KR102158730B1 - 세포 피막화용 알지네이트 미세캡슐 및 이의 제조방법 - Google Patents

세포 피막화용 알지네이트 미세캡슐 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코어가 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인, 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐 및 이의 제조방법, 이를 이용한 세포 피막화 방법에 관한 것이다.

Description

세포 피막화용 알지네이트 미세캡슐 및 이의 제조방법{Alginate microcapsules for cell membrane formation and a method for producing the same}
본 발명은 표면 개질 알지네이트 미세캡슐, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 피막화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포 이식에서 외부 환경으로부터 세포를 보호하기 위해 세포 피막화에 사용될 수 있고, 세포 생존능이 개선된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 피막화 방법에 관한 것이다.
알지네이트는 생체 적합성이 뛰어나고 생체 불활성이기 때문에 조직 공학, 세포 치료, 인공 장기 제작 등의 다양한 분야에서 생체 재료로서 활용되고 있다.
제1형 당뇨병의 치료에서 췌도 세포 이식(islet cell transplantation)은 효과적인 치료법으로 제시되었다. 그러나, 동종 이식은 수요에 비해 공급이 매우 부족하기 때문에, 이종 이식이 요구된다. 이종 이식은 이식 대상의 면역반응에 의해 이식된 세포가 파괴될 수 있기 때문에 이를 억제하는 것이 중요하다. 이식될 이종 세포를 보호하기 위하여 생체 재료를 이용한 피막화에 관한 연구가 진행되었으며, 알지네이트는 당뇨 치료를 위한 췌도 세포 이식(islet cell transplantation)에서 췌도가 면역반응에 노출되는 것을 막기 위한 피막화 재료로 제시되었다[Desai et al. Nature reviews Drug discovery 16.5 (2017), 338].
췌도 피막화에 사용된 대표적인 재료는 알지네이트 하이드로겔이다. 알지네이트 하이드로겔은 알긴산나트륨을 Ca2+와 같은 2가 양이온을 사용하여 가교시킴으로서 빠르고, 용이하게 제조될 수 있다. 그러나, Na+과 같은 1가 양이온이 다량 존재하는 환경에서는 1가 양이온이 가교에 사용된 2가 양이온과 교환되어 하이드로겔을 용액 상태로 졸-겔 상전이(sol-gel phase transition)될 수 있다. 한편, 체내는 Na+가 다량 존재하는 환경이다. 따라서, 체내 이식 시, 피막화에 사용된 알지네이트 하이드로겔은 Ca2+가 체내의 Na+와 교환되거나 또는 자연적으로 확산(diffusion)되기 때문에 체내에서 점차적으로 융해되는 문제가 있다. 이러한 융해는 미세캡슐의 수명을 단축시키고, 내부 세포를 외부 면역체계로부터 보호하지 못하는 원인이 되므로 미세캡슐화 췌도 상용화에 있어서 한계로 작용한다. 뿐만 아니라 형성된 하이드로겔은 세포가 완전히 생착되는 것을 방해하여 세포에 저산소증(hypoxia) 등을 유발시킨다. 뿐만 아니라 캡슐 자체의 부피에 비해 산소 또는 영양소의 확산량이 적다는 한계가 있다.
이러한 한계점을 극복하기 위하여 최근에는 Ca2+에 비의존적으로 하이드로젤을 형성하는 알지네이트(alginate) 접합체, 중공 캡슐(hollow capsule), 표면개질 세포(surface modified cell) 등에 대한 개발에 많은 연구가 진행되고 있다. Ca2+에 비의존적으로 하이드로젤을 형성하는 알지네이트(alginate) 접합체로 알지네이트-도파민 접합체 및 히알루론산(hyaluronic acid)-EGCG 접합체가 개발되었다. 알지네이트-도파민 접합체의 경우, 도파민(dopamine)의 산화에 의해 서로 결합시킬 수 있으나, 결합에 H2O2 와 HRP 효소가 필요하며, 결합이 강하지 않고, 항-증식 효과(antiproliferative effect), 라디칼 소거능(radical scavenging)과 같은 기능성이 다소 떨어지는 한계가 있다. 히알루론산(hyaluronic acid)-EGCG 접합체의 경우, 히알루론산이 체내에서 자연적으로 분해가 일어날 수 있는 물질이기 때문에, 제조된 접합체가 생체 내에서 분해될 수 있으며, ECGC 결합에 의한 하이드로겔 형성 반응은 속도가 느리며, 물성이 강하지 못하므로 미세피막화에 적용하기 어렵다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 세포 피막화용 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 제공하는 데에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 세포 피막화용 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 상기 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 이용한 세포 피막화 방법을 제공하는 데에 있다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 코어가 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인, 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체의 일부는 다른 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화에 의해 서로 결합된 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 쉘은 알지네이트 코팅층을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 알지네이트 코팅층은 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 함께 아마이드 결합을 형성한 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 쉘은 3차원 적으로 연결된 다수 개의 중공을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 코어는 액상의 알지네이트 또는 액상의 알지네이트와 알지네이트 하이드로겔의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 미세캡슐은 세포 피막용일 수 있으며, 바람직하게는 췌도 세포 피막화용일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 칼슘-알지네이트 미세캡슐을 제조하는 코어 제조 단계; (2) 칼슘-알지네이트 미세캡슐 및 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체를 반응시켜 상기 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면을 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물이 형성시키는 쉘 제조 단계; 및 (3) 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트 시키는 코어 액화 단계;를 포함하고, 상기 코어는 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 세포를 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐로 피막화하는 코어 제조단계; (b) 세포를 피막화한 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 반응시켜, 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면에 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물을 형성시키는 쉘 제조단계; 및 (c) 상기 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트 시켜, 상기 세포 주변의 하이드로겔을 액화시키는 단계;를 포함하는 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 이용한 세포 피막화 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 세포는 생체 내에 이식을 위한 세포일 수 있으며, 바람직하게는 췌도 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 알지네이트 미세캡슐은 EGCG의 산화에 의해 알지네이트를 가교할 수 있으므로, Ca2+ 비의존적으로 하이드로겔을 형성할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 알지네이트 미세캡슐은 EGCG가 알지네이트 하이드로겔의 Ca2+를 킬레이트 함으로써 생체 내에서 하이드로겔이 쉽게 분해되는 문제를 해결하였고, 내부 알지네이트 코어가 부분적으로 용해되기 때문에 산소 또는 영양소가 확산되어 내부의 피막화 세포에 전달되기 용이하여 세포 생존도를 향상시킬 뿐만 아니라 물성이 우수하고, 생체 내에서 쉽게 분해되는 문제를 해결하였다. 따라서 외부의 물리적 자극으로부터 내부 세포를 보호하는 성능이 향상되었으며, 면역반응을 최소화시켰다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 에키갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 이합체를 고성능 액체크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 이합체를 질량분석기로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따라 EGCG 이합체 99mg을 사용하여 제조된 알지네이트-EGCG(di) 접합체의 칼슘 이온(Ca2+) 비의존성 하이드로겔 형성 유무를 시간의 흐름에 따라 확인한 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 알지네이트-EGCG(di) 접합체의 유변학적 물성 측정 결과이다.
도 5는 본 발명에 따라 EGCG 이합체 4mg을 사용하여 제조된 알지네이트-EGCG(di) 접합체의 칼슘 이온(Ca2+) 비의존성 하이드로겔 형성 유무를 시간의 흐름에 따라 확인한 것이다.
도 6은 본 발명의 비교예 3에 따른 알지네이트-EGCG(di) 미세캡슐 제조결과이다.
도 7은 본 발명의 비교예 4에 따른 알지네이트/알지네이트-EGCG(di) 미세캡슐 제조결과이다.
도 8은 비교예 1 및 비교예 4에 따른 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제로 5분간 처리하여 분해도를 평가한 것이다(a: 비교예 1, b: 비교예 4).
도 9는 본 발명의 반응 시간에 따른 실시예 1의 미세캡슐 제조 결과이다.
도 10은 HRP 처리 유무, 다양한 반응시간 및 EGCG 이합체 농도에 따른 실시예 1의 미세캡슐 제조 결과이다.
도 11는 HRP 처리 유무에 따른 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 색 변화를 확인한 결과이다(좌:HRP 첨가 X, 우:HRP 첨가 O).
도 12는 ECGC가 결합된 알지네이트 비드, 알지네이트 비드 및 알지네이트-EGCG 비드를 HRP 첨가 여부 및 AC 알지네이트 코팅 여부에 따라 구별한 것이다.
도 13은 비교예 1, 실시예 1, 실시예 2의 미세캡슐의 주사전자현미경(SEM)이미지이다.
도 14는 ECGC가 결합된 알지네이트 비드에 HRP를 첨가하지 않은 미세캡슐(왼쪽) HRP를 첨가한 미세캡슐(오른쪽)의 광학 현미경 이미지이다.
도 15는 췌도를 실시예 1 또는 2에 따른 표면 개질 알지네이트 미세캡슐로 피막화하는 과정을 모식화하여 나타낸 것이다.
도 16은 비교예 1의 칼슘-알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제로 알려진 EDTA (100 mM)를 20분간 처리하고, 형태 변화를 확인한 것이다.
도 17은 실시예 1의 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제로 알려진 EDTA (100 mM)를 10분 또는 20분간 처리하고, 형태 변화를 확인한 것이다.
도 18은 비교예 1, 비교예 3 및 실시예 1에 따른 미세캡슐의 리올로지(Rheology) 측정결과이다.
도 19는 비교예 1, 비교예 3 및 실시예 1에 따른 미세캡슐의 점탄성 측정 결과이다. (a) 비교예 1, (b) 비교예3, (c) 실시예 1, HRP 첨가 O, (d) 실시예 1, HRP 첨가 X.
도 20은 실시예 1에 따른 미세캡슐의 제조된지 2주 후의 점탄성 측정 결과이다. (a) HRP 첨가 O, (b) HRP 첨가 X.
도 21은 비교예 1, 비교예 3 및 실시예 1에 따른 미세캡슐의 점탄성을 측정한 결과를 도시한 것이다.
도 22의 상단은 HRP 미첨가된 췌도 캡슐화 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 광학현미경 이미지이며, 도 22의 하단은 HRP 첨가된 췌도 캡슐화 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 광학현미경 이미지이다.
도 23은 EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 분해 저항성을 농도별로 구별하여 광학 현미경 이미지로 나타낸 것이다.
도 24는 EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 외부 EGCG 층 형성 여부를 광학현미경으로 확인한 것이다.
도 25는 미세캡슐 내부의 췌도에 대한 인슐린 분비능을 그래프로 나타낸 것이다.
도 26은 EGCG가 84mg 사용되었을 때의 표면 개질 미세캡슐 내의 췌도의 혈중 당 농도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 27은 알지네이트 미세캡슐 및 표면개질 알지네이트 미세캡슐의 혈중 당 농도 및 중량을 그래프로 나타낸 것이다.
도 28은 표면개질 미세캡슐화 췌도 및 알지네이트 미세 캡슐화 췌도의 형태를 광학현미경으로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 코어가 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인, 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 코어는 유동상일 수 있으며, 상기 유동상은 액상 또는 액상과 하이드로겔의 혼합물일 수 있다. 상기 코어가 유동상이면 산소 및 물질을 내부의 세포에 용이하게 전달할 수 있고, 세포 생존능을 향상시킬 수 있으므로 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체는 에피갈로카테킨 단량체의 6, 8 탄소가 알데히드와 반응하여 형성된 것일 수 있다. 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체는 8-8 이성질체, 6-8 이성질체(2 종류) 및 6-6 이성질체 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 이들 4종의 혼합물 일 수 있다.
상기 에피갈로카테킨 갈레이트 8-8 이합체는 하기 화학식 1에 정의된 바와 같다.
[화학식 1]
Figure 112019033869351-pat00001
상기 한 쌍의 에피갈로카테킨 갈레이트 6-8 이합체 하기 화학식 2 및 3에 정의된 바와 같다.
[화학식 2]
Figure 112019033869351-pat00002
[화학식 3]
Figure 112019033869351-pat00003
상기 에피갈로카테킨 갈레이트 6-6 이합체는 하기 화학식 4에 정의된 바와 같다.
[화학식 4]
Figure 112019033869351-pat00004
본 발명에 의하면, 상기 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체의 일부는 다른 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화에 의해 서로 결합된 것일 수 있다. 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체들 간의 산화 결합은 쉘을 두껍게 형성시키기 위한 것일 수 있다. 상기 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체들 간의 산화 결합은 본 발명에 따른 미세캡슐의 물리적 특성을 향상시켜 피막화하는 세포를 물리적 충격으로부터 보호하는데 효과적일 수 있다. 산화 결합된 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체를 하기 화학식 5에 나타내었다.
[화학식 5]
Figure 112019033869351-pat00005
본 발명에 의하면, 상기 쉘은 알지네이트 코팅층을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 알지네이트 코팅층은 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 함께 아마이드 결합을 형성한 것일 수 있다.
상기 화학식 5에 나타낸 바와 같이, 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체는 아민기를 포함하므로 양전하성을 나타낸다. 종래의 연구에 따르면, 양전하성 생체 재료는 중성 또는 음전하성 생체 재료에 비하여 면역 반응 및 염증이 많이 유발될 수 있다. 상기 알지네이트 코팅층은 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체의 상기 아민기와 알지네이트의 -COOH기가 아마이드 결합을 형성하고 있으므로 양전하성을 나타내지 않도록 하므로 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 쉘은 3차원 적으로 연결된 다수 개의 중공을 포함하는 것일 수 있다. 상기 중공은 산소 및 물질을 내부의 세포에 용이하게 전달할 수 있어서 바람직하다. 상기 중공은 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 표면개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제로 처리함으로써 용이하게 형성시킬 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 미세캡슐은 세포 피막용일 수 있다. 상기 세포의 종류는 제한이 없으며, 생체 내 이식을 위한 세포일 수 있고, 바람직하게는 췌도 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "췌도"란 랑게르한스섬(Langerhans islets)을 의미하며, 췌도 이식은 제1형 당뇨병의 개선을 위한 실용적인 치료법이다. 이는 췌도가 인슐린을 분비하는 베타 세포를 포함하고 있기 때문에 췌도의 이식을통해 인슐린 의존형인 제1형 당뇨병을 치료할 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명은 (1) 칼슘-알지네이트 미세캡슐을 제조하는 코어 제조 단계; (2) 칼슘-알지네이트 미세캡슐 및 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체를 반응시켜 상기 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면을 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물이 형성시키는 쉘 제조 단계; 및 (3) 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트 시키는 코어 액화 단계;를 포함하고, 상기 코어는 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조방법을 제공한다.
먼저 칼슘-알지네이트 미세캡슐을 제조한다.
다음으로, 칼슘-알지네이트 미세캡슐 및 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체를 반응시킨다. 상기 반응으로 칼슘-알지네이트 하이드로겔의 알지네이트는 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 의해 가교되면서 외각(쉘)으로 하이드로겔을 형성하게 되고, 내부의 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온 일부 또는 전부는 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트 된다. 칼슘 이온이 전부 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트되는 경우, 내부는 알지네이트가 액상으로 바뀌며, 칼슘 이온이 일부 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트되는 경우, 내부는 액상의 알지네이트와 칼슘-알지네이트 하이드로겔이 공존하면서 유동상의 슬러리를 형성한다.
상기 미세캡슐은 췌도 세포를 포함하는 췌도 세포 캡슐일 수 있다.
본 발명에서 용어 "췌도 세포 캡슐"이란 췌도 세포를 생체적합성 고분자로 둘러싸서 캡슐의 형태를 형성하는 것을 의미한다. 이와 같은 췌도 세포 캡슐은 면역세포의 투과를 방지하여 이종 개체로부터 분리된 췌도 또는 동종 개체로부터 분리된 췌도에 의해 일어나는 면역 거부 반응을 억제할 수 있도록 한다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 산화는 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체의 산화에 통상적으로 사용되는 방법이면 특별히 제한은 없으나, 기질을 탈수소화하는 촉매반응에 관여하는 HRP(horseradish peroxidase) 효소가 보다 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 코팅은 순수 알지네이트 용액을 첨가하여 반응시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 칼슘 이온 킬레이트제는 예를 들어 EDTA일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 세포를 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐로 피막화하는 코어 제조단계; (b) 세포를 피막화한 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 반응시켜, 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면에 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물을 형성시키는 쉘 제조단계; 및 (c) 상기 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트시켜, 상기 세포 주변의 하이드로겔을 액화시키는 단계;를 포함하는 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 이용한 세포 피막화 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 세포는 생체 내에 이식을 위한 세포일 수 있으며, 바람직하게는 췌도 세포일 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 미세캡슐 제조에 사용되는 에피갈로카테킨 갈레이트의 농도는 알지네이트 5mg당 바람직하게는 42mg 내지 167mg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 63 내지 167mg일 수 있으며, 보다 더욱 바람직하게는 84 내지 167mg 일 수 있다. 본 발명에 의하면 가장 바람직한 일 구현예는 알지네이트 5mg당 에피갈로카테킨 갈레이트의 농도가 84mg인 것이다.
본 발명의 하나의 양태로서, 본 발명은 당뇨병의 예방 또는 치료에 사용하기 위하여 상기 췌도 세포 캡슐을 포함하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다.
상기 당뇨병 치료는 바람직하게 상기 캡슐을 생체에 이식하여 수행할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 췌도 세포 캡슐의 생존능이 높고, 글루코스에 반응하는 인슐린 분비능이 높으며, 대사물질은 투과시키지만 면역세포는 투과시키지 않는 것을 확인하여 면역 억제제의 투여가 없이도, 작은 부위에 이식하여 인슐린을 분비하여 당뇨병을 치료할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "치료"란 본 발명의 췌도 세포 캡슐을 포함하는 조성물 투여에 의해 당뇨병 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 상기 당뇨병 치료는 당뇨병이 발생할 수 있는 임의의 포유 동물에적용이 가능하며, 그 예로 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등 가축을 제한없이 포함하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐은 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 이식할 수 있으며, 이식 부위로는 복강, 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액 등이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐은 면역억제제의 투여가 없어도 되나, 바람직하게는 면역억제제 또는 항염증제와 조합하여 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 상기 면역억제제는 시클로스포린(cyclosporine), 시롤리무스(sirolimus), 라파마이신(rapamycin) 및 오르타크롤리무스(ortacrolimus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항염증제는 아스피린, 이부프로펜, 스테로이드 및 비스테로이성 항염증제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 면역억제제 또는 항염증제는 췌도 캡슐의 이식 후 6개월 동안, 바람직하게는 1개월 동안 투여되는 것이 좋다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 캡슐의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명에 따른 췌도 세포 캡슐을 수여자에게 이식하기 위해서는, 이식되는 췌도 캡슐의 양은 마우스의 경우 4,000 내지 10,000 IEQ/kg, 비인간영장류의 경우 10,000 내지 15,000 IEQ/kg가 바람직하며, 공여자의 종류, 성별 및 췌장 상태, 수여자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 당뇨병이 걸린 개체 또는 당뇨병에 걸릴 위험이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용한 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 조성물은 표적 부위로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 당뇨병의 예방 또는 치료용 약제를 생산하기 위하여 상기 미세캡슐을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다.
실시예
합성예 1. 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 이합체 제조
2,2-디에톡시에틸아민(2,2-diethoxyethylamine, DA)은 산성 환경에서 알데히드로 존재한다. 메탄술폰산(methanesulfonic acid, MSA) 하에서 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)와 DA를 반응시켜, 알데히드 매개 중합반응을 시켜 EGCG 이합체를 제조하였다.
구체적으로, 10 ml 바이알에 테트라히드로퓨란 3.8 ml 및 메탄술폰산 7 μl를 혼합한 뒤, 암실 조건 및 질소 기류하에서 EGCG 2.29 g(5 mmol)을 첨가한 후, 1 내지 2시간 동안 교반하였다. 다음으로, 냉각시킨 10 ml 바이알에 테트라히드로퓨란 1 ml 및 메탄술폰산 0.2 ml의 혼합 용매에 2,2-디에톡시에틸아민 145 μl를 첨가하여 20분 내지 30분간 교반하여, 2,2-디에톡시에틸아민의 에톡시기를 제거하고, 알데히드기를 노출시켰다. 에톡시기가 제거된 2,2-디에톡시에틸아민의 용액을 먼저 제조한 EGCG 용액에 천천히 적가(drop wise)하고, 상온의 암실 조건에서 일야(overnight) 반응하였다. 반응 종료 후, 반응 혼합물을 플라스크에 옮기긴 뒤, 감압하여 용매를 제거하고, 다음으로 플라스크 내부를 질소 기류로 만든 뒤, 밀폐하였다. 암조건 하에서 상기 밀폐한 용기에 실린지를 이용하여 탈이온수 10 ml을 첨가하고 교반하였다. 반응 종료 후, 암 조건하에서 반응 혼합물에 에틸아세테이트 및 증류수를 첨가하고, 분별 깔대기를 사용하여 유기층 및 물층으로 분리하였다. 물층을 급속냉동 후, 동결건조하여 목적하는 EGCG 이합체를 얻었다. 제조된 EGCG 이합체는 사용하기 전에 초저온 냉동고에 보관하였다.
하기 반응식 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 6, 8 탄소가 알데히드와 반응하여 이합체를 형성한다. 이때, 결합 양상에 따라 제조된 EGCG 이합체는 8-8 이성질체, 6-8 이성질체(2 종류) 및 6-6 이성질체의 혼합물로 얻어진다. 이를 확인하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량분석기(Mass spectrometry)를 사용하여 제조된 EGCG 이합체를 분석하였다. 도 1은 HPLC 결과이고, 도 2는 질량분석 결과이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 4 종류의 EGCG 이합체의 합성이 관찰되었다. 한편, EGCG 이합체가 정상적으로 합성되지 못하고, 응집체가 형성되는 경우에는 6~6.4분대에서 피크가 나타났다.
HRMS-ESI: C46H40NO22 [M+H]+ 계산값 958.2036, 실험값 958.2062
[반응식 1]
Figure 112019033869351-pat00006
합성예 2. 알지네이트-EGCG 접합체의 제조
반응식 2의 방법으로 카보디이미드 매개 커플링 반응을 이용하여 카복실산기를 갖는 고분자에 EGCG 이합체를 접합시킨다. 알지네이트(Alginate)를 N-히드록시숙신이미드(NHS), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드(EDC) 존재 하의 산성 조건(pH 4.7)에서 EGCG 이합체와 밤새 반응시켜, EGCG의 아민기와 HA의 카복실산이 아마이드 결합된 아마이드 결합시켜 알지네이트-EGCG 접합체를 제조한다.
[반응식 2]
Figure 112019033869351-pat00007
구체적으로, 암실 조건에서, 3구 플라스크에 0.4 M MES 완충액(pH 5.2) 20.2 ml 및 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 2.5 ml의 혼합용액에 알지네이트 202 mg을 첨가하고, 교반하였다. 알지네이트가 완용되면, 플라스크 내부를 질소 분위기로 교체하고 밀폐하였다. 0.4 M MES 완충액(pH 5.2) 3 ml에 NHS 89 mg (0.78 mmol)을 용해시킨 뒤, 실린지를 이용하여 첨가하였다. 탈이온수 2.33 ml에 상기 합성예 1에서 제조한 EGCG 이합체 4 mg (0.082 mol)을 용해시킨 뒤, 실린지를 이용하여 첨가하였다. 다음으로, 0.4 M MES 완충액(pH 5.2) 3 ml에 EDC 66 mg (0.78 mmol)을 용해시킨 후, 실린지를 이용하여 첨가하였다. 모든 반응은 질소 분위기 하의 암실 조건에서 교반시켰다.
다음으로, 반응 혼합물을 에탄올 침전법으로 침전시키고, 미반응물(EDC, NHS, 미반응 EGCG 이합체)를 제거하였다. 구체적으로 질소 분위기 하에서, 탈이온수 125 ml에 반응 혼합물을 용해시키고, 5M 염화나트륨 수용액 16.7 ml을 첨가한 뒤, pH를 3으로 조정하였다. 에탄올 310 ml를 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리용 용기에 옮겨 담고, 초원심분리(ultracentrifugation)하여 침전시켰다. 상층액을 제거하고, 침전물을 탈이온수 250 ml에 용해시키고, 5M 염화나트륨 수용액 33 ml을 첨가한 뒤, pH를 3으로 조정하였다. 에탄올 620 ml을 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리용 용기에 옮겨 담고, 초원심분리(ultracentrifugation)하여 침전시켰다. 상층액을 제거하고, 침전물을 500 ml에 용해시키고, 5M 염화나트륨 수용액 67 ml을 첨가한 뒤, pH를 3으로 조정하였다. 에탄올 1,240 ml을 첨가한 다음, 혼합물을 원심분리용 용기에 옮겨 담고, 초원심분리(ultracentrifugation)하여 침전시켰다. 상층액을 제거하고, 침전물을 탈이온수 300 ml에 용해시켰다.
얻어진 용해물을 350 Da 투석막을 사용하여, 질소 분위기 하에서 24시간 투석하였다. 투석된 용액을 급냉시키고, 동결건조하여 목적하는 알지네이트-EGCG(di) 접합체를 얻었다. 제조된 알지네이트-EGCG(di) 접합체는 사용하기 전에 초저온 냉동고에 보관하였다.
합성예 3. EGCG 이합체의 산화
EGCG는 크게 두 가지 방향으로 변성될 수 있으며, 그중 하나는 산화이고, 다른 하나는 에피머화이다. 상기 변성은 EGCG의 농도, pH, 온도 및 산소 분압 등의 여러 조건에 따라 그 양상과 속도가 달라진다. EGCG가 마이크로몰 농도 수준으로 존재하는 경우에는 빠르게 산화가 진행되며, 미리몰 농도 수준으로 존재하는 경우에는 각각의 EGCG 분자들이 서로 산화를 억제함으로써 산화 속도가 느려지게 된다. 또한, EGCG는 pH 2 내지 5.5의 약산성 조건에서는 산화가 억제되고, 에피머화가 진행되나, 강산 또는 염기성 조건에서는 산화가 빠르게 진행되며, 50℃ 이상의 온도조건에서는 EGCG의 에피머화가 일어나지만, 그보다 낮은 온도에서는 산화가 진행된다. 특히, 극저온 조건하에서는 EGCG의 변성이 매우 느리게 진행됨이 확인되었다. 한편, 산소 분압이 낮을수록 EGCG의 산화가 억제되고, 에피머화가 진행되며, pH 또는 농도 조건이 갖추어지지 않은 환경의 EGCG는 공기 중에 노출될 경우 빠르게 산화가 일어나 응집체가 형성될 수 있다.
따라서, 응집체가 형성되지 않는 EGCG 이합체의 산화를 위해서 EGCG의 농도, pH, 온도 및 산소 분압의 조절을 수행하였다.
알지네이트-EGCG(di) 접합체의 산화를 하기에 나타내었다.
Figure 112019033869351-pat00008
제조예
알지네이트 대 EGCG 이합체의 비율 확립
알지네이트-EGCG 접합체의 하이드로겔 형성 여부 확인
최적화된 세포 피막용 미세캡슐을 제조하기 위해서는 알지네이트-EGCG 접합체가 공기 중에 노출되어도 겔화가 진행되지 않고 용액상태로 존재해야 한다. 이를 확립하기 위해서 알지네이트에 접합되는 EGCG의 종류 및 양을 변화시키면서 알지네이트 대비 EGCG의 양을 최적화하였다.
1. EGCG 단량체 사용
종래 방법에 따라 EGCG 단량체 202 mg을 사용하여 알지네이트에 접합시켰다. 알지네이트에 EGCG가 다량 접합되었으나, 효소가 없는 환경에서도 공기에 노출되었을 때 빠르게 겔화되었다.
2. ECGC 이합체 9 내지 99 mg 사용
EGCG 이합체 99 mg을 사용하여 합성예 2의 방법으로 알지네이트-EGCG 접합체를 제조하였다. 그러나, 도 3에 나타낸 바와 같이, 접합체는 공기 중의 산소에 노출되어 즉시 하이드로겔을 형성하였다. 형성된 하이드로겔의 유변학적 물성을 측정하였으며, 이를 도 4에 나타내었다. 형성된 하이드로겔의 물성은 미세 캡슐에 적용 가능한 수준이었지만, 공기에 노출되는 즉시, 겔화가 일어나므로 미세캡슐의 공정에 적용하기는 어려웠다. 따라서 알지네이트에 접합되는 EGCG 이합체의 양을 줄일 필요성이 있었다.
3. ECGC 이합체 4 mg 사용
EGCG 이합체 4 mg을 사용하여 합성예 2의 방법으로 알지네이트-EGCG 접합체를 제조하였다. 제조된 접합체는 공기 중에서 겔화되지 않았다. 이를 하기 도 5에 나타내었다.
미세캡슐의 제조
비교예 1. 칼슘-알지네이트 캡슐 제조
알려진 제조방법에 따라 칼슘-알지네이트 캡슐을 제조하였다.
비교예 2. 알지네이트-EGCG(mono) 미세캡슐 제조
EGCG 단량체 202 mg을 사용하여 알지네이트-EGCG(mono) 미세캡슐을 제조하였다.
비교예 3. 알지네이트-EGCG(di) 미세캡슐 제조
EGCG 이합체 4 mg 사용하여 제조된 알지네이트-EGCG(di) 접합체를 이용하여 미세캡슐을 제조하였다. 캡슐 제조시 칼슘 이온의 농도는 100 mM 또는 1M이었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 캡슐이 제대로 형성되지 않았다. 캡슐화 공정 중에서 이러한 형태는 일반적으로 알지네이트의 농도가 적정 범위를 벗어나거나 칼슘 이온의 농도가 낮을 때 나타난다. 본 발명에서는 EGCG의 항산화 특성이 칼슘 이온 매개된 알지네이트 가교를 저해하는 것으로 파악하였다. 일반적으로 EGCG와 같은 카테킨은 금속 양이온과 결합 및 킬레이트 할 수 있다. 반응물 내 존재하던 소량의 칼슘 이온이 EGCG와 결합하여 EGCG의 구조를 변화시키고, EGCG의 항산화능을 감소시키는 것으로 예측된다.
비교예 4. 알지네이트/알지네이트-EGCG(di) 미세캡슐 제조
EGCG에 의한 가교 저해 문제를 해소하기 위해서, 순수 알지네이트 용액과 알지네이트-EGCG(di) 접합체를 혼합한 혼합물을 사용하여 캡슐화를 수행하였다. 반응은 EGCG의 산화를 방지하기 위하여, 질소 분위기 하의 암실 조건에서 실시하였다.
먼저, 알지네이트 대 알지네이트-EGCG 접합체의 혼합비의 최적화를 위해, 알지네이트 대 알지네이트-EGCG 접합체의 혼합비가 각각 1:1, 2:1 및 3:1 중량부인 혼합물을 제조하여 캡슐화하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 알지네이트-EGCG 접합체 1 중량부에 대하여 알지네이트의 혼합비가 2 중량부 이상인 경우에서 정상적으로 미세캡슐이 형성되었다.
칼슘 이온 의존성 및 분해도 평가
비교예 1 및 비교예 4(알지네이트 및 알지네이트-EGCG 접합체의 혼합 미세캡슐)에 따라 제조된 미세캡슐의 칼슘 이온 의존성 및 분해도를 평가하였다. 구체적으로 칼슘이온 킬레이트제인 EDTA로 처리한 뒤, 미세캡슐의 형태를 확인하였으며, 이를 도 8에 나타내었다.
비교예 4의 미세캡슐은 비교예 1의 미세캡슐에 비해 칼슘 이온 킬레이트제에 저항성을 갖는 것이 확인되었다. 그러나, 분해도는 큰 차이를 나타내지 않는 것으로 나타나, 분해도 개선효과가 크지 않은 것으로 확인되었다. 한편, HRP 효소를 처리한 경우, 비교예 4의 미세캡슐은 비교예 1의 미세캡슐에 비해 빠르게 분해되었는데, 이는 잔존한 HRP의 EDTA 촉매 작용에 의한 것으로 판단되었다.
실시예 1. 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조
칼슘-알지네이트 미세캡슐을 EGCG 이합체로 표면개질 하였다. 최적화를 위해 다양한 반응 시간, EGCG 이합체의 농도 및 산화 처리 유무의 조건으로 미세캡슐을 제조하였다.
반응 시간
겔화 경향을 증가시키지 않으면서 EGCG의 접합량을 증가시키기 위해서 칼슘-알지네이트 캡슐을 제조한 뒤, EGCG 이합체를 접합시켰다.
알려진 방법으로 칼슘-알지네이트 캡슐을 제조하였다. 제조된 캡슐을 HEPES 완충액(pH 7.4)로 4회 세척하고, 다음으로 MES 완충액(pH 6.0)으로 2회 세척하였고, MES 완충액 50 ml에 세척된 캡슐을 보관하였다. 암실 조건 하에서, 캡슐이 존재하는 MES 완충액에 MES 완충액 2 ml에 용해시킨 NHS 40 mg(0.347 mmol)을 첨가하여 교반하였다. 다음으로 EGCG 이합체를 여러 농도(0.347 mmol 및 0.174 mmol)로 첨가하여 교반하였다. 다음으로 MES 완충액 2 ml에 용해시킨 EDC 66 mg(0.0347 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 시간대 별(10분, 20분, 30분 및 60분)로 확인하여 표면 개질 상태를 체크하였다. 모든 반응은 암실 조건하에서 수행되었다.
또한, 산화처리에 의한 영향을 확인하기 위해 반응 시간 0분에서 HRP 1 U/ml을 첨가하고 30분간 교반하였다.
이때 반응에 사용된 EDC, NHS의 양은 알지네이트의 단위체 몰수를 기준으로 몰수 비가 EDC:NHS:알지네이트 =1:1:1이 되도록 처리하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 반응시간 10분, 20분, 30분 및 60분에서 모두 알지네이트 캡슐의 표면 개질이 정상적으로 이루어졌다. 반응시간이 증가할수록 EGCG의 응집이 더 많이 형성되었으며, 미세캡슐 표면에 접합된 EGCG 이합체에 다른 EGCG 이합체가 결합되고, EGCG가 미세캡슐 내부로 침투된 형태를 갖는 것이 관찰되었다.
추가 실험에서는 세포 손상을 최소화하기 위해서, 반응시간은 10 분 내지 20분으로 설정하여 실시하였다.
반응시간, EGCG 이합체 농도 및 HRP 처리
미세캡슐을 HRP 처리 유무, 다양한 반응시간 및 EGCG 이합체 농도로 개질하였으며, 이의 이미지를 도 10에 나타내었다.
EGCG의 결합도는 반응시간 보다는 처리된 EGCG 이합체의 농도에 더 큰 영향을 받는 것으로 확인되었다.
또한, 광학 현미경으로는 산화 여부가 유의적으로 관측되지 않았으나, 육안으로는 색 변화를 통해 용이하게 관측되었다. 도 11 및 도 12는 HRP 처리 유무에 따른 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 색 변화를 확인한 결과이다. 도 11은 좌측은 HRP 처리되지 않았고, 우측은 HRP 처리된 것이다. HRP에 의해 미세캡슐 표면의 EGCG는 산화됨에 따라 EGCG는 서로 응집되었으며, 붉은색으로 변하였다.
실시예 2. 표면 개질된 알지네이트 캡슐 제조 공정 및 알지네이트 코팅된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조
EGCG 이합체는 아민기를 포함한다. 알지네이트와 직접적으로 접합된 EGCG 이합체의 경우에는 아민기가 알지네이트와 아마이드 결합을 형성하므로 양으로 하전되지 않지만, EGCG 간 산화에 의해 결합된 EGCG 이합체의 경우에는 아민기를 가지고 있으므로 양전하성을 나타낸다. 종래의 연구에 따르면, 양전하성 생체 재료는 중성 또는 음전하성 생체 재료에 비하여 면역 반응 및 염증이 많이 유발된다.
불필요한 면역 반응의 발생을 막기 위해, 실시예 1의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 외부를 알지네이트로 코팅하였다.
알려진 방법으로 칼슘-알지네이트 캡슐을 제조하였다. 제조된 캡슐을 HEPES 완충액(pH 7.4)로 4회 세척하고, 다음으로 MES 완충액(pH 6.0)으로 2회 세척하였고, MES 완충액 50 ml에 세척된 캡슐을 보관하였다. 암실 조건 하에서, 캡슐이 존재하는 MES 완충액에 MES 완충액 2 ml에 용해시킨 NHS 40 mg(0.347 mmol)을 첨가하여 교반하였다. 다음으로 EGCG 이합체를 여러 농도(0.347 mmol 및 0.174 mmol)로 첨가하여 교반하였다. 다음으로 MES 완충액 2 ml에 용해시킨 EDC 66 mg(0.0347 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 시간대 별(10분, 20분, 30분 및 60분)로 확인하여 표면 개질 상태를 체크하였다. 모든 반응은 암실 조건하에서 수행하였다.
또한, 산화처리에 따른 영향을 확인하기 위하여, HRP 처리/비처리하였다.
실시예 3. EDTA 처리 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조
실시예 1 및 실시예 2의 미세캡슐을 100 mM EDTA로 처리(10분 및 20분)하여 미세캡슐에 중공을 형성시켰다.
시험예 1. 구조 분석
표면 분석
도 13은 비교예 1, 실시예 1, 실시예 2의 미세캡슐을 주사전자현미경(SEM)으로 관측한 것이다. SEM 이미지는 각각 ×70, ×10000, ×50000, ×100000 배율로 촬영하였다. 비교예 1과 비교하여 실시예 1의 미세캡슐은 표면에서 특이적 형태가 나타난 것이 관측되었다. 한편 실시예 2의 미세캡슐 표면에서는 실시예 1에서 보였던 것과 같은 특이적 형태가 사라진 것이 확인되었다. 이를 통해서 EGCG 이합체로 개질된 알지네이트 미세캡슐 표면이 알지네이트로 코팅된 것이 확인되었다.
내부 구조 분석
주사전자현미경(SEM)으로 실시예 1 및 실시예 2의 미세캡슐 내부 구조를 분석하였으며, 도 14에 나타내었다.
SEM 이미지를 통해서도 코어-쉘 구조가 형성되었음을 확인할 수 있다. 외막 두께의 경우 HRP 처리한 미세캡슐이 HRP 미처리한 미세캡슐보다 더 두껍게 형성되었으며, 기공 발달이 우수하였다.
도 15는 췌도를 실시예 1 또는 2에 따른 표면 개질 알지네이트 미세캡슐로 피막화하는 과정을 모식화하여 나타낸 것이다.
먼저, 췌도를 칼슘-알지네이트 미세캡슐로 피막화한다. 다음으로, 칼슘-알지네이트 미세캡슐의 표면에 EGCG 이합체를 접합시킨다. 알지네이트와 결합한 EGCG 이합체는 내부의 칼슘을 킬레이트 하기 때문에, 칼슘-알지네이트 하이드로겔은 용해된다. 이러한 과정을 통해 내부 알지네이트가 일부 용해되어 알지네이트 코어/알지네이트-EGCG 이합체 쉘 구조의 미세캡슐이 형성된다. 이때, 상기 칼슘-하이드로겔의 용해는 전부 또는 일부만 일어날 수 있다.
이러한 구조는 종래 기술에 따른 미세캡슐에 비해 산소 및 영양소의 확산이 용이하기 때문에 갭슐화한 췌도의 생존도를 향상시킬 수 있다.
칼슘 이온 의존성 및 분해도 평가
EGCG 이합체의 사용량, 반응시간 및 HRP 처리에 따른 비교예 1 및 실시예 1의 미세캡슐의 칼슘 이온 의존성 및 분해도를 평가하였다. 비교예 1 및 실시예 1의 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제로 알려진 EDTA (100 mM)를 처리하고, 형태 변화를 확인하였다.
도 16에 개시된 바와 같이, 비교예 1의 칼슘-알지네이트 미세캡슐은 100 mM EDTA로 20 분간 처리한 조건에서 완전 분해되어 용액 상태로 바뀌었다. 한편, 도 17에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 미세캡슐은 EDTA 처리에도 미세캡슐이 붕괴되지 않고, 형태가 유지되었다. 이는 본 발명에 따른 미세캡슐이 EDTA에 의한 칼슘 이온 킬레이트 작용에 저항성을 갖는다는 것을 의미한다. EDTA 처리는 오히려 실시예 1의 미세캡슐에 중공(hollow)을 형성시켰으며, 캡슐 내부로 물질 확산 및 산소 공급에 이점을 제공하는 것으로 확인되었다. 물성(물리적 손상에 대한 안정성)은 EDTA 비처리된 미세캡슐이 EDTA 처리된 미세캡슐보다 우수하였다.
한편, 미세캡슐 제조시 사용된 EGCG 이합체의 양이 많을수록, 반응시간이 길수록 분해도가 증가하는 경향을 나타내었지만, 유의적인 수준은 아니었다. 또한, HRP 처리된 실시예 1의 미세캡슐의 경우, 분해도가 증가하였는데, 이는 잔존하는 HRP가 EDTA의 활성을 증가시키는 것에서 기인한 것으로 보인다.
따라서, EDTA의 처리시간 및 처리농도를 조절하여 미세캡슐의 형태를 최적화함으로써 피막화된 췌도의 생존를 더욱 향상시키고, 물리적 손상으로부터 보호할 수 있다.
유변학적 특성 평가
비교예 1, 비교예 3 및 실시예 1에 따른 미세캡슐의 물성을 확인하기 위하여 유변학적 특성을 측정하였으며, 이를 하기 도 18 내지 도 21에 나타내었다.
도 18은 리올로지(Rheology) 측정결과이며, 도 19 내지 도 21은 점탄성 측정결과이다.
도 19를 참고하면, 비교예 1에 비해 비교예 3의 미세캡슐은 낮은 물성을 나타내었는데, 이는 EGCG의 칼슘 이온 킬레이트 작용에 의한 것으로 추정된다. 실시예 1의 미세캡슐은 HRP의 첨가 유무와 무관하게 비교예 1의 미세캡슐보다 높은 물성을 나타내었다. 한편, HRP 처리된 미세캡슐은 HRP 미처리된 미세캡슐보다 낮은 물성을 나타내었는데, 이는 HRP 처리에 의해 더 두꺼운 EGCG 쉘이 형성되었음에도 불구하고, HRP 처리에 의해 EGCG의 칼슘 이온 킬레이트 작용이 보다 활발하게 진행되어 코어의 물성이 감소된 것으로 예상된다.
실시예 1의 미세캡슐을 제조한 후 2주간 보관한 뒤, 점탄성 변화를 확인하였다(도 21). HRP 처리된 미세캡슐의 경우, 점탄성이 감소하였으나, HPR 처리된 미세캡슐은 점탄성이 대부분 유지되었다. 이는 HRP 처리된 미세캡슐은 코어의 알지네이트의 용해가 촉진되어 물성이 일부 감소되었지만, HRP을 통해 EGCG간 안정한 결합이 형성되었기 때문이다. 한편, HRP 미처리 미세캡슐의 경우에는 제조 시점에서는 완전히 용해되지 않았던 코어의 알지네이트에 의해 높은 물성이 나타났지만, 보관하는 동안 코어의 알지네이트가 용해되면서 물성의 감소가 일어난 것으로 추정되었다.
실시예 4. 췌도 캡슐화
실시예 1에 따른 미세캡슐 제조방법을 사용하여 췌도를 캡슐화하였다. 미세캡슐 제조시 HRP 처리 유무에 따른 특성을 광학현미경으로 확인하였으며, 이를 도 22에 나타내었다.
도 22의 상단은 HRP 미첨가된 췌도 캡슐화 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 광학현미경 이미지이며, 도 22의 하단은 HRP 첨가된 췌도 캡슐화 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 광학현미경 이미지이다. 코어의 알지네이트는 일부는 용액 형태로 용해되고, 일부는 하이드로겔 상태를 갖는 슬러리 형태로 관측되었다. 물리적 손상으로부터 세포를 보호하면서, 생존도를 향상시키는데 적합하도록 췌도의 피막화가 잘 이루어진 것을 확인하였다.
실시예 5. EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 분해 저항성 확인
EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 분해 저항성을 확인하기 위해 알지네이트 5ml 당 EGCG 첨가량이 10.5, 21, 42 및 84mg 일 때의 미세캡슐의 형태를 광학현미경으로 확인하여 도 23에 나타내었다. EDTA를 통한 Ca2+ 제거 시 발생하는 분해에 대한 저항성을 측정하였으며, EGCG 사용량이 알지네이트(alginate) 5 ml 당 84 mg 이상일 때부터 저항성이 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 6. EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 외부 EGCG 층 형성 여부 확인
EGCG 사용량에 따른 표면 개질 미세캡슐의 외부 EGCG 층 형성 여부를 확인하기 위해 EGCG 첨가량이 10.5, 21, 42 및 84mg 일 때의 외부 층의 형태를 공초점 광학현미경으로 확인하여 도 24에 나타내었다. 분해 저항성은 코어 알지네이트(alginate) 외부에 형성되는 EGCG 층에 의하여 나타났으며, EGCG 층 내부의 결합은 Ca2+과 무관하게 EGCG 자체의 자동산화(autooxidation)에 의해 형성되므로 일반적인 알지네이트의 용해 과정과는 상이하였다.
상기 실시예로부터 EGCG 층의 형성은 표면 개질 미세캡슐 제조 시 사용되는 EGCG의 양이 알지네이트(alginate) 5 ml 당 84 mg 이상일 때 뚜렷하게 형성됨을 확인하였다.
실시예 7. 미세캡슐 내부 췌도의 포도당 반응성 및 인슐린 분비능 확인
일반 췌도, 알지네이트 미세캡슐 내부 췌도 및 표면 개질 미세캡슐 내부 췌도의 포도당 반응성 및 인슐린 분비능을 확인하기 위하여 GSIS(Glucose-stimulated insulin secretion) 분석을 수행한 결과를 도 25에 나타내었다, 그 결과 미세캡슐 내부의 췌도는 일반 췌도에 비해 포도당 반응성이 낮음을 확인하였다. 이는 미세캡슐 구조에 의해 인슐린의 확산이 더뎌지는 것에 기인한 결과이다. 하지만 알지네이트 미세캡슐 내부 췌도와 표면 개질 미세캡슐 내부 췌도의 경우 포도당 반응성에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 표면 개질 공정이 내부 췌도의 기능성에 영향을 주지 않음을 의미한다.
실시예 8. 당뇨 질환 마우스 동물모델에서 표면 개질 미세캡슐화 췌도의 이식을 통한 효능, 지속기간 평가 및 회수된 미세캡슐의 효능, 지속기간 및 형태 분석
EGCG dimer 84 mg를 이용하여 제조한 표면 개질된 미세캡슐의 혈중 당 농도를 도 26에 나타내었고, 표면 개질된 미세캡슐 및 알지네이트 미세 캡슐의 효과 및 형태를 분석하기 위하여 췌도 이식에 따른 당뇨병 질환 마우스의 혈당 농도 및 체중을 도 27에 표현하였고, 이식 후 67일째 및 85일째에 이식된 미세캡슐을 회수하여 이의 형태를 광학현미경으로 관찰하여 도 28에 나타내었다.
먼저 혈당 조절 기간의 경우, 표면 개질 미세캡슐 및 알지네이트 미세캡슐 등 통계적 비유효성으로 약 60일 내외로 효능이 지속되었다. 회수된 미세캡슐의 형태의 경우, 표면 개질 미세캡슐이 알지네이트 미세캡슐에 비해 더 안정적으로 유지된 것을 확인하였다. 표면 개질 미세캡슐의 경우 표면에 세포 흡착이 나타난 것 외의 면역반응이 발생하지 않은 반면, 알지네이트 미세캡슐의 경우 내부에 조직이 형성되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, EGCG를 통한 알지네이트(alginate) 미세캡슐의 표면 개질은 미세캡슐의 구조 안정성을 개선하는 효과적인 방법임을 확인할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 코어가 유동상의 알지네이트이고,
    쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인, 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체의 일부는 다른 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화에 의해 서로 결합된 것인 미세캡슐.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 쉘은 알지네이트 코팅층을 더 포함하는 것인 미세캡슐.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 알지네이트 코팅층은 쉘의 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 함께 아마이드 결합을 형성한 것인 미세캡슐.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 쉘은 3차원 적으로 연결된 다수 개의 중공을 포함하는 것인 미세 캡슐.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 액상의 알지네이트 또는 액상의 알지네이트와 알지네이트 하이드로겔의 혼합물인 미세캡슐.
  7. 제1항에 있어서,
    세포 피막용인 미세캡슐.
  8. (1) 칼슘-알지네이트 미세캡슐을 제조하는 코어 제조 단계;
    (2) 칼슘-알지네이트 미세캡슐 및 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체를 반응시켜 상기 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면을 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물이 형성시키는 쉘 제조 단계; 및
    (3) 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트 시키는 코어 액화 단계;를 포함하고,
    상기 코어는 유동상의 알지네이트이고, 쉘이 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체로 가교된 알지네이트 하이드로겔;인 표면 개질 알지네이트 미세캡슐의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함하는 것인 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함하는 것인 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것인 제조방법.
  12. (a) 세포를 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐로 피막화하는 코어 제조단계;
    (b) 세포를 피막화한 칼슘-알지네이트 하이드로겔 미세캡슐을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 반응시켜, 칼슘-알지네이트 미세캡슐 표면에 알지네이트-에피갈로카테킨 갈레이트 이합체 가교물을 형성시키는 쉘 제조단계; 및
    (c) 상기 칼슘-알지네이트의 칼슘 이온을 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체에 킬레이트시켜, 상기 세포 주변의 하이드로겔을 액화시키는 단계;를 포함하는 코어-쉘 구조의 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 이용한 세포 피막화 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제조된 쉘의 에피칼로카테킨 갈레이트 이합체를 인접한 에피갈로카테킨 갈레이트 이합체와 산화 결합시키는 단계를 더 포함하는 것인 세포 피막화 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 제조된 쉘을 알지네이트로 코팅시키는 단계;를 더 포함하는 것인 세포 피막화 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 제조된 표면 개질 알지네이트 미세캡슐을 칼슘 이온 킬레이트제와 반응시켜 중공을 형성시키는 단계를 더 포함하는 것인 세포 피막화 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 췌도 세포인 세포 피막화 방법.







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