ES2714694T3

ES2714694T3 - Proteína de fusión

Info

Publication number: ES2714694T3
Application number: ES14772194T
Authority: ES
Inventors: Simon Westbrook
Original assignee: LEVICEPT Ltd
Current assignee: LEVICEPT Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: MX2016003530A; WO2015040398A1; CA2924410A1; DK3046934T3; IL244588A0; RS58463B1; JP6681834B2; BR112016006113A2; HUE043273T2; JP2016531590A; CY1121347T1; KR102205633B1; GB201316592D0; PT3046934T; SI3046934T1; EA037416B1; TR201903490T4; LT3046934T; AU2014322842B2; HRP20190434T1

Abstract

Proteína de fusión (NBP)-Fc de unión a neurotrofina p75NTR, comprendiendo: (a) una porción p75NTR(NBP); y (b) una porción Fc de inmunoglobulina donde las porciones p75NTR(NBP) y Fc están conectadas por medio de un conector comprendiendo un péptido de fórmula Gx, donde x es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y donde el conector no comprende ni consta de la secuencia GGGGS.

Description

DESCRIPCION

Protefna de fusion.

Antecedentes de la invencion

[0001] Las neurotrofinas, el factor de crecimiento neurotrofico (NGF, por sus siglas en ingles), el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF, por sus siglas en ingles), la neurotrofina 3 (NT-3) y la neurotrofina 4/5 (NT-4/5) actuan por medio de cuatro receptores: el receptor neurotrofico p75 de baja afinidad (p75NTR) y los receptores de tirosina quinasa de alta afinidad; TrkA, TrkB y TrkC. El receptor p75NTR de baja afinidad se une y es activado por medio de las cuatro neurotrofinas, y se ha descrito que funciona de manera independiente respecto a los otros receptores. Sin embargo, los receptores Trk se activan de manera mas selectiva, es decir, NGF es el ligando selectivo para TrkA, BDNF es el ligando para TrkB y NT-3, 4/5 son los ligandos para TrkC. Asimismo, se ha descrito que cuando las protefnas p75NTR y Trk se coexpresan, estas forman complejos que alteran las senales de ambos receptores (Huang y Reichardt, 2003, Annu Rev Biochem. 72:609-42). De hecho, se ha insinuado que p75NTR facilita la selectividad de cada una de las neurotrofinas por su respectivo receptor Trk.

[0002] El p75NTR es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR-SF) y fue el primer miembro de esta superfamilia que se caracterizo completamente. La superfamilia (codificada por unos 30 genes en los humanos) se define mediante dominios de union a ligandos que consisten en una o mas repeticiones (normalmente cuatro) de un dominio rico en cistefna (CRD) de 40 aminoacidos que se identifico primero en p75NTR (Johnson et al., 1986 Cell 47:545-554; Radeke et al., 1987 Nature 325:593-597). En cambio, los dominios intracelulares de todos los miembros de la familia TNFR-SF no comparten ningun motivo secuencial. Por consiguiente, los mecanismos de senalizacion de las protefnas TNFR-SF varfan de manera significativa.

[0003] Una caracterfstica inusual de la estructura de p75NTR es la existencia de un dfmero de p75NTR con enlace disulfuro, formado por medio de residuos de cisteinil en los dominios transmembranales. Este enlace disulfuro resulta necesario para que el p75NTR realice una senalizacion eficaz dependiente de neurotrofinas, y desempena una funcion importante en la formacion de un dominio intracelular y extracelular (Vilar et al., 2009 Neuron 62:72-83). Las neurotrofinas existen fisiologicamente como dfmeros asociados de manera no covalente (Bothwell y Shooter, 1977 J Biol Chem. 252(23):8532-6) con una vida media de distribucion de aproximadamente 5 min (Tria et al., 1994 Exp Neurol. 127(2):178-83). La activacion de p75NTR dependiente de neurotrofinas conlleva la asociacion de un dfmero de neurotrofina con CRD 2-4 de los dos dominios extracelulares de un dfmero p75NTR (He y Garcia, 2004 Science 304:870-875). Estudios recientes respaldan un modelo en el que la union a neurotrofinas provoca que los dos dominios extracelulares de los dfmeros p75NTR se acerquen mas entre sf, lo cual deriva en que los dominios intracelulares se separen con un movimiento similar al de las pinzas para caracoles centrado en el enlace disulfuro, y posibilita una asociacion de los dominios intracelulares con las protefnas adaptadoras de senales, NRIF y TRAF6 (Vilar et al., 2009 J Cell Sci 122:3351-3357, Vilar et al., 2009 Neuron 62:72-83). Los enlaces disulfuro de dominio intratransmembranal, tal como estan presentes en p75NTR, no se han descrito anteriormente en otros miembros de la familia TNFR-SF ni en cualquier otra protefna de membrana.

[0004] p75NTR se somete a escision proteolftica secuencial mediante actividades a-secretasa y Y-secretasa y metaloproteinasas de matriz (MMP), liberando su dominio intracelular (ICD) en el citoplasma, de manera analoga a la via de senalizacion dependiente de la escision de la protefna precursora p-amiloide y Notch (Jung et al., 2003 J Biol Chem 278:42161-42169; Kanning et al., 2003 J Neuro- sci 23:5425-5436). La liberacion citoplasmica del ICD de p75NTR por esta via estimula la senalizacion de la NRIF asociada (Kenchappa et al., 2006 Neuron 50:219-232). La funcion del dominio extracelular de p75NTR, posteriormente a la escision proteolftica mediante las actividades a-secretasa y Y-secretasa y las MMP, no se comprende completamente.

[0005] Se ha documentado que NGF y otras neurotrofinas (BDNF, NT-3 y NT-4/5) cumplen una funcion significativa en la patologfa, por ejemplo, en el dolor causado por la osteoartritis, pancreatitis, artritis reumatoide, psoriasis, prurito y esclerosis multiple (Watanabe et al., 2008 J Neurosci Res. 86(16):3566-74; Raychaudhuri et al., 2011 Arthritis Rheum. 63(11):3243-52; Barthel et al., 2009 Arthritis Res Ther. 11(3):R82; Truzzi et al., 2011 Cell Death Differ. 18:948-58; McDonald et al., 2011 Curr Med Chem. 18:234-44; Yamaoka et al., 2007 J Dermatol Sci. 46(1 ):41-51). Se ha demostrado que los anticuerpos selectivos para cualquiera de las neurotrofinas, ya sea NGF o BDNF, NT-3 y NT-4/5, reducen el dolor de manera significativa. Asimismo, los anticuerpos dirigidos a los receptores de neurotrofinas p75NTR Trk A, Trk B o Trk C han demostrado ser eficaces tambien en modelos de dolor (Orita S et al., 2010 J Orthop Res. 28:1614-20; Svensson P et al., 2010 Pain. 148:473-80; Iwakura et al., 2010 J Hand Surg Am. 35:267-73; Cirilio et al., 2010 Cell Mol Neurobiol. 30:51-62; Pezet et al., 2010 Pain.

90:113-25; Hayashi et al., 2011 J Pain. 12:1059-68; Chu et al., 2011 Pain. 152:1832-7; Ueda et al., 2010 J Pharmacol Sci. 112:438-43; Ghilardi et al., 2010 Bone. 48:389-98; Fukui et al., 2010 J Orthop Res. 2010; 28:279 83). Fukui et al., (2010) demostraron, en un modelo de dolor (alodinia mecanica tras un aplastamiento del nervio ciatico), una eficacia considerable en criterios de valoracion relacionados con el dolor tras el tratamiento con un anticuerpo anti-p75NTR. A rafz de este estudio, se llego a la conclusion de que el tratamiento con un anticuerpo inhibidor p75NTR redujo la expresion de CGRP y p75NTR, lo que dio lugar a una reduccion significativa del dolor.

[0006] La presente invencion se refiere a una protema de fusion (NBP)-Fc de protema de union a neurotrofina p75NTR. Se describe la afinidad y la cinetica in vivo de dicha molecula, asf como su eficacia en el tratamiento del dolor en un modelo animal. La protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc resulta util para el tratamiento del dolor y otras patologfas relacionadas con el factor neurotrofico, tales como la psoriasis, el eccema, la artritis reumatoide, la cistitis, la endometriosis y la osteoartritis.

Breve descripción de la invencion

[0007] De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se da a conocer una protema de fusion (NBP)-Fc de protema de union a neurotrofina p75NTR, comprendiendo:

(a) una porcion p75NTR(NBP); y

(b) una porcion Fc de inmunoglobulina.

[0008] En esta, las porciones p75NTR(NBP) y Fc estan conectadas por medio de un conector, comprendiendo el conector un peptido de formula G^x, donde x es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, y donde el conector no comprende ni consta de la secuencia GGGGS.

[0009] En una forma de realización especialmente preferida de la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc la según invencion, la p75NTR(NBP) es una p75NTR(NBP) humana. En otra forma de realización especialmente preferida de la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc segú lan invencion, la Fc es una Fc humana.

[0010] En otra forma de realización preferida adicional, la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion comprende o consta de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 3. En otra forma de realizacion preferida, la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion comprende o consta de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 15.

[0011] En una forma de realización preferida, la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con la invencion se une a cualquiera de NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 con una afinidad de union (K^d) de entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 50 nM, medida mediante resonancia de plasmones superficiales a 20 °C.

[0012] En un segundo aspecto de la presente invencion, se da a conocer la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc descrita conforme a cualquier otro aspecto de la invencion para su uso en el tratamiento del dolor.

[0013] En un tercer aspecto de la presente invencion, se da a conocer una molecula de acido nucleico que codifica la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o el segundo aspecto de la invencion, comprendiendo opcionalmente, ademas, la codificacion de una secuencia senal.

[0014] En un cuarto aspecto de la presente invencion, se da a conocer un vector de expresion replicable para transfectar a una celula, opcionalmente una celula de mairnfero, comprendiendo el vector la molecula de acido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invencion.

[0015] Preferiblemente, el vector de expresion replicable es un vector viral.

[0016] En un quinto aspecto de la presente invencion, se da a conocer una celula huesped que alberga la molecula de acido nucleico del tercer aspecto de la invencion.

[0017] En un sexto aspecto de la presente invencion, la molecula de acido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion o el vector de acuerdo con el cuarto aspecto de la presente invencion se destina para su uso en el tratamiento del dolor.

[0018] El termino dolor incluye, aunque sin caracter limitativo: dolor agudo; dolor cronico; dolor inflamatorio; dolor nociceptivo; dolor neuropatico; hiperalgesia; alodinia; dolor central; dolor oncologico; dolor postoperatorio; dolor visceral; dolor musculoesqueletico; dolor cardfaco o vascular; dolor de cabeza, incluyendo migranas; dolor orofacial, incluyendo dolor dental; y dolor de espalda. El tratamiento del dolor incluye, aunque sin caracter limitativo, la prevencion, mejora, control, reduccion de la incidencia o retraso en el desarrollo o la evolucion del dolor.

[0019] En un septimo aspecto, se da a conocer la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto, o el acido nucleico o el vector de acuerdo con el tercer o cuarto aspecto, donde la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc o la molecula de acido nucleico o el vector se utilizan de forma separada, secuencial o simultanea en una combinacion combinado con un segundo compuesto farmacologicamente activo.

[0020] En un octavo aspecto, la presente invencion da a conocer una composicion farmaceutica, comprendiendo la protema de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier aspecto de la invencion o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con cualquier aspecto de la invencion, y un portador y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

[0021] Preferiblemente, la composicion farmaceutica se destina para su uso en uno o mas de entre prevencion, mejora, control, reduccion de la incidencia o retraso del desarrollo o la evolucion del dolor.

[0022] En un aspecto adicional de la presente invencion, se da a conocer un kit que comprende:

(a) la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invencion, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invencion, o la composicion farmaceutica el o scetagvúon aspecto; y

(b) instrucciones para la administracion de una cantidad efectiva de dicha protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc, molecula de acido nucleico, vector o composicion farmaceutica a un individuo para uno o mas de entre la prevencion o el tratamiento del dolor, o bien para mejorar, controlar, reducir la incidencia o retrasar el desarrollo o la evolucion del dolor.

[0023] En otro aspecto adicional de la presente invencion, se da a conocer un metodo para tratar y/o para prevenir el dolor en un individuo que comprende la administracion a dicho individio de una cantidad efectiva desde el punto de vista terapeutico de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier aspecto de la invencion, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con cualquier aspecto de la invencion, comprendiendo ademas, opcionalmente, un portador farmaceuticamente aceptable, o la composicion farmaceutica conforme al octavo aspecto de la invencion.

Descripcion de las figuras

[0024]

Figura 1. Secuencia de aminoacidos de una protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con la presente invencion (SEQ ID N.° 1). Los sitios de escision de la alfa-secretasa y gamma-secretasa se muestran en negrita. La porcion Fc de IgG1 se muestra en cursiva.

Figura 2. Producto de traduccion (SEQ ID N.° 2), desde el codon de inicio hasta el de terminacion, de la secuencia de acido nucleico expuesta en la figura 4 (SEQ ID N.° 4).

Figura 3. Secuencia de aminoacidos de una protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc preferida de acuerdo con la presente invencion (SEQ ID N.° 3). La porcion Fc de IgG1 se muestra en cursiva. La secuencia conectora entre las porciones p75NTR(NBP) y Fc aparece subrayada.

Figura 4. Secuencia de acido nucleico del producto genico completo desde el sitio de clonacion 5' hasta el sitio de clonacion 3' (SEQ ID N.° 4).

Figura 5. Variantes de la protefna de fusion p75-NTR(NBP)-Fc: 1: p75_NTR - La secuencia p75-NTR (SEQ ID N.° 6); 2: La protefna de fusion p75-NTR-Fc disponible en el mercado (SEQ ID N.° 7); 3: p75_Fc - La protefna de fusion p75-NTR-Fc disponible en el mercado con la secuencia Fc modificada en funcion de la de la region constante de IgGlza de Lonza (SEQ ID N.° 8); 4: p75_Fc_C222S - La protefna de fusion p75-NTR-Fc disponible en el mercado con la secuencia Fc modificada en funcion de la de la region constante de IgGlza de Lonza y una mutacion adicional de cistefna a serina en la posicion 222 (SEQ ID N.° 9); 5: p75_Fc_G4x1 -Variante 1, una protefna de fusion p75-NTR-Fc propuesta con un conector de glicina de 4 residuos (SEQ ID N.° 10); 6: p75_Fc_G4Sx1 - variante 2, una protefna de fusion p75-NTR-Fc propuesta con un unico conector de tetraglicina y serina (SEQ ID N.° 11); 7: p75_Fc_G4Sx2 - variante 3, una protefna de fusion p75-NTR-Fc propuesta con dos conectores de tetraglicina y serina (SEQ ID N.° 12); 8: Region constante de IgGlza de Lonza (SEQ ID N.° 13).

En este alineamiento, se utiliza un esquema de formato para destacar las regiones de similitud entre los receptores putativos, la protefna de fusion Fc y la region constante Fc: el estilo encuadrado se utiliza para indicar regiones de secuencia identica entre las protefnas variantes y la p75-NTR; el subrayado simple se emplea para indicar regiones de secuencia identica entre todas las protefnas de fusion Fc y la Fc de IgGlza de Lonza; la cursiva se utiliza para indicar las regiones de enlace en la union de p75-NTR y la region constante Fc; el subrayado doble y la negrita se emplean para indicar la posicion de secuencia no identica mas alla de la region de enlace, en la posicion equivalente a 222 en la protefna de fusion p75-NTR Fc parental.

Figura 6: La p75NTR-Fc reduce significativamente el dolor en un modelo de roedor con OA inducida por MIA. *P <0,1 y **P <0,05

Figura 7: Secuencia de aminoacidos de una protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc preferida de acuerdo con la presente invencion (SEQ ID N.° 15). La porcion Fc de IgG1 se muestra en cursiva. La secuencia conectora entre las porciones p75NTR(NBP) y Fc se muestra subrayada.

Descripcion detallada de la invencion

[0025] De acuerdo con un primer aspecto de la presente invencion, se da a conocer una protefna de fusion (NBP)-Fc de protefna de union a neurotrofina p75NTR, comprendiendo:

(a) una porcion p75NTR(NBP); y

(b) una porcion Fc de inmunoglobulina.

[0026] En esta, las porciones p75NTR(NBP) y Fc estan conectadas por medio de un conector, comprendiendo el conector un peptido de formula G^x, donde x es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, y donde el conector no comprende ni consta de la secuencia GGGGS.

[0027] En una forma de realización especialmente preferida de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc la según invencion, la p75NTR(NBP) es una p75NTR(NBP) humana. En otra forma de realizacion especialmente preferida de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc segú lan invencion, la Fc es una Fc humana.

[0028] En otra forma de realización preferida adicional, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc segú lan invencion comprende o consta de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 3. En otra forma de realización preferida, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion comprende o consta de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 15.

[0029] Preferiblemente, la protefna de union a neurotrofina p75NTR, p75NTR(NBP), esta pegilada; mas preferiblemente, esta glicosilada.

[0030] La protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la presente invencion se une preferiblemente a cualquiera o cualesquiera de NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 con una afinidad de union (K^d) de entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 50 nM. En algunas formas de realización preferidas, la afinidad de union (K^d) se encuentra entre aproximadamente 0,01 nM y cualquier cantidad de aproximadamente 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 1,5 nM, 2 nM, 2,5 nM, 3 nM, 3,5 nM, 4 nM, 4,5 nM, 5 nM, 5,5 nM, 6 nM, 6,5 nM, 7 nM, 7,5 nM, 8 nM, 8,5 nM, 9 nM, 9,5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM, 40 nM, 45 nM o 50 nM medida en un ensayo de union in vitro para NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 tal como se describe en el presente documento, preferiblemente medida mediante resonancia de plasmones superficiales a 20 °C. En algunas formas de realizacion preferidas adicionales, la afinidad de union (K^d) es equivalente o menor que cualquier cantidad de entre aproximadamente 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 950 pM o 1 nM medida en un ensayo de union in vitro para la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc con las neurotrofinas tal como se describe en el presente documento, preferiblemente medida mediante resonancia de plasmones superficiales a 20 °C. En una forma de realización adicional mas preferida, la afinidad de union (K^d) es de aproximadamente 0,3 nM o de aproximadamente 1 nM, medida en un ensayo de union in vitro para la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc con las neurotrofinas tal como se describe en el presente documento, preferiblemente medida mediante resonancia de plasmones superficiales a 20 °C.

[0031] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion se destina para su uso en el tratamiento del dolor. Sin querer limitarse a ninguna teorfa en particular, los inventores creen que la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc logra ser eficaz en el tratamiento del dolor incidiendo en la actividad funcional de las neurotrofinas anteriormente mencionadas (definida como la modulacion o la regulacion al alza o a la baja de la actividad funcional de las neurotrofinas), NGF, BDNF, NT3 o NT4/5; por ejemplo, la actividad funcional de las neurotrofinas mencionadas anteriormente resultantes de su interaccion con sus respectivos receptores.

[0032] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc incide en la actividad funcional de BDNF evaluada mediante el ensayo funcional de cualquiera de entre el crecimiento y la diferenciacion de las neuronas y las sinapsis, la supervivencia y la diferenciacion en cultivo celular de neuronas, la senalizacion de Trk, la estimulacion del crecimiento axonal in vitro o in vivo.

[0033] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc incide en la actividad funcional de NGF evaluada midiendo la union de NGF a TrkA y la activacion de TrkA, como se muestra en los ensayos clasicos de supervivencia neuronal (tal como se expone en Cowan et al., Annu. Rev. Neurosci. 2001;24:551-600).

[0034] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc incide en la actividad funcional de NT3 evaluada midiendo la actividad de union de NT3 al receptor Trk endogeno y la activacion del receptor Trk endogeno, como se demuestra en la fosforilacion del receptor Trk, en ensayos indicadores de fosforilacion de protefna quinasa activada por mitogenos o ensayos de supervivencia celular y de extension neurftica.

[0035] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc incide en la actividad funcional de NT4/5 evaluada midiendo la fosforilacion de NT4/5 in vitro o in vivo y mediante ensayos de activacion, por ejemplo, en ensayos de fosforilacion de protefna basica de la mielina (PBM) o, de manera alternativa, in vivo en un ensayo de angiogenesis mediante Matrigel del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en ingles)/angiogenesis inducida por el factor de crecimiento fibroblastico basico.

[0036] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc se une a los residuos de contacto de una o mas de las neurotrofinas NGF, NT3, BDNF y ⁿT4/5, tal como se muestra en He y Garcia (2001) Science, 301, paginas 870 - 805.

[0037] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc es soluble, preferiblemente soluble en solucion acuosa, preferiblemente soluble en un fluido biologico, como suero, plasma o sangre.

[0038] Tal como se utiliza en el presente documento, se entiende por «Fc», «Fc de inmunoglobulina» o «Fc de Ig» a la porcion carboxiterminal de una region constante de cadena de inmunoglobulina, preferiblemente una region constante de la cadena pesada de inmunoglobulina o una parte de la misma. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende 1) un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3, opcionalmente con una region bisagra de inmunoglobulina, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, opcionalmente con una region bisagra de inmunoglobulina, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, opcionalmente con una region bisagra de inmunoglobulina, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, opcionalmente con una region bisagra de inmunoglobulina, o bien 5) una combinacion de dos o mas dominios seleccionados, aunque sin caracter limitativo, de entre CH1, CH2 y CH3, opcionalmente combinados con una region bisagra de inmunoglobulina. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende al menos una region bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3, y, opcionalmente, un dominio CH1. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de una Fc o una porcion de una Fc de una inmunoglobulina de isotipo que incluye, aunque sin caracter limitativo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, mas preferiblemente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, sIgA, mas preferiblemente IgG1, IgG2 o IgG4, mas preferiblemente IgG1. Opcionalmente, la Fc de inmunoglobulina tambien comprende mutaciones de aminoacidos, deleciones, sustituciones o modificaciones qufmicas que sirven para minimizar la fijacion del complemento o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o que mejoran la afinidad de union al receptor Fc.

[0039] Mas preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de cualquiera de: (a) un dominio CH2 o porcion del mismo y un dominio CH3 o porcion del mismo, (b) un dominio CH2 o porcion del mismo, o (c) un dominio CH3 o porcion del mismo, donde la Fc de inmunoglobulina o porcion de la misma es del isotipo que incluye, aunque sin caracter limitativo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, mas preferiblemente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, sIgA, mas preferiblemente IgG, IgG2 o IgG4, mas preferiblemente IgG1.

[0040] Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de la region carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y puede comprender los dominios CH2 y/o CH3, o partes de los mismos, de los isotipos de anticuerpos IgG, IgA o IgD, o bien los dominios CH2 y/o CH3 y/o CH4, o partes de los mismos de IgM o IgE. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de un fragmento de la Fc, que comprende principalmente CH3 y una pequena porcion de CH2, tal como puede derivar de la digestion de pepsina de la inmunoglobulina. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de la region Fc completa, que comprende CH2 y CH3, conectada adicionalmente a la region bisagra, que es un segmento corto de cadena pesada que conecta las regiones CH1 y CH2 en la inmunoglobulina intacta, y que se puede producir en la digestion de papafna de la inmunoglobulina. Preferiblemente, la region bisagra de inmunoglobulina comprende o consta de una region bisagra o parte de una region bisagra derivada de una IgG, preferiblemente IgG humana, mas preferiblemente seleccionada, aunque sin caracter limitativo, de entre IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, mas preferiblemente IgG1, o bien, de manera alternativa, es una especie o variante alelica de las formas de realización de region bisagra anteriores. La region bisagra o una parte de una region bisagra de inmunoglobulina puede situarse en el extremo C-terminal o N-terminal de la region Fc, preferiblemente en el extremo N-terminal.

[0041] De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invencion, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta, preferiblemente, de una Fc o una porcion de una Fc de una inmunoglobulina, que comprende una o mas mutaciones de aminoacidos de la secuencia natural en la region CH2 que reducen la funcion efectora de Fc. Preferiblemente, estas mutaciones son A330, P331 a S330, S331 (numeracion de aminoacidos en referencia a la secuencia de IgG1 natural, donde la region CH2 esta en la region constante de IgG1 de la cadena pesada humana: [Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]. Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina esta glicosilada y altamente cargada de pH fisiologico, de modo que ayuda a solubilizar la p75NTR(NBP). La region Fc facilita tambien la deteccion de p75NTR(NBP) mediante ELISA anti-Fc, por ejemplo, con fines de diagnostico. La p75NTR(NBP) de la invencion se sintetiza preferiblemente en una celula que glicosila la Fc de Ig, preferiblemente en sitios de glicosilacion normales.

[0042] Preferiblemente, la Fc de inmunoglobulina comprende o consta de una region Fc de inmunoglobulina humana.

[0043] De acuerdo con la presente invencion, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc muestra, preferiblemente, propiedades biologicas ventajosas de solubilidad mejorada de p75NTR(NBP) y/o de estabilidad de p75NTR(NBP) y/o p75NTR(NBP) con una vida media serica mejorada. Se desea una solubilidad mejorada con el fin de maximizar la biodisponibilidad de la p75NTR(NBP) para su administracion y con el fin de que se pueda determinar y llevar a cabo una dosificacion precisa de la p75NTR(NBP). La solubilidad mejorada resulta ventajosa para superar el problema de los agregados, que no son deseables, ya que provocan dolor en la administracion in vivo y derivan en una potencial inflamacion. La mejora de la vida media serica presenta la ventaja de facilitar niveles reducidos o una frecuencia reducida de la dosis requerida durante su utilizacion para el tratamiento con el fin de lograr el efecto terapeutico equivalente o mantenido de la p75NTR(NBP) administrada. Una vida media prolongada y una mayor estabilidad en sangre o suero conlleva la ventaja de permitir una pauta posologica con dosis menos frecuentes y/o niveles de dosis menores, reduciendo de este modo la posible toxicidad o los posibles efectos secundarios in vivo. En este caso, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc es mas potente en cuanto a su efecto terapeutico y/o mas estable en la circulacion. Las dosis resultantes menores o menos frecuentes resultan ventajosas para minimizar cualquier posible efecto toxico o efecto secundario potencialmente asociado a la administracion de p75NTR(NBP). El peso molecular de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc tambien aumenta a lo largo de la p75NTR(NBP) simple, y este hecho conlleva la ventaja de que la molecula quedara bien retenida en la circulacion sangufnea cuando se administre de forma intravenosa, lo cual reduce el riesgo de penetracion en sitios no deseados, por ejemplo, el sistema nervioso central, lo que provoca que la molecula sea adecuada para la retencion o concentracion en los tejidos diana. Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc muestra una solubilidad mejorada de p75NTR(NBP) y/o una mejora de la estabilidad de p75NTR(NBP) y/o una mejora en la vida media serica en comparacion con la p75NTR(NBP) simple. Preferiblemente, la solubilidad mejorada se refiere a la solubilidad en una solucion acuosa, como agua, preferiblemente con excipientes tales como tampones y/o sales, preferiblemente con un pH fisiologico, preferiblemente comprendido entre pH 5 y pH 8, preferiblemente aproximadamente pH 7, o a la solubilidad en un fluido biologico, tal como suero o sangre. Preferiblemente, la estabilidad mejorada se refiere a la estabilidad de actividad o integridad estructural de la protefna p75NTR(NBP) a causa de los efectos de desnaturalizacion, oxidacion, fragmentacion o agregacion durante un perfodo de tiempo, durante un perfodo de almacenamiento o tras someterse a congelacion y descongelacion. La estabilidad estructural se puede calcular empleando medidas convencionales de desnaturalizacion, oxidacion, agregacion o agregacion, y la estabilidad de actividad se puede medir mediante los ensayos de union o funcionales expuestos en el presente documento. Se conocen metodos para medir la vida media serica de la protefna.

[0044] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc se puede expresar a niveles elevados a partir de varias celulas huesped de mamffero para proporcionar una unica especie, y se puede purificar de manera eficaz mediante cromatograffa de afinidad, por ejemplo, uniendose a la protefna A de Staphylococcus aureus.

Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc se puede dimerizar y, preferiblemente, el dfmero presenta un aumento de la afinidad a las neurotrofinas NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 en comparacion con la p75NTR(NBP) simple. Una union mas firme conlleva la ventaja de una mayor potencia y una mayor eficacia terapeutica calculada mediante los efectos de la p75NTR(NBP), por ejemplo, determinada mediante los ensayos funcionales de neurotrofina expuestos en el presente documento. Una potencia mas elevada conlleva la ventaja de que la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc se pueda utilizar en cantidades de dosis menores para lograr la misma eficacia terapeutica, de modo que se reduzca la posible toxicidad o los posibles efectos secundarios in vivo.

[0045] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion posee una vida media in vivo superior o equivalente a aproximadamente cualquiera de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 o 210 horas /-1 hora; ademas, preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion presenta una vida media in vivo de aproximadamente 24 horas o mas.

[0046] Mas preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion posee una vida media in vitro superior o equivalente a aproximadamente cualquiera de entre 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 o 210 dfas /-1 dfa, y ademas, preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion posee una vida media in vitro de aproximadamente 6 dfas o mas. Preferiblemente, la estabilidad se mide aproximadamente en el pH fisiologico, en una solucion acuosa tamponada, preferiblemente a 20 °C o 37 °C.

[0047] De acuerdo con las formas de realización preferidas anteriormente mencionadas, preferiblemente, la vida media in vivo es la vida media en ratas o la vida media en humanos, mas preferiblemente en humanos.

Preferiblemente, la vida media se determina a partir de mediciones sericas de los niveles de protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion tras la administracion in vivo, por ejemplo, mediante inyeccion intravenosa o subcutanea.

[0048] Las porciones p75NTR(NBP) y Fc de inmunoglobulina de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc estan conectadas por medio de un conector. Preferiblemente, el conector comprende o consta de un aminoacido o una pluralidad de aminoacidos o comprende o consta de una secuencia polipeptfdica de aminoacidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 aminoacidos, preferiblemente de cualquier cantidad entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoacidos, mas preferiblemente de cualquier cantidad entre aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 aminoacidos, mas preferiblemente 13 aminoacidos.

[0049] Preferiblemente, el conector comprende o consta de una secuencia polipeptfdica de aminoacidos que carece de cualquier estructura secundaria estable, tal como una helice alfa, cadena beta, helice 310 y helice pi, helice de poliprolina, lamina alfa. Preferiblemente, la region de enlace comprende o consta de una secuencia polipeptfdica de aminoacidos que define un polipeptido flexible, dinamico o no estructurado, tal como, por ejemplo, un bucle flexible, enrollamiento al azar o giro flexible. Dichos polipeptidos no estructurados se suelen encontrar conectando regiones de estructura secundaria en moleculas proteicas grandes.

[0050] Preferiblemente, el conector es una secuencia polipeptfdica de aminoacidos que comprende una cantidad mayor o equivalente a aproximadamente un 50 % de glicina y/o alanina y/o serina en p75NTR(NBP), mas preferiblemente mayor o equivalente a aproximadamente un 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de glicina y/o alanina y/o serina en p75NTR(NBP). Preferiblemente, la region de enlace comprende o consta de una secuencia polipeptfdica de aminoacidos que comprende tanto glicina como serina, preferiblemente con una proporcion mayor de glicina que de serina; preferiblemente, la region de enlace comprende o consta de conectores flexibles.

[0051] Sin pretender limitarse a ninguna teorfa en particular, los inventores creen que los conectores flexibles solucionan o previenen el impedimento esterico que podrfa interferir en la capacidad de union a neurotrofinas anteriormente mencionada o en la actividad biologica de la fusion p75NTR(NBP)-Fc en comparacion con la p75NTR(NBP) simple. Por lo tanto, la region de enlace posibilita, preferiblemente, la flexibilidad entre la porcion p75NTR(NBP) y la porcion Fc de inmunoglobulina y permite la conservacion o la mejora de la actividad biologica mencionada anteriormente de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc en comparacion con la p75NTR(NBP) simple libre o nativa determinada mediante la union a neurotrofinas empleando ensayos de union tales como los descritos en el presente documento.

[0052] Mas preferiblemente, el conector es inmunologicamente inerte, de tal modo que no provoca lisis mediada por complemento, no estimula la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (CCDA) y no activa la microglia ni las celulas T. Preferiblemente, la region de enlace se reduce en una o mas de estas actividades.

[0053] Mas preferiblemente, el conector comprende o consta de un polipeptido que se sabe o se predice, a partir del analisis estructural o la prediccion estructural, que es un polipeptido flexible, dinamico o no estructurado, o que carece de una estructura secundaria estable.

[0054] El conector comprende un peptido de formula G^x, donde x es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, donde el conector no comprende ni consta de la secuencia GGGGS.

[0055] La protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion tambien puede comprender un sitio de escision proteolftica, opcionalmente interpuesto entre la porcion p75NTR(NBP) y la porcion Fc de la inmunoglobulina. El sitio de escision proteolftica puede estar situado en el conector o en la union del conector con la porcion p75NTR(NBP) y/o con la porcion Fc de la inmunoglobulina. La p75NTR(NBP) puede escindirse, opcionalmente, de la porcion Fc de la inmunoglobulina antes de la formulacion y/o de la administracion con fines terapeuticos.

[0056] De manera alternativa, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de la invencion se puede modificar para eliminar los sitios de escision proteolftica. En una forma de realizacion preferida, se pueden eliminar los sitios de escision de alfa-secretasa y gamma-secretasa. En una forma de realizacion especialmente preferida, se elimina la secuencia GSSQPVVTRGTTDNDIEGRMD (SEQ ID N.° 5).

[0057] En formas de realización adicionales preferidas, se pueden cambiar ciertos aminoacidos en la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc con el fin de mejorar propiedades, tales como el rendimiento o la solubilidad. Una forma de realización especialmente preferida es el cambio del residuo de cistefna en la posicion 222 a un residuo de serina, que se descubrio que reducfa la agregacion de la protefna, ya que se expresa a partir de celulas CHO durante la elaboracion de la protefna.

[0058] Preferiblemente, el conector y/o la porcion Fc de la inmunoglobulina no perjudica(n) ni afecta(n) de manera significativa a la porcion p75NTR(NBP) en cuanto a:

(a) su efecto en la actividad funcional de las neurotrofinas (definido como modulacion o regulacion al alza o a la baja de la actividad funcional de las neurotrofinas) NGF, BDNF, NT3 o NT4/5,

(b) su afinidad de union a cualquiera de entre NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 con una afinidad de union de entre aproximadamente 0,1 nM y aproximadamente 50 nM,

(c) su capacidad para unirse a cada una de las neurotrofinas NGF, NT3, BDNF y NT4/5, preferiblemente NGF, NT3, BDNF y NT4/5 de humano.

[0059] Segun otro aspecto de la invencion, se da a conocer una molecula de acido nucleico que codifica la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto. Preferiblemente, la molecula de acido nucleico se utiliza en el tratamiento del dolor.

[0060] De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invencion, la molecula de acido nucleico puede comprender, ademas, una region que codifica una secuencia serial, preferiblemente una secuencia serial de p75NTR, por ejemplo, una secuencia de ADN o de ARN.

[0061] De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se da a conocer un vector de expresion replicable para la transfeccion de una celula, comprendiendo el vector la molecula de acido nucleico del tercer aspecto; preferiblemente, el vector es un vector viral. Preferiblemente, el vector se utiliza en el tratamiento del dolor.

[0062] Ademas, de acuerdo con los aspectos anteriores de la invencion, se da a conocer un metodo de expresion de la molecula de acido nucleico o del vector de la invencion para producir o secretar la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc. Preferiblemente, el metodo comprende la introduccion de la molecula de acido nucleico o del vector en una celula y la expresion del acido nucleico que se encuentra en esta para producir o secretar la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc. Preferiblemente, la molecula de acido nucleico o el vector se introduce en la celula in vitro, y de manera alternativa, in vivo. Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc se expresa in vitro y ademas, opcionalmente, se afsla y se purifica; de manera alternativa, preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc expresada se expresa in vivo, y preferiblemente, la expresion in vivo constituye terapia genica. Preferiblemente, el vector es un vector de expresion replicable, opcionalmente, para transfectar una celula de mamffero y, preferiblemente, el vector es un vector viral.

[0063] De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se da a conocer una celula huesped que alberga la molecula de acido nucleico o el vector del tercer o del cuarto aspecto; preferiblemente, la celula es una celula de mamffero.

[0064] De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se da a conocer la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc para su uso en el tratamiento del dolor, o bien un acido nucleico o vector para su uso en el tratamiento del dolor. El dolor puede incluir, aunque sin caracter limitativo:

(a) dolor agudo y/o dolor espontaneo,

(b) dolor cronico y/o dolor continuo,

(c) dolor inflamatorio, incluyendo cualquiera de entre dolor artrftico, dolor provocado por osteoartritis o por artritis reumatoide, como resultado de enfermedades inflamatorias intestinales, psoriasis y eccema,

(d) dolor nociceptivo,

(e) dolor neuropatico, incluyendo neuropatfa diabetica dolorosa o dolor asociado a la neuralgia postherpetica, (f) hiperalgesia,

(g) alodinia,

(h) dolor central, dolor central tras un ictus, dolor provocado por esclerosis multiple, dolor provocado por lesion de la medula espinal, o dolor provocado por la enfermedad de Parkinson o la epilepsia,

(i) dolor oncologico

(j) dolor postoperatorio,

(k) dolor visceral, incluido el dolor visceral digestivo y el dolor visceral no digestivo, dolor causado por trastornos gastrointestinales (GI), dolor provocado por trastornos funcionales intestinales (TFI), dolor provocado por enfermedades inflamatorias intestinales (EII), dolor provocado por la dismenorrea, dolor pelvico, cistitis, cistitis intersticial o pancreatitis,

(l) dolor musculoesqueletico, mialgia, fibromialgia, espondilitis, artropatfas seronegativas (no reumatoides), reumatismo no articular, distrofinopatfa, glucogenolisis, polimiositis, piomiositis,

(m) dolor cardfaco o vascular, dolor provocado por angina, infarto de miocardio, estenosis mitral, pericarditis, fenomeno de Raynaud, escleredema, escleredema o isquemia del musculo esqueletico,

(n) dolor de cabeza, incluyendo la migrana, migrana con aura, migrana sin aura, cefalalea histamfnica, cefalea tensional.

(o) dolor orofacial, incluyendo el dolor dental, dolor miofascial temporomandibular o tinnitus, o bien

(p) dolor de espalda, bursitis, dolor menstrual, migrana, dolor referido, neuralgia del trigemino, hipersensibilizacion, dolor provocado por trauma espinal y/o degeneracion o apoplejfa.

[0065] El tratamiento del dolor incluye, aunque sin caracter limitativo, la prevencion, mejora, control, reduccion de la incidencia o retraso en el desarrollo o en la evolucion del dolor.

[0066] De acuerdo con otro aspecto de la invencion, se da a conocer la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc segun el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de estos, o la molecula de acido nucleico o el vec setogrún el tercer y cuarto aspectos, donde la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc o la molecula de acido nucleico o el vector se utilizan de forma separada, secuencial o simultanea en una combinacion combinados con un segundo compuesto farmacologicamente activo. Preferiblemente, el segundo compuesto farmacologicamente activo de la combinacion puede incluir, aunque sin caracter limitativo;

un analgesico opioide, por ejemplo, morfina, herofna, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanilo, cocafna, codefna, dihidrocodefna, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, naloxona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina o pentazocina;

un medicamento antiinflamatorio no esteroideo (AINE), por ejemplo, aspirina, diclofenaco, diflusinal, etodolaco, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolaco, acido meclofenamico, acido mefenamico, meloxicam, nabumetona, naproxeno, nimesulida, nitroflurbiprofeno, olsalazina, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulfasalazina, sulindaco, tolmetina o zomepirac;

un sedante barbiturico, por ejemplo, amobarbital, aprobarbital, butabarbital, butalbital, mefobarbital, metarbital, metohexital, pentobarbital, fenobarbital, secobarbital, talbutal, tiamilal o tiopental;

una benzodiazepina que presente una accion sedante, por ejemplo, clordiazepóxido, clorazepato, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam o triazolam;

un antagonista Hi que presente una accion sedante, por ejemplo, difenhidramina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina o clorciclizina;

un sedante, tal como glutetimida, meprobamato, metacualona o dicloralfenazona;

un relajante del musculo esqueletico, por ejemplo, baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol u orfenadrina;

un antagonista del receptor NMDA, por ejemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano) o su metabolito dextrorfano ((+)-3-hidroxi-N-metilmorfinano), ketamina, memantina, pirroloquinolina quinona, acido cis-4-(fosfonometil)-2-piperidina carboxflico, budipina, EN-3231 (MorphiDex®, una formulacion de combinacion de morfina y dextrometorfano), topiramato, neramexano o perzinfotel, incluyendo un antagonista de NR2B, por ejemplo, ifenprodil, traxoprodil o (-)-(R)-6-{2-[4-(3-fluorofenil)-4-hidroxi-1-piperindinil]-1-hidroxietil-3,4-dihidro-2(lH)-quinolinona;

un alfa adrenergico; por ejemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina, guanfacina, dexmetatomidina, modafinilo o 4-amino-6,7-dimetoxi-2-(5-metano-sulfonamido-1,2,3,4-tetrahidroisoquinol-2-il)-5-(2-piridil) quinazolina;

un antidepresivo tricfclico, por ejemplo, desipramina, imipramina, amitriptilina o nortriptilina;

un anticonvulsivo, por ejemplo, carbamazepina, lamotrigina, topiramato o valproato;

un antagonista de taquicinina (NK), en concreto, un antagonista de NK-3, NK-2 o NK-1, por ejemplo, (aR,9R)-7-[3,5-bis(trifluorometil)bencil]-8,9,10,11-tetrahidro-9-metil-5-(4-metilfenil)-7H-[1,4]diazocino[2,1-g][1,7]-naftiridina-6-13-diona (TAK-637), 5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etoxi-3-(4-fluorofenil)-4-morfolinil]-metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (m K-869), aprepitant, lanepitant, dapitant o 3-[[2-metoxi-5-(trifluorometoxi)fenil]-metilamino]-2-fenilpiperidina (2S,3S);

un antagonista muscarfnico, por ejemplo, oxibutinina, tolterodina, propiverina, cloruro de trospio, darifenacina, solifenacina, temiverina e ipratropio;

un inhibidor selectivo de COX-2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, parecoxib, valdecoxib, deracoxib, etoricoxib o lumiracoxib;

un analgesico de alquitran de hulla, en concreto paracetamol;

un neuroleptico, tal como droperidol, clorpromazina, haloperidol, perfenazina, tioridazina, mesoridazina, trifluoperazina, flufenazina, clozapina, olanzapina, risperidona, ziprasidona, quetiapina, sertindol, aripiprazol, sonepiprazol, blonanserina, iloperidona, perospirona, racloprida, zotepina, bifeprunox, asenapina, lurasidona, amisulprida, balaperidona, aplindore, eplivanserina, osanetant, rimonabant, meclinertant, Miraxion® o sarizotan;

un agonista del receptor vaniloide (p. ej., resiniferatoxina) o un antagonista del receptor vaniloide (p. ej., capsacepina);

un beta adrenergico, tal como propranolol;

un anestesico local, tal como mexiletina;

un corticosteroide, tal como dexametasona;

un agonista o antagonista del receptor 5-HT, especialmente un agonista de 5-HT^ib/1dtal como eletriptan, sumatriptan, zolmitriptan o rizatriptan;

• un antagonista del receptor 5-HT2A, tal como R(+)-alfa-(2,3-dimetoxi-fenil)-1-[2-(4-fluorofeniletil)]-4-piperidinametanol (MDL-100907);

• un analgesico colinergico (nicotfnico), tal como isproniclina (TC-1734), (E)-N-metil-4-(3-piridinil)-3-buten-1-amina (RJR-2403), (R)-5-(2-azetidinilmetoxi)-2-cloropiridina (ABT-594) o nicotina;

• Tramadol®;

• un inhibidor de PDEV, tal como 5-[2-etoxi-5-(4-metil-1 -piperazinil-sulfonil)fenil]-1 -metil-3-n-propil-1,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona (sildenafilo), (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-hexahidro-2-metil-6-(3,4-metilendioxifenil)-piracino[2',1':6,1]-pirido[3,4-b]indol-1,4-diona (IC-351 o tadalafilo), 2-[2-etoxi-5-(4-etilpiperazina-1-il-1-sulfonil)-fenil]-5-metil-7-propil-3H-imidazo[5,1-f][1,2,4]triazin-4-ona (vardenafilo), 5-(5-acetil-2-butoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-etil-3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 5-(5-acetil-2-propoxi-3-piridinil)-3-etil-2-(1-isopropil-3-azetidinil)-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 5-[2-etoxi-5-(4-etilpiperazin-1-ilsulfonil)piridin-3-il]-3-etil-2-[2-metoxietil]-2,6-dihidro-7H-pirazolo[4,3-d]pirimidin-7-ona, 4-[(3-cloro-4-metoxibencil)amino]-2-[(2S)-2-(hidroximetil)pirrolidin-1-il]-N-(pirimidin-2-ilmetil)pirimidina-5-carboxamida, 3-(1-metil-7-oxo-3-propil-6,7-dihidro-1 H-pirazol[4,3-d]pirimidin-5-il)-N-[2-( 1 -metilpirrolidin-2-il)etil]-4-propoxibencenosulfonamida;

• un cannabinoide;

• antagonista del receptor metabotropico de glutamato subtipo 1 (mGluR1);

• un inhibidor de la recaptacion de serotonina, tal como sertralina, metabolito de sertralina desmetilsertralina, fluoxetina, norfluoxetina (metabolito de desmetilfluoxetina), fluvoxamina, paroxetina, citalopram, metabolito de citalopram desmetilcitalopram, escitalopram, d,1-fenfluramina, femoxetina, ifoxetina, cianodotiepina, litoxetina, dapoxetina, nefazodona, cericlamina y trazodona;

• un inhibidor de la recaptacion de noradrenalina (norepinefrina), tal como maprotilina, lofepramina, mirtazapina, oxaprotilina, fezolamina, tomoxetina, mianserina, buproprion, metabolito de bupropion hidroxibupropion, nomifensina y viloxazina (Vivalan®), especialmente un inhibidor selectivo de la recaptacion de noradrenalina, tal como reboxetina, en concreto (S,S)-reboxetina;

• un inhibidor dual de la recaptacion de serotonina-noradrenalina, tal como venlafaxina, metabolito de venlafaxina O-desmetilvenlafaxina, clomipramina, metabolito de clomipramina desmetilclomipramina, duloxetina, milnacipran e imipramina;

• un inhibidor de la óxido nftrico sintasa inducible (iONS) tal como S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-L-homocistefna, S-[2-[(1-iminoetil)-amino]etil]-4,4-dioxo-L-cistefna, S-[2-[(1-iminoetil)amino]etil]-2-metil-L-cistefna, acido (2S,5Z)-2-amino-2-metil-7-[(1-iminoetil)amino]-5-heptenoico, 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)-butil]tio]-5-cloro-3-piridincarbonitrilo; 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-4-clorobenzonitrilo, (2S,4R)-2-amino-4-[[2-cloro-5-(trifluorometil)fenil]tio]-5-tiazolbutanol, 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil) butil]tio]-6-(trifluorometil)-3 piridincarbonitrilo, 2-[[(1R,3S)-3-amino-4-hidroxi-1-(5-tiazolil)butil]tio]-5-clorobenzonitrilo, N-[4-[2-(3-clorobencilamino)etil]fenil]tiofeno-2-carboxamidina, o guanidinoetildisulfuro;

• un inhibidor de la acetilcolinesterasa, tal como donepecilo;

• un antagonista de la prostaglandina E2 subtipo 4 (EP4), tal como acido W-[({2-[4-(2-etil-4,6-dimetil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-1-il)fenil] etil} amino)-carbonil]-4-metilbencenosulfonamida o 4-[(1S)-1-({[5-cloro-2-(3-fluorofenoxi)piridin-3-il]carbonil}amino)etil]benzoico;

• un antagonista de leucotrieno B4; tal como acido 1-(3-bifenil-4-ilmetil-4-hidroxi-croman-7-il)-ciclopentanocarboxflico (CP-105696), acido 5-[2-(2-Carboxietil)-3-[6-(4-metoxifenil)-5E-hexenil]oxifenoxi]-valerico (ONO-4057) o DPC-11870,

• un inhibidor de la 5-lipoxigenasa, tal como zileuton, 6-[(3-fluoro-5-[4-metoxi-3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il])fenoxi-metil]-1-metil-2-quinolona (ZD-2138), o 2,3,5-trimetil-6-(3-piridilmetil),1,4-benzoquinona (CV-6504);

• un bloqueador de los canales de sodio, tal como lidocafna; o

• un antagonista de 5-HT3, tal como ondansetron;

y las sales y solvatos farmaceuticamente aceptables de los mismos.

[0067] De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invencion, se da a conocer un metodo de tratamiento, prevencion, mejora, control, reduccion de la incidencia o retraso del desarrollo o de la evolucion del dolor o de cualquiera de los dolores anteriores en un individuo, comprendiendo la administracion al individuo de una cantidad efectiva de la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con el tercer y cuarto aspectos.

[0068] La presente invencion se puede aplicar tanto al campo medico humano como al veterinario. Preferiblemente, el individuo es un mamffero; por ejemplo, un animal de companfa, tal como un caballo, gato o perro, o un animal de granja, tal como una oveja, vaca o cerdo. Mas preferiblemente, el individuo es un humano.

[0069] De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invencion, se da a conocer una composicion farmaceutica para uno o mas de entre el tratamiento, la prevencion, la mejora, el control, la reduccion de la incidencia o el retraso del desarrollo o evolucion del dolor o de cualquiera de los dolores anteriores, que comprende la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con el tercer y cuarto aspectos y un portador farmaceuticamente aceptable y/o un excipiente.

[0070] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspectos o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector e sle tegrúcner y cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto esta preparada o resulta adecuada para su administracion por via oral, sublingual, bucal, topica, rectal, inhalatoria, transdermica, subcutanea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracardfaca, intraosea, intradermica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravftrea, intraarticular, periarticular, local o epicutanea.

[0071] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector el se tegrúcner y cuarto aspecto, o la composicion farmaceutica del octavo aspecto esta preparada o resulta adecuada para su administracion antes y/o durante y/o despues del comienzo del dolor o para dicha utilizacion.

[0072] Preferiblemente, la p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o el segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector el s teegrúcner y el cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto se destina o se prepara para su administracion entre una y 7 veces por semana, mas preferiblemente entre una y cuatro veces al mes, mas preferiblemente entre una y seis veces por cada perfodo de 6 meses, mas preferiblemente de una a doce veces al ano. Preferiblemente, el medicamento esta pensado o esta preparado para administrarse de forma secundaria en un perfodo que incluye, aunque sin caracter limitativo: una vez al dfa, una vez cada dos, tres, cuatro, cinco o seis dfas, semanalmente, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueves meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses o anualmente.

[0073] Mas preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con el tercer y cuarto aspecto, o la composicion farmaceutica del octavo aspecto esta pensada o esta preparada para administrarse de forma secundaria por medio de una via que incluye, aunque sin caracter limitativo, una o mas de: la via oral, sublingual, bucal, topica, rectal, inhalatoria, transdermica, subcutanea, intravenosa, intraarterial o intramuscular, intracardfaca, intraosea, intradermica, intraperitoneal, transmucosa, vaginal, intravftrea, epicutanea, intraarticular, periarticular o local.

[0074] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector e sle tegrúcner y cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto esta pensada o preparada para su administracion con una concentracion de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 200 mg/ml; preferiblemente con cualquiera de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mg/ml /- aproximadamente un 10 % de error, mas preferiblemente con aproximadamente 3 mg/ml en aplicaciones veterinarias y 0,1 en humanos.

[0075] Preferiblemente, la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con el primer o el segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector e sle tegrúcner y cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto esta destinada o preparada para su administracion con una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal; preferiblemente, con cualquiera de aproximadamente 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal /- aproximadamente un 10 % de error, mas preferiblemente con aproximadamente 10 mg/kg en aplicaciones veterinarias y 0,3 en humanos.

De acuerdo con un noveno aspecto de la presente invencion, se da a conocer un kit que comprende:

(a) la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc según el primer o segundo aspecto o las formas de realizacion preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con el tercer y cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto; y

(b) instrucciones para la administracion de una cantidad efectiva de dicha protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc, molecula de acido nucleico, vector o composicion farmaceutica a un individuo para lograr uno o mas de entre la prevencion o el tratamiento del dolor, o bien para mejorar, controlar, reducir la incidencia o retrasar el desarrollo o la evolucion del dolor.

[0076] El kit puede incluir uno o mas recipientes que contengan la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc, el acido nucleico, el vector o la composicion farmaceutica descritos en el presente documento e instrucciones para su utilizac sieognún cualquiera de los metodos y usos de la invencion. El kit puede comprender, ademas, una descripción de la seleccion de un individuo adecuado para el tratamiento basada en identificar si ese individuo presenta un dolor o un sfntoma de dolor o corre el riesgo de tenerlo. Las instrucciones para la administracion de la composicion farmaceutica pueden incluir información en cuanto a la dosis, el esquema de dosificacion y las vfas de administracion para el tratamiento previsto.

[0077] De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invencion, se da a conocer la protefna de fusion p75NTR(NBP)-F scegún el primer o segundo aspecto o las formas de realización preferidas de la misma, o la molecula de acido nucleico o el vector según el tercer y cuarto aspecto o la composicion farmaceutica del octavo aspecto para su utilizacion en una o mas de entre la prevencion o el tratamiento, o bien para mejorar, controlar, reducir la incidencia o retrasar el desarrollo o evolucion de una afeccion o los sfntomas de una afeccion asociada a una o mas de las neurotrofinas NGF, BDNF, NT-3 o NT-4/5.

- El NGF (factor de crecimiento nervioso) se une a al menos dos clases de receptores: el p75NTR y el TrkA, una tirosina quinasa transmembrana, implicado en el crecimiento axonal, la ramificacion y el alargamiento. Se conocen afecciones y sfntomas asociados al NGF. El NGF se expresa en condiciones inflamatorias y en el dolor y se asocia a los mismos [Secuencia proteica NP_002497.2, NP_038637]. Ademas, se ha demostrado que el NGF desempena una funcion en varias enfermedades cardiovasculares, tales como aterosclerosis coronaria, obesidad, diabetes tipo 2 y sfndrome metabolico, asf como en la esclerosis multiple. Los niveles plasmaticos reducidos de NGF (y tambien de BDNF) se han asociado a los sfndromes coronarios agudos y a los sfndromes metabolicos. El NGF tambien esta relacionado con diversos trastornos psiquiatricos, tales como la demencia, la depresion, la esquizofrenia, el autismo, el sfndrome de Rett, la anorexia nerviosa y la bulimia nerviosa, y se ha relacionado tambien con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer y de trastornos neurodegenerativos. Tambien se ha demostrado que el NGF acelera la cicatrizacion de las heridas, y hay pruebas de que podrfa resultar util para el tratamiento de ulceras cutaneas y ulceras corneales; se ha demostrado que reduce la degeneracion neuronal y estimula la regeneracion nerviosa periferica en ratas.

- El BDNF (factor neurotrofico derivado del cerebro) es una neurotrofina que ayuda a la supervivencia y al crecimiento neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso [Secuencia proteica NP_001137277.1, NP_001041604]. El BDNF une los receptores de la superficie celular TrkB y p75NTR, y tambien modula la actividad del receptor nicotfnico alfa 7. Se conocen afecciones y sfntomas asociados al BDNF. Se ha demostrado que el BDNF desempena una funcion significativa en la transmision de dolor fisiologico y patologico, especialmente en modelos de dolor agudo, dolor inflamatorio y dolor neuropatico, donde se ha descubierto que la sfntesis de BDNF aumenta de forma considerable; tambien se ha demostrado que el BDNF se regula al alza en afecciones con dolor cronico, asf como en otras afecciones, tales como eccema y psoriasis. La regulacion a la baja de BDNF se observa en la depresion, la esquizofrenia, el trastorno obsesivo-compulsivo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, el sfndrome de Rett y la demencia, asf como en la anorexia nerviosa y en la bulimia nerviosa.

- La neurotrofina-4 (NT-4), tambien conocida como neurotrofina-5 (NT-5), es un factor neurotrofico que transmite una senal principalmente a traves de los receptores p75NTR y TrkB, y estimula la supervivencia de las neuronas simpaticas sensoriales perifericas. El peptido maduro de esta protefna es identico en todos los mamfferos examinados, incluidos humanos, cerdos, ratas y ratones. [Secuencia proteica NP_006170, NP_937833]. La NT-4 es sintetizada por la mayorfa de neuronas del ganglio de la rafz dorsal (GRD), y las de los ganglios simpaticos paravertebrales y prevertebrales, el asta dorsal y el asta ventral de la medula espinal, y se encuentra expresada en muchos tejidos, incluidos la prostata, el timo, la placenta y el musculo esqueletico. Se conocen afecciones y sfntomas asociados a la NT-4/5. Los defectos en NT4/5 estan relacionados con la susceptibilidad al glaucoma primario de angulo abierto. Tambien se ha demostrado que la neurotrofina 4 contribuye a la supervivencia celular del cancer de mama y es una diana para inhibir el crecimiento tumoral. Se sabe que la NT-4/5 esta implicada en sistemas de senalizacion del dolor, tales como dolor nociceptivo; se observa tambien regulacion al alza de NT-4/5 en enfermedades inflamatorias cronicas de la piel, tales como dermatitis, eccema o lesiones pruriginosas de dermatitis atopica. La regulacion a la baja de NT-4/5 se observa en la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington.

- La neurotrofina-3 (NT-3) es una neurotrofina que esta relacionada desde el punto de vista estructural con la beta-NGF, BDNF y NT-4, y que controla la supervivencia y la diferenciacion de las neuronas de mamfferos y el mantenimiento del sistema nervioso adulto, y puede afectar al desarrollo de las neuronas en el embrion cuando se expresa en la placenta humana. Se conocen afecciones y sfntomas asociados a la NT3. Los ratones con deficiencia de NTF3 generados mediante insercion dirigida de un gen (gene targeting) muestran defectos graves en el movimiento de las extremidades. La NT-3 transmite una senal a traves de los receptores Trk y estimula el crecimiento y la supervivencia de las celulas nerviosas y gliales [Secuencia proteica NP_00l096124.1 y NP_032768]. Las secuencias de aminoacidos de la NT-3 humana, de raton y de rata son identicas. Se sabe que la NT3 y su receptor especffico, la tirosina quinasa C (TrkC), modulan el dolor neuropatico y el dolor nociceptivo, asf como el mecanismo de nocicepcion y propiocepcion; por ejemplo, la expresion de NT3 aumenta en las celulas pequenas del GRD de animales neuropaticos. La expresion de NT3 se asocia tambien a neuropatfas, tales como la polineuropatfa diabetica, la neuropatfa relacionada con el VIH y la neuropatfa de fibras grandes, incluida la atrofia. Tambien esta relacionada con el desarrollo de hiperalgesia (una disminucion en el umbral de un estfmulo nocivo normal), la alodinia (un estfmulo no nocivo se torna nocivo), y el dolor espontaneo (dolor en ausencia aparente de estfmulos), y es un modulador conocido del dolor muscular.

[0078] A continuacion, se describira la invencion con referencia a los siguientes ejemplos, que se exponen para ilustrar la invencion, y no para limitarla.

Ejemplos

Pruebas de inmunogenicidad in silico para secuencias de p75NTR-Fc

[0079] Actualmente, se emplea la tecnologfa de ADN recombinante para producir un amplio abanico de farmacos de origen biologico, incluyendo la clase novedosa de protefnas de fusion terapeuticas multifuncionales basadas en el Fc (fragmento cristalizable) de anticuerpos monoclonales (mAb) (Huang 2009 Curr Opin Biotechnol, 20(6), 692-9). La fusion de una protefna terapeutica a un dominio Fc realza el efecto terapeutico global del producto biofarmaceutico mediante la ampliacion de la vida media serica de la molecula de dos maneras distintas. En primer lugar, el reciclado de la fusion Fc mediante union dependiente al pH al receptor Fc neonatal (FcRn) reduce la degradacion de la protefna terapeutica en endosomas. En segundo lugar, el incremento del tamano molecular a traves tanto de la adicion de los dominios Fc como de la dimerizacion mediada por Fc en la protefna terapeutica ayuda a limitar el aclaramiento renal relativo a la molecula terapeutica.

[0080] Se pueden crear protefnas de fusion uniendo directamente dos o mas dominios. No obstante, esto puede dar como resultado propiedades moleculares no deseables en la protefna de fusion resultante, como una bioactividad alterada (Bai et al. 2005 Proc. Natl. Acad. Sci. 102 7292-7296), un mal plegamiento de protefnas (Zhao et al. 2008 Protein Expr. Purif. 61, 73-77) o rendimientos de produccion bajos (Amet et al. 2009 Pharm. Res. 26, 523-528). Se puede insertar una secuencia conectora entre los dominios para abordar estos potenciales problemas, pero se deben tener en cuenta varios factores a la hora de elegir el conector apropiado. En primer lugar, el conector debe reflejar la funcion prevista general de los dominios en la protefna de fusion. En algunas situaciones, los dominios deben funcionar de manera independiente, por lo que es deseable que el conector presente flexibilidad. En cambio, puede ser necesario un conector rfgido si los dominios van a estar conectados. En segundo lugar, el conector no debe introducir ninguna funcionalidad no deseada en la protefna de fusion, a traves de modificaciones postraduccionales (PTM, por sus siglas en ingles). Por ultimo, se debe considerar la potencial inmunogenicidad del conector y las regiones flanqueantes del conector, ya que el conector puede ser una secuencia disenada de novo que no se origine de manera natural en el cuerpo humano.

[0081] La mayorfa de protefnas terapeuticas son, en mayor o menor grado, inmunogenicas (Van Walle et al.

2007 Expert Opin Biol Ther. 7(3):405-18, Stas et al. 2009 Immunogenicity assessment of antibody therapeutics. Cambridge University Press, Cambridge), e incluso los denominados productos terapeuticos a base de anticuerpos totalmente humanos pueden contener regiones inmunogenicas (Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256 265). La inmunogenicidad es la capacidad para inducir una respuesta Th (T auxiliar), que se desencadena cuando un unico receptor de celulas T reconoce a un peptido unido a las moleculas HLA de clase II mostradas en celulas que presentan antfgenos. Los peptidos se generan a partir de protefnas internalizadas por la celula que presenta el antfgeno, y que posteriormente se procesan a traves de la via de escision endosomal. La superficie celular presentara unicamente peptidos con una afinidad suficiente a las moleculas HLA de clase II, y es posible que pudieran desencadenar una respuesta Th.

[0082] Como consecuencia, se puede reducir el potencial de inmunogenicidad eliminando epftopos Th, proceso conocido como desinmunizacion (Chamberlain 2002 The Regulatory Review 5, 4-9, Baker y Jones 2007 Curr. Opin Drug Discov. Devel. 10, 219-227). Esto se consigue prediciendo que peptidos se pueden unir en la protefna terapeutica a las moleculas HLA de clase II y, posteriormente, introduciendo sustituciones que eliminen o reduzcan la afinidad de union del peptido a las moleculas HLA de clase II.

[0083] Existen varios genes HLA de clase II, y practicamente todos son altamente polimorficos. Por otro lado, las moleculas HLA de clase II constan de una cadena alfa y beta, cada una derivada de un gen distinto que, con su polimorfismo inherente, incrementa mas la variacion. En concreto, cada individuo expresa los genes: DRA/DRB, DQA/DQB y DPA/DPB. De estos, solo DRA es no polimorfico. Ademas, puede haber presente tambien un «segundo» gen DRB (DRB3, DRB4 o DRB5), cuyo producto se asocia tambien a la cadena DRA.

[0084] Durante un proceso de desinmunizacion, el foco se situa en los alotipos DR, que se sabe que se expresan a mayor nivel que DQ y DP (Laupeze et al. 1999 Hum. Immunol. 60, 591-597, Gansbacher y Zier 1988 Cell Immunol. 117, 22-34, Berdoz et al. 1987 J. Immunol. 139, 1336-1341, Stunz et al. 1989 J. Immunol. 143, 3081 3086). Los alotipos DR se suelen denominar por el gen DRB, ya que el gen DRA se mantiene constante; por ejemplo, DRB1*01:01, donde los dfgitos son espedficos del alelo.

[0085] La evaluacion de la gravedad de epttopos individuales se basa en los criterios de promiscuidad, esto es, el numero de alotipos HLA a los que se une un epttopo espedfico, asf como la importancia (frecuencia) de los alotipos en la poblacion, y una evaluacion cualitativa de la fuerza de union del complejo HLA:peptido. Puesto que la poblacion de celulas T de un individuo se ha seleccionado para no reconocer «autopeptidos», se puede determinar la presencia de peptidos en la protema que este siendo desinmunizada que correspondan a autopeptidos (conocidos) que normalmente no debenan inducir una respuesta Th. Aunque no se conoce con detalle que protemas endogenas se internalizan durante la maduracion de celulas T, y puesto que estas dan lugar a autopeptidos, los anticuerpos se encuentran entre ellas (Kirschmann et al. 1995 J. Immunol. 155, 5655 5662, Verreck et al. 1996 Immunogenetics 43, 392-397, Harding et al. 2010 MAbs. 2, 256-265).

Diseno de la protefna de fusion p75-NTR Fc

[0086] El alotipo concreto de la porcion Fc de la protema de fusion p75-NTR Fc era el vector IgGza de IgG pCon (ver arriba).

[0087] El diseno de una protema de fusion p75-NTR Fc se llevo a cabo en varias etapas:

• Se definio el constructo exacto de la secuencia p75-NTR que se iba a utilizar en la protema de fusion Fc. Se consideraron varios factores, entre ellos:

° La fusion p75-NTR Fc debena ser capaz de unirse a varias neurotrofinas, incluyendo al menos NGF, BDNF, NT-3 y NT-4; se debe conservar la flexibilidad en la protema de fusion p75-NTR Fc.

° Los sitios de escision no deseados de alfa-secretasa estan presentes en el dominio extracelular de p75-NTR-Fc (SEQ ID N.° 1), y estos se deben eliminar de la secuencia, puesto que se someteran a escision, y, como consecuencia, reduciran la actividad biologica y el perfil PK del producto p75-Fc in vivo. El producto p75-Fc original (vease la SEQ ID N.° 1) contema sitios de escision de alfa-secretasa y, por consiguiente, la vida media y la actividad biologica (PK/PD) se redujo significativamente en comparacion con la SEQ ID N.° 3 (vease mas adelante).

[0088] Se identificaron conectores empmcos apropiados, adecuados para su uso con el fin de unir el dominio extracelular de p75-NTR y la Fc en una protema de fusion p75-NTR Fc. Se excluyeron las secuencias conectoras que conteman sitios que podfan participar potencialmente en modificaciones postraduccionales (PTM).

[0089] Se formaron diversas variantes de la protema de fusion p75-NTR Fc in silico empleando el constructo definido de p75-NTR con la porcion apropiada de la region Fc utilizando distintas secuencias conectoras posibles. Se intento llevar a cabo un modelado estructural y un analisis del C-terminal del dominio extracelular de p75-NTR, la region bisagra Fc y el conector potencial (ver tabla 1).

[0090] Se determino la presencia de posibles epftopos Th en las variantes con distintas secuencias conectoras utilizando Epibase™.

[0091] Se propuso la protema de fusion p75-NTR Fc expresada en la secuencia 3 (SEQ ID No. 3) basandose en el riesgo de inmunogenicidad previsto.

Analisis secuencial de la protefna de fusion Fc

[0092] Las secuencias proteicas para trece de las protemas de fusion Fc terapeuticas disponibles en la actualidad se obtuvieron a partir del sitio web de los nombres adoptados por los Estados Unidos (United States Adopted Names, USAN) (http://www.ama-assn.org/ama/pub/physician-resources/medical-science/). Cuando fue posible, las secuencias proteicas se cotejaron y se comprobaron comparandolas con otros recursos electronicos, como sitios web sobre información de patentes en lmea. Las secuencias proteicas para protemas de fusion Fc de caracter investigador se obtuvieron a partir de otros proveedores comerciales empleando recursos en lmea.

[0093] Con el fin de identificar la secuencia parental putativa de la que derivaron las diversas protemas de fusion Fc, las secuencias proteicas de fusion Fc se alinearon con los productos proteicos traducidos de los vectores IgG pCon propios de Lonza utilizando MAFFT (Katoh et al. 2002 Nucleic Acids Res. 30, 3059-3066). Las secuencias proteicas de fusion Fc alineadas se truncaron a continuacion en la posicion en la que comenzo la fusion Fc para coincidir con la secuencia IgG. Para determinar donde se inicio la secuencia IgG, se utilizo un criterio de tres residuos de IgG consecutivos.

[0094] Se realizo una busqueda de Blast (Altschul et al. 1997 Nucleic Acids Res. 25 3389-3402) de una copia propia de la base de datos Uniprot (The UniProt Consortium, lanzamiento de UniProt 2012-09 - 3 de octubre, 2012) utilizando las secuencias proteicas de fusion Fc truncadas sin su secuencia IgG con el fin de identificar las secuencias proteicas coincidentes mas cercanas. A continuacion, cada secuencia proteica de fusion Fc se volvio a alinear manualmente tanto con las secuencias coincidentes mas cercanas halladas en la base de datos Uniprot como con la secuencia IgG pCon de Lonza coincidente mas cercana. Posteriormente, se extrajeron las uniones entre los miembros de fusion y las regiones Fc, y se crearon dos conjuntos, uno para las 13 protemas de fusion Fc terapeuticas y otro para las protefnas de fusion Fc disponibles comercialmente. Finalmente, a partir de estos dos conjuntos, se identificaron las regiones de enlace.

[0095] El conjunto de secuencias de protefnas de fusion Fc disponibles en el mercado se trunco a continuacion en la posicion N-terminal donde se hallo la identidad de secuencias con la secuencia IgG pCon de Lonza coincidente mas cercana. Posteriormente, las secuencias truncadas se clasificaron, y se genero un conjunto de secuencias no redundante.

Perfil inmunologico con Epibase™

[0096] El perfil inmunologico con Epibase™ se llevo a cabo en las variantes de la protefna de fusion Fc utilizando los 85 alotipos HLA de clase II en el conjunto global.

[0097] Resulta muy diffcil establecer una comparacion de las variantes de la protefna de fusion Fc con respecto a su riesgo inmunogenico empleando unicamente predicciones de union de HLA. Esto se debe a que no se tienen en cuenta varios factores importantes:

• El peptido de union puede no generarse por medio del mecanismo de procesamiento y, por lo tanto, nunca estarfa expuesto como un complejo peptido-HLA a celulas Th mediante las celulas que presentaban antfgenos.

• El complejo peptido-HLA puede no ser reconocido por una celula Th.

[0098] Dadas estas consideraciones, se pueden realizar tres tipos de comparaciones cuantitativas entre secuencias variantes utilizando el perfil inmunologico de Epibase™. En primer lugar, se puede comparar el numero de epftopos crfticos para cada uno de los conjuntos de alotipos DRB1, DRB3/4/5, DQ y DP, uniendose los peptidos a multiples alotipos del mismo grupo considerados como uno solo. Dicho recuento de epftopos muestra el numero de epftopos unicos en cada conjunto, y la diferencia entre las variantes revela la eliminacion o adicion completa de posibles epftopos Th.

[0099] Puesto que muchos epftopos, especialmente los epftopos promiscuos, se unen a multiples alotipos, el cambio en el recuento de epftopos Th unicos puede ocultar la reduccion o el incremento real del potencial de inmunogenicidad entre variantes. Por consiguiente, la segunda comparacion cuantitativa se realiza a nivel de cada alotipo HLA en la totalidad de epftopos Th, donde un recuento de los peptidos de union por alotipo para las variantes, junto con el serotipo y la frecuencia de poblacion, permite una comparacion a nivel de serotipo o de alotipo. En tercer lugar, se puede calcular una puntuacion aproximada que exprese un riesgo inmunogenico para el peor de los casos de la siguiente manera:

puntuacion = I (recuento de epftopos x frecuencia de alotipos)

[0100] El producto multiplicativo para cada alotipo afectado se calcula a partir del numero de epftopos que se predijo que se unirfan a un alotipo determinado, y la frecuencia alelica del alotipo afectado. Los productos se suman para todos los alotipos DRB1, DRB3/4/5, dQ y DP afectados empleados en el estudio. Cabe destacar que las puntuaciones de alotipos individuales no suponen la metrica absoluta mediante la cual se puede medir el riesgo de inmunogenicidad, ya que se deberfan tener en cuenta todos los alotipos HLA elegidos (DRB1, DRB3/4/5, DQ y DP).

[0101] No se considero que las secuencias de la lfnea germinal de anticuerpos humanos, tales como las derivadas de la Fc de pCon IgG de Lonza, fueran inmunogenicas, ya que se encuentran en el grupo de anticuerpos circulantes presentes en el sistema inmunologico humano, y se pueden considerar autopeptidos. Del mismo modo, no se considera que p75-NTR sea intrfnsecamente inmunogenico, ya que se expresa de manera natural en el cuerpo humano. Como consecuencia, los epftopos crfticos resultantes de peptidos derivados completamente de secuencias de la lfnea germinal de anticuerpos humanos o de p75-NTR se excluyen de los recuentos y de las puntuaciones de inmunogenicidad presentados.

Modelado estructural

[0102] Los modelos estructurales de la protefna de fusion p75-NTR Fc propuesta se generaron utilizando la plataforma de modelado de Lonza. Se puntuaron los fragmentos de patron estructural del candidato para la porcion p75-NTR y Fc, se clasificaron y se seleccionaron tanto de una base de datos de anticuerpos propios como del Banco de Datos de Protefnas (Protein Data Bank, PDB), por su identidad de secuencias, asf como por las medidas cristalograficas cualitativas de la estructura del patron, tal como la resolucion (en angstrom (A)).

[0103] Se genero un alineamiento de secuencias de los fragmentos del patron estructural con la protefna de fusion p75-NTR Fc. Los fragmentos del patron, asf como el alineamiento de secuencias, se procesaron mediante MODELLER (Sali et al. 1993 J. Mol. 234, 779-815). Este protocolo crea restricciones conformacionales derivadas del conjunto de patrones estructurales alineados. Se crea un conjunto de estructuras que satisfacen las restricciones mediante gradiente conjugado y procesos simulados de optimizacion de hibridacion. Se selecciona uno o varios modelos de estructuras de este conjunto basandose en una fuente de energfa, derivado(s) de la puntuacion de la estructura proteica y de la satisfaccion de las restricciones conformacionales. Los modelos se examinaron, y las cadenas laterales de las posiciones que difenan entre la diana y el patron se optimizaron empleando un algoritmo de optimizacion de la cadena lateral, con energfa minimizada. Se utilizo un paquete de programas de visualizacion y herramientas informaticas para evaluar la variabilidad conformacional de las estructuras, as ^ como el empaquetamiento local y del nucleo de los dominios para seleccionar uno o varios modelos preferidos.

Diseno de la protefna de fusion p75-NTR Fc

[0104] Se disenaron tres variantes de conector de las protemas de fusion p75-NTR Fc. Debido a las restricciones de diseno presentes al tratar de conservar la flexibilidad en las regiones p75-NTR en las protemas de fusion Fc finales y al deseo de evitar sitios de escision no deseables para la alfa-secretasa y gamma-secretasa, se trunco la secuencia p75-NTR extracelular en la posicion G237. La secuencia 1 original de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 1) se trunco en la posicion A250. Se han identificado sitios de escision de alfa-secretasa en la porcion extracelular de p75-NTR entre las posiciones 241-242 y las posiciones 244-245 (Zampieri et al. 2005 J Biol Chem. 280, 14563 71) y se ha inferido un sitio de escision putativo de gamma-secretasa mediante homologfa de secuencias en las regiones de la posicion 282. Resulta evidente, a rafz del PK/PD de la secuencia 1, que el PK y la actividad biologica de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) se ha reducido de manera significativa en comparacion con la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3). A partir de estos experimentos, se concluyo que los sitios de alfa-secretasa y gamma-secretasa contribrnan a reducir la actividad in vivo.

[0105] Los requisitos fundamentales de los conectores elegidos para las variantes son permitir la flexibilidad del miembro de fusion en la protema de fusion Fc, evitar la introduccion de cualquier residuo que pueda portar modificaciones postraduccionales, y mantener un riesgo de inmunogenicidad bajo.

[0106] Existen dos tipos de conectores disponibles para unir la p75-NTR a la region constante Fc, conectores empmcos y conectores derivados de protemas naturales. Los conectores derivados de protemas naturales pueden introducir sitios que pueden portar modificaciones postraduccionales no deseables y, debido a su naturaleza, conllevar posiblemente un mayor riesgo de introduccion de inmunogenicidad. Los conectores empfticos fueron impulsados para investigaciones posteriores debido a estos motivos, y se pueden clasificar en terminos generales como flexibles o ngidos. Las secuencias de los conectores empmcos de la unidad de repeticion se listan a continuacion, junto con su clasificacion de flexibilidad:

• (G4S)x - flexible

• Gx - flexible

• A(EAAAK)xA - rigido (SEQ ID N.° 14)

• (PA)x - ngido

[0107] Debido a la necesidad de flexibilidad para asegurar la union a varios ligandos neurotroficos, incluyendo al menos NGF, BDNF, NT3 y NT4 en la protema de fusion Fc final, unicamente se consideraron conectores flexibles.

[0108] En funcion de estas consideraciones, se construyeron tres variantes, una variante utilizando un conector de poliglicina y dos variantes utilizando el conector de tetraglicina y serina. Todas las variantes consideran que G209 (protema expresada, vease la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3)) forma parte de la secuencia conectora en la secuencia p75-NTR original. Ademas, las variantes contienen la mutacion de cistema a serina en la ubicacion equivalente a la posicion 222 en la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) de la protema de fusion p75-NTR Fc original. Las regiones de enlace de las variantes se muestran en la figura 5.

[0109] Se llevo a cabo un analisis del potencial de inmunogenicidad para cada una de las variantes y las otras secuencias que se indican en la figura 1 utilizando Epibase™. Las puntuaciones de inmunogenicidad previstas para los epftopos crfticos que afectan a los 85 alotipos HLA de clase II en el conjunto global se muestran mas adelante, en la tabla 1. Asimismo, la tabla 1 presenta tambien información acerca del numero de alotipos afectados por epftopos no crfticos.

Tabla 1: Resumen de las puntuaciones calculadas de epftopos crfticos

Puntuacion de epftopo crftico

Molecula Epftopos no crfticos

DRB1 DRB3/4/5 DQ DP

p75-Fc comercial 167,7 53,6 0 0

Puntuacion de epftopo crftico

Molecula Epftopos no crfticos

DRB1 DRB3/4/5 DQ DP

p75-Fc 55,1 24,2 0 0 -

p75-Fc (C222S) 75 24,2 0 0 -

p75-Fc (G4x1) (SEQ ID

_{N.° 3)}0 0 0 0 7 epftopos DQ medios

p75-Fc (G4Sx1) 2,4 0 0 0 1 epftopo DRB1 medio, 5 epftopos DQ medios

p75-Fc (G4Sx2) 2,4 0 42,2 0 ^{3 epftopos DQ fuertes, 1 epftopo DRB1 medio, 6} _{epftopos DQ medios}

SEQ ID N.° 15 0 0 0 0 -

p75NTR-Fc de Apollo 167,7 53,6 0 0 -

[0110] Basandose en la inmunogenicidad prevista y en la ausencia de sitios que puedan portar modificaciones postraduccionales, la variante 1 (p75_Fc_G4x1) presenta las mejores caractensticas de las tres variantes, y se produjo para pruebas in vivo.

Afinidad de p75NTR-Fc por NGF en la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y en la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3)

[0111] Se preparo un chip de Biacore en un experimento en el que la protema A se urna a las celulas de flujo 1 y 2 mediante acoplamiento de aminas. Se midio la cinetica de ciclo unico de la union de NGF a la p75-Fc capturada.

[0112] La capacidad de union (Rmax) de una superficie de chip depende del nivel inmovilizado del ligando (protema de fusion). Para un estudio cinetico, se recomienda una Rmax de 50-100 RU. Al utilizar los pesos moleculares de p75-Fc y NGF, se puede calcular un nivel de inmovilizacion deseado para la protema de fusion.

Rmax = (peso molecular de NGF/peso molecular de la protema de fusion) x nivel de inmovilizacion x relacion estequiometrica: 50 = (13500/102 000) x nivel de inmovilizacion x 1

[0113] Por consiguiente, el nivel de inmovilizacion requerido = (102 000/13 500) x 50 = 378 RU. p75NTR-Fc y NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y de la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3) se inmovilizaron en el chip de protema A con anterioridad a la cinetica de ciclo unico.

[0114] Mediante una operacion manual, se capturo la p75-Fc de la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3) en la celula de flujo 2 del chip de protema A hasta que se alcanzo el nivel deseado de aproximadamente 380 RU. Esto se llevo a cabo mediante una inyeccion de 22 segundos con una velocidad de flujo de 10 pl/min y una concentracion de p75-Fc en la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3) de 10 mg/ml, que dio como resultado 418 RU de la protema de fusion capturada en la superficie de la protema A.

[0115] En el primer caso, se analizaron las concentraciones de NGF de 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 nM. Se analizaron estas concentraciones debido a que la Kd para la protema de fusion se encontraba, aproximadamente, dentro de este intervalo de concentraciones de NGF.

[0116] El metodo cinetico de ciclo unico implicaba:

- inyectar 0,625 nM de NGF en la p75-Fc capturada durante 120 segundos a 30 pl/min

- posteriormente, este proceso se repitio con una inyeccion de NGF a 1,25 nM, y a continuacion de 2,5, 5 y 10 nM

- tras haber inyectado la concentracion final de NGF, se realizo una fase de disociacion de 600 segundos haciendo fluir el tampon del analisis (HBS-EP) sobre el chip.

[0117] Una vez completado, el chip se regenero de nuevo a su superficie de protefna A inyectando 10 mM de HCl de glicina, pH 2 durante 60 segundos a 30 pl/min.

[0118] A continuacion, se capturo la p75-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) en el chip realizando una inyeccion de 38 segundos con una velocidad de flujo de 10 pl/min y una concentracion de 10 pg/ml. Se alcanzo el nivel deseado de 430 RU. A continuacion, se repitio el proceso cinetico de ciclo unico descrito anteriormente.

Analisis de datos

[0119] Los datos de union protefna de fusion-NGF se analizaron de la siguiente manera utilizando el software de evaluacion Biacore T200 v1:

- Los datos se registraron para la union de NGF a la protefna de fusion en la celula de flujo 2 (Fc=2) y para que NGF fluyera sobre la celula de flujo control 1 (Fc=1; protefna A unica).

- Los datos de Fc=1 se restaron a continuacion de Fc=2 para obtener datos de union «2-1».

- Los datos de union 2-1 para una inyeccion de 0 nM (tampon del analisis unico HBS-EP) se restaron a continuacion de todos los datos de union 2-1 para controlar cualquier desviacion respecto al valor de referencia a lo largo del experimento.

- Por ultimo, se ajustaron estos datos a un modelo de union 1:1 para calcular caracterfsticas de union, incluyendo las tasas de asociacion (ka), las tasas de disociacion (kd) y las afinidades (K^d).

Datos cineticos de ciclo unico de la union de NGF a las protefnas de fusion p75-Fc capturadas de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y 3 (SEQ ID N.° 3)

[0120] Los perfiles de union de ambas protefnas de fusion a NGF fueron de 400 pM (SEQ ID N.° 1) y 360 pM (SEQ ID N.° 3). A rafz de estos estudios, resulto evidente que la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3) presentaba una afinidad mayor a NGF que la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1).

Farmacocinetica in vivo de p75NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y 3 (SEQ ID N.° 3)

[0121] En este estudio, se utilizaron ratas Wistar macho (de Charles River UK) que pesaban 120-150 g a su llegada. Se reviso cada animal a su llegada y, aparentemente, se mostraron sanos. Se asignaron de manera aleatoria a una jaula de dos individuos, y se le atribuyo a cada rata un unico numero de identificacion marcado en la cola. Los animales se aclimataron a la unidad animal durante al menos 10 dfas antes del inicio del estudio en el dfa 0.

[0122] Una vez que las ratas se habfan aclimatado a su entorno, se trasladaron a una sala de procedimientos/almacen, donde se llevaron a cabo todos los procesos in vivo. Los animales se mantuvieron iluminados mediante luces fluorescentes configuradas para proporcionar un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad (desde las 07.00 hasta las 19.00), conforme a la recomendacion del Ministerio del Interior de Reino Unido en la Ley de Procedimientos Cientfficos en Animales (Animals (Scientific Procedures) Act) de 1986. Las salas se climatizaron, y se midio de manera rutinaria la temperatura del aire (21°C /- 2°C) y la humedad relativa.

[0123] Se alimento a las ratas con una dieta a base de alimentos irradiados (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, Francia), y disponfan de agua esterilizada en el autoclave ad libitum a lo largo del estudio. Se comprobo y se examino la composicion y los contaminantes de cada lote de alimentacion de manera sistematica. Los nidos y las jaulas se esterilizaron en el autoclave, y se ventilo cada jaula individualmente (sistema IVC).

[0124] El diseno del estudio se realizo de tal manera que habfa 5 grupos de tratamiento, segun se indica en la tabla 2.

Tabla 2: Grupos de tratamiento

Numero de rata Tratamiento Dosis Via de administracion Dfas de tratamiento n

1 - 4 p75-Fc de la Sec. 1 1 mg/kg Subcutanea 0,5 y 10 4

p75-Fc de la Sec. 2 1 mg/kg Subcutanea 0,5 y 10 4

[0125] Se extrajo una muestra de sangre de la vena caudal de ratas, aproximadamente a la misma hora (10 am -11.30 am) en los dfas 2, 4, 6, 8, 12 y 15, y se preparo el plasma.

Toma de muestras de sangre de la vena caudal

[0126] Las ratas se colocaron en una caja de calentamiento configurada a 38 °C durante un perfodo de tiempo minimo de cinco minutos pero no superior a diez minutos para inducir la vasodilatacion de la vena caudal con el fin de facilitar el sangrado. Se confino a las ratas en un inmovilizador con un tamano apropiado, se pincho la vena caudal utilizando una aguja esterilizada de 23 G, y se dejo fluir la sangre hacia un tubo Microvette CB 300 (Sarstedt 16.444). Se obtuvo un minimo de 100 pl y un maximo de 300 pl de sangre de cada rata en todos los momentos. Se escogio un sitio distinto para repetir la toma de muestras, y las ratas se mostraron tranquilas durante el proceso. Las ratas toleraron bien la repeticion de la toma de muestras de sangre, sin presentar signos de hematomas. La sangre obtenida se utilizo para preparar plasma.

Muestra de sangre final del corazon

[0127] Las muestras de sangre finales se tomaron mediante puncion cardiaca con anestesico isoflurano con una jeringa Terumo de 1 ml y una aguja de 23 G. Los animales fueron sacrificados a continuacion mediante dislocacion cervical. La sangre obtenida se utilizo para preparar suero.

Preparacion de plasma

[0128] El tubo Microvette que contenia sangre de la vena caudal se invirtio con cuidado varias veces para asegurar una mezcla correcta con el anticoagulante (potasio-EDTA). A continuacion, se colocaron los tubos sobre hielo para centrifugarse a 2700 x g durante 10 minutos, y el plasma se dividio en alicuotas en tubos de polipropileno (dos alicuotas por animal por momento, excepto en el dfa 2, en el que se preparo unicamente una alfcuota). Todas las muestras de plasma se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80 °C hasta el momento de su uso.

Preparacion de suero

[0129] Se dejo coagular la sangre extrafda mediante puncion cardiaca en el dfa 15 en un tubo de polipropileno a temperatura ambiente durante entre 2 y 3 horas (3 horas como maximo). Posteriormente, se centrifugo la sangre coagulada a 4000 x g durante 5 minutos, y el suero se dividio en alicuotas en tubos de polipropileno (dos alicuotas por animal). Las muestras de suero se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80 °C.

Determinacion de p75NTR-Fc en plasma

[0130] Se midio la p75NTR-Fc en plasma utilizando un ELISA modificado para p75NTR (sistemas R y D) y ELISA para Fc de IgG1 (sistemas R y D) como medio para determinar las concentraciones plasmaticas intactas totales de p75NTR-Fc.

[0131] Se determino la farmacocinetica de p75NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y de la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3).

p75NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID p75NTR-Fc de la secuencia 3 (SEQ ID N.°

N.° 1) 3)

Ligando NGF BDNF NT3/4 NGF BDNF NT3/4

PM 90-120 kDa 90-100 kDa

Kd de Biacore 390 pM 360 pM

T^1/2de la rata 1,5 dfas 3,3 dfas

T^maxde la rata 0,5 dfas 3 dfas

Eficacia en el dolor 10 mg/kg 1 -3 mg/kg

C^ef10 nM 2 nM

Conclusion

[0132] Al eliminar los sitios de escision de la alfa-secretasa y gamma-secretasa de p75NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) en comparacion con la secuencia 3 (SEQ ID N.° 3), esta ha mejorado significativamente el PK de p75NTR-Fc y, posteriormente, la eficacia evaluada mediante las puntuaciones de dolor tras un tratamiento cronico. Los sitios de escision de la alfa-secretasa y gamma-secretasa de p75NTR-Fc de la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) provocaron que este compuesto resultara inapropiado como farmaco in vivo para el tratamiento del dolor y de otras patologfas relacionadas con la biologfa de las neurotrofinas; por ejemplo, enfermedades respiratorias.

[0133] La secuencia 3 (SEQ ID N.° 3) es estable, y presenta un mejor perfil de PK/PD en comparacion con la secuencia 1 (SEQ ID N.° 1) y una mayor afinidad por las neurotrofinas.

P75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) es analgesica.

[0134] El objetivo del presente estudio era investigar los efectos de la exposicion cronica de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) en la eficacia del dolor en la osteoartritis (OA) inducida por yodoacetato monosodico (MIA) en ratas.

[0135] Anteriormente, hemos mostrado tambien que se podna realizar una evaluacion del dolor espontaneo midiendo la capacidad para soportar peso estatico utilizando un medidor de incapacidad, y que esta guarda relacion con la histopatologfa de la rodilla. Los estudios preclmicos que utilizan terapias novedosas para el dolor han sido criticados por su capacidad para inducir a sesgos en los datos. Con el fin de abordar este problema, se eligio de manera aleatoria tanto la rodilla izquierda como la rodilla derecha para la induccion de Oa , y ningun operario de las tareas diarias in vivo conocfa el estado de cada rodilla. Segun se puede extraer de la bibliograffa, la induccion de OA normalmente se lleva a cabo unicamente en la rodilla derecha, aunque en anteriores estudios no se hallaron diferencias sustanciales entre la induccion de OA en la rodilla izquierda frente a la rodilla derecha, independientemente del momento o de la dosis de MIA empleada.

Preparacion de MIA

[0136] Se preparo MIA a 0,3 mg/50 pl de ETF-PBS (el volumen empleado para cada inyeccion intraarticular), que equivale a 6 mg/ml de solucion madre. Se pesaron 302 mg de MIA y se disolvieron en 50,3 ml de ETF-PBS. El MIA se preparo un dfa antes, y se almaceno a 4 °C en oscuridad hasta el momento de su uso.

Animates

[0137] En este estudio, se utilizaron 44 ratas Wistar macho (de Charles River UK) que pesaban 110-130 g a su llegada. Se reviso cada animal a su llegada y, aparentemente, se mostraron sanos. Se asignaron de manera aleatoria a una jaula de dos individuos, y se le asigno a cada rata un unico numero de identificacion marcado en la cola. Los animales se aclimataron a la unidad animal durante al menos 10 dfas antes del inicio del estudio en el dfa 0. Una vez que las ratas se habfan aclimatado a su entorno, se trasladaron a una sala de procedimientos/almacen, donde se llevaron a cabo todos los procesos in vivo. Los animales se mantuvieron iluminados mediante luces fluorescentes configuradas para proporcionar un ciclo de 12 horas de luz-oscuridad (desde las 07.00 hasta las 19.00), conforme a la recomendacion del Ministerio del Interior de Reino Unido en la Ley de Procedimientos Cientfficos en Animales (Animals (Scientific Procedures) Act) de 1986. Las salas se climatizaron, y se midio de manera rutinaria la temperatura del aire (21 °C /- 2 °C) y la humedad relativa.

[0138] Se alimento a las ratas con una dieta a base de alimentos irradiados (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, Francia), y dispoman de agua esterilizada en el autoclave ad libitum. Se comprobo y se examino de manera sistematica la composicion y los contaminantes de cada lote de alimentacion. Los nidos y las jaulas se esterilizaron en el autoclave, y se ventilo cada jaula individualmente (sistema IVC).

Diseno experimental

[0139] El diseno del estudio era tal que habfa cinco grupos de animales: anticuerpo humano de control (n=6), 0,3 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3), 1 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3), 3 mg/kg de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) y 3 mg/kg de PG-007 (anticuerpo anti-NGF biosimilar del Tanezumab de Pfizer).

[0140] Se administraron anticuerpos y p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) mediante inyeccion subcutanea cada 5 dfas durante 25 dfas.

[0141] Se midio el peso corporal y se tomo una muestra de sangre de referencia de la vena caudal en la manana del dfa -2. La capacidad para soportar peso estatico de referencia se midio aproximadamente a la misma hora del dfa -1. En el dfa 0, de nuevo aproximadamente a la misma del dfa, todas las ratas se trataron con su respectivo anticuerpo o protema de fusion p75NTR-Fc. Tres horas despues, se les aplico a todos los animales una inyeccion intraarticular de 0,3 mg de MIA en una rodilla (se inyecto ETF-PBS en la rodilla contralateral).

Aleatorizacion del tratamiento

[0142] Antes del comienzo del estudio, se pesaron las ratas y se asigno de manera aleatoria cada jaula de dos ratas a un grupo de tratamiento, de tal manera que el peso corporal medio de los animales en cada grupo era aproximadamente equivalente. Ademas de asignarse cada rata a un grupo de tratamiento concreto, se llevo a cabo tambien una aleatorizacion posterior, de modo que la inyeccion con MIA se realizo en cualquiera de entre la rodilla derecha o la rodilla izquierda de cada rata (inyectandose la rodilla contralateral de cada rata con ETFPBS). La asignacion del grupo de tratamiento y de la rodilla que recibio tratamiento para cada rata se produjo utilizando un generador de numeros aleatorios en Microsoft Excel para Mac (version 14.1.1). El proceso de aleatorizacion y asignacion se llevo a cabo por personal que no habfa tenido contacto con los animales.

[0143] Para cada animal, se marcaron dos viales de polipropileno de 7 ml para designar la rodilla izquierda o la derecha (88 viales en total). Los 88 viales fueron preparados por dos personas (uno puntuaba y comprobaba la ficha de aleatorizacion maestra y uno dividfa en alfcuotas la solucion para la inyeccion intraarticular). El proceso de division en alfcuotas se llevo a cabo de manera secuencial, de modo que los viales MIA se llenaron primero y, a continuacion, se llenaron los viales restantes con ETF-PBS (este era el vial de la rodilla contralateral para cada animal). Durante el transcurso del estudio in vivo, los cientfficos desconocfan el estado de tratamiento de todos los animales.

Procedimientos con animates

Inyeccion intraarticular de la rodilla

[0144] Se anestesio a todas las ratas mediante inhalacion de isoflurano utilizando un aparato de Boyle. Se recortaron los pelos de ambas rodillas de cada animal, y las rodillas se limpiaron con etanol. En cada rodilla, a traves del ligamento infrapatelar, se inyectaron 50 pl de 0,3 mg de MIA en ETF-PBS, o bien unicamente ETF-PBS, utilizando una jeringa para insulina esterilizada de 0,5 ml Becton Dickinson Micro-Fine con una aguja acoplada de 27 G.

Evaluacion del dolor espontaneo

[0145] Se determino el dolor espontaneo para cada animal midiendo la capacidad para soportar peso de las extremidades posteriores izquierda y derecha empleando un medidor de incapacidad (Linton Instruments, Reino Unido). Las ratas se colocaron en una caja para animales de Perspex con un tamano apropiado en el medidor de incapacidad, de tal manera que sus extremidades posteriores reposaban sobre sensores independientes. El tamano de la caja permitfa que la rata reposara comodamente sin aplastarse, aunque, de igual modo, no permitfa que la rata tuviera suficiente espacio como para girarse. Una vez que la rata estaba firme y tranquila, se registro la capacidad para soportar peso de cada extremidad durante 5 segundos, y se registro la fuerza media en gramos ejercida por ambas extremidades posteriores. Se determino cinco veces la distribucion del peso de las patas traseras (la validez que se ha demostrado anteriormente) para cada rata en cada momento, y se calculo la media de las cinco lecturas. Los datos individuales de capacidad para soportar peso se convirtieron en una distribucion de peso dividiendo el peso de la extremidad derecha por el peso total de ambas extremidades posteriores.

Mediciones de dolor espontaneo tras la OA inducida por MIA

[0146] Se evaluo el dolor espontaneo utilizando un medidor de incapacidad para medir la distribucion del peso a traves de las extremidades traseras. Las evaluaciones se llevaron a cabo al inicio y 3 semanas despues del tratamiento con MIA.

[0147] Los datos que se muestran en la figura 6 representan la proporcion del peso total en las extremidades traseras.

[0148] En el caso de los animales que no recibieron tratamiento, no hubo diferencias estadfsticamente significativas entre la proporcion de peso en las extremidades posteriores y las expectativas teoricas de 0,5.

[0149] En el caso de los animales tratados con anticuerpos de control, se soporto una cantidad de peso significativamente menor desde el punto de vista estadfstico en la extremidad tratada que en la extremidad no tratada (39 % frente a 61 %). En los animales tratados con el anticuerpo anti-NGF (3 mg/kg de Tanezumab PG-007 biosimilar) y los tratados con p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) con 0,3 y 1 mg/kg no hubo diferencias estadfsticamente significativas (P <01) entre la proporcion de peso en la extremidad trasera tratada y las expectativas teoricas de 0,5 (distribucion uniforme en ambas extremidades traseras) en cualquiera de los momentos medidos. El efecto analgesico de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) con 3 mg/kg fue todavfa mas significativo desde el punto de vista estadfstico (P <0,05) en comparacion con los controles correspondientes.

[0150] A rafz de estos estudios, resulta evidente que p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) es analgesica en el modelo de OA con MIA en ratas. Los efectos analgesicos de p75NTR-Fc (SEQ ID N.° 3) fueron superiores a los observados para los anticuerpos anti-NGF (PG-007: anticuerpo Tanezumab anti-NGF biosimilar de Pfizer) en dosis similares: 3 mg/kg, subcutanea.

Mejora inesperada de la afinidad de la molecula p75NTR-Fc de la secuencia 3 y de la secuencia 15 respecto a neurotrofinas individuales

[0151] A partir de la bibliograffa y de la tecnica anterior, se acepta generalmente que el receptor de neurotrofinas p75 de baja afinidad presenta una afinidad similar por todas las neurotrofinas de aproximadamente 1 nM (Ichim et al., 2012 Exp Cell Res 318(11): 1221-8). Asimismo, la tecnica anterior de Apollo Life Sciences (Molecules and chimeric molecules thereof, US 20090232808 A1) ejemplifica ademas la similitud de la afinidad del receptor de neurotrofinas p75 por las neurotrofinas individuales. «NGFR es una protelna de membrana de tipo I que se sintetiza como una glucoprotelna de 427 aminoacidos que consta de un peptido senal de 28 aminoacidos. NGFR se une con una afinidad equivalente a todas las neurotrofinas».

Claims

REIVINDICACIONES

1. Protefna de fusion (NBP)-Fc de union a neurotrofina p75NTR, comprendiendo:

(a) una porcion p75NTR(NBP); y

(b) una porcion Fc de inmunoglobulina

donde las porciones p75NTR(NBP) y Fc estan conectadas por medio de un conector

comprendiendo un peptido de formula Gx, donde x es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 y donde el conector no comprende ni consta de la secuencia GGGGS.

2. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con la reivindic 1a,c dióonnde la p75NTR(NBP) es una p75NTR(NBP) humana.

3. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la Fc es una Fc humana.

4. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier reivindic aancteiórionr, comprendiendo o constando de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 3.

5. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo o constando de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID N.° 15.

6. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier reivi anndteicriaorci dóonnde la p75NTR(NBP) se une a cualquiera de NGF, BDNF, NT3 o NT4/5 con una afinidad de union (Kd) de entre aproximadamente 0,01 nM y aproximadamente 50 nM, medida mediante resonancia de plasmones superficiales a 20 °C.

7. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquier reivindic aantceiróionr para su uso en el tratamiento del dolor.

8. Molecula de acido nucleico que codifica la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, opcionalmente comprendiendo, ademas, la codificacion de una secuencia senal.

9. Vector de expresion replicable para la transfeccion de una celula, opcionalmente una celula de mamffero, comprendiendo el vector la molecula de acido nucleico la reivindicació 8.n según

10. Vector de expresion replicable la reivindicaci soengú 9n donde el vector es un vector viral.

11. Celula huesped que acoge la molecula de acido nucleico la reivindicac 8i.ón según

12. Molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindica 8c oió vnector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10 para su uso en el tratamiento del dolor.

13. Protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la reivindicacion 7 o acido nucleico o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc o la molecula de acido nucleico o el vector se utiliza de forma separada, secuencial o simultanea en una combinacion combinado con un segundo compuesto farmacologicamente activo.

14. Composicion farmaceutica, comprendiendo la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o l raeivindicación 7 o s leag múnolecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 12, y un portador y/o un excipiente farmaceuticamente aceptable.

15. Kit comprendiendo:

(a) la protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o segun la reivindicación 7 o la molecula de acido nucleico o el vector de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 12; y (b) instrucciones para la administracion de una cantidad efectiva de dicha protefna de fusion p75NTR(NBP)-Fc, molecula de acido nucleico, vector o composicion farmaceutica a un individuo para uno o mas de la prevencion o el tratamiento del dolor o para mejorar, controlar, reducir la incidencia o retrasar el desarrollo o la evolucion del dolor.