KR101676103B1 - 인산화된 칼슘 알기네이트 복합체로부터 유래된 주사가능한 하이드로겔 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인산화된 칼슘 알기네이트(CaPAlg)를 포함하는 다공성의 주사가능한 하이드로겔의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 하이드로겔에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인산화된 칼슘 알기네이트 복합체로부터 유래된 주사가능한 하이드로겔은 물리적으로 더 안정하고, 세포성장에 유리한 마이크로 환경을 제공할 수 있으며, 세포독성 및 세포 전달에 있어서 우수한 효과를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하이드로겔은 세포의 3D 캡슐화에 대하여 유리한 마이크로 환경을 제공할 수 있어, 연골 및 소프트 조직 공학에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인산화된 칼슘 알기네이트 복합체로부터 유래된 주사가능한 하이드로겔{Injectable Hydrogels Derived from Phosphorylated Calcium Alginate Complexes}
본 발명은 인산화된 칼슘 알기네이트(CaPAlg)를 포함하는 다공성의 주사가능한 하이드로겔의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 제조된 하이드로겔에 관한 것이다.
1960년대 O.Wichterle et al.(Nature, 1960)등에 의해 폴리-2-하이드록시에틸메타아크릴레이트(PHEMA)로 이루어진 하이드로겔이 개발된 이후로 하이드로겔이 가지는 친수성과 생체적합성으로 인하여 생체재료분야에서의 응용에 대한 관심이 꾸준히 증가되어 왔다.
이러한 하이드로겔은 초기에는 고흡수성을 기반으로 하는 위생용품에 주로 이용되었으나, 현재에는 다양한 부가적인 기능성의 도입에 의해 약물전달시스템, 색전술, 조직공학용 지지체, 케미컬밸브, 단백질의 분리, 농축 및 안정화, 면역어세이, 생물반응기, 센서, 크로마토그래피 및 화장품 충진제 등 의약학적 응용에서 산업적 응용에 이르기까지 매우 광범위한 분야에서 유용하게 이용되고 있다.
1980년경 칼슘알기네이트 하이드로겔이 개발된 이후 천연 또는 합성고분자를 이용한 다양한 생체재료용 하이드로겔이 개발되었으며, 특히, 생분해성을 가진 주사가능한 하이드로겔은 생물학적으로 활성 분자의 캡슐화가 가능하고, 이들의 우수한 성형성(formability)으로 인하여 고통스러운 수술없이 인체에 투여되는 것이 가능한 독특한 특성 때문에, 바이오활성 제제의 방출을 조절하기 위한 약물 전달 시스템 및 조직 공학을 위한 일시적인 세포외 기질로서 활발하게 연구되고 있다.
한편, 알기네이트는 Ca2 +, Mg2 +, Ba2 +와 같은 2가 양이온과 킬레이팅하여 하이드로겔을 형성하는 것으로 알려져있다(Seliktar, D. et al., Science., 2012). 상기 하이드로겔은 CaCl2 및 CaSO4와 같은 칼슘 염을 사용한 전형적인 외부적 세팅 기술(external setting technique)에 의하여 제조되며, 두 개의 마주보는 GG 블록(egg-box model)의 산소원자가 양이온과 결합함으로써 체인간 크로스-링킹을 형성한다. 이러한 알기네이트 하이드로겔은 생체적합성 및 낮은 독성 때문에 바이오메디컬 응용분야에서 중요성을 가진다.
특히, 바이오물질로서 알기네이트 하이드로겔은 화학적 변형을 통하여 내재적 특성을 강화시킬 수 있고, 새로운 특성을 도입할 수 있다. 그 예로, Grøndahl et al.(Biomacromolecules , 2011)은 하이드록시아파타이트(hydroxyl apatite)의 결정핵생성(nucleation) 및 성장을 유도하는 능력을 측정하는 유레아/포스페이트 방법을 사용하여 인산화된 알기네이트 유도체(PAlg)를 제조하였다.
그러나 일반적으로 사용되는 외부적으로 Ca2 +을 첨가되는 것에 의한 방법으로는 인산화된 알기네이트를 이용하여 하이드로겔을 형성하기가 어렵다. 이는 인산화된 알기네이트의 분자량 감소 및 인산화에 의한 입체적 변화(conformational change) 때문이라고 생각된다.
이에 본 발명자들은 인산화된 알기네이트를 이용하여 하이드로겔을 제조하기 위하여 예의 연구,노력한 결과, 새로운 알기네이트 유도체로서 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg)를 알기네이트 소듐 염과 혼합하면 자기-겔화(self-gelation)없이 하이드로겔을 간편하게 형성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인산화된 알기네이트를 포함하는 수용액에 칼슘이온(Ca2 +)을 첨가하여 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg) 수용액을 제조하는 제1단계; 및 상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 소듐 알기네이트 수용액을 혼합하여 하이드로겔을 형성하는 제2단계를 포함하며, 상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg)는 인산화된 알기네이트와 칼슘이온이 결합하여 수용액에 분산된 것인, 주사가능한 하이드로겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의하여 제조된 주사가능한 하이드로겔을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 칼슘이온(Ca2+)으로 가교결합된 인산화된 알기네이트 칼슘(CaPAlg)을 포함하는 다공성의 주사가능한 하이드로겔을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인산화된 알기네이트를 포함하는 수용액에 칼슘이온(Ca2+)을 첨가하여 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg) 수용액을 제조하는 제1단계; 및 상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 소듐 알기네이트 수용액을 혼합하여 하이드로겔을 형성하는 제2단계를 포함하며, 상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg)는 인산화된 알기네이트와 칼슘이온이 결합하여 수용액에 분산된 것인, 주사가능한 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명의 주사가능한 하이드로겔을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 인산화된 알기네이트를 포함하는 하이드로겔을 제조함에 있어서, 일반적으로 사용되는, 칼슘이온을 알기네이트 용액내에 분산시켜 하이드로겔을 형성하는 경우(이러한 방법을 이하 '외부적 세팅 기법(external setting technique)'이라 한다), 칼슘이온(Ca2+)이 포스페이트에 대하여 강한 친화력을 보이고, 다른 인산화된 알기네이트 분자(PAlg)와는 가교결합하지 않기 때문에, 인산화된 알기네이트를 포함하는 하이드로겔을 형성하기 어려운 점을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 가교제로서 칼슘이온을 먼저 인산화된 알기네이트와 결합시킨 후, 보다 쉽게 이온화될 수 있는 알기네이트와 혼합할 경우(이러한 방법을 이하 '내부적 확산 기법(internal diffusion technique)'이라 한다) 보다 손쉽게 인산화된 알기네이트를 포함하는 하이드로겔을 형성할 수 있는 것에 그 기술적 특징이 있다.
본 발명의 "알기네이트"는 알긴산 염으로서, 알긴산은 자연산 다당류로 미역, 다시마와 같은 갈조류의 중요 구성성분이다. 알긴산은 생체적합성이 뛰어나고 독성이 낮으며 가격이 비교적 저렴한 장점이 있다. 또한, 알긴산 수용액은 2가 양이온(예: Ca2 +)과 결합하여 하이드로겔을 비교적 쉽게 생성한다. 알긴산의 구성요소인 D-만누론산과 L-글루론산의 함량은 갈조류의 종류에 따라 다르고 알긴산의 물성에 큰 영향을 미친다. 특히 알긴산의 분자구조는 D-만누론산과 L-글루론산이 블록공중합체 형태를 이루고 있고, L-글루론산 블록이 2가 양이온과 결합하여 하이드로젤을 형성하기 때문에 L-글루론산 블록의 길이가 알긴산 하이드로젤의 물리적인 성질을 결정하는 중요한 요소이다. 현재 사용되는 알긴산의 일반적인 분자량은 30,000∼400,000이고,Mark-Houwink 관계식([η]＝KMv a )의 상수값 K와 a는 각각 2×10-3과 0.97이다(0.1 M NaCl 용액, 25 ℃).
본 발명에 따른 인산화된 칼슘 알기네이트를 포함하는 하이드로겔의 제조방법에서 제1단계는 인산화된 알기네이트(PAlg)를 수용액에 용해한 후 칼슘이온(Ca2+)을 첨가하여 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg) 수용액을 제조하는 단계이다(도 1).
여기서, 상기 PAlg를 제조하는 방법은 당업계에서 알기네이트를 인산화하기 위하여 사용하는 방법이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 일예로, 1가 이온과 염형태를 이루고 있는 알기네이트를 인산염과 혼합하여 제조할 수 있다. 이는 알기네이트 전구체가 수용성이어야 하나, 2가 이온들의 경우, 알기네이트와 반응시 겔을 형성하여 비수용성이 되기 때문에, 상기 1가 이온과 염형태를 이루고 있는 알기네이트를 사용한다. 상기 1가 이온으로는 H+, Li+, Na+, K+, NH4 + 등이 가능하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는, 소듐 알기네이트를 H3PO4/P2O5/Et3PO4/1-hexanol 기법을 사용하여 인산화된 알기네이트(PAlg)를 제조하는 것으로, 상세하게는 소듐 알기네이트를 인산(H3PO4)용액에 분산시키고, 오산화인(P2O5) 및 트라이에틸포스페이트(Et3PO4)가 포함되어 있는 헥산올 용액을 첨가한 후, 상기 반응 혼합물에 과량의 메탄올을 첨가하여 제조하였다.
상기 CaPAlg 복합체는 인산화된 알기네이트와 칼슘이온이 결합한 것이며, 이는 인산화된 알기네이트 분자와 칼슘이온의 양성자 교환에 의하여 제조할 수 있다.
상세하게는 상기 PAlg를 증류수에 용해시키고, 이에 Ca(OAc)2 수용액을 첨가하여 제조할 수 있다. 이는 pH 8이하일 수 있다.
또한, 상기 제1단계는 상기 CaPAlg 복합체 수용액을 투석하여 무기염을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 투석 및 동결건조 후에 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체는 흰색 분말로 얻어진다.
본 발명의 제2단계는 상기 CaPAlg 복합체 수용액 및 PAlg 수용액을 혼합하여 하이드로겔을 형성하는 단계이다. 일예로 1 내지 10중량%의 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 상기 소듐 알기네이트 수용액을 혼합할 수 있으며, 다른 일예로는 1 내지 3중량%일 수 있다.
또한, 상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 소듐 알기네이트 수용액은 1:0.1 내지 1:10의 부피비로 혼합할 수 있으며, 일 예로 1:0.25 내지 1:4의 부피비로 혼합할 수 있다. 또 다른 일 예로는 1:0.67 내지 1:1.5의 부피비로 혼합할 수 있다.
상기 부피비로 혼합된 CaPAlg40~60은 주사가능한 최적의 겔화시간(약2~10분) 및 300~400㎛ 크기의 기공구조를 가져 세포성장에 유리한 마이크로 환경을 제공할 수 있으며(실험예 4, 도 7 및 도 8), 진동수에 따른 모듈러스 변화의 변화가 적어 더 안정한 하이드로겔을 제공할 수 있고(실험예 3, 도 8(f)), 생체적합성과 관련하여, 단기간의 세포 배양에 있어서, 세포독성 및 세포 전달에 있어서 우수한 효과를 제공할 수 있다(실험예 5).
알기네이트를 포함하는 하이드로겔에 있어서, P가 포함되면(인산화된 알기네이트), 강화된 분해에 대한 저항성이 나타난다. 그러나, 종래의 칼슘이온을 외부에서 첨가하여 하이드로겔을 제조하는 외부적 세팅 기법으로는 인산화된 알기네이트를 포함하는 하이드로겔을 제조할 수 없었다. 이에 본 발명자들은 미리 제조한 CaPAlg 복합체를 이용함으로써(내부적 확산 기법) 인산화된 알기네이트를 포함하는 하이드로겔을 간편하게 제조할 수 있음을 확인하였다(실험예4 및 도 8)
다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 주사가능한 하이드로겔을 제공한다.
상기 제조방법으로 제조된 하이드로겔은 CaPAlg 복합체 수용액 및 PAlg 수용액의 비율에 따라 겔화시간이 상이하며, CaPAlg40~60의 경우에, 약 2 ~ 10분의 겔화시간을 나타내어 주사방법으로 투여가 가능함을 확인하였다(실험예 4 및 도 8)
또한, 다공성의 몰폴로지를 가짐을 확인하여 약물 전달 시스템 및 조직 공학을 위한 일시적인 세포외 기질로서 사용될 수 있음을 확인하였다(실험예 2 및 도6).
또 다른 양태로서, 본 발명은 인산화된 알기네이트 칼슘(CaPAlg)을 포함하는 칼슘이온(Ca2+)으로 가교결합된 다공성의 주사가능한 하이드로겔을 제공한다.
본 발명에서 CaPAlg 복합체는 Ca2 + 및 PO4 -이온을 가지고 있는 폴리사카라이드 체인을 제공한다. 전형적인 외부적 세팅 기법(external setting technique)과 달리, 본 발명의 내부적 세팅 기법(internal diffusion technique)은 변형된 분자에 전반적으로 칼슘 이온 농도를 균일하게 증가시키기 위하여 칼슘이온(Ca2 +)을 알기네이트 분자내로 효율적으로 공급함을 ICP-OES 분석을 통하여 증가된 DS값으로 확인할 수 있었다(실험예 1-(3)).
본 발명의 주사가능한 하이드로겔은 소듐 알기네이트 및 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체의 비율의 조절에 의하여 최적의 겔화 시간 및 기계적 강도를 가진 하이드로겔을 제조하는 것이 가능함을 확인할 수 있었다(실험예3 및 도 8(f)).
본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 인산화된 칼슘 알기네이트 복합체로부터 유래된 주사가능한 하이드로겔은 주사로 피하에 주입가능한 최적의 겔화시간(약2~10분) 및 300~400㎛ 크기의 기공구조를 가져 세포성장에 유리한 마이크로 환경을 제공할 수 있으며, 진동수에 따른 모듈러스 변화의 변화가 적어 더 안정하고, 생체적합성과 관련하여, 단기간의 세포 배양에 있어서, 세포독성 및 세포 전달에 있어서 우수한 효과를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 주사가능한 하이드로겔의 제조방법은 온화한 반응조건에서 인산화된 알기네이트를 제조할 수 있으며, 최소의 Ca(OAc)2를 사용하는 것이 가능하고, 외부적으로 칼슘이온을 첨가하는 방법에 의하여 제조할 수 없었던 인산화된 알기네이트 하이드로겔을 내부적 세팅 기법(internal diffusion technique)에 의하여, NaAlg 및 CaPAlg를 혼합함으로써 균일한 이온농도를 가진 하이드로겔을 간단하게 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하이드로겔은 세포의 3D 캡슐화에 대하여 유리한 마이크로 환경을 제공할 수 있어, 연골 및 소프트 조직 공학에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg)를 제조하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 소듐 알기네이트(NaAlg), 인산화된 알기네이트(PAlg) 및 인산화된 칼슘 알기네이트 복합체(CaPAlg)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 소듐 알기네이트(NaAlg), 인산화된 알기네이트(PAlg) 및 인산화된 칼슘 알기네이트 복합체(CaPAlg)의 서모그램을 나타낸 것이다.
도 4은 NaAlg, PAlg 및 CaPAlg의 1H-NMR (D2O) 스펙트럼을 나타낸 것이다. 여기서, G 및 M 유닛 각각에 대하여 Gn 및 Mn은 C-n(n=1~5)에서의 양성자를 나타낸다.
도 5는 PAlg 폴리머의 31P-NMR 스펙트럼에서의 특징적인 피크를 나타낸 것이다.
도 6는 CaPAlg(A:적색) 및 NaAlg(B:청색)을 사용한 주사가능한 하이드로겔의 제조 및 형성에 대한 도시를 나타낸 것이다. (삽입된 사진은 전구체 용액의 액체 형태 및 A+B 혼합용액의 주사가능한 특성을 나타낸다.)
도 7은 CaPAlg 하이드로겔의 SEM이미지(a~d) 및 DMA 그래프(e)를 나타낸다: (a) CaPAlg20, (b) CaPAlg40, (c) CaPAlg60 및 (d) CaPAlg80을 나타낸 것이다.
도 8의 a)~d)는 CaPAlg 및 NaAlg 용액의 서로 다른 부피 비율로부터 제조된 하이드로겔을 나타낸 것이고, e)는 외부적 세팅 기법에 의해 제조된 하이드로겔을 나타낸 것이다: 동결전조 전(A), 후(B)의 형상 및 겔화시간(C)을 나타낸다. f)는 NaAlg 및 CaPAlg의 서로다른 조성비를 가지는 CaPAlg의 DMA를 나타낸 것이다.
도 9은 a) 4시간, b) 1일 및 c) 3일의 배양기간 동안, 하이드로겔 CaPAlg50 내에 캡슐화된 세포의 형광이미지를 나타낸다. 녹색 점은 생존한 세포를 나타낸 것이다.
도 10는 NaAlg 하이드로겔 및 CaPAlg50 하이드로겔의 0 ~ 1일 동안의 초기 세포의 생존 능력을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료의 준비>
본 발명의 소듐 알기네이트(NaAlg; Mw 1.2 ~ 1.9 ×105, M/G 비: 1.56), 트라이에틸포스페이트(triethylphosphate), 포스포러스 펜톡사이드( phosphorous pentoxide) 및 1-헥산올(1-hexanol)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, USA)로부터 구입하였으며, 인산(phosphoric acid)는 J.T.Baker(USA)로부터 구입하였다. 구입한 모든 화학물질은 추가의 정제없이 사용하였다.
제조예 1: 인산화된 알기네이트(PAlg)의 제조
NaAlg를 Amaral et al.(J. Biomater. Sci. Polymer Ed. 2005)에서 개시된 키토산의 인산화 과정에 따라 인산화하였다. 구체적으로, 소듐 알기네이트 파우더 1g을 37℃의 H3PO4 (43 mL)에 분산시키고, 여기에 별도로 제조된 오산화인(P2O5, 28 g) 및 트라이에틸포스페이트(Et3PO4, 38 mL)를 포함하는 헥산올(40mL) 용액을 서서히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 37℃에서 2일 동안 교반한 후, 과량의 메탄올(200ml)에 쏟아부어 흰색 침전을 얻었다. 상기 침전을 PTFE 필터(0.5 μm 의 기공크기, 47 mm 의 직경)를 사용하여 여과하고, 메탄올(50 mL)로 3회 세척하고 진공상태, 상온에서 하루동안 건조시켜 700mg의 옅은 노랑색의 인산화된 알기네이트(PAlg) 파우더를 72%의 수득률로 얻었다.
제조예 2: 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체( CaPAlg )의 제조
상기 제조예1에서 얻은 PAlg 파우더 100mg를 증류수 100ml에 용해시키고, 1.0N의 Ca(OAc)2 수용액을 서서히 첨가하여 pH를 8이하로 조절하였다. 이에 의하여 인산화된 알기네이트의 양성자와 칼슘이온(Ca2+)의 양성자 교환에 의하여 인산화된 알기네이트에 칼슘이온이 결합된 CaPAlg 복합체를 제조하였다(도 1). 이후, 상기 용액을 투석막(dialysis tubing membrane, (pore: 12,000 Da))을 사용하여 2일 동안 투석하여 상기 용액 내의 모든 무기염을 제거하였다. 물은 매 6시간마다 교환하였으며, 투석 및 동결건조 후에 87%의 수득률로, CaPAlg 흰색 파우더 97mg을 얻었다.
실시예 1: 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체( CaPAlg )로부터 하이드로겔의 제조
2wt%의 NaAlg 수용액(용액A) 및 상기 제조예 2에서 제조된 CaPAlg 복합체가 2wt% 포함된 수용액(용액B)를 별도로 제조하였다. 용액A 및 용액B를 하기 표 1에 나타난 각각의 비율로 혼합하고 짧은 볼텍싱(voltexing)을 하여 CaPAlg20, CaPAlg40, CaPAlg60 및 CaPAlg80을 제조하였다.
　Entry No 용액 A (mL) 용액 B (mL) Hydrogel
Code-Name
1 0.2 0.8 CaPAlg20
2 0.4 0.6 CaPAlg40
3 0.6 0.4 CaPAlg60
4 0.8 0.2 CaPAlg80
각각의 혼합물이 하이드로겔을 형성할 때까지 PDMS몰드(SYLGARD®)에 고정시켰다(도 6).
실험예 1 : 제조된 알기네이트 유도체의 특성 조사
NaAlg, PAlg 및 CaPAlg의 각각의 특성의 차이점을 확인하기 위하여, 하기와 같이 FT-IR 분석, TGA 분석, ICP-OES 분석 및 NMR 분석을 수행하였다.
(1) FT - IR 분석
FT-IR 분석은 Perkin-Elmer Spectrum BXII FT-IR spectrometer로 수행하였으며, IR 스펙트럼은 4000 내지 500cm-1 사이에서 4 cm-1의 분해능으로 16스캔을 가지고 기록하였다.
FT-IR 분석 결과, 도 2에 도시된 것과 같이 변형되지 않은 NaAlg와 변형된 알기네이트 샘플(PAlg 및 CaPAlg)의 FT-IR 스펙트럼을 나타내었다. 먼저, NaAlg의 IR 스펙트럼은 1614 및 1416 cm-1 (카복실레이트의 C=O 스트레칭 모드(비대칭 및 대칭)) 및 1300~1090 cm-1( C-O(H)) 및 C-O-C (고리) 진동모드)에서 특징적인 밴드를 나타내었다.
한편, NaAlg에서 인산화되어 구조가 변형된 PAlg의 경우, IR 스펙트럼에서 1740, 1630, 1244, 1084, 948 및 928 cm-1에서 몇몇의 새로운 피크가 관찰되었다. 이로써 1740 및 1630 cm-1 피크는 카복시산의 C=O 스트레칭 모드에 상응하므로, 소듐 알기네이트의 카복실레이트 이온이 대부분 산-형태로 전환되었음을 확인하였다.
또한, P=O 비대칭적 스트레칭, P-O-C (지방족) 및 두 개의 P-O(H) 진동모드와 같은 포스페이트 그룹으로부터의 다른 피크들도 분명하게 관찰되었으므로, 고리상에 포스페이트가 존재함을 확인할 수 있다.
소듐 알기네이트와 달리, 인산화 후 알기네이트에서 1300cm- 1피크가 소멸하였다. 이는 인산화가 알기네이트 고리의 하이드록실 그룹에서 일어난다는 사실을 나타낸다.
CaPAlg 복합체의 FT-IR 스펙트럼은 도 2에 나타난 바와 같이 NaAlg와 유사하나, PAlg와는 다소 차이가 나타났다. 1244 ~ 928 cm-1에서의 인(P)과 관련된 작용기(P=O, P-O-C, 및 P-O(H))의 특징적인 피크가 NaAlg와 비교하여 중요한 변화가 없다는 것은 알기네이트 고리에서 포스페이트가 온전하게 유지된다는 것을 나타낸다. 특히, PAlg의 1740 및 1630 cm- 1피크로부터 이동된 C=O와 관련된 1608 및 1422 cm-1에서의 넓은 피크는 모든 카복시산이 CaPAlg 복합체를 형성하는 카복실레이트 음이온으로 전환되었다는 것을 나타낸다.
따라서, 제조예 2에 따라 CaPAlg 복합체가 PAlg와 Ca(OAc)2의 양이온 교환 반응에 의하여 제조됨을 확인하였다.
(2) 열중량 분석( Thermogravimetric analysis , TGA )
열중량 분석(Thermogravimetric analysis, TGA)는 SCINCO TGA N-1500 (샘플중량 5 ± 0.1 mg, 승온속도 10 oC/min, 최초 온도 상온)을 사용하여 수행하였다.
TGA분석 결과인 열적 분해 패턴(thermal decomposition patterns)을 도 3에 나타내었다. 대조군으로서 사용된 NaAlg 샘플은 물의 증발 이후에 두 단계의 열적 분해를 보여준다. 탄화수소 분획의 열분해의 첫번째 단계는 200℃에서 일어났다. 약간 감소된 잔존 탄수화물이 250-500℃의 범위에서 열분해된 후, 열분해의 두번째 단계는 소듐 옥사이드의 잔존 중량의 약 20.7%를 유지한 채로 ~600℃에서 일어났다.
반면에 PAlg의 경우, 복잡한 단계의 열분해가 관찰되었다. 탄화수소 분획의 열분해의 첫번째 단계는 분명하게 200℃에서 일어난다. 그러나, 다음 단계는 추가적인 탄수화물의 열분해, 포스페이트 그룹의 포스포러스 펜톡사이드로의 탈수 및 포스포러스 펜톡사이드의 증발로 인하여 300-600℃ 및 >600℃의 범위에서 일어난다. 그 결과 잔존하는 다형성의 폴리포스페이트의 오직 0.5wt%만이 유리질 또는 무정형의 형태로서 존재한다.
PAlg의 경우와 유사하게, CaPAlg의 서모그램에서도 여러단계의 열분해가 관찰된다. 물의 증발 이후에, 탄화수소 분획의 열분해의 첫번째 단계는 200-300℃, 포스페이트 그룹이 포스포러스 펜톡사이드로의 탈수를 포함하는 추가적인 탄수화물 열분해에 대한 두번째 단계는 300-600℃에서 분명하게 관찰된다. 800℃ 이상의 고온 범위에서 추가적인 중량 손실은 아마도 고온에서 형성되는 Ca(OH)2 및 CaP 화합물의 계속적인 탈수의 진행이 원인일 것으로 생각된다. (예를 들면: Ca(OH)2 → CaO; Ca(H2PO4)2 → CaHPO4 → Ca2(PO4)2).
(3) ICP - OES 분석
ICP-OES 분석은 PAlg 및 CaPAlg 샘플의 DS값을 결정하기 위하여 사용되었다. 샘플들을 질산을 사용하여 침지(digest)시켰으며, Perkin Elmer Optima 5300dV spectrometer을 사용하여 1.5 mL/min의 포워드 레이트(forward rate)로 24℃의 온도 및 29±1%의 상대습도에서 분석하였다. 이 때, Burgener PEEK Mira Mist nebulizer가 사용되었으며, 상기 기기는 PAlg 샘플에 대하여는 213.62nm에서, CaPAlg 샘플에 대하여는 317.93nm에서 3개의 5초의 적분값의 평균을 구하는 것으로 수행되었다. 상기 모든 샘플을 3회씩 측정하였다.
이와 같이, PAlg 내의 P, 및 CaPAlg 내의 Ca의 함량은 ICP-OES를 이용한 원소 분석에 의하여 측정되었다. 모든 분석은 양 샘플(각각 100mg)에 대하여 3회씩 실시되었다. 고리형 단당류 유닛 1몰당 포함되어 있는 포스포러스 및 칼슘의 함량(ppm 및 mol%)은 표 2에 정리하였다.
Sample P Ca
x104 (mg/kg) DS (mol%) x104 (mg/kg) DS (mol%)
PAlg 1.5 ±0.1 12.5 - -
CaPAlg 0.31±0.02 7.8 7.8±0.1 112.5
평균적으로, PAlg 샘플은 고리형 단당류 유닛(CMU) 10몰 당 P원소 1.25몰을 포함하고 있고, CaPAlg 샘플은 고리형 단당류 유닛 1몰당 Ca 원소 1.13몰을 초과하여 포함하고 있다. 결과적으로 각각은 12.5 및 112.5mol%의 DS값을 나타낸다. 상기 DS값은 알기네이트 서브유닛당 도입된 포스페이트 그룹 또는 칼슘이온의 농도로서, CaPAlg 복합체가 높은 농도의 칼슘이온을 가짐을 알 수 있다. 상기 CaPAlg 복합체에 대한 Ca 이온의 DS값(112.5mol%)은 PAlg에 대한 P 원소의 DS값(12.5mol%)보다 훨씬 더 높게 나타났다. 이론적으로, PAlg 분자내의 카복시산 및 인산과 같은 작용기는 Ca(OAc)2의 존재하에 인산화된 알긴산 칼슘 복합체를 형성하기 위하여 양이온 교환하는 것이 가능하므로, 본 실험예에서는 CaPAlg 복합체 분자에 대한 Ca 이온의 DS 값은 분자내의 모든 카복시산 작용기 그룹에서 양성자가 칼슘이온으로 교환되었다는 전제하에 계산하였다. 따라서, 얻어진 높은 DS값은 모든 두 개의 고리형 단당류 유닛이 카복실레이트 작용기 사이트에서 칼슘이온을 가진다는 것을 나타내며, 약 12개의 고리형 단당류 유닛은 포스페이트 그룹 사이트에서 칼슘 이온을 가진다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 이러한 결과는 모든 카복실레이트 및 포스페이트 작용기는 2가 양이온과 임의의 뚜렷한 겔화작용(gelation)없이 강한 이온결합을 형성하고, 각각의 칼슘이온이 폴리머 분자의 표면에서 고르게 분산되어 있다는 것을 나타낸다. 이러한 화학적 특징은 CaPAlg 복합체가 잠재적으로 주사가능한 하이드로겔의 제조에 적합하다는 것을 보여준다.
(4) NMR 분석
NMR 분석은 Bruker Ultrashield 500 PLUS NMR spectrometer 에서 1H 및 31P의 핵에 대하여 실시하였다.
1H-NMR 분석은 인산화 및 Ca2 +와 양이온 교환이 가능한 사이트를 확인하기 위하여 PAlg 및 CaPAlg 모두에 대하여 실시하였다. 변형되지 않은 알기네이트 및 인산화된 알기네이트에 대한 1H-NMR 스펙트럼의 분석은 종래문헌에 잘 기재되어 있으며(Coleman, R., et al., Biomacromolecules 2011), 변형되지 않은 소듐 알기네이트 및 본 발명에서 제조된 포스페이트-변형된 알긴산의 메이저 피크는 도 4에 나타난 바와 같이 상기 문헌 값에 기초하여 정하였다. 전체적인 스펙트럼은 인산화 및 양성자화에 있어서 상당히 증가된 복잡성을 가지고 다운필드로 이동된다는 것을 잘 보여준다. Grøndahl et al.는 M잔기의 인산화는 주로 C-3 적도면상 하이드록실 그룹에서 일어나고, 또한 G 잔기에서도 인산화는 일어나나, 인산화의 사이트를 결정하는 것은 어렵다고 보고하고 있다. 그러나 도 4에 도시된 것과 같이, 상기 제조된 PAlg에 대하여 M 및 G 유닛 모두의 C-2, -3 및 -5에서 C-H 양성자는 NaAlg의 M 및 G 유닛 모두의 C-2, -3 및 -5에서 C-H 양성자과 비교하여 강하게 다운필드로 이동되었다. 반면에 C-1, -4 의 C-H 양성자는 약하게 이동되었다. 이러한 결과는 하이드록실 그룹의 인산화 및 C-5에서 모든 카복실레이트 그룹의 양성자 첨가에 의하여 C-2, -3 및 -5에서 많은 전기적 변화가 나타났다는 것을 보여준다.
따라서, H3PO4/P2O5/Et3PO4 방법은 다른 어떤 방법보다 비교적 높은 정도의 인산화의 증가를 가질 것으로 합리적으로 기대할 수 있다.
1H NMR 스펙트럼에서 나타난 중요한 변화는 상대적으로 높은 PAlg의 DS 값(평균 12.5 mol%)을 나타내는 ICP-OES의 결과와 일치하였다. 또한, 도 5에서 보여진 바와 같이, 피로인산염(pyrophosphate)으로 알려진 -0.01ppm에서의 강한 시그널 및 -10.83ppm에서의 낮은 세기의 시그널의 테스트된 PAlg의 31P-NMR 스펙트럼은 Grøndahl의 결과와 일치하였다. 이외의 다른 시그널을 관찰되지 않았다.
결과적으로, 칼슘이온과 PAlg의 양이온 교환 후에 얻어진 CaPAlg의 1H NMR 스펙트럼은 인산화에 의하여 야기된 PAlg에서 나타난 스펙트럼의 높은 복잡성이 유지되었다. 반면에, 전체적인 스펙트럼은 칼슘염의 형성 때문에 NaAlg의 경우와 유사한 업필드로 다시 이동되었다. NaAlg 의 스펙트럼과 비교할 때, CaPAlg의 M 및 G 유닛 모두의 C-2 및 C-3와 관련된 양성자는 인산화 때문에 여전히 약하게 다운필드로 이동되었다(도 4). 반면에 C-1, C-4 및 C-5는 NaAlg의 화학적 이동 값으로 거의 되돌아왔다. 또한, 양성자 피크의 일반적인 스플릿팅 패턴은 NaAlg의 패턴과 유사하였으나, 파인(fine) 패턴은 여전히 포스페이트 그룹의 존재 때문에 NaAlg의 패턴보다 더 복잡하게 나타났다(컬러 원 표시에서 피크 비교). 2가 양이온을 통하여 탈양성화된 포스페이트 및 카복실레이트 그룹 사이의 네트워크된 분자 내부 및 분자간 복합체는 아마도 양성자 피크의 스플릿팅 패턴에 영향을 미칠 것으로 생각된다.
결과적으로 C-2 및 C-3에서 하이드록실 그룹의 인산화 및 C-2, C-3 및 C-5에서 인산칼슘염(phosphoric acid calcium salt) 및 카복실산 칼슘 염(carboxylic acid calcium salt)과 같은 칼슘염의 형성은 G 및 M 유닛 모두에 대하여 C-2 및 C-3에서 양성장의 다운필드 이동 및 더 복잡한 양성자 피크의 스플릿팅을 야기시킨다.
실험예 2 : CaPAlg 및 NaAlg 의 비율에 따른 하이드로겔의 기공 구조 분석
CaPAlg 하이드로겔의 미소공 구조를 분석하기 위하여 감압 동결건조된 하이드로겔 샘플(Hitachi S-4300)에서 20kV의 전압으로 전자 주사 현미경(scanning electron microscopy, SEM)을 이용하여 측정하였다. SEM 분석은 각각 2회씩 측정하였다.
알기네이트 하이드로겔의 미소공 구조는 도 7에 나타난 바와 같이 칼슘이온에 의해 가교결합된 매우 상호연결된 기공을 나타내었다. 20 내지 80 v/v%로 증가된 CaPAlg의 양에 따라, 하이드로겔은 ⅰ)기공 크기의 감소, ⅱ)기공 형태의 규칙성 감소 및 ⅲ)기공 벽의 경도증가를 포함하는 몇몇의 중요한 특징적 경향을 보여준다. 사실, CaPAlg20은 NaAlg 및 CaCl2 에 의하여 형성된 기공구조와 유사한 그들의 크기 및 소프트한 특성(길이에서 평균 기공 크기 ~800㎛) 때문에 매우 접히고, 압착된 기공의 구조를 나타낸다. 다른 하이드로겔은 그들의 작은 크기(지름이 320-400㎛ 범위의 평균 기공 크기) 때문에 덜 압착된 기공 구조를 보여준다. 기공 벽의 증가된 경도는 하이드로겔 내의 CaPAlg의 증가된 함량의 결과일 것으로 생각된다. 증가하는 CaPAlg 농도에 대하여 기공의 형태의 증가된 불규칙성은 아마도 순수한 알기네이트 분자과의 네트워크 과정에 있어서 폴리머릭 카운더 음이온(polymeric counter anion, P-변형된 알기네이트)의 불규칙한 참여 때문일 것이다. SEM 분석 결과, 특히 하이드로겔 CaPAlg40~60이 최적의 겔화시간(약2-10분) 및 300-400㎛의 지름의 기공 구조를 가지므로, 조직공학 분야에 있어서 세포 성장을 위하여 유리한 마이크로환경을 제공할 수 있다.
실험예 3 : 동적 기계 분석( Dynamic mechanical analysis , DMA )
NaAlg 및 CaPAlg의 서로다른 구성비율을 가지는 하이드로겔의 점탄성의 거동을 연구하기 위하여 동적기계분석을 실시하였으며, 이러한 동적기계분석(DMA)은 인장압축 모드에서 작동하시키고 컴프레션 로드-플래이트 배열(compression rod-plate configuration)을 사용하여 동적 기계분석기(DMA 25N, 01dB-Metravib, France)에서 수행하였다. 상온에서 10분동안 0.5 내지 10Hz의 범위에서 샘플의 증가하는 진동수의 동적 압축 스트레스 사이클을 측정하였다. 3개의 복제 샘플은 각각의 조건에 대하여 저장 모듈러스(E') 및 손실 모듈러스(E")의 평균값을 얻기 위하여 측정하였다.
그 결과, CaPAlg20의 모듈러스는 진동수(frequency)가 증가한 만큼 상당히 증가하였다(도 8(f)). CaPAlg40 및 CaPAlg60에 대하여 모듈러스 변화는 더 안정한 하이드로겔을 제공하기 위한 가교결합에 상당하게 공헌하는 CaPAlg의 더 높은 함량을 나타내는 넓은 범위의 진동수에 걸쳐서 최소가 되었다. 도 8(a)-(e)에 나타난 결과와 함께 고려할 때, 하이드로겔 형성에 대하여 NaAlg 및 CaPAlg의 최적의 함량은 CaPAlg 60% 임을 알 수 있었다.
실험예 4 : 겔화시간 측정
실시예 1에 따라 제조된 하이드로겔에 대한 겔화 시간의 측정은 잘 알려진 바이알 인벌젼 테스트(vial inversion test)(또는 흐름 시험(the flow test)) 을 사용하였다. 겔화 시간은 용액 A 및 용액 B의 혼합물이 바이알을 거꾸로 세운 경우 더 이상 흐르지 않는 지점에 의하여 결정된다. 3개의 복제 샘플에 대하여 상온에서 측정하고 그 평균값을 얻었다.
각각의 샘플에 대한 겔화 시간 및 동결 건조 전후의 몰폴로지적 형태은 도 8에 나타내었다. CaPAlg20 및 CaPAlg80는 Ca이온의 부족 및 두 개의 마주보고 있는 GG 블록(egg-box model)의 결합을 위하여 요구되는 G 블록을 포함하고 있는 정상적인 알기네이트 뼈대의 부족 때문에 상대적으로 더 긴 겔화 시간을 나타낸다(각각 >40분 및 >30분, 도 8(a) 및 (d)). CaPAlg40 및 CaPAlg60의 하이드로겔은 2-10분에서 겔화되고 PDMS 몰드에 잘 고정되는 최적의 결과를 얻었다(도 8(b) 및 (c)). 최적의 겔화 시간은 양 구성요소(용액 A 및 용액 B)의 농도를 잘 조절함으로써 얻을 수 있다. CaPAlg50 하이드로겔 (2 wt% CaPAlg 용액 1 mL + 2 wt% NaAlg 용액 1 mL)의 제조에 있어서, 내부적으로 공급되는 Ca이온의 양은 38.44mg의 알기네이트 구성성분 내에 약 1.56mg(0.04mmol)이라고 생각된다. 이와 같은 CaPAlg50 하이드로겔이 포함하고 있는 NaAlg (38.44 mg/1.5 mL) 및 CaCl2 (0.04 mmol/0.5 mL 또는 4.44 mg/0.5 mL) 같은 몰의 양을 사용하여 겔화 가능성을 측정하기 위하여, 외부적 첨가에 의한 겔화(종래의 방법)를 시도하였으나, 겔화를 전혀 관찰할 수 없었다(도 8(e)). 칼슘이온의 외부적 공급에 의한 최적의 하이드로겔 형성을 얻기 위하여, 적어도 17.32mg(CaPAlg의 경우보다 약 4배 더 많은 양인 0.156 mmol)의 CaCl2이 필요한 것으로 생각된다. 그러나, 이 경우에는 겔화시간이 지나치게 짧기 때문에 주사기를 통하여 피부 하에 주입하는 것은 부적절하다. CaPAlg40~60로부터 얻은 피하에 주사가능한 최소한의 Ca이온의 양 및 최적의 겔화시간에 의한 효율적인 겔화와 향상된 결과는 (i) Ca이온 공급의 서로 다른 루트(내부적 대 외부적), (ⅱ) 변형된 알기네이트 분자에서 Ca이온에 균일한 분산능력, (ⅲ) CaPAlg의 카복실레이트 (및/또는 포스페이트) 작용기로부터 NaAlg 분자의 카복실레이트 작용기로 Ca이온 이동의 서로 다른 메커니즘 및 (ⅳ)정상적인 알기네이트 분자와 네트워킹에 있어서 포스페이트 및 카복실레이트를 가지는 CaPAlg 의 폴리머릭 카운터 이온(polymeric counter ion)의 직접적인 참여에 의해 야기될 수 있었다.
또한, 주사가능한 알기네이트-기반 하이드로겔을 생산하기 위한 CaPAlg를 사용함으로써 제조된 하이드로겔의 부피에 상당한 변화없이 손쉬운 겔화를 보여주었다. 이것은 캡슐화된 세포가 하이드로겔의 겔화작용 동안에 부피 변화를 유도할 수 있는 물리적 응력(stress)로부터 자유로울 수 있기 때문에 세포 캡슐화에 대하여 중요한 특징일 수 있다.
실험예 5 : 생체 외 세포-캡슐화된 하이드로겔의 세포테스트
세포 캡슐화 물질로서의 용도를 위한 주사가능한 CaPAlg 하이드로겔의 적용 가능성을 평가하기 위하여 하이드로겔에 의해 캡슐화된 MC3T3의 생존능력을 형광 현미경(fluorescence microscope) 및 MTS분석을 통하여 LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 측정하였다. 1×106의 세포밀도에서 서브-배양된 MC3T3은 1ml의 하이드로겔로 캡슐화하고, 7일동안 배양하였다. 모든 과정은 라미네이트된 층상 흐름 후드(laminated lamellar flow hood)에서 수행하였다.
배지는 배양하는 동안 매 2일마다 완전히 새로 교체하였다. 미리 정해지 배양 시간 후에, 세포 캡슐화된 하이드로겔은 새로운 플레이트에 옮기고, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 세포착색 후 세포의 생존능력(viability) 및 몰폴로지를 측정하였다. 하이드로겔의 캡슐화 효율을 분석하기 위하여, 캡슐화 후 세포 생존능력을 Live/Dead staining에 기초한 직접적인 세포-카운팅에 의하여 측정하였다. 배양하는 동안에 세포의 대사활동은 MTS 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 배양 후, 하이드로겔은 24-웰 플레이트에 위치시키고, MTS 용액을 각각의 하이드로겔에 첨가하였다. 37℃ 에서 4시간의 인큐베이션 후, 비색적 측정은 490nm에서 광학적 밀도 리딩(reading)을 가지고 마이크로 리더(micro reader)에서 수행하였다. 모든 세포 배양 실험은 3회 실시하였으며, 통계적 분석을 수행하는데 있어서 p<0.0006의 유의 수준에서 one-way ANOVA를 사용하여 비교하였다.
CaPAlg40~60의 중간 조성물을 가지는, 주사가능한 하이드로겔 CaPAlg50의 생체적합성은 세포 몰폴로지, 생존능력 모니터링 및 하이드로겔 내에 캡슐화된 세포의 대사 활성을 통하여 평가하였다. 이를 위하여, 50 mM CaCl2 용액을 사용하여 제조된 NaAlg 하이드로겔의 생체적합성이 대조군으로서 비교되었다. 도 9는 3일의 배양기간동안 하이드로겔 내의 캡슐화된 세포의 형광이미지를 보여준다. 녹색 점은 생존한 세포를 나타낸다. 형광이미지를 통하여 본 발명자들은 하이드로겔 내에서의 세포 분산, 세포 몰폴로지 및 생존능력을 확인하였다. 도 10은 도 9 a)의 0 ~ 1일 동안의 초기 세포의 생존 능력을 정량화하여 나타낸 것이다. 도 9 a) 및 도 10에 나타난 바와 같이, 캡슐화(0일) 4시간 후에, 균일한 분산을 가지는 둥근 모양의 세포는 모든 하이드로겔 내에서 관찰되었고, 대조군(NaAlg)에 비하여 CaPAlg50 하이드로겔의 세포 생존 능력은 큰 차이가 없었다(도 9).

Claims (8)

  1. 인산화된 알기네이트를 포함하는 수용액에 칼슘이온(Ca2+)을 첨가하여 인산화된 알기네이트 칼슘(CaPAlg) 복합체 수용액을 제조하는 제1단계; 및
    상기 인산화된 알기네이트 칼슘(CaPAlg) 복합체 수용액 및 소듐 알기네이트(NaAlg) 수용액을 혼합하여 하이드로겔을 형성하는 제2단계를 포함하며, 상기 인산화된 알기네이트 칼슘(CaPAlg) 복합체는 인산화된 알기네이트(PAlg)와 칼슘이온이 결합한 것인, 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계의 인산화된 알기네이트는 소듐 알기네이트를 인산염을 포함하는 용액과 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액의 pH가 7 내지 8인 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1단계는 투석하여, 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체(CaPAlg) 수용액으로부터 무기염을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제2단계는 1~3 중량%의 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 1~3중량%의 소듐 알기네이트 수용액을 혼합하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2단계는 인산화된 알기네이트 칼슘 복합체 수용액 및 소듐 알기네이트 수용액을 1:0.67 내지 1:1.5의 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 주사가능한 하이드로겔의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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Zhao et al., Biomaterials, 31(25), pp 6502-6510 (2010. 6. 8. online)*

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