KR101220429B1

KR101220429B1 - 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101220429B1
Application number: KR1020100093726A
Authority: KR
Inventors: 변영로; 안철희; 이동윤; 박준범; 정지헌
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2013-01-18
Also published as: KR20120032209A

Abstract

본 발명은 고분자를 이용한 췌장소도 봉입용 캡슐(encapsulated pancreatic islets) 표면의 개질 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 췌장소도를 캡슐로 봉입(encapsulation)한 후 다양한 고분자 결합(polymeric grafting)을 이용하여 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 사슬을 췌장소도 캡슐의 표면에 결합시켜 표면을 개질하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 표면개질 방법에 의해 표면이 변형된 췌장소도는 이식시 면역거부 반응을 최소화할 뿐만 아니라, 섬유아세포에 의한 섬유화도 막을 수 있어 췌장소도의 효율과 생존기간을 연장시킬 수 있다.

Description

표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐 및 이의 제조방법{Encapsulated pancreatic islets having modified surface and preparation method thereof}

본 발명은 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐(encapsulated pancreatic islets) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 절대적 또는 상대적 결핍에 따른 고혈당과 이에 수반되는 여러 가지 대상 장애를 특징으로 하는 질병이다. 인슐린을 분비하는 췌장소도 내의 베타세포(β-cell)의 대량 파괴에 의한 제1형(인슐린 의존성) 당뇨병은 물론이고 제2형(인슐린 비의존성) 당뇨병의 경우에도 포도당 자극에 대한 인슐린 분비반응의 결함이 발견되는데, 이와 같은 분비반응의 이상기전에 대해서는 현재까지 확실하게 밝혀지지 않고 있다.

제1형 당뇨병의 근본적인 치료법으로 제시된 췌장소도 이식술은 인슐린의 정맥주사 방법과는 달리 혈액 내의 혈당 변화에 따라 인슐린을 분비하거나 글루카곤을 분비하여 혈당량을 일정하게 유지하는 기능을 수행하며 필요한 효소를 분비함으로써 인슐린 의존형 당뇨병 말기환자에 있어서의 유일한 완치방법으로 제시되어 왔다. 하지만, 췌장소도를 이식하는 방법에 있어서 자가 이식(Auto-transplantation)인 경우에는 이식된 췌장소도의 파괴 정도는 적은 장점이 있지만 이식할 수 있는 췌장소도의 구입이 극히 제한되어 있다는 점이 가장 큰 걸림돌이 되어 왔다.

이러한 문제점들을 극복하기 위하여, 타인의 췌장소도를 이식하는 타가이식(allo-transplantation) 및 이종이식(Xeno-transplantation) 기술이 개발되었는데, 이종이식 기술을 예로 들면 돼지 등의 췌장소도를 사람에게 이식시키는 방법으로써 충분한 췌장소도를 확보할 수 있다는 장점은 있으나, 면역거부 반응이 심하여 이식 후 2주 이내에 췌장소도가 파괴되는 것으로 보고되었으며, 면역 억제제의 사용에 따른 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 따라서, 면역거부 반응을 유발하지 않는 췌장소도의 개발이 절실히 요구되고 있다.

췌장소도의 이식 후에 나타나는 면역거부 반응을 억제하기 위해서 여러 가지의 방법들이 제안되었다. 예를 들면 혈관 내 장치(intravascular device), 마이크로캡슐봉입(microencapsulation) 방법, 마크로캡슐봉입(macrocapsulation) 방법 등이 개발되었는데, 이중 마이크로 캡슐 봉입 방법이 주로 사용되고 있다.

마이크로 캡슐봉입(microencapsulation)은 가장 널리 사용되는 방법 중의 하나로 췌장소도 표면에 음이온의 알긴산 등과 폴리-L-라이신산을 이용해 반투과성 막(semipermeable membrane)을 형성하고 최종적으로 음이온을 띤 알긴산 등으로 생체적합성 표면을 만드는 방법이다.

마이크로 캡슐봉입 방법의 반투과성 막은 크기가 작은 포도당과 인슐린, 산소, 영양분 등의 자유롭게 통과되지만, 크기가 큰 면역 세포들은 캡슐내로 들어갈 수 없게 된다. 한편, 마이크로 캡슐은 마크로 캡슐(macrocapsule)에 비해 막의 두께가 얇으므로, 산소, 영양분, 포도당 등이 보다 용이하게 췌장소도로 확산될 수 있어 일반적으로 사용되는 다른 췌장소도의 면역 분리 장치에 비하여 세포의 생존 능력을 증가시킨다. 또한, 막의 두께가 얇기 때문에 확산속도(diffusion rate)가 빨라 포도당의 농도에 보다 빠르고 민감하게 반응할 수 있는 장점이 있다.

하지만, 폴리-L-라이신산이 결합된 캡슐은 섬유아세포에 의한 섬유증의 위험을 가지고 있다. 섬유증이 일어나면, 영양분과 산소의 공급이 어려워지므로 이식한 세포가 사멸하게 되고, 또한 포도당에 의한 반응성도 떨어져 이식 실패로 이어지게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 알긴산의 순도를 높이거나, 알긴산 내의 만뉴론산과 글루론산 비를 조절하거나, 또는 캡슐의 크기를 변화시켜 섬유증을 줄이려는 시도들이 이어지고 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위하여 췌장소도를 알긴산염으로 캡슐화하여 봉입하고 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 "PEG"라고 약칭함)과 같은 생체적합성 고분자를 췌장소도 표면에 그래프팅(grafting)시켜 캡슐 표면을 개질함으로써, 면역거부 반응에 의한 췌장소도의 파괴를 최소한으로 줄이고 섬유아세포에 의한 섬유화를 줄여 췌장소도의 효율과 생존기간을 늘리는 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 췌장소도 봉입용 캡슐을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장소도가 알긴산염으로 구성되는 캡슐 내부에 봉입되고, 상기 캡슐 표면은 생체적합성 고분자로 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐을 제공한다.

또한, 본 발명은 알긴산염으로 췌장소도를 봉입한 후 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)으로 처리하여 췌장소도 봉입용 캡슐을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1의 췌장소도 봉입용 캡슐 표면 개질을 위한 생체적합성 고분자를 활성화시키는 단계(단계 2); 및

상기 단계 1에서 제조한 췌장소도 봉입용 캡슐의 표면에 상기 단계 2에서 활성화시킨 생체적합성 고분자를 그래프팅(grafting)시키는 단계(단계 3)를 포함하는 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐은, 췌장소도가 봉입된 캡슐의 표면에 생체적합성 고분자를 그래프팅시킴으로써, 당뇨병 환자를 위한 췌장소도 이식시 면역세포의 공격을 효과적으로 막을 뿐만 아니라, 섬유아세포에 의한 섬유화도 예방할 수 있어 췌장소도의 효율과 생존기간을 연장시킬 수 있다.

도 1은 캡슐에 봉입된 췌장소도를 광학현미경으로 촬영한 사진이다.
도 2는 선형-PEG가 캡슐표면에 그래프팅된 췌장소도 봉입용 캡슐을 나타낸 도면이다.
도 3은 가지형-PEG가 캡슐표면에 그래프팅된 췌장소도 봉입용 캡슐을 나타낸 도면이다.
도 4는 플루오로-PEG가 캡슐표면에 그래프팅된 췌장소도 봉입용 캡슐의 형광 현미경 사진이다.
도 5는 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 생존성을 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 6은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 생존성을 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 7은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 CCK-8 kit를 이용한 발색 분석법의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 인슐린 분비능의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스에 1000, 1500 및 2000 IEQ(Islet Equivalent)의 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 10은 마우스에 표면이 개질되지 않은 캡슐에 봉입된 췌장소도 1000 IEQ를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 11은 마우스에 표면이 개질되지 않은 캡슐에 봉입된 췌장소도 2000 IEQ를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 12는 3마리의 마우스에 1000 IEQ의 PEG-캡슐 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 13은 4마리의 마우스에 2000 IEQ의 PEG-캡슐 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.
도 14는 마우스에 이식 10일 후 적출한 PEG-캡슐 췌장소도를 광학현미경으로 촬영한 사진이다.
도 15는 마우스에 이식 10일 후 적출한 PEG-캡슐 췌장소도를 고정하고, 절편(section)한 후 H&E 염색하고 광학현미경으로 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 췌장소도가 알긴산염으로 구성되는 캡슐 내부에 봉입되고, 상기 캡슐 표면은 생체적합성 고분자로 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐을 제공한다. 본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐은 생체적합성 고분자를 췌장소도 봉입용 캡슐의 표면에 화학적으로 그래프팅(grafting)시킴으로써 췌장소도의 이식시 면역거부 반응 및 섬유아세포에 의한 섬유화를 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 고분자는 측쇄 또는 말단에 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 설폰기(sulfone group) 등의 관능기가 부착된 것을 포함한다.

상기 생체적합성 고분자는 친수성 고분자로서, 물과의 접촉각이 90도 이하인 친수성 고분자를 포함한다.

바람직하게, 상기 생체적합성 고분자는 친수성 합성고분자, 생체고분자 또는 이들의 유도체 및 결합체이다.

본 발명에서 사용되는 생체적합성 고분자 중에서 친수성 합성고분자로는 폴리(아크릴산)계(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계(polystryene), 폴리옥사이드계(polyoxide), 셀룰로오즈계(cellulose), 전분계(starch), 폴리다당류계(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 등의 유도체를 포함한다.

상기 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 가지형의 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 유도체를 사용할 수 있는데, 폴리에틸렌 글리콜은 유체역학적 용량이 매우 크고 물분자를 포집하고 있는 능력이 매우 높기 때문에 췌장소도 봉입용 캡슐 표면에 그래프팅된 폴리에틸렌 글리콜은 물분자막을 형성하여 면역세포가 항원으로 인식되지 못하도록 하는 역할을 하게 된다.

이때, 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 분자량은 1,000 내지 100,000 달톤인 것이 바람직하다. 만약, 분자량이 1,000 달톤 미만일 경우에는 면역 반응을 효과적으로 막을 수 없고, 분자량이 100,000 달톤을 초과하는 경우에는 췌장소도 봉입용 캡슐끼리 뭉치는 문제가 있다.

상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체로는 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEG-aldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르(PEG succinimidyl ester) 등을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 생체적합성 고분자 중에서 생체고분자로는 항혈전성을 갖는 생체고분자로서 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative), 헤파린 유사체(heparin analogue) 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐을 제조하기 위해서, 알긴산염으로 췌장소도를 봉입한 후 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)으로 처리하여 췌장소도 봉입용 캡슐을 제조하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 제조한 췌장소도 봉입용 캡슐의 표면에 상기 단계 2에서 활성화시킨 생체적합성 고분자를 그래프팅(grafting)시키는 단계(단계 3)를 포함하는 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1은 알긴산염을 사용하여 췌장소도를 캡슐화하고 폴리-L-라이신으로 처리하여 췌장소도 봉입용 캡슐을 제조하는 단계이다.

구체적으로, 알긴산염 나트륨 용액에 췌장소도를 현탁시켜 캡슐에 봉입한 후 폴리-L-라이신으로 처리하여 캡슐의 표면에 PEG 등의 고분자와 그래프팅할 수 있는 아미노기를 생성시킨다. 이때, 상기 폴리-L-라이신 이외에도, 생체적합성 고분자의 관능기와 결합할 수 있는 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 티올기(thiol group), 아지드기(azide group) 등의 관능기를 가지는 생체 적합성 화합물을 사용하여 캡슐의 표면을 처리할 수 있다.

본 발명에서 췌장소도를 봉입하는 캡슐은 마이크로캡슐로서, 마크로캡슐과 비교할 때 췌장소도를 둘러싼 막의 두께가 훨씬 얇기 때문에 산소나 영양분이 훨씬 용이하게 췌장소도 내로 확산될 수 있을 뿐만 아니라, 막의 두께가 얇아 높은 확산속도를 가짐으로써 글루코즈의 농도 변화에 민감하게 반응할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 췌장소도 봉입용 캡슐에 생체적합성 고분자를 그래프팅시키기 위하여 생체적합성 고분자를 활성화시키는 단계이다.

구체적으로, 상기 생체적합성 고분자의 말단기(-OH)를 반응성이 좋은 말단기(-COOH)로 치환하기 위하여 카르복실화 반응을 수행한다. 생체적합성 고분자를 카르복실화시키는 방법은 고분자의 한쪽 하이드록시기(hydroxy group)를 메틸에테르기(methyl ether group)로 치환시키고, 나머지 한쪽 하이드록시기에는 친전자성 물질(electrophile)을 함유한 기능기를 결합시키는 방법 등이 사용될 수 있다.

상기 단계 2의 생체적합성 고분자는 측쇄 또는 말단에 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 설폰기(sulfone group) 등의 관능기가 부착된 것을 사용할 수 있다.

상기 생체적합성 고분자는 친수성 고분자로서, 물과의 접촉각이 90도 이하인 친수성 고분자를 사용할 수 있다.

바람직하게는, 친수성 합성고분자, 생체고분자 또는 이들의 유도체 및 결합체를 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서 사용되는 생체적합성 고분자 중에서 친수성 합성 고분자로는 폴리(아크릴산)계(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계(polystryene), 폴리옥사이드계(polyoxide), 셀룰로오즈계(cellulose), 전분계(starch), 폴리다당류계(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 등의 유도체를 사용할 수 있다.

상기 선형-폴리에틸렌 글리콜, 가지형-폴리에틸렌 글리콜 및 이의 유도체를 사용할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 유체역학적 용량이 매우 크고 물분자를 포집하고 있는 능력이 매우 높기 때문에 췌장소도 봉입용 캡슐 표면에 그래프팅된 폴리에틸렌 글리콜은 물분자막을 형성하여 면역세포가 항원으로 인식되지 못하도록 하는 역할을 하게 된다.

상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체로는 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEG-aldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르(PEG succinimidyl ester) 등의 유도체를 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서 사용되는 생체적합성 고분자 중에서 생체고분자는 항혈전성을 갖는 생체고분자로, 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린과 유사한 특성을 갖는 헤파린 유사체(heparin analogue)를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 활성화 시킨 생체적합성 고분자를 췌장소도 캡슐의 표면에 공유결합시키는 단계이다.

구체적으로, 췌장소도 캡슐 표면의 관능기와 반응할 수 있는 생체적합성 고분자의 말단 또는 측쇄의 아민기(amine group), 하이드록시기(hydroxy group), 카르복실기(carboxyl group), 설폰기(sulfone group) 등의 관능기가 서로 공유결합하여 그래프팅되는 것이다.

생체적합성 고분자와 췌장소도 캡슐 표면과의 그래프팅에는 DCC(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, Y-K Lee et al., Thromb. Res., 92, 149-156, 1998), EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, D. H. Rich and J. Singh, "The carbodiimde method" in The Peptides: Vol.1, Academic Press, New York, 1979, pp. 241-261), 광반응(photoreaction) 등의 방법이 사용될 수 있다. 공유결합으로 췌장소도 봉입용 캡슐 표면에 그래프팅된 생체적합성 고분자는 생체 내에 이식된 후에도 안정적으로 췌장소도에 존재할 수 있으며, 화학적인 공유결합과 함께 물리적으로 췌장소도 봉입용 캡슐 내에 생체적합성 고분자를 침투시켜 효율을 보다 높일 수 있는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법은, 면역거부 반응의 최소화 및 섬유아세포에 의한 섬유화의 예방을 위한 목적으로, 췌장소도 봉입용 캡슐의 표면에 생체적합성 고분자를 수회 그래프팅시켜, 췌장소도 봉입용 캡슐 표면에 그래프팅된 생체적합성 고분자의 밀도를 최대화할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 캡슐 표면이 PEG 로 개질된 췌장소도 봉입용 마이크로캡슐의 제조

준비 단계: 췌장소도의 분리

본 발명에 따른 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐에서, 췌장소도는 다음과 같은 방법으로 수행하여 얻었다.

먼저, 췌장소도를 분리하기 하루 전부터 금식시킨 체중 250 내지 300 g의 SD 랫트(대한실험동물센터, 한국)를 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine)의 혼합용액으로 피하주사하여 마취시켰다. 복강을 개복한 후 췌장을 부풀리기 위해 콜라게네이즈(collagenase; 1.5mg 콜라게네이즈/HBSS 1mL, 12.5mL/SD 래트)를 담즙관(bile duct)을 통해 주입하였고, 주입이 끝남과 동시에 즉시 부풀려진 췌장을 적출하였다. 적출한 췌장을 가위로 잘게 부수고, 37℃ 수조 내에서 흔들어주면서 분해시킨 후 더 이상의 분해를 막기 위하여 냉각된 HBSS를 첨가하였다. 분해된 췌장 조직을 채로 거른 후 여러 번 세척하였다. 이를 약 1400 rpm에서 4분간 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하고, 27, 23, 20 및 11%의 피콜(ficoll) 농도 구배를 준 후 약 2400 rpm에서 24분간 원심분리를 실시하였다. 20%와 23% 층 사이 및 11%와 20% 층 사이에 존재하는 췌도를 모아 세척한 후 RPMI-1640 배양액이 첨가된 배양접시로 옮겨 37℃, 5% CO₂를 공급하면서 배양하였다. 배양액은 이틀에 한 번씩 새것으로 교체해 주었고 이로부터 췌장소도를 분리하였다.

단계 1: 췌장소도가 봉입된 마이크로캡슐의 제조

본 발명에 따른 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐에서, 봉입용 캡슐은 다음과 같은 방법으로 수행하여 제조하였다.

먼저, 3000 개/㎖ 농도의 췌장소도를 정제된 1.5 w/v% 알긴산염 나트륨 용액에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 5 ㎖ 주사기에 담은 후 정전 방울 발전기(electrostatic bead generator)의 주사기 펌프를 이용하여 100 mM 염화칼슘 용액에 적하하여 알긴산염 마이크로캡슐을 제조하였다. 췌장소도가 담긴 상기 마이크로캡슐을 50 mM 염화칼슘 용액으로 세척한 후 다시 25 mM 염화칼슘 용액으로 세척하고 마지막으로 150 mM 생리식염수 용액으로 세척하였다. 세척이 끝난 상기 마이크로캡슐을 0.05 w/v% 폴리-L-라이신(poly-L-lysine, 2000 Mr) 용액에 첨가하여 10분 동안 반응시킨 후 10 mM(몰포리노)프로판설폰산 완충용액으로 1분간 세척하고, 다시 한번 더 같은 용액으로 5분간 세척하였다. 이 후, 상기 마이크로캡슐을 0.15% 알긴산염 나트륨 용액에 4 내지 5분 동안 현탁시킨 후 55 mM 구연산염 나트륨 용액으로 마이크로캡슐을 4분 동안 세척하여 캡슐 안쪽의 알긴산염 겔을 액화시켰다. 마지막으로, 상기 마이크로캡슐을 생리식염수 용액으로 세척하고 다시 RPMI-1640 배양액으로 세척한 후 동일한 배양액에 옮겨서 배양하였다. 상기에서 제조한 캡슐에 봉입된 췌장소도를 광학현미경으로 촬영한 사진을 도 1에 나타내었다.

단계 2: 캡슐 표면 개질용 생체적합성 고분자의 활성화

본 발명에 따른 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐에서, 캡슐 표면에 그래프팅되는 생체적합성 고분자는 다음과 같은 방법으로 수행하여 활성화하였다.

먼저, mPEG-5000 45 g을 500 ㎖ 3-목 플라스크(3-neck flask)에 넣고 450 ㎖의 톨루엔(toluene anhydrous)을 첨가하여 용해시켰다. PEG 중탕으로 온도를 120 ℃로 유지하면서 순수 아르곤(pure Ar)을 계속 순환시켰다. 톨루엔과 mPEG를 혼합한 용액이 끓어서 축합반응(condensation)이 일어나면 상분리가 발생하는데, 이때 불투명한 부분인 물을 제거한 후 온도를 실온으로 낮추었다. 상기 혼합용액에 칼륨 부톡사이드(potassium butoxide)를 첨가하고 24시간 동안 70℃에서 반응시키고 온도를 다시 실온으로 낮춘 후 에틸-3-브로모프로피온산염(ethyl-3-bromopropionate)를 첨가하여 하루 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 혼합용액을 여과하여 칼륨브로마이드(potassium bromide, KBr)를 걸러낸 후 에테르(ether)를 첨가하여 침전시켰다. 상기 침전용액을 냉동실에 2 내지 3시간 동안 보관하였다가 다시 여과하여 건조시켰다. 약 200 내지 300 ㎖의 1 M NaOH를 건조된 PEG와 혼합하여 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 NaCl 15g을 첨가하고 6 M HCl을 이용하여 pH를 3까지 조절하였다. 여기에 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 상분리를 수행한 후 클로로포름 층만을 제거한 후 MgSO₄를 첨가하여 여분의 수분을 제거하였다. 상기 용액을 여과하고 에테르에 침전시킨 후 다시 여과하여 하루 동안 감압건조시켜서 카르복실화 mPEG를 얻었다.

다음으로, 상기 카르복실화 mPEG를 췌장소도를 봉입한 캡슐 표면에 존재하는 라이신의 아민기와 반응하도록 활성화시키기 위하여 하기와 같이 실시하였다. 먼저, 2-목 플라스크(2-neck flask)에 mPEG-COOH를 넣고 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 첨가하여 용해시켰다. 여기에, N-하이드로숙시니미드(N-hydrosuccinimide)를 첨가하여 완전히 용해시킨 후 얼음 수조에서 1,3-디클로로카보디이미드(1,3-dicyclohexylcarbodiimide)를 첨가하고 하루 동안 반응시켜서 여과하였다. 메틸렌 클로라이드를 증발시키고 벤젠을 약 50 내지 100 ㎖ 정도 가하여 6시간 정도 유지하였다가 다시 여과하였다. 상기 여과액을 에테르에 침전시켜 다시 여과하여 활성화된 mPEG를 얻었다.

단계 3: 캡슐 표면의 개질

본 발명에 따른 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐에서, 캡슐 표면에 생체적합성 고분자를 그래프팅시켜 캡슐 표면을 개질하는 방법은 다음과 같이 수행하였다.

상기 단계 1에서 제조한 췌장소도를 봉입한 마이크로 캡슐에 PEG가 잘 그래프팅할 수 있도록 췌장소도를 봉입한 마이크로 캡슐에 묻어 있는 배양액을 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 씻어준 후 23 ㎎의 활성화 PEG를 용해시킨 15 ㎖의 HBSS 완충용액을 췌장소도를 봉입한 마이크로 캡슐에 첨가하여 세포배양기 내(5% 이산화탄소, 95% 산소, 37℃)에서 시간별로 췌장소도를 봉입한 마이크로 캡슐과 PEG를 반응시켰다. PEG 결합반응(PEGylation) 후, 더 이상의 반응을 막기 위해 췌장소도를 봉입한 마이크로 캡슐을 배양액으로 세척하였다. 상기에서 제조한 PEG가 그래프팅된 캡슐에 봉입된 췌장소도를 도 2에 나타내었다.

< 실시예 2> 캡슐 표면이 가지형의 PEG 로 개질된 췌장소도 봉입용 마이크로캡슐의 제조

PEG로서, 가지형의 PEG(40,000 달톤, Y-shape PEG NHS ester; 10,000 달톤 4arm-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl(SCM))를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 가지형의 PEG가 그래프팅된 마이크로캡슐에 봉입된 췌장소도를 제조하였다. 상기에서 제조한 가지형 PEG가 그래프팅된 캡슐에 봉입된 췌장소도를 도 3에 나타내었다.

< 실시예 3> 캡슐 표면이 FITC - PEG 로 개질된 췌장소도 봉입용 마이크로캡슐의 제조

췌장소도 표면에 반응된 PEG의 양을 정량하기 위하여 PEG 대신 형광물질이 표지된 5,000 달톤의 FITC(fluorescein isothiocyanate)-PEG를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 FITC-PEG가 그래프팅된 마이크로캡슐에 봉입된 췌장소도를 제조하였다. 상기에서 제조한 FITC-PEG가 그래프팅된 캡슐에 봉입된 췌장소도를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

< 실험예 1> PEG -캡슐 췌장소도의 생존성 측정

실시예 1에서 제조한 캡슐 표면이 PEG로 개질된 마이크로캡슐에 봉입된 췌장소도(이하, PEG-캡슐 췌장소도라 함.)의 생존성을 알아보기 위하여 생체 외(in vitro) 조건에서 다음과 같은 실험을 수행하였다.

PEG-캡슐 췌장소도를 직접 세어, 배양 플레이트 내에 첨가하였다. 배양액은 FBS가 10% 포함된 RPMI-1640 (제조사: Sigma, 11.1 mM glucose, 2 mM sodium pyruvate, 6 mM HEPES, 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin)을 사용하였고, 세포배양기 내에서 이틀간 배양하였다. 상기 배양한 PEG-캡슐 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 세척한 다음, 생/사 세포 키트(live/dead cell kit)로 15분간 반응시킨 후 형광 현미경을 이용해서, 세포의 생존성을 확인한 결과를 도 6에 나타내었다.

배양 1일, 7일, 14일 후에, 10개의 PEG-캡슐 췌장소도를 직접 세어 RPMI-1640 배양액이 첨가된 96-well 플레이트로 옮겨 37℃, 5% CO₂를 공급하며, 24 시간 배양하였다. 이후에 세포 정량 키트-8(cell counting kit-8, 제조사: Dojindo Molecular Technologies Inc., 제조국: Rockville, MD) 용액을 첨가한 후 4시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 통해 세포의 생존성을 도 7에 나타내었다.

도 7은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 세포 정량 키트를 이용한 발색 분석법의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, 2주가 지난 후에도 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도는 여전히 살아 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도는 그 생존기간이 연장됨으로써 췌장소도 이식술 전처리 과정에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 당 농도에 따른 인슐린 분비 측정

상기 실시예 1에서 제조한 PEG-캡슐 췌장소도에서, 당(글루코오즈) 농도에 따라 분비되는 인슐린을 측정하기 위하여 다음과 같이 생체 외(in vitro) 조건에서 실험을 수행하였다.

먼저, 10개의 PEG-캡슐 췌장소도를 배양 플레이트 삽입기를 넣고 KRBB 배양액(3.469 g NaCl, 0.175 g KCl, 0.160 g MgSO₄7H₂O, 0.0816 g KH₂PO4, 0.1054 g CaCl₂, 1.05 g NaHCO₃, 1.19 g HEPES, 0.025 g BSA, 1 ℓ 물)을 사용하고, 37 ℃에서 5% CO₂를 공급하며 배양하였다. 당 농도가 2.8 mM 농도인 배양액에 1시간 동안 전배양(pre-incubation)하였고, 2.8mM 농도에서 2시간, 당 농도가 28 mM인 배양액에서 2시간 배양하였다. 이때, 매 10분마다 삽입기를 흔들어주었다. 2시간 배양이 끝난 후 2.8 mM과 28 mM 배양액에서 시료를 채취하여 ELISA 키트(제조사: Millipore Corp.)로 인슐린 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 인슐린 분비능의 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8에 나타난 바와 같이, 당 농도를 달리한 배양액에서 이틀 후 측정한 인슐린 농도에서 유의적인 변화가 관찰되었는데, 이것은 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도의 당 농도에 반응하는 민감성이 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도는 당 농도에 반응하는 민감성이 우수하므로, 췌장소도 이식술 전처리 과정에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 3> PEG -캡슐 췌장소도의 이식

상기 실시예 1에서 제조한 PEG-캡슐 췌장소도를 실험용 쥐에 이식하여 혈당의 변화를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

먼저, 약 20g의 C57BL/6 마우스에 180 ㎎/㎏ 스트렙토조토신(streptozotocin)을 주사하여 당뇨를 유발하였다. 이 중에서 혈당 농도가 350 ㎎/dl 이상인 마우스를 당뇨가 유발된 것으로 선별하여 PEG-캡슐 췌장소도 이식의 수혜자(recipient)로 선정하였다. 다음으로, PEG-캡슐 췌장소도 이식군의 혈당 변화량을 비교해 보기 위하여 다음과 같이 대조군 및 실험군을 설정하였다.

대조군 1. 아무런 처리를 하지않은 췌장소도를 1000, 1500 및 2000 IEQ (Islet Equivalent)를 각 마우스에 이식한 군.

대조군 2. 실시예 1의 단계 1에서 제조한 표면이 개질되지 않은 캡슐에 봉입된 췌장소도를 1000 및 2000 IEQ를 마우스에 이식한 군.

실험군 1. 실시예 1에서 제조한 PEG-캡슐 췌장소도를 1000 및 2000 IEQ를 각 마우스에 이식한 군.

상기 대조군 및 실험군에서 이식 후 경과에 따른 혈당의 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 9, 도 10, 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 9는 마우스에 1000, 1500 및 2000 IEQ(Islet Equivalent)의 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.

도 10은 마우스에 표면이 개질되지 않은 캡슐에 봉입된 췌장소도 1000 IEQ를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.

도 11은 마우스에 표면이 개질되지 않은 캡슐에 봉입된 췌장소도 2000 IEQ를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.

도 12는 3마리의 마우스에 1000 IEQ의 PEG-캡슐 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.

도 13은 4마리의 마우스에 2000 IEQ의 PEG-캡슐 췌장소도를 이식한 후 혈당 변화를 관찰한 그래프이다.

도 9, 도 10, 도 11, 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 췌장소도를 1000 IEQ 이식한 경우, 혈당 저하 효과를 보이지 않은 반면 표면 미처리 캡슐봉입 췌장소도 1000 IEQ의 경우는 3일, PEG-캡슐 췌장소도 1000 IEQ의 경우는 5일 정도 혈당 저하 효과를 나타내었다. 아무런 처리를 하지 않은 췌장소도 2000 IEQ 이식한 경우 약 5~6일 정도 혈당저하 효과를 보였고, 표면 미처리 캡슐봉입 췌장소도 2000 IEQ의 경우 유사한 기간동안 보다 안정적으로 혈당저하 효과를 보였다. 반면에, PEG-캡슐 췌장소도를 2000 IEQ 이식한 경우에는 평균적으로 15~20일 정도 혈당 저하 효과를 나타냄을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도는 아무런 처리를 하지 않은 췌장소도에 비하여 이식 후 생존기간이 약 3배 이상 늘어나므로, 췌장소도 이식술 전처리 과정에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 4> 조직검사( Histology )

당뇨병 환자에게 췌장소도를 이식할 경우, 임파구(lymphocytes)의 면역 반응으로 췌장소도는 파괴되고, 섬유아세포에 의한 섬유화에 의해 생존성 및 인슐린 분비가 감소되므로 췌장소도의 코팅이 필요하다.

상기 실시예 1에서 제조한 PEG-캡슐 췌장소도를 실험용 쥐에 이식할 경우에 PEG-캡슐 췌장소도 표면 또는 캡슐 내로 침입하는 임파구(lymphocytes) 및 표면 주위에 섬유아세포에 의한 섬유화 여부를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

먼저, PEG-캡슐 췌장소도 표면 또는 캡슐 내로 침입하는 임파구 및 표면 주위에 섬유아세포에 의한 섬유화 여부를 알아보기 위해, 실시예 1에서 제조한 PEG-캡슐 췌장소도를 이식하고 10일 동안 사육한 C57BL/6 마우스의 복강에서, 적출한 췌장을 10% 포르말린(formalin) 용액으로 고정시키고, 파라핀에 조직 시료를 담근 후 마이크로톰(microtome)을 이용하여 5 ㎛의 두께로 잘라서 슬라이드 글래스에 위치시켰다. 잘게 잘려진 조직 시료를 자일렌 용액에 담가 파라핀을 제거하고 H&E 염색을 실시하여 췌도세포의 핵은 짙은 푸른색으로 염색시키고 세포질은 붉은색으로 염색시켰다.

상기 과정에서 염색된 췌장소도를 광학현미경으로 관찰하며 조직검사를 실시하였고, 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14는 마우스에 이식 10일 후 적출한 PEG-캡슐 췌장소도를 광학현미경으로 촬영한 사진이다.

도 15는 마우스에 이식 10일 후 적출한 PEG-캡슐 췌장소도를 고정하고, 절편(section)한 후 H&E 염색하고 광학현미경으로 촬영한 사진이다.

도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 PEG-캡슐 췌장소도의 표면 및 내부로 침투한 임파구는 관찰되지 않았고, 표면 주위에 섬유아세포에 의한 섬유화 또한 일어나지 않는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따른 PEG로 표면이 개질된 캡슐에 봉입된 췌장소도는 임파구(lymphocytes)의 면역 반응으로 파괴되는 것을 억제하고, 섬유아세포에 의한 섬유화를 예방하는 효과가 있으므로, 췌장소도 이식술 전처리 과정에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

췌장소도가 알긴산염 내층과, 폴리-L-라이신 중간층 및 알긴산염 외층으로 구성되는 캡슐 내부에 봉입되고, 상기 중간층을 구성하는 폴리-L-라이신 말단의 아민기와 생체적합성 고분자가 공유결합으로 연결된 췌장소도 봉입용 캡슐.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 측쇄 또는 말단에 관능기가 부착된 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제2항에 있어서, 상기 관능기는 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group) 및 설폰기(sulfone group)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 친수성 고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제4항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 물과의 접촉각이 90도 이하인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 친수성 합성고분자 또는 생체고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제6항에 있어서, 상기 친수성 합성고분자는 폴리(아크릴산)계(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계(polystryene), 폴리옥사이드계(polyoxide), 셀룰로오즈계(cellulose), 전분계(starch), 폴리다당류계(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제7항에 있어서, 상기 친수성 합성고분자는 선형 또는 가지형의 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제8항에 있어서, 상기 선형 또는 가지형의 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 유도체의 분자량은 1,000 내지 100,000 달톤인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제8항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEG-aldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르(PEG succinimidyl ester)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제6항에 있어서, 상기 생체고분자는 항혈전성을 갖는 생체고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
제11항에 있어서, 항혈전성을 갖는 생체고분자는 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐.
알긴산염으로 췌장소도를 봉입한 후 폴리-L-라이신(poly-L-lysine)으로 처리하고, 알긴산염으로 다시 처리하여 췌장소도 봉입용 캡슐을 제조하는 단계(단계 1);
상기 단계 1의 췌장소도 봉입용 캡슐 표면 개질을 위한 생체적합성 고분자를 활성화시키는 단계(단계 2); 및
상기 단계 1에서 제조한 췌장소도 봉입용 캡슐에서 폴리-L-라이신 말단의 아민기에 상기 단계 2에서 활성화시킨 생체적합성 고분자를 공유결합시키는 단계(단계 3)를 포함하는 생체적합성 고분자로 표면이 개질된 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 2의 생체적합성 고분자는 측쇄 또는 말단에 관능기가 부착된 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 관능기는 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group) 및 설폰기(sulfone group)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 2의 생체적합성 고분자는 친수성 고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 물과의 접촉각이 90도 이하인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 2의 생체적합성 고분자는 친수성 합성고분자 또는 생체고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 친수성 합성고분자는 폴리(아크릴산)계(poly[acrylic acid]), 폴리(아크릴산염)계(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)계(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)계(poly[vinyl ester]), 폴리(비닐알콜)계(poly[vinyl alcohol]), 폴리스티렌계(polystryene), 폴리옥사이드계(polyoxide), 셀룰로오즈계(cellulose), 전분계(starch), 폴리다당류계(polysaccharide), 폴리일렉트로라이트계(polyelectrolyte), 폴리(1-니트로프로필렌)(poly[1-nitropropylene]), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제19항에 있어서, 상기 친수성 합성고분자는 선형 또는 가지형의 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 선형 또는 가지형의 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이의 유도체의 분자량은 1,000 내지 100,000 달톤인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제20항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEG-aldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르(PEG succinimidyl ester)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제18항에 있어서, 상기 생체고분자는 항혈전성을 갖는 생체고분자인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제23항에 있어서, 항혈전성을 갖는 생체고분자는 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제13항에 있어서, 상기 단계 3의 췌장소도 봉입용 캡슐의 표면에 활성화시킨 생체적합성 고분자를 그래프팅(grafting)시키는 방법은 췌장소도 봉입용 캡슐 표면의 아민기(amine group), 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 티올기(thiol group) 및 아지드기(azide group)로 구성된 군으로부터 선택되는 관능기를 이용하는 화학적 공유결합인 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.
제13항에 있어서, 췌장소도 봉입용 캡슐 표면에 생체적합성 고분자를 1회 또는 수회 그래프팅시키는 것을 특징으로 하는 췌장소도 봉입용 캡슐의 제조방법.