에 비해 개선된 혈청 반감기를 입증한다. 바람직하게 개선된 용해도는 물, 바람직하게는 생리학적 pH, 바람직하게 pH 5에서 pH 8 사이, 바람직하게 약 pH 7에서 버퍼 및/또는 염과 같은 첨가제를 가지는 물과 같은 수용액에서의 용해도이다. 또는 개선된 용해도는 혈청 또는 혈액과 같은 생물학적 유체에서의 용해도이다. 바람직하게 개선된 안정도는 저장 또는 이어지는 동결 및 해동 동안, 일정기간에 걸쳐 변성(denaturation), 산화, 단편화(fragmentation) 또는 응집(aggregation)의 효과에 기인하는 p75NTR(NBP) 단백질의 활성 또는 구조적 온전성(structural integrity) 안정도이다. 구조적 안정도는 변성, 산화, 단편화 또는 응집의 표준 측정법에 의해 판단될 수 있고, 활성 안정도는 여기서 개시된 결합 또는 기능적 분석법, 알려져 있는 단백질 혈청 반감기 측정 방법에 의해 측정될 수 있다.

바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 단일 종(single species)을 제공하기 위해 다양한 포유류 숙주세포로부터 고레벨에서 발현될 수 있고, 예를 들어 스타필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus) 단백질 A에 결합시켜 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 효과적으로 정제될 수 있다. 바람직하게 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 이량체로 될 수 있고 바람직하게 이량체는 p75NTR(NBP) 단독에 비해 뉴로트로핀 NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5에 대해 증가된 친화도를 가진다. 더 단단한 결합은 예를 들어 여기서 개시된 뉴로트로핀 기능적 분석법에 의해 결정되는 바와 같은 p75NTR(NBP)의 효과에 의해 판단되는 더 높은 효능과 더 높은 치료 효과라는 장점을 가진다. 더 높은 효능은 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질이 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 더 낮은 복용량으로 사용할 수 있게 하여 인비보 잠재적 독성 또는 부작용을 감소시키는 잇점을 가진다.

바람직하게 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 약 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 또는 210 시간 +/- 1시간 또는 이들 중 어느 하나 이상의 인비보 반감기를 가지며, 더 바람직하게 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 약 24시간 이상의 인비보 반감기를 가진다.

더 바람직하게 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 약 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 62, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 또는 210일 +/- 1일 또는 이들 중 어느 하나 이상의 인비트로 반감기를 가지며, 더 바람직하게 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 약 6일 이상의 인비트로 반감기를 가진다. 바람직하게 안정도는 대략 생리학적 pH에서, 버퍼 수용액에서, 바람직하게 20℃ 또는 37℃에서 측정된다.

상기한 바람직한 구현예에 따르면, 바람직하게 인비보 반감기는 래트(rat)에서 반감기 또는 인간에서 반감기이고, 더 바람직하게 인간에서이다. 바람직하게 반감기는 인비보 투여, 예를 들어 정맥 또는 피하 주사 후에 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 레벨의 혈청 측정으로부터 결정된다.

p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 p75NTR(NBP) 및 면역글로불린 Fc 부분은 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는 바람직하게 하나 또는 복수의 아미노산으로 구성되거나 포함하고 또는 아미노산의 폴리펩티드 서열, 바람직하게 약 1에서 약 25 아미노산, 바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 아미노산, 더 바람직하게 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 22, 23 또는 24 아미노산, 가장 바람직하게 13 아미노산으로 구성되거나 포함한다.

바람직하게 링커는 알파 헬릭스, 베타 스트랜드, 3₁₀헬릭스 및 pi 헬릭스, 폴리프롤린(polyproline) 헬릭스, 알파 시트(sheet)와 같은 임의의 안정한 2차 구조가 결여된 아미노산의 폴리펩티드 서열로 구성되거나 포함한다. 바람직하게 링커 영역은 예를 들어 예를 들어 유연성 루프, 랜덤 코일 또는 유연성 턴(flexible turn)과 같은 유연성 또는 동적 또는 구조화되지 않은 폴리펩티드로 규정되는 아미노산의 폴리펩티드 서열로 구성되거나 포함하며, 구조화되지 않은 폴리펩티드는 큰 단백질 분자에서 2차 구조의 연결 영역에서 종종 발견된다.

바람직하게 링커는 p75NTR(NBP)에서 약 50% 또는 그 이상의 글리신 및/또는 알라닌 및/또는 세린을 포함하는 아미노산의 폴리펩티드 서열이며, 더 바람직하게는 p75NTR(NBP)에서 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상의 글리신 및/또는 알라닌 및/또는 세린을 포함하는 아미노산의 폴리펩티드 서열이다. 바람직하게 링커 영역은 글리신 및 세린을 포함하는, 더 바람직하게는 세린보다 글리신을 더 큰 비율로 포함하는 아미노산의 폴리펩티드 서열로 구성되거나 포함하며, 바람직하게 링커 영역은 유연한 링커로 구성되거나 포함한다.

임의의 특정 이론에 얽매이게 되는 바램없이, 본 발명자들은 유연성 링커는 p75NTR(NBP) 단독에 비해서 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 상기한 뉴로트로핀 결합 능력 또는 생물학적 활성을 간섭할 수 있는 입체 장애를 극복 또는 방지한다. 이런 이유로 링커 영역은 바람직하게 p75NTR(NBP) 부분과 면역글로불린 Fc 부분 사이의 유연성을 허용하고 여기서 설명된 바와 같은 결합 분석법을 사용하여 뉴로트로핀에 결합하는 것으로써 결정되는 바와 같이 유리 또는 천연 p75NTR(NBP) 단독에 비해 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질의 상기한 생물학적 활성의 보유 또는 개선을 가능하게 한다.

더 바람직하게 링커는 면역학적으로 불활성이어서, 보체 매개 용해(lysis)를 촉발하지 않으며, 항체-의존성 세포 매개 세포 독성(antibody-dependent cell mediated cytotoxicity(ADCC))을 자극하지 않고, 소교 세포(microglia) 또는 T-세포를 활성화하지 않는다. 바람직하게 링커 영역은 하나 이상의 이들 활성에서 감소된다.

더 바람직하게 링커는 알려지거나 구조 분석 또는 유연 또는 동적 또는 구조화되지 않은 폴리펩티드가 될 것이라거나 또는 안정한 2차 구조가 결여된다는 구조 예측으로부터 예측되는 폴리펩티드로 구성되거나 포함한다.

더 바람직하게, 링커는 식 Gx(x는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.)의 펩티드로 구성되거나 포함한다.

본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 또한 단백질 분해 절단 부위(proteolytic cleavage site)를 포함할 수 있으며, 선택적으로 p75NTR(NBP) 부분과 면역글로불린 Fc 부분 사이에 배치된다. 단백질 분해 절단 부위는 링커 내에 또는 p75NTR(NBP) 부분 및/또는 면역글로불린 Fc 부분과 링커의 접합부에 위치할 수 있다. p75NTR(NBP)는 선택적으로 치료 목적을 위한 제형화 및/또는 투여에 앞서 면역글로불린 Fc 부분으로부터 절단될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 단백질 분해 절단 부위를 제거하도록 설계될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 알파 및 감마 세크레타제(secretase) 절단 부위가 제거될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 서열 GSSQPVVTRGTTDNDIEGRMD(SEQ ID No.5)가 제거된다.

더 바람직한 구현예에서, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질에서 소정 아미노산은 수율 또는 용해도와 같은 특성을 개선하기 위해 변경될 수 있다. 하나의 특별히 바람직한 구현예는 위치 222에서 시스테인 잔기의 세린 잔기로의 변경이고, 이는 단백질의 제조 동안 CHO 세포로부터 발현되어 단백질의 응집을 줄이는 것이 발견되었다.

바람직하게 링커 및/또는 면역글로불린 Fc 부분은 p75NTR(NBP) 부분을 손상 또는 상당하게 손상시키지 않는다:

(a) NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5 뉴로트로핀의 기능적 활성에 영향을 미치며(뉴로트로핀의 기능적 활성을 조정하거나 또는 상향 또는 하향 제어하는 것으로 규정되는),

(b) 약 0.1 nM에서 약 50 nM 사이의 결합 친화도를 가지는 NGF, BDNF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 하나에 대한 결합 친화도,

(c) 뉴로트로핀 NGF, BDNF, NT3 및 NT4/5, 바람직하게 인간 NGF, BDNF, NT3 및 NT4/5 각각에 결합하는 능력.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 제1 또는 제2 측면에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 바람직하게 핵산 분자는 통증의 치료시 용도를 위한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 핵산 분자는 신호 서열, 바람직하게 p75NTR 신호 서열, 예를 들어 DNA 또는 RNA 서열을 엔코딩하는 영역을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터를 제공하며, 이 벡터는 제3 측면에 따른 핵산 분자를 포함하며, 바람직하게 벡터는 바이러스 벡터이다. 바람직하게 벡터는 통증의 치료에서 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 상기 측면들에 따르면, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질을 생산 또는 분비하기 위해 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 발현하는 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 방법은 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질을 생산 또는 분비하기 위해 핵산 분자 또는 벡터의 세포 내로의 도입과 거기에서 핵산의 발현을 포함한다. 바람직하게 핵산 분자 또는 벡터는 인비트로, 대안적으로 인비보 세포 내로 도입된다. 바람직하게 발현된 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 인비트로 발현되고, 선택적으로 더 분리 및 정제되며, 대안적으로 바람직하게 발현된 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 인비보 발현되며, 바람직하게 인비보 발현은 유전자 치료를 구성한다.

바람직하게 벡터는 복제가능한 발현 벡터이고, 선택적으로 포유류 세포를 트랜스팩션하기 위한 것이고, 바람직하게 벡터는 바이러스 벡터이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 제3 또는 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 보유하는 숙주 세포가 제공되며, 바람직하게 세포는 포유류 세포이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 통증 또는 통증 증후의 치료시 사용을 위한 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 통증 또는 통증 증후의 치료시 사용을 위한 핵산 또는 벡터가 제공된다. 통증 또는 통증의 증후는 하기 내용을 포함하며 이에 제한되지 않는다:

(a) 급성 통증 및/또는 자발통,

(b) 만성 통증 및/또는 진행성 통증,

(c) 관절염 통증, 골관절염 또는 류마티스성 관절염으로부터 오는 통증, 염증성 장 질환으로부터 오는 통증, 건선 및 습진의 어느 것을 포함하는 염증성 통증,

(d) 침해성 통증(nociceptive pain),

(e) 고통스러운 당뇨병성 신경병증 또는 포진 후 신경통과 관련되는 통증을 포함하는 신경병성 통증,

(f) 통각 과민,

(g) 이질통,

(h) 중추성 통증, 뇌졸중 후 중추성 통증, 다발성 경화증으로부터 오는 통증, 척수 손상으로부터 오는 통증, 파킨슨병 또는 뇌전증으로부터 오는 통증,

(i) 암성 통증,

(j) 수술 후 통증,

(k) 소화기 내장성 통증 및 비소화기 내장성 통증을 포함하는 내장통(visceral pain), 위장관병(gastrointestinal (GI) disorders)에 기인하는 통증, 기능성 장질환(functional bowel disorders(FBD))으로부터 오는 통증, 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases(IBD))으로부터 오는 통증, 월경통, 골반통, 방광염, 간질성 방광염 또는 췌장염으로부터 오는 통증,

(l) 근골격계 통증, 근육통, 섬유근육통, 척추염, 혈청 음성(비류머티즘성) 관절통증, 비-관절성 류머티즘, 근이영양증(dystrophinopathy), 글리코겐 분해, 다발성 근육염, 화농성 근염,

(m) 심장 또는 혈관 통증, 협심증에 의한 통증, 심근경색, 승모판막 협착증, 심낭염, 레이노 증후군, 공피증(scleredoma), 공피증 또는 골격근 허혈,

(n) 편두통, 조짐편두통, 무조짐편두통, 군발두통, 긴장성 두통을 포함하는 두통,

(o) 치통, 턱관절 근막통증(temporomandibular myofascial pain) 또는 이명을 포함하는 구강안면 통증, 또는

(p) 요통, 윤활낭염, 월경통, 편두통, 연관통, 삼차 신경병증, 하이퍼센티세이션(hypersensitisation), 척수 외상 및/또는 변성(degeneration) 또는 뇌졸중(stroke)으로부터 오는 통증.

통증의 치료는 통증 및/또는 통증의 증후를 예방, 완화, 제어, 발생 감소, 발전 또는 진전의 지연을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 또는 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터가 제공되며, p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 핵산 분자 또는 벡터는 제2의 약물학적으로 활성인 화합물과 결합된 조합에서 개별로, 연속적으로 또는 동시 사용을 위한 것이다. 바람직하게 조합의 제2의 약물학적으로 활성인 화합물은 하기 내용을 포함하나 이에 제한되지 않는다:

- 오피오이드 진통제, 예를 들면, 모르핀, 헤로인, 하이드로모르폰, 옥시모르폰, 레보파놀, 레발로판, 메타돈, 메페리딘, 펜타닐, 코카인, 코데인, 디하이드로코데인, 옥시코돈, 하이드로코돈, 프로폭시펜, 날메펜, 날로핀, 날록손, 날트렉손, 부프레노르핀, 부토르파놀, 날부핀 또는 펜타조신;

- 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 예를 들면, 아스피린, 디클로페낙, 디플루시날, 에토돌락, 펜부펜, 페노프로렌, 플루페니살, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페남산, 메페남산, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 니메술리드, 니트로플루비프로펜, 올살라진, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캄, 설파알라진, 술린닥, 톨메틴 또는 조메피락;

- 수면 진정제(barbiturate sedative), 예를 들면, 아모바비탈, 아프로바비탈, 부타바비탈, 부타비탈, 메포바비탈, 메타르비탈, 메쏘헥시탈, 펜토바비탈, 페노바비탈, 세코바비탈, 탈부탈, 티아미랄(theamylal) 또는 티오펜탈;

- 진정 작용이 있는 벤조디아제핀, 예를 들면, 클로르디아제폭시드, 클로라제페이트, 디아제팜, 플루라제팜, 로라제팜, 옥사제팜, 테마제팜 또는 트리아졸람;

- 진정 작용이 있는 H₁ 길항제, 예를 들면 디펜히드라민, 피릴라민, 프로메타진, 클로르페니라민 또는 클로르사이클리진;

- 글루테티이미드, 메프로바메이트, 메타쿠알론 또는 디클로랄페나존과 같은 진정제;

- 바클로펜, 카리소프로돌, 클로르족사존, 시클로벤자프린, 메토카바몰 또는 오르프레나딘과 같은 골격근이완제;

- 덱스트로메트로판(dextromethorphan)((+)-3-하이드록시-N-메틸모르피난((+)-3-hydroxy-N-methylmorphinan)) 또는 그것의 대사산물 덱스트로판(dextrorphan)((+)3-하이드록시-N-메틸모르피난), 케타민, 메만틴, 피롤로퀴놀린 퀴닌, 시스-4-(포스포노메틸)-2-피페리딘카복시산, 부디핀, EN-3231(MorphiDex®, 모르핀과 덱스트로메트로판의 조합 제제), 토피라메이트, 네라멕산 또는 이펜프로딜, 트락소프로딜 또는 (-)-(R)-6-{2-[4-(3-플루오로페닐)-4-하이드록시-1-피페리디닐]-1-하이드록시에틸-3,4-디하이드로-2(1H)-퀴놀리논과 같은 NR2B 길항제를 포함하는 페르진포텔과 같은 NMDA 수용체 길항제;

- 독사조신, 탐술로신, 클로니딘, 구안파신, 덱스메타토미딘, 모다피닐, 또는 4-아미노-6,7-디메톡시-2-(5-메탄-술폰아미도-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀-2-일)-5-(2-피리딜) 퀴나졸린과 같은 알파-수용체;

- 데시프라민, 이미프라민, 아미트립틸린 또는 노르트립틸린과 같은 삼환계 항우울제;

- 카바마제핀, 라모트리진, 토피라트메이트 또는 발프로에이트와 같은 경련 예방제;

- 타치키닌 (NK) 길항제(tachykinin (NK) antagonist), 특히 NK-3, NK-2 또는 NK-1 길항제, 예를 들면, (αR,9R)-7-[3,5-비스(트리플루오로메틸)벤질]-8,9,10,11-테트라하이드로-9-메틸-5-(4-메틸페닐)-7H-[1,4]디아조시노[2,1-g][1,7]-나프티리딘-6-13-디온(TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에톡시-3-(4-플루오로페닐)-4-모르폴리닐]-메틸]-1,2-디하이드로-3H-1,2,4-트리아졸-3-온(MK-869), 아프레피탄트, 라네피탄트, 다피탄트 또는 3-[[2-메톡시-5-(트리플루오로메톡시)페닐]-메틸아미노]-2-페닐피페리딘(2S,3S);

- 무스카린 길항제, 예를 들면 옥시부티닌, 톨테로딘, 프로피베린, 염화트로스피움, 다리페나신, 솔리페나신, 테미베린 및 이프라트로피움;

- COX-2 선택적 저해제, 예를 들면, 셀레콕시브, 로페콕시브, 파레콕시브, 발데콕시브, 데라콕시브, 에토리콕시브 또는 루미라콕시브;

- 콜-타르 수용체(coal-tar analgesic), 특히 파라세타몰;

- 드로페리돌, 클로르프로마진, 할로페리돌, 페르페나진, 티오리다진, 메소리다진, 트리플루오페라진, 플루페나진, 클로자핀, 올란자핀, 리스페리돈, 지프라시돈, 퀘티아핀, 세르틴돌, 아리피프라졸, 소네피프라졸, 블로난세린, 일로페리돈, 페로스피론, 라클로프라이드, 조테핀, 비페프루녹스, 아세나핀, 루라시돈, 아미술프라이드, 발라페리돈, 팔린도르(palindore), 에플리반세린, 오사네탄트, 리모나반트, 메클리네르탄트(meclinertant), 미락시온(Miraxion®) 또는 사리조탄과 같은 신경이완제;

- 바닐로이드 수용체 작용제(예. 레신페라톡신) 또는 길항제(예. 캅사제핀);

- 프로파놀롤과 같은 베타-수용체;

- 멕실레틴과 같은 국소마취제;

- 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드;

- 5-HT 수용체 작용제 또는 길항제, 특히 엘레트립탄, 수마트립탄, 나라트립탄, 졸미트립탄 또는 리자트립탄과 같은 5-HT_1B _/1D 작용제;

- R(+)-알파-(2,3-디메톡시-페닐)-1-[2-(4-플루오로페닐에틸)-4-피페리딘메탄올(MDL-100907)과 같은 5-HT_2A 수용체 길항제;

- 이스프로닉클린(TC-1734), (E)-N-메틸-4-(3-피리디닐)-3-부텐-1-아민(RJR-2403), (R)-5-(2-아제티디닐메톡시)-2-클로로피리딘(ABT-594) 또는 니코틴과 같은 콜린성(니코틴성) 수용체;

- 트라마돌(Tramadol®);

- 5-[2-에톡시-5-(4-메틸-1-피페라지닐-설포닐)페닐]-1-메틸-3-n-프로필-1,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(실데나필), (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-헥사하이드로-2-메틸-6-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-파라지노[2',1':6,1]-피리도[3,4-b]인돌-1,4-디온(IC-351 또는 타다라필), 2-[2-에톡시-5-(4-에틸-피페라진-1-일-1-설포닐)-페닐]-5-메틸-7-프로필-3H-이미다조[5,1-f][1,2,4]트라아진-4-온(바르데나필), 5-(5-아세틸-2-부톡시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-에틸-3-아제티디닐)-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-(5-아세틸-2-프로폭시-3-피리디닐)-3-에틸-2-(1-이소프로필-3-아제티디닐)-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 5-[2-에톡시-5-(4-에틸피페라진-1-일설포닐)피리딘-3-일]-3-에틸-2-[2-메톡시에틸]-2,6-디하이드로-7H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온, 4-[(3-클로로-4-메톡시벤질)아미노]-2[(2S)-2-(하이드록시메틸)피롤리돈-1-일]-N-(피리미딘-2-일메틸)피리미딘-5-카르복스아미드, 3-(1-메틸-7-옥소-3-프로필-6,7-디하이드로-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5-일)-N-[2-(1-메틸피롤리딘-2-일)에틸]-4-프로폭시벤젠설폰아미드와 같은 PDEV 저해제;

- 카나비노이드;

- 대사형 글루탐산 서브타입 1 수용체(mGluR1) 길항제;

- 세르트랄린, 세르트랄린 대사산물 데메틸세르트랄린, 플루옥세틴, 노르플루옥세틴(플로옥세틴 데스메틸 대사산물), 플루복사민, 파록세틴, 시탈로프람, 시탈로프람 대사산물 데스메틸시탈로프람, 에스시탈로프람, d,l-펜플루라민, 페목세틴, 이폭세틴, 시아노도티에핀, 리톡세틴, 다폭세틴, 네파조돈, 세리클라민 및 트라조돈과 같은 세로토닌 재흡수 저해제;

- 마프로틸린, 로페프라민, 미르타제핀, 옥사프로틸린, 페졸라민, 토목세틴, 미안세린, 부프로프리온, 부프로프리온 대사산물 하이드록시부프로프리온, 노미펜신 및 빌록사진(Vivalan®)과 같은 노르아드레날린(노르에피네프린) 재흡수 저해제, 특히 레복세틴, 특별히 (S,S)-레복세틴과 같은 선택적 노르아드레날린 재흡수 저해제;

- 벤라팍신, 벤라팍신 대사산물 O-데스메틸벤라팍신, 클로미프라민, 클로미프라민 대사산물 데스메틸클로미프라민, 듈록세틴, 밀낙프란 및 이미프라민과 같은 이중 세로토닌-노르아드레날린 재흡수 저해제;

- S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-L-호모시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)-아미노]에틸]-4,4-디옥소-L-시스테인, S-[2-[(1-이미노에틸)아미노]에틸]-2-메틸-L-시스테인, (2S,5Z)-2-아미노-2-메틸-7-[(1-이미노에틸)아미노]-5-헵탄산, 2-[[(1S,3S)-3-아미노-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-5-클로로-3-피리딘카보니트릴, 2-[[(1S,3S)-3-아미노-하이드록시-1-(5-티아졸릴)부틸]티오]-4-클로로벤조니트릴, (2S,4R)-2-아미노-4-[[2-클로로-5-(트리플루오로메틸)페닐]티오]-5-티아졸부탄올, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴) 부틸]티오]-6-(트리플루오로메틸)-3-피리딘카보니트릴, 2-[[(1R,3S)-3-아미노-4-하이드록시-1-(5-티아졸릴) 부틸]티오]-5-클로로벤조니트릴, N-[4-[2-(3-클로로벤질아미노)에틸]페닐]티오펜-2-카르복스아미딘, 또는 구아니디노에틸디설파이드와 같은 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase (iNOS)) 저해제;

- 도네페질과 같은 아세틸콜린에스테라아제;

- N-[({2-[4-(2-에틸-4,6-디메틸-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)페닐]에틸}아미노)-카보닐]-4-메틸벤젠설폰아미드 또는 4-[(1S)-1-({[5-클로로-2-(3-플루오로페녹시)피리딘-3-일]카보닐}아미노)에틸]벤조산과 같은 프로스타글란딘 E₂서브타입 4(EP4) 길항제;

- 1-(3-비페닐-4-일메틸-4-하이드록시-크로만-7-일)-시클로펜탄카복시산(CP-105696), 5-[2-(2-카복시에틸)-3-[6-(4-메톡시페닐)-5E-헥세닐]옥시페녹시]-발레산(ONO-4057) 또는 DPC-11870과 같은 류코트리엔 B4 길항제;

- 질류톤, 6-[(3-플루오로-5-[4-메톡시-3,4,5,6-테트라하이드로-2H-vlfks-4-일])페녹시-메틸]-1-메틸-2-퀴놀론(ZD-2138), 또는 2,3,5-트리메틸-6-(3-피리딜메틸)-1,4-벤조퀴논(CV-6504)와 같은 5-리폭시게나아제 저해제;

- 리도카인과 같은 소듐 채널 차단제; 또는

- 온단세트론과 같은 5-HT3 길항제;

및 약학적으로 수용가능한 염 및 그들의 용매화물.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터의 유효량을 개체(individual)에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에게서 통증 또는 앞서 언급한 통증 및/또는 통증 증후 중 어느 하나의 치료, 예방, 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전을 지연시키기 위한 방법이 제공된다.

본 발명은 인간과 수의학 분야 모두에 적용가능하다. 바람직하게 개체는 포유류이고, 예를 들면 말, 고양이 또는 개와 같은 반려동물(companion animal) 또는 양, 소 또는 돼지와 같은 농장동물이다. 가장 바람직하게 개체는 인간이다.

본 발명의 제8 측면에 따르면, 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 및 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 첨가제를 포함하는, 통증 또는 앞서 언급한 통증 및/또는 통증 증후 중 어느 하나의 치료, 예방, 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연 중 어느 하나 이상을 위한 약학적 조성물이 제공된다.

바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 경구, 설하, 구강(buccal), 국소적, 직장, 흡입, 경피, 피하, 정맥주사, 동맥내, 근육내, 심장내, 골내, 피내, 복강내, 경점막(transmucosal), 질, 유리체내(intravitreal), 관절내, 관절주위, 신체 일부 또는 에피큐테니어스(epicutaneous) 투여를 위해 제조되거나 또는 적합하다.

바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 통증의 시작에 앞서 및/또는 동안 및/또는 후에 투여를 위해 또는 그러한 용도를 위해 제조되거나 또는 적합하다.

바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 주당 1회에서 7회 사이의, 더 바람직하게는 월당 1회에서 4회 사이의, 더 바람직하게 6개월 기간당 1회에서 6회 사이의, 더 바람직하게 년당 1회에서 12회 사이의 투여를 위한 것이거나 또는 투여를 위해 제조된다. 바람직하게 약제는 하루에 한 번, 이틀에 한 번, 3일에 한 번, 4일에 한 번, 5일에 한 번 또는 6일에 한 번, 매주, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 매달, 두 달에 한 번, 세 달에 한 번, 네 달에 한 번, 다섯 달에 한 번, 여섯 달에 한 번, 일곱 달에 한 번, 여덟 달에 한 번, 아홉 달에 한 번, 열 달에 한 번, 열한 달에 한 번 또는 매년을 포함하나 이에 제한되지 않는 기간에 말초적으로 투여되거나 투여되도록 제조된다.

더 바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 경구적으로, 설하로, 구강(buccal)으로, 국소적으로, 직장내로, 흡입으로, 경피로, 피하로, 정맥주사로, 동맥내로 또는 근육내로, 심장내 투여를 통해, 골내로, 피내로, 복강내로, 경점막(transmucosal)으로, 질로, 유리체내(intravitreal)로, 에피큐테니어스(epicutaneous)로, 관절내로, 관절주위로 또는 신체 일부로부터 선택되는 하나 이상의 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 경로를 통해 말초적으로 투여되거나 투여를 위해 제조된다.

바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 약 0.05에서 약 200mg/ml 사이의 농도 에서 투여를 위한 것이거나 또는 투여를 위해 제조된다; 바람직하게 약 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/ml +/- 약 10% 오차 중 어느 하나에서, 가장 바람직하게는 수의학적 적용에서 약 3 mg/ml이고 인간은 약 0.1mg/ml에서 투여되거나 투여를 위해 제조된다.

바람직하게 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 kg 체중당 약 0.1에서 약 200mg 사이의 농도에서 투여되거나 또는 투여를 위해 제조된다; 바람직하게 약 0.5, 1, 5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 약 200 mg/체중 kg +/- 약 10% 오차 중 어느 하나에서, 가장 바람직하게는 수의학적 적용에서 약 10 mg/kg이고 인간은 약 0.3mg/kg에서에서 투여되거나 투여를 위해 제조된다.

본 발명의 제9 측면에 따르면, 하기를 포함하는 키트가 제공된다:

(a) 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물; 및

(b) 통증 및/또는 통증 증후의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상 또는 통증 및/또는 통증 증후의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연을 위해 개체에게 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 대한 지시서(instructions).

키트는 여기에 설명된 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 핵산, 벡터 또는 약학적 조성물을 함유하는 하나 이상의 컨테이너와 본 발명의 방법 및 용도 중 어느 것에 따르는 사용을 위한 지시서를 포함할 수 있다. 키트는 개체가 통증 또는 통증의 증후를 가지고 있는지 혹은 그것들을 가지는 위험에 처했는지를 확인하는 것에 기초하는 치료를 위해 개체에게 적합한 것을 선택하는 설명서(descriptions)를 더 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 투여를 위한 지시서는 복용량에 대한 정보, 복용 스케줄 및 의도된 치료를 위한 투여 경로에 대한 정보를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 뉴로트로핀 NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 중 하나 이상과 관련된 상태 또는 상태의 증후의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상의 용도를 위한 또는 완화, 제어, 발생 감소, 발전 또는 진전의 지연을 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면 또는 그들의 바람직한 구현예에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 또는 제3 및 제4 측면에 따른 핵산 분자 또는 벡터 또는 제8 측면에 따른 약학적 조성물이 제공된다.

- NGF(Nerve growth factor, 신경영양성장인자)는 최소한 두 종류(class)의 수용체와 결합한다: p75NTR 및 TrkA, 트랜스멤브레인 티로신 키나아제, 그것이 축삭성장, 분지(branching) 및 신장에서 수반된다. NGF와 관련된 상태 및 증후는 알려져 있다. NGF는 염증 상태 및 통증에서 발현되고 관련된다[Protein Sequence NP_002497.2, NP_038637]. 또한, NGF는 관상동맥 죽상경화증, 비만, 타입 2 당뇨와 같은 심장혈관계 질환, 및 대사증후군뿐만 아니라 다발성 경화증 모두에 역할을 하는 것을 보여준다. NGF의(그리고 또한 BDNF의) 감소된 혈장 레벨은 급성 관상동맥증후군 및 대사증후군과 관련되어 있다. NGF는 치매, 우울증, 정신분열증, 자폐증, 레트 증후군, 신경성 식욕부진증 및 폭식증과 같은 다양한 정신 질환에 관련되며, 알츠하이머 질환 및 퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)의 발전도 시사하고 있다. NGF는 또한 상처 치유를 가속화하는 것을 보여주며 피부 궤양 및 각막 궤양의 치료에 유용할 수 있다는 증거가 있으며, 래트에서 신경 퇴행(neural degeneration)을 감소시키고 말초신경 재생을 촉진하는 것을 보여준다.

- BDNF(brain-derived neurotrophic factor, 뇌유래 신경영양인자)는 신경계의 발달동안 신경 생존 및 성장(neuronal survival and growth)을 지원하는 뉴로트로핀이다[Protein Sequence NP_001137277.1, NP_001041604]. BDNF는 세포 표면 수용체 TrkB 및 p75NTR을 결속시키고 또한 알파-7 니코틴성 수용체의 활성을 조정한다. BDNF와 관련된 상태 및 증후는 알려져 있다. BDNF는 생리학적 및 병리학적 통증의 전달(transmission)에서, 특히 급성 통증, 염증성 통증 및 신경병증성 통증 모델에서 중대한 역할을 하는 것으로 나타나고 있으며, 여기서 BDNF 합성은 크게 증가되는 것으로 발견되며; 또한 BDNF는 만성 통증 상태뿐만 아니라 습진과 건선과 같은 상태에서도 상향-조절되는 것이 나타나고 있다. BDNF의 하향-조절은 우울증, 정신분열증, 강박장애, 알츠하이머 질환, 헌팅턴병, 레트 증후군 및 치매, 뿐만 아니라 신경성 식욕부진증 및 폭식증에서 보인다.

- 뉴로트로핀-5(NT-5)로 알려져 있는 뉴로트로핀-4(NT-4)는 p75NTR 및 TrkB를 통해서 대개 신호를 보내는 신경영양인자이며 말초감각 교감뉴런(peripheral sensory sympathetic neurons)의 생존을 촉진한다. 이 단백질의 성숙한 펩티드는 인간, 돼지, 래트 및 쥐를 포함하여 조사된 모든 포유류에서 동일하다[Protein Sequence NP_006170, NP_937833]. NT-4는 배근 신경절(dorsal root ganglion, DRG)의 대부분의 뉴런과 척추앞 및 척추앞 교감신경절(prevertebral sympathetic ganglia), 척수 후각 및 전각(spinal dorsal and ventral horn) 내 뉴런에 의해 합성되며 전립선, 흉선, 태반과 골격근을 포함하는 많은 조직에서 발현되는 것이 발견된다. NT-4/5와 관련된 상태 및 증후는 알려져 있다. NT4/5에서 결함은 원발성 개방각 녹내장(primary open angle glaucoma)에 대한 감수성과 연관된다. 뉴로트로핀 4는 유방암 세포 생존에도 기여하는 것으로 나타났으며 종양 성장을 억제하기 위한 표적이다. NT-4/5는 침해성 통증과 같은 통증-신호 시스템(pain-signalling systems)에서 수반되는 것이 알려져 있으며, NT-4/5의 상향조절은 또한 피부염, 습진, 아토피성 피부염의 양진 병변과 같은 피부의 만성 염증성 상태에서 보인다. NT-4/5의 하향 조절은 알츠하이머 질환, 헌팅턴병에서 보인다.

- 뉴로트로핀-3(NT-3)는 베타-NGF, BDNF 및 NT-4에 구조적으로 관련되는 뉴로트로핀이며 포유류 뉴런의 생존 및 분화와 성인 신경계의 유지를 조절하고, 인간 태반에서 발현될 때 배아에서 뉴런의 발전에 영향을 줄 수 있다. NT3와 관련된 상태 및 증후는 알려져 있다. 표적 유전자에 의해 생성된 NTF3-결핍 쥐가 심각한 사지의 운동 결함을 나타낸다. NT-3는 Trk 수용체를 통해 신호를 보내고 신경 및 신경교세포의 성장 및 생존을 촉진한다[Protein Sequence NP_001096124.1 및 NP_032768]. 인간, 쥐 및 래트 NT-3의 아미노산 서열은 동일하다. NT3 및 그것의 동종(cognate) 수용체, 티로신 키나아제 C(TrkC)가 신경병증성 통증 및 침해성 통증을 조정하는 것으로 알려져 있으며 통각수용 및 고유수용성 감각의 메카니즘(mechanism of nociception and proprioception), 예를 들면 NT3 발현이 신경병증성 동물의 작은 DRG 세포에서 증가된다. NT3 발현은 또한 당뇨병성다발신경병증 및 HIV-관련 신경병증과 같은 신경병증, 위축을 포함하는 굵은 섬유 신경병증과 관련되며, 그것은 통각과민(정상적으로 유해한 자극의 역치에서 감소), 이질통(비-유해성 자극이 유해성으로 된다), 및 자발통(명백한 자극 부재에서의 통증)에서 또한 수반되며 근육통의 알려진 조절자이다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 상세히 설명될 것이나, 본 발명이 이에 제한되지 않는다.

실시예

p75NTR ( NBP )- Fc 서열에 대한 인실리코 면역원성 테스트( In silico immunogenicity testing )

재조합 DNA 기술은 모노클로날 항체(mAbs)의 Fc(fragment crystallisable)에 기반한 다기능성 치료학적 융합 단백질의 신규 클래스를 포함하는 바이오의약품(biopharmaceuticals)의 광범위 생산을 위해 현재 활용된다(Huang 2009 Curr Opin Biotechnol, 20(6), 692-9). 치료용 단백질의 Fc 도메인에의 융합은 두 개의 구별된 방식에서 분자의 혈청 반감기를 연장시켜 바이오의약품의 전체적 치료 효과를 향상시킨다. 첫째로, 신생아(neonatal) Fc 수용체(FcRn)에 pH 의존하여 결합하는 Fc-융합을 리사클링하는 것은 엔도솜에서 치료용 단백질(therapeutic protein)의 저하(degradation)를 감소시킨다. 둘째로, Fc-도메인의 첨가를 통해서 그리고 치료용 단백질에 대해 Fc-매개 이량체화에 의한 분자 사이즈의 증가는 치료용 분자에 관해서 신장 청정(renal clearance)을 제한하는 것을 도와준다.

융합 단백질은 두 개 이상의 도메인을 함께 직접 연결하는 것에 의해 생성될 수 있다. 그렇지만, 이것은 얻어지는 융합 단백질에서 손상된 바이오-활성(Bai et al. 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. 102 7292-7296), 단백질 미스폴딩(misfolding) (Zhao et al. 2008 Protein Expr. Purif. 61, 73-77) 또는 낮은 생산 수율(Amet et al. 2009 Pharm. Res. 26, 523-528)과 같은 바람직하지 않은 분자 특성을 가져올 수도 있다. 링커 서열은 이들 잠재적 이슈를 다루기 위해 도메인들 사이에 삽입될 수 있으나 여러 요소가 적합한 링커를 선택하기 위해 고려되어야만 한다. 첫째, 링커는 융합 단배질 내 도메인의 전반적인 의도된 기능이 반영되어야만 한다. 일부 상황에서 도메인은 독립적으로 작동해야만 하므로, 유연성 링커가 바람직하다. 역으로, 만약 도메인이 묶여야 한다면 뻣뻣한 링커가 요구될 수도 있다. 둘째로, 링커는 번역후변경(post-translation modifications)(PTMs)을 통해 융합 단백질 내로 임의의 원치않는 기능성이 도입되어서는 안된다. 마지막으로, 링커가 인체 내에 자연적으로 생기지 않는 드노보(de novo) 디자인된 서열일 수 있으므로, 링커와 링커 측면 영역(regions flanking the linker)의 잠재적 면역원성이 고려되어야만 한다.

대부분의 치료용 단백질은 다양한 정도에 대해 면역원성(immunogenic)이며(Van Walle et al. 2007 Expert Opin Biol Ther. 7(3):405-18, Stas et al. 2009 Immunogenicity assessment of antibody therapeutics. Cambridge University Press, Cambridge) 심지어 소위 전-인간 항체 치료제는 면역원성 영역을 함유할 수 있다(Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256-265). 면역원성은 Th(T-helper) 반응을 유도하는 능력이며, 이는 독특한 T-세포 수용체가 항원 존재 세포상에 배치되는 HLA 클래스 II 분자에 결합된 펩티드를 인지할 때 촉발된다. 펩티드는 엔도솜 분열 경로(endosomal cleavage pathway)를 통해 처리되는 항원 존재 세포에 의해 내면화된 단백질로부터 생산된다. HLA 클래스 II 분자에 대해 충분한 친화도를 가지는 펩티드만이 세포 표면에 존재할 수 있고, Th 반응을 아마 촉발할 수 있다.

결론적으로, 탈-면역화(de-immunization)로 알려진 공정인 Th 에피토프를 제거하는 것에 의해 면역원성 잠재력을 낮출 수 있다(Chamberlain 2002 The Regulatory Review 5, 4-9, Baker and Jones 2007 Curr. Opin Drug Discov. Devel. 10, 219-227). 이것은 치료용 단백질에서 펩티드가 HLA 클래스 II 분자에 결합될 수 있고, 이어서 HLA 클래스 II 분자에 대한 펩티드 결합 친화도를 제거 또는 줄이는 치환을 도입할 수 있는 것을 예측하는 것에 의해 달성된다.

여러 HLA 클래스 II 유전자가 있고 거의 대부분은 매우 다형성(polymorphic)이다. 추가적으로, HLA 클래스 II 분자는 각각 다른 유전자로부터 유래되고, 내재된 다형성(inherent polymorphism)을 가지고, 변형을 더 증가시키는 알파 및 베타 사슬로 구성된다. 구체적으로, 모든 개체는 유전자: DRA/DRB, DQA/DQB 및 DPA/DPB를 발현한다. 이들 중 DRA만 비-다형성이다. 게다가, '두 번째(second)' DRB 유전자(DRB3, DRB4 또는 DRB5)도 또한 존재할 수 있고, 이들의 산물은 또한 DRA 사슬과 연결된다.

탈면역화 동안 촛점은 DR 알로타입에 있으며, 이는 DQ 및 DP보다 더 높은 레벨에서 발현하는 것으로 알려져 있다(Laupeze et al. 1999 Hum. Immunol. 60, 591-597, Gansbacher and Zier 1988 Cell Immunol. 117, 22-34, Berdoz et al. 1987 J. Immunol. 139, 1336-1341, Stunz et al. 1989 J. Immunol. 143, 3081-3086). DR 알로타입은 DRA 유전자가 예를 들면 DRB1*01:01, 숫자는 대립유전자 특이적(allele-specific)으로 일정하게 유지되기 때문에 DRB 유전자에 의해 언급된다.

개별 에피토프에 대한 심각도 평가는 프로미스큐티(promiscuity)의 기준에 기반한다: 즉 특정 에피토프가 결합하는 HLA 알로타입의 수, 뿐만아니라 집잔 내 알로타입의 중요성(빈도) 및 강하게 결합하는 HLA:펩티드 복합체의 양적 평가. 개체의 T-세포 집단(T-cell population)은 '자가-펩티드'를 인식하지 못하도록 선택되기 때문에, Th 반응을 보통 유도하지 않는 (알려진) 자가-펩티드에 상응하는 펩티드에 대해 탈면역화 되는 단백질을 스크린할 수 있다. 내생성 단백질이 T 세포 성숙(maturation) 동안 내면화되고 자가-펩티드가 생기게 하는 것은 잘 알려져 있지 않긴 하지만 항체는 그들 중에 있다(Kirschmann et al. 1995 J. Immunol. 155, 5655-5662, Verreck et al. 1996 Immunogenetics 43, 392-397, Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256-265).

p75- NTR Fc -융합 단백질 디자인

p75-NTR Fc-융합 단백질의 Fc 부분의 특정 알로타입은 IgG pCon 벡터 IgGza였다(상기 참조).

p75-NTR Fc-융합 단백질의 디자인은 몇 개의 단계로 진행된다:

Fc-융합 단백질에서 사용되기 위한 p75-NTR 서열의 정확한 구조가 규정되었다.

몇몇 요소는 하기를 포함하여 고려되었다:

p75-NTR Fc-융합 단백질은 최소한 NGF, BDNF, NT-3 및 NT-4를 포함하는 몇몇 뉴로트로핀을 결합할 수 있어야 하며; 유연성이 p75-NTR Fc-융합 단백질 내에 보유되어야만 한다.

원치않는 알파-세크레타제 절단(cleavage) 사이트가 p75-NTR-Fc(SEQ ID No.1)의 세포외 도메인에 존재하며, 그들은 절단에 종속될 것이고 결과적으로 p75-Fc 산물의 인비보 생물학적 활성 및 PK 프로파일을 감소시킬 것이기 때문에 이들은 서열로부터 제거되어야만 한다. 오리지널 p75-Fc 산물(SEQ ID No.1)이 알파-세크레타제 분열 사이트에 함유되고 결과적으로 반감기 및 생물학적 활성(PK/PD)이 SEQ ID No.3에 비해 상당하게 감소되었다(아래 참조).

적합한 경험적인 링커, p75-NTR Fc 융합 단백질에서 세포외 p75-NTR 도메인과 Fc를 결합하는 용도에 적절한 링커가 확인되었다. 번역후변형(PTMs)에 잠재적으로 참여할 수 있는 사이트를 함유하는 링커 서열을 제외했다.

p75-NTR Fc-융합 단백질의 몇몇 변형이 다른 잠재적 링커 서열을 사용하고 Fc 영역의 적합한 부분을 가지는 규정된 p75-NTR 구조를 사용하여 인실리코 구축되었다. 75-NTR 세포외 도메인의 C-터미너스(terminus), Fc 힌지 영역 및 잠재적 링커의 구조적 모델링 및 분석이 시도되었다(표 1 참조).

다른 링커 서열을 가지는 변형이 잠재적 Th 에피토프에 대해 에피베이스(Epibase^TM)를 이용하여 스크린되었다.

발현된 서열 3, p75-NTR Fc-융합 단백질(SEQ ID No.3)이 예측된 면역원성 위험에 기초하여 제안되었다.

Fc -융합 단백질 서열 분석

13개의 현재 이용가능한 치료용 Fc-융합 단백질에 대한 단백질 서열이 유나이티드 스테이트 어답티드 네임(United States Adopted Names (USAN)) 웹사이트(http://www.ama-assn.org/ama/pub/physician-resources/medical-science/)로부터 얻어졌다. 가능한 단백질 서열이 온라인 특허 정보 웹사이트와 같은 다른 온라인 자료에 대해서 크로스 참조 및 체크되었다. 리서치-그레이드(research-grade) Fc-융합 단백질에 대한 단백질 서열이 온라인 자료를 이용하여 다른 상업적 공급자로부터 얻어졌다.

다양한 Fc-융합 단백질로부터 유래된 추정적 부모 서열(putative parental sequence)을 확인하기 위해, Fc-융합 단백질 서열이 MAFFT를 이용하여 인하우스 론자 IgG pCom 벡터의 번역된 단백질 산물에 정렬되었다(Katoh et al. 2002 Nucleic Acids Res. 30, 3059-3066). 정렬된 Fc-융합 단백질 서열은 IgG 서열을 연결시키기(match) 위해 Fc-융합이 시작되는 위치에서 절단했다(truncate). IgG 서열이 시작된 위치를 결정하기 위해 세 개의 연이은 IgG 잔기 표준(criteria)이 사용되었다.

가장 가까운 매칭 단백질 서열을 확인하기 위해, 유니프롯 데이터베이스(Uniprot database)(The UniProt Consortium, UniProt release 2012-09 - Oct 3, 2012)의 인 하우스 카피(in house copy)의 블라스트 서치(Blast search)(Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. 25 3389-3402)를 길이가 짧아진(truncated) Fc-융합 단백질 서열을 이용하여 그들의 IgG 서열 없이 수행하였다. 그런 후 각각의 Fc-융합 단백질 서열을 유니프롯 데이터베이스에서 발견된 가장 가까운 매칭 서열과 가장 가까운 매칭 론자 IgG pCon 서열 둘 다에 대해서 수동으로 재정렬하였다. 융합 파트너와 Fc 영역 사이의 접합을 뽑아내어 두 개 세트를 만들었으며, 13 치료용 Fc-융합 단백질에 대한 것 하나와 상업적으로 이용가능한 Fc-융합 단백질에 대한 것 하나이다. 이들 두 세트로부터 링커 영역이 규정되었다.

상업적으로 이용가능한 Fc-융합 단백질 서열 세트는 가장 가까운 매칭 론자 IgG pCon 서열에 대해 확인된 서열이 발견된 N-터미널 위치에서 절단하였다(truncated). 길이가 짧아진 서열을 분류(sort)하여 서열의 비-중복(non-redundant) 세트를 생성하였다.

에피베이스 면역프로파일링 ( Epibase ^TM Immunoprofiling )

에피베이스^TM 면역프로파일링을 글로벌 세트(Global set)에서 85 HLA 클래스 II 알로타입을 이용하여 Fc-융합 단백질 변형체에서 수행하였다.

오직 HLA 결합 예측을 이용하여 그들의 면역원성 위험과 관련한 Fc-융합 단백질 변형체의 비교는 매우 어렵다. 이것은 몇몇 중요한 요소가 고려되지 않기 때문이다:

- 결합 펩티드가 가공 기계(processing machinery)에 의해 생성되지 않을 수 있으므로 항원 존재 세포에 의해 Th 세포에 펩티드-HLA 복합체로서 절대 노출되지 않을 것이다.

- 펩티드-HLA 복합체는 Th 세포에 의해 인지되지 않을 수 있다.

이런 고려사항을 감안하면, 세 개 타입의 양적 비교가 변형체 서열 사이의 에피베이스^TM 면역프로파일링을 이용하여 만들어질 수 있다. 첫번째, DRB1, DRB3/4/5, DQ 및 Dp 알로타입 세트 각각에 대한 중대한 에피토프(critical epitopes)의 수가 하나로 카운트되는 동일 그룹의 다중 알로타입에 결합하는 펩티드로 비교될 수 있다. 그러한 에피토프는 각 세트 내의 유일한(unique) 에피토프의 수를 보여주고 변형체들 사이의 차이는 잠재적 Th 에피토프의 완전한 제거 또는 첨가를 드러내 보인다.

다중 알로타입을 결합하는 많은 에피토프, 특히 프로미스큐어스(promiscuous) 에피토프로서, 유일한 Th 에피토프 수에서의 변화는 변형체들 사이의 면역원성 잠재력의 실제 감소 또는 증가를 모호하게 할 수 있다. 따라서 두 번째 양적 비교는 모든 Th 알로타입에 걸쳐 각각의 HLA 알로타입의 레벨, 혈청형(serotype)과 함께 고려한 변형체에 대한 알로타입당 결합 펩티드의 수에서이고, 집단 빈도(population frequency)는 혈청형 또는 알로타입 레벨에서 비교를 가능하게 한다. 세번째로, 최악의 경우 면역원성 위험을 발현하는 근사한 스코어가 하기와 같이 계산될 수 있다:

스코어(score) = Σ(에피토프 수(Epitope Count) × 알로타입 빈도(Allotype Frequency))

각각의 영향을 받은 알로타입에 대한 증식력이 있는(multiplicative) 산물이 주어진 알로타입에 결합하는 것으로 예측된 에피토프의 수, 그리고 영향을 받은 알로타입의 대립유전자 빈도(allele frequency)로부터 계산된다. 산물은 연구에서 사용된 모든 영향 받은 DRB1, DRB3/4/5, DQ 및 DP 알로타입을 더했다. 모든 선택된 HLA 알로타입(DRB1, DRB3/4/5, DQ 및 DP)이 고려되어야만 하기 때문에, 개별 알로타입 스코어는 면역원성 위험을 측정하는 것에 의해 절대 측정값(absolute metric)이 아니다는 것을 주목해야 한다.

론자 pCon IgG Fc로부터 유래된 것과 같은 인간 항체 생식계열(germline) 서열은, 인간 면역 시스템에 존재하는 항체 순환 풀에서 발견되고 자가-펩티드로 되는 것으로 고려될 수 있기 때문에, 면역원성이 되는 것으로 고려하지 않았다. 비슷하게, p75-NTR은 인체에서 자연적으로 발현되기 때문에 본질적으로 면역원성이 되는 것으로 고려하지 않았다. 결과로서, 인간 항체 생식계열 서열 또는 p75-NTR로부터 완전히 유래된 펩티드로부터 얻어진 중대한 에피토프는 존재하는 수 및 면역원성 스코어로부터 제외했다.

구조적 모델링 (Structural modelling)

제안된 p75-NTR Fc-융합 단백질의 구조적 모델을 론자 모델링 플랫폼을 이용하여 생성했다. p75-NTR 및 Fc 부분에 대한 후보 구조 견본 단편을 그들의 서열 동일성(sequence identity)에서, 뿐만아니라 해상도(Ångstrom(Å)에서)와 같이 견본 구조의 질적인 결정학상 방법에서 점수화하고, 순위를 매기고 인하우스 항체 데이터베이스 베이스와 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank(PDB)) 둘다로부터 선택했다.

p75-NTR Fc-융합 단백질에 대한 구조 견본 단편의 서열 정렬을 생성했다. 서열 정렬과 함께 견본 단편을 모델러(MODELLER (Sali et al. 1993 J. Mol. Biol 234, 779-815)에 의해 처리했다. 이 프로토콜은 정렬된 구조 견본 세트로부터 유래된 형태적 규제(conformational restraints)를 만든다. 규제를 만족하는 구조의 앙상블이 공액 구배(conjugate gradient) 및 가상 어닐링 최적화 절차에 의해서 만들어진다. 단백질 구조의 스코어 및 형태적 규제의 충족으로부터 유래된 하나 이상의 모델 구조가 이 앙상블로부터 에너지 스코어에 기초하여 선택된다. 모델은 검사되고 목표와 견본 사이에서 다른 위치의 사이드 사슬을 사이드 사슬 최적화 알고리즘 및 최소화된 에너지를 이용하여 최적화했다. 시각화 및 계산 도구 묶음, 뿐만아니라 하나 이상의 바람직한 모델을 선택하기 위한 도메인의 중심(core) 및 일부(local) 팩킹(packing)이 구조의 형택적 다양성을 평가하기 위해 사용되었다.

p75- NTR Fc -융합 단백질 디자인(p75- NTR Fc -Fusion Protein Design)

p75-NTR Fc-융합 단백질의 세 개의 링커 변형체를 디자인하였다. 마지막 Fc-융합 단백질에서 p75-NTR 영역에서 유연성을 보유하고 알파 및 감마 세크레타제에 대한 원치않는 절단 위치(cleavage sites)를 피하기 위한 시도의 디자인상의 제약을 감안하여, 세포외 p75-NTR 서열을 위치 G237에서 절단했다. 오리지날 p75NTR-Fc 서열 1(SEQ ID No.1)을 위치 A250에서 절단했다. 알파 세크레타제 절단 위치가 위치 241-242 및 위치 244-245 사이의 p75-NTR의 세포외 부분에서 확인되었고(Zampieri et al. 2005 J Biol Chem. 280, 14563-71), 추정상의 감마 세크레타제 절단 위치가 위치 282 영역에서 서열 상동관계(homology)에 의해 추론되었다. PK 및 서열 1(SEQ ID No.1)의 생물학적 활성이 서열 3(SEQ ID No.3)에 비해 상당하게 감소된 것은 서열 1의 PK/PD로부터 명백하다. 인비보 활성 감소의 원인이 된 알파 및 감마 세크레타제 위치가 이들 실험으로부터 판단이 내려졌다.

변형체에 대해 선택된 링커의 핵심적 요구사항은 PTMs를 만들수 있는 임의의 잔기를 도입하는 것을 피하고 낮은 면역원성 위험을 유지하기 위해 Fc-융합 단백질에서 융합 파트너의 유연성을 허용하게 한다.

p75-NTR을 Fc 불변부에 결합하는 것이 가능한 두 종류의 링커, 경험적 링커와 천연 단백질로부터 유래된 링커가 있다. 천연 단백질로부터 유래된 링커는 원치않는 PTM이 가능한 위치에 도입될 수 있으며, 그들의 잠재적 본성 때문에 면역원성 도입에서 더 큰 위험을 가진다. 경험적 링커는 이들 이유에 대해 더 조사가 진행되었으며, 유연성 또는 강직성(rigid)으로서 넓게 범주화될 수 있다. 반복 유닛 경험적 링커의 서열이 그들의 유연성 분류와 함께 하기에 리스트된다:

- (G₄S)_x - 유연성

- G_x -유연성

- A(EAAAK)_xA - 강직성(SEQ ID No.4)

- (PA)_X - 강직성

마지막 Fc-융합 단백질에서 최소한 NGF, BDNF, NT3 및 NT4를 포함하는 다중 뉴로트로핀 리간드에 결합하는 것을 보장하기 위한 유연성에 대한 요구를 감안하여, 오직 유연성 링커만 고려되었다.

이들 고려에 기초하여, 세 개의 변형체, 폴리-글리신 링커를 이용한 하나의 변형체와 테트라-글리신 세린 링커를 이용한 두 개의 변형체가 구축되었다. 모든 변형체가 링커 서열의 일부로서 오리지날 p75-NTR 서열에서 G209(발현된 단백질 서열 3 참조(SEQ ID No.3))를 고려한다. 게다가 변형체는 오리지날 p75-NTR Fc-융합 단백질 서열 1(SEQ ID No.1)에서 위치 222에 동등한 위치에서 시스테인에서 세린으로 변이를 함유한다. 변형체의 링커 영역이 도 5에 나타나 있다.

각각의 변형체 및 도 1에 나타낸 다른 서열에 대한 면역원성 잠재력의 분석을 에피베이스™을 이용하여 수행하였다. 글로벌 세트에서 85 HLA 클래스 II 알로타입에 영향을 미치는 중대한(critical) 에피토프에 대한 예측된 면역원성 스코어를 하기 표 1에 나타내었다. 추가적으로, 비-중대한 에피토프에 의해 영향받은 알로타입 수에 대한 정보도 표 1에 나타내었다. 표 1: 계산된 중대한 에피토프 스코어의 요약

예측된 면역원성 및 PTM 가능한 임의의 위치의 결함에 근거하여, 변형체 1(p75_Fc_G4x1)이 세 개 변형체의 최선의 특징을 가지며 인비보 테스트를 위해 생산되었다.

NGF에 대한 서열 1( SEQ ID NO.1) 및 서열 3( SEQ ID No.3) p75NTR - Fc의 친화도(Affinity of Sequence 1 ( SEQ ID No. 1) and Sequence 3 ( SEQ ID No. 3) p75NTR-Fc for NGF)

비아코어 칩(Biacore chip)을 실험에서 제조하였으며, 실험에서 단백질 A는 플로우 셀(flow cell) 1 및 2에 결합된 아민이었다. 캡쳐된 p75-Fc에 결합하는 NGF의 단일 사이클 키네틱을 측정하였다.

칩 표면의 결합 용량(R_max)이 리간드(융합 단백질)의 고정화 레벨에 의존한다. 키네틱 연구에 대해 50-100 RU의 R_max가 추천된다. p75-Fc 및 NGF의 분자량을 이용함으로써, 융합 단백질에 대한 원하는 고정화 레벨이 계산될 수 있다.

R_max=(NGF 분자량/융합 단백질 분자량)×고정화 레벨×화학양론비(stoichiometric ratio): 50 = (13,500/102,000)×고정화 레벨×1

따라서, 요구되는 고정화 레벨=(102,000/13,500)×50=378 RU 서열 1(SEQ ID No.1) 및 서열 3(SEQ ID No.3) p75NTR-Fc 및 NTR-Fc가 단일 사이클 키네틱에 앞서 단백질 A 칩 상에 고정화되었다.

수동 조작(manual run)을 이용하여, 거의 380 RU의 원하는 레벨이 달성될 때까지 서열 3 p75-Fc(SEQ ID No.3)가 단백질 A 칩의 플로우 세포(flow cell) 2 상으로 캡쳐되었다. 이는 단백질 A 표면 상으로 캡쳐된 융합 단백질의 418 RU를 가져오는 10 ㎕/min의 흐름 속도(flow rate)와 서열 3 p75-Fc(SEQ ID No.3) 농도 10 ㎕/㎖에서 22초 주입하여 수행되었다.

첫 번째 경우에 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625 nM의 NGF 농도가 시험되었다. 이들 농도는 이 범위 내의 NGF 농도로 되도록 근사치로 계산된 융합 단백질에 대한 K_D로서 시험되었다.

단일 사이클 키네틱 방법은 하기를 수반한다:

- 30 ㎕/min으로 120초 동안 캡쳐된 p75-Fc 상으로 NGF 0.625 nM 주입

- 이 공정이 1.25 nM에서 NGF 주입을 하고 이어서 2.5, 5 및 10 nM을 반복하였다.

- NGF 마지막 농도가 600초 주입된 후에 해리상(dissociation phase)이 칩에 대해 러닝 버퍼(HBS-EP)를 흘리면서 수행되었다.

일단 완결된 칩은 30 ㎕/min에서 60초 동안 10 mM 글리신 HCL, pH 2를 주입하여 칩의 단백질 A 표면으로 되돌아가게 재생하였다.

서열 1(SEQ ID No.1) p75-Fc가 10 ㎕/㎖의 농도, 10 ㎕/min의 흐름 속도에서 38초 주입을 수행하여 칩 상으로 캡쳐되었다. 이는 원하는 레벨인 430 RU를 달성하였다. 상기 언급된 단일 사이클 키네틱 절차가 반복되었다.

데이터 분석(Data analysis)

융합 단백질-NGF 결합 데이터를 비어코어 T200 평가 소프트웨어 v1을 이용하여 하기 매뉴얼에 따라 분석했다:

- 데이터가 플로우 셀 2(Fc=2)에서 융합 단백질에 NGF를 결합하기 위해 그리고 대조 플로우 셀 1(Fc=1; 단백질 A 단독)을 거쳐 흘러가는 NGF에 대해 기록된다.

- Fc=1로부터의 데이터는 "2-1" 결합 데이터를 주기 위해 Fc=2로부터 감산된다.

- 0nM(HBS-EP 러닝 버퍼만)의 주입에 대한 2-1 결합 데이터가 실험 내내 베이스라인에서 임의의 이동(drift)에 대해 제어하기 위해 모든 2-1 결합 데이터로부터 감산된다.

- 마지막으로, 이 데이터가 결합 속도(ka), 해리 속도(kd) 및 친화도(K_D)를 포함하는 결합 특성을 계산하기 위해 1:1 결합 모델에 맞춰진다.

캡쳐된 서열 1( SEQ ID No.1) 및 3( SEQ ID No.3) p75- Fc 융합 단백질에 결합하는 NGF의 단일 사이클 키네틱 데이터

융합 단백질 둘에 대한 NGF 결합 프로파일은 400pM(SEQ ID No.1) 및 360pM(SEQ ID No.3)이었다. 서열 3(SEQ ID No.3)은 서열 1(SEQ ID No.1)보다 NGF에 대해 더 큰 친화도를 가지는 것이 이들 연구로부터 명백하다.

서열 1( SEQ ID No.1) 및 3( SEQ ID No.3) p75NTR - Fc 인비보 약동학(Pharmacokinetics)

출발시 체중 120-150g의 수컷 위스타 래트(Wistar rats)(UK 찰스강에서 온)가 이 연구에서 사용되었다. 각각의 동물을 처음에 체크하였으며 외견상 건강하게 보였다. 그들을 랜덤하게 두 개의 우리에 배정하고 각각의 래트를 꼬리에 각인된 타투에 의해 독특한 식별 숫자를 할당했다. 동물은 연구 0일에 출발에 앞서 최소한 10일 동안 동물 유닛에 적응되었다.

일단 래트가 그들의 환경에 적응하면, 그들을 모든 인비보 절차가 수행되는 스톡/절차 방(stock/procedure room)으로 이동시킨다. 동물은 홈 오피스 동물(과학적 절차)법 1986(Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986)에서 권장된 대로 12시간 명-암 사이클(07:00 온 19:00 오프)을 주는 형광등 세트에 의해 조명이 유지되었다. 방을 에어-컨디션하고 공기 온도(21℃ +/- 2℃) 및 상대 습도를 일상적으로 측정하였다.

래트를 조사된 다이어트(irradiated diet)(과학적 동물 식품 및 공학, 오지, 프랑스)(Scientific Animal Food and Engineering, Augy, France)를 급여하고 멸균수를 연구 내내 임의로 이용가능하게 하였다. 각각의 다이어트 배치(batch)를 조성 및 오염물에 대해 일상적으로 체크하고 스크린했다. 둥지 및 우리를 멸균하고 각각의 우리를 개별적으로 환기시켰다(IVC 시스템).

연구 디자인은 표 2에 나타낸 것처럼 5개 처치(treatment) 그룹이 있게 하였다. 표 2: 처치 그룹

혈액 샘플을 2, 4, 6, 8, 12 및 15일에 대략 동일 시간(10 am ~ 11:30 am)에 래트의 꼬리 정맥으로부터 취하고 혈장을 제조했다.

꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플링

꼬리 정맥의 혈관 확장을 유도하여 출혈을 촉진하기 위해 래트를 38℃에 세팅된 워밍 박스(warming box)에 최소 5분, 10분을 넘지 않는 동안 두었다. 래트를 적합한 크기의 제한용기(restrainer)에 가두고, 꼬리 정맥을 멸균 23G 바늘을 사용하여 구멍을 내고 혈액이 CB300 마이크로베트 튜브(Sarstedt 16.444) 내로 흘러가게 하였다. 최소 100 ㎕ 및 최대 300 ㎕의 혈액을 각각의 래트로부터 매시간 지점에서 수집하였다. 반복된 샘플링에서 다른 위치가 선택되었으며 래트는 절차 내내 차분하였다. 래트는 불편함(bruising)의 증거없이 반복되는 혈액 샘플링 동안 잘 인내하였다. 수집된 혈액은 혈장 제조에 사용되었다.

심장에서 온 터미널 혈액 샘플(Terminal blood sample from the heart)

터미널 혈액 샘플을 이소플루란 마취를 하고 테루모(Terumo) 1 ml 시린지 및 23G 바늘로 심장 천자에 의해 취했다. 그런 후 동물을 자궁경부 전위에 의해 희생시켰다. 수집된 혈액을 혈청을 제조하기 위해 사용하였다.

혈장 제조

꼬리 정맥으로부터 온 혈액을 함유하는 마이크로베트를 항응고제(포타슘-EDTA)와 잘 섞이도록 몇 차례 부드럽게 거꾸로 하였다. 튜브를 10분 동안 2700xg에서 원심분리하기에 앞서 얼음 위에 두고 혈장을 폴리프로필렌 튜브 내로 등분(aliquoted)했다(2일째는 오직 한 개의 앨리쿼트만 제조된 것을 제외하고 시간 지점 및 동물당 두 개의 앨리쿼트(aliquot)). 모든 혈장 샘플을 즉시 냉동하고 필요할 때까지 -80℃에서 저장했다.

혈청 제조

15일째 심장 천자에 의해 수집된 혈액을 2~3시간 동안(최대 3시간) 실온에서 폴리프로필렌 튜브에서 엉기게 두었다. 응고된 혈액을 5분 동안 4000xg에서 원심분리하고 혈청을 폴리프로필렌 튜브 내로 등분하였다(동물 당 두 개 앨리쿼트). 혈청 샘플을 즉시 냉동하고 -80℃에서 저장했다.

혈장 p75NTR - Fc의 결정

혈장 p75NTR-Fc를 p75NTR에 대해 수정된 엘리사(ELISA)(R 및 D 시스템)를 이용하여 측정하고 p75NTR-Fc의 온전한 전체 혈장 농도를 결정의 수단으로서 IgG1 Fc 엘리사(R 및 D 시스템)를 이용하여 측정하였다.

p75NTR-Fc의 서열 1(SEQ ID No.1) 및 서열 3(SEQ ID No.3)의 약동학이 결정되었다.

결론

서열 3(SEQ ID No.3)에 비해 서열 1(SEQ ID No.1) p75NTR-Fc의 알파 및 감마 세크라타제 절단 위치를 제거함으로써 p75NTR-Fc의 PK가 상당하게 개선되었으며 그 뒤에 만성 치료 후에 통증 스코어에 의해 평가된 효능이 개선되었다. 서열 1(SEQ ID No.1) p75NTR-Fc의 알파 및 감마 세크레타제 절단 위치가 통증 및 뉴로트로핀 생물학에, 예를 들어 호흡기 질환에 관련된 다른 병리학의 치료 동안 인비보 약물로서 부적합한 이 화합물을 만든다.

서열 3(SEQ ID No.3)은 서열 1(SEQ ID No.1)에 비해 개선된 PK/PD와 뉴로트로핀에 대해 더 큰 친화도를 가지고 안정하다.

p75NTR - Fc(SEQ ID No.3)은 진통제이다.

이 연구의 목적은 래트에서 모노소듐-이오도아세테이트(monosodium-iodoacetate(MIA)) 유도된 골관절염(osteoarthritis)(OA)에서 통증 효능상의 p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)의 만성적 노출의 효과를 조사하기 위한 것이다.

앞서, 우리는 자발적 통증의 평가는 행동불능 테스터(incapacitance tester)를 이용하여 정적 체중 지지(static weight bearing)의 측정에 의해 만들어질 수 있고 이는 무릎의 조직병리학과 상관된다. 통증에 대한 신규 치료요법을 이용한 전-임상 연구가 데이터에서 바이어스(bias)를 유도하기 위해 그들의 능력에 대해 비평되었다. 이것을 해결하기 위해, 왼쪽 및 오른쪽 무릎을 OA의 유도를 위해 랜덤하게 선택하였으며, 매일 인비보 과업의 모든 조작자는 각각의 무릎의 상태에 대해 모르게(blind) 하였다. 전형적으로 OA의 문헌 유도로부터 오른쪽 무릎에 대해서만 수행되었으나, 앞선 연구에서 우리는 사용된 MIA의 시간 지점 또는 용량에 상관없이 왼쪽 대 오른쪽 무릎에서 OA의 유도 사이에 일관된 차이를 발견하지 못했다.

MIA의 제조

MIA를 6mg/ml 스톡 용액에 등가인 0.3mg/50㎕ ETF-PBS(각각의 관절 내 주입에 대해 사용된 부피)에서 제조했다. 302mg의 MIA를 달아서 50.3ml ETF-PBS에 용해시켰다. MIA를 하루 전에 제조하고 필요할 때까지 4℃의 어두운 곳에 저장했다.

동물(Animals)

출발시 체중 110-130g의 44 수컷 위스타 래트(UK 찰스강에서 온)를 이 연구에서 사용하였다. 각각의 동물을 처음에 체크하였으며 외견상 건강하게 보였다. 그들을 랜덤하게 두 개의 우리에 배정하고 각각의 래트를 꼬리에 각인된 타투에 의해 독특한 식별 숫자를 할당했다. 동물은 연구 0일에 출발에 앞서 최소한 10일 동안 동물 유닛에 적응되었다. 일단 래트가 그들의 환경에 적응하면, 그들을 모든 인비보 절차가 수행되는 스톡/절차 방(stock/procedure room)으로 이동시켰다. 동물을 홈 오피스 동물(과학적 절차)법 1986(Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986)에서 권장된 대로 12시간 명-암 사이클(07:00 온 19:00 오프)을 주는 형광등 세트에 의해 조명이 유지되었다. 방을 에어-컨디션하고 공기 온도(21℃ +/- 2℃) 및 상대 습도를 일상적으로 측정하였다.

실험 설계( Experimental design )

다섯 그룹의 동물이 있게 연구 설계를 했다: 대조 인간 항체(n=6), 0.3mg/kg p75NTR-Fc(SEQ ID No.3), 1mg/kg p75NTR-Fc(SEQ ID No.3), 3mg/kg p75NTR-Fc(SEQ ID No.3) 및 3mg/kg PG-007(화이자 타네주맙(Pfizer Tanezumab)의 바이오시밀러 항-NGF).

항체 및 p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)를 25일 동안 매 5일 마다 피하 주사로 투여하였다.

체중을 측정하고 베이스라인 혈액 샘플을 -2일(day) 아침에 꼬리 정맥으로부터 취했다. -1일에 거의 동일 시간에 베이스라인 정적 체중 지지(static weight bearing)를 측정하였다. 0일에, 다시 거의 일(day)의 동일 시간에 모든 래트를 그들의 각각의 항체 또는 p75NTR-Fc 융합 단백질로 처치했다. 세 시간 후에 모든 동물에게 한 개 무릎 내로 0.3mg MIA를 관절 내 주사를 주었다.

무작위 치료( Randomisation of treatment)

연구 시작에 앞서 래트의 체중을 재고, 각 그룹에서 동물들의 평균 체중은 거의 동일하도록 각 우리에 두 마리 래트를 랜덤하게 처치 그룹으로 배정했다. 각 래트가 특정 처치 그룹에 할당되는 것에 더하여 각각의 래트의 왼쪽 또는 오른쪽 무릎이 MIA로 주입되도록(ETFPBS로 주사한 각각의 래트에서 반대측 무릎으로) 더 무작위 수행을 했다. 처치 그룹의 할당 및 각각의 래트에 대해 처치를 받은 무릎이 맥(Mac)용 마이크로소프트 엑셀(버전 14.1.1)에서 난수발생기를 이용하여 생성되었다. 동물과 접촉하지 않은 인원이 무작위 절차 및 할당을 수행했다.

두 개의 7ml 폴리프로필렌 바이알을 왼쪽 또는 오른쪽 무릎을 나타내기 위해 각각의 동물에 대해 표시하였다(총 88 바이알). 두 사람(한 명은 마스터 무작위 시트에 대해 스코어링 및 체킹을 하고 한 명은 관절 내 주사를 위해 용액을 앨리쿼팅함)이 88 바이알을 제조했다. ETF-PBS로 채워진 남아있는 바이알로 뒤이어 MIA 바이알을 첫째로 채우도록 앨리쿼팅을 서열에서 수행했다(이는 각 동물에 대해 반대측 무릎 바이알이었다). 인비보 연구 내내 과학자들은 모든 동물의 처치 상태에 대해 몰랐다(blind).

동물 절차(Animal procedures )

무릎의 관절 내 주입

모든 래트를 보일스 도구(Boyles Apparatus)를 이용하여 이소플루란 흡입으로 마취시켰다. 각 동물의 양 무릎의 털을 클립하고 무릎을 에탄올로 닦았다. 각각의 무릎에 27G 바늘이 부착된 0.5ml 멸균 벡톤 디킨슨 마이크로-파인(Becton Dickinson Micro-Fine) 인슐린 시린지를 이용하여 ETF-PBS에서 0.3mg MIA 또는 ETF-PBS 단독 50㎕를 인프라-파텔라(infra-patellar) 인대를 통해 주입했다.

자발적 통증의 평가

행동불능 테스터(incapacitance tester)(린톤 인스트루먼트(Linton Instruments), U.K.)를 이용하여 왼쪽 및 오른쪽 뒷다리의 체중 지지(weight bearing)를 측정하여 각각의 동물에 대해 자발적 통증을 결정했다. 래트를 그들의 뒷발이 분리된 센서를 깔고 앉도록 행동불능 테스터 상에서 적합한 사이즈의 퍼스펙스(perspex) 동물 박스에 두었다. 래트가 편안하게 앉을 수 있는 박스의 사이즈는 스쿼싱(squashing)이 없으나 비슷하게 회전할 수 있는 충분한 공간을 허용하지는 않는다. 일단 래트가 진정되고 차분해지면, 각각의 다리의 체중 지지를 5초를 초과하여 기록했고 양 뒷다리에 가해진 그램 평균 하중(average force in gram)을 기록했다. 뒷발의 체중 분포를 매 시간 지점에서 각각의 래트에 대해 5회(우리가 전에 증명한 유효함) 결정했으며, 5회 측정값의 평균을 계산했다. 개별 체중 지지 데이터를 양 뒷다리에 대한 전체 체중으로 오른쪽 다리의 체중을 나눔으로써 체중 분포(weight distribution)로 전환하였다.

MIA-유도 OA 이후의 자발적 통증의 측정(Spontaneous pain measurements following MIA-induced OA)

뒷다리를 통해서 체중의 분포를 측정하기 위해 행동불능 테스터를 이용하여 자발적 통증을 평가했다. 평가는 MIA로 베이스라인 및 3주 처치 후에서 수행했다.

데이터를 도 6에 나타내었으며 뒷다리에 대해 전체 체중(the proportion of the total weight)의 비율로서 도시했다.

순진한 동물(naive animals)에 대해, 뒷다리의 체중 비율과 이론적 기대치 0.5 사이에 통계상으로 유의미한 차이는 없었다.

대조 항체로 처치된 동물에 대해, 처치된 다리에 처치되지 않은 다리보다 체중이 덜 걸리고 통계상으로 상당하였다(39% vs. 61%). 0.3 및 1mg/kg에서 항-NGF 항체(PG-007 타네주맙 바이오시밀러 3mg/kg)로 처치된 동물과 p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)으로 처치된 동물에서 임의의 측정 시간 지점에서 처치된 뒷다리의 체중 비율과 이론적 기대치 0.5(양 뒷다리 전체에 걸치는 고른 분포) 사이에 통계상으로(P<0.1) 의미있는 차이가 없었다. 3mg/kg에서 p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)의 진통 효과가 상응하는 대조군에 비해 더욱 더 통계상으로 의미있었다(P<0.05).

이 연구로부터 p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)가 OA의 MIA 래트 모델에서 진통제라는 것이 명백하다. p75NTR-Fc(SEQ ID No.3)의 진통 효과는 비슷한 용량(3mg/kg 피하)에서 항-NGF 항체(PG-007: 바이오시밀러 화이자 항-NGF 항체 타네주맙)에 대해 관찰된 것보다 더 컸다.

개별 뉴로트로핀에 대한 p75NTR - Fc 분자 서열 3 및 서열 15의 친화도의 예상 못한 개선

낮은 친화도 p75 뉴로트로핀 수용체가 문헌 및 선행기술로부터 일반적으로 받아들여지고 있으며 대략 1nM의 모든 뉴로트로핀에 대해 유사한 친화도를 가진다(Ichim etal., 2012 Exp Cell Res 318(11): 1221-8). 게다가 아폴로 라이트 사이언스(Apollo Life Sciences)(분자 및 그들의 키메릭 분자(Molecules and chimeric molecules thereof) US 20090232808 A1)의 선행기술은 개별 뉴로트로핀에 대한 p75 뉴로트로핀 수용체의 친화도의 유사성을 더 예를 든다. "NGFR은 28 아미노산 시그널 펩티드로 구성되는 427 아미노산 글리코단백질로서 합성된 타입 I 멤브레인 단백질이다. NGFR은 모든 뉴로트로핀에 동일한 친화도로 결합한다."

비아코어 플라즈마 공명 연구로부터 GGG 링커 스페이서를 이용하여 인간 IgG1 Fc에 결합되는 서열 3 및 15의 결합 친화도에서 의미있는 변화를 보았다. 표 4: 각각의 뉴로트로핀에 대한 서열 3 및 15의 비아코어 친화도

등전점 ( pI ) 감소(Reducing the Isoelectric point)

서열 3의 등전점과 아폴로 라이프 사이언스 선행기술에 개시된 것은 4.11의 이론적 pI를 가지지만, 이들 분자 둘다는 실제로 3-4의 범위에서 pI를 초래하도록 상당하게 글리코실화된다.

서열 15는 이론적 pI 4.23을 가지고 다른 p75NTR 보다 덜 글리코실화되어 있다. 이어서, pI는 4-5의 범위에 있다. 이는 서열 3 및 아폴로 라이프 사이언스 선행기술에 전에 개시된 서열에 대해 상당한 장점(글리코실레이션 위치 및 글리코실레이션의 양의 변화에 기인한 개선된 제형 및 분자 구조의 낮은 가변성)을 제공한다.

본 발명은 여기 설명된 구체적 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제, 여기서 설명된 것에 더해 본 발명의 다양한 변형이 앞선 설명 및 수반 도면에 으로부터 통상의 기술자에 의해 명백할 것이다. 그 변형은 부속된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 또한, 여기 설명된 모든 구현예는 광범위하게 적용가능하며 임의의 그리고 모든 다른 일관된 구현예와 적절하게 조합할 수 있다.

다양한 공개자료가 여기서 인용되었으며, 그들에 개시된 것은 그 전체가 참조로서 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Levicept Ltd. <120> FUSION PROTEIN <130> LEV01134GBP1 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 460 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein <400> 1 Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn 20 25 30 Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val 35 40 45 Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu 50 55 60 Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala 85 90 95 Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp 100 105 110 Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp 115 120 125 Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp 130 135 140 Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys 145 150 155 160 Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly 165 170 175 Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu 180 185 190 Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met 195 200 205 Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Asp Ile 210 215 220 Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 225 230 235 240 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 245 250 255 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 260 265 270 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 290 295 300 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 305 310 315 320 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 330 335 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 340 345 350 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 355 360 365 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 370 375 380 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 385 390 395 400 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 410 415 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 420 425 430 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 435 440 445 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 2 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion Protein <400> 2 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly 20 25 30 Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys 35 40 45 Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe 50 55 60 Ser Asp Val Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys 65 70 75 80 Val Gly Leu Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala 85 90 95 Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg 100 105 110 Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser 115 120 125 Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr 130 135 140 Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val 145 150 155 160 Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp 165 170 175 Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro 180 185 190 Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala 195 200 205 Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr 210 215 220 Thr Val Met Gly Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 3 Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn 20 25 30 Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val 35 40 45 Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu 50 55 60 Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg 65 70 75 80 Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala 85 90 95 Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp 100 105 110 Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp 115 120 125 Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp 130 135 140 Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys 145 150 155 160 Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly 165 170 175 Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu 180 185 190 Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met 195 200 205 Gly Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 4 <211> 1411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cloning insert <400> 4 aagcttgccg ccaccatgga atggtcctgg gtgttcctgt tcttcctgtc cgtgaccacc 60 ggcgtgcact ccaaagaggc ttgtcccacc ggcctgtaca cccactctgg cgagtgttgc 120 aaggcctgta acctgggaga aggcgtggcc cagccttgtg gcgctaatca gacagtgtgc 180 gagccctgcc tggactccgt gaccttctcc gatgtggtgt ccgccaccga gccttgcaag 240 ccctgcacag agtgtgtggg cctgcagtcc atgtccgccc cttgcgtgga agccgacgac 300 gccgtgtgta gatgcgccta cggctactac caggacgaga caaccggcag atgcgaggcc 360 tgcagagtgt gcgaagctgg ctctggcctg gtgttcagtt gtcaagacaa gcagaacacc 420 gtgtgcgagg aatgccccga cggcacctac tctgacgagg ccaatcacgt ggacccctgc 480 ctgccttgca ccgtgtgtga agataccgag cggcagctgc gcgagtgcac cagatgggct 540 gatgccgagt gcgaagagat ccctggccgg tggatcacca gatccacccc tccagagggc 600 tccgactcta ccgctccctc tacccaggaa cctgaggccc ctcctgagca ggacctgatc 660 gcttctacag tggccggcgt cgtgaccaca gtgatgggcg gaggcggcga gcctaagtcc 720 tccgacaaga cccacacctg tcccccttgt cctgcccctg aactgctggg cggaccttcc 780 gtgtttctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccggac ccccgaagtg 840 acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 900 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggaacagta caactccacc 960 taccgggtgg tgtctgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 1020 aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcca gcccccatcg aaaagaccat ctccaaggcc 1080 aagggccagc cccgggaacc ccaggtgtac acactgcccc ctagcaggga cgagctgacc 1140 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctcgtg aagggcttct acccctccga tatcgccgtg 1200 gaatgggagt ccaacggcca gcctgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1260 agcgacggct cattctttct gtactccaag ctgacagtgg acaagtcccg gtggcagcag 1320 ggcaacgtgt tctcctgcag cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 1380 tccctgtccc tgagccccgg ctgatgaatt c 1411 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Secretase site <400> 5 Gly Ser Ser Gln Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Asp Ile 1 5 10 15 Glu Gly Arg Met Asp 20 <210> 6 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence for sequence alignment. <400> 6 Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser 1 5 10 15 Gln 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Thr Val Met Gly Ile Pro 1 5 10 15 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr 20 25 30 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 35 40 45 Leu Phe 50 <210> 10 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence for sequence alignment <400> 10 Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 <210> 11 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence for sequence alignment <400> 11 Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 20 25 30 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 35 40 45 <210> 12 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence for sequence alignment <400> 12 Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 20 25 30 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 35 40 45 Phe Leu Phe 50 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial sequence for sequence alignment <400> 13 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 1 5 10 15 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Val Phe Leu Phe 35 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 14 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 15 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Fusion Protein <400> 15 Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys 1 5 10 15 Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn 20 25 30 Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val 35 40 45 Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu 50 55 60 Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val 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Tyr Lys Cys Lys Val Ser 275 280 285 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 290 295 300 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 305 310 315 320 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 325 330 335 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 340 345 350 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 355 360 365 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 370 375 380 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 385 390 395 400 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 405 410

Claims

(a) p75NTR(NBP) 단백질; 및
(b) 면역글로불린 Fc 부분(Fc portion)
을 포함하고,
상기 p75NTR(NBP) 단백질 및 Fc 부분은, 식 Gx (x는 3이다.)의 펩티드를 포함하는 링커를 통해 연결되되,
상기 링커는 서열 GGGGS로 구성되거나 서열 GGGGS를 포함하는 것이 아닌, p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 p75NTR(NBP)는 인간(human) p75NTR(NBP)인 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 Fc는 인간 Fc(human Fc)인 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질은 SEQ ID NO.3으로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함하는 것인 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질이 SEQ ID NO.15로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 포함하는 것인 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 p75NTR(NBP)는 20℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된 결합 친화도(K_d)가 약 0.01 nM에서 약 50 nM인 NGF, BNDF, NT3 또는 NT4/5 중 어느 하나에 결합하는 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
통증의 치료에 사용하기 위한 제1항에 따른 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질.
선택적으로 신호 서열을 엔코딩하는 것을 더 포함하는, 제1항에 따른 p75NTR 뉴로트로핀 결합 단백질(NBP)-Fc 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산 분자.
세포, 선택적으로 포유류 세포를 트랜스팩션하기 위한 복제가능한 발현 벡터로서, 상기 벡터가 제8항의 핵산 분자를 포함하는 복제가능한 발현 벡터.
제9항에서,
상기 벡터가 바이러스 벡터인 복제가능한 발현 벡터.
제8항의 핵산 분자를 보유하는(harbouring) 숙주 세포.
통증의 치료에 사용하기 위한 제8항에 따른 핵산분자.
통증의 치료에 사용하기 위한 제9항 또는 제10항에 따른 복제가능한 발현 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질로서, 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질은 제2의 약리학적 활성 화합물과 결합되는 조합에서 개별적, 연속적 또는 동시에 사용되는 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질.
제8항에 따른 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 제2의 약리학적 활성 화합물과 결합되는 조합에서 개별적, 연속적 또는 동시에 사용되는, 제8항에 따른 핵산 분자.
제9항 또는 제10항에 따른 복제가능한 발현 벡터로서, 상기 벡터는 제2의 약리학적 활성 화합물과 결합되는 조합에서 개별적, 연속적 또는 동시에 사용되는 제9항 또는 제10항에 따른 복제가능한 발현 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 제8항에 따른 핵산 분자 또는 제9항 또는 제10항에 따른 벡터; 및 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 첨가제를 포함하는 통증 치료용 약학적 조성물.
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 제8항에 따른 핵산 분자 또는 제9항 또는 제10항에 따른 벡터; 및
(b) 개체(individual)에게 통증의 예방 또는 치료 중 어느 하나 이상을 위한 또는 통증의 완화, 제어, 발생 감소, 또는 발전 또는 진전의 지연을 위한 상기 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질, 핵산 분자, 벡터 또는 약학적 조성물의 유효량 투여에 관한 지시서를 포함하는 키트.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 p75NTR(NBP)-Fc 융합 단백질 또는 제8항에 따른 핵산 분자 또는 제9항 또는 제10항에 따른 벡터의 치료학적으로 유효한 양을 인간이 아닌 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 수용가능한 담체를 더 포함하는 인간이 아닌 개체의 통증의 치료 및/또는 예방 방법.