CN101934090B - 一种可注射型骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可注射型骨修复材料及其制备方法。该可注射型骨修复材料主要由聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液组成。该方法包括首先制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸;将聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶于磷酸缓冲溶液;向制得的磷酸缓冲溶液中加入选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种成分,搅拌均匀;最后装入注射器中备用。本发明的可注射型骨修复材料,具有体温敏感性、可塑性性好、可降解、能促进骨缺损的再生、稳定性好、安全性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物活性材料领域,尤其是指一种可注射型骨修复材料及其制备方法。
背景技术
微创技术的发展使可注射骨修复材料成为了生物材料领域的一个重要研究领域。可注射骨修复材料可随意塑性;能原位固化成型,填充各种复杂的形状的骨缺损;缩短外科手术时间;创伤小,成本低等优点。另外,可注射材料也可载入细胞、生长因子和基因等。在可注射型的修复材料中,水凝胶因具备类细胞外基质的仿生结构、良好的生物相容性而得到广泛研究和应用。海藻酸就是制备可注射修复材料的一类天然高分子。海藻酸的化学组成为1,4-糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸(β-1,4-D-mannosyluronic acid,M)和α-L-古罗糖醛酸(α-1,4-L-gulosyluronic acid,G)结合的线性链状阴离子聚合物,能溶于水,与Ca2+交联可形成海藻酸钙凝胶。由于海藻酸钙良好的生物相容性、低毒、来源广,成本低等优点,使之在医用辅料(wound dressing)、药物传递(drug delivery)、细胞微囊(cell encapsulation)、组织工程(tissue engineering)和再生医学(regeneration medicine)等医学领域得到广泛的研究和应用。但是海藻酸钙凝胶也存在一些问题:一是常用钙盐(如氯化钙、硫酸钙)直接与海藻酸交联固化速度过快,难于获得均匀稳定的水凝胶;二是由于海藻酸钙在体内与体液的盐离子发生交换,凝胶降解的速度难于控制;三是人体没有可降解海藻酸生物大分子的酶,因此在体内的降解速度缓慢。但是低分子量的海藻酸能通过细胞的作用排除体外、因此通过降低分子量或对海藻酸的改性能调节和控制海藻酸的降解。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种骨修复材料及其制备方法,解决现有技术骨修复材料的固化速度快、稳定性差以及生物降解慢等问题。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:一种可注射型骨修复材料,主要由聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液组成。
所述聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸的化学结构式为下式(I):
其中n为正整数,PNIPAAm为聚异丙基丙烯酰胺,该氨基化海藻酸分子量的范围在2万-5万。
该可注射型骨修复材料进一步包括由选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种成分复合而成。
优选地,氨基化海藻酸溶液的重量与选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种形成的复合成分的重量,他们之间的重量比为1:(0.1-2)。
所述细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、成骨细胞中的一种或几种;骨生长因子选自重组骨形态发生蛋白-2或重组骨形态发生蛋白-7中的一种或两种。
所述聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液是磷酸缓冲溶液,质量/体积百分比浓度为3-10%,更优选为5%;羟基磷灰石或β-磷酸三钙在磷酸缓冲溶液中的质量/体积百分比浓度为1-20%;细胞在磷酸缓冲溶液中的浓度为1000-1000000个/ml;生长因子在磷酸缓冲溶液中的浓度为10-30μg/ml。
前述可注射型骨修复材料的制备方法包括以下步骤:制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸;将聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶于磷酸缓冲溶液;向制得的磷酸缓冲溶液中加入选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种成分,搅拌均匀;最后装入注射器中备用。
其中,制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸,进一步包括:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-20000的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠溶于步骤2制备的盐酸溶液中,完全溶解后加入一定量的己二酸二酰肼ADH;
4)将一定质量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDC和1-羟基苯并三唑HOBt溶于二甲基亚砜DMSO/水溶液中,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应一定时间;
5)将步骤4的反应液透析并沉淀制得分子量在6000以上的中间物溶液;
6)将步骤5的沉淀产物经冷冻、干燥从而获得的氨化海藻酸AAlg溶于纯水,制备AAlg溶液;
7)将PNIPAAm-COOH溶于纯水并加入步骤6获得的AAlg溶液进行接枝反应一定时间,透析出的聚合物即为异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸。
优选地,所述制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸具体包括:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-8000的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠溶于步骤2制备的盐酸溶液中,完全溶解后加入一定量的己二酸二酰肼ADH,ADH与海藻酸糖单元比值范围为1:1-1:5;
4)将一定质量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDC和1-羟基苯并三唑HOBt溶于二甲基亚砜(DMSO)/水溶液中,制备出EDC和HOBt的浓度分别为5-10mmol/ml,其中DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应14-28小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析分子量在6000以上的中间物溶液,加入一定的NaCl,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水再透析并沉淀的产物,经冷冻、干燥,得到氨化的海藻酸AAlg;将AAlg溶于纯水,制备AAlg质量比纯水体积百分比浓度为0.1-0.5%的AAlg溶液;
7)将PNIPAAm-COOH溶于纯水,并加入EDC,低温下保存一定时间,PNIPAAm-COOH质量与纯水体积百分比浓度范围为0.5-2%,PNIPAAm-COOH和EDC的比例为5:1;然后加入步骤6获得的AAlg溶液反应一定时间,反应产物经透析除去分子量小于为20000的各种杂质以及未反应的AAlg和PNIPAAm-COOH,从而获得异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸。
本发明的有益效果如下:本发明是在保持海藻酸良好生物相容性的基础上,通过聚异丙基丙烯酰胺接枝改性,解决海藻酸存在的不足,由其制备的可注射型骨修复材料,具有体温敏感性、可塑性性好、可降解、能促进骨缺损的再生、稳定性好、安全性高等诸多特点。可用于填充各种各样复杂的形状和尺寸骨缺损,材料的固化温度在31-35℃之间,常温下呈液态,能在体温下自固化,固化时间在3-15分钟;在缺损修复周期内能维持应有的形状,同时具备良好的生物相容性,能促进骨的再生。
具体实施方式
本发明是在保持海藻酸良好生物相容性的基础上,通过聚异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide),简称PNIPAAm)接枝改性,合成一种聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸,解决海藻酸存在的不足,并在此基础上开发出了一种温敏可注射型骨修复材料。
其中,聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸(英文名称:aminatedalginate-g-poly(N-isopropylacrylamide,简称AAlg-g-PNIPAAm),为一种新合成的聚合产物,其化学结构式为下式(I):
其中n为正整数,PNIPAAm为聚异丙基丙烯酰胺poly(N-isopropylacrylamide)的缩写。该接枝后的氨基化海藻酸分子量在20000以上,优选分子量的范围在2万-5万,能溶于水,室温下在水中的溶解浓度可达到20%,水溶液能在31-35℃的范围内迅速固化,形成固态凝胶。
式(I)结构的氨基化海藻酸是通过下述式(II)表述的聚合反应过程聚合合成的:
其中,Alginate为现有技术的海藻酸钠;ADH为己二酸二酰肼;AAlg为氨化的海藻酸中间产物;PNIPAAm为聚异丙基丙烯酰胺;AAlg-g-PNIPAAm为聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸;x和n均为正整数,x范围为900-10000之间。
其具体的制备方法包括如下步骤:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-20000的海藻酸钠,优选为平均分子量在6000-15000;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠溶于步骤2制备的盐酸溶液中,海藻酸钠质量比盐酸体积百分比浓度优选为0.5-1%,完全溶解后加入一定量的己二酸二酰肼(adipic dihydrazide,简称ADH),ADH的质量百分比浓度为0.5-20%,ADH与海藻酸糖单元比范围优选为1:1-1:5,较佳地,海海藻酸钠与ADH质量比为1:15-1:20;
4)将一定质量的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,简称EDC)和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole hydrate,简称HOBt)溶于二甲基亚砜(DMSO)/水溶液中,制备出EDC和HOBt的浓度分别优选为5-10mmol/ml,其中DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应14-28小时,通常搅拌反应24小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,然后取出透析后分子量在6000以上的中间物溶液,加入一定的NaCl,浓度达到5%,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水,再透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,冷冻,干燥,得到氨化的海藻酸(aminated alginate,简称AAlg);将AAlg溶于纯水,制备浓度为0.1-0.5%AAlg溶液,该浓度是指AAlg质量比纯水体积百分比;
7)将PNIPAAm-COOH溶于纯水,并加入EDC,2-8℃下保存48小时,PNIPAAm-COOH浓度范围为0.5-2%(该浓度是指PNIPAAm-COOH质量与纯水体积百分比),PNIPAAm-COOH和EDC的比例为5:1;然后加入步骤6获得的AAlg溶液反应24小时,透析3天,反应得到AAlg-g-PNIPAAm;其中透析袋半透膜可透析出的分子量为20000,可除去分子量小于为20000的各种杂质以及未反应的AAlg和PNIPAAm-COOH。
其中,PNIPAAm-COOH的合成方法参照已报道的文献制备(Polymer46(2005)4088–4097;Langmuir1998,14,910-914)。
由上述方法便可获得本发明创造的聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸AAlg-g-PNIPAAm,其具有良好生物相容性,能溶于水,室温下在水中的溶解浓度可达到20%,水溶液能在31-35℃的范围内迅速固化,形成固态均匀稳定的凝胶。其制成的可注射型骨修复材料,具有体温敏感性,可塑性性好,可降解,能促进骨缺损的再生,稳定性好,安全性高等诸多特点。
该温敏可注射型骨修复材料是由聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液,与选自羟基磷灰石、β-TCP、细胞、骨生长因子(如rhBMP-2,rhBMP-7)的一种或多种成分复合而成,他们之间的重量比例优选为1:(0.1-2)。
其中:β-TCP为β-磷酸三钙。
细胞选自:骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、成骨细胞等中的一种。这些细胞可根据现有技术的方法进行提取,或者直接购买得到。
骨生长因子选自:重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)或重组骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)中的一种。这些骨生长因子可直接购买得到。
该温敏可注射型骨修复材料的制备方法具体包括以下步骤:
1)将AAlg-g-PNIPAAm溶于磷酸缓冲(pH=7.4)溶液,形成浓度为:3-10%的AAlg-g-PNIPAAm溶液,浓度优选为5%,这里的浓度是指AAlg-g-PNIPAAm的质量与磷酸缓冲溶液体积百分比;
2)向AAlg-g-PNIPAAm溶液中加入羟基磷灰石、β-TCP、细胞或生长因子,搅拌均匀。
3)装入注射器中备用。
其中,步骤2中当成分选择羟基磷灰石或β-TCP时,羟基磷灰石或β-TCP在磷酸缓冲溶液中浓度范围为1-20%(这里的浓度是指羟基磷灰石或β-TCP的质量与磷酸缓冲溶液体积百分比),但最好不能超过相应AAlg-g-PNIPAAm浓度的2倍;当选择细胞的时,细胞在磷酸缓冲溶液中的浓度为1000-1000000个/ml;选择生长因子时,生长因子在磷酸缓冲溶液中的浓度为10-30μg/ml。
本发明的可注射型骨修复材料使用时直接注射到修复部位,注射液在体温的作用下迅速固化;其常温下呈液态,能在体温下自固化,固化时间在3-15分钟;可用于填充各种各样复杂的形状和尺寸骨缺损,材料的固化温度在31-35℃之间;而且该可注射型骨修复材料在缺损修复周期内能维持应有的形状,同时具备良好的生物相容性,能促进骨的再生。
下面结合实例进一步说明本发明的骨修复材料,但不作为本发明的限制。
实施例1
首先按反应式(II)制备式(I)结构的AAlg-g-PNIPAAm,具体制备方法如下:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-8000的低分子量的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的1g海藻酸钠溶于步骤2制备的100ml盐酸溶液中,完全溶解后加入15g ADH;
4)将1.6g EDC和1.4g HOBt溶于二甲基亚砜(DMSO)/水溶液中,EDC和HOBt的浓度分别为10mmol/ml,DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应24小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,然后取出透析后的溶液,加入一定的NaCl,浓度达到5%,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水,再透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,冷冻,干燥,得到氨化的海藻酸(aminated alginate,简称AAlg),将0.1g AAlg溶于纯水,制备浓度为0.1%AAlg溶液;
7)将0.5g PNIPAAm-COOH溶于100ml纯水,并加入0.1g EDC,4℃下保存48小时,然后加入步骤6获得的AAlg溶液反应24小时,透析3天,反应得到AAlg-g-PNIPAAm。其中透析袋半透膜可透析出的分子量为20000,最后经冷冻干燥处理就可获得分子量在20000以上的由聚异丙基丙烯酰胺接枝改性的氨化海藻酸。
由上述制得的AAlg-g-PNIPAAm,制备本发明温敏可注射型骨修复材料,具体方法如下:
(1)将5g AAlg-g-PNIPAAm溶于100ml磷酸缓冲(pH=7.4)溶液;
(2)向AAlg-g-PNIPAAm溶液中加入5g的β-TCP和细胞,细胞的浓度为1000-1000000个/ml;
(3)装入注射器中,注射到修复部位,注射液在体温的作用下迅速固化。
实施例2
首先按反应式(II)制备式(I)结构的AAlg-g-PNIPAAm,具体制备方法如下:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-8000的低分子量的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠0.5g溶于步骤2制备的的100ml盐酸溶液中,完全溶解后加入10g的ADH;
4)将0.8g EDC和0.7g HOBt溶于DMSO/水溶液中,其中DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应24小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,然后取出透析后的溶液,加入一定的NaCl,浓度达到5%,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水,再透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,冷冻,干燥,得到氨化的海藻酸(aminated alginate,简称AAlg);将0.5g AAlg溶于100ml,制备浓度为0.5%AAlg溶液;
7)将1g PNIPAAm-COOH溶于100ml纯水,并加入0.2g EDC,4℃下保存48小时,然后加入步骤6的AAlg溶液反应24小时,透析3天,反应得到AAlg-g-PNIPAAm,其中透析袋半透膜可透析出的分子量为20000,最后经冷冻干燥处理就可获得分子量在20000以上的由聚异丙基丙烯酰胺接枝改性的氨化海藻酸。
由上述制得的AAlg-g-PNIPAAm,制备本发明温敏可注射型骨修复材料,具体方法如下:
(1)将5g的AAlg-g-PNIPAAm溶于100ml磷酸缓冲(pH=7.4)溶液;
(2)向AAlg-g-PNIPAAm溶液中加入2g羟基磷灰石和生长因子,搅拌均匀,其中生长因子的浓度为10-30μg/ml;
(3)装入注射器中,注射到修复部位,注射液在体温的作用下迅速固化。
实施例3
首先按反应式(II)制备式(I)结构的AAlg-g-PNIPAAm,具体制备方法如下:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-8000的低分子量的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠0.5g溶于步骤2制备的100ml盐酸溶液中,完全溶解,然后加入10g的ADH;
4)将0.8g EDC和0.7g HOBt溶于DMSO/水溶液中,其中DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应24小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,然后取出透析后的溶液,加入一定的NaCl,浓度达到5%,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水,再透析3天,透析袋半透膜可透析出的分子量为6000,冷冻,干燥,得到氨化的海藻酸(aminated alginate,简称AAlg),将0.5g AAlg溶于100ml,制备浓度为0.5%AAlg溶液;
7)将1g PNIPAAm-COOH溶于100ml纯水,并加入0.2g EDC,4℃下保存48小时,然后加入步骤6获得的AAlg溶液反应24小时,透析3天,反应得到AAlg-g-PNIPAAm,其中透析袋半透膜可透析出的分子量为20000,最后经冷冻干燥处理就可获得分子量在20000以上的由聚异丙基丙烯酰胺接枝改性的氨化海藻酸。
由上述制得的AAlg-g-PNIPAAm,制备本发明温敏可注射型骨修复材料,具体方法如下:
(1)将5g的AAlg-g-PNIPAAm溶于100ml磷酸缓冲(pH=7.4)溶液;
(2)向AAlg-g-PNIPAAm溶液中加入1g的羟基磷灰石,搅拌均匀;
(3)装入注射器中,注射到修复部位,注射液在体温的作用下迅速固化。
Claims (9)
1.一种可注射型骨修复材料,主要由聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液组成;所述聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸的化学结构式为下式(I):
(I)
其中n为正整数,PNIPAAm为聚异丙基丙烯酰胺,该氨基化海藻酸分子量的范围在2万-5万;室温下在水中的溶解浓度可达到20%,水溶液能在31-35℃的范围内迅速固化,形成固态凝胶。
2.如权利要求1所述的可注射型骨修复材料,其特征在于:进一步包括由选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种成分复合而成。
3.如权利要求2所述的可注射型骨修复材料,其特征在于:所述氨基化海藻酸溶液的重量,与选自羟基磷灰石、β-磷酸三钙、细胞、骨生长因子的一种或多种形成的复合成分的重量,他们之间的重量比为1:(0.1-2)。
4.如权利要求3所述的可注射型骨修复材料,其特征在于:所述细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、成骨细胞中的一种或几种;骨生长因子选自重组骨形态发生蛋白-2或重组骨形态发生蛋白-7中的一种或两种。
5.如权利要求4所述的可注射型骨修复材料,其特征在于:所述聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶液是聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸溶解于磷酸缓冲溶液形成的,其质量/体积百分比浓度为3-10%;羟基磷灰石或β-磷酸三钙在磷酸缓冲溶液中的质量/体积百分比浓度为1-20%;细胞在磷酸缓冲溶液中的浓度为1000-1000000个/ml;骨生长因子在磷酸缓冲溶液中的浓度为10-30μg/ml。
6.如权利要求5所述的可注射型骨修复材料,其特征在于:所述聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸磷酸缓冲溶液质量/体积百分比浓度为5%。
8.如权利要求7所述可注射型骨修复材料的制备方法,其特征在于:所述制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸,进一步包括:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-20000的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠溶于步骤2制备的盐酸溶液中,完全溶解后加入己二酸二酰肼ADH,ADH与海藻酸糖单元比值范围为1:1-1:5;
4)将乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDC和1-羟基苯并三唑HOBt溶于二甲基亚砜DMSO/水溶液中,制备出EDC和HOBt的浓度分别为5-10mmol/ml,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应14-28小时;
5)将步骤4的反应液透析并沉淀制得分子量在6000以上的中间物溶液;
6)将步骤5的沉淀产物经冷冻、干燥从而获得的氨化海藻酸AAlg溶于纯水,制备AAlg溶液;
7)将PNIPAAm-COOH溶于纯水并加入步骤6获得的AAlg溶液进行接枝反应24小时,透析出的聚合物即为聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸。
9.如权利要求8所述可注射型骨修复材料的制备方法,其特征在于:所述制备聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸具体包括:
1)采用γ射线辐照海藻酸钠,获得平均分子量在6000-8000的海藻酸钠;
2)采用纯水和盐酸配制的pH为4-4.5的盐酸溶液;
3)将步骤1制备的海藻酸钠溶于步骤2制备的盐酸溶液中,完全溶解后加入己二酸二酰肼ADH,ADH与海藻酸糖单元比值范围为1:1-1:5;
4)将乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺EDC和1-羟基苯并三唑HOBt溶于二甲基亚砜(DMSO)/水溶液中,制备出EDC和HOBt的浓度分别为5-10mmol/ml,其中DMSO和水的比例为1:1,将该溶液加入到步骤3的混合液中,室温下搅拌反应14-28小时;
5)将步骤4的反应液在纯水中透析分子量在6000以上的中间物溶液,加入一定的NaCl,然后加入无水乙醇,沉淀出产物;
6)将步骤5的沉淀产物重新溶于水再透析并沉淀的产物,经冷冻、干燥,得到氨化的海藻酸AAlg;将AAlg溶于纯水,制备AAlg质量比纯水体积百分比浓度为0.1-0.5% 的AAlg溶液;
7)将PNIPAAm-COOH溶于纯水,并加入EDC,低温下保存48小时,PNIPAAm-COOH质量与纯水体积百分比浓度范围为0.5-2%,PNIPAAm-COOH和EDC的比例为5:1;然后加入步骤6获得的AAlg溶液反应24小时,反应产物经透析除去分子量小于20000的各种杂质以及未反应的AAlg和PNIPAAm-COOH,从而获得聚异丙基丙烯酰胺接枝的氨基化海藻酸。
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