CN112312897A - 用于细胞包膜的藻酸盐微胶囊及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新型鼠李糖脂化合物及其旋光异构体或其药剂学上可接受的盐。本发明的新型鼠李糖脂化合物及其旋光异构体或其的药剂学上可接受的盐通过呈现对人癌细胞株的细胞毒性来抑制癌细胞的成长，尤其，对上述癌具有优秀的预防或治疗效果。

Description

用于细胞包膜的藻酸盐微胶囊及其制备方法
技术领域
本发明涉及表面改性藻酸盐微胶囊、其制备方法及利用其的细胞包膜方法，更详细地，涉及可用于细胞包膜以在细胞移植过程中从外部环境保护细胞，并且提高了细胞存活率的表面改性藻酸盐微胶囊、其制备方法及利用其的细胞包膜方法。
本发明提及核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶，具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊、其制备方法及利用其的细胞包膜方法。
背景技术
由于藻酸盐的生物相容性优异且具有生物惰性，在组织工程学、细胞治疗、人工器官制造等多种领域中可用作生物材料。
在1型糖尿病的治疗中，作为有效治疗法提出了胰岛细胞移植(islet celltransplantation)。但是，由于相比于需求同种移植的供应非常不足，因此需要异种移植。异种移植可通过移植对象的免疫反应破坏移植的细胞，因此抑制其非常重要。为了保护要移植的异种细胞，已经进行了与利用生物材料的包膜有关的研究，并作为包膜材料提出了藻酸盐，以在治疗糖尿病的胰岛细胞移植(islet cell transplantation)中防止胰岛暴露在免疫反应(Desai et al.Nature reviews Drug discovery16.5(2017)，338)。
用于胰岛包膜的代表性材料为藻酸盐水凝胶。通过使用Ca2+等的二价阳离子来交联藻酸盐钠，可迅速并容易制备藻酸盐水凝胶。但是，在存在大量Na+等的一价阳离子的环境中，由于一价阳离子与用于交联的二价阳离子交换，水凝胶可在溶液状态下溶胶凝胶相变(sol-gel phase transition)。另一方面，体内为存在大量Na+的环境。因此，当体内移植时，可具有如下问题：由于Ca2+在体内与Na+交换或自然扩散(diffusion)，用于包膜的藻酸盐水凝胶在体内逐渐融解。由于这种融解成为缩短微胶囊的寿命并无法从外部免疫系统中保护内部细胞的原因，限制微胶囊化、胰岛相容化。不仅如此，形成的水凝胶通过阻止细胞完全移植存活来在细胞中诱发缺氧症(hypoxia)等。不仅如此，相比于胶囊自身的体积，具有氧或营养素的扩散量少的限制。
为了克服这种限制，最近对不依赖Ca2+形成水凝胶的藻酸盐(alginate)接合体、中空胶囊(hollow capsule)、表面改性细胞(surface modified cell)等的开发进行了许多研究。作为不依赖Ca2+形成水凝胶的藻酸盐(alginate)接合体开发了藻酸盐-多巴胺接合体及透明质酸(hyaluronic acid)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)接合体。在藻酸盐-多巴胺接合体的情况下，可通过多巴胺(dopamine)的氧化相互结合，但结合需要H2O2与辣根过氧化物酶(HRP)，结合力并不强，具有抗增殖效果(antiproliferative effect)、清除自由基(radical scavenging)等的功能性略差的限制。在透明质酸(hyaluronic acid)-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的情况下，由于透明质酸是可以在体内自然分解的物质，制备的接合体可在生物体内分解，基于表没食子儿茶素没食子酸酯结合的水凝胶形成反应速度慢，物性并不强，因此难以适用于微细包膜。
发明内容
技术问题
本发明所要解决的问题在于，提供用于细胞包膜的表面改性藻酸盐微胶囊。
本发明所要解决的再一问题在于，提供用于细胞包膜的表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法。
本发明所要解决的另一问题在于，提供利用上述表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供如下的表面改性藻酸盐微胶囊：核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶，具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊。
根据本发明，上述壳的部分表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物可通过与其他表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行氧化而相互结合。
根据本发明，上述壳还可包括藻酸盐涂敷层。
根据本发明，上述藻酸盐涂敷层可与壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物一同形成酰胺键。
根据本发明，上述壳可包括三维连接的多个中空。
根据本发明，上述核可为液体藻酸盐或液体藻酸盐与藻酸盐水凝胶的混合物。
根据本发明，上述微胶囊可用于细胞皮膜，优选地，可用于胰岛细胞包膜。
并且，本发明提供的如下的表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法：包括：核制备步骤(1)，制备藻酸钙微胶囊；壳制备步骤(2)，通过使藻酸钙微胶囊及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行反应来在上述藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及核液化步骤(3)，将藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物，上述核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶。
根据本发明，还可包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。
根据本发明，还可包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。
根据本发明，还可包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。
并且，本发明提供如下的利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法：包括：核制备步骤(a)，用藻酸钙水凝胶微胶囊包膜细胞；壳制备步骤(b)，使皮膜细胞的藻酸钙水凝胶微胶囊与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物产生反应来在藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及液化上述细胞周围的水凝胶的步骤(c)，将上述藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。
根据本发明，还可包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。
根据本发明，还可包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。
根据本发明，还可包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。
根据本发明，上述细胞可以为用于向生物体内移植的细胞，优选地，可以为胰岛细胞。
发明的效果
本发明藻酸盐微胶囊可通过表没食子儿茶素没食子酸酯的氧化交联藻酸盐，因此可不依赖Ca2+形成水凝胶。不仅如此，本发明的藻酸盐微胶囊可解决如下问题，即，可通过表没食子儿茶素没食子酸酯螯合藻酸盐水凝胶的Ca2+来解决了水凝胶在生物体内轻易分解的问题，由于内部藻酸盐核部分溶解，氧或营养素扩散并易于向内部的包膜细胞传递，从而不仅可提高细胞存活率，其物性优异且解决了易于在生物体内分解的问题。因此，提高了从外部的物理刺激中保护内部细胞的性能，并使免疫反应最小化。
附图说明
图1为示出利用高效液相层析法分析根据本发明制备的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)二聚物的结果的图。
图2为示出利用质谱仪分析根据本发明制备的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)二聚物的结果的图。
图3为示出随着时间的推移确认使用99mg的本发明表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物制备的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体是否形成不依赖钙离子(Ca2+)的水凝胶的图。
图4为示出本发明制备的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体的流变学物性测定结果的图。
图5为示出随着时间的推移确认使用4mg的本发明表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物制备的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体是否形成不依赖钙离子(Ca2+)的水凝胶的图。
图6为示出本发明的比较例3的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)微胶囊制备结果的图。
图7为示出本发明的比较例4的藻酸盐/藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)微胶囊制备结果的图。
图8为示出通过将比较例1及比较例4的微胶囊用钙离子螯合剂处理5分钟来评价分解度的图(a：比较例1、b：比较例4)。
图9为示出根据本发明的反应时间的实施例1的微胶囊制备结果的图。
图10为示出是否经过辣根过氧化物酶处理、多种反应时间及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物浓度的实施例1的微胶囊制备结果的图。
图11为示出确认是否经过辣根过氧化物酶处理的表面改性藻酸盐微胶囊的颜色变化的结果的图(左：辣根过氧化物酶添加X、右：辣根过氧化物酶添加O)。
图12为示出通过是否添加辣根过氧化物酶及是否涂敷AC藻酸盐来区别结合表没食子儿茶素没食子酸酯的藻酸盐珠、藻酸盐珠及藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯珠的图。
图13为示出比较例1、实施例1、实施例2的微胶囊的扫描电子显微镜(SEM)图像。
图14为示出向结合表没食子儿茶素没食子酸酯的藻酸盐珠未添加辣根过氧化物酶的微胶囊(左侧)及添加辣根过氧化物酶的微胶囊(右侧)的光学显微镜图像。
图15为示出通过实施例1或实施例2的表面改性藻酸盐微胶囊包膜胰岛的过程的示意图。
图16为示出将比较例1的藻酸钙微胶囊用已知为钙离子螯合剂的乙二胺四乙酸(EDTA)(100mM)处理20分钟并确认形态变化的图。
图17为示出将实施例1的微胶囊用已知为钙离子螯合剂的乙二胺四乙酸(100mM)处理10分钟或20分钟并确认形态变化的图。
图18为示出比较例1、比较例3及实施例1的微胶囊的流变能力(Rheology)测定结果的图。
图19为示出比较例1、比较例3及实施例1的微胶囊的粘弹性测定结果的图。(a)比较例1、(b)比较例3、(c)实施例1、辣根过氧化物酶添加O、(d)实施例1、辣根过氧化物酶添加X。
图20为示出制备实施例1的微胶囊2周后的粘弹性测定结果的图。(a)辣根过氧化物酶添加O、(b)辣根过氧化物酶添加X。
图21为示出比较例1、比较例3及实施例1的微胶囊的粘弹性测定结果的图。
图22的上端为示出未添加辣根过氧化物酶的胰岛胶囊化表面改性藻酸盐微胶囊的光学显微镜图像，图22的下端为示出添加辣根过氧化物酶的胰岛胶囊化表面改性藻酸盐微胶囊的光学显微镜图像。
图23为利用光学显微镜示出根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量按浓度区分表面改性微胶囊的分解抗性的图像。
图24为利用光学显微镜确认根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量在表面改性微胶囊的外部是否形成表没食子儿茶素没食子酸酯层的图。
图25为示出对于微胶囊内部的胰岛的胰岛素释放能力的曲线图。
图26为示出当使用84mg的表没食子儿茶素没食子酸酯时的表面改性微胶囊内的胰岛的血糖浓度的曲线图。
图27为示出藻酸盐微胶囊及表面改性藻酸盐微胶囊的血糖浓度及重量的曲线图。
图28为利用光学显微镜示出表面改性微胶囊化胰岛及藻酸盐微细胶囊化胰岛的形态的图。
具体实施方式
以下，进一步详细说明本发明。
本发明提供表面改性藻酸盐微胶囊，核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶，具有核壳结构。
根据本发明，上述核可以为流态，上述流态可以为液体或液体与水凝胶的混合物。当上述核为流态时，可易于向内部的细胞传递氧及物质，可提高细胞存活率，因此是优选的。
根据本发明，可通过使表没食子儿茶素单体的6，8碳与醛进行反应来形成上述表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。上述表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物可以为选自8-8同分异构体、6-8同分异构体(2种类)及6-6同分异构体中的一种以上，优选地，可以为它们4种的混合物。
上述表没食子儿茶素没食子酸酯8-8二聚物如下述化学式1所定义。
化学式1
Figure BDA0002711076480000071
上述一对表没食子儿茶素没食子酸酯6-8二聚物如下述化学式2及化学式3所定义。
化学式2
Figure BDA0002711076480000081
化学式3
Figure BDA0002711076480000082
上述表没食子儿茶素没食子酸酯6-6二聚物如下述化学式4所定义。
化学式4
Figure BDA0002711076480000083
根据本发明，上述壳的部分表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物可通过与其他表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行氧化而相互结合。多个上述表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物之间的氧化结合可用于形成厚壳。多个上述表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物之间的氧化结合可通过提高本发明的微胶囊的物理特性来有效地从物理冲击中保护包膜的细胞。氧化结合的没食子儿茶素没食子酸酯二聚物如化学式5所示。
化学式5
Figure BDA0002711076480000101
根据本发明，上述壳还可包括藻酸盐涂敷层。
根据本发明，上述藻酸盐涂敷层可与壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物一同形成酰胺键。
如上述化学式5所示，表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物包含胺基，因此表现阳电荷性。根据以往的研究，相比于中性或阴电荷性生物材料，阳电荷性生物材料可诱发较多的免疫反应及炎症。优选地，由于表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的上述胺基与藻酸盐的羧(-COOH)基形成酰胺键，因此上述藻酸盐涂敷层不表现阳电荷性。
根据本发明，上述壳可包括三维连接的多个中空。上述中空可易于向内部的细胞传递氧气及物质，因此是优选的。通过用钙离子螯合剂处理本发明的具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊处理可易于形成上述中空。
根据本发明，上述微胶囊可用于细胞皮膜。上述细胞的种类不受限制，可以为用于向生物体内移植的细胞，优选地，可以为胰岛细胞。
在本发明中，术语“胰岛”为朗格汉斯岛(Langerhans islets)，胰岛移植为用于改善1型糖尿病的实用治疗法。由于胰岛包含释放胰岛素的β细胞，可通过胰岛的移植来治疗依赖胰岛素的1型糖尿病。
并且，本发明提供如下的表面改性微胶囊的制备方法：包括：核制备步骤(1)，制备藻酸钙微胶囊；壳制备步骤(2)，通过使藻酸钙微胶囊及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行反应来在上述藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及核液化步骤(3)，将藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物螯合藻酸钙的钙离子，上述核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶。
首先，制备藻酸钙微胶囊。
接着，使藻酸钙微胶囊及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行反应。作为上述反应的结果，藻酸钙水凝胶的藻酸盐通过表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联，从而向外壳(壳)形成水凝胶，而内部的部分藻酸钙的钙离子或全部螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。当全部钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物时，内部的藻酸盐变为液体，当部分钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物时，液体藻酸盐和藻酸钙水凝胶共存于内部，从而形成流态的浆料。
上述微胶囊可以为包含胰岛细胞的胰岛细胞胶囊。
在本发明中，术语“胰岛细胞胶囊”为通过用生物相容性高分子包围胰岛细胞来形成胶囊的形态。这种胰岛细胞胶囊可通过防止免疫细胞的穿透来抑制从异种个体中分离的胰岛或从同种个体中分离的胰岛引起的免疫排斥反应。
根据本发明，还可包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。只要是通常使用在表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的氧化的方法，上述氧化并无特别的限制，更优选地，可使用涉及底物脱氢的催化反应的辣根过氧化物酶(HRP，horseradish peroxidase)。
根据本发明，还可包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。可通过添加纯藻酸盐溶液进行反应来进行上述涂敷。
根据本发明，还可包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。例如，上述钙离子螯合剂可以为乙二胺四乙酸。
并且，本发明提供如下的的细胞包膜方法：包括：核制备步骤(a)，用藻酸钙水凝胶微胶囊包膜细胞；壳制备步骤(b)，使皮膜细胞的藻酸钙水凝胶微胶囊与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物产生反应来在藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及液化上述细胞周围的水凝胶的步骤(c)，将上述藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。
根据本发明，还可包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。
根据本发明，还可包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。
根据本发明，还可包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。
根据本发明，上述细胞可以为用于向生物体内移植的细胞，优选地，可以为胰岛细胞。
根据本发明，优选地，相对于每5mg的藻酸盐，用于制备上述微胶囊的表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度可以为42～167mg，更优选地，可以为63～167mg，更加优选地，可以为84～167mg。根据本发明最优选一实例，相对于每5mg的藻酸盐，表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度为84mg。
作为本发明的一实施方式，本发明提供治疗糖尿病用组合物，包含上述胰岛细胞胶囊，以预防或治疗糖尿病。
优选地，上述糖尿病治疗可通过将上述胶囊移植到生物体来进行。经确认，本发明人发现本发明的胰岛细胞胶囊具有高生存能力，且具有与葡萄糖产生反应的高胰岛素释放能力，并且能够穿透代谢物质，但不穿透免疫细胞，因此，即使不给药免疫抑制剂也可以通过移植到小部位来分泌胰岛素，从而治疗糖尿病。
在本发明中，术语“治疗”为通过给药包含本发明的胰岛细胞胶囊的组合物来使糖尿病症状好转或有益改善的所有行为。上述糖尿病治疗适用于发病糖尿病的任何哺乳动物，例如，不仅包括人类及灵长类，还可包括牛、猪、羊、马、狗及猫等的家畜，优选地，可以是人。
本发明胰岛细胞胶囊可移植到需要糖尿病治疗的患者，优选地，移植部位包括腹腔、皮下、肌肉内、内部器官、器官动脉/静脉的血管、脑脊髓液或淋巴液等。并且，本发明的胰岛细胞胶囊无需给药免疫抑制剂，但优选地，可通过与免疫抑制剂或抗炎症剂组合来向治疗糖尿病的患者给药。上述免疫抑制剂可选自由环孢菌素(cyclosporine)、西罗莫司(sirolimus)、雷帕霉素(rapamycin)及奥他克莫司(ortacrolimus)组成的组中，但并不限定于此。
上述抗炎症剂可选自由阿司匹林、布洛芬、类固醇和非类固醇抗炎症剂组成的组中，但并不限定于此。在移植胰岛胶囊后，上述免疫抑制剂或抗炎症剂持续给药6个月，优选地，给药1个月。
上述组合物还可包含药剂学上可接受的载体，可以与载体一同被制剂化。在本发明中，术语“药剂学上可接受的载体”为不刺激生物体且能够不抑制给药胶囊的生物活性及特性的载体或稀释剂。在以液体溶液制剂化的组合物中，作为药剂学上可接受的载体可使用无菌及生物相容的盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合这些组成成分中的一种以上，根据需要也可添加抗氧化剂、缓冲液、静菌剂等其他普通添加剂。并且，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来制剂化为如水溶液、悬浊液、乳浊液等的注射用剂型。
为了向接受者移植本发明的胰岛细胞胶囊，在小鼠的情况下，移植胰岛胶囊时的量为4000～10000IEQ/kg，在非人灵长类的情况下，优选为10000～15000IEQ/kg，根据捐献者的种类、性别及胰岛状态，接受者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度等，其范围各不相同。
根据另一实施方式，本发明提供糖尿病治疗方法，包括向患有糖尿病的个体或处于患糖尿病风险的个体给药上述组合物的步骤。
在本发明中，术语“给药”是指以适当方法向患者导入规定物质，组合物的给药途径可通过任何常规途径进行给药，只要能够到达靶组织即可。可腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、经口给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药、直肠内给药，但并不限定于此。并且，组合物可通过能够移动到靶部位的任何装置进行给药。
根据另一实施方式，为了用于生产能够预防或治疗糖尿病的药剂，本发明提供包含上述微胶囊的组合物的用途。
以下，参照优选实施例进一步详细说明本发明。但是，这些实施例用于更具体说明本发明，对于所属领域的普通技术人员显而易见的是，本发明的范围并不限定于此。
实施例
合成例1.表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)二聚物制备
2，2-二乙氧基乙胺(2，2-diethoxyethylamine，DA)在酸性环境中作为醛存在。通过在甲磺酸(methanesulfonic acid，MSA)下使表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与2，2-二乙氧基乙胺进行反应来引起醛介导聚合反应，从而制备表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。
具体地，在10ml的小瓶中混合3.8ml的四氢呋喃及7μl的甲磺酸后，在暗室条件及氮气气流下添加2.29g(5mmol)的表没食子儿茶素没食子酸酯后搅拌1～2小时。接着，在冷却的10ml的小瓶中，向1ml的四氢呋喃及0.2ml的甲磺酸的混合溶剂添加145μl的2，2-二乙氧基乙胺并搅拌20～30分钟，从而去除氨基乙醛缩二乙中的乙氧基并暴露醛基。将去除乙氧基的2，2-二乙氧基乙胺溶液缓慢滴注(drop wise)到先前制备的表没食子儿茶素没食子酸酯溶液，并在常温的暗室条件下进行过夜(overnight)反应。反应完成后，将反应混合物移入烧瓶后，通过减压来去除溶剂，然后，将烧瓶内部制成氮气气流后进行密封。在暗条件下，利用注射器向上述密封的容器中添加10ml的去离子水并进行搅拌。反应完成后，在暗条件下，向反应混合物添加乙酸乙酯和蒸馏水并使用分液漏斗将其分离成有机层及水层。急速冷冻水层后，通过冷冻干燥获取目标表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。在使用制备的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物之前，放入超低温冷冻箱进行保管。
如下述反应式1所示，经确认，6，8碳通过与醛反应来形成二聚物。在此情况下，根据结合形态制备的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物为8-8同分异构体、6-8同分异构体(2种类)及6-6同分异构体的混合物。为了确认其，通过高性能液体色谱法(HPLC)及质谱仪(Mass spectrometry)分析制备的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。图1为高性能液体色谱法结果，图2为质量分析结果。如图1所示，观察到4种类的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的合成。另一方面，当表没食子儿茶素没食子酸酯二聚体不能正常合成并形成凝聚时，在6～6.4分钟段中出现了峰。
HRMS-ESI：C46H40NO22[M+H]+计算值958.2036，实验值958.2062
反应式1
Figure BDA0002711076480000161
合成例2.藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的制备
利用碳二亚胺介导的耦合反应并以反应式2的方法在具有羧酸基的高分子接合表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。在存在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)的酸性条件下(pH4.7)，使藻酸盐(Alginate)与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行过夜反应，从而通过进行表没食子儿茶素没食子酸酯的胺基与HA的羧酸形成酰胺键而成的酰胺基键合来制备藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体。
反应式2
Figure BDA0002711076480000181
具体地，在暗室条件下，在3颈烧瓶中，20.2ml的0.4M MES缓冲液(pH5.2)及2.5ml的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液添加202mg的藻酸盐并进行搅拌。藻酸盐完全溶解后，将烧瓶内部更换成氮气气氛并密封。在3ml的0.4M MES缓冲液(pH5.2)溶解89mg的N-羟基琥珀酰亚胺(0.78mmol)后，利用注射器进行添加。在2.33ml的去离子水溶解4mg的通过上述合成例1制备的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物(0.082mmol)后，利用注射器进行添加。接着，在3ml的0.4M MES缓冲液(pH5.2)溶解66mg的N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(0.78mmol)后，利用注射器进行添加。所有反应均在氮气气氛下的暗室条件下进行搅拌。
接着，通过乙醇沉淀法对反应混合物进行沉淀，去除未反应物(EDC，NHS，未反应EGCG二聚物)。具体地，在氮气气氛下，在125ml的去离子水溶解反应混合物，并添加16.7ml的5M氯化钠水溶液后，将pH调节成3。添加310ml的乙醇后，将混合物转移到离心分离用容器中，并通过超离心分离(ultracentrifugation)进行沉淀。去除上清液，在250ml的去离子水溶解沉淀物，添加33ml的5M氯化钠水溶液后，将pH调节成3。添加620ml的乙醇后，将混合物转移到离心分离用容器中，并通过超离心分离(ultracentrifugation)进行沉淀。去除上清液，在500ml的去离子水溶解沉淀物，添加67ml的5M氯化钠水溶液后，将pH调节成3。添加1240ml的乙醇后，将混合物转移到离心分离用容器中，并通过超离心分离(ultracentrifugation)进行沉淀。去除上清液，在300ml的去离子水溶解沉淀物。
使用350Da的透析膜，将获取的溶解物在氮气气氛下透析24小时。通过冷冻干燥透析的溶液来获取目标藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)结合体。在使用制备的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体之前，放入超低温冷冻箱进行保管。
合成例3.表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的氧化
表没食子儿茶素没食子酸酯大致可向两个方向进行变性，其中一个为氧化，而另一个为差向异构化。上述变形根据表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度、pH、温度及氧气分压等多种条件可改变其形态和速度。当表没食子儿茶素没食子酸酯以微摩尔浓度水平存在时，其氧化迅速进行，并且，当其以毫摩尔浓度存在时，各个表没食子儿茶素没食子酸酯分子将相互抑制氧化，从而降低氧化速度。并且，在pH为2～5.5的弱酸性条件下，抑制表没食子儿茶素没食子酸酯的氧化，虽然进行差向异构化，但是，在强酸或碱性条件下，氧化迅速进行，并且，当在高于50℃的温度条件下，表没食子儿茶素没食子酸酯可产生差向异构化，但在低的温度条件下可发生氧化。尤其，在极低温条件下表没食子儿茶素没食子酸酯的变性将进行得非常缓慢。另一方面，随着氧气分压的降低，表没食子儿茶素没食子酸酯的氧化将会被抑制，而进行差向异构化，在并不具有pH或浓度条件的环境下，当表没食子儿茶素没食子酸酯暴露在空气时，迅速进行氧化，从而可形成凝聚体。
因此，未形成凝聚体的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的氧化，调节了表没食子儿茶素没食子酸酯的浓度、pH、温度及氧气分压。
以下，示出了藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体的氧化。
Figure BDA0002711076480000211
制备例
藻酸盐与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的比率确定
确认是否形成藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的水凝胶
为了制备最优化用于细胞皮膜的微胶囊，即使藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体暴露在空气中也不会进行凝胶化，且应以溶液状态存在。为了确定这一点，通过改变与藻酸盐接合的表没食子儿茶素没食子酸酯的种类及量来最优化藻酸盐与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的量。
1.使用表没食子儿茶素没食子酸酯单体
通过现有方法，使用202mg的表没食子儿茶素没食子酸酯单体接合在藻酸盐。大量的表没食子儿茶素没食子酸酯接合在藻酸盐，当暴露在空气时，即使在无酶环境中也会迅速凝胶化。
2.使用9～99mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物
使用99mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物并通过合成例2的方法制备藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体。但是，如图3所示，当接合体暴露在空气中的氧气时，即刻形成了水凝胶。测定形成的水凝胶的流变物性，并在图4中示出。虽然形成的水凝胶的物性为可适用于微胶囊的水平，但是，当暴露在空气时，由于即刻发生凝胶化，难以适用于微胶囊的工序。因此，需要减少接合在藻酸盐的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的量。
3.使用4mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物
使用4mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物并通过合成例2的方法制备藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体。制备的结合体在空气中并未凝胶化。在图5中示出。
微胶囊的制备
比较例1.藻酸钙胶囊制备
通过已公开的制备方法制备藻酸钙胶囊。
比较例2.藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(mono)微胶囊的制备
使用202mg的表没食子儿茶素没食子酸酯单体制备藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(mono)微胶囊。
比较例3.藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)微胶囊的制备
通过利用使用4mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物制备的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)结合体制备微胶囊。当制备胶囊时，钙离子的浓度为100mM或1M。
如图6所示，胶囊并未正确形成。在胶囊化工序中，这种形态通常在藻酸盐的浓度超出适当范围或钙离子浓度低时发生。经确认，在本发明中，表没食子儿茶素没食子酸酯的抗氧化特性可抑制钙离子介导的藻酸盐交联。通常，如表没食子儿茶素没食子酸酯的儿茶素可以与金属阳离子相结合及螯合。据预测，存在于反应物内的少量钙离子通过与表没食子儿茶素没食子酸酯相结合来改变表没食子儿茶素没食子酸酯的结构，可减少表没食子儿茶素没食子酸酯的抗氧化能力。
比较例4.藻酸盐/藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)微胶囊的制备
为了解决基于表没食子儿茶素没食子酸酯的交联抑制问题，通过使用混合纯藻酸盐溶液与藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯(di)接合体的混合物来进行胶囊化。为了防止表没食子儿茶素没食子酸酯的氧化，在氮气气氛下的暗室条件下进行反应。
首先，为了最优化藻酸盐与藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的混合比率，通过制备藻酸盐与藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的混合比分别为1∶1、2∶1及3∶1重量份的混合物来进行胶囊化。如图7所示，相对于1重量份的藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体，当藻酸盐的混合比为2重量份以上时，可正常形成微胶囊。
钙离子依赖性及分解度评价
评价根据比较例1及比较例4(藻酸盐及藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯接合体的混合微胶囊)制备的微胶囊的钙离子依赖性及分解度。具体地，用作为钙离子螯合剂的乙二胺四乙酸处理后，确认微胶囊的形态，并在图8中示出。
经确认，相比于比较例1的微胶囊，比较例4的微胶囊具有对钙离子螯合剂的抗性。但是，在分解度的层面上并没有表示出很大的差异，分解度改善效果也不大。另一方面，当经过辣根过氧化物酶处理时，由于残留的辣根过氧化物酶的乙二胺四乙酸催化作用，相比于比较例1的微胶囊，比较例4的微胶囊被分解地更快。
实施例1.表面改性藻酸盐微胶囊的制备
用表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物表面改性藻酸钙微胶囊。为了最优化，在多个反应时间、表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的浓度及是否存在氧化处理的条件下制备微胶囊。
反应时间
为了在不增加凝胶化趋势的同时增加表没食子儿茶素没食子酸酯的接合量，在制备藻酸钙胶囊后，接合表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。
通过已公开的方法制备藻酸钙胶囊。将制备的胶囊用HEPES缓冲液(ph7.4)清洗4次，接着，用MES缓冲液(ph6.0)清洗2次，并在50ml的MES缓冲液中保管已清洗的胶囊。在暗室条件下，在2ml的存在胶囊的MES缓冲液中添加40mg的已溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(0.347mmol)并进行搅拌。接着，以多种浓度(0.347mmol及0.174mmol)添加没食子儿茶素没食子酸酯二聚物并进行搅拌。接着，在2ml的MES缓冲液中添加66mg的已溶解的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺。按时间(10分钟、20分钟、30分钟及60分钟)确认反应混合物，从而检查表面改性状态。所有反应均在暗室条件下进行。
并且，为了确认基于氧化处理的影响，在反应时间为0分钟的条件下，添加1U/ml的辣根过氧化物酶并搅拌30分钟。
在此情况下，反应中所使用的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的量以基于藻酸盐的单体摩尔的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺∶藻酸盐＝1∶1∶1。
如图9所示，在10分钟、20分钟、30分钟及60分钟的反应时间中，藻酸盐胶囊的表面改性均为正常。经观察，随着反应时间的增加，可形成更多表没食子儿茶素没食子酸酯的凝聚，接合在微胶囊表面的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与其他表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物相结合，表没食子儿茶素没食子酸酯具有向微胶囊内部渗透的形态。
在进一步的实验中，为了使细胞损伤最小化，将反应时间设定为10～20分钟。
反应时间、表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物浓度及辣根过氧化物酶处理
通过是否辣根过氧化物酶处理、多种反应时间及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物浓度改性微胶囊，在图10中示出其图像。
经确认，表没食子儿茶素没食子酸酯的结合度受表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的浓度的影响大于反应时间。
并且，虽然利用光学显微镜未能够观察到明显的氧化，但通过肉眼容易观察到颜色变化。图11及图12为确认根据是否经过辣根过氧化物酶处理的表面改性藻酸盐微胶囊的颜色变化的图。图11左侧部分为未经过辣根过氧化物酶处理的图，而右侧为经过辣根过氧化物酶处理的图。当微胶囊表面的表没食子儿茶素没食子酸酯通过辣根过氧化物酶，氧化时，表没食子儿茶素没食子酸酯相互凝聚，并变成红色。
实施例2.表面改性藻酸盐胶囊制备工序及涂敷藻酸盐的表面改性藻酸盐微胶囊 的制备
表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物包含胺基。在与藻酸盐直接接合的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的情况下，胺基与藻酸盐形成酰胺键，因此并不带阳电荷，但是，在表没食子儿茶素没食子酸酯之间通过氧化结合的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的情况下，由于具有胺基，表现出带阳电荷。根据以往的研究，阳电荷的生物材料比中性或具有阴电荷的生物材料可诱发更多的免疫反应及炎症。
为了防止发生不必要的免疫反应，用藻酸盐涂敷实施例1的表面改性藻酸盐微胶囊的外部。
通过已公开的方法制备藻酸钙胶囊。将制备的胶囊用HEPES缓冲液(pH7.4)清洗4次，接着，用MES缓冲液(pH6.0)清洗2次，并在50ml的MES缓冲液中保管已清洗的胶囊。在暗室条件下，在2ml的存在胶囊的MES缓冲液中添加40mg的已溶解的N-羟基琥珀酰亚胺(0.347mmol)并进行搅拌。接着，以多种浓度(0.347mmol及0.174mmol)添加没食子儿茶素没食子酸酯二聚物并进行搅拌。接着，在2ml的MES缓冲液中添加66mg的已溶解的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺。按时间(10分钟、20分钟、30分钟及60分钟)确认反应混合物，从而检查表面改性状态。所有反应均在暗室条件下进行。
并且，为了确认氧化处理的影响，进项经过/未经过辣根过氧化物酶处理。
实施例3.乙二胺四乙酸处理表面改性藻酸盐微胶囊的制备
通过用100mM的乙二胺四乙酸处理(10分钟及20分钟)实施例1及实施例2的微胶囊来在微胶囊中形成中空。
实施例1.结构分析
表面分析
图13为示出比较例1、实施例1、实施例2的微胶囊的扫描电子显微镜(SEM)图像。分别以×70、×10000、×50000、×100000倍率拍摄扫描电子显微镜图像。经观察，相比于比较例1，在实施例1的微胶囊的表面表现出了特异形态。另一方面，经确认，在实施例1中出现的特异形态在实施例2的微胶囊表面消失。由此确认，用表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物改性的藻酸盐微胶囊表面被涂敷藻酸盐。
内部结构分析
利用扫描电子显微镜(SEM)分析实施例1及实施例2的微胶囊内部结构，并在图14中示出。
也可通过扫描电子显微镜图像确认形成核壳结构。相比于未经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊，经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊可形成更厚的外膜，并具有优秀的气孔。
图15为示出用实施例1或实施例2的表面改性藻酸盐微胶囊包膜胰岛的过程的示意图。
首先，用藻酸钙微胶囊包膜胰岛。接着，在藻酸钙微胶囊的表面接合表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。由于与藻酸盐结合的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物螯合内部的钙，藻酸钙水凝胶被溶解。通过这种过程，部分内部藻酸盐被溶解，从而形成藻酸核/藻酸盐-表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物壳结构的微胶囊。在此情况下，上述钙-水凝胶的溶解可全部发生或仅发生一部分。
相比于现有技术的微胶囊，由于这种结构易于扩散氧气及营养素，从而可提高胶囊化的胰岛的存活率。
钙离子依赖性及分解度评价
评价根据表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的使用量、反应时间及经过辣根过氧化物酶处理的比较例1及实施例1的微胶囊的钙离子依赖性及分解度。用已知为钙离子螯合剂的乙二胺四乙酸(100mM)处理比较例1及实施例1的微胶囊并确认形态变化。
如图16所示，在用100mM的乙二胺四乙酸处理20分钟的条件下，比较例1的藻酸钙微胶囊完全被分解变为溶液状态。另一方面，如图17所示，实施例1的微胶囊经过乙二胺四乙酸处理，微胶囊也并没有被崩解，还维持着形态。这意味着本发明的微胶囊对于通过乙二胺四乙酸的钙离子螯合作用具有抗性。经确认，乙二胺四乙酸处理不仅能够在实施例1的微胶囊中形成中空(hollow)，而且有利于胶囊内部的物质扩散及氧气供给。乙二胺四乙酸未处理的微胶囊的物理性质(对于物理损伤的稳定性)优于乙二胺四乙酸处理的微胶囊。
另一方面，当制备微胶囊时使用的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物的量越多、反应时间越长，分解度显示出增加的趋势，但并不是显著的水平。并且，在经过辣根过氧化物酶处理的实施例1的微胶囊的情况下，分解度增加，其源于残留的辣根过氧化物酶可增加乙二胺四乙酸的活性。
因此，通过调节乙二胺四乙酸的处理时间及处理浓度来最优化微胶囊的形态，从而可进一步提高包膜的胰岛的存活率并保护其不受物理损伤。
流变学特性评价
为了确认比较例1、比较例3及实施例1的微胶囊的物性，测定流变学特性，其结果在图18至图21中示出。
图18为示出流变能力(Rheology)测定结果的图，图19至图21为示出粘弹性测定结果的图。
参照图19，相比于比较例1，比较例3的微胶囊表示较低的物性，据推测，其源于表没食子儿茶素没食子酸酯的钙离子螯合作用。与是否添加辣根过氧化物酶无关地，相比于比较例1，实施例1的微胶囊表示更高的物性。另一方面，经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊比未经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊表示较低的物性，据推测，其源于即便通过辣根过氧化物酶处理形成更厚的表没食子儿茶素没食子酸酯壳，但是通过辣根过氧化物酶处理更积极地促进了表没食子儿茶素没食子酸的钙离子螯合作用，从而降低了核的物性。
制备实施例1的微胶囊后保管2周后，确认粘弹性变化(图21)。在经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊的情况下，粘弹性有所降低，但经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊大部分维持着粘弹性。这是因为经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊的核中的藻酸盐的溶解被促进，从而降低部分物性，但是通过辣根过氧化物酶在表没食子儿茶素没食子酸酯之间形成稳定的结合。另一方面，据推测，在未经过辣根过氧化物酶处理的微胶囊的情况下，由于在制备时未完全溶解核的海藻盐呈现出高物性，但在保管期间，随着核的藻酸盐被溶解，物性被降低。
实施例4.胰岛胶囊化
使用实施例1的微胶囊制备方法对胰岛进行胶囊化。当制备微胶囊时，利用光学显微镜确认根据否经过辣根过氧化物酶处理的特性，并在图22中示出。
图22的上端为示出未添加辣根过氧化物酶的胰岛胶囊化表面改性藻酸盐微胶囊的光学显微镜图像，图22的下端为示出添加辣根过氧化物酶的胰岛胶囊化表面改性藻酸盐微胶囊的光学显微镜图像。经观察，部分核的藻酸盐被溶解为溶液形态，部分为具有水凝胶状态的浆料形态。经确认，胰岛的包膜很好的形成，以从物理损伤中保护细胞的同时以适于提高存活率。
实施例5.确认根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量的表面改性微胶囊的分解抗性
为了确认根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量的表面改性微胶囊的分解抗性，利用光学显微镜确认当在每5ml的藻酸盐中表没食子儿茶素没食子酸酯添加量为10.5mg、21mg、42mg及84mg时的微胶囊的形态，并在图23中示出。测定当通过乙二胺四乙酸去除Ca2+时发生的对于分解的抗性，经确认，当每5ml的藻酸盐(alginate)中的表没食子儿茶素没食子酸酯使用量为84mg以上时表示出抗性。
实施例6.确认是否形成根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量的表面改性微胶囊的外部表没食子儿茶素没食子酸酯层
为了确认是否形成根据表没食子儿茶素没食子酸酯使用量的表面改性微胶囊的外部表没食子儿茶素没食子酸酯层，利用共聚焦光学显微镜确认当表没食子儿茶素没食子酸酯添加量为10.5mg、21mg、42mg及84mg时的外部层的形态。分解抗性通过形成于核藻酸盐(alginate)外部的表没食子儿茶素没食子酸酯层表示，与Ca2+无关地，表没食子儿茶素没食子酸酯层内部的结合通过表没食子儿茶素没食子酸酯自身的自氧化(autooxidation)形成，与普通的藻酸盐的溶解过程不同。
经确认，在上述实施例中，当每5ml的藻酸盐(alginate)中的用于制备表面改性微胶囊所使用的表没食子儿茶素没食子酸酯的量为84mg以上时，表没食子儿茶素没食子酸酯层的形成非常明显。
实施例7.确认微胶囊内部胰岛的葡萄糖反应及胰岛素释放能力
为了确认普通胰岛、藻酸盐微胶囊内部胰岛及表面改性微胶囊内部胰岛的葡萄糖反应及胰岛素释放能力，进行了葡萄糖刺激下的胰岛素分泌试验(GSIS，Glucose-stimulated insulin secretion)分析，将其结果示于图25。经确认，相比于普通胰岛，微胶囊内部的胰岛的葡萄糖反应低。其为源于因微胶囊结构的胰岛素扩散缓慢而引起的结果。但是，在藻酸盐微胶囊内部胰岛与表面改性微胶囊内部胰岛的情况下，葡萄糖反应并没有显著差异。这意味着表面改性过程并不会影响内部胰岛的功能。
实施例8.在患有糖尿疾病的小鼠动物模型中通过表面改性微胶囊化胰岛的移植的功效、持续时间评价及回收的微胶囊的功效、持续时间及形态分析
将利用84mg的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物制备的表面改性微胶囊的血糖浓度示于图26，为了分析表面改性的微胶囊及藻酸盐微胶囊的效果及形态，将根据胰岛移植的患有糖尿病疾病的小鼠的血糖浓度及体重示于图27，在第67天及第85天回收移植的微胶囊并用光学显微镜观察其形态，将其结果示于图28。
首先，在调节血糖期间，由于表面改性微胶囊及藻酸盐微胶囊等统计上的非有效性，功效约持续了60天。经确认，在回收的微胶囊的形态的情况下，相比于藻酸盐微胶囊，表面改性微胶囊进一步稳定地维持。在表面改性微胶囊的情况下，除了在表面出现细胞吸附之外，并未产生免疫反应，而在藻酸盐微胶囊的情况下，在内部形成了组织。综合上述结果可确认，通过表没食子儿茶素没食子酸酯的藻酸盐(alginate)微胶囊的表面改性为改善微胶囊的结构稳定性的有效方法。

Claims (19)

1.一种表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶，具有核壳结构。
2.根据权利要求1所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，上述壳的部分表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物通过与其他表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行氧化而相互结合。
3.根据权利要求1所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，上述壳还包括藻酸盐涂敷层。
4.根据权利要求3所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，上述藻酸盐涂敷层与壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物一同形成酰胺键。
5.根据权利要求1所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，上述壳包括三维连接的多个中空。
6.根据权利要求1所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，上述核为液体藻酸盐或液体藻酸盐与藻酸盐水凝胶的混合物。
7.根据权利要求1所述的表面改性藻酸盐微胶囊，其特征在于，用于细胞皮膜。
8.一种表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法，其特征在于，
包括：
核制备步骤(1)，制备藻酸钙微胶囊；
壳制备步骤(2)，通过使藻酸钙微胶囊及表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物进行反应来在上述藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及
核液化步骤(3)，将藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物，
上述核为流态的藻酸盐，壳为由表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联而成的藻酸盐水凝胶。
9.根据权利要求8所述的表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法，其特征在于，还包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。
10.根据权利要求8所述的表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法，其特征在于，还包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。
11.根据权利要求8所述的表面改性藻酸盐微胶囊的制备方法，其特征在于，还包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。
12.一种利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法，，其特征在于，包括：
核制备步骤(a)，用藻酸钙水凝胶微胶囊包膜细胞；
壳制备步骤(b)，使皮膜细胞的藻酸钙水凝胶微胶囊与表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物产生反应来在藻酸钙微胶囊表面形成藻酸盐表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物交联物；以及
液化上述细胞周围的水凝胶的步骤(c)，将上述藻酸钙的钙离子螯合到表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物。
13.根据权利要求12所述的利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法，其特征在于，还包括使上述制备的壳的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物与相邻的表没食子儿茶素没食子酸酯二聚物氧化结合的步骤。
14.根据权利要求12所述的利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法，其特征在于，还包括用藻酸盐涂敷上述制备的壳的步骤。
15.根据权利要求12所述的利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法，其特征在于，还包括通过使上述制备的表面改性藻酸盐微胶囊与钙离子螯合剂进行反应来形成中空的步骤。
16.根据权利要求12所述的利用具有核壳结构的表面改性藻酸盐微胶囊的细胞包膜方法，其特征在于，上述细胞为胰岛细胞。
17.一种糖尿病的治疗方法，其特征在于，包括向有需要的个体给药权利要求1至7中任一项所述的胶囊的治疗有效量的步骤。
18.一种组合物，其特征在于，包含用于预防或治疗糖尿病的权利要求1至7中任一项所述的胶囊。
19.一种组合物的用途，其特征在于，包含用于生产用于预防或治疗糖尿病的药剂的权利要求1至7中任一项所述的胶囊。
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