CN105873943B

CN105873943B - 融合蛋白

Info

Publication number: CN105873943B
Application number: CN201480060027.8A
Authority: CN
Inventors: S·韦斯特布鲁克
Original assignee: LEVICEPT Ltd
Current assignee: LEVICEPT Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: MX2016003530A; WO2015040398A1; CA2924410A1; DK3046934T3; IL244588A0; RS58463B1; JP6681834B2; BR112016006113A2; HUE043273T2; ES2714694T3; JP2016531590A; CY1121347T1; KR102205633B1; GB201316592D0; PT3046934T; SI3046934T1; EA037416B1; TR201903490T4; LT3046934T; AU2014322842B2

Abstract

本发明涉及一种包含p75N‑TR(NBP)部分和免疫球蛋白部分的p75NTR神经营养因子结合蛋白(NBP)‑Fc融合蛋白。在某些实施方案中，p75NTR(NBP)‑Fc融合蛋白用于治疗疼痛和/或疼痛症状。

Description

融合蛋白

发明背景

神经营养因子、神经营养生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)和神经营养因子4/5(NT-4/5)通过4种受体：低亲和力p75神经营养受体(p75NTR)和高亲和力酪氨酸激酶受体TrkA、TrkB和TrkC发挥作用。低亲和力受体p75NTR结合并且被全部4种神经营养因子激活并且已经报道独立于其他受体发挥作用。但是，更选择性地激活Trk受体，即，NGF是TrkA的选择性配体，BDNF是TrkB的配体，并且NT-3、NT-4/5是TrkC的配体。此外已经报道，当p75NTR蛋白和Trk蛋白共表达时，它们形成改变两种受体的信号传导的复合物(Huang和Reichardt，2003，生物化学年评(Annu Rev Biochem.)72：609-42)。实际上，已经提出p75NTR促进每种神经营养因子对其相应Trk受体的选择性。

p75NTR是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFR-SF)的成员并且是这个超家族中充分表征的第一个成员。这个超家族(在人类中由大约30个基因编码)由配体结合结构域定义，所述配体结合结构域由首先在p75NTR中鉴定的40氨基酸富含半胱氨酸结构域(CRD)的一个或多个(一般4个)重复序列组成(Johnson等人，1986细胞(Cell)47：545-554；Radeke等人，1987自然(Nature)325：593-597)。与之相反，全部TNFR-SF家族成员的胞内结构域不共有序列基序。因此，TNFR-SF蛋白的信号传导机制大幅度变动。

p75NTR结构的不寻常特征是存在借助跨膜结构域内部的半胱氨酰残基形成的二硫键连接的p75NTR二聚体。这个二硫键是p75NTR进行有效神经营养因子依赖性信号传导所需要的并且在胞内和胞外结构域的形成中发挥重要作用(Vilar等人，2009神经元(Neuron)62：72-83)。神经营养因子在生理学上作为非共价缔合的二聚体存在(Bothwell和Shooter,1977生物化学杂志(J Biol Chem.)252(23)：8532-6)，分布半寿期为大致5分钟(Tria等人,1994实验神经学(Exp Neurol.)127(2):178-83)。神经营养因子依赖性p75NTR激活包含神经营养因子二聚体与p75NTR二聚体的两个胞外结构域的CRD 2-4缔合(He和Garcia，2004科学(Science)304：870-875)。最近的研究支持一种模型，其中神经营养因子结合造成p75NTR二聚体的两个胞外结构域移动靠得更近，迫使胞内结构域以该二硫键为中心的蜗牛钳样(snail-tong-like)运动展开并允许胞内结构域与信号传导衔接蛋白NRIF和TRAF6缔合(Vilar等人,2009细胞科学杂志(J Cell Sci)122：3351-3357，Vilar等人，2009神经元(Neuron)62：72-83)。以前尚未在其他TNFR-SF家族成员中或任何其他膜蛋白中描述跨膜结构域内二硫键，如p75NTR中存在的那些。

p75NTR以类似于刻缺蛋白(Notch)和β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursorprotein)的切割赖性信号传导途径的方式依次接受α-分泌酶活性和γ-分泌酶活性和基质金属蛋白酶(MMP)的蛋白酶剪切，释放其胞内结构域(ICD)至细胞质中(Jung等人，2003生物化学杂志(J Biol Chem)，278：42161-42169；Kanning等人,2003神经科学杂志(J Neuro-sci)23：5425-5436)。p75NTR ICD通过这条途径的胞质释放促进相关NRIF的信号传导(Kenchappa等人,2006神经元(Neuron)50：219-232)。在α-分泌酶活性和γ-分泌酶活性和MMP的蛋白酶剪切后，p75NTR胞外结构域的作用未得到充分理解。

已经记录，NGF和其他神经营养因子(BDNF、NT-3和NT-4/5)在病理学例如因骨关节炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、银屑病、搔痒症和多发性硬化所致的疼痛中发挥重要作用(Watanabe等人，2008神经研究杂志(JNeurosci Res.)86(16):3566-74)；Raychaudhuri等人,2011关节炎风湿病(Arthritis Rheum.)63(11)：3243-52；Barthel等人，2009关节炎研究疗法(Arthritis Res Ther.11)(3)：R82；Truzzi等人，2011细胞死亡分化(Cell DeathDiffer.)l8：948-58；McDonald等人，2011当今药物化学(Curr Med Chem.)18：234-44；Yamaoka等人，2007皮肤病学科学杂志(J Dermatol Sci.)46(1)：41-51)。证实针对任何神经营养因子；NGF或BDNF、NT-3和NT-4/5的选择性抗体显著地减少疼痛。另外，还已经证实针对神经营养因子受体p75NTR Trk A、Trk B或Trk C的抗体在疼痛模型中有效(Orita S等人，2010整形外科研究杂志(J Orthop Res.)28：1614-20；Svensson P等人，2010疼痛(Pain.)148：473-80；Iwakura等人，2010手外科学美国卷(J Hand Surg Am.)35：267-73；Cirilio等人,2010细胞分子神经生物学(Cell Mol Neurobiol.)30：51-62；Pezet等人，2010疼痛(Pain.)90：113-25；Hayashi等人，2011疼痛杂志(J Pain.)12：1059-68；Chu等人，2011疼痛(Pain.)152：1832-7；Ueda等人，2010药学科学杂志(J Pharmacol Sci.)112：438-43；Ghilardi等人，2010骨(Bone.)48：389-98；Fukui等人，2010整形外科研究杂志(JOrthop Res.)2010；28:279-83)。Fukui等人(2010)在一个疼痛模型中(坐骨神经挤压后的机械性异常疼痛)用抗p75NTR抗体治疗后显示疼痛相关性终点方面的显著功效。从这项研究得出结论，用p75NTR抑制性抗体治疗减少CGRP和p75NTR表达，导致显著减少疼痛。

本发明涉及一种p75NTR神经营养因子结合蛋白(NBP)-Fc融合蛋白。我们描述了这种分子的亲和力和体内动力学，以及动物模型中治疗疼痛的有效性。p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可用于治疗疼痛和其他神经营养因子相关性疾病，如银屑病、湿疹、类风湿性关节炎、膀胱炎、子宫内膜异位症和骨关节炎。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供一种p75NTR神经营养因子结合蛋白(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(a)p75NTR(NBP)部分；和

(b)免疫球蛋白Fc部分。

优选地，p75NTR(NBP)部分和Fc部分经接头连接。更优选地，接头包含式G_x的肽，其中x是1、2、3、4、5或6。

在根据本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的特别优选的实施方案中，p75NTR(NBP)是人p75NTR(NBP)。在根据本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的另一个特别优选的实施方案中，Fc是人Fc。

在又一个优选的实施方案中，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ IDNO.3中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方案中，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO.15中所述的氨基酸序列或由SEQ ID NO.15中所述的氨基酸序列组成。

在一个优选实施方案中，根据本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白以通过表面等离子体共振在20℃所测量的约0.01nM至约50nM之间的结合亲和力(K_d)与NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者结合。

在本发明的第二方面，根据本发明任何其他方面提供如所述那样的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白用于治疗疼痛或疼痛症状。

在本发明的第三方面，提供编码根据本发明第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的核酸分子，所述核酸分子任选地还包括编码信号序列。

在本发明的第四方面，提供一种用于转染细胞、可选地转染哺乳动物细胞的复制型表达载体，所述载体包含根据本发明的第三方面的核酸分子。

优选地，该复制型表达载体是病毒载体。

在本发明的第五方面，提供一种携带本发明的第三方面的核酸分子的宿主细胞。

在本发明的第六方面，根据本发明第三方面的核酸分子或根据本发明第四方面的载体用于治疗疼痛或疼痛症状。

疼痛或疼痛症状包括但不限于：急性疼痛；慢性疼痛；炎性疼痛；伤害性疼痛；神经病理性疼痛(neuropathic pain)；痛觉过敏；异常性疼痛(allodynia)；中枢性疼痛；癌疼痛；术后疼痛；内脏疼痛；肌肉骨骼疼痛；心脏或血管疼痛；头部疼痛，包括偏头痛；口面疼痛，包括牙疼痛和背痛。疼痛的治疗包括，但不限于，预防疼痛和/或疼痛症状、改善疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟疼痛和/或疼痛症状形成或进展。

在第七方面，提供根据第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根据第三方面或第四方面的核酸或载体，其中p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或载体组合中与第二药理活性化合物组合时分别、依次或同时使用。

在第八方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明任何方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据本发明任何方面的核酸分子或载体，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

优选地，药物组合物用于以下任一种或多种情况：预防疼痛和/或疼痛症状、改善疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率或延迟疼痛和/或疼痛症状形成或进展。

在本发明的又一个方面，提供一种试剂盒；其包含：

(a)根据本发明任何方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据本发明任何方面的核酸分子或载体，或根据第八方面的药物组合物；和

(b)用于针对以下任一种或多种情况向个体给药有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、核酸分子、载体或药物组合物的说明书：预防或治疗疼痛和/或疼痛症状或用于缓解疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟疼痛和/或疼痛症状形成或进展。

在本发明的又一个方面，提供一种治疗和或预防个体中疼痛和/或疼痛症状的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量根据本发明任何方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据本发明任何方面的核酸分子或载体，任选地进一步包括药学上可接受的载体，或者根据本发明第八方面的药物组合物。

附图说明

图1.根据本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。α分泌酶切割位点和γ分泌酶切割位点以粗体显示。IgG1Fc部分以斜体显示。

图2.图4中所述的核酸序列(SEQ ID NO.4)的翻译产物(SEQ ID NO.2)，从起始密码子至终止密码子。

图3.根据本发明的优选的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO.3)。IgG1Fc部分以斜体显示。p75NTR(NBP)部分和Fc部分之间的接头序列加下划线显示。

图4.从5’克隆位点至3’克隆位点的完整产物基因的核酸序列(SEQ ID NO.4)

图5.p75-NTR(NBP)-Fc融合蛋白变体：1：p75_NTR-p75-NTR序列(SEQ ID NO.6)；2：市售p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.7)；3：p75_Fc-Fc序列相对于IgG1za的Lonza恒定区被修饰的市售p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.8)；4：p75_Fc_C222S-Fc序列相对于IgG1za的Lonza恒定区被修饰及位置222处额外半胱氨酸突变成丝氨酸的市售p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.9)；5：p75_Fc_G4x1-变体1，提出的具有4残基甘氨酸接头的p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.10)；6：p75_Fc_G4Sx1-变体2，所提出的具有单个四甘氨酸丝氨酸接头的p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.11)；7：p75_Fc_G4Sx2-变体3，提出具有两个四甘氨酸丝氨酸接头的p75-NTR-Fc融合蛋白(SEQ ID NO.12)；8：IgG1za的Lonza恒定区(SEQ IDNO.13)。

在这个比对结果中，一种格式方案用来突出显示推定性受体、Fc-融合蛋白和Fc恒定区之间具有相似性的区域：加框的类型用来显示变体蛋白和p75-NTR之间序列相同的区域；单下划线用来显示全部Fc-融合蛋白和Lonza IgG1za Fc之间序列相同的区域；斜体用来显示在p75-NTR和Fc恒定区交界处的接头区域；双下划线和粗体类型用来显示接头区域外部序列不相同的位置，在等同于亲本p75-NTR Fc-融合蛋白中222的位置处。

图6：p75NTR-Fc在MIA诱导的啮齿动物OA模型中显著减少疼痛。*P<0.1并且**P<0.05

图7：根据本发明的优选的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO.15)。IgG1Fc部分以斜体显示。p75NTR(NBP)部分和Fc部分之间的接头序列加下划线显示。

发明详述

(a)p75NTR(NBP)部分；和

(b)免疫球蛋白Fc部分。

优选地，p75NTR神经营养因子结合蛋白p75NTR(NBP)是聚乙二醇化的，进一步优选地它是糖基化的。

本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白优选地与NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者或多者以约0.01nM至约50nM之间的结合亲和力(K_d)结合。在一些优选的实施方案中，结合亲和力(K_d)在约0.01nM和约0.1nM、0.2nM、0.5nM、1nM、1.5nM、2nM、2.5nM、3nM、3.5nM、4nM、4.5nM、5nM、5.5nM、6nM、6.5nM、7nM、7.5nM、8nM、8.5nM、9nM、9.5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM或50nM的任一者之间，如针对NGF、BDNF、NT3或NT4/5的体外结合测定法中如本文所述那样测量，优选地通过表面等离子体共振在20℃测量。在一些其他的优选实施方案中，结合亲和力(Kd)是或小于约250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、600pM、650pM、700pM、750pM、800pM、850pM、950pM或1nM的任一者，如采用神经营养因子在p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的体外结合测定法中如本文所述那样测量，优选地通过表面等离子体共振在20℃所测量。在又一个更优选的实施方案中，结合亲和力(K_d)是约0.3nM或约1nM，如采用神经营养因子在p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的体外结合测定法中如本文所述那样测量，优选地通过表面等离子体共振在20℃所测量。

优选地，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白用于治疗疼痛或疼痛症状的用途。不希望受任何具体理论约束，发明人认为通过实现前述神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5的功能活性(定义为调节或者上调或下调神经营养因子的功能活性)，例如，前述神经营养因子因其与其相应受体相互作用而产生的功能活性，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白实现治疗疼痛或疼痛症状的效力。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白实现BDNF的功能活性，如通过以下任一者的功能测定法所评估：神经元和突触的生长和分化、神经元细胞培养中的存活和分化、Trk信号传导、体外或体内刺激轴突增生。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白实现NGF的功能活性，如通过测量NGF与TrkA结合和TrkA激活所评估，如经典神经元存活测定法(如在Cowan等人，神经科学年鉴(Annu.Rev.Neurosci.)2001；24：551-600中提供)中所展示。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白实现NGF的功能活性，如通过测量NT3与内源性Trk受体结合和内源性Trk受体活性激活所评估，如在Trk受体磷酸化、促分裂原活化蛋白激酶磷酸化报道分子测定法或细胞存活和神经突延展测定法中所展示。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白实现NT4/5的功能活性，如通过测量NT4/5体外或体内磷酸化和激活测定法所评估，例如，在髓鞘碱性蛋白(MBP)磷酸化测定法或可选地在体内在血管内皮生长因子(VEGF)/碱性成纤维细胞生长因子诱导的血管发生(angiogenesis)的基质胶血管发生测定法中所评估。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白与神经营养因子NGF、NT3、BDNF和NT4/5中一者或多者的接触残基结合，如He和Garcia(2001)科学(Science)，301，第870-805页中所显示。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白是可溶的，优选地可溶于水性溶液中，优选地可溶于生物流体如血清、血浆、血液中。

如本文所用，术语“Fc”或“免疫球蛋白Fc”或“Ig Fc”理解为意指免疫球蛋白链恒定区的羧基端部分，优选地免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分，或其部分。优选地，免疫球蛋白Fc包含1)CH1域、CH2域和CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区，2)CH1域和CH2域，任选地连同免疫球蛋白铰链区，3)CH1域和CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区，4)CH2域和CH3域，任选地连同免疫球蛋白铰链区或5)选自但不限于CH1、CH2和CH3的两个或更多个结构域的组合，任选地与免疫球蛋白铰链区组合。优选地，免疫球蛋白Fc至少包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域，和任选地CH1结构域。优选地，免疫球蛋白Fc包含具有以下同种型的免疫球蛋白的Fc或Fc部分或由其组成，所述同种型包括但不限于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，进一步优选地IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、sIgA，更优选地IgG1、IgG2或IgG4，最优选地IgG1。任选地，免疫球蛋白Fc还包含了起到使补体固定或抗体依赖性细胞毒性最小化或改善与Fc受体结合的亲和力的氨基酸突变、缺失、置换或化学修饰。

进一步优选地，免疫球蛋白Fc包含以下任一者或由其组成：(a)CH2域或其部分和CH3域或其部分，(b)CH2域或其部分，或(c)CH3域或其部分，其中免疫球蛋白Fc或其部分具有以下同种型，所述同种型包括但不限于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、进一步优选地IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、sIgA、更优选地IgG1、IgG2或IgG4，最优选地IgG1。

优选地，免疫球蛋白Fc包含免疫球蛋白重链的羧基末端区域或由其组成，并且可以包含来自IgG、IgA或IgD抗体同种型的CH2域和/或CH3域或其部分，或来自IgM或IgE的CH2域和/或CH3域和/或CH4域或其部分。优选地，免疫球蛋白Fc包含Fc片段或由其组成，所述Fc片主要段包含CH3和小部分的CH2，如通过胃蛋白酶消化免疫球蛋白可衍生。优选地，免疫球蛋白Fc包含完整Fc区或由其组成，所述完整Fc区包含CH2和CH3，额外地与铰链区连接，所述铰链区是在完整免疫球蛋白中连接CH1区和CH2区的重链短片段，如可以通过木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白产生。优选地，免疫球蛋白铰链区包含铰链区或铰链区的部分或由其组成，所述铰链区或铰链区的部分源自IgG、优选人IgG，更优选地选自但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，最优选IgG1，或可选地是前述铰链区实施方案的物种变体或等位变体。所述铰链区或免疫球蛋白铰链区的部分可以位于Fc区的C或N末端处，优选地在N末端处。

根据本发明的一个优选实施方案，免疫球蛋白Fc优选地包含免疫球蛋白的Fc或Fc的部分或由其组成，所述免疫球蛋白在CH2区中包含野生型序列的减少Fc效应子功能的一个或多个氨基酸突变。优选地，这些突变是A330、P331至S330、S331(氨基酸编号相对于野生型IgG1序列，其中CH2区域处于人重链IgG1恒定区中[欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1999)29:2613-2624]。优选地，免疫球蛋白Fc是糖基化并且在生理pH高度带电，因此有助于增溶p75NTR(NBP)。Fc区还允许通过抗Fc酶联免疫吸附测定(ELISA)检测p75NTR(NBP)，例如出于诊断目的。本发明的p75NTR(NBP)优选地在正常糖基化位点处使Ig Fc糖基化的细胞中合成。

优选地，免疫球蛋白Fc包含人免疫球蛋白Fc区或由其组成。

根据本发明，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白优选地显示出有利的生物学特性：改善的p75NTR(NBP)溶解度和/或p75NTR(NBP)稳定性和/或改善的p75NTR(NBP)血清半寿期。改善的溶解度是合乎需要的，旨在p75NTR(NBP)的生物利用率在给药时最大化并且可以确定并实施p75NTR(NBP)的精确剂量。改善的溶解度有利于克服聚集体问题，所述聚集体是不想要的，在体内递送时造成疼痛并且导致潜在的炎症。改善的血清半寿期具有以下优点：促进在治疗使用期间为实现递送的p75NTR(NBP)的等同治疗作用或维持治疗作用所要求的剂量水平减少或给药频率减少。在血液或血清中延长的半寿期和更高的稳定性具有如下优点：允许较少频率给药和/或较低给药水平的剂量方案，因此减少体内潜在毒性或副作用。在这种情况下，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白在其治疗作用方面更强有力和/或在循环中更稳定。所得的较低或较少给药频率在最小化与p75NTR(NBP)给药可能相关的任何潜在毒性作用或副作用方面是有利的。p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的分子量还超过单独的p75NTR(NBP)增加，这具有以下优点：当静脉内给药时，该分子将充分留在血液循环中，从而降低渗透至非目的部位(例如中枢神经系统)的风险，并且产生适于在靶向的组织中停留或浓缩的分子。

优选地，与单独的p75NTR(NBP)相比，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白显示改善的p75NTR(NBP)溶解度和/或改善的p75NTR(NBP)稳定性和/或改善的血清半寿期。优选地，改善的溶解度是在水性溶液(如水)中的、优选地含有赋形剂如缓冲剂和/或盐、优选地在生理pH、优选地在pH 5至pH 8之间、优选地在约pH 7时的溶解度，或是在生物流体如血清或血液中的溶解度。优选地，改善的稳定性是在一段时间范围内、在一个储存时间期间或在冷冻和融化后p75NTR(NBP)蛋白的活性或结构完整性因变性、氧化、片段化或聚集效应所致的稳定性。结构稳定性可以由变性、氧化、团集或聚集的标准计量判定，可以通过本文中公开的结合测定法或功能测定法测量活性的稳定性，测量蛋白质血清半寿期的方法是已知的。

优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可以从多种哺乳动物宿主细胞以高水平表达以提供单一种类并且可以有效地通过亲和层析纯化，例如通过与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A结合来纯化。优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可以二聚化，并且优选地，与单独的p75NTR(NBP)相比，二聚体对于神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5具有增加的亲和力。更紧密的结合具有更高效力和更高治疗功效的优点，如通过p75NTR(NBP)效果所判定，例如，如通过本文中公开的神经营养因子功能测定法所测定。更高的效力具有如下益处：p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可以按较低剂量使用以实现相同的治疗功效，因此减少体内潜在毒性或副作用。

优选地，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白具有约或大于以下任一者的体内半寿期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210小时+/-1小时，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白进一步优选地具有约或大于24小时的体内半寿期。

本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白进一步优选地具有约或大于以下任一者的体外半寿期：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208或210日+/-1日，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白进一步优选地具有约或大于6日的体外半寿期。优选地在约生理pH、在缓冲的水性溶液，优选地在20℃或37℃测量稳定性。

根据前述优选实施方案，体内半寿期优选地是在大鼠中的半寿期或在人类中的半寿期，更优选地是在人类中的半寿期。优选地，在体内给药例如通过静脉内或皮下注射后，从本发明p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的血清测量水平确定半寿期。

p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的p75NTR(NBP)和免疫球蛋白Fc部分可以由接头连接。接头优选地包含一个或多个氨基酸或由其组成或者包含具有如下个氨基酸的多肽序列或由其组成：优选地约1至约25个氨基酸、优选地1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸的任意个氨基酸、进一步优选地约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个氨基酸的任一个氨基酸，最优选地13个氨基酸。

优选地，接头包含缺少任何稳定二级结构如α螺旋、β链、3₁₀螺旋和pi螺旋、多聚脯氨酸螺旋、α折叠的氨基酸的多肽序列或由其组成。优选地，接头区域包含限定柔性或动态或非结构化多肽如柔性环、随机卷曲或柔性转角的氨基酸的多肽序列或由其组成，经常发现这类非结构化多肽连接大蛋白质分子中的二级结构区域。

优选地，接头是如下氨基酸的多肽序列，所述氨基酸包含p75NTR(NBP)中大于或约50％的甘氨酸和/或丙氨酸和/或丝氨酸，进一步优选地包含p75NTR(NBP)中大于或约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的甘氨酸和/或丙氨酸和/或丝氨酸。接头区域优选地包含如下氨基酸的多肽序列或由其组成，所述氨基酸包含甘氨酸和丝氨酸二者，优选地甘氨酸的比例大于丝氨酸的比例，接头区域优选地包含柔性接头或由其组成。

不希望受任何具体理论约束，发明人认为，柔性接头克服或防止空间位阻，其中与单独的p75NTR(NBP)相比时，所述空间位阻可能干扰p75NTR(NBP)-Fc融合物的前述神经营养因子结合能力或生物活性。因此，接头区域优选地允许p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白Fc部分之间的柔性并且与单独的游离或天然p75NTR(NBP)相比，允许保留或改善p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的前述生物活性，如使用如本文所述的结合测定法通过与神经营养因子的结合所测定。

进一步优选地，接头是免疫上惰性的，从而它不触发补体介导的溶解，不刺激抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，不活化小胶质细胞或T细胞。优选地，接头区域在这些活性的一种或多种活性方面减弱。

进一步优选地，接头包含从结构分析或结构预测中已知或预测为柔性或动态或非结构化多肽或缺少稳定二级结构的多肽或由其组成。

最优选地，接头包含式G_x的肽或由其组成，其中x是1、2、3、4、5或6。

本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白还可以包含蛋白酶剪切位点，所述剪切位点任选地间插在p75NTR(NBP)部分和免疫球蛋白Fc部分之间。该蛋白酶剪切位点可以位于接头中或接头与p75NTR(NBP)部分或/和免疫球蛋白Fc部分的交界处。p75NTR(NBP)可以任选地在配制和或为治疗目的给药之前从免疫球蛋白Fc部分切下。

备选地，本发明的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白可以经工程化以移除蛋白酶剪切位点。在一个优选实施方案中，可以移除α分泌酶切割位点和γ分泌酶切割位点。在一个特别优选的实施方案中，移除序列GSSQPVVTRGTTDNDIEGR MD(SEQ ID NO.5)。

在其他的优选实施方案中，可以改变p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白中的某些氨基酸以改善特性如产率或溶解度。一个特别优选的实施方案是将位置222处的半胱氨酸残基变成丝氨酸残基，发现所述改变在制造该蛋白质期间从CHO细胞表达时减少蛋白质的聚集。

优选地，接头和/或免疫球蛋白Fc部分不损害或不明显损害p75NTR(NBP)部分：

(a)对神经营养因子NGF、BDNF、NT3或NT4/5的功能活性的影响(定义为调节或上调或下调神经营养因子的功能活性)，

(b)针对NGF、BDNF、NT3或NT4/5中任一者的结合亲和力，结合亲和力在约0.1nM至约50nM之间，

(c)与神经营养因子NGF、NT3、BDNF和NT4/5每一者、优选地与人NGF、NT3、BDNF和NT4/5结合的能力。

根据本发明的另一个方面，提供编码根据第一方面或第二方面的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的核酸分子。优选地，该核酸分子用于治疗疼痛。

根据本发明的一个优选实施方案，该核酸分子还可以包含编码信号序列，优选地p75NTR信号序列的区域，例如DNA或RNA序列。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于转染细胞的可复制表达载体，所述载体包含第三方面的核酸分子，优选地该载体是病毒载体。优选地，该载体用于治疗疼痛的用途。

进一步根据本发明的以上方面，提供一种表达本发明的核酸分子或载体以产生或分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的方法。优选地，该方法包括将核酸分子或载体引入细胞并且在其中表达所述核酸以产生或分泌p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白。优选地，将核酸分子或载体体外引入细胞中，可选地体内引入。优选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表达是体外表达，任选地进一步分离并纯化，备选地，p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白的表达优选地是体内表达，体内表达优选地构成基因治疗。优选地，载体是可复制表达载体，任选地用于转染哺乳动物细胞，优选地，载体是病毒载体。

根据本发明的另一个方面，提供一种携带第三方面或第四方面的核酸分子或载体的宿主细胞，优选地，细胞是哺乳动物细胞。

根据本发明的另一个方面，提供用于治疗疼痛或疼痛症状的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或用于治疗疼痛或疼痛症状的核酸或载体。疼痛或疼痛症状可以包括但不限于：

(a)急性疼痛和/或自发性疼痛，

(b)慢性疼痛和或持续性疼痛，

(c)炎性疼痛，包括以下任一种：关节炎疼痛、因骨关节炎或类风湿性关节炎产生的疼痛、因炎性肠病、银屑病和湿疹产生的疼痛，

(d)伤害性疼痛，

(e)神经性疼痛，包括痛苦的糖尿病性神经病或与疱疹后神经痛相关的疼痛，

(f)痛觉过敏，

(g)异常性疼痛，

(h)中枢性疼痛、中枢性中风后疼痛、因多发性硬化产生的疼痛、因脊髓损伤产生的疼痛或因帕金森病或癫痫产生的疼痛，

(i)癌症疼痛，

(j)术后疼痛，

(k)内脏疼痛，包括消化道内脏疼痛和非消化道内脏疼痛，因胃肠(GI)紊乱所致的疼痛、因功能性肠病症(FBD)产生的疼痛、因炎性肠病(IBD)产生的疼痛、因痛经、盆腔疼痛、膀胱炎、间质性膀胱炎或胰腺炎产生的疼痛，

(l)肌肉骨骼疼痛、肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性(非类风湿性)关节病、非关节风湿病、抗肌萎缩蛋白病、糖原分解、多发性肌炎、化脓性肌炎，

(m)心脏或血管疼痛、因心绞痛(angina)、心肌梗死、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬皮病(scleredoma)、硬皮病或骨骼肌局部缺血所致的疼痛，

(n)头部疼痛，其包括偏头痛、有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛。

(o)口面疼痛，其包括牙疼痛、颞颚肌筋膜疼痛或耳鸣，或

(p)背痛、滑囊炎(menstrual pain)、月经疼痛、偏头痛、牵涉痛、三叉神经痛、超敏(hypersensitisation)、因脊柱创伤和/或变性或脑卒中(stroke)产生的疼痛。

疼痛的治疗包括，但不限于，预防疼痛和/或疼痛症状、改善疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟疼痛和/或疼痛症状形成或进展。

根据本发明的另一方面，提供根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体，其中p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或载体在组合中与第二药理活性化合物组合时分别、依次或同时使用。优选地，组合的第二药理活性化合物可以包括但不限于：

·阿片类镇痛药，例如吗啡(morphine)、海洛因(heroin)、氢吗啡酮(hydromorphone)、羟吗啡酮(oxymorphone)、左啡诺(levorphanol)、左洛啡烷(levallorphan)、美沙酮(methadone)、哌替啶(meperidine)、芬太尼(fentanyl)、可卡因(cocaine)、可待因(codeine)、双氢可待因(dihydrocodeine)、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)、右丙氧芬(propoxyphene)、纳美芬(nalmefene)、烯丙吗啡(nalorphine)、纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、纳布啡(nalbuphine)或喷他佐辛(pentazocine)；

·非甾体抗炎药(NSAID)，例如阿司匹林、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳(diflusinal)、依托度酸(etodolac)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟苯柳(flufenisal)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美洛昔康(meloxicam)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、尼美舒利(nimesulide)、硝基氟吡洛芬(nitroflurbiprofen)、奥沙拉秦(olsalazine)、奥沙普秦(oxaprozin)、保泰松(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)或佐美酸(zomepirac)；

·巴比妥类镇静剂，例如异戊巴比妥(amobarbital)、阿普比妥(aprobarbital)、仲丁巴比妥(butabarbital)、布他比妥(butabital)、甲苯比妥(mephobarbital)、美沙比妥(metharbital)、美索比妥(methohexital)、戊巴比妥(pentobarbital)、苯巴比妥(phenobartital)、司可巴比妥(secobarbital)、他布比妥(talbutal)、塞米乐(theamylal)或硫喷妥(thiopental)；

·具有镇静作用的苯二氮

(benzodiazepine)，例如氯氮

(chlordiazepoxide)、氯拉

酸(clorazepate)、地西泮(diazepam)、氟西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)或三唑仑(triazolam)；

·具有镇静剂作用的H₁拮抗剂，例如苯海拉明(diphenhydramine)、吡拉明(pyrilamine)、异丙嗪(promethazine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)或氯环利嗪(chlorcyclizine)；

·镇静剂，如格鲁米特(glutethimide)、甲丙氨酯(meprobamate)、甲喹酮(methaqualone)或二氯醛比林(dichloralphenazone)；

·骨骼肌松弛药、例如巴氯芬(baclofen)、卡立普多(carisoprodol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、美索巴莫(methocarbamol)或邻甲苯海拉明(orphrenadine)；

·NMDA受体拮抗剂，例如右美沙芬(dextromethorphan)((+)-3-羟-N-甲基吗啡喃)或其代谢物右啡烷(dextrorphan)((+)-3-羟-N-甲基吗啡喃)、氯胺酮(ketamine)、美金刚(memantine)、吡咯并喹啉奎宁(pyrroloquinoline quinine)、顺-4-(膦酰甲基)-2-哌啶羧酸、布地品(budipine)、EN-3231(

，吗啡和右美沙芬(dextromethorphan)的组合制剂)、托吡酯(topiramate)、奈拉美生(neramexane)或培净福太(perzinfotel)，包括NR2B拮抗剂，例如艾芬地尔(ifenprodil)、曲索罗地(traxoprodil)或(-)-(R)-6-{2-[4-(3-氟苯基)-4-羟-1-哌啶基]-1-羟乙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮；

·α-肾上腺素能药，例如多沙唑嗪(doxazosin)、坦索罗辛(tamsulosin)、可乐定(clonidine)、胍法辛(guanfacine)、右美托咪定(dexmetatomidine)、莫达非尼(modafinil)、或4-氨基-6,7-二甲氧基-2-(5-甲烷-亚磺酰氨基-1,2,3,4-四氢异喹啉-2-基)-5-(2-吡啶基)喹唑啉；

·三环抗忧郁药，例如地昔帕明(desipramine)、丙米嗪(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline)；

·抗惊厥药，例如卡马西平、拉莫三嗪(lamotrigine)、托吡酯(topiratmate)或丙戊酸盐(valproate)；

·速激肽(NK)拮抗剂，特别地是NK-3、NK-2或NK-1拮抗剂，例如(αR,9R)-7-[3,5-双(三氟甲基)苄基]-8,9,10,11-四氢-9-甲基-5-(4-甲基苯基)-7H-[1,4]二氮杂环辛并[2,1-g][1,7]-萘啶-6-13-二酮(TAK-637)、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮(MK-869)、阿瑞吡坦(aprepitant)、拉奈匹坦(lanepitant)、达匹坦(dapitant)或3-[[2-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-甲氨基]-2-苯基哌啶(2S,3S)；

·毒蕈碱拮抗剂，例如奥昔布宁(oxybutynin)、托特罗定(tolterodine)、丙哌维林(propiverine)、曲司氯铵(tropsium chloride)、达非那新(darifenacin)、索利那辛(solifenacin)、替米维林(temiverine)和异丙托铵(ipratropium)；

·COX-2选择性抑制剂，例如塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、帕瑞考昔(parecoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、地拉考昔(deracoxib)、依托考昔(etoricoxib)或鲁米考昔(lumiracoxib)；

·煤焦油镇痛药，尤其扑热息痛(paracetamol)；

·神经安定药，如氟哌利多(droperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氟哌啶醇(haloperidol)、奋乃静(perphenazine)、硫利达嗪(thioridazine)、美索达嗪(mesoridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、氯氮平(clozapine)、奥氮平(olanzapine)、利培酮(risperidone)、齐拉西酮(ziprasidone)、喹硫平(quetiapine)、舍吲哚(sertindole)、阿立哌唑(aripiprazole)、索奈哌唑(sonepiprazole)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、雷氯必利(raclopride)、佐替平(zotepine)、联苯芦诺(bifeprunox)、阿塞那平(asenapine)、鲁拉西酮(lurasidone)、氨磺必利(amisulpride)、巴拉皮利酮(balaperidone)、帕林朵(palindore)、依利色林(eplivanserin)、奥沙奈坦(osanetant)、利莫纳班(rimonabant)、美兰纳坦(meclinertant)、

或沙立佐坦(sarizotan)；

·香草素受体(vanilloid receptor)激动剂(例如树胶脂毒素(resinferatoxin)或拮抗剂(例如辣椒平(capsazepine))；

·β-肾上腺素能药如普萘洛尔(propranolol)；

·局部麻醉药如美西律(mexiletine)；

·皮质类固醇如地塞米松(dexamethasone)；

·5-HT受体激动剂或拮抗剂，特别地5-HT_1B/1D激动剂如依立曲坦(eletriptan)、舒马曲坦(sumatriptan)、那拉曲坦(naratriptan)、佐米曲坦(zolmitriptan)或利扎曲坦(rizatriptan)；

·5-HT_2A受体拮抗剂如R(+)-α-(2,3-二甲氧基-苯基)-1-[2-(4-氟苯乙基)]-4-哌啶甲醇(MDL-100907)；

·胆碱能(烟碱)镇痛药，如异丙克兰(ispronicline)(TC-1734)、(E)-N-甲基-4-(3-吡啶基)-3-丁烯-1-胺(RJR-2403)、(R)-5-(2-吖丁啶基甲氧基)-2-氯吡啶(ABT-594)或尼古丁；

·

·PDEV抑制剂，如5-[2-乙氧基-5-(4-甲基-1-哌嗪基-磺酰基)苯基]-1-甲基-3-正丙基-1,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(西地那非(sildenafil))、(6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-六氢-2-甲基-6-(3,4-亚甲二氧苯基)-吡嗪并[2',1':6,1]-吡啶并[3,4-b]吲哚-1,4-二酮(IC-351或他达拉非(tadalafil))、2-[2-乙氧基-5-(4-乙基-哌嗪-1-基-1-磺酰基)-苯基]-5-甲基-7-丙基-3H-咪唑并[5,1-f][1,2,4]三嗪-4-酮(伐地那非(vardenafil))、5-(5-乙酰基-2-丁氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-乙基-3-吖丁啶基)-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、5-(5-乙酰基-2-丙氧基-3-吡啶基)-3-乙基-2-(1-异丙基-3-吖丁啶基)-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、5-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基磺酰基)吡啶-3-基]-3-乙基-2-[2-甲氧乙基]-2,6-二氢-7H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮、4-[(3-氯-4-甲氧苄基)氨基]-2-[(2S)-2-(羟甲基)吡咯烷-1-基]-N-(嘧啶-2-基甲基)嘧啶-5-甲酰胺、3-(1-甲基-7-氧代-3-丙基-6,7-二氢-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)-N-[2-(1-甲基吡咯烷-2-基)乙基]-4-丙氧基苯磺酰胺；

·大麻素(cannabinoid)；

·促代谢型谷氨酸盐亚型1受体(mGluR1)拮抗剂；

·血清素再吸收抑制剂，如舍曲林(sertraline)、舍曲林代谢物-去甲基舍曲林、氟西汀(fluoxetine)、诺氟西汀(norfluoxetine)(氟西汀去甲基代谢物)、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)、西酞普兰(citalopram)、西酞普兰代谢物-去甲基西酞普兰(desmethylcitalopram)、艾司西酞普兰(escitalopram)、d,l-芬氟拉明(d,l-fenfluramine)、非莫西汀(femoxetine)、伊福西汀(ifoxetine)、氰基度硫平(cyanodothiepin)、利托西汀(litoxetine)、达泊西汀(dapoxetine)、奈法唑酮(nefazodone)、西文氯胺(cericlamine)和曲唑酮(trazodone)；去甲肾上腺素(noradrenaline)(去甲肾上腺素(norepinephrine))再吸收抑制剂，如马普替林(maprotiline)、洛非帕明(lofepramine)、米氮平(mirtazepine)、羟丙替林(oxaprotiline)、非唑拉明(fezolamine)、托莫西汀(tomoxetine)、米安色林(mianserin)、安非他酮(buproprion)、安非他酮代谢物-羟安非他酮(hydroxybuproprion)、诺米芬辛(nomifensine)和维洛沙秦(viloxazine)

特别地是选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂如瑞波西汀(reboxetine)、尤其(S,S)-瑞波西汀；

·血清素-去甲肾上腺素再吸收双重抑制剂，如文拉法辛(venlafaxine)、文拉法辛代谢物O-去甲基文拉法辛(O-desmethylvenlafaxine)、氯米帕明(clomipramine)、氯米帕明代谢物-去甲基氯米帕明(desmethylclomipramine)、度洛西汀(duloxetine)、米那普仑(milnacipran)和丙咪嗪(imipramine)；

·诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂，如S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-L-同型半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-4,4-二氧代-L-半胱氨酸、S-[2-[(1-亚氨乙基)氨基]乙基]-2-甲基-L-半胱氨酸、(2S,5Z)-2-氨基-2-甲基-7-[(1-亚氨乙基)氨基]-5-庚烯酸、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-5-氯-3-吡啶甲腈；2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)-丁基]硫代]-4-氯苯腈、(2S,4R)-2-氨基-4-[[2-氯-5-(三氟甲基)苯基]硫代]-5-噻唑丁醇、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-6-(三氟甲基)-3-吡啶甲腈、2-[[(1R,3S)-3-氨基-4-羟-1-(5-噻唑基)丁基]硫代]-5-氯苯腈、N-[4-[2-(3-氯苄氨基)乙基]苯基]噻吩-2-甲脒或胍基乙基二硫醚；

·乙酰胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐(donepezil)；

·前列腺素E₂亚型4(EP4)拮抗剂，如N-[({2-[4-(2-乙基-4,6-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-1-基)苯基]乙基}氨基)-羰基]-4-甲基苯磺酰胺或4-[(1S)-1-({[5-氯-2-(3-氟苯氧基)吡啶-3-基]羰基}氨基)乙基]苯甲酸；

·白三烯B4拮抗剂；如1-(3-联苯基-4-基甲基-4-羟-苯并二氢吡喃-7-基)-环戊烷羧酸(CP-105696)、5-[2-(2-羧乙基)-3-[6-(4-甲氧苯基)-5E-己烯基]氧苯氧基]-戊酸(ONO-4057)或DPC-11870，

·5-脂加氧酶抑制剂，如齐留通(zileuton)、6-[(3-氟-5-[4-甲氧基-3,4,5,6-四氢-2H-吡喃-4-基])苯氧甲基]-1-甲基-2-喹诺酮(ZD-2138)或2,3,5-三甲基-6-(3-吡啶基甲基)、1,4-苯醌(CV-6504)；

·钠通道阻滞剂，如利多卡因(lidocaine)；或

·5-HT3拮抗剂，如昂丹司琼(ondansetron)；

以及它们药学上可接受的盐和溶剂化物。

根据本发明的又一个方面，提供一种治疗、预防、缓解、控制、减少个体中疼痛形成或进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的发生率或延迟疼痛形成或进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的方法，所述方法包括向个体给药有效量的根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体。

本发明适用于人类医学和兽医医学领域。优选地，个体是哺乳动物，例如伴侣动物如马、猫或犬或家畜如羊、牛或猪。最优选地，个体是人。

根据本发明的第八方面，提供一种用于治疗、预防、缓解、控制、减少疼痛形成或进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的发生率或延迟疼痛形成或进展或任何前述疼痛和/或疼痛症状的组合物，所述组合物包含根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

优选地，制备根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物用于或适于口服、舌下、颊部、局部、直肠、吸入、透皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、心内、骨内、皮内、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、关节内、关节周、局部或皮内给药。

优选地，制备根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物是用于或适于疼痛发作之前和/或期间和/或之后给药或用于或适于这类用途。

优选地，制备根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物用于或适于每周1次至7次之间给药，进一步优选地每月1次至4次之间给药、进一步优选地每6个月时间1次至6次之间给药，进一步优选地每年1次至12次给药。优选地，将药物意在或制备意在以包括但不限于以下的时间外周地给药：每日1次、每2、3、4、5或6日1次、每周1次、每2周1次、每3周1次、每月1次、每2个月1次、每3个月1次、每4个月1次、每5个月1次、每6个月1次、每7个月1次、每8个月1次、每9个月1次、每10个月1次、每11个月1次或每年1次。

进一步优选地，将根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物意在或制备意在通过包括但不限于以下的一个或多个途径外周地给药：口服、舌下、经颊地、局部、直肠、通过吸入、经皮、皮下、静脉内、动脉内或肌内、通过心内给药、骨内、皮内、腹膜内、经粘膜、阴道、玻璃体内、表皮、关节内、关节周或局部途径。

优选地，制备根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物用于或适于以约0.05mg/ml至约200mg/ml之间的浓度；优选地在以如下任一个浓度：约0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml+/-约10％误差，最优选地在兽医应用中以约3mg/ml及人类中以0.1mg/ml给药。

优选地，制备根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物用于或适于以约0.1mg/kg至约200mg/kg体重之间的浓度；优选地在以如下任一个浓度：约0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、110mg/kg、120mg/kg、130mg/kg、140mg/kg、150mg/kg、160mg/kg、170mg/kg、180mg/kg、190mg/kg或约200mg/kg体重+/-约10％误差，最优选地在兽医应用中以约10mg/kg及人类中以0.3mg/kg给药。

根据本发明的第九方面，提供一种试剂盒，其包含：

(a)根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物；和

(b)针对以下任一种或多种情况向个体给药有效量的所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、核酸分子、载体或药物组合物的说明书：预防或治疗疼痛和/或疼痛症状或用于缓解疼痛和/或疼痛症状、控制疼痛和/或疼痛症状、减少疼痛和/或疼痛症状的发生率，或延迟疼痛和/或疼痛症状形成或进展。

该试剂盒可以包含一个或多个容器，所述容器含有本文所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白、核酸、载体或药物组合物，和根据本发明任何方法和用途的使用说明书。试剂盒还可以包含选择适于治疗的个体的描述，所述选择基于鉴定该个体是否具有疼痛或疼痛症状或面临具有这种疼痛或疼痛症状的风险。用于给药药物组合物的说明书可以包含信息，如关于预期治疗的剂量、给药方案和给药途径。

根据本发明的又一个方面，提供根据第一方面或第二方面或其优选实施方案的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或根据第三方面和第四方面的核酸分子或载体或第八方面的药物组合物用于以下任一种或多种情况：预防或治疗病状或病状的症状或缓解该病状或该病状的症状、控制该病状或该病状的症状、减少该病状或该病状的症状发生率，或延迟该病状或该病状的症状形成或进展，所述病状与神经营养因子NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5的任一种或多种相关。

-NGF(神经生长因子)与至少两类受体p75NTR和TrkA(一种参与轴突生长、支化和伸长的跨膜酪氨酸激酶)结合。与NGF相关的病状和症状是已知的。NGF在炎性病症和疼痛中表达并与之相关[蛋白质序列NP_002497.2，NP_038637]。另外，已经显示NGF在许多心血管疾病如冠状动脉粥样硬化、肥胖症、2型糖尿病和代谢综合征中以及在多发性硬化中发挥作用。降低的NGF血浆水平(以及另外降低的BDNF血浆水平)已经与急性冠状动脉综合征和代谢综合征相关。NGF还与各种精神病症相关，如痴呆、抑郁、精神分裂症、孤独症、Rett综合征、神经性厌食和神经性贪食，并且还已经涉及阿尔茨海默病和神经变性病的形成。还已经显示NGF加速伤口愈合，并且存在它可以用于治疗皮肤溃疡和角膜溃疡的证据，已经显示它减少神经变性并在大鼠中促进外周神经再生。

-BDNF(脑衍生神经营养因子)是在神经系统发育期间支持神经元存活和生长的神经营养因子[蛋白质序列NP_001137277.1、NP_001041604]。BDNF结合细胞表面受体TrkB和p75NTR并且还调节α-7烟酸受体的活性。与BDNF相关的病状和症状是已知的。已经显示BDNF在生理疼痛和病理疼痛传递方面、特别在其中发现BDNF合成大大增加的急性疼痛、炎性疼痛和神经性疼痛的模型中发挥重要作用；还已经显示BDNF在慢性疼痛病状以及其他病状如湿疹和银屑病中上调。在抑郁、精神分裂症、强迫性障碍、阿尔茨海默病、亨廷顿病病、Rett综合征和痴呆以及神经性厌食和神经性贪食中观察到BDNF的下调。

-神经营养因子-4(NT-4)，也称作神经营养因子-5(NT-5)，是优势地经p75NTR受体和TrkB受体传导信号并促进外周感觉交感神经神经元存活的神经营养因子。这种蛋白质的成熟肽在检查过的全部哺乳动物(包含人、猪、大鼠和小鼠)中是相同的[蛋白质序列NP_006170，NP_937833]。NT-4大多由背根神经节(DRG)的神经元和椎旁和椎前交感神经节、脊髓背角和腹角中的那些神经元合成，并且发现在许多组织(包括前列腺、胸腺、胎盘和骨骼肌)中表达。与NT-4/5相关的病状和症状是已知的。NT4/5中的缺陷与原发性开角型青光眼的易患性相关。还已经显示神经营养因子子4有助于乳腺癌细胞存活并且是抑制肿瘤生长的靶。NT-4/5已知参与疼痛-信号传导系统，如伤害性疼痛，还在皮肤慢性炎性病症中观察到NT-4/5的上调，如皮炎、湿疹、异位性皮炎的痒疹病灶。在阿尔茨海默病、亨廷顿病病中观察到NT-4/5的下调。

-神经营养因子-3(NT-3)，是结构上与β-NGF、BDNF和NT-4相关并控制哺乳动物神经元存活和分化及成体神经系统维持的神经营养因子，并且在人胎盘中表达时可以影响胚胎中神经元的发育。与NT3相关的病状和症状是已知的。通过基因打靶产生的NTF3-缺陷小鼠显示严重的肢体运动缺陷。NT-3通过Trk受体进行信号传导并促进神经和神经胶质细胞的生长和存活[蛋白质序列NP_001096124.1和NP_032768]。人、小鼠和大鼠NT-3的氨基酸序列相同。已知NT3及其同族受体，酪氨酸激酶C(TrkC)，调节神经性疼痛和伤害性疼痛和伤害感受及本体感受机制，例如NT3表达在神经病理动物的小DRG细胞中增加。NT3表达还与神经病如糖尿病性多发性神经病和HIV相关性神经病、大纤维神经病(包括萎缩)相关，它还参与痛觉过敏(通常有害的刺激的阈值下降)、异常性疼痛(无害刺激变得有害)和自发性疼痛(明显缺乏刺激的情况下疼痛)的形成并且是肌肉疼痛的已知调节物。

现在将参以下实施例描述本发明，其中提供所述实施例以说明而非限制本发明。

实施例

p75NTR-Fc序列的免疫原性计算机检验(In silico immunogenicy testing)

目前利用重组DNA技术产生广泛类型的生物药物，包括新类别的基于单克隆抗体(mAb)的Fc(可结晶片段)的多功能治疗性融合蛋白(Huang 2009生物技术新观点(CurrOpin Biotechnol)，20(6)，692-9)。治疗性蛋白与Fc结构域融合通过两种不同方式延长分子的血清半寿期，增强生物制药的总体治疗作用。首先，通过pH依赖的新生Fc受体(FcRn)结合作用，再循环性Fc-融合物减少治疗性蛋白在内体中的降解。其次，相对治疗性分子，通过添加Fc-结构域和通过Fc-介导的与治疗性蛋白二聚化增加分子大小有助于限制肾清除作用。

可以通过将两个或更多个结构域直接连接在一起产生融合蛋白。但是，这可能在所得的融合蛋白中导致不利的分子特性，如受损的生物活性(Bai等人，2005美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)102 7292-7296)、蛋白质错误折叠(Zhao等人，2008蛋白质表达和纯化(Protein Expr.Purif.)61,73-77)或低产率(Amet等人，2009制药研究(Pharm.Res.)26，523-528)。可以在结构域之间插入接头序列以解决这些潜在问题，但是必须考虑几种因素以选出适宜的接头。首先，接头必须反映融合蛋白内部结构域的总体预期功能。在一些情况下，结构域必须独立地发挥作用，因此需要接头柔性。相反，如果将结构域固定，则可能需要刚性接头。第二，接头不得通过翻译后修饰(PTM)向融合蛋白引入任何不想要的官能性。最后，必须考虑接头和接头旁侧区域的潜在免疫原性，因为接头可以是不天然存在于人体中的从头设计序列。

大部分治疗性蛋白不同程度地具有免疫原性(Van Walle等人,2007生物治疗专家意见(Expert Opin Biol Ther.)7(3):405-18,Stas等人,2009抗体疗法的免疫原性评价(Immunogenicity assessment of antibody therapeutics.)剑桥大学出版社(CambridgeUniversity Press)，剑桥)并且甚至所谓全人类抗体治疗药可能含有免疫原性区域(Harding等人，2010单克隆抗体(MAbs.)2,256-265)。免疫原性是诱导Th(辅助T细胞(T-helper))反应的能力，其中独特T细胞受体识别与抗原呈递细胞上展示的HLA II类分子结合的肽时，所述反应触发。肽从抗原呈递细胞内化的蛋白质生成，所述蛋白质随后通过内体切割途径加工。仅对HLA II类分子具有足够亲和力的肽将呈递在细胞表面上，并且或许可能触发Th反应。

因此，可以通过移除Th表位降低免疫原性潜力，一个称作去免疫化的过程(Chamberlain 2002监管评估(The Regulatory Review)5，4-9；Baker和Jones2007药物发现和发现的新观点(Curr.Opin Drug Discov.Devel.)10，219-227)。这通过以下方式实现：预测治疗性蛋白中的哪些肽可以与HLA II类分子结合并随后引入置换消除或减少肽对HLAII类分子的结合亲和力。

存在几个HLA II类基因并且几乎均具有高度多态性。另外，HLA II类分子由α和β链组成，所述链各自衍生自不同基因，所述基因连同内在多态性一起进一步增加变异。具体而言，每位个体表达基因：DRA/DRB、DQA/DQB和DPA/DPB。这些基因当中，仅DRA无多态性。此外，‘第二’DRB基因(DRB3、DRB4或DRB5)也可以是存在的，其产物也与DRA链结合。

去免疫化期间，重点在于DR同种异型，已知以比DQ和DP更高的水平表达(Laupeze等人，1999人类免疫学(Hum.Immunol.)60，591-597，Gansbacher和Zier 1988细胞免疫学(Cell Immunol.)117，22-34，Berdoz等人,1987免疫学杂志(J.Immunol.)139，1336-1341，Stunz等人，1989免疫学杂志(J.Immunol.)143，3081-3086)。DR同种异型通常通过DRB基因提到，因为DRA基因保持恒定，例如DRB1*01:01，其中数字是等位基因特异的。

个体表位的严重性评定基于混杂标准，即与特定表位结合的HLA同种异型的数目，以及群体中同种异型的重要性(频率)和HLA:肽复合物结合强度的定性评定。由于已经选择个体的T细胞群体不识别‘自身肽’，所以可能筛选正在对下述肽去免疫化的蛋白质，所述肽对应于正常情况下不应当诱导Th反应的(已知)自身肽。尽管不知道哪些内源蛋白在T细胞成熟期间内化并且因此产生自身肽，但是抗体属于这些内源蛋白(Kirschmann等人，1995免疫学杂志(J.Immunol.)155，5655-5662,Verreck等人，1996免疫遗传学(Immunogenetics)43，392-397，Harding等人，2010单克隆抗体(MAbs.)2，256-265)。

p75-NTR Fc-融合蛋白设计

p75-NTR Fc-融合蛋白的Fc部分的特定同种异型是IgG pCon载体IgGza(见上文)。

p75-NTR Fc-融合蛋白的设计按几个阶段推进：

·确定Fc-融合蛋白中待使用的p75-NTR序列的确切结构。考虑几种因素，包括：

°p75-NTR Fc-融合物应当能够结合几种神经营养因子，至少包括NGF、BDNF、NT-3和NT-4；必须在p75-NTR Fc-融合蛋白中保留柔性。

。不想要的α-分泌酶切割位点存在于p75-NTR-Fc(SEQ ID NO.1)上的胞外结构域中，这些切割位点必须从该序列移除，因为它们将受到切割并且因此减少p75-Fc产物在体内的生物学活性和PK谱(PK profile)。原始的p75-Fc产物(参见SEQ ID NO.1)含有α-分泌酶切割位点并且与SEQ ID NO.3相比，半寿期和生物学活性(PK/PD)因此显著减少(见下文)。

鉴定了适用于p75-NTR Fc-融合蛋白中连接胞外p75-NTR结构域和Fc的适宜实证性接头。排除了含有可能潜在参与翻译后修饰(PTM)的位点的接头序列。

使用具有Fc区的适宜部分的所确定的p75-NTR构建体，使用不同的潜在接头序列，以计算机方式构建p75-NTR Fc-融合蛋白的几种变体。尝试p75-NTR胞外结构域C末端、Fc铰链区和潜在接头的结构建模和分析(参见表1)。

使用Epibase^TM，对具有不同接头序列的变体筛选潜在Th表位。

基于预测的免疫原性风险，提出表达的序列3p75-NTR Fc-融合蛋白(SEQ IDNO.3)。

Fc-融合蛋白序列分析

13种目前可用的治疗性Fc-融合蛋白的蛋白质序列从美国采用名称(USAN)网址获得(http://www.ama-assn.org/ama/pub/physician-resources/medical-science/)。在可能的情况下，将蛋白质序列交叉参比并且相对于其他在线资源(如在线专利信息网址)检查。使用在线资源，研究级Fc-融合蛋白的蛋白质序列从其他商业供应商获得。

为了鉴定衍生多种Fc-融合蛋白的推定性亲本序列，使用MAFFT，将Fc-融合蛋白序列与自有Lonza IgG pCon载体的翻译蛋白质产物比对(Katoh等人,2002核酸研究(NucleicAcids Res.)30，3059-3066)。比对的Fc-融合蛋白序列随后在其中Fc-融合物开始匹配IgG序列的位置处截短。为了确定IgG序列在何处开始，使用三个连续IgG残基标准。

使用无IgG序列的截短型Fc-融合蛋白序列，进行Uniprot数据库(UniProt协会(The UniProt Consortium)，UniProt发布2012-09-Oct3，2012)自有副本的Blast检索(Altschul等人,1997核酸研究(Nucleic Acids Res.)253389-3402)，以鉴定匹配最接近的蛋白质序列。每个Fc-融合蛋白序列随后针对Uniprot数据库中存在的匹配最接近的序列和匹配最接近的Lonza IgG pCon序列手工再比。随后提取融合配偶体和Fc区之间的交界并且产生两个集合，一个集合针对13种治疗性Fc-融合蛋白和一个结合针对市售Fc-融合蛋白。随后从这两个集合限定接头区域。

市售Fc-融合蛋白序列集合随后在其中相对于匹配最接近的Lonza IgG pCon序列找到序列同一性的N末端位置处截短。随后分选截短的序列并且生成无冗余序列集合。

Epibase^TM免疫概况分析

使用Global集合中的85个HLA II类同种异型，对Fc-融合蛋白变体进行Epibase^TM免疫概况分析。

仅使用HLA结合作用预测，就免疫原性风险比较Fc-融合蛋白变体是非常困难的。这是因为几个重要因素未考虑：

··结合肽可能不由加工装置生成并且因此它将从未作为肽-HLA复合物由抗原呈递细胞暴露于Th细胞。

··肽-HLA复合物可能不被Th细胞识别。

鉴于这些考虑，可以使用Epibase^TM免疫概况分析在变体序列之间进行三个类型的定量比较。首先，可以比较DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP同种异型集合中每个集合的关键表位数目，其中与相同组的多个同种异型结合的肽计为一个。这种表位计数显示，每个集合内部独特表位的数目和变体之间的差异揭示完全移除或添加潜在Th表位。

由于许多表位，尤其杂乱表位，结合多个同种异型，独特Th表位计数的变化可能模糊变体间免疫原性潜力的实际减少或增加。因此，第二定量比较是在全部Th表位范围内每个HLA同种异型水平上，其中变体的每种同种异型的结合肽计数，连同血清型和群体频率一起，允许在血清型水平或同种异型水平比较。其三，表达最差情况下免疫原性风险的近似评分可以如下计算：

评分＝∑(表位计数x同种异型频率)

从预测与给定同种异型结合的表位的数目和受影响同种异型的等位基因频率计算每个受影响同种异型的乘积。本研究中使用的全部受影响DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP同种异型的乘积。应当指出个体同种异型评分不是借此测量免疫原性风险的绝对度量，因为应当考虑全部选择的HFA同种异型(DRB1、DRB3/4/5、DQ和DP)。

认为人抗体种系序列(如衍生自Lonza pCon IgG Fc的那些)无免疫原性，因为它们存在于呈递给人免疫系统的循环型抗体池中并且可以视为自身肽。类似地，认为p75-NTR内在地无免疫原性，因为它在人体中天然表达。因此，从展示的计数评分和免疫原性评分排除因完全从人抗体种系序列或从p75-NTR衍生的肽产生的关键表位。

结构建模

使用Lonza的建模平台，生成所提出的p75-NTR Fc-融合蛋白的结构模型。基于其序列同一性，以及模板结构的定性结晶学量值，如分辨率(以埃

计)，将p75-NTR和Fc部分的候选结构性模板片段评分、排序并且从自有抗体数据库和蛋白质数据库(PDB)选出。

生成结构性模板片段与p75-NTR Fc-融合蛋白的序列比对结果。模板片段连同序列比对结果由MODEFFER(Sal等人，1993分子生物学杂志(J.Mol.Biol)234，779-815)处理。这个方案产生从所比对的结构性模板集合导出的构象性约束。通过共轭梯度法和模拟退火优化法产生满足这些约束的全体结构。基于衍生自蛋白结构评分的能量评分和满足构象约束，从这个全体选出一个或多个模型结构。检查模型并且使用侧链优化算法，将靶和模板之间差异的位置的侧链优化并使能量最小化。一套可视化和计算工具用来评估各结构的构象变异性，以及结构域的核心堆积和局部堆积以选择一个或多个优选的模型。

p75-NTR Fc-融合蛋白设计

设计了p75-NTR Fc-融合蛋白的三个接头变体。鉴于尝试在最终Fc-融合蛋白中p75-NTR区域内保留柔性的设计约束因素和避开不利的α分泌酶和γ分泌酶切割位点的要求，将胞外p75-NTR序列在位置G237处截短。原始p75NTR-Fc序列1(SEQ ID NO.1)在位置A250处截短。已经在p75-NTR的胞外部分中位置241-242和位置244-245之间鉴定到α分泌酶切割位点(Zampieri等人，2005生物化学杂志(J Biol Chem)280,14563-71)并且已经通过位置282的区域内的序列同源性推断出一个推定性γ分泌酶切割位点。从序列1的PK/PD显而易见，与序列3(SEQ ID NO.3)相比，序列1(SEQ ID NO.1)的PK和生物学活性显著减少。从这些实验得出结论，α分泌酶位点和γ分泌酶位点促成体内活性减少。

为变体所选择的接头的关键要求是Fc-融合蛋白中允许融合配偶体的柔性以避免引入能够造成PTM的任何残基并维持低免疫原性风险。

存在两类可用于连接p75-NTR至Fc恒定区的接头，实证性接头和衍生自天然蛋白质的接头。衍生自天然蛋白质的接头可能引入能够造成不利PTM的位点并且归因于其性质，可能具有更大的引入免疫原性的风险。出于这些原因，期待对实证性接头进一步研究并且可以将它们广义地划分为柔性或刚性。下文列出重复单元实证性接头的序列，连同它们的柔性分类：

·(G4S)_x-柔性

·G_x-柔性

·A(EAAAK)_XA-刚性(SEQ ID NO.14)

·(PA)_X-刚性

鉴于需要柔性以确保与最终Fc-融合蛋白中的多个神经营养性配体(至少包括NGF、BDNF、NT3和NT4)结合，仅考虑柔性接头。

基于这些考虑，构建三种变体：一种使用聚甘氨酸接头的变体和两种使用四甘氨酸丝氨酸接头的变体。变体均将原始p75-NTR序列中的G209(表达的蛋白质，参见序列3(SEQID NO.3))视为接头序列的部分。此外，变体在与原始p75-NTR Fc-融合蛋白序列1(SEQ IDNO.1)中位置222等同的位置含有半胱氨酸至丝氨酸突变。图5中显示变体的接头区域。

使用Epibase^TM，分析图1中所示的每种变体和其余序列的免疫原性潜力。下文在表1中显示影响Global集合中85种HLA II类同种异型的关键表位的预测免疫原性评分。另外，表1中还显示受非关键表位影响的同种异型的数目信息。

表1：总结计算的关键表位评分

基于预测的免疫原性和缺少能够PTM的任何位点，变体1(p75_Fc_G4x1)具有三种变体的最佳特征并且产生以便体内检验。

序列1(SEQ ID NO.1)和序列3(SEQ ID NO.3)p75NTR-Fc对NGF的亲和力

Biacore芯片以其中蛋白A胺法偶联于流动小室1和2的实验制备。测量与捕获的p75-Fc结合的NGF的单循环动力学。

芯片表面的结合容量(R_max)取决于配体(融合蛋白)的固定化水平。对于动力学研究，建议50RU-100RU的R_max。通过使用p75-Fc和NGF的分子量，可以计算融合蛋白的所需固定水平。

R_max＝(NGF分子量/融合蛋白分子量)x固定化水平x化学计量比率：50＝(13,500/102,000)x固定化水平x1。

因此，要求的固定化水平＝(102,000/13,500)x 50＝378RU。在单一循环动力学之前，将序列1(SEQ ID NO.1)和序列3(SEQ ID NO.3)p75NTR-Fc和NTR-Fc固定在蛋白A芯片上。

使用手工运行，序列3p75-Fc(SEQ ID NO.3)捕获到蛋白A芯片的流动小室2上直至约380RU的所需水平实现。这个过程用22秒注射以流速10μl/分钟和序列3p75-Fc(SEQ IDNO.3)浓度10μg/ml进行，这导致418RU融合蛋白捕获到蛋白A表面上。

在第一种情况下，测试10nM、5nM、2.5nM、1.25nM和0.625nM的NGF浓度。测试这些浓度，因为融合蛋白的K_D近似处于这个NGF浓度范围内部。

单一循环动力学方法涉及：

-以30μl/分钟注射0.625nM NGF到捕获的p75-Fc上持续120秒

-随后以1.25nM，随后2.5nM、5nM和10nM注射NGF，重复这个过程

-在已经注射NGF终浓度后，通过使运行缓冲液(HBS-EP)在芯片流过，进行600秒解离相。

一旦完成，通过按30μl/分钟注射10mM甘氨酸HCl，pH2持续60秒，使芯片再生恢复其蛋白A表面。

随后通过按流速10μl/分钟以10μg/ml浓度注射38秒，将序列1(SEQ ID NO.1)p75-Fc捕获到芯片上。这实现430RU所需水平。随后重复上文描述的单一循环动力学法。

数据分析

按以下方式使用Biacore T200评价软件vl，分析融合蛋白-NGF结合数据：

-记录NGF与流动小室2上的融合蛋白结合(Fc＝2)和NGF在对照流动小室1上流过(Fc＝1；单独的蛋白A)的数据。

-来自Fc＝1的数据随后从Fc＝2扣除以产生“2-1”结合数据。

-随后从全部2-1结合数据扣除注射0nM(单独的HBS-EP运行缓冲液)时2-1结合数据以控制整个实验期间基线的任何漂移。

-最后，数据则拟合于1:1结合模型以计算结合特征，包括结合速率(ka)、解离速率(kd)和亲和力(K_D)。

-

与捕获的序列1(SEQ ID NO.1)和序列3(SEQ ID NO.3)p75-Fc融合蛋白结合的NGF的单一循环动力学数据

两种融合蛋白与NGF的结合特征均是400pM(SEQ ID NO.1)和360pM(SEQ IDNO.3)。从这些研究显而易见，序列3(SEQ ID NO.3)对NGF具有比序列1(SEQ ID NO.1)更大的亲和力。

序列1(SEQ ID NO.1)和序列3(SEQ ID NO.3)p75NTR-Fc的体内药物代谢动力学

这项研究中使用抵达时重120g-150g的雄性Wistar大鼠(来自英国查尔斯河(Charles River UK))。每只动物在抵达时受到检查并且外观显得健康。将它们随机分配至两个笼子之一并且按尾上印记的刺青，对每只大鼠分配一个独特识别编号。在第0日启动研究前，动物适应于动物设施至少10天。

一旦大鼠已经适应其环境，则将它们转移至其中实施全部体内流程的储藏室/流程室。如1986年内政部动物(科学流程)法案(Home Office Animals(ScientificProcedures)Act)中推荐，通过设定成产生12小时光照-黑暗循环(07:00开灯，19:00关灯)的荧光灯，对动物给予照明。调节各房间的空气并且常规测量空气温度(21℃+/-2℃)和相对湿度。

大鼠采食照射的膳食(科学的动物食品与工程学(Scientific Animal Food andEngineering)，Augy，法国)并且整个研究期间可随意获得高压灭菌水。检查每个批次的膳食并且常规筛查组成和污染物。将筑窝材料和笼子高压灭菌并且每个笼子独立通风(IVC系统)。

研究如此设计，从而存在如表2中所概述的5个处理组。

表2：处理组

大鼠数目	处理	剂量	给药途径	处理天数	n
						1-4	Seq 1p75-Fc	1mg/kg	皮下	0、5和10	4
5-8	Seq 2p75-Fc	1mg/kg	皮下	0、5和10	4

在第2、4、6、8、12和15日在大致相同的时间(早10点-11:30点)，从大鼠尾静脉取得血液样品并制备血浆。

从尾静脉对血液采样

将大鼠置于设定在38℃的加温盒中持续最少5分钟但不超过10分钟，以引起尾静脉血管舒张并且促进出血。将大鼠束缚于适宜的大小限位器(restrainer)中，使用无菌23号针头穿刺尾静脉并且允许血液流入CB300微量采血管(Sarstedt 16,444)。在全部时间点从每只大鼠采集最少100μl和最多300μl的血液。选择不同部位以反复采样并且大鼠在整个手术期间平静。大鼠良好耐受反复血液采样，无淤紫迹象。采集的血液用来制备血浆。

来自心脏的最终血液样品

在异氟烷麻醉药作用下通过心脏穿刺，用Terumo 1ml注射器和23号针头取得最终血液样品(terminal blood samples)。随后通过颈椎脱臼法处死动物。采集的血液用来制备血清。

血浆制备

将含有来自尾静脉的血液的微量采血管温和地颠倒几次以确保与抗凝血剂(钾-EDTA)良好混合。采血管随后置于冰上，之后以2700x g离心10分钟，并且将血浆等分入聚丙烯管(每个时间点每只动物两份等分试样，例外是在第2日，此时仅制备一个等分试样)。全部血浆样品立即冷冻并贮存在-80℃直至需要。

血清制备

允许在第15日通过心脏穿刺采集的血液在室温在聚丙烯管中凝固2小时至3小时(最长3小时)。随后将凝固的血液以4000x g离心5分钟并且将血清等分到聚丙烯管(每只动物两份等分试样)。血清样品立即冷冻并贮存在-80℃。

血浆p75NTR-Fc的测定

使用针对p75NTR(R&D Systems)和IgG1Fc ELISA(R&D Systems)的改良ELISA作为确定完整p75NTR-Fc总血浆浓度的手段，测量血浆p75NTR-Fc。

测定序列1(SEQ ID NO.1)和序列3(SEQ ID NO.3)p75NTR-Fc的药物代谢动力学。

结论

与序列3(SEQ ID NO.3)相比，通过移除序列1(SEQ ID NO.1)p75NTR-Fc的α分泌酶切割位点和γ分泌酶切割位点，则显著地改善p75NTR-Fc的PK及随后改善效力，如慢性治疗后通过疼痛评分所评估。序列1(SEQ ID NO.1)p75NTR-Fc的α分泌酶切割位点和γ分泌酶切割位点使得这种化合物不适合作为治疗疼痛和与神经营养因子生物学有关的其他病变(例如呼吸道疾病)的体内药物。

序列3(SEQ ID NO.3)是稳定的，与序列1(SEQ ID NO.1)相比，具有改善的PK/PD特征和更大的神经营养因子亲和力。

P75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)有镇痛性。

这项研究的目的是研究p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)长期暴露对大鼠中碘乙酸单钠(MIA)所致骨关节炎(OA)的疼痛效力的影响。

先前，我们还已经证实，可以通过使用双足平衡测痛仪(incapacitance tester)测量静态承重进行自发性疼痛的评定并且这种与膝部组织病理学相关。使用疼痛新治疗药的临床前研究已经因其引起数据偏倚的能力受到批评。为了解决这个问题，随机选择左膝和右膝用于诱导OA，并且因每日执行体内任务的全部操作员不知道每个膝部的状态。一般从文献得知，OA的诱导仅在右膝实施，但是在此前研究中，我们发现无论使用什么时间点或MIA剂量，在左膝与右膝中诱导OA之间无恒定差异。

MIA的制备

按0.3mg/50μl ETF-PBS(用于每次关节内注射的体积)制备MIA，这等同于6mg/ml母液。称量出302mg MIA并溶解于中50.3ml ETF-PBS。提前一天制备MIA并且避光贮存在4℃直至需要。

动物

这项研究中使用抵达时重110g-130g的44只雄性Wistar大鼠(来自英国查尔斯河)。每只动物在抵达时受到检查并且外观显得健康。将它们随机分配至两个笼子之一并且按尾上的刺青，对每只大鼠分配一个独特识别编号。在第0日启动研究前，动物适应于动物设施至少10天。一旦大鼠已经适应其环境，则将它们转移至其中实施全部体内流程的储藏室/流程室。如1986年内政部动物(科学流程)法案中推荐，通过设定成产生12小时光照-黑暗循环(07:00开灯，19:00关灯)的荧光灯，对动物给予照明。调节各房间的空气并且常规测量空气温度(21℃+/-2℃)和相对湿度。

大鼠采食照射的膳食(科学的动物食品与工程学，Augy，法国)并且可随意获得高压灭菌水。检查每个批次的膳食并且常规筛查组成和污染物。将筑窝材料和笼子高压灭菌并且每个笼子独立通风(IVC系统)。

实验设计

研究如此设计，从而存在5组动物：对照人抗体(n＝6)、0.3mg/kg p75NTR-Fc(SEQID NO.3)、1mg/kg p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)、3mg/kg p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)和3mg/kgPG-007(辉瑞他尼珠单抗(Tanezumab)的生物仿制药抗NGF抗体)。

每5天通过皮下注射给药抗体和p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)，持续25天。

在第-2日清晨，测量体重和从尾静脉取得基线血液样品。在大致相同的时间，在第-1日，测量基线静态承重。在第0日，再次在大致相同的时间，将全部大鼠用相应的抗体或p75NTR-Fc融合蛋白处理。三小时后，向全部动物给予关节内注射0.3mg MIA至一个膝部(ETF-PBS注入对侧膝部)。

处理的随机化

在启动本研究之前，将大鼠称重并且每个笼两只大鼠随机分配至处理组，从而每个组中动物的平均体重大致相等。除每只大鼠分配特定处理组之外，还实施进一步随机化，从而将每只大鼠的左膝或右膝用MIA注射(来自每只大鼠的对侧膝部用ETFPBS注射)。使用Mac用微软Excel(版本14.1.1)中的随机数字发生器生成处理组分配和每只大鼠的哪个膝部接受治疗。不接触动物的员工实施随机化流程和分配。

对每只动物标记两个7ml聚丙烯小瓶以指示左膝或右膝(总计88个小瓶)。两个人(一个人评定并检查主要随机化工作薄并且一个人等分关节内注射用溶液)准备这88个小瓶。等分过程依次实施，从而首先灌装MIA小瓶，接着剩下的小瓶用ETF-PBS灌装(这是用于每只动物的对侧膝部小瓶)。在整个体内研究期间，科学家不知道全部动物的处理状态。

动物手术

膝部的关节内注射

全部大鼠均使用Boyles装置，通过吸入异氟烷麻醉。剔除每只动物的两个膝部上的毛发并且膝部用乙醇擦拭。使用0.5ml无菌Becton Dickinson Micro-Fine胰岛素注射器连同随附的27号(27G)针头，用ETF-PBS中的50μl 0.3mg MIA或单独ETF-PBS经髌韧带内注射每只膝部。

自发性疼痛的评定

通过使用双足平衡测痛仪(林顿仪器(Linton Instruments)，英国)测量左后肢和右后肢的承重，测定每只动物的自发性疼痛。将大鼠置于双足平衡测痛仪上适当大小的有机玻璃动物盒中，从而它们后足坐在分离的传感器上。盒的大小允许大鼠在不挤压的情况下舒适地坐下，但是类似地不允许它有足够空间转身。一旦大鼠坐稳并平静，记录每个肢体的承重5秒并且记录以克计由双后肢发出的平均力量。在每个时间点测定每只大鼠后爪的重量分布5次(我们事先已经展示其正确性)，并且计算5个读数的均数。通过右侧肢体的重量除以双后肢的总重量，将各个承重数据换算成重量分布。

MIA诱导OA后的自发性疼痛测量

使用双足平衡测痛仪测量经过后肢的重量分布，评定自发性疼痛。在基线和在MIA处理后的3周实施评定。

数据在图6中显示并且作为总重量对后肢的比例显示。

对于从未用过药的动物，后肢上重量比例之间不存在统计显著差异并且理论期望值是0.5。

对于对照抗体处理的动物，与未处理的肢体相比，在处理的肢体上存在统计显著更少的重量(39％与61％)。在用抗NGF抗体(PG-007他尼珠单抗生物仿制药3mg/kg)处理的动物和用p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)按0.3mg/kg和1mg/kg处理的那些动物中，在处理的后肢体上重量比例之间不存在统计(P<0.01)显著差异并且理论期望值为0.5(双后肢之间均匀分布)在测量的任何时间点。与相应的对照相比，3mg/kg的p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)的镇痛作用甚至更统计显著(p<0.05)。

从这些研究显而易见，p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)在OA的MIA大鼠模型中具有镇痛性。p75NTR-Fc(SEQ ID NO.3)的镇痛作用比针对抗NGF抗体(PG-007：生物相似的辉瑞抗NGF抗体他尼珠单抗)在相似剂量皮下3mg/kg时观察到的镇痛作用更大。

p75NTR-Fc分子序列3和序列15对各个神经营养因子的亲和力的改善在意料之外

从文献和现有技术普遍认为，对p75神经营养因子受体的亲和力低并且对全部神经营养因子具有约1nM的相似亲和力(Ichim等人，2012实验细胞研究(Exp Cell Res)318(11):1221-8)。另外，阿波罗生命科学(Apollo Life Sciences)(分子及其嵌合分子US20090232808A1)的现有技术进一步例示p75神经营养因子受体对各种神经营养因子的亲和力的相似性。“NGF是一种作为427个氨基酸糖蛋白合成的I型膜蛋白，这种糖蛋白包含一个28氨基酸信号肽。NGF以相等的亲和力结合全部神经营养因子”。

从Biacore等离子体共振研究中，我们已经证实使用GGG接头间隔团与人IgG1Fc偶联的序列3和序列15的结合亲和力显著变化。

表3：序列3和序列15对每种神经营养因子的Biacore亲和力

序列	NT-3(pM)	NT-4(pM)	BDNF(pM)	NGF(pM)
					3	14	181	48	525
15	15	164	38	498

降低等电点(pI)：

序列3和在阿波罗生命科学(Apollo Life Science)现有技术中公开的那些序列理论上具有4.11的pI。然而，这两类分子显著糖基化，导致实际上pI处于3-4范围内。

序列15具有4.23的理论pI并且比其他p75NTR较少糖基化。从而，pI处于4-5范围内。这提供胜过序列3和阿波罗生命科学现有技术中先前公开的序列的显著优点(配制改善和分子结构的变异性较小，原因在于糖基化位点和糖基化数量的变异)。

本发明在范围方面不受本文中描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前文描述和附图是本领域技术人员显而易见。这类修改意在落入所附权利要求的范围内。另外，如果适宜，本文所述的全部实施方案将视为与任何和全部其他一致性实施方案广义适用和与之可组合。

本文中援引多种出版物是，其公开内容通过引用的方式完整并入。

Claims

1.一种p75NTR神经营养因子结合蛋白(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.15中所述的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白由SEQ ID NO.3中所述的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，所述融合蛋白由SEQ ID NO.15中所述的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR(NBP)以通过表面等离子体共振在20℃所测量的0.01nM至50nM之间的结合亲和力(K_d)与NGF、BDNF、NT3或NT4/5的任一者结合。

5.根据任何一项前述权利要求所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白在制备治疗疼痛或疼痛症状的药物中的用途。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，其中所述p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白或核酸分子或载体在组合中与第二药理活性化合物组合时分别、依次或同时使用。

7.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

8.一种试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)根据权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，和

9.权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白在制备治疗和/或预防个体中疼痛和或疼痛症状的药物中的用途，所述用途包括向所述个体给药治疗有效量的权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的用途，所述治疗有效量的权利要求1至4中任一项所述的p75NTR(NBP)-Fc融合蛋白，进一步包括药学上可接受的载体。