KR102149070B1 - 조사적 세포 기반 분석 및 이의 사용 - Google Patents

조사적 세포 기반 분석 및 이의 사용 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 모델 구축을 통해 생물학적 시스템 또는 과정(예를 들어, 암과 같은 질병 조건)을 분석하기 위한 발견 플랫폼 기술이 기술된다.

Description

조사적 세포 기반 분석 및 이의 사용{INTERROGATORY CELL-BASED ASSAYS AND USES THEREOF}
본 출원은 조사적 세포 기반 분석 및 이의 사용에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2012년 4월 2일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/619326호; 2012년 7월 6일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/668617호; 2012년 4월 4일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/620305호; 2012년 6월 28일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/665631호; 2012년 8월 1일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/678596호; 및 2012년 8월 1일 출원된 미국 예비 특허 출원 제 61/678590호의 우선권을 주장하며, 각 출원의 전체 내용은 참조를 통해 본 명세서에 명시적으로 통합된다.
1964년 오늘날 분자생물학이라 불리는 분야의 선구자인 제임스 왓슨(James Watson)과 프란시스 크릭(Francis Crick)에 의해 DNA가 발견된 이후, 신약 개발이 크게 향상되었다. 분자생물학의 도구와 제품들로 인해 빠르고 상세하며 정확한 유전자 조절의 측정이 DNA 및 RNA 수준 모두에서 가능하게 되었다. 패러다임을 뒤바꾼 이 발견 이후 30년간 녹다운(knock-out) 동물 모델 및 핵심 효소결합 반응이 나타났고, 앞서 언급한 플랫폼으로부터 질병 메커니즘과 병리생리학을 새롭게 이해할 수 있게 되었다. 2000년 봄, 크레이그 벤토(Craig Ventor)와 프란시스 콜린스(Francis Collins)는 인간 게놈의 초기 염기 서열을 발표하였고, 과학계에는 새로운 의약품의 파고가 몰아치게 되었다.
게놈의 매핑은 즉각적으로, 예를 들어, 유전자 치료를 사용하여 알츠하이머 또는 파킨슨 씨 병을 일으키는 뇌의 퇴행적 과정을 역전시킴으로써 질병이 시작되기 이전에도 이를 통제할 수 있고, 또한 정상적인 조직 구조와 생리학적 상태를 복원시키면서도 종양 위치에 도입하여 질병을 근절시킬 수 있는 구조체를 만들 수 있다는 희망을 불러 일으켰다. 다른 사람들은 이러한 논쟁에서 더 나가 눈이나 머리 색깔, 키 등에 대해 원하는 대로 자손을 창출하는 개념을 제안하기도 하였다. 그러나, 10년이 지났지만, 아직도 많은 사람들이 유전자 치료의 지속 가능한 성공, 또는 심지어 유전학적 과정의 초보적 제어를 기다리고 있을 뿐, 이에 대한 가시적 경로는 보이지 않고 있다.
따라서, 최소한 구조체를 지지하는 것과는 독립적인 유전학은 최종적인 생리상태를 창출하지는 않는다는 것이 눈에 보이는 현실이다. 실제로, 전사 후 변형, 변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP), 및 전사 변형 등과 같은 많은 과정들이 자연적 섭리로 주어진 유전자 및/또는 이 유전자의 부호화된 보완 단백질을 변화시킬 수 있으며, 따라서 이를 통해 질병 과정에 기여할 수 있다.
정보 시대가 도래하고 인터넷이 나타남에 따라 과도한 정보가 쏟아지고 있지만, 국제적 협동과 비평 또한 쉽게 이루어지게 되었다. 역설적이게도, 상기 언급된 현실은 과학계가 몇 개의 단순한 점들을 간과하는 원인이 될 수 있는데, 여기에는 신호 증폭의 통신과 세포 및/또는 조직 간의 교차 대화(상호 대화)가 무엇인가 잘못되었을 때 항상성 및 시정적 메커니즘을 위한 메시지를 발생토록 한다는 것이다.
이와 관련된 사항은 심장병(CVD)과 연관된 것으로, 이 질병은 미국 및 많은 선진국에서 주요 사망 요인으로 남아 있으며, 미국에서만 2.8명의 사망자 중 1명이 심장병과 관련되어 있다. 또한, CVD는 만성 신장 질환(미국에서 약 천9백만 사례), 만성 피로 증후군, 및 대사증후군에서의 핵심 요소와 같은 연관 합병증에 기여하는 병리 현상의 배경으로 작용한다. 진단법과 관련된 기술, 외과적 시술을 최소화하는 치료 기술, 수용 약제 혈관 삽입 및 효과적인 임상적 관리 등에서의 상당한 진보는 시술 심장학 분야에서 유래 없는 성장의 시기를 만들어 냈으며, 또한 보다 효과적인 CVD 관리를 가능하게 하였다. 그러나, CVD, 당뇨 및 주변 혈관 질병과 같은 연관된 보조 이병률과 관련된 질병 원인론은 아직 충분히 밝혀지지 않았다.
질병 조건(예를 들어, CVD)의 원인론과 같은 생물학적 과정에 포함된 메커니즘 및 경로를 탐구하고 핵심 조절 경로 및/또는 목표 분자(예를 들어, “약제로 치료할 수 있는 목표(drugable targets)”) 및/또는 보다 나은 질병 진단, 관리 및/또는 치료를 위한 표지 인자를 파악하기 위한 새로운 접근 방법들은 아직도 부족하다.
본 명세서에서 기술된 발명은 최소한 부분적으로는 네트워크 생물학, 게놈, 단백질체, 대사체 및 전사체에 대한 학문과 생체 정보학의 도구 및 방법론의 신규의 협업적 활용에 기반한 것으로서, 이들이 결합된다면, 암, 당뇨, 비만, 심장병, 및 신생 혈관 생성을 포함하여 선택된 질병 조건과 같은 관심의 대상인 생물학적 시스템을 조직적인 생물학 연구방법을 이용하여 연구하는데 사용될 수 있다. 첫 번째 단계로서, 질병 과정과 같은 다양한 생물학적 시스템을 탐구하기 위해 세포 모델링 시스템이 개발되었으며, 이 시스템은 다양한 질병 관련 환경 자극(예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태, 면역 스트레스, 및 지질 과산화, 세포 밀도, 혈관 형성 작용 물질 및 억제 물질)을 겪는 질병 관련 세포들을 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 세포 모델링 시스템은 반응에 참여하는 다양한 세포 유형들(예를 들어 대동맥의 평활근 세포(HASMC), 기부 세관 신장 세포(HK-2), 대동맥 내피 세포(HAEC), 및 진피 섬유아세포(HDFa)) 사이의 세포 간 상호 대화 메커니즘을 포함한다. 세포 모델 시스템으로부터의 고성능 생물학적 해독은 기술들의 조합을 통해 얻어지며, 이러한 기술들은 예를 들어, 최신의 질량 분광학(LC/MSMS), 유동 세포 계수법, 세포-기반 분석, 및 기능적 분석 등이 포함된다. 고성능의 생물학적 해독은 생물정보학적 분석을 거쳐 생체 외, 생체 내, 및 컴퓨터 모의 모델링에 의해 합치되는 데이터 경향을 연구한다. 이로부터 비롯되는 매트릭스를 통해 상호 연관된 데이터 마이닝이 가능하며 이로부터 결정적인 압점(또는 “허브”)에 이를 수 있는 선형 및 비선형 회귀 분석이 개발되었다. 본 명세서에서 제시되는 이들 “허브”들은 신약 발견의 후보가 된다. 특히, 이들 허브들은 잠재적 약품 타겟 및/또는 질병 표지 인자를 나타낸다.
분별의 분자 서명은 질병의 시작과 발달에 이르는 조직의 마이크로환경에서의 변이를 지배하는 메커니즘에 대한 통찰력을 가지게 해 준다. 이들을 모두 통합하면, 이전에 언급된 기술 플랫폼들을 전략적 세포 모델링과 조합함으로써 견고한 지성적 방법을 채택하여 질병에 대한 보다 나은 이해를 확립하고 동시에 치료 수준을 임상적으로 확장시킬 수 있는 생물학적 표지 인자 라이브러리와 약품 후보 물질을 생성하는 것이 가능하게 된다.
또한, 이 접근 방식은 질병 진단 또는 시술에 유용할 뿐만 아니라, 둘 또는 그 이상의 세포 시스템이 반응하는 생물학적 시스템과 같이 사실상 생물학적 시스템 내의 모든 병리학적 또는 비병리학적 조건들에 일반적으로 적용할 수 있다. 예를 들어, 이 접근 방식은 약제의 독성에 연관되어 있거나 인과 관계를 가지는 메커니즘을 이해하는 통찰력을 얻는데 유용하다. 따라서 본 발명은 광범위한 스펙트럼의 설정에 일반적으로 적용될 수 있는 조사적 생물학적 평가를 위한 프레임워크를 제공한다.
본 발명의 플랫폼의 의미 있는 특징은 이러한 AI 기반 시스템이 생물학적 과정과 관련하여 알려진 생물학적 관계와 같은 해당 분야의 기존 지식에 의존하거나 이를 고려하지 않으면서(즉, 어떠한 데이터 포인트도 인위적이지 않으면서) 세포 모델 시스템으로부터 획득된 데이터 집합에 기반하고 있다는 것이다. 이에 따라, 이러한 플랫폼으로부터 생성되어 결과적으로 나타나는 통계적 모델은 편향되어 있지 않다. 예를 들어, 이로부터 얻어진 세포 모델 시스템 및 데이터 집합과 같은 본 발명의 플랫폼 및 그 구성 요소의 또 다른 의미 있는 특징은 이로부터 (예를 들어, 새로운 세포 및/또는 조건을 도입함으로써) 시간에 걸친 연속적인 세포 모델의 구축이 가능하다는 것이며, 이에 따라 생물학적 시스템 또는 과정에 대한 세포 모델로부터 생성된 초기의 “최초 세대”의 합치 인과 관계 네트워크가 세포 모델 자체의 진화에 따라 다중 생성 인과 관계 네트워크로 진화해 나갈 수 있다는 것이다(또한 델타 또는 델타-델타 네트워크가 이로부터 얻어진다). 이러한 방식으로, 세포 모델과 이 세포 모델로부터의 데이터 집합, 및 이 세포 모델로부터 플랫폼 기술 방법을 사용하여 생성된 인과 관계 네트워크 모두가 끊임없이 진화하고 이러한 플랫폼 기술로부터 얻은 이전의 지식 위에 구축될 수 있다.
본 발명은 생물학적 시스템의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
생물학적 시스템의 특징적 측면을 나타내기 위해 생물학적 시스템에 연관된 세포를 이용하여 생물학적 시스템에 대한 모델을 수립하는 단계;
상기 모델로부터 생물학적 시스템과 연관된 세포 내에서 단백질체의 전역적 변화를 나타내는 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계;
상기 모델로부터 생물학적 시스템과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 효소의 전역적 활성이 생물학적 시스템과 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질(substrate)에 미치는 영향을 포함하는 단계;
프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1 및 제 2 데이터 집합에만 기반하여 상기 단백질체의 전역적 변화 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 및 제 2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 최소한 하나의 효소는 생물학적 시스템의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 제 1 데이터 집합은 단일 단백질체의 데이터 집합이다. 특정 실시예에서, 제 2 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포의 단일 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다. 특정 실시예에서, 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 지질체적 데이터를 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 지질체적 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성을 포함한다.
특정 실시예에서, 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 지질체적, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터를 더 나타낸다. 특정 실시예에서, 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 둘 또는 그 이상의 지질체적, 대사체적, 전사체적, 게놈적 및 SNP 데이터를 더 나타낸다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈, 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 최소한 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 영향을 더 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 효소의 전역적 활성은 전역 키나아제 활성을 포함한다. 특정 실시예에서, 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과는 세포의 인산 단백질체를 포함한다.
특정 실시예에서, 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈, 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 최소한 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 영향을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 더 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 생물학적 시스템의 모델은 생물학적 시스템과 연관된 세포의 생체 외 배양을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 생물학적 시스템의 모델은 제어 세포의 합치되는 생체 외 배양을 선택 사항으로 더 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 생물학적 시스템의 모델의 세포의 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪으며, 합치 제어 세포의 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪지 않은 세포와 동일하다. 특정 실시예에서, 상기 생물학적 시스템의 모델에서의 환경적 교란은 생물체에 작용하는 제제와의 한 번 또는 그 이상의 접촉, 배양 조건에서의 변화, 유전학적 수정 / 변이의 도입, 및 유전학적 수정 / 변이를 야기하는 매개 수단의 도입을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 생물학적 시스템의 모델에서의 환경적 교란은 세포를 효소 활성 억제 인자와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 생물학적 시스템의 모델 내의 효소 활성 억제 인자 는 키나아제 억제 인자다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 상기 세포를 CoQ10와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 상기 세포를 CoQ10과 더 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 생성 단계는 인공 지능 (AI) -기반 정보학 플랫폼에 의해 수행된다. 특정 실시예에서, 상기 AI 기반 정보학 플랫폼은 통계적 압점을 적용하지 않고 모든 데이터 입력을 제 1 및 제 2 데이터 집합으로부터 수신한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 생성 단계에서 수립된 상기 합치 인과 관계 네트워크는 합치 인과 관계 네트워크 내의 하나 또는 그 이상의 인과 관계의 예측에 대한 신뢰 수준을 제공하기 위해, 식별 단계 이전에, 입력 데이터에 기반한 컴퓨터 모의 시뮬레이션에 의해 시뮬레이션 인과 관계 네트워크로 더 개량된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 고유한 인과 관계는 생물학적 시스템과 연관된 세포에 고유하게 존재하고 상기 합치된 제어 세포에 존재하지 않는 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별된다. 특정 실시예에서, 상기 고유한 인과 관계는 환경적 교란을 겪은 세포에 고유하게 존재하고 상기 합치된 제어 세포에 존재하지 않는 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 식별된 고유한 인과 관계는 유전자의 발현 및 지질의 수준; 유전자의 발현 및 전사체의 수준; 유전자의 발현 및 대사 물질의 수준; 제 1 유전자의 발현 및 제 2 유전자의 발현; 유전자의 발현 및 SNP의 존재; 유전자의 발현 및 기능적 활성; 지질의 수준 및 전사체의 수준; 지질의 수준 및 대사 물질의 수준; 제 1 지질의 수준 및 제 2 지질의 수준; 지질의 수준 및 SNP의 존재; 지질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 전사체의 수준 및 제 2 전사체의 수준; 전사체의 수준 및 대사 물질의 수준; 전사체의 수준 및 SNP의 존재; 제 1 전사체의 수준 및 기능적 활성의 수준; 제 1 대사 물질의 수준 및 제 2 대사 물질의 수준; 대사 물질의 수준 및 SNP의 존재; 대사 물질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 SNP의 존재 및 제 2 SNP의 존재; 및 SNP의 존재 및 기능적 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 한 쌍 사이의 관계이다. 특정 실시예에서, 상기 식별된 상기 고유한 인과 관계는 최소한 지질의 수준, 유전자의 발현, 및 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 사이의 관계이며, 이때 상기 기능적 활성은 키나아제 활성이다.
본 발명은 질병 과정의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
질병 과정의 특징적 측면을 나타내기 위해 질병에 관련된 세포를 사용하여 질병 과정에 대한 모델을 수립하는 단계;
상기 모델로부터 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 이때 상기 제 1 데이터 집합은 질병에 관련된 세포 내의 단백질체의 전역적 변화를 나타내는 단계;
상기 모델로부터 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 이때 상기 제 2 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 질병에 관련된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과를 포함하는 단계;
상기 세포의 단백질체의 전역적 변화 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 제 1 및 제 2 데이터 집합만을 기반으로 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 및 제 2 데이터 집합을 제외한 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 질병 과정에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계에 연관된 최소한 하나의 효소는 질병 과정의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 단일 단백질체의 데이터 집합. 특정 실시예에서, 제 2 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포의 단일 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타낸다. 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 지질체 데이터를 더 나타낸다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 지질체 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터를 더 나타낸다. 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 둘 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터를 더 나타낸다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 최소한 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 효소의 전역적 활성은 전역 키나아제 활성을 포함하며, 이때 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과는 세포의 인산 단백질체를 포함한다. 특정 실시예에서, 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 상기 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 질병 과정은 암, 당뇨, 비만, 심장병, 노화 관련 황반 변성, 당뇨성 망막증, 또는 감염성 질병이다. 특정 실시예에서, 상기 질병 과정은 신생 혈관 생성을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 질병 과정은 간세포 암종, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 비늘형의 세포암종(squamous cell carcinoma, 편평상피암), 결장암, 췌장암, 갑상선암, 자궁 내막암, 방광암, 신장암, 고형 종양, 백혈병, 비 호지킨(non-Hodgkin) 림프종, 또는 약제 저항형 암을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 질병 모델은 질병 세포의 생체 외 배양을 포함하며, 제어 또는 정상 세포의 합치되는 생체 외 배양을 선택적으로 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 질병 세포의 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪으며, 상기 합치된 제어 세포의 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪지 않은 질병 세포와 동일하다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 생체에 작용하는 제제와의 한 번 또는 그 이상의 접촉, 배양 조건에서의 변화, 유전학적 수정 / 변이의 도입, 및 유전학적 수정 / 변이를 야기하는 매개 수단의 도입을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 세포를 효소 활성 억제 인자와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 효소 활성 억제 인자는 키나아제 억제 인자다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 상기 세포를 CoQ10와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 상기 세포를 CoQ10과 더 접촉시키는 것을 더 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 질병 과정의 특징적 측면은 저산소 상태 조건, 고혈당 조건, 젖산 풍부 배양 조건, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 생성 단계는 인공 지능(AI) 기반 정보학 플랫폼에 의해 수행된다. 특정 실시예에서, 상기 AI 기반 정보학 플랫폼은 통계적 압점을 적용하지 않고 모든 데이터 입력을 제 1 및 제 2 데이터 집합으로부터 수신한다.
특정 실시예에서, 생성 단계에서 수립된 상기 합치 인과 관계 네트워크는 합치 인과 관계 네트워크 내의 하나 또는 그 이상의 인과 관계에 대한 예측의 신뢰 수준을 제공하기 위해 입력 데이터에 기반한 컴퓨터 모의 시뮬레이션에 의해 식별 단계 이전에 모의 인과 관계 네트워크로 더욱 개량된다. 특정 실시예에서, 상기 고유한 인과 관계는 질병 세포의 모델 내에 고유하게 존재하며 합치된 제어 세포에는 존재하지 않는 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별된다. 특정 실시예에서, 상기 고유한 인과 관계는 환경적 교란을 겪은 세포 내에 고유하게 존재하며 합치된 제어 세포에는 존재하지 않는 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별된다.
본 발명은 생물학적 시스템의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
생물학적 시스템의 특징적 측면을 나타내기 위해 생물학적 시스템에 연관된 세포를 이용하여 생물학적 시스템에 대한 모델을 수립하는 단계;
상기 모델로부터 세포 내에서 단백질체의 전역적 변화 및 생물학적 시스템과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈, 및 SNP 데이터를 나타내는 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계;
상기 모델로부터 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 생물학적 시스템과 연관된 세포의 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 전역 키나아제 활성 및/또는 상기 전역 키나아제 활성이 생물학적 시스템과 연관된 세포 내의 키나아제 대사 물질 또는 기질에 미치는 영향을 포함하는 단계;
프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1 및 제 2 데이터 집합에만 기반하여 상기 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터, 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 및 제 2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 최소한 하나의 키나아제는 생물학적 시스템의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하기 위한 방법을 제공하며,
상기 방법은 이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 본 명세서에서 제공된 방법 중의 어느 하나에 의해 식별된 조절 인자에 영향을 미쳐서, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하게 해주는 생체 작용 물질을 포함하는 약학적 조성을 치료적으로 효과적인 양으로 투여(administrating)하는 단계를 포함한다.
본 발명은 대상 포유류에서의 질병을 진단 또는 예단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
본 명세서에서 제공된 방법 중 어느 하나를 사용하여 식별된 하나 또는 그 이상의 조절 인자의, 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에서의, 발현 또는 활성 수준을 결정하는 단계; 및
대상에서의 수준을 제어 표본에서의 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준 또는 활성과 비교하는 단계를 포함하며,
이때 대상에서의 수준과 제어 표본에서의 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준 또는 활성 사이의 차이는 대상이 질병에 걸렸거나, 질병이 진전될 상태에 있거나, 또는 질병에 대한 치료에 우호적으로 반응함을 나타내며, 이에 의해 대상 포유류의 질병을 진단하거나 예단할 수 있다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 치료적 화합물을 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상 포유류로부터의 생물학적 표본을 검사 화합물에 접촉시키는 단계;
생물학적 표본 내에서 본 명세서에서 제공된 방법 중의 어느 하나에 의해 식별된 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준을 결정하는 단계;
상기 생물학적 표본 내 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준을 검사 화합물과 접촉되지 않은 제어 표본과 비교하는 단계; 및
상기 생물학적 표본 내 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준을 조절하는 검사 화합물을 선택하는 단계를 포함하며,
이에 의해 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 치료적 화합물을 식별할 수 있다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 방법을 제공하며,
상기 방법은 이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 본 명세서에서 제공된 방법 중의 어느 하나에 의해 식별된 치료적 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방할 수 있다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 방법을 제공하며,
상기 방법은 이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21 중 어느 하나 또는 그 이상의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 생체 작용 물질을 포함하는 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 질병은 간세포 암종이다.
본 발명은 대상 포유류에서의 질병을 진단 또는 예단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에서 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21 중 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 결정하는 단계; 및
대상 내에서의 상기 수준을 제어 표본 내 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준 또는 활성과 비교하는 단계를 포함하며,
이때 대상에서의 수준과 제어 표본에서의 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준 또는 활성 사이의 차이는 대상이 질병에 걸렸거나, 질병이 진전될 상태에 있거나, 또는 질병에 대한 치료에 우호적으로 반응함을 나타내며, 이에 의해 대상 포유류의 질병을 진단하거나 예단할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 질병은 간세포 암종이다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 치료적 화합물을 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상 포유류로부터의 생물학적 표본을 검사 화합물에 접촉시키는 단계;
생물학적 표본 내에서, TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21 중 어느 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계;
상기 생물학적 표본 내 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준을 검사 화합물과 접촉되지 않은 제어 표본과 비교하는 단계; 및
상기 생물학적 표본 내 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준을 조절하는 검사 화합물을 선택하는 단계를 포함하며,
이에 의해 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 치료적 화합물을 식별할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 질병은 간세포 암종이다.
본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방하기 위한 방법을 제공하며,
상기 방법은 이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 본 명세서에서 제공된 방법 중의 어느 하나에 의해 식별된 치료적 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 치료적으로 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방할 수 있다.
본 발명은 신생 혈관 생성의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 신생 혈관 생성의 특징적 측면을 나타내기 위해 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 사용하여 신생 혈관 생성에 대한 모델을 수립하는 단계;
(2) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 데이터를 나타내는 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계;
(3) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계;
(4) 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1 및 제 2 데이터 집합에만 기반하여 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 데이터, 및 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
(5) 상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 유전자, 지질, 단백질, 대사 물질, 전사체, 또는 SNP는 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
본 발명은 신생 혈관 생성의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 신생 혈관 생성의 특징적 측면을 나타내기 위해 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 사용하여 신생 혈관 생성에 대한 모델을 수립하는 단계;
(2) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 지질체 데이터를 나타내는 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계;
(3) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계;
(4) 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1 및 제 2 데이터 집합에만 기반하여 리피도믹스 데이터 및 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 상기 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
(5) 상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 지질은 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합은 효소의 전역적 활성 및 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내에서 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과를 나타낸다.
본 발명은 신생 혈관 생성의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 신생 혈관 생성의 특징적 측면을 나타내기 위해 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 사용하여 신생 혈관 생성에 대한 모델을 수립하는 단계;
(2) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 데이터를 나타내는 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계;
(3) 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 키나아제를 나타내는 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및/또는 상기 효소의 전역적 활성이 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 미치는 영향을 포함하는 단계;
(4) 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1 및 제 2 데이터 집합에만 기반하여 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 및 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 이때 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 및 제 2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계; 및
(5) 상기 합치 인과 관계 네트워크로부터 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 효소는 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 효소의 전역적 활성은 전역 키나아제 활성을 포함하며 상기 효소의 전역적 활성이 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 미치는 영향은 세포의 인산 단백질체를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 효소의 전역적 활성은 전역 프로테아제 활성을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 조절 인자는 신생 혈관 생성을 자극하거나 촉진한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 조절 인자는 신생 혈관 생성을 억제한다.
특정 실시예에서, 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 포함하는 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델은 생체 외 세포 배양 신생 혈관 생성 모델, 쥐의 대동맥 미세 혈관 모델, 새로 태어난 생쥐의 망막 모델, 병아리 융모 요막(CAM) 모델, 각막 혈관 형성 성장 요소 주머니 모델, 피하 이식 혈관 형성 성장 요소 이식 모델, 마트리겔(MATRIGEL®) 혈관 형성 성장 요소 이식 모델, 및 종양 이식 모델로 이루어진 군으로부터 선택되며; 상기 신생 혈관 생성 모델은 제어 세포를 포함하는 신생 혈관 생성의 제어 모델을 선택적으로 더 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 생체 외 배양 신생 혈관 생성 모델은 마트리겔(MATRIGEL®) 관 형성 분석, 이주 분석, 보이든(Boyden) 챔버 분석, 스크래치 분석으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 실시예에서, 생체 외 배양 모델에서의 상기 신생 혈관 생성과 연관된 세포는 인간 내피의 혈관 세포(HUVEC)이다. 특정 실시예에서, 각막 혈관 형성 성장 요소 주머니 모델, 피하 해면 혈관 형성 성장 요소 이식 모델, 또는 마트리겔(MATRIGEL®) 혈관 형성 성장 요소 이식 모델에서의 상기 혈관 형성 성장 요소는 FGF-2 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 신생 혈관 생성의 모델 내의 세포는 환경적 교란을 겪으며, 신생 혈관 생성의 합치된 모델 내의 세포는 환경적 교란을 겪지 않은 세포와 동일하다. 특정 실시예에서, 상기 환경적 교란은 제제와의 한 번 또는 그 이상의 접촉, 배양 조건에서의 변화, 유전학적 수정 또는 변이의 도입, 및 유전학적 수정 또는 변이를 야기하는 매개 수단의 도입 및 국소 빈혈의 유도를 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제제는 혈관 형성 촉진 제제 또는 항혈관 형성 제제이다. 특정 실시예에서, 상기 혈관 형성 촉진 제제는 FGF-2 및 VEGF로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 항혈관 형성 제제는 VEGF 억제 인자, 인테그린 억제 물질, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 텀스타틴, 아바스틴, 넥사바(Sorafenib), 수니티니브, 파조파니브, 및 에버롤리머스, 용해성 VEGF-수용기, 안지오포이에틴 2, 트롬보스폰딘1, 트롬보스폰딘 2, 바소스타틴, 칼레티큘린, 프로트롬빈(크링글 도메인-2), 안티트롬빈 III 파편, 혈관 내피의 성장 억제 인자 (VEGI), 단백질 (FS-E)의 폴리스타틴 영역에 해당하는 산성 및 풍부한 시스테인 내 분비 단백질(SPARC) 및 SPARC 펩티드, 및 코엔자임 Q10으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 상기 제제는 효소 활성 억제 인자이다. 다른 실시예에서, 상기 제제는 키나아제 활성 억제 인자이다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 게놈 데이터 집합 내 다수의 유전자의 단백질 및/또는 mRNA 발현 수준을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합 둘 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 데이터를 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 셋 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 데이터를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포 외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 더 포함한다.
본 발명의 어떠한 실시예에서, 제 1 데이터 집합은 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 데이터 중 하나와 같은 단일 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 두 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 세 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 네 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 다섯 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 여섯 개의 데이터 집합일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS 및 시호스(Seahorse) 분석 데이터로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 포함하는 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중 하나와 같은 단일 데이터 집합이다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 2 데이터 집합은 두 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 세 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 네 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 다섯 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 여섯 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 일곱 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 여덟 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 아홉 개의 데이터 집합일 수 있다. 본 발명의 실시예 중 어느 하나에서, 상기 제 1 데이터 집합은 열 개의 데이터 집합일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 효소 활성은 키나아제 활성일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 효소 활성은 프로테아제 활성일 수 있다.
본 발명의 특정한 실시예에서, 상기 단계(4)는 인공 지능 (AI) -기반 정보학 플랫폼에 의해 수행된다. 특정 실시예에서, 상기 AI 기반 정보학 플랫폼은 REFS(TM)을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 AI 기반 정보학 플랫폼은 통계적 압점을 적용하지 않고 모든 데이터 입력을 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합으로부터 수신한다. 특정 실시예에서, 상기 단계(4)에서 수립된 합치 인과 관계 네트워크는 합치 인과 관계 네트워크 내의 하나 또는 그 이상의 인과 관계에 대한 예측의 신뢰 수준을 제공하기 위해 단계(5) 이전에 입력 데이터에 기반한 컴퓨터 모의 시뮬레이션에 의해 시뮬레이션 인과 관계 네트워크로 더 개량된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 고유한 인과 관계는 세포 내에 고유하게 존재하며, 합치된 제어 세포 내에는 존재하지 않는 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별된다.
본 발명에서, 상기 고유한 인과 관계는 유전자의 발현 및 지질의 수준; 유전자의 발현 및 전사체의 수준; 유전자의 발현 및 대사 물질의 수준; 제 1 유전자의 발현 및 제 2 유전자의 발현; 유전자의 발현 및 SNP의 존재; 유전자의 발현 및 기능적 활성; 지질의 수준 및 전사체의 수준; 지질의 수준 및 대사 물질의 수준; 제 1 지질의 수준 및 제 2 지질의 수준; 지질의 수준 및 SNP의 존재; 지질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 전사체의 수준 및 제 2 전사체의 수준; 전사체의 수준 및 대사 물질의 수준; 전사체의 수준 및 SNP의 존재; 제 1 전사체의 수준 및 기능적 활성의 수준; 제 1 대사 물질의 수준 및 제 2 대사 물질의 수준; 대사 물질의 수준 및 SNP의 존재; 대사 물질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 SNP의 존재 및 제 2 SNP의 존재; 및 SNP의 존재 및 기능적 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 한 쌍 사이의 관계로 식별된다.
특정 실시예에서, 상기 기능적 활성은 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관 기능, 세포 이주, 관 형성, 효소 활성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 및 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 실시예에서, 상기 기능적 활성은 키나아제 활성이다. 특정 실시예에서, 상기 기능적 활성은 프로테아제 활성이다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 식별된 고유한 인과 관계는 최소한 지질의 수준, 유전자의 발현, 및 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 사이의 관계이며, 이때 상기 기능적 활성은 키나아제 활성이다.
본 발명에서, 상기 방법은 신생 혈관 생성 내의 상기 식별된 고유한 인과 관계를 증명하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델을 제공하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
신생 혈관 생성의 특징적 측면을 나타내기 위해, 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 사용하여 신생 혈관 생성에 대한 모델을 수립하는 단계로서, 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델은 플랫폼 방법에서 사용된 데이터 집합을 생성하기에 유용한 단계를 포함하며;
이에 의해 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델을 제공한다.
본 발명은 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 획득하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 제 1 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 포함하며, 상기 제 1 데이터 집합은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 데이터를 포함하는 단계;
(2) 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계로서, 상기 제 2 데이터 집합은 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 단계를 포함하며;
이에 의해 플랫폼 방법에서 사용하기 위한 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 획득한다.
본 발명은 신생 혈관 생성의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 얻어진 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하는 단계로서, 상기 모델은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 포함하고, 상기 제 1 데이터 집합은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 데이터를 나타내며; 상기 제 2 데이터 집합은 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내고, 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 제외한 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 단계;
(2) 상기 합치 인과 관계 네트워크로부터, 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 상기 고유한 인과 관계와 연관된 최소한 하나의 유전자, 지질, 단백질, 대사 물질, 전사체, 또는 SNP가 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함하며,
이에 의해 신생 혈관 생성의 조절 인자를 식별할 수 있다.
본 발명은 신생 혈관 생성의 조절 인자 식별 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(1) 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 생성된 합치 인과 관계 네트워크를 제공하는 단계;
(2) 상기 합치 인과 관계 네트워크로부터, 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하는 단계로서, 상기 고유한 인과 관계와 연관된 최소한 하나의 유전자, 지질, 단백질, 대사 물질, 전사체, 또는 SNP가 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 단계를 포함하며,
이에 의해 신생 혈관 생성의 조절 인자를 식별할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 합치 인과 관계 네트워크는 신생 혈관 생성에 대한 모델로부터 획득된 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합 중에서 생성되고, 상기 모델은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 포함하고, 상기 제 1 데이터 집합은 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 게놈 데이터, 지질체 데이터, 단백질체 데이터, 대사체 데이터, 전사체 데이터, 및 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP) 데이터를 나타내며;
상기 제 2 데이터 집합은 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내고, 상기 합치 인과 관계 네트워크의 생성은 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합을 제외한 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는다.
특정 실시예에서, 상기 신생 혈관 생성에 대한 모델은 생체 외 세포 배양 신생 혈관 생성 모델, 쥐의 대동맥 미세 혈관 모델, 새로 태어난 생쥐의 각막 모델, 병아리 융모 요막(CAM) 모델, 각막 혈관 형성 성장 요소 주머니 모델, 피하 해면 혈관 형성 성장 요소 이식 모델, 마트리겔(MATRIGEL®) 혈관 형성 성장 요소 이식 모델, 및 종양 이식 모델로 이루어진 군으로부터 선택되며; 상기 신생 혈관 생성의 모델은 제어 세포를 포함하는 신생 혈관 생성의 합치된 제어 모델을 선택적으로 더 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 리피도믹스 데이터를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 제 1 데이터 집합은 리피도믹스 데이터만을 포함한다.
특정 실시예에서, 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 상기 제 2 데이터 집합은 효소의 전역적 활성, 및 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 효소의 전역적 활성의 영향을 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 제 2 데이터 집합은 키나아제 활성 또는 프로테아제 활성을 포함한다. 특정 실시예에서, 제 2 데이터 집합은 키나아제 활성 또는 프로테아제 활성만을 포함한다.
특정 실시예에서, 신생 혈관 생성과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 상기 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론 프로파일링, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 키나아제 활성, 및 프로테아제 활성; 및 ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택된 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 포함한다.
본 발명의 특정 실시예에서, 상기 신생 혈관 생성은 질병 상태에 관련된다.
본 발명은 포유류 대상에서 신생 혈관 생성 조절 방법을 제공하며, 상기 방법은:
이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 본 명세서에서 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 식별된 조절 인자에 영향을 주는 생체 작용 물질을 포함하는 약학적 조성을 치료적으로 효과적인 양으로 투여하여, 이에 의해 신생 혈관 생성을 조절하도록 하는 단계를 포함한다.
본 발명은 포유류 대상에서 조절된 신생 혈관 생성을 탐지하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상으로부터 얻어진 생물학적 표본 내에서의 본 명세서에서 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 식별된 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 수준, 활성, 또는 존재를 결정하는 단계; 및
상기 수준, 활성, 또는 존재를 제어 표본 내에서의 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 수준, 활성, 또는 존재와 비교하는 단계를 포함하며,
이때 대상에서의 상기 수준, 활성, 또는 존재와 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 존재 하에서의 상기 수준, 활성, 또는 존재 사이의 차이가 포유류 대상에서 신생 혈관 생성이 조절되었다는 것을 나타낸다.
본 발명은 대상 포유류에서 신생 혈관 생성을 조절하는 치료적 화합물을 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
대상 포유류로부터의 생물학적 표본을 검사 화합물과 접촉시키는 단계;
생물학적 표본 내에서 본 명세서에서 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 식별된 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 발현 수준을 결정하는 단계;
생물학적 표본 내에서의 상기 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 수준, 활성, 또는 존재를 상기 검사 화합물과 접촉하지 않은 제어 표본과 비교하는 단계; 및
생물학적 표본 내에서의 상기 하나 또는 그 이상의 조절 인자의 수준, 활성, 또는 존재를 조절하는 검사 화합물을 선택하는 단계를 포함하며,
이에 의해 대상 포유류에서 신생 혈관 생성을 조절하는 치료적 화합물을 식별하는 치료적 화합물을 식별할 수 있다.
본 발명은 대상 포유류에서 신생 혈관 생성을 조절하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은:
이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 본 명세서에서 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 식별된 치료적 화합물을 포함하는 약학적 조성을 치료적으로 효과적인 양으로 투여하여, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단할 수 있다.
특정 실시예에서, “환경적 교란”은 본 명세서에서 “외부 자극 성분”으로도 불리며, 치료용 제제를 의미한다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 소형 분자 (예를 들어, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 500 달톤, 또는 250 달톤 이하의 소형 분자)이다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 생물학적이다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 화학적이다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 세포에 대해 내생적이거나 외생적이다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 MIM 또는 에피시프터(epishifter)이다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 저산소 상태, 고혈당증, 고지질증, 고인슐린증, 및/또는 풍부한 젖산 조건과 같은 세포 시스템에 대한 스트레스 요소이다.
특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 질병 조건을 치료하기 위한 치료용 제제 또는 치료용 제제 후보를 포함할 수 있으며, 여기에는 화학 치료용 제제, 단백질 기반 생물학적 제제, 항체, 융합 단백질, 소형 분자 약제, 지질, 다당류, 핵산 등이 포함된다.
특정 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 저산소 상태, 고혈당 조건, (젖산 치료로 모방할 수 있는) 산성 환경 등을 포함하는 다양한 질병 조건 하에서 생체 내에서 자주 접하게 되는 하나 또는 그 이상의 스트레스 요소를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 이러한 외부 자극 성분은 이하에서 정의되는 하나 또는 그 이상의 MIM 및/또는 에피시프터(epishifter)를 포함할 수 있다. 예시적 MIM은 코엔자임 Q10(본 명세서에서 CoQ10로도 기술됨) 및 비타민 B군 내 화합물, 또는 비타민 B군 내 화합물을 포함하는 뉴클레오시드, 모노뉴클레오타이드 또는 디뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극은 CoQ10이 아니다. 특정 실시예에서, 이러한 외부 자극은 비타민 B 또는 비타민 B군 내 화합물이 아니다.
세포의 출력을 측정함에 있어서(단백질 발현, 지질 수준 등), 절대적 양(예를 들어, 발현 또는 전체 양)이나 상대적 수준 (예를 들어, 상대적 발현 수준 또는 양)이 사용될 수 있다. 일 실시예에서는, 절대적 양(예를 들어, 발현 또는 전체 양)이 사용된다. 일 실시예에서는, 상대적 수준 또는 양(예를 들어, 상대적 발현 수준 또는 양)이 사용된다. 예를 들어, 세포 시스템의 상대적 단백질 발현 수준을 결정하기 위해서는, 세포 시스템에 대한 외부 자극이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 세포 시스템 내에서 주어진 단백질의 양을 적절한 제어 세포 라인 또는 세포 라인들의 혼합물(예를 들어, 동일한 실험에 사용된 모든 세포) 및 주어진 배수 증가 또는 배수 감소 값과 비교할 필요가 있다. 통상의 기술자라면 유전자 및/또는 RNA 전사 수준, 지질의 수준, 또는 예를 들어, 세포 자살의 수준, 독성의 수준, 또는 본 명세서에서 기술된 ECAR 또는 OCR와 같은 어떠한 기능적 출력 등의 세포의 모든 출력 측정에서도 절대량 또는 상대량을 채택할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 배수 증가에 대한 소정의 임계 수준(예를 들어, 최소한 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75나 100 또는 그 이상의 배수 증가), 또는 배수 감소에 대한 임계 수준(예를 들어, 최소한 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 또는 0.05 배수로의 감소, 또는 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 이하로의 감소)이 의미 있는 분별을 선택하기 위해 사용될 수 있으며, 의미 있는 분별을 위한 세포의 출력 데이터가 본 발명의 방법의 플랫폼 기술을 사용하는 데이터 집합(예를 들어, 제 1 및 제 2 데이터 집합)에 포함될 수 있다. 위의 목록에서 제시된 모든 값들은 범위의 상한 또는 하한으로서, 예를 들어, 1.5와 5 배 사이, 5와 10 배, 2와 5 배, 또는 0.9와 0.7 사이, 0.9와 0.5, 또는 0.7과 0.3 배 사이 등일 수 있으며, 본 발명의 일부로서 이해되어야 한다.
본 출원 전체에 걸쳐, 예를 들어 위에서 언급된 것과 같이 목록에서 제시되는 모든 값들은 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있다.
본 발명의 방법의 일 실시예에서, 인과 관계 네트워크 내에서 관찰된 모든 인과 관계가 생물학적 의미를 가지는 것은 아닐 수 있다. 본 발명의 조사적 생물학적 평가가 적용되는 어떠한 주어진 생물학적 시스템에 대해, 인과 관계(또한 이들과 관련된 유전자들)의 일부(또는 전부일 수 있음)는 특정한 생물학적 현안 문제에 대해 “결정론적”일 수 있는데, 예를 들어, 질병 조건(치료적 시술을 위한 잠재적 타겟)을 야기하는 것에 책임이 있거나 질병 조건(잠재적인 진단적 또는 예후의 요소)에 대한 생물학적 표지 인자이다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템에 고유한 관찰된 인과 관계는 당면한 특정한 생물학적 문제에 대하여 결정론적이다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템에 고유한 관찰된 모든 인과 관계 당면한 특정 문제에 대해 결정론적인 것은 아니다.
이러한 결정론적 인과 관계는 대상 방법의 최종 사용자가 선택할 수 있으며, 또는 이러한 관계는 REFS, DAVID-활성 비교 경로 분석 프로그램과 같은 생물정보학 소프트웨어 프로그램, 또는 KEGG 경로 분석 프로그램에 의해 선택될 수 있다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 사용되었으며, 둘 또는 그 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램으로부터의 합치된 결과를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는, 세포의 출력의 “분별”은 세포의 출력의 어떠한 하나 또는 그 이상의 매개변수에서의 변화(예를 들어, 증가되거나 감소된 수준)를 포함한다. 특정 실시예에서, 이러한 분별은 mRNA 전사 내 분별, 단백질 발현, 단백질 활성, 대사 물질 / 중간 물질 수준, 및/또는 리간드-타겟 상호 반응으로 이루어지는 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 단백질 발현 수준에 대하여, 외부 자극 성분에 의한 치료 이전과 이후의 세포 시스템과 관련된 출력과 같은 두 세포의 출력 사이의 분별이 측정될 수 있으며, 질량 분광학 기반 측정과 같이 기술 분야에서 인식된 기술(예를 들어, iTRAQ, 2D-LC-MSMS 등)을 사용하여 정량화될 수 있다.
한 측면에서, 생물학적 시스템을 위한 세포 모델은 세포 간 상호 대화 시스템을 포함하며, 이때 외부 자극 성분이 있는 제 1 세포 환경을 가지는 제 1 세포 시스템은 제 1 수정된 세포 환경을 생성함으로써 제 2 세포 환경을 가지는 제 2 세포 시스템을 제 1 수정된 세포 환경에 노출하게 되어 상호 대화 세포 시스템이 확립된다.
일 실시예에서, 최소한 하나의 의미 있는 세포 간 상호 대화 분별이 상기 상호 대화 세포 시스템으로부터 생성되며; 최소한 하나의 결정론적 세포 간 상호 대화 분별이 식별되어 조사적 생물학적 평가가 발생하게 된다. 특정 실시예에서, 상기 최소한 하나의 의미있는 세포 간 상호 대화 분별은 다수의 분별이다.
특정 실시예에서, 최소한 하나의 결정론적 세포 간 상호 대화 분별이 최종 사용자에 의해 선택된다. 다른 방법으로서, 또 다른 실시예에서, 최소한 하나의 결정론적 세포 간 상호 대화 분별이 정량적 단백질체학 데이터에 기반한(예를 들어, REFS, KEGG 경로 분석 또는 DAVID-활성 비교적 경로 분석과 같은) 생물 정보학 소프트웨어 프로그램에 의해 선택된다.
특정 실시예에서, 이 방법은 제 1 세포 시스템을 위한 의미 있는 세포의 출력 분별을 생성하는 것을 포함한다.
특정 실시예에서, 분별은 mRNA 전사 내 분별, 단백질 발현, 단백질 활성, 대사 물질 / 중간 물질 수준, 및/또는 리간드-타겟 상호 반응로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 제 1 세포 시스템 및 제 2 세포 시스템은 균일한 군집의 제 1 세포, 암 세포 라인, 또는 정상 세포 라인으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시예에서, 제 1 수정된 세포 환경은 제 1 세포 시스템에 의해 제 1 세포 환경으로 분비된 요소를 포함하며, 결과적으로 제 1 세포 시스템을 외부 자극 성분과 접촉시키게 된다. 상기 요소는 분비된 단백질 또는 기타 신호 발생 분자들을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 제 1 수정된 세포 환경은 실질적으로 원래의 외부 자극 성분을 가지지 않는다.
특정 실시예에서, 이러한 상호 대화 세포 시스템은 삽입 구획을 가지는 트랜스웰(transwell) 및 막으로 구분되는 웰(well) 구획을 포함한다. 예를 들어, 제 1 세포 시스템은 삽입 구획(또는 웰 구획)에서 성장할 수 있으며, 제 2 세포 시스템은 웰 구획(또는 삽입 구획)에서 성장할 수 있다.
특정 실시예에서, 이러한 상호 대화 세포 시스템은 제 1 세포 시스템을 성장시키기 위한 제 1 배양, 및 제 2 세포 시스템을 성장시키기 위한 제 2 배양을 포함한다. 이 경우에, 제 1 수정된 세포 환경은 제 1 세포 시스템으로부터 매체로 조건이 가해질 수 있다.
특정 실시예에서, 제 1 세포 환경 및 제 2 세포 환경은 동일할 수 있다. 특정 실시예에서, 제 1 세포 환경 및 제 2 세포 환경은 다를 수 있다.
특정 실시예에서, 상호 대화 세포 시스템은 제 1 세포 시스템 및 제 2 세포 시스템의 공생 배양을 포함한다.
본 발명의 방법은 임의의 개수의 “조사적 생물학적 평가”를 위해 사용되거나 이에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법을 조사적 생물학적 평가에 적용함으로써 생물학적 시스템 또는 과정의 생물학적 시스템 또는 결정론적 세포 과정 “추진 인자”의 하나 또는 그 이상의 조절 인자를 식별할 수 있게 된다.
본 발명의 방법은 광범위한 범위의 조사적 생물학적 평가를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병 상태를 진단하는 것이다. 특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 약의 효능을 결정하는 것이다. 특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 약의 독성을 결정하는 것이다. 특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병 상태의 단계를 구분하는 것이다. 특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 노화 방지 화장품의 타겟을 식별하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는, “조사적 생물학적 평가”는 생물학적 시스템의 하나 또는 그 이상의 조절 인자, 예를 들어, 환경적 교란 또는 외부 자극 성분, 또는 생물학적 시스템 또는 과정 특유의 고유한 인과 관계와 관련된 결정론적 세포 과정 “추진 인자”(예를 들어, 생물학적 경로, 또는 경로의 핵심 멤버, 또는 경로의 멤버의 핵심 조절자의 활성에 있어서의 증가 또는 감소)의 식별을 포함할 수 있다. 이는 상기 식별된 결정론적 세포 과정 추진 인자가 생체 내 동물 모델 및/또는 생체 외 조직 배양 실험을 포함하는 환경적 교란 또는 외부 자극 성분과 관련된 후속 이벤트에 필요한지의 여부 및/또는 이를 위해 충분한지의 여부를 테스트하거나 증명하기 위하여 설계된 추가적 단계를 더 포함한다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병 상태의 진단 또는 단계 파악이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 치료적 시술을 받을 수 있는 질병 표지 인자 또는 치료적 타겟 중 하나를 나타낸다. 본 발명의 조사적 생물학적 분석은 이론적으로 어떠한 질병 조건에도 적절하지만, 종양학 / 암 생물학, 당뇨, 비만, 심장병, 및 신경학적 조건들(특히, 제한 없이, 알츠하이머 병, 파킨슨씨 병, 헌팅턴 병, 루게릭 병(ALS), 및 노화 관련 신경 퇴행성 질환 등과 같은 퇴행성 신경 질환), 및 신생 혈관 생성과 연관된 조건들과 관련된 분야에 특히 유용한 것으로 밝혀질 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 약의 효능의 결정이며, 이때 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 상기 식별된 조절 인자는 성공적인 약제의 전형적 특징일 수 있으며, 또한 MIM 또는 에피시프터(epishifter)와 같이 동일한 질병 조건을 치료하기 위한 추가적 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 감염을 예방하고 치료하기 위한 약제 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 감염 상태를 유발하는 표지 인자/지표 또는 핵심 생물학적 분자일 수 있으며, 또한 감염 방지 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 예를 들어, 주어진 질병 프로필에 대한 약제와 같은 제제의 분자 효과에 대한 평가이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 하나 또는 그 이상의 생물학적 경로, 또는 경로(들)에서의 핵심 멤버, 또는 경로(들)의 멤버들의 핵심 조절 인자의 활성에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있으며, 또한, 예를 들어, 주어진 질병에 대한 제제의 치료적 효능을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 예를 들어, 세포, 조직, 기관 또는 기관계에 대한 약제와 같은 제제의 독성 프로필에 대한 평가이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 예를 들어, 세포 독성과 같은 독성의 지표일 수 있으며, 또한 제제의 독성 프로필을 예측하고 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 약제 또는 약제 후보의 심장 독성의 지표일 수 있으며, 또한 약제 또는 약제 후보의 독성 프로필을 예측하고 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병을 야기하는 원생동물, 균류, 박테리아, 저항 인자, 바이러스, 또는 독소와 같은 생물학적 무기에 의해 야기되는 질병 또는 질환을 예방하고 치료하기 위한 약제 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자 예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 상기 질병 또는 질환을 야기하는 표지 인자/지표 또는 핵심 생물학적 분자일 수 있으며, 또한 생물학적 방어 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 노화 방지 화장품과 같은 노화 방지 제제의 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)의 조절 인자는 노화 과정, 특히 피부에서의 노화 과정의 표지 인자 또는 지표일 수 있으며, 또한 노화 방지 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 노화 방지 화장품의 타겟을 식별하기 위해 사용되는 노화에 대한 한 예시적 세포 모델에서, 상기 세포 모델은 예를 들어, 자외선(환경적 교란 또는 외부 자극 성분)으로 처리된 노화하는 상피의 세포, 및/또는 또한 선택적으로 자외선으로 처리된 신생아의 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 노화를 위한 세포 모델은 세포 간 상호 대화 시스템을 포함한다. 노화 방지 화장품을 위한 타겟을 식별하기 위해 확립된 2-세포 상호 대화 시스템의 예시적인 일례에서, 노화되는 상피의 세포(제 1 세포 시스템)는 자외선 (외부 자극 성분)으로 처리되고, 신생아의 세포를 매체의 조건을 겪은 처리된 노화 상피의 세포에 접촉시킴으로써 신생아의 세포(제 2 세포 시스템) 내에서의 생기는 변화, 예를 들어, 단백질체의 변화 및/또는 기능적 변화와 같은 변화가 측정될 수 있으며, 예를 들어, 단백질체 변화를 종래의 정량적 질량 분광학으로 측정하거나, 노화에 고유한 인과 관계를 데이터로부터 생성된 인과 관계 네트워크로부터 식별할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 발견을 위한 플랫폼 기술을 사용하여 조사적 생물학적 평가를 수행하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 본 발명의 방법으로부터 생성된 인과 관계 네트워크의 대상인 분석 성분의 존재 여부의 탐지 및/또는 그 양의 정량화를 위한 하나 또는 그 이상의 반응 제제를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 분석 성분은 생물학적 시스템에 독특한 인과 관계, 예를 들어, 생물학적 시스템 내의 독특한 인과적 관계와 관련된 유전자의 대상이다. 특정 실시예에서, 상기 분석 성분은 단백질이며, 상기 반응 제제는 단백질에 대한 항체, 단백질을 위한 라벨, 및/또는 고성능 분석(예를 들어, 질량 분광학 기반의 염기서열 결정)을 위한 단백질을 준비하기 위한 하나 또는 그 이상의 제제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 이러한 방법을 필요로 하는 포유류에 치료적으로 효과적인 양의 약학적 조성을 투여하는 것을 포함하며, 상기 약학적 조성은 하나 또는 그 이상의 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21의 발현 또는 활성에 영향을 미치며, 이에 따라 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하게 해 주는 생물학적으로 활성화된 물질을 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 질병은 암, 예를 들어 간세포의 암종이다. 다양한 실시예들에서, 이러한 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34 개의 키나아제를 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 상기 기술은 대상 포유류의 질병을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상으로부터 획득한 생물학적 표본에서 하나 또는 그 이상의 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21의 발현 또는 활성 수준을 결정하고, (ii) 대상에서의 수준을 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준 또는 활성과 비교하는 것을 포함하며, 이때 대상에서의 수준을 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준 또는 활성 사이의 차이는 대상이 질병을 겪고 있거나, 질병이 전개될 예후 상태에 있거나, 질병에 대한 치료에 우호적으로 반응하고 있음을 나타내며, 이에 따라 대상 포유류의 질병을 진단할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 질병은 암, 예를 들어 간세포의 암종이다. 다양한 실시예에서, 이러한 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34 개의 키나아제를 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 차이는 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성의 증가이다. 또 다른 실시예에서, 상기 차이는 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성의 감소이다.
또 다른 측면에서, 상기 기술은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하기 위한 치료용 화합물을 식별하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 대상 포유류로부터의 생물학적 표본을 검사 화합물에 접촉시키고, (ii) 생물학적 표본 내에서 하나 또는 그 이상의 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21의 발현 수준을 결정하며, (iii) 생물학적 표본 내의 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준을 검사 화합물에 접촉하지 않은 제어 표본의 수준과 비교하고, (iv) 생물학적 표본 내의 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현 수준을 조절하는 검사 화합물을 선택하는 것을 포함하며, 이에 의해 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하기 위한 치료용 화합물을 식별하기 위한 치료적 화합물을 식별하게 된다. 일부 실시예에서, 상기 질병은 암, 예를 들어 간세포 암종이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34 개의 키나아제를 사용할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 화합물은 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성을 증가시킨다. 또 다른 실시예에서, 상기 화합물은 하나 또는 그 이상의 키나아제의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 상기 기술은 대상 포유류의 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 방법을 필요로 하는 포유류에 치료적으로 효과적인 양의 약학적 조성을 투여하는 것을 포함하며, 상기 조성물은 상기 기술된 측면에 의해(즉, 하나 또는 그 이상의 TCOF1, TOP2A, CAMK2A, CDK1, CLTCL1, EIF4G1, ENO1, FBL, GSK3B, HDLBP, HIST1H2BA, HMGB2, HNRNPK, HNRPDL, HSPA9, MAP2K2, LDHA, MAP4, MAPK1, MARCKS, NME1, NME2, PGK1, PGK2, RAB7A, RPL17, RPL28, RPS5, RPS6, SLTM, TMED4, TNRCBA, TUBB, 및 UBE21을 사용하여) 식별된 치료적 화합물을 포함하며, 이에 의해 질병의 증세를 치료하고 완화하거나, 질병의 전개를 억제하거나, 질병을 예방, 진단 또는 그 예후를 판단하게 된다. 일부 실시예에서, 상기 질병은 암, 예를 들어 간세포의 암종이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34개의 키나아제를 사용할 수 있다.
본 명세서에 기술된 모든 실시예는, 예시적으로만 설명된 실시예를 포함하여, 본 발명의 일반적인 기술의 일부로 이해되어야 하며, 본 명세서에서 명시적으로 배제되거나 부적절한 것으로 기술되지 않는 한 다른 실시예와 조합할 수 있다.
본 발명의 개시의 다양한 실시예들은 아래의 다음과 같은 도면을 참조하여 설명된다:
도 1은 치료제를 식별하기 위한 접근 방식의 예시도이다.
도 2는 암의 시스템 생물학 및 다중 생리학적 상호 반응 출력 조절의 결과의 예시도이다.
도 3은 MIMS를 사용한 생물학적 관련성의 체계적 조사에 대한 예시도이다.
도 4는 조사 생물학적 질의를 가능케 하기 위한 암 네트워크 모델링의 예시도이다.
도 5는 조사 생물학 플랫폼 기술의 예시도이다.
도 6은 본 플랫폼 기술에서 채택한 기술의 예시도이다.
도 7은 데이터 수집, 데이터 통합, 및 데이터 마이닝을 포함하는 본 발명의 플랫폼의 구성 요소를 개략적으로 나타낸다.
도 8은 “체학(omics)” 캐스케이드로부터의 반응 데이터의 MIMS 및 수집을 사용한 체계적 조사를 개략적으로 나타낸다.
도 9는 정상 및 당뇨성 상태를 나타내는 생체 외 모델을 구축하기 위해 채택되는 구성 요소를 개략적으로 나타낸다.
도 10은 질병 생리병리학과 관련하여 단백질의 인과 네트워크를 생성하기 위해 사용되는 정보학 플랫폼 REFS™를 개략적으로 나타낸다.
도 11은 당뇨성 상태 대 정상적 상태 및 MIMS에 의한 치료에 의해 정상적 상태로 회복된 당뇨성 노드에서의 분별 네트워크의 생성을 위한 접근 방식을 개략적으로 나타낸다.
도 12는 당뇨성 상태 대 정상적 상태에서의 대표적인 분별 네트워크이다.
도 13은 노드 및 연관된 관심 있는 간선(중앙의 노드 1)을 개략적으로 나타낸다. 각 간선과 연관된 상기 세포 기능성이 도시된다.
도 14는 일부 실시예에 따른 예시적 방법의 고 수준 흐름도이다.
도 15A-15D는 일부 예시적 실시예에서 사용될 수 있는 AI 기반 정보학 시스템의 구성 요소 및 과정에 대한 고 수준의 개략적 예시도이다.
도 16은 일부 예시적 실시예에서 사용될 수 있는 AI 기반 정보학 시스템의 과정의 흐름도이다.
도 17은 본 명세서에서 기술된 예시적 실시예를 실시하기에 적절한 예시적 컴퓨팅 환경을 개략적인 묘사이다.
도 18은 예 1에 기술된 사례 연구 설계의 예시도이다.
도 19는 하향 노드에 대한 CoQ10 치료의 효과를 도시한다.
도 20은 CoQ10 치료가 암 세포 라인 HepG2에서 LDHA의 발현을 감소시킴을 보여 준다.
도 21은 구축된 모든 모델 중에서, 70% 파편 빈도에서 Paca2, HepG2 및 THLE2 세포 라인으로부터의 데이터에 기반한 REFS 합치된 네트워크의 예시적 단백질 상호 반응을 도시한다.
도 22는 두 암 세포 라인 내에서 LDHA 발현 시뮬레이션에 반응하는 단백질이 본 플랫폼 기술을 사용하여 식별되었음을 보여 준다.
도 23은 LDHA - PARK7 네트워크의 진정 경로 보조(Ingenuity Passway Assist®) 분석이 TP53를 상향 허브로 식별함을 보여 준다.
도 24는 SKMEL28 암 세포 라인에서 TP53 발현 수준에 대한 CoQ10 처리의 효과를 보여 준다.
도 25는 SKMEL28 암 세포 라인에서 세포 자살을 실현하는 BCL-2 단백질의 변경된 발현과 연관된 TP53의 활성화와 SKMEL28 내의 Bcl-2, Bax 및 카스파제3 발현 수준에 대한 CoQ10 처리의 효과를 보여 준다.
도 26은 델타-델타 네트워크의 생성에 대한 수학적 접근 방식을 예시한다.
도 27은 ECAR 및 OCR을 추진하는 암- 건강 표본 분별(델타-델타) 네트워크이다. 각 추진 인자는 간선의 두께로 표현되는 종단점에 대한 분별 효과를 가진다. 사이토스케이프(Cytoscape)에서 간선의 두께는 배수 변화의 강도를 나타낸다.
도 28은 IPA를 사용하는 조사적 플랫폼 기술 출력으로부터의 PARK7 매핑 및 연관된 노드를 보여 준다: 회색 모양은 IPA로 가져온 조사적 플랫폼 기술 출력으로부터의 PARK7과 연관된 모든 노드를 나타낸다. 채워지지 않은 모양은 (이름과 함께) 완전한 맵을 생성하기 위해 IPA에 의해 통합된 새로운 연결이다.
도 29는 본 발명의 조사 플랫폼 기술을 예시하며, PARK7과 연관된 노드의 신규의 연관을 보여 준다. 대시 라인으로 나타낸 간선은 노드를 가지나 IPA 내의 중간 물질 노드를 가지지 않는 시뮬레이션에서의 중간 물질 내 두 노드 사이의 연결이다. 점선으로 나타낸 간선은 노드를 가지나 IPA 내에서 서로 다른 중간 물질 노드를 가지는 시뮬레이션에서의 중간 물질 내 두 노드 사이의 연결이다.
도 30은 델타-델타 네트워크의 생성에 대한 수학적 접근 방식을 예시한다. NG∩HG 델타 네트워크 내 NG로부터의 고유한 간선들을 HG∩HGT1 델타 네트워크 내 HGT1의 고유한 간선들과 비교한다. NG 및 HGT1의 교집합 내의 간선들은 T1에 의해 NG로 회복된 HG 간선이다.
도 31은 NG∩HG 델타 네트워크 상에 중첩된 코엔자임 Q10 처리에 의해 정상으로 회복된 당뇨성 간선들의 델타-델타 네트워크 이다.
도 32는 정상 지질 상태 ∩ 고지질증 델타 네트워크 상에 중첩된 코엔자임 Q10 처리에 의해 정상으로 회복된 고지질증 간선들의 델타-델타 네트워크이다.
도 33은 질병 및 약제 치료 내 지방산 운명의 변화를 개략적으로 나타낸다. ATP 생성을 위한 자유 지방산(FFA)의 활용과 막 생물학 교란에 대한 반응으로서 막 리모델링 사이의 균형이 약제 유도 심장 독성과 관련된다.
도 34는 당뇨성 심장근 세포에서의 약제 유도 독성을 연구하기 위해 사용된 실험적 설계 및 모델링 매개변수를 개략적으로 나타낸다.
도 35는 당뇨성 심장근 세포 내의 인간 미토콘드리아의 약제 처리(T)에 의한 에너지 대사 유전자의 전사적 네트워크 및 발현의 조절 장애를 나타낸다: 구조 분자(R)는 유전자 발현을 정상화시킨다.
도 36: A. 약제 치료(T)가 고혈당증의 조건을 겪은 심장근 세포로부터의 미토콘드리아 내 GPAT1 및 TAZ의 발현을 유도하였다. 구조 분자와 조합하여(T+R) GPAT1 및 TAZ의 수준이 정상화되었다. B. G3P 로부터 TAG의 합성을 보여준다.
도 37: A. 약제 치료(T)가 고혈당증의 조건을 겪은 심장근 세포내 미토콘드리아의 OCR (산소 소모율)을 감소시켰다. 구조 분자(T+R)가 OCR을 정상화한다. B. 약제 치료(T)가 고혈당증의 조건을 겪은 심장근 세포내 미토콘드리아의 ATP 합성을 억제한다.
도 38은 약제 치료에 의해 하향 조절된 단백질의 GO 주석을 보여준다. 미토콘드리아의 에너지 대사에 포함된 단백질은 약제 치료에 의해 하향 조절되었다.
도 39는 델타 네트워크의 생성에 대한 수학적 접근 방식을 예시한다. 양 모델이 당뇨성 환경에 있을 때 T 대 UT로부터의 고유한 간선을 비교한다.
도 40은 약제 유도 독성의 생리병리학을 추진하는 잠재적 단백질 허브 및 네트워크를 나타내는 개략도이다.
도 41은 생물학적 시스템 또는 질병 과정의 조절 인자를 식별하는 방법의 예시도이다.
도 42는 ENO1 활성에서의 상당한 감소를 도시하지만 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서의 ENO1 발현에 대해서는 그렇지 않음을 보여 준다.
도 43은 PGK1 활성에서의 상당한 감소를 도시하지만 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서의 PGK1 단백질 발현에 대해서는 그렇지 않음을 보여 준다.
도 43은 PGK1 활성에서의 상당한 감소를 도시하지만 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서의 PGK1 단백질 발현에 대해서는 그렇지 않음을 보여 준다.
도 44는 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서 LDHA 활성의 상당한 감소를 도시한다.
도 45는 AI 기반 REFS™ 시스템을 사용하여 결과적인 데이터 집합을 분석함으로써 생산될 수 있는 인과적 분자의 상호 반응 네트워크를 예시한다.
도 46은 베이지안(Bayesian) 네트워크 추정 알고리즘을 채택하는 다중체적 데이터의 통합이 어떻게 간세포 암종에서의 신호 전달 경로의 이해로 귀결되는지를 예시한다. 노란색 사각형은 전사후 수정(인산) 데이터를 나타내며, 파란색 삼각형은 활성 기반(키나아제) 데이터를, 녹색 원은 단백질체 데이터를 나타낸다.
도 47은 간세포 암종에서의 신호 전달 경로에서의 자동 조절과 역 피드백 조절이 어떻게 플랫폼에 의해 추정될 수 있는지를 예시한다. 사각형은 PMT(인산) 데이터(회색/어두움 = 키나아제, 노란색/밝음 - 키나아제 활성 없음)를 나타내며, 사각형은 활성 기반(키나아제) + 단백질체학 데이터(회색/어두움 = 키나아제, 노란색/밝음 - 키나아제 활성 없음)를 나타낸다.
도 48 내지 51은 플랫폼에 의해 추정된 신호 전달 경로에서의 도출된 인과적 연관의 예시도이다. 키나아제 동형 단백질은 대표적인 사각형과 원으로 나타내어 졌으며, 연결기에 의해 나타나는 인과적 연관을 보여 준다.
도 52A와 B는 (A) 융합성 또는 (B) 하위융합성 배양에서 성장한 인간 배꼽의 정맥 내피의 세포(HUVEC)자 표시된 농도 범위의 CoQ10으로 24시간 동안 처리되었음을 보여 준다. 융합성 세포는 '정상' 세포와 매우 유사함에 반해 하위 융합성 세포는 증식 세포의 혈관 형성 표현형을 매우 유사하게 나타낸다. 융합성 배양에서, 농도를 증가시킨 CoQ10의 첨가는 EC의 보다 밀접한 연관, 연장 및 정렬을 가져왔다. 5000μM은 원형화된 세포에서 미묘한 증가를 가져 왔다.
도 53A-C는 HUVEC 세포의 융합성 (A) 및 하위 융합성 (B) 배양이 100 또는 1500μM CoQ10으로 24시간 동안 처리되고 요오드화프로피디엄 양성 세포 사멸제 세포에 대해 분석된 것을 도시한다. CoQ10 융합에서 처리된 EC를 보호하는 경향이 있으며, 반면에 하위-융합성 세포는 CoQ10에 민감하고 1500μM CoQ10에서 증가하는 세포 자살을 보여 주었다. (C) 하위-융합성 제어 EC(왼쪽), 100μM CoQ10(중앙) 및 1500μM CoQ10(오른쪽)의 대표적인 히스토그램을 도시한다.
도 54A-C는 HUVEC 세포의 하위 융합성 배양이 100 또는 1500μM CoQ10으로 72시간 동안 처리되고 요오드화프로피디엄 통합 분석(G2/M 위상 DNA를 탐지)을 사용하여 세포의 개수(A) 및 증식(B) 모두에 대한 분석을 도시한다. 높은 농도의 CoQ10는 세포의 개수에서 상당한 감소를 가져 왔으며 EC 증식에 대한 투여량에 의존하는 효과를 보여 주었다. CoQ10의 농도가 증가함에 따라 세포 증식이 낮아지는 것을 보여 주는 세포 사이클의 G2/M 위상 내의 세포에 대한 대표적인 세포 증식 게이팅의 히스토그램[제어 EC(왼쪽), 100μM CoQ10(중앙) 및 1500μM CoQ10(오른쪽)]이 (C)에 도시되었다.
도 55는 HUVEC 세포가 "스크래치" 분석을 사용하는 이주를 위해 검사되는 융합으로 성장하였음을 보여 준다. 100 또는 1500μM의 CoQ10가 스크래치 시 가해졌으며 정리된 영역의 폐쇄가 48시간에 걸쳐 모니터링되었다. 100μM의 CoQ10가 제어 표본에 비해 내피의 폐쇄를 지연시켰다. 1500μM CoQ10를 추가하면 48시간 까지도 폐쇄가 방지되었다(데이터 미도시).
도 56는 3-D 마트리겔 형태의 튜브에서 시간에 따라 성장하는 내피의 세포를 보여 준다. 관 형성에 대한 100μM 및 1500 μM CoQ10의 분별 효과가 관찰되었다. 저해된 세포에서 세포로의 연관 및 초기 관 구조의 붕괴가 1500 μM CoQ10에 상당히 발생하였다. 도시된 영상 72시간에 촬영되었다.
도 57A-B는 하위융합성 및 융합성 배양 내에서 성장한 내피의 세포가 CoQ10의 존재 또는 부재 하에 정상 및 혈중 산소 감소 조건에서 성장하였음을 보여 준다. CoQ10 및 저산소 상태에 대한 반응으로서 산화질소(NO)(A) 및 반응성 산소 종(ROS)(B)의 생성이 분석되었다.
도 58A-D는 지정된 성장 조건 하에서 미토콘드리아의 산소 소모를 분석하기 위해 내피의 세포가 CoQ10의 존재 또는 부재 하에서 하위 융합성 또는 융합성 배양에서 성장되는 것을 도시한다. 전체 OCR의 평가(A); 미토콘드리아의 OCR(B); ATP 생산(C); ECAR(D)이 도시된다.
I. 개요
본 발명의 예시적 실시예들은 질병 생리병리학 또는 신생 혈관 생성과 같은 광범위한 범위의 생물학적 과정들을 이해할 수 있는 도구이며 질병 과정을 가능하게 하는 요소들을 포함하여 이러한 생물학적 과정의 기반이 되는 핵심적 분자의 추진 인자인 조사적 생물학 플랫폼(“플랫폼”)을 사용하여 수행될 수 있는 방법들을 통합한다. 일부 예시적 실시예들에는 이 플랫폼의 최소한 일부 또는 전체를 통합할 수 있는 시스템이 포함된다. 일부 예시적 방법들은 이 플랫폼의 최소한 일부 또는 전체를 채택할 수 있다. 이 플랫폼을 포함하는 일부 예시적 실시예의 목표와 목적은 일반적인 예시의 목적으로 이하에서 개략적으로 설명된다:
i) 생물학적 과정(예를 들어, 질병 과정, 신생 혈관 생성)의 임계 성분의 추진 인자로서 이들이 전반적인 생물학적 과정에 관계되는 특정한 분자 서명을 창출한다.
ii) 다른 생물학적 단계(예를 들어, 정상적 상태)에 대하여 특정 생물학적 상태(예를 들어, 질병 상태, 신생 혈관 생성 상태)를 구분하는 분별 분자 서명을 식별하고, 두 생물학적 상태 간의 변화(예를 들어, 정상 상태에서 질병 상태 또는 신생 혈관 생성 상태로의)의 메커니즘을 중재하는 서명 또는 분자 객체 전체에 대한 이해를 발전시키는데 도움을 줄 수 있는, 생물학적 과정과 관련된 분자 서명 또는 분별 맵을 생성한다.
iii) 생물학적 과정의 외부 제어를 위한 잠재적 시술 타겟으로서(예를 들어, 허브를 잠재적 치료적 타겟 또는 신생 혈관 생성의 조절을 위한 타겟으로 사용), 또는 문제가 되는 생물학적 과정을 위한 잠재적 생물학적 표지 인자로서(예를 들어, 예후 및/또는 치료 진단(theranostics)에서의 사용에서의 질병에 특정한 생물학적 표지 인자 및 혈관 형성 특정한 표지 인자)의 분자 활성 “허브”의 역할을 조사한다.
이 플랫폼을 포함하는 일부 예시적 방법들은 다음 특성 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다:
1) 하나 또는 그 이상의 모델, 바람직하게는 생체 외 모델 또는 실험실 모델(예를 들어, CAM 모델, 각막 주머니 모델, 마트리겔(MATRIGEL®) 모델)에서 생물학적 과정과 연관된 세포를 사용하여 생물학적 과정(예를 들어, 질병 과정, 혈관 형성 과정) 및/또는 생물학적 과정(예를 들어, 질병 생리학 및 생리병리학, 신생 혈관 생성의 생리학)의 구성 요소에 대한 모델링. 예를 들어, 상기 세포는 문제가 되는 생물학적 과정에 정상적으로 참여하는 인간에서 유래한 세포일 수 있다. 상기 모델은 해당 생물학적 과정(예를 들어, 질병, 신생 혈관 생성)에 특정된 여러 세포의 알림 신호 / 조건 / 교란을 포함할 수 있다. 이상적으로, 상기 모델은 생물학적 (질병, 신생 혈관 생성) 조건의 정적 평가가 아닌 여러(질병, 신생 혈관 생성) 상태 및 플럭스(flux) 성분을 나타낸다.
2) 해당 분야에서 알려진 수단을 사용한 mRNA 및/또는 단백질 서명의 프로파일링. 예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR) 및 질량 분광학(MS)과 같은 단백질체학 분석 도구. 이러한 mRNA 및 단백질 데이터 집합은 환경 / 교란에 대한 생물학적 반응을 나타낸다. 적용할 수 있고 가능한 경우에, 리피도믹스, 대사체학, 및 전사체학 데이터 또한 문제가 되는 생물학적 과정을 위한 보조적 또는 대체적 수단으로 통합?? 수 있다. SNP 분석은 때때로 과정에서 사용할 수 있는 또 다른 구성 요소이다. 이는, 예를 들어, SNP 또는 특정한 변이가 생물학적 과정에 영향을 미치는 지의 여부를 조사하는데 도움이 될 수 있다. 이들 변수들은 생물학적 과정을 정적인 “순간 상태(snapshot)” 또는 동적 과정의 표현 중 하나로 기술하기 위해 사용될 수 있다.
3) 신호 및 교란에 대한 하나 또는 그 이상의 세포 반응의 평가로서, 생명 에너지론 프로파일링, 세포 증식, 세포 자살, 및 기관계 기능을 포함하나 이에 한정되지 않음. 진정한 유전자형-표현형 연관이 ATP, ROS, OXPHOS, 시호스(Seahorse) 분석, 카스파제 분석, 이주 분석, 주화성 분석, 관 형성 분석 등과 같은 기능적 모델을 채택함으로써 실현된다. 이러한 세포 반응들은 생물학적 과정(또는 이들의 모델)에서의 mRNA / 단백질 발현, 및 상기 2)에서 기술된 다른 관련 상태의 해당 상태(들)에 대한 세포의 반응을 나타낸다.
4) 상기 3)에서 단백질체학으로 이렇게 획득한 기능적 분석 데이터 및 상기 2)에서 획득한 기타 데이터를 통합하고, 인과 관계에 의해, 인공 지능(AI) 기반 정보학 시스템 또는 플랫폼에 의해 추진되는 단백질 연관을 결정. 이러한 AI 기반 시스템은 생물학적 과정에 대한 기존 지식에 의존하지 않고 상기 2) 및/또는 3)에서 획득한 데이터 집합에, 바람직하게는 상기 데이터 집합에만 기반한다. 바람직하게는, 어떠한 데이터 포인트도 통계적으로 또는 인위적으로 잘려나가지 않는다. 그 대신, 획득된 모든 데이터 단백질연관의 결정을 위한 AI 시스템으로 공급된다. 상기 통합 과정의 한 목표 또는 출력은 서로 다른 생물학적 상태(예를 들어, 질병 상태 대 정상적 상태) 사이의 하나 또는 그 이상의 분별 네트워크(다른 경우에 본 명세서에서 “델타 네트워크”로 또는 일부 경우에는 경우가 의미하는 바에 따라 “델타-델타 네트워크”로 불릴 수 있다)이다.
5) 활성의 각 허브를 잠재적 치료적 타겟 및/또는 생물학적 표지 인자로 탐구하기 위한 AI 기반 정보학 플랫폼으로부터의 출력에 대한 프로파일링. 이러한 프로파일링은 어떠한 실제 수중 실험실 실험에 의존하지 않고 획득한 데이터 집합에 기반한 컴퓨터 시뮬레이션만으로 수행될 수 있다.
6) 분자의 및 세포 기술을 채택하여 활성의 허브를 증명. 이러한 수중 실험실 세포-기반 실험에 의한 출력에 대한 정보 취득 이후 증명은 선택 사항일 수 있으나, 완전히 순환적인 조사를 창출하는데 도움이 될 것이다.
상기 개략적으로 설명된 것 중 어느 하나 또는 모든 접근 방식이 최소한 부분적으로는 특정한 적용의 특성에 따라 생물학적 과정에 대해 특정하게 적용될 수 있다. 즉, 상기 개략적으로 설명된 것 중 하나 또는 그 이상의 접근 방식이 생략되거나 수정될 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 추가적인 접근 방식이 특정한 적용에 따라 채택될 수 있다.
상기 플랫폼을 예시하는 여러 개략적 예시가 제공된다. 특히, 상기 플랫폼을 사용하여 치료제를 식별하기 위한 예시적 접근 방식의 예시가 도 1에서 묘사된다. 암 및 통합된 다중 생리학적 상호 반응 출력 조절의 결과의 시스템 생물학에 대한 예시가 도 2에서 묘사된다. MIMS를 사용한 생물학적 관련성의 체계적 조사의 예시가 도 3에서 묘사된다. 조사적 생물학적 질의를 가능하게 하기 위한 암 네트워크의 모델링의 예시가 도 4에서 묘사된다.
상기 플랫폼에서 채택된 조사적 생물학 플랫폼 및 기술의 예시가 도 5 및 6에서 묘사된다. 데이터 수집, 데이터 통합, 및 데이터 마이닝을 포함하는 상기 플랫폼의 구성요소의 개략적 표현이 도 7에서 묘사된다. MIMS 및 “체학(omics)” 증폭으로부터의 반응 데이터의 수집을 이용한 체계적 조사에 대한 개략적 표현이 도 8에서 묘사된다.
도 14는 예시적 방법(10)에 대한 고 수준의 흐름도로서, 예시적 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 예시적 시스템의 구성 요소를 나타낸다. 초기에, 일반적으로 생물학적 과정과 연관된 세포를 사용하여 생물학적 과정 (예를 들어, 질병 과정) 및/또는 생물학적 과정 (예를 들어, 질병 생리학 및 생리병리학)의 구성 요소를 위한 모델(예를 들어, 생체 외 모델)을 수립한다(단계 12). 예를 들어, 상기 세포는 생물학적 과정(예를 들어, 질병)에 정상적으로 참여하는 인간으로부터 유래된 세포일 수 있다. 세포 모델은 생물학적 과정(예를 들어, 질병)에 특유한 여러 세포 단서, 조건, 및/또는 교란을 포함할 수 있다. 이상적으로, 상기 세포 모델은 생물학적 과정의 정적 평가가 아닌 생물학적 과정(예를 들어, 질병)의 여러 (질병) 상태 및 플럭스 성분을 나타낸다. 상기 비교 세포 모델은 제어 세포 또는 정상(예를 들어, 질병이 없는) 세포를 포함할 수 있다. 이 세포 모델의 추가적인 설명은 이하 제 III.A절 및 IV절에서 주어진다.
제 1 데이터 집합은 생물학적 과정을 위한 세포 모델로부터 얻어지며, 알려진 과정 또는 시스템(예를 들어, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 질량 분광학(MS)과 같은 단백질체학 분석 도구)을 사용하여 다수의 유전자(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 서명)의 발현 수준을 나타내는 정보를 포함한다(단계 16).
제 3 데이터 집합은 비교 생물학적 과정을 위한 세포 모델로부터 얻어 진다(단계 18). 상기 제 3 데이터 집합은 비교 세포 모델로부터의 비교 세포 내의 다수의 유전자의 발현 수준을 나타내는 정보를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시예에서, 이들 제 1 및 제 3 데이터 집합은 본 명세서에서 총체적으로 생물학적 시스템과 연관된 세포(비교 세포를 포함하는 모든 세포) 내에서 다수의 유전자의 발현 수준을 나타내는 “제 1 데이터 집합”으로 통칭된다.
제 1 데이터 집합 및 제 3 데이터 집합 하나 또는 그 이상의 mRNA 및/또는 단백질 서명 분석 시스템(들)로부터 얻어질 수 있다. 제 1 및 제 3 데이터 집합 내의 상기 mRNA 및 단백질 데이터는 환경 및/또는 교란에 대한 생물학적 반응을 나타낼 수 있다. 적용 또는 가능한 경우, 리피도믹스, 대사체, 및 전사체 데이터가 상기 생물학적 과정에 대한 보조적이거나 대체적 수단으로서 통합될 수 있다. SNP 분석은 상기 과정에서 때때로 사용될 수 있는 또 다른 구성 요소이다. 이는, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 특정한 변이가 생물학적 과정에 영향을 미치는지를 조사하는데 도움이 될 것이다. 이러한 데이터 변수는 정적 “순간 상태(snapshot)” 또는 동적 과정의 표현 중 하나로서 생물학적 과정을 기술하는데 사용될 수 있다. 세포 내 다수의 유전자의 발현 수준을 나타내는 정보에 관한 추가적인 설명은 이하 제 III.B절에서 주어진다.
제 2 데이터 집합은 생물학적 과정을 위한 세포 모델로부터 얻어지며, 세포의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보를 포함한다(단계 20). 마찬가지로, 제 4 데이터집합은 생물학적 과정을 위한 세포 모델로부터 얻어지며, 비교 세포의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보를 포함한다(단계 22).
본 발명의 방법의 특정 실시예에서, 이들 제 2 및 제 4 데이터 집합은 본 명세서에서 총체적으로 생물학적 시스템과 관련된 세포(비교 세포를 포함하는 모든 세포)의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 “제 2 데이터 집합”으로 통칭한다.
하나 또는 그 이상의 기능적 분석 시스템이 기능적 활성 또는 세포 또는 비교 세포의 반응에 관한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. 신호 및 교란에 대한 기능적 세포 반응과 관련된 상기 정보는 생물에너지론 프로파일링, 세포 증식, 세포 자살, 및 기관계의 기능을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 과정 및 경로에 대한 기능적 모델(예를 들어, 아데노신 3 인산(ATP), 활성 산소종(ROS), 산소 첨가 인산화(OXPHOS), 시호스(Seahorse) 분석, 카스파제 분석, 이주 분석, 주화성 분석, 관 형성 분석 등)들이 진정한 유전자형-표현형 연관을 얻기 위해 채택될 수 있다. 상기 기능적 활성 또는 세포 반응은 mRNA / 단백질 발현의 해당 상태(들) 및 기타 관련된 적용 조건 또는 교란에 대한 반응에서 생물학적 과정(또는 이들의 모델) 내 세포의 반응을 나타낸다. 세포의 기능적 활성 또는 반응을 나타내는 정보 획득에 대한 추가적 정보는 이하 제 III.B절에서 제공된다.
상기 방법은 또한 컴퓨터로 구현된 세포 및 제어 세포 내에서의 생물학적 과정의 모델을 생성하는 것을 포함한다. 예를 들어, 다수의 유전자 발현 수준 및 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 이들의 모임) 인과 관계의 베이지안(Bayesian) 네트워크가 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합으로부터 세포 모델(“생성된 세포 모델 네트워크”)에 대해 생성될 수 있다(단계 24). 상기 생성된 세포 모델 네트워크는, 개별적으로 또는 총체적으로, 관계에 대한 정량적 확률적 방향 정보를 포함한다. 상기 생성된 세포 모델 네트워크는 제 1 데이터 및 제 2 데이터 집합으로부터의 정보를 제외하고는 유전자 발현 및/또는 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 알려진 생물학적 관계에 기반하지 않는다. 상기 하나 또는 그 이상의 생성된 세포 모델 네트워크는 총체적으로 합치된 세포 모델 네트워크라 칭할 수 있다.
예를 들어, 다수의 유전자 발현 수준 및 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 하나 또는 그 이상의 (예를 들어, 이들의 모임) 인과 관계의 베이지안(Bayesian) 네트워크가 제 1 데이터 집합 및 제 2 데이터 집합으로부터 비교 세포 모델(“생성된 비교 세포 모델 네트워크”)에 대해 생성될 수 있다(단계 26). 상기 생성된 비교 세포 모델 네트워크는, 개별적으로 또는 총체적으로, 관계에 대한 정량적 확률적 방향 정보를 포함한다. 상기 생성된 세포 네트워크는 제 1 데이터 및 제 2 데이터 집합으로부터의 정보를 제외하고는 유전자 발현 및/또는 기능적 활성 또는 세포 반응 사이의 알려진 생물학적 관계에 기반하지 않는다. 상기 하나 또는 그 이상의 생성된 비교 세포 모델 네트워크는 총체적으로 합치된 세포 모델 네트워크라 칭할 수 있다.
상기 생성된 세포 모델 네트워크 및 생성된 비교 세포 모델 네트워크는 인공 지능(AI) 기반 정보학 플랫폼을 사용하여 창출할 수 있다. 생성된 세포 모델 네트워크의 창출, 생성된 비교 세포 모델 네트워크의 창출 및 AI 기반 정보학 시스템에 대한 보다 자세한 사항은 이하 제 III.C절 및 도 2A-3에 대한 설명에서 주어진다.
다른 많은 AI 기반 플랫폼 또는 시스템이 정량적 확률적 방향 정보를 포함하는 인과 관계의 베이지안(Bayesian) 네트워크를 생성하기 위해 사용될 수 있음을 인식하여야 한다. 본 명세서에서 기술된 특정 예들이 특정한 상용으로 사용할 수 있는 시스템, 즉, GNS(캠브리지, MA)로부터의 REFS™ (역 엔지니어링/정방향 시뮬레이션)을 채택하였지만, 실시예는 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예를 구현하기에 적절한 AI 기반 시스템 또는 플랫폼은 입력 변수(예를 들어, 제 1 및 제 2 데이터 집합)들 사이의 인과 관계를 잠재적, 확립된 생물학적 관계 및/또는 증명된 생물학적 관계에 대한 어떠한 기존의 지식에도 의존하지 않고 입력 데이터에만 기반하여 확립하기 위해 수학적 알고리즘을 채택한다.
예를 들어, REFS™ AI 기반 정보학 플랫폼은 실험적으로 도출된 가공되지 않았거나(원래의) 또는 최소한으로 처리된 입력 생물학적 데이터(예를 들어, 유전학적, 게놈 관련, 후성유전학, 단백질체, 대사체, 임상적 데이터)를 활용하며, 분자가 완전한 시스템 내에서 서로 어떻게 반응하는지를 결정하기 위해 수 조 회의 계산을 빠르게 수행한다. REFS™ AI 기반 정보학 플랫폼은 입력 데이터를 기반으로 기반이 되는 생물학적 시스템을 정량적으로 나타내는 컴퓨터로 구현된 컴퓨터 모의 세포 모델(예를 들어, 생성된 세포 모델 네트워크)을 생성하기 위한 목표로 역 엔지니어링 과정을 수행한다. 또한, 가설과 관련하여 연관된 신뢰 수준을 수반하는 예측을 얻어내기 위해, 기반이 되는 생물학적 시스템에 대한 가설이 개발되고 컴퓨터로 구현된 세포 모델를 기반으로 빠르게 모의될 수 있다.
이러한 접근 방식을 사용하여, 생물학적 시스템이 어떠한 환자가 주어진 치료 식이 요법에 반응할지를 결정하는 생물학적 시스템(예를 들어, 질병)의 상세한 메카니즘, 효과적인 시술 전략, 및/또는 임상적 생물학적 표지 인자를 알아내기 위한 “시술” 이 모의되는 정량적 컴퓨터로 구현된 세포 모델로 나타내어 진다. 알려진 생물학의 모델링에 기반한 접근 방식뿐만 아니라 종래의 생물정보학 및 통계적 접근 방식은 일반적으로 이러한 유형의 통찰을 제공하지 못한다.
상기 생성된 세포 모델 네트워크 및 상기 생성된 비교 세포 모델 네트워크가 만들어진 후에, 이들은 각각 비교된다. 생성된 세포 모델 네트워크의 최소한 일부에 존재하는 하나 또는 그 이상의 인과 관계, 및 상기 생성된 비교 세포 모델 네트워크에 부재하거나 최소한 하나의 의미 있는 다른 매개변수를 가지는 인과 관계가 식별된다(단계 28). 이러한 비교는 결과적으로 네트워크의 생성을 일으킬 수 있다. 이러한 비교, 식별, 및/또는 분별(델타) 네트워크 생성은 분별 네트워크 생성 모듈을 사용하여 수행될 수 있으며, 이 모듈은 이하 제 III.D절 및 도 26의 설명과 관련하여 보다 상세히 기술된다.
일부 실시예에서, 입력 데이터 집합은 하나의 세포 유형 및 하나의 비교 세포 유형으로부터 유래하며, 이는 하나의 세포 유형에 기반한 세포 모델 네트워크들의 모임 및 하나의 비교 제어 세포 유형에 기반한 또 다른 비교 세포 모델 네트워크들의 모임을 생성할 수 있다. 분별이 한 세포 유형의 네트워크들의 모임과 비교 세포 유형(들)의 네트워크들의 모임 사이에 수행될 수 있다.
다른 실시예에서, 입력 데이터 집합은 다중 세포 유형(예를 들어, 둘 또는 그 이상의 암 세포 유형, 예를 들어, 서로 다른 혈관 형성 촉진 자극에 의해 유도된 서로 다른 신생 혈관 생성 상태에서의 둘 또는 그 이상의 세포 유형), 다중 비교 세포 유형(예를 들어, 둘 또는 그 이상의 정상, 암세포가 아닌 유형, 둘 또는 그 이상의 비혈관 형성 및 혈관 형성 세포 유형)으로부터 유래된다. 세포 모델 네트워크들의 모임은 각각의 세포 유형 및 각각의 비교 세포 유형에 대해 개별적으로 생성되고, 또한/또는 다중 세포 유형 및 다중 비교 세포 유형으로부터의 데이터가 각자의 합성 데이터 집합으로 결합될 수 있다. 상기 합성 데이터 집합은 다중 세포 유형(합성 데이터)에 해당하는 네트워크들을 모임 및 다중 비교 세포 유형(비교 합성 데이터)에 해당하는 네트워크들의 또 다른 모임을 생성할 수 있다. 분별이 비교 합성 데이터에 대한 네트워크들의 모임과 비교하여 합성 데이터에 대한 네트워크들의 모임에 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 분별은 두 개의 서로 다른 분별 네트워크 사이에서 수행될 수 있다. 이 출력은 델타-델타 네트워크로 불릴 수 있으며, 이하 도 26과 관련하여 설명된다.
정량적 관계 정보 생성된 세포 모델 네트워크의 각 관계에 대해 식별될 수 있다(단계 30). 마찬가지로, 생성된 비교 세포 모델 네트워크 내에서의 각 관계에 대한 정량적 관계 정보가 식별될 수 있다(단계 32). 관계에 대한 상기 정량적 정보는 인과율을 나타내는 방향, 관계에 대한 통계적 불확실성의 척도(예를 들어, 커브 아래 면적(Area Under the Curve: AUC) 통계적 측정), 및/또는 관계의 강도에 대한 정량적 양(예를 들어, 배수)의 발현을 포함할 수 있다. 생성된 세포 모델 네트워크 내의 상기 여러 관계는 잠재적 치료적 타겟 및/또는 생물학적 표지 인자로서의 활성 네트워크 내의 각 허브를 탐구하기 위해 정량적 관계 정보를 사용하여 프로파일링될 수 있다. 이러한 프로파일링은 실제의 수중 실험실 실험에 의존하지 않고 완전히 생성된 세포 모델 네트워크로부터의 결과에 기반한 컴퓨터 시뮬레이션으로 수행할 수 있다.
일부 실시예에서, 활성 네트워크 내의 허브는 분자 및 세포 관련 기술을 채택하여 증명될 수 있다. 수중 실험실 세포 기반 실험에 의한 출력에 대해 이러한 사후 정보 인증을 수행할 필요는 없지만, 이는 완전히 순환적인 조사를 수행하는데 도움이 될 것이다. 도 15는 예시적 AI 기반 정보학 시스템 (예를 들어, REFS™ AI 기반 정보학 시스템) 및 AI 기반 시스템 과 조사적 생물학 플랫폼 (“플랫폼”)의 기타 요소 또는 부분 사이의 상호 반응의 기능성의 단순화된 고 수준의 표현을 개략적으로 묘사한다. 도 15A에서, 약제의 투여, 치료의 실행, 단백질 발현, mRNA 발현, 및 기타 다수의 연관된 기능적 조치들(OCR, ECAR과 같은)과 같은 생물학적 과정 (예를 들어, 질병 모델)에 대한 모델로부터 얻어진 여러 데이터 집합들이 AI 기반 시스템으로 공급된다. 도 15B에서 보인 바와 같이, 입력 데이터 집합으로부터, AI-시스템은 생물학적 과정 (예를 들어, 질병), 베이지안(Bayesian) 파편 일람표(도 15B)로 불리는 과정에서의 분자의 메커니즘을 추진하는 변수들(단백질, 지질 및 대사 물질)을 포함하는 “네트워크 파편들”의 라이브러리를 생성한다.
도 15C에서, 상기 AI 기반 시스템은 라이브러리에서 네트워크 파편의 부분 집합을 선택하여 상기 파편으로부터 초기 시도 네트워크를 구성한다. 상기 AI 기반 시스템은 또한 라이브러리에서 네트워크 파편의 다른 부분 집합을 선택하여 또 다른 초기 시도 네트워크를 구성한다. 결과적으로 라이브러리 내 네트워크 파편의 서로 다른 부분 집합들로부터 초기 시도 네트워크들의 모임(예를 들어, 1000개의 네트워크)이 생성된다. 이 과정은 병행 모임 샘플링이라 부를 수 있다. 모임 내의 각각의 시도 네트워크는 라이브러리로부터의 추가적인 네트워크 파편의 추가, 차감 및 대입에 의해 진화하거나 최적화된다. 추가적인 데이터가 얻어지는 경우, 이 추가적인 데이터는 라이브러리 내 네트워크 파편들로 통합될 수 있으며 각 시도 네트워크의 진화를 통해 시도 네트워크의 모임들로 통합될 수 있다. 최적화/진화 과정이 완료된 이후, 이 시도 네트워크들의 모임은 생성된 세포 모델 네트워크로서 기술될 수 있다.
도 15D에서 보인 바와 같이, 생성된 세포 모델 네트워크들의 모임은 생물학적 시스템의 거동을 시뮬레이션하기 위해 사용될 수 있다. 상기 시뮬레이션은 수중 실험실 세포-기반, 또는 동물-기반 실험에 의해 증명될 수 있는 조건의 변화에 대한 생물학적 시스템의 거동을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 생성된 세포 모델 네트워크에서의 관계의 정량적 매개변수는 생성된 세포 모델 네트워크 내 다른 노드에 대한 영향을 관찰하면서 시뮬레이션된 교란을 각 노드 개별적으로 적용함으로써 시뮬레이션 기능성을 사용하여 추출할 수 있다. 이에 대한 보다 상세한 사항은 이하 제 III.C절에서 설명된다.
도 2A-2D에서 묘사된 AI 기반 정보학 시스템 자동화된 역 엔지니어링 과정은 편향되지 않고 체계적인 컴퓨터 기반 세포 모델 네트워크인 생성된 세포 모델 네트워크들의 모임을 생성한다.
상기 역 엔지니어링은 데이터 내에서의 분자의 측정과 관심의 대상인 표현형 결과 사이의 확률 방향적 네트워크 연결을 결정한다. 분자의 측정에서의 변동은 이러한 객체들 및 종단점들에서의 변화 사이의 확률적인 원인 결과 관계를 학습할 수 있게 해 준다. 플랫폼의 기계 학습적 성격은 또한 끊임없이 진화하는 데이터 집합에 기반한 훈련 및 예측을 가능하게 해 준다.
데이터 내에서의 분자 측정들 사이의 네트워크 연결은 “확률적”이며, 이는 부분적으로 이러한 연결이 컴퓨터 알고리즘에 의해 “학습된” 관찰된 데이터 집합들 사이의 상호 관계에 기반할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 단백질 X의 발현 수준과 단백질 Y의 발현 수준이 긍정적 또는 부정적으로 상호 관련되어 있다면, 데이터 집합의 통계적 분석을 기반으로, 단백질 X 및 Y 사이의 네트워크를 수립하도록 인과 관계가 지정될 수 있다. 이러한 추정 상의 인과 관계의 신뢰성은 이러한 연결의 확률로써 정의될 수 있으며, p-값(예를 들어, p < 0.1, 0.05, 0.01, 등)으로 측정될 수 있다.
데이터 내에서의 분자 측정들 사이의 네트워크 연결은 “방향성”을 가지며, 이는 부분적으로 역 엔지니어링 과정으로 결정되는 분자 측정들 사이의 네트워크 연결이 연결된 유전자 / 단백질 사이의 관계의 원인과 결과를 반영함으로써 이로 인해 한 단백질의 발현 수준을 올리는 것이 상기 연결이 발현을 촉진하는지 저지하는지에 따라 다른 단백질의 발현 수준을 올리거나 내릴 수 있기 때문이다.
데이터 내에서 분자의 측정들 사이의 네트워크 연결은 “정량적”이며, 이는 부분적으로, 이 과정에 의해 결정되는 분자의 측정 사이의 네트워크 연결 이 기존의 데이터 집합 및 이 데이터와 연관된 확률적 척도에 기반한 컴퓨터 시뮬레이션으로 모의될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 분자의 측정들 사이에 확립된 네트워크 연결에서, 주어진 단백질(네트워크 내의 “노드”)의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 것이(예를 들어, by 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50,100-배수 또는 그 이상) 이론적으로 가능할 수 있으며, 이의 네트워크 내의 다른 연결된 단백질에 대한 영향을 정량적으로 모의할 수 있다.
데이터 내에서 분자의 측정들 사이의 네트워크 연결은 “편향되지 않으며(unbiased)”, 이는 최소한 부분적으로는 어떠한 데이터 포인트도 통계적으로 또는 인위적으로 배제되지 않기 때문이며, 부분적으로는 상기 네트워크 연결이 문제가 되는 생물학적 과정에 대한 기존의 지식을 참조하지 않고 입력 데이터에만 기반하기 때문이다.
데이터 내에서 분자의 측정들 사이의 네트워크 연결은 “체계적”이며 (또한 편향되지 않으며), 이는 부분적으로 모든 입력 변수들 사이의 모든 잠재적 연결이 예를 들어, 쌍 단위의 방식으로 체계적으로 탐구되었기 때문이다. 이러한 체계적인 탐구를 실행하기 위한 컴퓨터 연산에 대한 의존은 입력 변수의 개수가 증가할수록 기하학적으로 늘어난다.
일반적으로, 보통 약 1,000개에 이르는 네트워크의 모임이 모든 측정된 개체들 사이의 확률적, 인과적, 정량적 관계를 예측하기에 충분하다. 네트워크들의 모임은 데이터 내의 불확실성을 포획하며 각 모델 예측에 대한 신뢰도 척도의 계산을 가능하게 한다. 네트워크들의 모임을 함께 사용하여 생성된 예측에서, 모임 내 개별적 네트워크로부터의 예측에 있어서의 차이는 예측 내의 불확실성의 정도를 나타낸다. 이러한 특성은 상기 모델로부터 생성된 임상적 반응의 예측에 대한 신뢰성 척도를 지정할 수 있게 해준다.
모델들이 일단 역 엔지니어링되면, 질병 조건과 같은 문제가 되는 생물학적 과정에 대한 핵심 분자의 추진 인자를 결정하기 위해 추가적인 시뮬레이션 질의가 모델들의 모임에 수행될 수 있다.
정상 및 당뇨성 상태들을 나타내는 표본적 생체 외 모델을 구축하기 위해 채용된 구성 요소의 개략적 묘사가 도 9에 도시되었다. 질병 생리병리학과 관련하여 단백질의 인과 네트워크를 생성하기 위해 사용되는 정보학 플랫폼 REFS™의 개략적 표현이 도 10에서 묘사된다. 당뇨성 상태 대 정상적 상태 및 MIMS에 의한 치료에 의해 정상적 상태로 회복된 당뇨성 노드에서의 분별 네트워크의 생성을 위한 접근 방식은 도 11에서 개략적으로 묘사된다. 당뇨성 상태 대 정상적 상태에서의 대표적인 분별 네트워크는 도 12에서 묘사된다. 노드 및 연관된 관심 있는 간선(중앙의 노드 1) 및 각 간선과 연관된 상기 세포 기능성이 도 13에서 도시된다.
본 발명을 위에서 일반적으로 기술하였으므로, 이하의 명세서 부분들에서는 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 분석될 수 있는 하나 또는 그 이상의 특정한 생물학적 시스템을 가지는 상기 일반적인 발명의 여러 측면 또는 요소에 대한 보다 상세한 설명이 제공될 것이다. 그러나, 이하 예시적 목적으로 사용된 특정한 생물학적 시스템들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 대체적 시스템 및 수정된 시스템을 포함하여 다른 별개의 생물학적 시스템들 및 이들과 균등한 사항들 또한 마찬가지로 본 발명의 플랫폼 기술을 사용하여 분석될 수 있을 것이다.
II . 정의
본 명세서에서 사용되며 특정한 의도로 정의되었으나 본 명세서의 다른 절에서 아직 정의되지 않은 특정 용어들을 여기에서 정의한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “하나” 및 “하나의”는 영문 명세서의 관사에 해당하며 본 명세서에서 하나 또는 하나 이상(즉, 최소한 하나)의 문법적 객체를 나타낸다. 예로써, “한 요소”는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 “포함하는”은 본 명세서에서 “포함하나 이에 한정되지 않는”의 의미로 사용되며, 이들 용어들은 서로 교차적으로 사용된다.
용어 “또는”은 본 명세서에서 용어 “및/또는”의 의미로 사용되며, 다르게 명확하게 지정되지 않는 한 이들 용어들은 서로 교차적으로 사용된다.
용어 “와 같은”은 본 명세서에서 용어 “와 같은 그러나 이에 한정되지 않는”의 의미로 사용되며, 이들 용어들은 서로 교차적으로 사용된다.
“대사 경로”는 한 화합물을 다른 화합물로 변환하고 세포 기능을 위한 중간 단계와 에너지를 제공하는 일련의 효소 중재 반응들을 말한다. 이러한 대사 경로는 선형 또는 환형 또는 분지형일 수 있다.
“대사 상태”는 주어진 시점에서 건강 또는 질병 상태와 관련하여 다양한 화학적, 생물학적 지표에 의해 측정되는 특정한 세포, 다중 세포 또는 조직 환경의 분자의 내용물을 말한다.
“신생 혈관 생성” 이미 존재하는 혈관으로부터의 새로운 혈관의 성장을 포함하는 생리학적 과정을 말한다. 신생 혈관 생성의 최소한 혈관 내피의 세포의 증식, 일반적으로 화학요법 제제에 대한 반응으로서 혈관 내피의 세포의 이주, 일반적으로 기질 금속 단백질 분해 효소의 생성으로 인한 세포 외 기질의 퇴화, 기질 금속 단백질 분해 효소 생성, 관상 형성, 혈관 루멘 형성, 혈관 분출, 일반적으로 인테그린 발현인 접착 분자 발현, 및 분화를 포함한다. 배양 시스템(예를 들어, 일차원 대 삼차원) 및 세포 유형에 따라, 여러 측면의 신생 혈관 생성이 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서 성장한 세포에서 관찰될 수 있다. 혈관 형성 세포 또는 혈관 형성 세포의 특성 중 최소한 하나의 특성을 보이는 세포는 위에서 설명한 특성 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 그 이상의 특성을 보인다. 신생 혈관 생성의 조절 인자는 위에서 설명한 특성 중 최소한 하나를 증가 또는 감소시킨다. 신생 혈관 생성은 혈관의 자생적 형성인 맥관 생성이나 기존의 혈관이 나뉘어져 새로운 혈관이 형성되는 세포의 영양분 삽입 성장(intussusception)을 나타내는 용어와는 다른 것이다.
용어 “미세 배열”은 종이, 나일론 또는 다른 유형의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드, 또는 기타 다른 적절한 고체 지지체와 같은 기질 상에서 합성된 별개의 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리펩티드(예를 들어, 항체) 또는 펩티드의 배열을 말한다.
용어 “질환” 및 “질병”은 포괄적으로 사용되며 신체의 어떠한 부분, 기관 또는 체계(이들의 임의의 조합)가 정상적 구조 또는 기능으로부터 벗어나는 것을 말한다. 특정한 질병은 생물학적, 화학적 및 물리적 변화를 포함하는 특유한 증상 및 신호에 의해 발현되고, 때때로 다양한 다른 요소들과 관련되어 있으며, 이러한 요소들은 인구 통계학적, 환경적, 고용 관련, 유전학적 및 의학적 이력과 관련된 요소들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정한 특유 신호, 증상, 및 관련 요소들이 진단적 정보를 생성하기 위해 다양한 방법으로 정량 측정될 수 있다.
용어 “발현”은 DNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로부터 폴리펩티드가 생산되는 과정을 포함한다. 이 과정은 유전자의 mRNA로의 전사 및 이 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함할 수 있다. 용어가 사용되는 문맥에 따라, “발현”은 RNA, 단백질 또는 둘 모두의 생산을 말할 수 있다.
용어 “유전자의 발현 수준” 또는 “유전자 발현 수준”은 pre-mRNA 발생기의 전사체(들), 전사체 처리 중간체, 성숙한 mRNA(들) 및 퇴행 산물뿐만 아니라 mRNA의 수준, 또는 세포 내 유전자에 의해 부호화된 단백질의 수준을 말한다.
용어 “조절”은 반응의 상향 조절(즉, 활성화 또는 자극), 하향 조절(즉, 금지 또는 억제), 또는 이 둘의 조합 또는 각각을 말한다. “조절 인자”는 조절을 수행하는 화합물 또는 분자이며, 예를 들어, 작용 물질, 억제 물질, 활성 인자, 자극 인자, 억제 인자, 또는 금지 인자일 수 있다.
표현 “조절 인자에 대한 영향”은 조절 인자의 발현을 변화시키거나, 그 수준을 변화시키거나, 또는 그 활성을 변화시키는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “트롤라민”은 트롤라민 NF, 트리에탄올아민, TEAlan®, TEAlan 99%, 트리에탄올아민, 99%, 트리에탄올아민, NF 또는 트리에탄올아민, 99%, NF를 말한다. 이러한 용어들은 본 명세서에서 교차적으로 사용될 수 있다.
용어 “게놈”은 생물학적 객체(세포, 조직, 기관, 시스템, 기관계)의 유전학적 정보 전체를 말한다. 이는 DNA 또는 RNA(예를 들어, 특정 바이러스에서) 중 하나에서 부호화된다. 게놈은 유전자 및 DNA 부호화되지 않은 염기서열 모두를 포함한다.
용어 “단백질체”는 주어진 시점에 게놈, 세포, 조직, 또는 기관계에 의해 표현되는 단백질의 전체 집합을 말한다. 보다 특정적으로, 이는 주어진 시점에 정의된 조건 하에서 주어진 유형의 세포 또는 기관계에서 발현된 단백질의 전체 집합을 말할 수 있다. 단백질체는, 예를 들어, 유전자의 대체적 이어 맞추기 및/또는 (글리코실화 또는 인산화와 같은) 전사 후 변형으로 인한 단백질 이형체를 포함할 수 있다.
용어 “전사체”는 주어진 시점에 하나 또는 군집으로 된 세포로부터 생산된 mRNA, rRNA, tRNA, 마이크로 RNA, 다이서 기질 RNA, 및 기타 비 코딩 RNA를 포함하는 전사된 RNA 분자의 전체 집합을 말한다. 이 용어는 주어진 기관계 내의 전체 집합의 전사체에, 또는 특정한 세포 유형에 존재하는 특정한 전사체의 부분 집합에 적용될 수 있다. 주어진 세포 라인(변이는 제외)에 대략적으로 고정되어 있는 게놈과는 달리, 전사체는 외부 환경적 조건에 따라 변화할 수 있다. 이는 세포 내의 모든 mRNA 전사체를 포함하기 때문에, 전사체는 주어진 시점에 활성으로 발현되고 있는 유전자를 반영하나, 전사적 감쇄와 같은 mRNA 퇴화 현상은 제외한다.
전사체학의 연구는, 발현 프로파일링으로도 불리며, 주어진 세포 군집 내에서 mRNA의 발현 수준을 검사하며, 때로는 DNA 미세 배열 기술에 기반한 고성능 기술을 사용한다.
용어 “대사체”는 단일 기관계와 같은 생물학적 표본에서 주어진 시점에 주어진 조건 하에서 발견되는 (대사적 중간 물질, 호르몬 및 기타 신호 생성 분자, 및 2차 대사 물질과 같은) 소형 분자 대사 물질들의 완전한 집합을 말한다. 상기 대사체는 동적이며, 매 초마다 변화할 수 있다.
용어 “지질체”는 주어진 시점에 주어진 조건 하에서 단일 기관계와 같은 생물학적 표본 내에서 발견되는 지질들의 전체 집합을 말한다. 지질체는 동적이고, 매 초마다 변화할 수 있다.
용어 “상호 작용체”는 연구 중인 생물학적 시스템(예를 들어, 세포) 내의 분자의 상호 반응들의 전체 집합을 말한다. 이는 방향성을 가진 그래프로 보여 질 수 있다. 분자의 상호 반응은 다른 생화학적 그룹(단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등)에 속하는 분자들 사이에서, 또한 주어진 그룹 내부 에서 일어날 수 있다. 단백질체학의 관점에서 기술하면, 상호 작용체는 단백질-단백질 상호 반응 네트워크(PPI), 또는 단백질 상호 반응 네트워크(PIN)를 말한다. 광범위하게 연구된 또 하나의 유형의 상호 작용체는 단백질-DNA 상호작용체 (전사 요소(또한 DNA 또는 염색질 조절 단백질)에 의해 형성된 네트워크) 및 이들의 타겟 유전자이다.
용어 “세포의 출력”은 매개변수, 바람직하게는 세포 상태와 관련된 측정가능한 매개변수의 수집을 포함하며 다음을 포함한다(이에 한정되지는 않는다): (예를 들어, RT-PCR, qPCR, 미세 배열 등으로 측정 가능한) 하나 또는 그 이상의 유전자의 전사의 수준, (예를 들어, 질량 분광학 또는 서부 블롯에 의해 측정 가능한) 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 발현 수준, (예를 들어, 기질 변환률로서 측정 가능한) 하나 또는 그 이상의 효소 또는 단백질의 절대적 활성 또는 (예를 들어, 최대 활성에 대한 % 값으로 측정 가능한) 상대적 활성, 하나 또는 그 이상의 대사 물질 또는 중간 물질의 수준, (예를 들어, 산소 소모율 또는 OCR에 의해 측정 가능한) 산소 첨가 인산화의 수준, (예를 들어, 외부 세포 산화율 또는 ECAR에 의해 측정 가능한) 해당 과정의 수준, 리간드-타겟 결합 또는 상호 반응의 정도, 세포 외 분비 분자의 활성 등. 세포의 출력은 소정 개수의 타겟 유전자 또는 단백질 등에 대한 데이터를 포함할 수 있으며, 또는 모든 탐지 가능 유전자 또는 단백질에 대한 전역 평가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어떠한 특정한 단백질이 표본 또는 세포 군집 내에서 발현될지에 대한 사전 지식 없이 주어진 표본 또는 세포 군집 내에서 발현된 모든 탐지 가능 단백질을 식별하고, 또한/또는 정량화하기 위해 질량 분광학이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, “세포 시스템”은 균일하거나 불균일한 세포의 군집을 포함한다. 세포 시스템 내의 상기 세포는 자연적 또는 생리학적 환경 하에서 생체 내에서 성장하거나, 예를 들어, 제어된 조직 배양 환경과 같은 생체 외에서 성장하고 있을 수 있다. 시스템 내의 상기 세포는 상대적으로 균일하거나(예를 들어, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.9% 이상으로 균일), 또는 보통 밀접한 근접성의 생체 내에서 성장하는 것으로 발견되는 세포 유형, 또는 예를 들어, 근거리 분비 또는 다른 먼 거리의 세포 간 통신을 통해 또 다른 생체 내 세포 유형과 반응할 수 있는 세포 유형과 갈은 둘 또는 그 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포 시스템 내의 상기 세포는 암 세포 라인, 불멸의 세포 라인, 또는 정상 세포 라인을 포함하는 확립된 세포 라인으로부터 도출되거나 주된 세포 또는 살아 있는 조직 또는 기관으로부터 분리된 세포일 수 있다.
세포 시스템 내의 세포는 일반적으로 영양분, 기체(산소 또는 CO2 등), 화학제품, 또는 세포의 거동에 영향을 미치는 조건을 제공할 수 있는 단백질계 / 비단백질계 자극 물질을 제공할 수 있는 “세포 환경”과 접촉한다. 상기 세포 환경은 정의된 화학적 성분 및/또는 다소 잘 정의되지 않은 조직 추출물 또는 혈청 성분을 가지는 화학적 매체일 수 있으며, 세포가 성장하는 특정한 pH, CO2 내용물, 압력, 및 온도를 포함할 수 있다. 대체적 방법으로, 상기 세포 환경은 자연적이거나 또는 특정한 세포 시스템에 대해 생체 내에서 발견되는 생리학적 환경일 수 있다.
특정 실시예에서, 세포 환경은 생물학적 시스템 또는 과정의 한 측면, 예를 들어, 질병 상태, 과정, 또는 환경을 시뮬레이션하는 조건을 포함한다. 이러한 배양 조건들은, 예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태, 또는 젖산 풍부 조건을 포함한다. 몇 개의 이러한 조건들이 본 명세서에서 기술된다.
특정 실시예에서, 특정한 세포 시스템에 대한 세포 환경은 또한 수용기의 유형 또는 세포 표면 상의 리간드 및 이들 각각의 활성, 탄수화물 또는 지질 분자의 특성, 막의 극성이나 흐름성, 특정 막 단백질의 뭉친 상태 등과 같은 세포 시스템의 특정한 세포 표면 특성을 포함한다. 이러한 세포 표면 특성들은 다른 세포 시스템에 속하는 세포와 같은 근접한 세포들의 기능에 영향을 줄 수 있다. 그러나, 다른 특정한 실시예에서, 상기 세포 시스템의 세포 환경은 세포 시스템의 세포 표면 특성을 포함하지 않는다.
상기 세포 환경은 “수정된 세포 환경”이 되도록 변경될 수 있다. 변경은 하나 또는 그 이상의 “외부 자극 성분”을 세포 환경에 추가하는 것을 포함하는 세포 환경에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 성분에 있어서의 변화(예를 들어, 증가 또는 감소)를 포함할 수 있다. 상기 환경적 교란 또는 외부 자극 성분은 세포 환경에 내생적이거나(예를 들어, 상기 세포 환경이 일정 수준의 자극제를 포함하고, 그 이상의 자극제가 그 수준을 증가시키기 위해 첨가됨), 세포 환경에 외생적(예를 들어, 상기 자극제가 변경 이전의 세포 환경에 대체적 방법으로 존재하지 않음)일 수 있다. 상기 세포 환경은 외부 자극 성분을 추가함으로써 야기되는 2차적 변화에 의해 더 변경될 수 있으며, 이는 상기 외부 자극 성분이 세포 시스템에 의해 세포 환경으로 분비된 분자를 포함하여 세포 시스템의 세포의 출력을 변화시킬 수 있기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 “외부 자극 성분”은 본 명세서에서 “환경적 교란”으로도 불리며, 세포의 기능에 영향을 줄 수 있는 어떠한 외부의 물리적 및/또는 화학적 자극을 포함한다. 이는 어떠한 대형 또는 소형의 기관 관련 또는 기관 내의 분자, 자연적이거나 합성된 화학 물질, 온도의 전이, pH 변화, 복사, 빛(UVA, UVB 등), 마이크로 웨이브, 초음파, 전기 전류, 변경되거나 변경되지 않은 자기장 등을 포함할 수 있다.
용어 “MIM ( Multidimensional Intra Cellular Molecule: 다차원 세포 내 분자)”은 신체에 의해 자연적으로 생산되고 또한/또는 인간의 최소한 하나의 세포에 존재하는 내생 분자의 분리된 버전 또는 합성적으로 생산된 버전이다. MIM은 세포 내로 진입할 수 있으며, 상기 세포 내로의 진입은 분자의 생물학적으로 활성화된 부분이 세포 내로 완전히 들어가는 한, 완전하거나 부분적인 세포 내로의 진입을 포함한다. MIM는 세포 내에서 신호 형질 도입 및/또는 유전자 발현 메커니즘을 유도할 수 있다. MIM은 분자들이, 예를 들어, 약 전달과 같은 치료적 효과 및 담체 효과를 모두 가지므로 다차원적이다. MIM는 또한 분자들이 질병 상태에서는 특정 방식으로 정상적 상태에서는 이와 다른 방식으로 행동하므로 다차원적이다. 예를 들어, CoQ-10의 경우, VEGF의 존재 하에서 흑색종 세포에 대한 CoQ-10의 투여는 결과적으로 감소된 수준의 Bcl2를 야기하며, 이는 다시 흑색종 세포에 대한 감소된 종양 형성 가능성을 야기한다. 반면에, 정상적인 섬유아세포에서는, CoQ-10 및 VEFG의 보조 투여가 Bcl2의 수준에 영향을 미치지 않는다.
일 실시예에서, MIM은 또한 에피시프터이며, 또 다른 실시예에서, MIM은 에피시프터가 아니다. 또 다른 실시예에서, MIM은 하나 또는 그 이상의 상기 기술한 기능으로 특징지워진다. 또 다른 실시예에서, MIM은 둘 또는 그 이상의 상기 기술한 기능으로 특징지워진다. 추가적인 실시예에서, MIM은 셋 또는 그 이상의 상기 기술한 기능으로 특징지워진다. 추가적인 또 다른 실시예에서, MIM은 상기 기술한 기능 모두로 특징지워진다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 MIM이 둘 또는 그 이상의 내생 분자의 혼합물을 포함하는 것으로 의도되었다는 것을 인식할 수 있을 것이며, 이때 상기 혼합물은 하나 또는 그 이상의 상기 기술한 기능으로 특징지워진다. 혼합물 내의 상기 내생 분자는 혼합물이 MIM으로서 기능할 수 있는 비율로 존재한다.
MIM은 지질 기반 또는 비지질 기반 분자일 수 있다. MIM의 예는 CoQ10, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌 및 시스테인과 같은 아미노산을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일 실시예에서, 상기 MIM은 소형 분자이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 MIM은 CoQ10가 아니다. MIM은 본 명세서에서 상세히 기술된 분석 방법을 사용하여 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 식별될 수 있다. MIM은 미국 특허 12/777,902 (US 2011-0110914)에서 보다 상세히 기술되며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로써 명시적으로 통합된다.
본 명세서에서 사용되는, “에피메타볼릭 시프터(에피대사적 시프터)” (에피시프터: epi-shifter)는 건강한(또는 정상의) 상태로부터 질병 상태로의 대사 전이 및 그 반대의 전이를 조절함으로써 이에 의해 인간에서의 세포, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주의 건강을 유지하거나 재확립하는 분자이다. 에피시프터는 조직의 마이크로환경 내에서 정규화를 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 에피시프터는 세포에 첨가되거나 이로부터 고갈되었을 때 세포의 마이크로환경(예를 들어, 대사 상태)에 영향을 줄 수 있는 모든 분자를 포함한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 에피시프터가 둘 또는 그 이상의 분자의 혼합물도 또한 포함하도록 의도된 것임을 인식할 수 있을 것이며, 이때 상기 혼합물은 상기 기술한 기능들 중 하나 또는 그 이상으로 특징지워진다. 상기 혼합물 내의 분자들은 혼합물이 에피시프터로 기능하도록 하는 비율로 존재한다. 에피시프터의 예는 CoQ-10; 비타민 D3; 피브로넥틴과 같은 ECM 성분; TNFa 또는 어떠한 인터루킨, 예를 들어, IL-5, IL-12, IL-23와 같은 면역조절 인자; 혈관 형성 요소; 및 세포 사멸 요소를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일 실시예에서, 상기 에피시프터는 또한 MIM이다. 일 실시예에서, 상기 에피시프터는 CoQ10가 아니다. 에피시프터는 본 명세서에 상세하게 기술된 분석을 사용하여 해당 분야에서의 기술들 중 하나로써 통상적으로 식별될 수 있다. 에피시프터는 미국 특허 12/777,902(US 2011-0110914)에 보다 상세하게 설명되며, 그 전체 내용은 참조로써 본 명세서에 명시적으로 통합된다.
각 용어가 나타나는 시점의 적용에 있어서 정의되지 않은 용어들은 해당 분야의 통상의 전문가들이 보통 이해하는 의미를 가진다.
III . 본 플랫폼 기술의 예시적 단계 및 구성 요소
단지 예시의 목적으로, 본 발명의 플랫폼 기술의 다음 단계들이 암 모델로부터 획득된 데이터를 통합하기 위해, 또한 암의 발병을 추진하는 신규의 단백질 / 경로를 식별하기 위해 사용되는 예시적 활용으로서 이하의 본 명세서에서 기술될 수 있다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 암과 관련된 진단적 / 예후적 표지 인자뿐만 아니라 암 치료 타겟을 제공한다. 그러나, 본 플랫폼 기술은 어떠한 생물학적 시스템 또는 과정에도 일반적으로 적용될 수 있으며, 및 특정한 암 또는 기타 특정 질병 모델에 한정되지 않는다.
추가적으로, 하기의 설명이 일 부분에서는 비연속적인 단계로 기술되기는 하지만, 이는 예시적 목적 및 단순성을 위한 것이며, 따라서 실제로는 순서 및/또는 단계간의 구분을 그렇게 엄격히 규정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 단계들은 분리되어 수행될 수 있으며, 본 명세서에서 제공되는 발명은 본 발명의 플랫폼 기술의 개별적 단계들을 하나 또는 그 이상(예를 들어, 어느 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 개의 모든 단계)의 단계들의 조합뿐만 아니라 이들을 각각 분리하여 포함하기 위한 것이며, 상기 단계들은 남아 있는 단계들에 관계없이 독립적으로 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 플랫폼 기술이 모든 측면을 별개의 성분들과 및 본 발명의 실시예로서 포함하도록 의도된 것이다. 예를 들어, 상기 생성된 데이터 집합들은 본 발명의 실시예로서 의도된 것이다. 추가적인 예로서, 상기 생성된 인과 관계 네트워크, 생성된 합치 인과 관계 네트워크, 및/또는 생성된 모의 인과 관계 네트워크 또한 본 발명의 실시예로서 의도된 것이다. 생물학적 시스템에서 특유한 것으로 식별된 상기 인과 관계는 본 발명의 실시예로서 의도된 것이다. 또한, 특정한 생물학적 시스템에 대한 상기 필요에 따라 구축된 모델 또한 본 발명의 실시예로서 의도된 것이다. 예를 들어, 질병 상태 또는 과정에 대한 필요에 따라 구축된 모델, 예를 들어, 신생 혈관 생성에 대한 모델, 암, 비만/당뇨/심장병에 대한 세포 모델, 또는 약제의 독성 (예를 들어, 심장 독성)에 대한 필요에 따라 구축된 모델과 같은 필요에 따라 구축된 모델 또한 본 발명의 실시예로서 의도된 것이다.
A. 필요에 따른 모델(custom model) 구축
본 플랫폼 기술의 제 1 단계는 생물학적 시스템 또는 과정에 대한 모델을 수립하는 것이다.
1. 신생 혈관 생성 모델
신생 혈관 생성의 생체 외 및 생체 내 모델 모두가 알려져 있다. 예를 들어, 인간 배꼽의 제대혈관 내피 세포(HUVEC)를 사용하는 생체 외 모델이 예에서 상세히 기술된다. 간단하게 설명하면, HUVEC가 하위-융합성 배양에서 성장하면, 이는 혈관 형성 세포의 특성을 보인다. HUVEC가 융합성 배양에서 성장하면, 이는 혈관 형성 세포의 특성을 보이지 않는다. 내피의 세포 증식, 이주 및 분화를 포함하는 혈관 형성 캐스케이드에서의 대부분의 단계는 생체 외에서 분석될 수 있다. 증식 연구는 세포 계수, 티미딘 통합, 또는 세포 증식을 위한(PCNA 의 측정에 의한) 면역 조직화학 검사 염색 또는 (단말 디옥시뉴클레이타이딜 전달 효소-중재 dUTP 닉 말단 라벨링 또는 투넬(Tunel) 분석에 의한) 세포 사멸에 기반한 것이다. 주화성은 막 필터로 구분되는 상부 및 하부 웰로 구성되는 보이든(Boyden) 챔버 내에서 검사될 수 있다. 화학 주화성 용액은 하부 웰에 위치하고, 세포는 상부 웰에 추가되며, 배양 기간 후에 화학 주화성 자극 쪽으로 이주해 온 세포가 막의 하부 표면에서 계수된다. 세포 이주는 하기 예에서 제공되는 “스크래치(scratch)” 분석을 사용하여서도 연구될 수 있다. 분화는 이차원 및 삼차원 응결, 콜라겐 겔 및 마트리겔을 포함하는 서로 다른 ECM 성분의 내피의 세포를 배양함으로써 생체 외 유도가 가능하다. 미세 혈관 또한 3차원 피브린 겔 내에 삽입된 생쥐 대동맥의 링으로부터 성장한 것으로 밝혀 졌다. 매트릭스 금속 단백질 분해효소 발현은 지모겐 분석에 의해 분석될 수 있다.
망막의 맥관 구조는 생쥐가 탄생할 때 완전히 형성되지 않는다. 혈관 성장 및 신생 혈관 생성의 이 모델에서 상세히 연구되어 왔다. 단계적 상태의 망막이 정상적 생물학적 과정으로서의 신생 혈관 생성을 분석하기 위해 사용될 수 있다.
병아리 융모 요막(CAM) 측정은 해당 분야에서 잘 알려져 있다. 초기의 병아리 배아는 성숙한 면역 시스템이 결여되어 있으며, 따라서 종양 유도 신생 혈관 생성 연구를 위해 사용된다. 조직 그라프트는 달걀 껍질에 만들어진 창을 통해 CAM 상에 위치한다. 이는 구현 후 4일 내에 혈관의 그라프트 쪽으로의 전형적인 반지름 방향의 재배치와 그라프트 근처 혈관의 분명한 증가를 야기하였다. 그라프트로 들어가는 혈관들은 스테레오 현미경 하에서 계수된다. 시험 물질의 항-혈관 형성 또는 혈관 형성 활성을 분석하기 위해, 상기 화합물은 느리게 생성되는 중합체 펠릿에서 생성되어 젤라틴 스폰지로 흡수되거나, 또는 플라스틱 디스크 상에서 공기로 건조된 후 CAM 상에 심어 진다. 페트리 접시 내의 껍질 없는 배아의 배양을 포함하는 CAM 분석의 다양한 이형, 및 서로 다른 정량화 방법들(즉 방사능으로 라벨링된 프롤린을 사용한 기반 막의 생체합성 비율 측정, 현미경 또는 영상 분석 하의 혈관의 개수 세기)이 기술되었다.
각막은 생체 내 혈관 현장을 제공한다. 따라서, 연곽으로부터 각막 지질로 통과하는 혈관은 새로이 형성된 것으로 식별될 수 있다. 혈관 형성 반응을 유도하기 위해, 혈관 형성 물질(즉 VEGF의 FGF-2)을 포함하는 느린 분비의 중합체 펠릿[즉 폴리-2-하이드록시에틸-메타크릴레이트(하이드론) 또는 에틸에네비닐 아세테이트 공중합체(ELVAX)]이 쥐의 각막 지질 내에 생성된 "주머니"에 이식되었다. 또한, 광범위한 조직, 세포, 세포 추출물 및 조건을 겪은 매체가 각막 내에서 이들의 신생 혈관 생성의 효과에 대해 조사되었다. 혈관 반응 각막에 인디아 잉크를 관류시킨 이후 컴퓨터 영상 분석에 의해 정량 측정될 수 있다. 각막은 수확되어 본 명세서에서 제공된 플랫폼 방법을 이용하여 분석될 수 있다.
마트리겔(MATRIGEL®)은 엥겔브레스-홀름-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 쥐과 동물 육종으로 알려진 생쥐의 기반 막 종양 기질이다. 이는 라미닌, 콜라겐 유형 IV, 헤파란 황화물, 피브린 및 성장 요소를 포함하는 기반 막 단백질의 복잡한 혼합물이며, EGF, TGF-b, PDGF 및 IGF-1을 포함한다. 이는 원래 내피의 생체 외 세포 분화를 연구하기 위해 개발되었다. 그러나, 마트리겔(MATRIGEL®)-함유 FGF-2는 생쥐의 피하에 주입될 수 있다. 마트리겔(MATRIGEL®)은 4°C에서 액화되지만 37°C에서 고체 겔을 형성하여 성장 요소를 포획함으로써 분비가 서서히 일어나게 한다. 일반적으로 10일 후에, 이 마트리겔(MATRIGEL®) 플러그가 제거되며 신생 혈관 생성이 플러그 부분에서 조직학적으로 또는 형태측정세포학적으로 정량화된다. 마트리겔(MATRIGEL®) 플러그는 본 명세서에서 제공된 플랫폼 방법을 사용하여 수확되고 분석될 수 있다.
2. 생체 외 질병 모델
생물학적 시스템 또는 과정의 일례로 암을 들 수 있다. 다른 복잡한 생물학적 과정 또는 시스템과 마찬가지로, 암은 다중의 특유 측면으로 특징지울 수 있는 복잡한 병리학적 조건을 가지고 있다. 예를 들어, 높은 성장 속도로 인해, 많은 암 세포들이 저산소 조건에서도 성장할 수 있도록 적응되며, 상향 조절된 해당 과정 및 감축된 산화적 인산화 대사 경로를 가진다. 결과적으로, 암 세포는 잠재적 약제의 의한 치료와 같은 환경적 교란에 대해, 정상 세포가 동일한 치료에 대한 반응과 비교하여 다르게 반응할 수 있다. 따라서, 정상 세포의 반응과 비교하여 약 치료에 대한 암의 독특한 반응을 판독하는 것이 관심의 대상이 될 것이다. 이러한 목적을 위해, 암 세포의 환경, 예를 들어, 생체 내 종양 내의 암 세포의 조건을 매우 근사하게 나타내는 세포 배양 조건을 생성함으로써 환경조건을 시뮬레이션하거나, 암 세포의 다른 성장 조건을 분리함으로써 암 성장의 여러 측면을 모방하는 주문형 암 모델이 수립될 수 있다.
이러한 암 “환경”, 또는 성장 스트레스 조건 중 하나는 고형 종양 내에서 일반적으로 발견되는 저산소 상태이다. 저산소 상태는 해당 분야에 알려진 방법을 세포 내에서 사용하여 세포 내에서 유도될 수 있다. 예를 들어, 저산소 상태는 세포 시스템을 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업 기체 혼합물로 흘러 넘치게 할 수 있는 모듈라 배양기 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)내에 위치시킴으로써 유도될 수 있다. 소정의 기간 후, 예를 들어, 저산소 상태 처리 후 24시간 후에, 추가적인 외부 자극 성분들(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 부 존재 하에서 효과를 측정할 수 있다.
마찬가지로, 세포의 젖산 치료는 종양 환경 생체 내에 존재하는 방식의 해당 과정 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 젖산 유도 스트레스는 소정의 시간, 예를 들어, 24 시간에서 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 비 존재 하에서 약 12.5 mM의 최종 젖산 농도로 조사될 수 있다.
고혈당증은 보통 당뇨에서 발견되는 조건이다; 그러나, 많은 암 세포들이 자신들의 주된 에너지 원으로서 글루코스에 의존하기 때문에 고혈당증은 어느 정도 암 성장의 일 측면을 모방한다. 대상 세포를 일반적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은 매체 내 글루코스의 최종 농도가 약 22 mM가 되도록 10% 배양 등급의 글루코스를 적절한 매체에 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
암 성장의 다른 측면을 반영하는 개별적 조건들이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 별도로 조사되고 또한/또는 함께 조합될 수 있다. 일 실시예에서, 암 성장 / 조건의 서로 다른 측면들을 반영하거나 모의하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 개별적 조건 및, 추가적으로, 암 성장 / 조건의 서로 다른 측면들을 반영하거나 모의하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 조사된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 1과 20 사이, 1과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이, 또는 10과 50 사이의 서로 다른 조건들일 수 있다.
세포를 처리하기 위해 사용될 수 있는 조건들의 몇 개의 예시적 조합들이 여기에 열거된다. 수행되는 특정한 조사적 생물학적 평가에 따라 다른 조합들이 형성될 수 있다.
1. 매체만 존재
2. 50 μM CTL 코엔자임 Q10 (CoQ10)
3. 100 μM CTL 코엔자임 Q10
4. 12.5 mM 젖산
5. 12.5 mM 젖산 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
6. 12.5 mM 젖산 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
7. 저산소 상태
8. 저산소 상태 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
9. 저산소 상태 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
10. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산
11. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
12. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
13. 매체 + 22 mM 글루코스
14. 50 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22 mM 글루코스
15. 100 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22 mM 글루코스
16. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스
17. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
18. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10
19. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스
20. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
21. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
22. 저산소 상태 +12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스
23. 저산소 상태 +12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
24. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10
하나 또는 그 이상의 정상 세포 라인(예를 들어, THLE2 및 HDFa)이 제어로서 단백질 또는 경로(이하 참조)에 고유한 암을 식별하기 위해 비슷한 조건에서 배양된다. 상기 제어는 상기 기술된 비교 세포 모델일 수 있다.
단일 암 세포 유형과는 반대로, 같거나 다른 근원의 다중 암 세포들(예를 들어, 암 라인 PaCa2, HepG2, PC3 및 MCF7)이 암 모델에 포함될 수 있다. 특정한 상황에서 서로 다른 암 세포들(예를 들어, HepG2 및 PaCa2) 사이의 상호 대화 또는 ECS 실험이 다양한 상호 관련된 목적을 위해 수행될 수 있다.
상호 대화를 포함하는 일부 실시예에서, 상기 세포 모델에 수행된 실험은 정의된 치료 조건(예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태(국소 빈혈)) 하에서 세포 상태 또는 하나의 세포 시스템 또는 군집(예를 들어, 간 암종 세포 HepG2)의 기능에 대한 또 다른 세포 시스템 또는 군집(예를 들어, 췌장 관련 암 PaCa2)에 의한 조절을 결정하도록 설계된다. 전형적인 설정에 따르면, 제 1 세포 시스템 / 군집은 후보 분자(예를 들어, 소형 약제 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예를 들어, 저산소 상태, 고글루코스 환경)와 같은 외부 자극 성분에 접촉된다. 반응에서, 제 1 세포 시스템 / 군집 변화는 그 전사체, 단백질체, 대사체, 및/또는 상호 작용체로서, 세포의 내부 및 외부에서 쉽게 탐지될 수 있는 변화에 이르게 한다. 예를 들어, 전사체에서의 변화는 다수의 타겟 mRNA에서의 전사 수준에 의해 측정될 수 있다; 단백질체에서의 변화는 다수의 타겟 단백질의 발현 수준에 의해 측정될 수 있다; 또한 대사체 내 변화는 특히 주어진 대사 물질에 대해 설계된 분석을 통한 다수의 타겟 대사 물질의 수준에 의해 측정될 수 있다. 대체적 방법으로, 대사체 및/또는 단백질체에서의 상기 기준 변화는, 최소한 특정 분비 대사 물질 또는 단백질에 대해서는, 전사체, 단백질체, 대사체, 및 제 2 세포 시스템 / 군집의 상호작용체의 조절을 포함하는 제 2 세포 시스템 / 군집에 대한 이들의 영향에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 상기 실험들은 서로 다른 치료 조건 하에서 제 2 세포 시스템 / 군집에 제 1 세포 시스템 / 군집에 의해 분비된 관심있는 분자(들)의 영향을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 실험들은 또한 예를 들어, 단백질체학의 분별 선별에 의해 제 1 세포 시스템 (외부 자극 성분 치료에 대한 반응으로)에서 또 다른 세포 시스템으로의 신호 전달의 결과로 조절되는 어떠한 단백질을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 실험적 설정이 제 2 세포 시스템들 사이의 상호 효과 또한 분석될 수 있도록 역 설정에 대해서도 적응될 수 있다. 일반적으로, 이러한 유형의 실험에 대해, 세포 라인 쌍의 선택은 근원, 질병 상태 및 세포 기능 등과 같은 요소에 크게 기반한다.
2-세포 시스템이 일반적으로 이러한 유형의 실험적 설정에 관련되기는 하지만, 예를 들어, 각각의 별개의 세포 시스템을 별도의 고형 지지체에 고정시킴으로써 유사한 실험들이 둘 이상의 세포 시스템에 대해서도 설계될 수 있다.
일단 필요에 따른 모델이 구축되면, 환자에서 환자로의 유전학적 변이, 또는 특정 약제 또는 사전 약제로 치료되거나 치료되지 않은 것과 같은 하나 또는 그 이상의 “교란”이 시스템에 적용될 수 있다. 이에 대해서는 도 15D을 참조한다. 질병 관련 암 세포 및 질병 관련 정상 제어 세포에 대한 영향을 포함하여 이러한 교란이 시스템에 미치는 영향은 이하 제 III.B절에 기술된 해당 분야에서 알려진 다양한 방법 또는 특정 시행자의 수단을 사용하여 측정될 수 있다.
예시적 실험에서, 암 라인 PaCa2, HepG2, PC3 과 MCF7, 및 정상 세포 라인 THLE2과 HDFa는 각 고혈당증, 저산소 상태, 및 젖산 풍부 조건과 함께 이들 조건들 모두 또는 둘 또는 셋으로 조합된 조건을 겪게 되며, 이와 함께 환경적 교란, 특히 코엔자임 Q10에 의한 치료가 추가되거나 추가되지 않을 수 있다.
상기 필요에 따라 구축된 세포 모델은 본 명세서에서 기술된 단계들을 수행함으로써, 본 발명의 플랫폼 기술의 단계들에 걸쳐서 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 궁극적으로 식별하기 위해 확립되어 사용될 수 있다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자는 생물학적 과정에 대해 초기의, “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된 필요에 따라 구축된 세포 모델이, 예를 들어, 추가적인 암 또는 정상 세포 라인 및/또는 추가적인 암 조건을 도입함으로써 시간이 지남에 따라 지속적으로 진화 또는 확장될 수 있음을 이해할 것이다. 진화된 세포 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 확장되거나 진화된 세포 모델로부터 수집된 상기 새로운 데이터, 즉, 새롭게 추가된 부분(들)로부터의 세포 모델이 이후 이전에 보다 견고한 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해, "제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된 데이터 집합에 도입될 수 있다. 생물학적 시스템에 고유한 새로운 인과 관계는 이제 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크로부터 식별될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 세포 모델의 진화는 합치 인과 관계 네트워크의 진화를 제공하며, 이에 의해 새롭고 또한/또는 보다 신뢰성있는 생물학적 시스템의 조절 인자에 대한 통찰을 제공한다.
필요에 따라 구축된 세포 모델의 추가적 예들이 본 명세서에서 상세히 설명된다.
B. 데이터 수집
일반적으로, 두 가지 유형의 데이터가 특정 필요에 따라 구축된 모델 시스템으로부터 수집될 수 있다. 이러한 데이터의 한 유형(예를 들어, 제 1 데이터 집합, 제 3 데이터 집합)은 보통 DNA, RNA, 단백질, 지질 등과 같은 특정 마크로 분자의 수준에 관련된다. 이러한 범주의 예시적 데이터 집합은 단백질체의 데이터(예를 들어, 표본으로부터의 모든 또는 실질적으로 모든 측정 가능한 단백질의 발현에 관련된 정성적 및 정량적 데이터)이다. 다른 유형의 데이터는 일반적으로 제 1 유형의 데이터에서의 변화의 결과로 나타나는 표현형 변화를 반영하는 기능적 데이터(예를 들어, 제 2 데이터 집합, 제 4 데이터 집합)이다.
일부 실시예에서, 제 1 유형의 데이터에 대해 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 단백질체학이 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 및 단백질체학에 의한 세포 mRNA 및 단백질 발현에서의 변화를 프로파일링하기 위해 수행된다. 전체 RNA는 상용의 RNA 분리 키트를 사용하여 분리될 수 있다. cDNA 합성에 뒤이어, 상용으로 사용 가능한 신생 혈관 생성, 세포 자살, 및 당뇨와 같은 질병 영역 또는 세포 과정에 대한 특정한 qPCR 배열(예를 들어, SA 바이오사이언스로부터의 제품), 이 제조사의 사용 지침에 따라 유전자의 사전 정의된 집합을 프로파일링하기 위해 채택될 수 있다. 예를 들어, Biorad cfx-384 증폭 시스템이 모든 전사 관련 프로파일링 실험에 사용될 수 있다. 데이터 수집(Ct)에 뒤이어, 최종 배수 변화에 걸친 제어가 제조사의 프로토콜에서 설명된 δCt 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 단백질체의 표본 분석은 이후의 절에서 설명된 대로 수행될 수 있다.
대상 방법은 유사한 성격의 수 백 개의 표본을 가지는 대규모의 고 출력 성능의 정량적 단백질체의 분석을 채용할 수 있으며, 및 세포의 출력 분별을 식별하기 위해 필요한 데이터를 제공한다.
이러한 목적으로 사용하기에 적절한 몇 개의 기술들이 해당 분야에 알려져 있다. 예시적 기술로서, 질량 분광학과 조합된 iTRAQ 분석이 아래에서 간단히 소개된다.
정량적 단백질체학 접근 방식은 펩티드 식별 및 정량화를 위해 8-plex iTRAQ 반응 제제 및 2D-LC MALDI MS/MS를 사용한 안정된 동위원소 라벨링에 기반한다. 이러한 기술을 사용한 정량화는 상대적이다: 펩티드 및 단백질은 기준 표본에 대한 상대적 존재 비율로서 지정된다. 다중 iTRAQ 실험에서의 통상의 기준 표본들이 다중의 iTRAQ 실험에 걸쳐 표본의 비교를 용이하게 해 준다.
예를 들어, 이 분석 방법 체계를 구현하기 위해, 여섯 개의 주요 표본 및 두 개의 제어 풀 표본이 제조사의 제안에 따라 하나의 8-plex iTRAQ 혼합물로 결합될 수 있다. 이러한 여덟 개 표본의 혼합물은 다시 일차원에서의 강한 양이온 교환 (SCX), 및 이차원에서의 역위상 HPLC로 구성되는 이차원 액체 크로마토그래피로 분리될 수 있으며, 질량 분광학적 분석으로 분석될 수 있다.
채택 가능한 예시적 실험실 과정에 대한 간단한 검토가 본 명세서에서 제공된다.
단백질 추출: 세포는 프로테아제를 금지 인자로 하여 8 M 요소 용균 버퍼에 용해되어(서모 사이언티픽 홀트(Thermo Scientific Halt) 프로테아제 금지 인자, EDTA 없음) 얼음 위에서 매 10 분 마다 5초간의 버텍스로서 30 분 간 배양할 수 있다. 5 초 단위로 초음파 처리하여 용균을 완수할 수 있다. 세포 용해물은 세포 조각을 제거하기 위해 14000 x g에서 15분 간(4 °C) 원심 분리될 수 있다. 단백질 농도를 결정하기 위해 브래폴드(Bradford) 분석이 수행될 수 있다. 각 표본으로부터의 100ug 단백질이 환원(10mM Di티오트레이톨 (DTT), 55 °C, 1 시간), 알킬화(25 mM 이오도 아세타마이드, 실온, 30 분)되고 트립신으로 소화될 수 있다(1:25 w/w, 200 mM 트리에틸암모늄 탄산수소염 (TEAB), 37 °C, 16시간).
세크리톰 표본 준비: 1) 일 실시예에서, 상기 세포는 혈청이 없는 매체에서 배양될 수 있다: 조건을 겪은 매체는 냉동 건조기에 의해 농축되고, 환원되며(10mM 디티오트레이톨 (DTT), 55 °C, 1 시간), 알킬레이트화되고(25 mM 이오도 아세타마이드, 실온, 30분 간 배양), 이후 아세톤 침전에 의해 제염된다. 농축되어 조건을 겪은 매체로부터의 동일한 양의 단백질이 트립신 (1:25 w/w, 200 mM 트리에틸암모늄 탄산수소염(TEAB), 37 °C, 16시간)으로 소화될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 세포는 혈청을 포함하는 매체에서 배양될 수 있다: 매체의 부피는 3k MWCO Vivaspin 기둥(GE 헨스케어 라이프(Healthcare Life) 사이언스)을 사용하여 감소시킬 수 있고, 이후 1xPBS(인비트로젠)로서 재구성될 수 있다. 혈청 알부민은 조건 매체를 최적화하여 적용시키기 위해 버퍼-교환과 더불어 제조사의 지침에 따라 알부보이드(AlbuVoid) 기둥(Biotech Support Group, LLC)을 사용하여 모든 표본으로부터 고갈시킬 수 있다.
iTRAQ 8 Plex 라벨링 : 실험적 설정에서 각각의 트립신 소화로부터의 부분 표본은 함께 모아 제어 표본의 풀을 형성할 수 있다. 각 표본 및 제어 표본들의 풀로부터의 동등한 부분 표본들은 iTRAQ 8 Plex 반응 제제에 의해 제조사의 프로토콜(AB Sciex)에 따라 라벨링될 수 있다. 상기 반응은 결합되어, 진공으로 건조되고, 0.1% 포름산을 첨가하여 다시 현탁한 후, LC-MS/MS에 의해 분석될 수 있다.
2D- NanoLC - MS / MS : 라벨링된 모든 펩티드 혼합물들은 온라인 2D-나노 LC에 의해 분리되고 전극 분사 탠덤 질량 분광학으로 분석될 수 있다. 상기 실험은 나노 전기 분광 이온 소스를 장착한 LTQ 오비트랩 벨로스(오비트랩 벨로스(Velos)) 질량 분광계(Thermo Electron, Bremen, 독일)에 연결된 엑시겐트(Eksigent) 2D NanoLC 울트라 시스템 상에서 수행될 수 있다.
상기 펩티드 혼합물은 4 μL / min의 흐름으로 5 cm SCX 기둥(PolyLC, 콜롬비아, MD 제 300μm ID, 5μm, 폴리설포에틸 아스타르트마이드 기둥)으로 주입되어 10 이온 교환 용출 세그먼트에서 C18 트랩 기둥(메서추세츠, 워본 뉴오브젝티브(New Objective) 사의 2.5 cm, 100μm ID, 5μm, 300 A ProteoPep II)으로 녹여서 분리되고 H2O/0.1%FA로 5분 간 세척될 수 있다. 이러한 분리는 이후 15 cm 용융 실리카 기둥(메서추세츠, 워본 뉴오브젝티브 사의75μm ID, 5μm, 300 A ProteoPep II)에 대해 300 nL/min에서 2-45% B (H2O /0.1%FA (용매 A) 및 ACN /0.1%FA (용매 B))의 기울기를 사용하여 120분 간 더 수행될 수 있다.
완전 주사 MS 스펙트럼(m/z 300-2000)이 오비트랩 내에서 30,000의 해상도로 획득될 수 있다. 가장 강렬한 이온(10에 이름)이 고 에너지 C-트랩 분리(HCD)를 사용하여 연속적으로 분리될 수 있으며 30 초 간 동적으로 배제될 수 있다. HCD는 1.2 Da의 분리 폭으로 수행될 수 있다. 결과적으로 나타나는 파편 이온은 오비트랩 내에서 7500의 해상도로 주사될 수 있다. LTQ 오비트랩 벨로스(Velos)는 파운데이션 1.0.1의 엑스칼리버(Xcalibur) 2.1에 의해 제어될 수 있다.
펩티드/단백질 식별 및 정량화: 펩티드 및 단백질은 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에 대해 마스코트 탐색 엔진을 탑재한 단백질체 발견용 소프트웨어(Thermo Electron)를 사용하는 자동화된 데이터베이스 탐색에 의해 식별될 수 있다. 탐색 매개변수는 MS 허용치에 대해 10 ppm, MS2 허용치에 대해 0.02 Da, 및 2개까지의 분할 손실을 허용하는 완전한 트립신 소화를 포함할 수 있다. 카르바미도메틸화(C)가 고정된 조절로서 설정될 수 있다. 산화(M), TMT6, 및 탈아미드화(NQ)가 동적 조절로서 설정될 수 있다. 펩티드 및 단백질 식별은 마스코트 상당 임계(p<0.05)로써 필터링될 수 있다. 상기 필터는 99%의 단백질 식별 신뢰 수준(1% FDA)으로 허용될 수 있다.
단백질체 발견 소프트웨어는 보고자 이온에 대한 보정 요소를 적용할 수 있으며, 모든 정량 측정 채널이 존재하지 않는 경우에는 모든 정량 측정값을 거부할 수 있다. 상대적 단백질 정량 측정은 중간 강도의 정규화를 통해 성취할 수 있다.
제 2 유형의 데이터에 대해, 일부 예시적 실시예에서, 암 및 정상 모델의 생명 에너지론적 프로파일링은 해당 과정 및 산소 첨가 인산화 성분의 이해를 가능하도록 하기 위해 시호스(Seahorse™) XF24 분석기를 채택할 수 있다.
특히, 세포는 시호스(Seahorse) 배양 플레이트 상에서 최적의 밀도로 놓여질 수 있다. 이들 세포들은 100 μl의 매체 내에 놓여지거나 치료 후 37oC 배양기에서 5% CO2로 유지될 수 있다. 두 시간 후에, 세포가 24개 웰 플레이트에 부착되면, 추가적인 150 μl의 매체 또는 치료 용액 중 하나가 추가될 수 있으며 플레이트는 배양 인큐베이터 내에 하루 밤 동안 놓여질 수 있다. 이러한 두 단계의 뿌리는 절차는 세포들이 배양 플레이트 내에 고르게 분포될 수 있게 해 준다. 산소 및 pH를 함유하는 시호스(Seahorse) 카트리지는 CO2를 포함하지 않는 37oC의 배양기 내의 조정액 내에서 하루밤 동안 수화시킬 수 있다. 세 개의 미토콘드리아 약제가 일반적으로 카트리지의 세 포트에 적재된다. 올리고마이신, 복합체 III 금지 인자, FCCP, 공역 방지제 및 로테논, 복합체 I 금지 인자가 카트리지의 포트 A, B 및 C로 각각 적재될 수 있다. 모든 재고 약제가 버퍼링되지 않은 DMEM 매체 내에서 10x의 농도로 준비될 수 있다. 상기 카트리지는 분석 전에 먼저 CO2를 포함하지 않는 배양기 내에서 미토콘드리아의 화합물로 약 15분 간 배양될 수 있다. 배양 플레이트는 글루코스를 포함하는 DMEM 기반 버퍼링되지 않은 매체에서 정상 성장 매체에서 발견되는 농도로 세척될 수 있다. 이 세포들은 630 ul의 버퍼링되지 않은 매체로 적층될 수 있으며 사전 조정된 카트리지를 장착한 시호스(Seahorse) 기기에 놓여지기 전에 CO2를 포함하지 않는 배양기 내에서 평형의 맞추어질 수 있다. 이 기기는 포트를 통한 약제의 투입이 시작되기 전에 기반을 형성하기 위해 혼합, 대기 및 측정의 사이클로 이루어지는 세 개-네 개의 루프에서 동작할 수 있다. 다음 약제가 도입되기 전에 두 개의 루프가 있을 수 있다.
OCR(산소 소모율) 및 ECAR(세포 외 산화율)는 7 ul 챔버 내의 전극에 의해 기록될 수 있으며, 상기 해마 배양 플레이트에 밀어 넣어지는 카트리지를 사용하여 생성될 수 있다.
C. 데이터 통합 및 컴퓨터 모의 모델 생성
적합한 데이터 집합이 얻어지면, 컴퓨터로 구현된 통계적 모델의 데이터 집합 및 세대의 통합이 AI 기반 정보학 시스템 또는 플랫폼 (예를 들어, REFS™ 플랫폼)을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 예시적 AI 기반 시스템은 대사적 종단점(ECAR/OCR)의 핵심 추진 인자로서 단백질 연관의 시뮬레이션-기반 네트워크를 생성할 수 있다. 이에 대해서는 도 15를 참조한다. REFS™ 시스템에 대한 상세한 배경 설명은 징(Xing) 등의 “네트워크 앙상블 시뮬레이션을 사용한 류머티스 관절염과 관련된 유전학적 및 유전자 발현 데이터 예측 유전자의 인과적 모델링” PLoS Computational Biology, 제 7권. 제 3판, 1-19 (2011년 3월) (e100105) 및 페리왈(Periwal)의 미국 특허 제 7,512,497호에서 찾아볼 수 있으며, 각 문서의 내용은 참조로써 본 명세서에 전체적으로 통합된다. 이전에 기술된 설명에서, 상기 REFS™ 시스템은 본질적으로 입력 변수들(예를 들어, 단백질 발현 수준, mRNA 발현 수준, 및 시호스(Seahorse) 배양 플레이트 상에서 측정된 OCR / ECAR 값과 같이 이에 해당하는 기능적 데이터)들 사이의 인과 관계를 확립하기 위해 수학적 알고리즘을 채택하는 AI 기반 시스템이다. 이 과정은 어떠한 잠재적이고, 확립되고 또한/또는 증명된 생물학적 관계에 대한 기존 지식을 고려하지 않고 입력 데이터에만 기반할 수 있다.
특히, 본 발명의 플랫폼의 상당한 이점은 상기 AI 기반 시스템이 생물학적 과정과 관련된 분야에서의 기존 지식에 의존하거나 이를 고려하지 않고 세포 모델로부터 얻어진 데이터 집합에 기반한다는 것이다. 또한, 바람직하게는, 어떠한 데이터 포인트도 통계적으로 또는 인위적으로 잘려나가지 않으며, 그 대신, 획득된 모든 데이터가 단백질 연관을 결정하기 위한 AI 시스템으로 공급된다. 이에 따라, 상기 플랫폼에서 생성되어 결과로 나타나는 통계적 모델은 어떠한 알려진 생물학적 관계도 고려하지 않기 때문에 편향되지 않는다.
특히, 단백질체학 및 ECAR/OCR으로부터의 데이터가 AI 기반 정보 시스템으로 입력될 수 있으며, 상기 설명된 데이터 연관에 기반한 통계적 모델을 구축한다. 이 후, 단백질 연관의 시뮬레이션-기반 네트워크가 다음 방법을 사용하여 치료 및 조건을 포함하는 각 질병 대 정상 시나리오에 대해 도출된다.
상기 생성된(예를 들어, 최적화되거나 진화한) 네트워크의 구축을 위한 예시적 과정의 상세한 설명은 도 16과 관련한 기술 아래 나타난다. 상기 기술한 바와 같이, 단백질체 및 기능적 세포 데이터로부터의 데이터는 AI 기반 시스템으로 입력된다(단계 210). 상기 입력 데이터는 가공되지 않았거나 최소한으로 가공된 데이터일 수 있으며, 정규화(예를 들어, 가변 위치 함수 또는 내부 표준을 사용하여)를 포함할 수 있는 사전 처리 단계를 거친다(단계 212). 상기 사전 처리는 사라진 데이터 값들을 (예를 들어, K-최접근 이웃(K-NN) 알고리즘을 사용하여) 충당하는 과정을 포함할 수 있다(단계 212).
사전 처리된 데이터는 네트워크 파편 라이브러리를 구축하기 위해 사용된다(단계 214). 상기 네트워크 파편은 가능한 측정된 변수(입력 데이터)의 모든 소형 집합들(예를 들어, 2-3 원소 집합 또는 2-4 원소 집합) 사이의 정량적, 연속적 관계를 정의한다. 파편 내 변수들 사이의 관계는 선형, 로지스틱, 다항 분포형, 우성 또는 열성의 동형 접합적 등의 관계일 수 있다. 각 파편에서의 관계는 후보 관계가 얼마나 입력 데이터에 주어질 수 있는 지를 반영하고, 또한 관계에 수학적 복잡성으로 인한 벌칙을 부과하는 베이지안(Bayesian) 확률적 스코어에 지정된다. 입력 데이터로부터 추정되는 가능한 모든 쌍 및 삼각 관계(또한 일부 실시예에서 사각 관계도 가능)에 대한 스코어를 부과함으로써, 라이브러리 내의 가장 유망한 파편이 식별될 수 있다(유망한 파편). 관계의 정량적 매개변수 또한 입력 데이터를 기반으로 계산될 수 있으며 각 파편에 대해 저장될 수 있다. 파편 일람표 내의 여러 모델 유형이 사용될 수 있으며, 여기에는 선형 회귀, 로지스틱 회귀, (분산의 분석) ANOVA 모델, (공분산의 분석) ANCOVA 모델, 비선형/다항 회귀 모델 및 균등 비 매개 변수 회귀가 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 모델 매개변수에 대한 사전 가정에서 걸(Gull) 분포 또는 모델에서 사용된 매개변수의 개수에 관련된 베이지안(Bayesian) 정보 기준(BIC) 벌칙이 가정될 수 있다. 네트워크 추정 과정에서, 초기 시험 네트워크 모임 내의 각 네트워크는 파편 라이브러리 내 파편들의 부분 집합으로부터 구축된다. 초기 시험 네트워크들의 모임 내의 각 초기 시험 네트워크는 라이브러리 내 다른 파편들의 부분 집합으로부터 구된다(단계 216).
베이지안(Bayesian) 네트워크 및 네트워크 파편의 기반을 이루는 징(Xing) 외, “류머티스 관절염과 관련된 유전학적 및 유전자 발현 데이터 예측의 네트워크 앙상블 시뮬레이션을 사용한 인과적 모델링” PLoS Computational Biology, 제 7권. 제 3판, 1-19 (2011년 3월) (e100105)에 기반한 수학적 표현에 대한 개요가 이하에서 설명된다.
임의 변수
Figure 112014104946452-pct00001
를 가지는 다중 변량 시스템 많은 수의 매개변수 Θ를 포함하는 다중 변량 확률 분포 함수
Figure 112014104946452-pct00002
에 의해 특성화될 수 있다. 상기 다중 변량 확률 분포 함수는 요소로 표현되어 다음과 같은 국지적 조건 확률 분포의 곱으로 나타낼 수 있다:
Figure 112014104946452-pct00003
,
여기서, 각 변수
Figure 112014104946452-pct00004
는
Figure 112014104946452-pct00005
로 표현되는 이에 대한
Figure 112014104946452-pct00006
부모 변수가 주어졌을 때 비하강 변수와 무관하다. 요소에 의한 표현 이후, 각 국지적 확률 분포는 자신의 매개변수 Θi를 가진다.
상기 다중 변량 확률 분포 함수는 각 특정한 요소화 및 해당 매개변수가 별개의 확률적 모델인 다른 방법으로 요소화될 수 있다. 각각의 특정한 요소화(모델)는 각 변수
Figure 112014104946452-pct00007
에 대한 정점 및 국지적 조건 분포
Figure 112014104946452-pct00008
에서 변수를 사이의 의존성을 나타내는 정점들을 잇는 방향을 가지는 간선을 가지는 방향성 아크릴 그래프(Directed Acrylic Graph: DAC)로 표현할 수 있다. 각각 정점을 가지고 방향성 간선과 연관된 DAG의 하위 그래프는 네트워크 파편들이다.
모델은 주어진 입력 데이터에 대해 가장 유망한 요소화 및 가장 유망한 매개변수를 결정함으로써 진화하거나 최적화된다. 이는 “베이지안(Bayesian) 네트워크의 학습” 또는, 달리 표현하면, 입력 데이터의 훈련 집합이 주어졌을 때, 입력 데이터에 가장 잘 합치되는 네트워크를 찾는 것이라 할 수 있다. 이는 입력 데이터에 대해 각 네트워크를 평가하는 스코어링 함수를 사용하여 성취된다.
입력 데이터가 주어졌을 때 베이지안(Bayesian) 프레임워크가 요소화의 확률을 결정하기 위해 사용된다. 베이즈의 법칙에 따르면, 데이터의 확률, P(D),이 모델 전체에 걸쳐 일정하다고 가정하면, 데이터 D가 주어진 모델 가정,
Figure 112014104946452-pct00009
,에 대해 데이터의 후반 확률의 곱에 비례한다고 하면,
Figure 112014104946452-pct00010
에 모델의 사전 확률,
Figure 112014104946452-pct00011
을 곱한 값이다. 이는 다음과 같은 식으로 표현된다:
Figure 112014104946452-pct00012
.
모델을 가정하는 데이터의 후반 확률은 매개변수들의 이전 분포에 대한 데이터 확률의 적분이다:
Figure 112014104946452-pct00013
.
모든 모델들이 동일한 확률을 가진다고 가정하면(즉, P(M)가 상수인 경우), 데이터 D가 주어졌을 때, 모델 후반 확률, M,은 다음과 같이 각 네트워크 파편 Mi에 대한 매개변수에 대한 적분의 곱으로 요소화될 수 있다:
Figure 112014104946452-pct00014
.
상기 식에서 중요한 상수 항이 생략되었음을 주목해야 한다. 일부 실시예에서, 모델의 조건부 확률
Figure 112014104946452-pct00015
의 음의 로그를 취하는 베이지안(Bayesian) 정보 기준(BIC)이 다음과 같이 각 모델의 “스코어”를 정하기 위해 사용될 수 있다:
Figure 112014104946452-pct00016
,
여기서 모델 M에 대한 전체 스코어 S tot 는 각각의 국지적 네트워크 파편의 국지적 스코어 S i 의 합이다. BIC는 각 개별적 네트워크 파편의 스코어를 결정하기 위한 표현을 더 제공한다:
Figure 112014104946452-pct00017
여기서 κ(M i )은 모델 M i 내에서 합치되는 매개변수의 개수이며 N은 표본(데이터 포인트)의 개수이다. S MLE (M i )은 네트워크 파편에 대한 확률 함수의 음의 로그로서 이 함수는 각각의 네트워크 파편에 대해 사용된 기능적 관계로부터 계산될 수 있다. BIC 스코어에 대해, 스코어가 낮을 수록, 모델이 입력 데이터에 합치할 확률이 높아진다.
상기 시도 네트워크들의 모임은 전역적으로 최적화되며, 이는 네트워크의 최적화 또는 진화로 설명될 수 있다(단계 218). 예를 들어, 상기 시도 네트워크들은 메트로폴리스 몬테카를로 샘플링 알고리즘을 사용하여 진화되거나 최적화될 수 있다. 시뮬레이션된 아닐링 또한 국지적 변환을 통해 모임 내 시험 네트워크를 최적화하거나 진화시키기 위해 사용될 수 있다. 아닐링 과정을 시뮬레이션하는 예에서, 각 시험 네트워크는 라이브러리로부터 네트워크 파편을 추가하고, 시험 네트워크로부터 네트워크 파편을 제거하며, 네트워크 파편을 차감하거나 달리 네트워크 토폴로지를 변경시킴으로써 변화되며, 이 후 네트워크에 대한 새로운 스코어가 계산된다. 일반적으로 말하면, 스코어가 개선되면, 변화가 유지되고 스코어가 나빠지면 변화는 거부된다. “온도” 매개변수는 유지되는 스코어를 악화시키는 일부 국지적 변화를 허용하여, 국지적 최소값들을 피하기 위한 최적화 과정에 도움을 주게 된다. “온도” 매개변수는 최적화/진화 과정이 수렴하도록 하기 위해 시간이 지남에 따라 감소된다.
네트워크 추정 과정의 전부 또는 일부는 서로 다른 시험적 네트워크들에서 병렬로 수행될 수 있다. 각 네트워크는 별도의 프로세서 및/또는 별도의 컴퓨터 장치들에서 병렬로 최적화될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 최적화 과정은 병렬로 동작하는 수백 내지 수천 개의 프로세서가 통합된 수퍼 컴퓨터에서 수행될 수 있다. 정보는 병렬 프로세서에서 수행되는 최적화 과정들 사이에서 공유될 수 있다.
상기 최적화 과정은 전체적인 점수에 대한 임계 표준을 충족시키지 못하는 특정 네트워크를 모임으로부터 제거하는 네트워크 필터를 포함할 수 있다. 제거된 네트워크는 새로운 초기 네트워크로 교체될 수 있다. 또한 “확장성이 없는(scale free)” 특정 네트워크 또한 모임으로부터 제거될 수 있다. 네트워크들의 모임이 최적화되거나 진화한 이후에, 그 결과는 생성된 세포 모델 네트워크들의 모임으로 불릴 수 있으며, 총체적으로 생성된 합치 네트워크로 불릴 수 있다.
D . 정량적 관계 정보를 추출하고 예측하기 위한 시뮬레이션
생성된 세포 모델 네트워크에서의 각 관계에 관련된 정량적 매개변수 정보를 추출하기 위해 시뮬레이션이 사용될 수 있다(단계 220). 예를 들어, 정량적 정보 추출을 위한 시뮬레이션은 각각 10배의 노드 네트워크 내의 교란(증가하거나 감소하는)와 모델 내 다른 노드들(예를 들어, 단백질)에 대한 사후 분포의 계산을 포함할 수 있다. 종단점은 t-검사에 의해 그룹 당 100개 표본의 가정과 비교되며, 0.01은 잘라내는 것을 의미 한다. 상기 t-검사 통계는 100회의 t-검사의 중간값이다. 이러한 시뮬레이션 기술의 사용을 통해, 예측의 강도를 나타내는 AUC(곡선 아래 면적) 및 종단점을 구동하는 노드의 컴퓨터 모의 세기를 나타내는 배수 변화가 네트워크의 모임 내 각 관계에 대해 생성된다.
지역 컴퓨터 시스템의 관계 정량화 모듈이 AI 기반 시스템이 교란을 수행하도록 지도하고 AUC 정보 및 배수 정보를 추출하기 위해 채택될 수 있다. 상기 추출된 정량적 정보는 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각 간선에 대한 배수 변화 및 AUC를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 필요에 따라 구축된 R 프로그램 이 상기 정량적 정보를 추출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 생성된 세포 모델 네트워크의 모임은 시뮬레이션을 통해 조건에서의 변화에 대한 반응을 예측하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 추후에 수중 실험실 세포-기반 또는 동물-기반 실험에 의해 증명될 수 있다.
AI 기반 시스템의 출력은 정량적 관계 매개변수 및/또는 다른 시뮬레이션 예측(222)일 수 있다.
E. 분별(델타) 네트워크의 생성
분별 네트워크 생성 모듈이 생성된 세포 모델 네트워크와 생성된 비교 세포 모델 네트워크 사이의 분별(델타) 네트워크를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 일부 실시예에서, 상기 분별 네트워크는 생성된 세포 모델 네트워크 및 생성된 비교 세포 모델 네트워크 내에서의 관계의 모든 정량적 매개변수를 비교한다. 상기 분별 네트워크 내의 각 관계에 대한 정량적 매개변수는 비교에 기반한 것이다. 일부 실시예에서, 분별이 델타-델타 네트워크로 칭해지는 여러 분별 네트워크들 사이에서 수행될 수 있다. 델타-델타 네트워크의 예는 이하 예 부분에서 도 26과 관련하여 설명된다. 상기 분별 네트워크 생성 모듈은 프로그램이거나 PERL로 작성된 스크립트일 수 있다.
F. 네트워크의 시각화
네트워크 및 분별 네트워크의 모임에 대한 관계 값들은 네트워크 시각화 프로그램(예를 들어, 사이토스케이프(Cytoscape) 컨소시엄으로부터의 복잡한 네트워크 분석 및 시각화를 위한 사이토스케이프 오픈 소스 플랫폼)을 사용하여 시각화될 수 있다. 상기 네트워크의 시각적 묘사에 있어서, 각 간선(예를 들어, 단백질을 연결하는 각 선분)의 두께는 배수 변화의 강도를 나타낸다. 상기 간선들은 또한 방향적 지시 인과성일 수 있으며, 각 간선은 연관된 예측 신뢰 수준을 가진다.
G. 예시적 컴퓨터 시스템
도 17은 일부 실시예에서 AI 기반 정보학 시스템과 통신하기 위해, 분별 네트워크를 생성하기 위해, 네트워크를 시각화하기 위해, 데이터를 보관하고 저장하기 위해, 또한/또는 사용자와 상호 반응하기 위해 채택될 수 있는 예시적 컴퓨터 시스템/환경을 개략적으로 묘사한다. 상기 설명된 대로, AI 기반 정보학 시스템을 위한 계산은 상기 예시적 컴퓨터 시스템과 직접적 또는 간접적으로 반응하는 수백 또는 수천 개의 병렬 프로세서를 가지는 별도의 수퍼 컴퓨터로 수행될 수 있다. 상기 환경은 관련 주변 장치를 가진 컴퓨터 장치(100)를 포함한다. 상기 컴퓨터 장치(100) 는 본 명세서에서 밝힌 여러 방법, 또는 상기 방법의 일부를 수행하기 위한 실행 가능 코드(150)를 구현하기 위한 프로그래밍이 가능하다. 상기 컴퓨터 장치(100)는 하드 드라이브, CD-ROM, 또는 기타 비휘발성 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 저장 장치(116)를 포함한다. 상기 저장 장치(116)는 운영 체제(118) 및 기타 관련 소프트웨어를 저장한다. 상기 컴퓨터 장치(100)는 메모리(106)를 더 포함할 수 있다. 상기 메모리(106)는 컴퓨터 시스템 메모리 또는 DRAM, SRAM, EDO RAM 등과 같은 임의 접근 메모리를 포함할 수 있다. 상기 메모리(106)는 또한 다른 유형의 메모리, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터 장치(100)는 저장 장치(116) 및/또는 메모리(106) 내에 실행 가능 코드(150)의 각 부분을 구현하고 처리하기 위한 명령어를 저장할 수 있다.
상기 실행 가능 코드(150)는 상기 AI 기반 정보학 시스템(190)과 통신하기 위한 코드, 분별 네트워크(예를 들어, 분별 네트워크 생성 모듈)를 생성하기 이한 코드, 상기 AI 기반 정보학 시스템으로부터 정량적 관계 정보(예를 들어, 관계 정량화 모듈)를 추출하기 위한 코드 및 네트워크를 시각화하기 위한 코드(예를 들어, 사이토스케이프(Cytoscape))를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 컴퓨터 장치(100)는 상기 AI 기반 정보학 시스템(190)(예를 들어, REFS를 실행하기 위한 시스템)과 직접적으로 또는 간접적으로 통신할 수 있다. 예를 들어, 상기 컴퓨터 장치(100)는 데이터 파일(예를 들어, 데이터 프레임)은 상기 AI 기반 정보학 시스템(190)에 네트워크를 통해 전송함으로써 AI 기반 정보학 시스템(190)과 통신할 수 있다. 또한, 상기 컴퓨터 장치(100)는 AI 기반 정보학 시스템(190)으로의 인터페이스 및 실행 명령을 제공하는 실행 가능 코드(150)를 가질 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 컴퓨터 장치(100)는 입력 데이터 집합에 대한 데이터를 제공하는 하나 또는 그 이상의 실험적 시스템(180)과 직접적 또는 간접적으로 통신할 수 있다. 데이터를 생성하기 위한 실험적 시스템(180)은 질량 분광학 기반 단백질체학, 미세 배열 유전자 발현, qPCR 유전자 발현, 질량 분광학 기반 대사체학, 및 질량 분광학 기반 리피도믹스, SNP 미세 배열, 기능적 분석의 패널, 및 기타 체외 생물학 플랫폼 및 기술을 위한 시스템을 포함할 수 있다.
컴퓨터 장치(100)는 또한 메모리(106)에 저장된 소프트웨어 및 시스템 하드웨어 제어를 위한 다른 프로그램을 실행하기 위한 프로세서(102)를 포함하며, 하나 또는 그 이상의 추가적인 프로세서(들)(102)를 포함할 수 있다. 상기 프로세서(102) 및 상기 프로세서(들)(102) 각각은 단일 코어 프로세서 또는 다중 코어(104 및 104) 프로세서일 수 있다. 컴퓨터 장치(100)에서 가상화를 채용하여 컴퓨터 장치 내의 기반 구조 및 자원을 동적으로 공유하도록 할 수 있다. 가상화된 프로세서는 저장 장치(116)에 저장된 실행 가능 코드(150) 및 다른 소프트웨어와 함께 사용될 수 있다. 가상화 기계(114)는 상기 프로세스가 다중이 아닌 단일 컴퓨터 자원만을 사용하는 것처럼 보이도록 다중 프로세서에서 동작하는 프로세스를 다루기 위해 제공될 수 있다. 다중 가상 기계는 하나의 프로세서에서도 사용할 수 있다.
사용자는 사용자 인터페이스(124) 또는 기타 인터페이스를 보여 줄 수 있는 컴퓨터 모니터와 같은 시각적 디스플레이 장치(122)를 통해 컴퓨터 장치(100)와 통신할 수 있다. 상기 디스플레이 장치(122)의 사용자 인터페이스(124)는 가공되지 않은 데이터, 네트워크의 시각적 표현 등을 보여줄 수 있다. 상기 디스플레이 장치(122)는 또한 예시적 실시예(예를 들어, 저장 장치(116)에 대한 아이콘)의 다른 측면 또는 요소들을 보여 줄 수 있다. 상기 컴퓨터 장치(100)는 키보드 또는 다중 포인트 터치 인터페이스(108) (예를 들어, 터치 스크린) 및 포인팅 장치(110) (예를 들어, 마우스, 트랙볼 및/또는 트랙 패드)와 같이 사용자로부터 입력을 받기 위한 I/O 장치를 포함할 수 있다. 상기 키보드(108) 및 상기 포인팅 장치(110) 는 시각적 디스플레이 장치(122) 및/또는 상기 컴퓨터 장치(100)에 유선 및/또는 무선 연결로 연결될 수 있다.
상기 컴퓨터 장치(100)는 네트워크 장치(126)와 상호 작용할 수 있는 근거리 통신망(LAN), 원거리 통신망(WAN) 또는 표준 전화선, LAN 또는 WAN 연결(예를 들어, 802.11, T1, T3, 56kb, X.25), 광대역 연결(예를 들어, ISDN, 프레임 릴레이, ATM), 무선 연결, 제어기 영역 네트워크(CAN), 또는 상기의 일부 또는 모든 조합을 포함하나 이에 한정되지는 않는 다양한 연결을 통한 인터넷 네트워크 인터페이스(112)를 포함할 수 있다. 상기 네트워크 인터페이스(112)는 내장 네트워크 어댑터, 네트워크 인터페이스 카드, PCMCIA 네트워크 카드, 카드 버스 네트워크 어댑터, 무선 네트워크 어댑터, USB 네트워크 어댑터, 모뎀 또는 컴퓨터 장치(100)가 어떠한 유형의 네트워크와도 통신할 수 있게 하며 본 명세서에서 기술된 동작을 수행할 수 있도록 해주기에 적절한 기타 장치를 포함할 수 있다.
또한, 상기 컴퓨터 장치(100)는 워크스테이션, 데스크탑 컴퓨터, 서버, 노트북, 핸드헬드 컴퓨터 또는 통신이 가능하며 본 명세서에서 기술된 동작을 수행하기에 충분한 프로세서 파워와 메모리 용량을 가지는 다른 형태의 연산 또는 전기 통신 장치와 같은 컴퓨터 시스템일 수 있다.
상기 컴퓨터 장치(100)는 마이크로소프트의 모든 버전의 윈도우즈 운영 체제, 서로 다른 판의 유닉스 및 리눅스 운영 체제, 매킨토시 컴퓨터를 위한 모든 버전의 맥 오에스, 모든 임베디드 운영 체제, 모든 실시간 운영 체제, 모든 오픈 소스 운영 체제, 모든 사적으로 보유한 운영 체제, 모바일 컴퓨터 장치를 위한 모든 운영 체제, 또는 상기 컴퓨터 장치에서 구동되며 본 명세서에서 기술된 동작을 수행하는 기타 다른 운영 체제 등의 어떠한 운영 체제(118)에서도 구동할 수 있다. 상기 운영 체제는 네이티브 모드 또는 에뮬레이션 모드에서 동작할 수 있다.
IV . 생물학적 시스템에 대한 모델 및 그 사용
A. 생물학적 시스템을 위한 모델 수립
모든 생물학적 시스템 또는 과정은 시각적으로 서로 다른 세포 유형 및/또는 기관 시스템들 사이의 복잡한 상호 반응을 포함한다. 한 세포 유형 또는 기관에서의 핵심 기능의 교란은 다른 상호 반응 세포 유형 및 기관에 대한 이차 효과로 이어질 수 있으며, 이러한 하방 흐름의 변화는 다시 초기 변화로 피드백되어 더 복잡한 상황을 야기할 수 있다. 따라서, 생물학적 시스템 또는 과정에 대한 보다 완전하고 전역적인 시각을 가지기 위해서는 주어진 생물학적 시스템 또는 과정을 세포 유형 또는 기관의 쌍 사이의 상호 반응과 같은 구성 요소로 분할하여 이들 구성 요소 사이의 상호 반응을 체계적으로 탐구하는 것이 도움이 된다.
이에 따라, 본 발명은 생물학적 시스템에 대한 세포 모델을 제공한다. 이러한 목적을 위해, 출원인들은 본 발명의 발견 플랫폼 기술에서 채택된 다양한 예시적 생물학적 시스템에 대한 세포 모델을 구축하였다. 출원인들은 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 포함하는 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 본 발명의 발견 플랫폼 기술을 사용하여 세포 모델에 대한 실험을 수행하였으며, 이에 의해 특정한 생물학적 시스템 또는 과정에 대해 중요한 “조절 인자” 또는 핵심 분자의 “추진 인자”를 식별하였다.
본 발명의 플랫폼 기술 및 그 구성 요소의 의미있는 이점 중 하나는, 예를 들어, 세포 모델로부터 획득한 상기 필요에 따라 구축된 세포 모델 및 데이터 집합에서, 생물학적 시스템 또는 과정에 대해 생성된 초기의 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크가, 예를 들어, 추가적인 세포 라인/유형 및/또는 추가적인 조건의 도입에 의해 시간이 지남에 따라 지속적으로 진화 또는 확장할 수 있다는 것이다. 진화한 세포로부터의 추가적인 데이터, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 확장되거나 진화된 세포 모델, 즉, 세포 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터 수집된 이러한 새로운 데이터는 보다 견고한 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 다시 이전에 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 생성된 데이터 집합에 도입될 수 있다. 생물학적 시스템에 고유한 새로운 인과 관계는 이 후 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크로부터 식별될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 모델의 진화가 합치 인과 관계 네트워크의 진화를 제공하며, 이에 의해 생물학적 시스템의 조절 인자로의 새로운 통찰 및/또는 보다 신뢰성 있는 통찰을 제공한다. 이러한 방식으로, 세포 모델로부터의 데이터 집합과 본 플랫폼 기술 방법을 사용하여 세포 모델로부터 생성된 인과 관계 네트워크의 양 세포 모델 모두가 지속적으로 진화하여 상기 플랫폼 기술로부터 획득한 이전의 지식을 확대해 나갈 수 있게 된다.
이에 따라, 본 발명은 본 플랫폼 기술에서 채택된 세포 모델로부터 생성된 합치 인과 관계 네트워크를 제공한다. 이들 합치 인과 관계 네트워크는 제 1 세대의 합치 인과 관계 네트워크, 또는 다중 세대의 합치 인과 관계 네트워크, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20번째 또는 이를 초과하는 세대의 합치 인과 관계 네트워크일 수 있다. 또한, 본 발명은 본 플랫폼 기술에서 채택된 세포 모델로부터 생성된 합치된 모의 인과 관계 네트워크를 제공한다. 이들 합치된 모의 인과 관계 네트워크는 제 1 세대의 합치된 모의 인과 관계 네트워크, 또는 다중 세대의 합치된 모의 인과 관계 네트워크, 예를 들어, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째, 일곱 번째, 여덟 번째, 아홉 번째, 열 번째, 열한 번째, 열두 번째, 열세 번째, 열네 번째, 열다섯 번째, 열여섯 번째, 열일곱 번째, 열여덟 번째, 열아홉 번째, 스무 번째 또는 이를 초과하는 모의된 세대의 합치 인과 관계 네트워크들일 수 있다. 본 발명은 본 발명의 합치 인과 관계 네트워크로부터 생성된 델타 네트워크 및 델타-델타 네트워크를 더 제공한다.
생물학적 시스템 또는 과정에 대한 필요에 따라 구축된 세포 모델은 생물학적 시스템과 관련된 하나 또는 그 이상의 세포를 포함한다. 생물학적 시스템/과정에 대한 상기 모델은 생물학적 시스템 또는 과정의 특징적 측면을 모방하는 조건(예를 들어, 세포 배양 조건)을 생성함으로써 생물학적 시스템의 환경, 예를 들어, 암 세포의 생체 내 환경을 모의하기 위해 수립될 수 있다.
동일하거나 다른 근원의 다중 세포들은, 단일 세포 유형과는 반대로, 상기 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 그 이상의 서로 다른 세포 라인 또는 세포 유형들이 세포 모델에 포함된다. 일 실시예에서, 상기 세포는 모두 동일한 유형, 예를 들어, 모두 유방암 세포 또는 식물 세포이거나, 서로 달리 수립된 세포 라인, 예를 들어, 서로 달리 수립된 유방암 세포 또는 식물 세포의 세포 라인일 수 있다. 앞의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 세포 라인 또는 세포 유형일 수 있다.
본 발명의 세포 모델에 포함될 수 있는 세포 유형에는 인간 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 효모, 박테리아, 또는 균류가 포함되나 이로 한정되지는 않는다. 일 실시예에서, 본 세포 모델의 세포는 암 세포 또는 박테리아에 의해 또는 바이러스에 의해 감염된 세포, 질병에 걸린 세포를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 본 세포 모델의 세포는 당뇨, 비만 또는 심장병 상태에 관련된 세포와 같은 질병과 연관된 세포, 예를 들어, 대동맥의 평활근 세포 또는 간 세포를 포함할 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자라면 예를 들어, 질병 상태/과정과 같은 특정한 생물학적 상태/과정에 포함되거나 관련된 이들 세포들, 및 이러한 모든 세포들이 본 발명의 세포 모델에 포함된다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
본 발명의 세포 모델은 하나 또는 그 이상의 “제어 세포”를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제어 세포는 처리되지 않거나 교란되지 않은 세포일 수 있다. 또 다른 실시예에서, “제어 세포”는 정상 세포, 예를 들어, 질병에 걸리지 않은 세포일 수 있다. 일 실시예에서, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 서로 다른 제어 세포들이 상기 세포 모델에 포함된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 제어 세포 라인 또는 제어 세포 유형일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 제어 세포는 모두 같은 유형이지만 해당 세포 유형의 다르게 확립된 세포 라인일 수 있다. 일 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 정상, 예를 들어, 질병에 걸리지 않은 세포 라인이, 제어로서, 생물학적 상태 또는 과정에 고유한 단백질 또는 경로를 식별하기 위해 유사한 조건에서 배양되고, 또한/또는 세포 모델의 주된 세포로서 동일한 교란에 노출된다.
본 발명의 필요에 따라 제작된 세포 모델은 또한 생물학적 상태 또는 과정의 특징적 측면을 모방하는 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종양 환경 생체 내의 암 세포의 조건, 또는 심장병을 앓는 환자의 대동맥의 평활근 세포의 조건을 매우 가깝게 근사하는 세포 배양 조건이 선택될 수 있다. 일부 경우에, 상기 조건은 스트레스 조건이다. 여러 조건 / 스트레스 인자가 본 발명의 세포 모델에서 채택될 수 있다. 일 실시예에서, 이들 스트레스 인자 / 조건들은 세포 시스템에 대한 “교란”, 예를 들어, 외부 자극을 구성할 수 있다. 한 예시적 스트레스 조건은 저산소 상태로서, 이는, 예를 들어, 고형 종양 내에서 일반적으로 발견되는 조건이다. 저산소 상태는 해당 분야에서 알려진 방법들을 사용하여 유도할 수 있다. 예를 들어, 저산소 상태는 세포 시스템을 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업용 기체로 흘러 넘치게 할 수 있는 모듈라 배양기 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA) 내에 위치시킴으로써 유도할 수 있다. 그 효과는 저산소 상태 치료 이후 소정의시간, 예를 들어, 24 시간 후에 추가적인 외부 자극 성분들(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 비존재 하에서 측정될 수 있다. 마찬가지로, 젖산 치료는 해당 과정 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 젖산 유도 스트레스는 약 12.5 mM의 최종 젖산 농도에서 소정의 시간, 예를 들어, 24시간에서, 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 부재 하에서 조사될 수 있다. 고혈당증은 암뿐만 아니라 당뇨에서도 발견되는 조건이다. 대상 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있는 전형적인 고혈당 조건은 매체 내 글루코스의 최종 농도를 약 22 mM로 하기 위해 적절한 매체에 첨가된 10% 배양 등급 글루코스를 포함한다. 고지혈증은, 예를 들어, 비만 및 심장병에서 발견되는 조건이다. 고지질증 조건은 세포를 0.15 mM 나트륨 팔미테이트를 포함하는 매체에서 배양함으로써 제공될 수 있다. 고인슐린증은, 예를 들어, 당뇨에서 발견되는 조건이다. 고인슐린증 조건은 세포를 1000 nM 인슐린을 포함하는 매체에서 배양함으로써 유도될 수 있다.
개별적 조건들이 본 발명의 필요에 따라 구축된 세포 모델에서 별개로 조사되거나 함께 조사되거나 두 조사를 병행할 수 있다. 일 실시예에서, 생물학적 시스템의 서로 다른 특성적 측면을 반영하거나 시뮬레이션하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 세포 모델에서 조사되었다. 일 실시예에서, 개별적 조건 및, 추가적으로 생물학적 시스템의 서로 다른 특성적 측면을 반영하거나 시뮬레이션하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 세포 모델에서 조사되었다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이, 또는 10과 50 사이의 서로 다른 조건일 수 있다.
일단 필요에 따라 구축된 세포 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 환자에서 환자로의 유전학적 변이, 또는 특정 약제 또는 사전 약제에 의한 치료 또는 비치료와 같은 “교란”이 상기 시스템에 적용될 수 있다. 도 15D를 참조한다. 이러한 교란이 세포 모델 시스템에 미치는 영향은 해당 분야에서 인식되거나 특정적으로 수행되는 여러 수단을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 수단들은 아래 제 III.B절에서 설명된다.
상기 필요에 따라 구축된 세포 모델은 예를 들어, “환경적 교란” 또는 “외부 자극 성분”과 같은 교란에 노출될 수 있다. 이러한 “환경적 교란” 또는 “외부 자극 성분”은 세포 환경에 내생적(예를 들어, 세포 환경이 일정 수준의 자극제를 포함하고 수준을 증가시키기 위해 그 이상의 자극제가 추가됨)이거나, 세포 환경에 외생적(예를 들어, 자극제/교란이 변이 이전의 세포 환경에 전반적으로 존재하지 않음)일 수 있다. 상기 세포 환경은 환경적 교란 또는 외부 자극 성분의 추가의 결과로 나타나는 이차적 변화에 의해 더 변경될 수 있으며, 이는 외부 자극 성분이 세포 시스템에 의해 세포 환경으로 분비된 분자를 포함하여 세포 시스템의 세포의 출력을 변화시킬 수 있기 때문이다. 상기 환경적 교란 또는 외부 자극 성분은 세포 기능에 영향을 미칠 수 있는 어떠한 외부 물리적 및/또는 화학적 자극을 포함할 수 있다. 이는 자연적이거나 합성된 화학 물질인 어떠한 크거나 작은 기관 또는 기관 내 분자의, 온도 변화, pH 변화, 복사, 빛(UVA, UVB 등), 마이크로웨이브, 초음파, 전기 전류, 조절되거나 조절되지 않는 자기장 등을 포함할 수 있다. 상기 환경적 교란 또는 외부 자극 성분은 또한 유전학적 수정 / 변이를 야기하는 도입된 유전학적 수정 또는 변이 또는 매개 수단(예를 들어, 벡터)을 포함할 수 있다.
(i) 상호 대화 세포 시스템
둘 또는 그 이상의 세포 시스템들 간의 상호 반응이 조사되는 것이 바람직한 특정한 상황에서, “상호 대화 세포 시스템”이, 예를 들어, 제 1 세포 시스템의 수정된 세포 환경을 제 2 세포 시스템에 접촉도록 하여 제 2 세포 시스템의 세포 출력에 영향을 줌으로써 형성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, “상호 대화 세포 시스템”은 둘 또는 그 이상의 세포 시스템을 포함하며, 제 2 세포 시스템 내의 최소한 하나의 세포의 출력이 변화되거나 영향을 받도록 이 시스템 내에서 상기 최소한 하나의 세포 시스템의 세포 환경이 이차 세포 시스템과 접촉하게 된다. 특정 실시예에서, 상기 상호 대화 세포 시스템 내의 세포 시스템은 직접 접촉할 수 있다. 다른 실시예에서, 어떠한 세포 시스템도 서로 직접적으로 접촉하지 않는다.
예를 들어, 특정 실시예에서, 상기 상호 대화 세포 시스템은 제 1 세포 시스템이 삽입체 내에서 성장하고 제 2 세포 시스템이 해당 웰 구획에서 성장하는 트랜스웰의 형태일 수 있다. 상기 2-세포 시스템은 동일하거나 서로 다른 매체에 접촉시킬 수 있으며, 매체 성분의 일부 또는 전부를 교환할 수 있다. 한 세포 시스템에 추가된 외부 자극 성분은 한 세포 시스템에 의해 실질적으로 흡수될 수 있고, 또한/또는 다른 세포 시스템에 분산될 기회를 가지기 이전에 저하될 수 있다. 대체적 방법으로, 상기 외부 자극 성분은 결과적으로 상기 2 세포 시스템의 평형에 접근해 가거나 이에 도달할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 상호 대화 세포 시스템은 각 세포 시스템이 자신의 매체 및/또는 배양 조건(온도, CO2 내용물, pH 등)을 가지거나, 유사하거나 동일한 배양 조건을 가지는 별도로 배양된 세포 시스템의 형태를 채택할 수 있다. 상기 2-세포 시스템은, 예를 들어, 조건을 겪은 매체를 한 세포 시스템에서 취하여 다른 세포 시스템과 접촉케 함으로써 서로 접촉할 수 있다. 2-세포 시스템 사이의 직접적인 세포-세포 간 접촉 또한 필요한 경우 수행될 수 있다. 예를 들어, 2-세포 시스템의 세포들은 필요한 경우 어떠한 포인트에서 공생 배양될 수 있고, 상기 공생 배양된 세포 시스템은 이후 최소한 하나의 세포 시스템 내의 세포가 정렬 가능한 표지 인자 또는 라벨(예를 들어 안정되게 발현된 형광 표지 인자 단백질 GFP)을 가지게 될 때, 예를 들어, FACS 정렬에 의해 분리될 수 있다.
마찬가지로, 특정 실시예에서, 상기 상호 대화 세포 시스템은 단순한 공생 배양일 수 있다. 상기 공생 배양 내의 처리된 세포를 다른 세포 시스템의 세포와 배양시키기 전에, 하나의 세포 시스템 내에서의 세포의 선택적 치료가 먼저 해당 세포 시스템 내의 세포를 처리함으로써 실시될 수 있다. 상기 공생 배양 상호 대화 세포 시스템 설정은, 예를 들어, 외부 자극 성분에 의한 제 1 세포 시스템의 자극 이후에 제 1 세포 시스템에서의 세포 표면 변화에 의해 야기된 2차 세포 시스템에 대한 영향을 연구하는 것이 바람직한 경우에 도움이 될 수 있다.
본 발명의 상호 대화 세포 시스템은 특정한 소정의 외부 자극 성분의 하나 또는 양 세포 시스템의 세포의 출력에 대한 영향을 탐구하기에 특히 적절하다. 이러한 자극이 (자극이 직접적으로 접촉되는) 제 1 세포 시스템에 미치는 일차적 영향은 제 1 세포 시스템이 상기 외부 자극과 접촉하기 이전과 이후의 세포의 출력(예를 들어, 단백질 발현 수준)을 비교함으로써 결정될 수 있으며, 이는, 본 명세서에서 사용되는 표현에서는, “(상당한) 세포의 출력 분별”로 불릴 수 있다. 이러한 자극이 제 2 세포 시스템에 미치는 부차적 효과는 (이의 세크리톰과 같은)제 1 세포 시스템의 수정된 세포 환경을 통한 중재이며, 이 또한 마찬가지로 측정될 수 있다. 이때, 예를 들어, 제 2 세포 시스템의 단백질체와의 비교가 제 1 세포 시스템에 대한 외부 자극 치료가 행해진 제 2 세포 시스템의 단백질체 및 제 1 세포 시스템에 대한 외부 자극 치료가 행하여 지지 않은 제 2 세포 시스템의 단백질체 사이에서 수행될 수 있다. (단백질체 또는 관심 대상인 다른 세포의 출력에서) 상당한 변화가 관찰되는 경우 이는 “상당한 세포 간 상호 대화 분별”로 불릴 수 있다.
(단백질 발현과 같은) 세포의 출력 측정을 수행함에 있어서, 절대적 발현량 또는 상대적 발현 수준이 사용될 수 있다. 예를 들어, 제 2 세포 시스템의 상대적 단백질 발현 수준을 결정하기 위해, 제 1 세포 시스템에 대한 외부 자극이 존재하거나 존재하지 않는 제 2 세포 시스템 내의 주어진 단백질의 양이 세포 라인의 적절한 제어 세포 라인 및 혼합물 및 주어진 배수 증가 또는 배수 감소값과 비교될 수 있다. 이러한 배수 증가(예를 들어, 최소한 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100 또는 그 이상의 배수 증가) 또는 배수 감소(예를 들어, 최소한 0.95, 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.6, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1 또는 0.05 배수, 또는 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 또는 그 이하로의 감소)에 대한 소정의 임계 수준이 상당한 세포 간 상호 대화 분별을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 상기 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위, 예를 들어, 1.5와 5 배 사이, 2와 10배 사이, 1과 2배 사이, 또는 0.9와 0.7배 사이의 상한 또는 하한일 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 목록으로 제시된 모든 값들, 예를 들어, 위에서 기술된 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있다.
이를 예시하기 위해, 심장병 모델의 측면을 모방하기 위해 수립된 한 예시적인 2-세포 시스템에서, 심장 평활근 세포 라인(제 1 세포 시스템)이 저산소 상태 조건 (외부 자극 성분)에 의해 처리되고, 신장 세포를 심장 평활근의 조건을 겪은 매체에 접촉시킨 결과로 발생하는 신장 세포 라인(제 2 세포 시스템)에서의 단백질체 변화가 통상의 정량적 질량 분광학에 의해 측정될 수 있다. 이들 신장 세포에서의 상당한 세포 간 상호 대화 분별이 적절한 제어(예를 들어, 저산소 상태 조건으로 처리되지 않은 마찬가지로 배양된 심장 평활근 세포의 조건을 겪은 매체와 접촉한 마찬가지로 배양된 신장 세포)와의 비교를 기반으로 결정될 수 있다.
관찰된 모든 상당한 세포 간 상호 대화 분별이 생물학적 의미를 가지지 않을 수 있다. 대상의 조사적 생물학적 평가가 적용된 주어진 생물학적 시스템에 대해, 일부(또는 모두일 수 있음)의 상당한 세포 간 상호 대화 분별은 문제가 되는 특정한 생물학적 문제에 대해 “결정론적”일 수 있다, 예를 들어, 질병 조건(치료적 시술을 위한 잠재적 타겟)을 야기하는 것에 책임이 있거나 질병 조건(잠재적 진단적 또는 예후의 요소)에 대한 생물학적 표지 인자이다.
이러한 결정론적 상호 대화 분별은 해당 방법의 최종 사용자에 의해 선택되거나, DAVID-활성 비교 경로 분석 프로그램, 또는 KEGG 경로 분석 프로그램과 같은 생물정보학 소프트웨어 프로그램에 의해 선택될 수 있다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램이 사용되며, 둘 또는 그 이상의 생물정보학 소프트웨어 프로그램으로부터의 합치된 결과를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 세포의 출력의 “분별”은 세포의 출력의 하나 또는 그 이상의 매개변수들에서의 차이(예를 들어, 증가되거나 감소된 수준)를 포함한다. 예를 들어, 단백질 발현 수준에 대해, 외부 자극 성분에 의한 치료 이전 및 이후의 세포 시스템과 연관된 출력과 같은 두 세포의 출력사이의 분별이 질량 분광학 기반 분석(예를 들어, iTRAQ, 2D-LC-MSMS 등)과 같이 해당 분야에서 알려진 기술을 사용하여 측정되고 정량화될 수 있다.
(ii) 암 특정 모델
생물학적 시스템 또는 과정의 한 예는 암이다. 다른 복잡한 생물학적 과정 또는 시스템과 마찬가지로, 암은 다양한 여러 측면에 의해 특징지워지는 복잡한 병리학적 조건이다. 예를 들어, 그 높은 성장률로 인해, 많은 암 세포들이 저산소 상태 조건에서 성장하도록 적응되며, 상향 조절된 해당 과정 및 감소된 산소 첨가 인산화 대사 경로를 가진다. 결과적으로, 암 세포는 잠재적 약제에 의한 치료와 같은 환경적 교란에 대해, 동일한 치료에 대한 정상 세포의 반응과 비교하여, 다르게 반응할 수 있다. 따라서, 정상 세포의 반응과 비교하여 암의 약제 치료에 대한 고유한 반응을 판독하는 것이 관심사일 수 있다. 이러한 목적으로, 적절한 암 세포 라인을 선택하고 질병 상태 또는 과정의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건을 창출함으로써, 필요에 따라 제작된 암 모델이 암 세포의 환경, 예를 들어, 종양 생체 내 환경을 모의하기 위해 수립될 수 있다. 예를 들어, 세포의 조건을 매우 가깝게 근사하거나, 종양 생체 내 암 성장의 여러 측면을 모방하는 세포 배양 조건이 암 세포의 서로 다른 성장 조건을 분리함으로써 선택될 수 있다.
단일 암 세포 유형과 반대로 동일하거나 서로 다른 근원을 가지는 다중 암 세포(예를 들어, 암 라인 PaCa2, HepG2, PC3 및 MCF7)이 상기 암 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 다른 암 세포 라인 또는 암 세포 유형이 상기 암 모델에 포함된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 암 세포 라인 또는 세포 유형일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 암 세포들은 모두 동일한 유형, 예를 들어, 모두 유방암 세포이지만, 세포 라인들은 예를 들어, 다르게 수립된 유방암의 세포 라인과 같이, 다르게 수립된 암세포 라인이다.
상기 암 모델에 포함될 수 있는 암 세포 유형의 예는 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 비늘형의 세포암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 자궁 내막암, 방광 암, 신장 암, 고형 종양, 백혈병, 비 호지킨(non-Hodgkin) 림프종을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 일 실시예에서, 약제 저항 암 세포가 상기 암 모델에 포함될 수 있다. 암 모델에 포함될 수 있는 세포 라인의 특정 예는 PaCa2, HepG2, PC3 및 MCF7 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 다수의 암 세포 라인들이 해당 분야에서 알려져 있으며, 이러한 암 세포 라인이 본 발명의 암 모델에 포함될 수 있다.
본 발명의 세포 모델은 하나 또는 그 이상의 “제어 세포”를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제어 세포는 처리되지 않거나 또는 교란되지 않은 암 세포이다. 또 다른 실시예에서, “제어 세포”는 정상의, 암에 걸리지 않은 세포일 수 있다. 다수의 정상의, 암에 걸리지 않은 세포 라인 중 어느 하나가 상기 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 정상 세포는 하나 또는 그 이상의 THLE2 및 HDFa 세포이다. 일 실시예에서, 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 서로 다른 정상 세포 유형이 상기 암 모델에 포함된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 정상 세포 라인 또는 세포 유형일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 정상 세포는 모두 동일한 유형, 예를 들어, 모두 건강한 상피의 또는 유방 세포이거나, 다르게 수립된 세포 라인, 예를 들어, 다르게 수립된 상피의 또는 유방 세포의 세포 라인일 수 있다. 일 실시예에서, 제어로서, 하나 또는 그 이상의 정상적인 비 암 세포 라인(예를 들어, THLE2 및 HDFa)들이 암에 고유한 단백질 또는 경로를 식별하기 위해 비슷한 조건 하에서 배양될 수 있고, 또한/또는 세포 모델의 암 세포와 동일한 교란에 노출될 수 있다.
필요에 따라 구축된 암 모델은 또한 암적 상태 또는 과정의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 암 세포의 서로 다른 성장 조건들을 분리해 냄으로써 세포 배양 조건을 종양 환경 생체 내 암 세포의 조건을 매우 가깝게 근사하거나, 암 성장의 여러 측면을 모방하도록 선택할 수 있다. 일부 경우에 상기 세포 배양 조건은 스트레스 조건일 수 있다.
이러한 암 “환경”, 또는 스트레스 조건 중 하나는 저산소 상태로서, 고형 종양에서 일반적으로 발견되는 조건이다. 저산소 상태는 세포 내에서 해당 분야에 알려진 방법을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 저산소 상태는 세포 시스템을 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 포함하는 산업용 기체로 흘러 넘치게 할 수 있는 모듈라 배양기 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)내에 위치시킴으로써 유도될 수 있다. 효과는 소정의 시간 이후, 예를 들어, 저산소 상태 치료 후 24시간 이후에, 추가적인 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 부존재 하에서 측정될 수 있다.
마찬가지로, 세포의 젖산 치료는 종양 환경 생체 내에 존재하는 높은 활성의 해당 과정을 가지는 세포 환경을 모방한다. 젖산 유도 스트레스는 약 12.5 mM의 최종 젖산 농도에서 소정의 시간, 예를 들어, 24시간에 추가적인 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 부존재 하에서 검사될 수 있다.
고혈당증은 보통 당뇨에서 발견되는 조건이다; 그러나, 많은 암 세포들이 자신들의 주요 에너지 원으로서 글루코스에 의존하기 때문에 고혈당증은 또한 어느 정도 암 성장의 한 측면을 모방한다. 대상 세포를 일반적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은 매체 내 글루코스의 최종 농도가 약 22 mM가 되도록 10% 배양 등급 글루코스를 적절한 매체에 추가하는 것을 포함할 수 있다.
암 성장의 다른 측면을 반영하는 개별적 조건들이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 별도로 조사되고, 또한/또는 함께 조합되어 조사될 수 있다. 일 실시예에서, 서로 다른 측면의 암 성장 / 조건을 반영하거나 모의하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 서로 다른 측면의 암 성장 / 조건을 반영하거나 모의하는 개별적 조건들 및, 이에 추가하여, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 암 모델에서 조사된다. 앞의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이, 또는 10와 50 사이의 서로 다른 조건일 수 있다.
일단 필요에 따라 구축된 세포 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 환자에서 환자로의 유전학적 변이, 또는 특정 약제 또는 사전 약제에 의한 치료 또는 비치료와 같은 “교란” 이 상기 시스템에 적용될 수 있다. 도 15D를 참조한다. 이러한 교란이 세포 모델 시스템에 미치는 영향은 해당 분야에서 인식되거나 특정적으로 수행되는 여러 수단을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 수단들은 아래 제 III.B절에서 설명된다.
예시적 실험에서, 환경적 교란, 특히 코엔자임 Q10에 의한 치료가 존재하거나 존재하지 않는 상황에서, 암 라인 PaCa2, HepG2, PC3과 MCF7, 및 정상 세포 라인 THLE2과 HDFa는 각 고혈당증, 저산소 상태, 및 젖산 풍부 조건 및, 세 조건 중 둘 또는 셋의 조합의 조건을 겪게 된다. 본 명세서의 이하에서는 교란, 코엔자임 Q10 치료가 존재하거나 존재하지 않는 상황에서의 이러한 조건들의 예시적 조합이 열거되며, 이들은 암 세포 모델의 암 세포 및/또는 제어(예를 들어, 정상) 세포를 치료하는데 사용될 수 있다. 수행되는 특정한 조사적 생물학적 평가에 따라 다른 조합이 쉽게 형성될 수 있다.
1. 매체만 존재
2. 50 μM CTL 코엔자임 Q10
3. 100 μM CTL 코엔자임 Q10
4. 12.5 mM 젖산
5. 12.5 mM 젖산 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
6. 12.5 mM 젖산 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
7. 저산소 상태
8. 저산소 상태 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
9. 저산소 상태 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
10. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산
11. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
12. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
13. 매체 + 22 mM 글루코스
14. 50 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22 mM 글루코스
15. 100 μM CTL 코엔자임 Q10 + 22 mM 글루코스
16. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스
17. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
18. 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10
19. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스
20. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
21. 저산소 상태 + 22 mM 글루코스 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
22. 저산소 상태 +12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스
23. 저산소 상태 +12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
24. 저산소 상태 + 12.5 mM 젖산 + 22 mM 글루코스 +100 μM CTL 코엔자임 Q10
특정한 상황에서, 서로 다른 암 세포들(예를 들어, HepG2 및 PaCa2) 사이의 상호 대화 또는 ECS 실험은 다양한 상호 연관된 목적을 위해 수행될 수 있다. 상호 대화를 포함하는 일부 실시예에서, 세포 모델에 대해 수행된 실험들은 특정 세포 시스템 또는 군집(예를 들어, 간암종 세포 HepG2)의 세포의 상태 또는 기능에 대한 정의된 치료 조건(예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태(국소 빈혈)) 하의 또 다른 세포 시스템 또는 군집 (예를 들어, 췌장 관련 암 PaCa2)에 의한 조절을 결정하도록 설계되었다. 일반적인 설정에 따르면, 제 1 세포 시스템 / 군집은 후보 분자 (예를 들어, 소형 약 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예를 들어, 저산소 상태, 고 글루코스 환경)과 같은 외부 자극 성분과 접촉된다. 반응에서, 제 1 세포 시스템 / 군집은그 전사체, 단백질체, 대사체, 및/또는 상호작용체를 변화시키며, 세포의 내부와 외부 모두에서 쉽게 탐지될 수 있는 변화에 이르게 된다. 예를 들어, 전사체에서의 변화는 다수의 타겟 mRNAs의 전사 수준에 의해 측정될 수 있고, 단백질체에서의 변화 다수의 타겟 단백질들의 발현 수준에 의해 측정될 수 있으며, 대사체에서의 변화는 특히 주어진 대사 물질에 대해 설계된 분석에 의해 다수의 타겟 대사 물질의 수준에 의해 측정될 수 있다. 대체적 방법으로, 대사체 및/또는 단백질체에서 최소한 특정한 분비 대사 물질 또는 단백질에 대한 위의 기준적 변화 또한 전사체, 단백질체, 대사체, 및 제 2 세포 시스템 / 군집의 상호 작용체의 조절을 포함하여 이들이 제 2 세포 시스템 / 군집에 미치는 영향에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 상기 실험은 제 1 세포 시스템 / 군집에 의해 분비된 관심 있는 분자(들)가 서로 다른 치료 조건 하의 제 2 세포 시스템 / 군집에 미치는 영향을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 실험은 또한 제 1 세포 시스템(외부 자극 성분 치료에 대한 반응으로)으로부터 또 다른 세포 시스템으로의, 예를 들어, 단백질체학의 분별 선별에 의한 신호 전달의 결과로 조절되는 어느 하나의 단백질을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 실험적 설정이 반대의 설정에 적응되어, 두 세포 시스템 사이의 상호 효과 또한 분석되도록 할 수도 있다. 이러한 유형의 실험에 있어서, 일반적으로 세포 라인의 쌍은 근원, 질병 상태 및 세포의 기능과 같은 요소에 크게 좌우된다.
2-세포 시스템이 이러한 유형의 실험 설정에 일반적으로 포함되기는 하지만, 둘 이상의 세포 시스템에 대해서도, 예를 들어, 각각의 분리된 세포 시스템을 별도의 고체 지지체에 고정시킴으로써 유사한 실험을 설계할 수 있다.
상기 필요에 따라 구축된 암 모델은 본 명세서에서 기술된 단계들을 수행함으로써 본 발명의 플랫폼 기술의 전 단계에 걸쳐 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 궁극적으로 식별하기 위해 수립되거나 사용될 수 있다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자라면, 초기의 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된 암 모델이, 예를 들어, 추가적인 암 또는 정상 세포 라인 및/또는 추가적인 암 조건의 도입에 의해 시간이 지남에 따라 “지속적으로 진화 또는 확장할 수 있다”는 것을 인식할 수 있을 것이다. 진화한 암 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 확장되거나 진화된 암 모델, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터 수집된 이러한 새로운 데이터는 보다 견고한 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 다시 이전에 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 생성된 데이터 집합에 도입될 수 있다. 암 상태(또는 암 상태의 교란에 대한 반응에 고유한)에 고유한 새로운 인과 관계는 이 후 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크로부터 식별될 수 있다. 이러한 방식으로, 암 모델의 진화가 합치 인과 관계 네트워크의 진화를 제공하며, 이에 의해 암 상태의 결정론적 추진 인자 (또는 조절 인자)로의 새로운 통찰 및/또는 보다 신뢰성 있는 통찰을 제공한다.
(iii) 당뇨/비만/심장병 세포 모델
생물학적 시스템 또는 과정의 다른 예는 당뇨, 비만 및 심장병이다. 암과 마찬가지로, 당뇨, 비만 및 심장병과 관련된 질병 상태는 다중의 특이한 측면으로 특징지워지는 복잡한 병리학적 조건을 가진다. 당뇨/비만/ 심장병의 발병을 추진하는 단백질/경로가 관심사일 수 있다. 정상 세포의 반응과 비교하여 당뇨/비만/심장병의 약제 치료와 관련된 세포의 고유한 반응을 판독하는 것이 관심사일 수도 있다. 이러한 목적을 위해, 적절한 세포 라인을 선택하고 및 질병 상태 또는 과정의 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건을 생성함으로써 질병 관련 세포가 경험하는 환경을 모의하기 위한 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장혈관 모델이 수립될 수 있다. 예를 들어, 고혈당증, 고지혈증, 고인슐린증, 저산소 상태 또는 젖산이 풍부한 조건을 매우 가까이 근사하는 세포 배양 조건이 선택될 수 있다.
당뇨/비만/심장병과 관련된 어떠한 세포도 당뇨/비만/심장병 모델에 포함될 수 있다. 당뇨/비만/심장병과 관련된 세포의 예는, 예를 들어, 지방 세포, 근관 세포, 간 세포, 대동맥의 평활근 세포(HASMC) 및 기부 관상 세포(예를 들어, HK2)를 포함한다. 단일 세포 유형과는 달리, 같거나 다른 근원의 다중 세포 유형이 당뇨/비만/심장병 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 서로 다른 세포 유형들이 상기 당뇨/비만/심장병 모델에 포함된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 세포의 세포 유형일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 세포들은 모두 동일한 유형, 예를 들어, 모두 지방 세포이지만, 세포 라인들은 예를 들어, 다르게 수립된 지방 세포의 세포 라인과 같이, 다르게 수립된 지방 세포의 세포 라인이다. 당뇨/비만/심장병 상태와 관련되는 다수의 다른 세포 유형이 해당 분야에서 알려져 있으며, 이러한 어떠한 세포도 본 발명의 당뇨/비만/심장병 모델에 포함될 수 있다.
본 발명의 당뇨/비만/심장병 세포 모델은 하나 또는 그 이상의 “제어 세포”를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 제어 세포는 처리되지 않거나 또는 교란되지 않은 질병 관련 세포, 예를 들어, 고지질증 또는 고인슐린증 조건에 노출된 세포이다. 또 다른 실시예에서, “제어 세포”는 상피 세포와 같은 질병과 관련되지 않은 세포일 수 있다. 다수의 질병과 관련되지 않은 세포 중 어느 하나가 상기 세포 모델에 포함될 수 있다. 일 실시예에서, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 질병에 관련되지 않은 세포 유형이 세포 모델에 포함된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 또는 5와 15 사이의 서로 다른 질병에 관련되지 않은 세포 라인 또는 세포 유형일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 질병에 관련되지 않은 세포는, 예를 들어, 모두 건강한 상피의 또는 유방 세포와 같이 모두 같은 유형이지만, 다르게 수립된 세포 라인, 예를 들어, 다르게 수립된 상피의 또는 유방 세포의 세포 라인일 수 있다. 일 실시예에서, 당뇨/비만/심장병에 고유한 단백질 또는 경로를 식별하기 위해 하나 또는 그 이상의 질병과 관련되지 않은 세포 라인들이 제어로서 유사한 조건 하에서 배양되고, 또한/또는 세포 모델의 질병과 관련된 세포와 동일한 교란에 노출된다.
필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 모델은 또한 당뇨/비만/심장병의 상태 또는 과정의 (이의 생리병리학을 나타내는) 특징적 측면을 모방하는 세포 배양 조건을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 조건을 환경 생체 내 당뇨/비만/심장병과 관련된 세포의 조건을 매우 가깝게 근사하거나, 당뇨/비만/심장병의 여러 측면을 모방하도록 선택할 수 있다. 일부 경우에 상기 세포 배양 조건은 스트레스 조건일 수 있다.
당뇨/ 비만/ 심장병의 생리병리학을 나타내는 예시적 조건은, 예를 들어, 어느 하나 또는 그 이상의 저산소 상태, 젖산 풍부 조건, 고혈당증, 고 리미드 증세 및 고인슐린증을 포함한다. 저산소 상태는 세포 내에서 해당 분야에 알려진 방법을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 저산소 상태는 세포 시스템을 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 포함하는 산업용 기체로 흘러 넘치게 할 수 있는 모듈라 배양기 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA)내에 위치시킴으로써 유도될 수 있다. 효과는 소정의 시간 이후, 예를 들어, 저산소 상태 치료 후 24시간 이후에, 추가적인 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 부존재 하에서 측정될 수 있다.
마찬가지로, 세포의 젖산 치료는 종양 환경 생체 내에 존재하는 방식의 해당 과정 활성이 높은 세포 환경을 모방한다. 젖산 유도 스트레스는 소정의 시간, 예를 들어, 24 시간에서 외부 자극 성분(예를 들어, 0, 50, 또는 100 μM에서의 CoQ10)의 존재 또는 비 존재 하에서 약 12.5 mM의 최종 젖산 농도로 조사될 수 있다. 고혈당증은 당뇨에서 발견되는 조건이다. 대상 세포를 일반적인 고혈당 조건에 노출시키는 것은 매체 내 글루코스의 최종 농도가 약 22 mM가 되도록 10% 배양 급 글루코스를 적절한 매체에 추가하는 것을 포함할 수 있다. 고지혈증은 비만 및 심장병에서 발견되는 조건이다. 이러한 고지질증 조건은 세포를 0.15 mM 나트륨 팔미테이트를 함유하는 매체 내에서 배양함으로써 제공될 수 있다. 고인슐린증은 당뇨에서 발견되는 조건이다. 이러한 고인슐린증 조건 세포를 1000 nM 인슐린을 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도될 수 있다.
당뇨/ 비만/ 심장병의 생리병리학을 나타내는 추가적 조건은, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 감염, 소포체 스트레스, 미토콘드리아의 스트레스 및 퍼옥시즘 스트레스이다. 세포 내의 감염과 유사한 조건을 생성하는 방법은 해당 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 감염 조건은 세포를 TNF알파 및/또는 IL-6의 존재 하에서 배양함으로써 모의될 수 있다. 소포체 스트레스를 모의하는 조건을 생성하는 방법 또한 해당 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 소포체 스트레스를 모의하는 조건은 세포를 탭시가긴 및/또는 트니카미신의 존재 하에서 배양함으로써 생성될 수 있다. 미토콘드리아의 스트레스를 모의하는 조건을 생성하는 방법 또한 해당 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 미토콘드리아의 스트레스를 모의하는 조건은 세포를 라파미신 및/또는 갈락토제의 존재 하에 배양함으로써 생성될 수 있다. 퍼옥시즘 스트레스를 모의하는 조건을 생성하는 방법 또한 해당 분야에서 알려져 있다. 예를 들어, 퍼옥시즘 스트레스를 모의하는 조건은 세포를 낙엽산의 존재 하에 배양함으로써 생성될 수 있다.
당뇨/비만/심장병의 다른 측면을 반영하는 개별적 조건들이 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 모델에서 별도로 조사되고, 또한/또는 함께 조합되어 조사될 수 있다. 일 실시예에서, 서로 다른 측면의 당뇨/비만/심장병을 반영하거나 모의하는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 모델에서 조사된다. 일 실시예에서, 서로 다른 측면의 당뇨/비만/심장병을 반영하거나 모의하는 개별적 조건들 및, 이에 추가하여, 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그 이상의 조건들의 조합이 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 모델에서 조사된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이, 또는 10와 50 사이의 서로 다른 조건일 수 있다.
일단 필요에 따라 구축된 세포 모델이 구축되면, 하나 또는 그 이상의 환자에서 환자로의 유전학적 변이, 또는 특정 약제 또는 사전 약제에 의한 치료 또는 비치료와 같은 “교란” 이 상기 시스템에 적용될 수 있다. 이에 대해 도 15D를 참조한다. 이러한 교란이 당뇨/비만/심장병 관련 세포를 포함하여 세포 모델 시스템에 미치는 영향은 해당 분야에서 인식되거나 특정적으로 수행되는 여러 수단을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 수단들은 아래 제 III.B절에서 설명된다.
예시적 실험에서, 각각의 지방 세포, 근관 세포, 간 세포, 대동맥의 평활근 세포(HASMC) 및 기부 관상 세포(HK2)는 각각의 고혈당증, 저산소 상태, 고지혈증, 고인슐린증, 및 젖산 풍부 조건과 함께 이들 각 조건의 둘, 셋, 넷 및 다섯 개의 조합의 조건을 겪게 되며, 추가적으로, 환경적 교란의 존재 또는 비 존재 하에서, 코엔자임 Q10로서 특별하게 치료된다. 암 모델과 관련하여 위에서 설명한 조건들의 예시적 조합과 더불어, 본 명세서의 이하 기술에서 일부 추가적인 조건들의 교란의 존재 또는 부존재 하에서의 예시적 조합이 열거되며, 이들은, 예를 들어, 당뇨/비만/심장병 세포 모델의 당뇨/비만/심장병 관련 세포(및/또는 제어 세포)를 치료하기 위해 사용될 수 있는 코엔자임 Q10 치료이다. 이는 단순히 예시적인 목적으로 제시된 것이며, 해당 분야의 통상의 기술자라면 당뇨/ 비만/ 심장병의 생리병리학을 나타내는 상기 언급한 조건들의 개별적 및/또는 조합이 세포 모델에서 출력 데이터 집합을 생성하기 위해 채택될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 수행되는 특정한 조사적 생물학적 평가에 따라 다른 조합들이 쉽게 형성될 수 있다.
1. 매체만 존재
2. 50 μM CTL 코엔자임 Q10
3. 100 μM CTL 코엔자임 Q10
4. 0.15 mM 나트륨 팔미테이트
5. 0.15 mM 나트륨 팔미테이트 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
6. 0.15 mM 나트륨 팔미테이트 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
7. 1000 nM 인슐린
8. 1000 nM 인슐린 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
9. 1000 nM 인슐린 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
10. 1000 nM 인슐린 + 0.15 mM 나트륨 팔미테이트
11. 1000 nM 인슐린 + 0.15 mM 나트륨 팔미테이트 + 50 μM CTL 코엔자임 Q10
12. 1000 nM 인슐린 + 0.15 mM 나트륨 팔미테이트 + 100 μM CTL 코엔자임 Q10
특정한 상황에서, 서로 다른 질병 관련 세포들(예를 들어, HASMC 및 HK2 세포, 또는 간 세포 및 지방 세포) 사이의 상호 대화 또는 ECS 실험은 다양한 상호 연관된 목적을 위해 수행될 수 있다. 상호 대화를 포함하는 일부 실시예에서, 세포 모델에 대해 수행된 실험들은 특정 세포 시스템 또는 군집(예를 들어, 간 세포)의 세포의 상태 또는 기능에 대한 정의된 치료 조건(예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태, 고지혈증, 고인슐린증) 하의 또 다른 세포 시스템 또는 군집 (예를 들어, 지방 세포)에 의한 조절을 결정하도록 설계되었다. 일반적인 설정에 따르면, 제 1 세포 시스템 / 군집은 후보 분자 (예를 들어, 소형 약 분자, 단백질) 또는 후보 조건 (예를 들어, 저산소 상태, 고 글루코스 환경)과 같은 외부 자극 성분과 접촉된다. 반응에서, 제 1 세포 시스템 / 군집은 그 전사체, 단백질체, 대사체, 및/또는 상호작용체를 변화시키며, 세포의 내부와 외부 모두에서 쉽게 탐지될 수 있는 변화에 이르게 된다. 예를 들어, 전사체에서의 변화는 다수의 타겟 mRNAs의 전사 수준에 의해 측정될 수 있고, 단백질체에서의 변화 다수의 타겟 단백질들의 발현 수준에 의해 측정될 수 있으며, 대사체에서의 변화는 특히 주어진 대사 물질에 대해 설계된 분석에 의해 다수의 타겟 대사 물질의 수준에 의해 측정될 수 있다. 대체적 방법으로, 대사체 및/또는 단백질체에서 최소한 특정한 분비 대사 물질 또는 단백질에 대한 위의 기준적 변화 또한 전사체, 단백질체, 대사체, 및 제 2 세포 시스템 / 군집의 상호 작용체의 조절을 포함하여 이들이 제 2 세포 시스템 / 군집에 미치는 영향에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 상기 실험은 제 1 세포 시스템 / 군집에 의해 분비된 관심있는 분자(들)가 서로 다른 치료 조건 하의 제 2 세포 시스템 / 군집에 미치는 영향을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 실험은 또한 제 1 세포 시스템(외부 자극 성분 치료에 대한 반응으로)으로부터 또 다른 세포 시스템으로의, 예를 들어, 단백질체학의분별 선별에 의한 신호 전달의 결과로 조절되는 어느 하나의 단백질을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 동일한 실험적 설정이 반대의 설정에 적응되어, 두 세포 시스템 사이의 상호 효과 또한 분석되도록 할 수도 있다. 이러한 유형의 실험에 있어서, 일반적으로 세포 라인의 쌍은 근원, 질병 상태 및 세포의 기능과 같은 요소에 크게 좌우된다.
2-세포 시스템이 이러한 유형의 실험 설정에 일반적으로 포함되기는 하지만, 둘 이상의 세포 시스템에 대해서도, 예를 들어, 각각의 분리된 세포 시스템을 별도의 고체 지지체에 고정시킴으로써 유사한 실험을 설계할 수 있다.
상기 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 모델은 본 명세서에서 기술된 단계들을 수행함으로써 본 발명의 플랫폼 기술의 전 단계에 걸쳐 당뇨/비만/심장병 상태에 고유한 인과 관계를 궁극적으로 식별하기 위해 수립되거나 사용될 수 있다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자라면, 암 모델과 마찬가지로, 초기의 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된 당뇨/비만/심장병 모델이, 예를 들어, 추가적인 질병 관련 세포 라인 및/또는 추가적인 질병 관련 조건의 도입에 의해 시간이 지남에 따라 “지속적으로 진화 또는 확장할 수 있다”는 것을 인식할 수 있을 것이다. 진화한당뇨/비만/심장병 모델로부터의 추가적인 데이터, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터의 데이터가 수집될 수 있다. 확장되거나 진화된 암 모델, 즉, 암 모델의 새롭게 추가된 부분(들)으로부터 수집된 이러한 새로운 데이터는 보다 견고한 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 다시 이전에 “제 1 세대” 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 생성된 데이터 집합에 도입될 수 있다. 당뇨/비만/심장병 상태(또는 당뇨/비만/심장병 상태의 교란에 대한 반응에 고유한)에 고유한 새로운 인과 관계는 이후 “제 2 세대” 합치 인과 관계 네트워크로부터 식별될 수 있다. 이러한 방식으로, 당뇨/비만/심장병 모델의 진화가 합치 인과 관계 네트워크의 진화를 제공하며, 이에 의해 당뇨/비만/심장병 상태의 결정론적 추진 인자(또는 조절 인자)로의 새로운 통찰 및/또는 보다 신뢰성 있는 통찰을 제공한다.
B. 조사적 생물학적 평가를 위한 세포 모델의 사용
본 발명에서 제공되는 방법 및 세포 모델은 임의의 개수의 “조사적 생물학적 평가”를 위해 사용되거나 이에 적용될 수 있다. 조사적 생물학적 평가를 의한 본 발명의 방법의 사용은 생물학적 시스템의 “조절 인자” 또는 결정론적 세포 과정 “추진 인자”의 식별을 빠르게 수행하도록 해 준다.
본 명세서에서 사용되는, “조사적 생물학적 평가”는 생물학적 시스템의 하나 또는 그 이상의 조절 인자, 예를 들어, 환경적 교란 또는 외부 자극 성분과 연관된 결정론적 세포 과정 “추진 인자”(예를 들어, 생물학적 경로, 또는 경로의 핵심 멤버, 또는 경로의 멤버의 핵심 조절자의 활성에 있어서의 증가 또는 감소), 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 특유 인과 관계의 식별을 포함한다. 이는 상기 식별된 결정론적 세포 과정 추진 인자가 생체 내 동물 모델 및/또는 생체 외 조직 배양 실험을 포함하는 환경적 교란 또는 외부 자극 성분과 연관된 하향 이벤트에 필요하고, 또한/또는 충분한 지를 검사하거나 증명하기 위해 설계된 추가적 단계를 더 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병 상태의 진단 또는 단계 파악이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의 조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 치료적 시술을 받을 수 있는 질병 표지 인자 또는 치료적 타겟을 나타낸다. 상기 대상의 조사적 생물학적 평가는 이론적으로는 어떠한 질병 조건에도 적절하지만, 종양학 / 암 생물학, 당뇨, 비만, 심장병, 및 신경학적 조건(특히 한정됨이 없이 알츠하이머 질병, 파킨슨 씨 병, 헌팅턴 질병, 루게릭 병(ALS), 및 노화 관련 신경 퇴행성 질환과 같은 퇴행성 신경 질병)과 같은 영역에서 특히 유용한 것으로 밝혀질 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 약의 효능의 결정이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의 조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자 (예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 성공적인 약제의 전형적 특징이며, 다시 MIM 또는 에피시프터(epishifter)와 같은 동일한 질병 조건을 치료하기 위한 추가적 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 감염(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스 감염)을 예방하고 치료하기 위한 약제 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의 조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 감염 상태를 야기하는 표지 인자/지표 또는 핵심 생물학적 분자일 수 있으며, 다시 항 감염 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 주어진 질병 프로필에서 제제, 예를 들어, 약제의 분자에 대한 효과에 대한 평가이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 하나 또는 그 이상의 생물학적 경로, 또는 경로(들)의 핵심 멤버, 또는 경로(들)의 멤버의 핵심 조절자의 활성에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있으며, 또한, 예를 들어, 주어진 질병에 대한 제제의 치료적 효능을 예측하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 제제, 예를 들어, 약제의 세포, 조직, 기관 또는 기관계에 대한 독성의 프로필의 평가이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의 조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 독성, 예를 들어, 세포 독성의 지표이며, 다시 제제의 독성의 프로필을 예측하거나 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 식별된 생물학적 시스템의 조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 약제 또는 약제 후보의 심장 독성의 지표일 수 있으며, 이는 다시 약제 또는 약제 후보의 심장 독성 프로필을 예측하거나 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 질병 야기 원생동물, 균류, 박테리아, 대항체, 바이러스, 또는 독소와 같은 생물학적 무기에 의해 야기되는 질병 또는 질환을 예방하거나 치료하기 이한 제약 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 상기 질병 또는 질환을 야기하는 표지 인자/지표 또는 핵심 생물학적 분자일 수 있으며, 이는 다시 생물학적 방어 제제를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 상기 조사적 생물학적 평가는 노화 방지 화장품과 같은 노화 방지 제제의 타겟의 식별이며, 이때 상기 식별된 생물학적 시스템의조절 인자, 예를 들어, 결정론적 세포 과정 추진 인자(예를 들어, 세포 간 상호 대화 분별 또는 생물학적 시스템 또는 과정에 고유한 인과 관계)는 상기 노화 과정, 특히 피부에서의 노화 과정의 표지 인자 또는 지표일 수 있으며, 이는 다시 노화 방지 제제의 식별을 위해 사용될 수 있다.
노화 방지 화장품에 대한 타겟을 식별하기 위한 본 발명의 방법에서 사용된 하나의 예시적 세포 모델에서, 상기 세포 모델은 노화하는 상피의 세포, 즉, 예를 들어, 자외선 (환경적 교란 또는 외부 자극 성분)으로 처리된 세포, 및/또는 역시 선택적으로 자외선으로 처리된 신생아의 세포를 포함한다. 일 실시예에서, 노화에 대한 세포 모델은 세포 간 상호 대화 시스템을 포함한단. 노화 방지 화장품에 대한 타겟을 식별하기 위해 수립된 한 예시적 2-세포 상호 대화 시스템, 노화하는 상피 세포(제 1 세포 시스템)는 자외선(외부 자극 성분)으로 처리될 수 있으며, 신생아의 세포(제 2 세포 시스템)에서의 변화, 예를 들어, 신생아의 세포를 상기 처리된 노화하는 상피의 세포의 조건이 가해진 매체에 접촉시킨 결과로 발생하는 단백질체의 변화 및/또는 기능적 변화가 측정될 수 있으며, 이때, 예를 들어, 단백질체 변화는 통상의 정량적 질량 분광학을 사용하여 측정될 수 있거나, 노화에 고유한 인과 관계는 데이터로부터 생성된 인과 관계 네트워크로부터 식별될 수 있다.
V. 단백체 표본 분석
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 유사한 성격의 수 백개의 표본의 대규모의 고 성능 출력 정량적 단백질체의 분석을 채택하며, 세포의 출력 분별을 식별하기 위해 필요한 데이터를 제공한다.
이러한 목적으로 사용하기에 적절한 기술들이 해당 분야에서 다수 인식되고 있다. 예시적 기술로서, 질량 분광학을 사용한 조합에서의 iTRAQ 분석이 이하에서 간단히 설명된다.
iTRAQ 기술을 사용한 상대적 정량화의 기준 표본을 제공하기 위해, 다중 QC 풀이 생성된다. 각 표본의 부분 표본으로 구성되는 두 개의 분리된 QC 풀이, 각각 QCS1 및 QCS2로 표기되는 세포 #1 및 세포 #2 표본 및 상층액 및 펠릿에 대한 각각의 QCP1 및 QCP2 으로부터 생성된다. 두 세포 라인에 걸친 단백질 농도 비교를 가능하게 하기 위해, 상기 기술된 QC 풀로부터의 세포 펠릿 부분 표본이 동일한 부피로 결합되어 기준 표본(QCP)을 생성한다.
정량적 단백체 접근 방법은 8-plex iTRAQ 반응 제제를 사용하는 안정된 동위원소 라벨링 및 펩티드 식별 및 정량화를 위한 2D-LC MALDI MS/MS에 기반한다. 이러한 기술을 사용한 정량화는 상대적이다: 펩티드 및 단백질은 기준 표본에 상대적인 존재 비율이 지정된다. 다중 iTRAQ 실험에서의 공통된 기준 표본이 다중 iTRAQ 실험에 걸쳐 표본의 비교를 쉽게 수행할 수 있도록 해준다.
이러한 분석 방법 체제를 구현하기 위해, 여섯 개의 주요 표본 및 두 개의 제어 풀 표본이 하나의 8-plex iTRAQ 혼합물로 결합되며, 이때 상기 제어 풀 표본은 제조사의 제시에 따라 113 및 117 반응 제제로 라벨링된다. 이러한 여덟 개 표본의 혼합물은 이후 다음과 같은 이차원 액체 크로마토그래피에 의해 분별된다; 제 1 차원에서의 강한 양이온 교환 (SCX), 및 제 2 차원에서의 역위상 HPLC. 상기 HPLC 용해 분리물은 MALDI 플레이트 상에서 직접적으로 구분되며, 상기 플레이트는 MDS SCIEX/AB 4800 MALDI TOF/TOF 질량 분광계 상에서 분석된다.
추가적인 정보가 부재한 상황에서, 단백질 발현에서 가장 중요한 변화는 다른 치료 조건 하에서 동일한 세포 유형의 변화인 것으로 가정한다. 이러한 이유로, 세포#1 및 세포#2로부터의 주요 표본들은 별도의 iTRAQ 혼합물에서 분석된다. 세포#1 대 세포#2 표본 내에서의 단백질 발현의 비교를 보다 쉽게 하기 위해, 보편적 QCP 표본이 주요 표본 또는 세포 라인 특정 QC 표본(QC1 및 QC2)에 의해 점유되지 않는 가용한 “iTRAQ 슬롯”에서 분석된다.
채택된 실험실 절차가 아래에서 간단히 검토된다.
A. 세포 상층액 표본으로부터의 단백질 추출
세포 상층액 표본(CSN)에 대해, 배양 매체로부터의 단백질이 매우 과량으로 배양된 세포에서 분비된 단백질 상에 존재한다. 이러한 배경을 감소시키기 위한 시도로서, 전면에 존재하는 단백질의 고갈이 구현된다. 특정한 친화성 기둥이 소과 또는 말의 혈청 단백질에 대해서는 사용할 수 없기 때문에, 항인간 IgY14 기둥이 사용되었다. 항체가 인간 단백질에 대해 가해지는 동안, 항체의 다중 복제성 특성에 의해 제공되는 광범위한 특정성이 사용된 세포 배양 매체 내에 존재하는 소 및 말의 단백질의 고갈을 성취할 것으로 예상된다.
CSN QC 물질의 200-μl 부분 표본이 뒤따르는 물질에서의 전체 단백질 농도를 결정하기 위한 연구(바이신코닉 산(BCA) 분석)를 시작하기 전에 10-mL IgY14 고갈 기둥 상에 적재된다. 이후 적절한 양의 40 μg 전체 단백질을 함유하는 고갈 부분을 성취하기 위해 적재 부피가 선택된다.
B . 세포 펠릿으로부터의 단백질 추출
세포 #1 및 세포 #2의 부분 표본이 BGM에서의 조직 표본의 분석에 사용되는 “표준” 용균 버퍼 내에 용해되고, 전체 단백질 내용물이 BCA 분석에 의해 결정된다. 이들 대표적인 세포 용해물의 단백질 내용들이 확립되면, 모든 세포 펠릿 표본(제 1.1절에서 기술된 QC 표본을 포함)들이 세포 용해물로 처리된다. 약 40 μg의 전체 단백질 양의 용해물이 과정의 작업 절차에서 흐르게 된다.
C . 질량 분광학을 위한 표본 준비
표본 준비는 표준 작업 절차를 따르며 다음과 같이 구성된다:
단백질의 환원 및 알킬화
역 위상 컬럼에서의 단백질 세척(세포 펠릿에만 적용)
트립신에 의한 소화
iTRAQ 라벨링
강한 양이온 교환 크로마토그래피 - 여섯 부분의 수집(아질란트(Agilent) 1200 시스템)
HPLC 분별 및 MALDI 플레이트의 위치 식별(Dionex Ultimate3000/Probot 시스템)
D. MALDI MS 및 MS / MS
HPLC-MS는 일반적으로 온라인 ESI MS/MS 전략을 채택한다. BG 의약품은 동일한 표본을 여러 번 주입할 필요가 없이 결과적으로 주 표본에 걸쳐 관측된 단백질 집합의 보다 나은 일치를 가져올 수 있는 오프라인 LC-MALDI MS/MS 플랫폼을 사용한다. 모든 iTRAQ 혼합물에 걸친 첫 번째 데이터 수집 절차에 이어, 펩티드 부분이 MALDI 타겟 플레이트에 계속 남아 있기 때문에, 상기 표본은 타겟이 맞추어진 제 1 획득에서 얻은 지식으로부터 도출된 MS/MS 획득 패턴을 사용하여 두 번째로 분석될 수 있다. 이러한 방식으로, 식별된 모든 단백질에 대한 최대 관찰 빈도를 성취할 수 있다(이상적으로, 모든 단백질은 모든 iTRAQ 혼합에서 측정되어야 한다).
E. 데이터 처리
BGM 단백질체학 작업 흐름 내에서의 데이터 처리 과정은 각각의 iTRAQ 혼합에 대해 개별적으로 완수되는 예비 펩티드 식별 및 정량화와 같은 절차(제 1.5.1절) 및 프로젝트를 위한 데이터 획득이 완료될 때까지는 완수되지 않는 단백질에 대한 펩티드의 최종 지정 및 단백질의 최종 정량화와 같은 과정(제 1.5.2절)으로 나누어질 수 있다.
BGM 단백질체학 내에서의 주요 데이터 처리 단계는 다음과 같다:
마스코트(매트릭스 과학) 데이터베이스 탐색 엔진을 사용한 펩티드 식별
자동화된 실험실 내 마스코트 ID 증명
펩티드의 정량화 및 단백질의 사전 정량화
최종 데이터 집합의 전문가 큐레이션
자동화된 PVT 도구를 사용한 각 혼합물로부터 공통된 집합의 단백질로의 펩티드의 최종 지정
극단치 제거 및 단백질의 최종 정량화
(i) 개별적 iTRAQ혼합물의 데이터 처리
각각의 iTRAQ 혼합물이 작업 흐름을 통해 처리됨에 따라 MS/MS 스펙트럼이 정량화 정보의 초기 평가와 함께 펩티드 및 단백질 식별을 위한 특정회사의 BGM 소프트웨어 도구를 사용하여 분석된다. 이러한 사전 분석 결과를 바탕으로, 혼합물 내 각 주요 표본에 대한 작업 흐름의 질이 BGM 성능 척도에 대해 결정된다. 주어진 표본 (또는 혼합물)이 특정한 최소 척도를 통과하지 못하고 추가적인 물질을 사용할 수 있는 경우, 해당 표본은 전체적으로 반복 수행되며 이러한 작업 흐름의 2차적 수행에서 얻은 데이터가 최종 데이터 집합에 통합된다.
(ii) 펩티드 식별
MS/MS 스펙트럼이 돼지의 트립신과 같은 통상의 오염 염기서열을 사옹하여 증폭된 인간, 소과 동물 및 말의 염기서열을 포함하는 유니프롯(Uniprot) 단백질 염기서열 데이터베이스에 대해 탐색된다. 마스코트 탐색 매개변수의 상세 사항은, 수정의 완전한 목록을 포함하여, 표 3에서 주어진다.
표 3 : 마스코트 검색 매개변수
전구체 질량 허용치 100 ppm
파편 질량 허용치 0.4 Da
변수 수정 N-항 iTRAQ8
라이신 iTRAQ8
시스 카르바미도메틸
파이로-글루 (N-항)
파이로-카르바미도 메틸 시스(N-항)
탈아미드화(N에 한함)
산화(M)
효소 특정성 완전한 트립신
허용되는 소실된 트립신 부위의 개수 2
고려되는 펩티드 순위 1
마스코트 탐색이 완료된 이후, 자동 증명 절차가 특정한 마스코트 펩티드 합치를 촉진(즉, 증명)하기 위해 사용된다. 타당한 합치와 타당하지 않은 합치 사이의 구분은 예상된 마스코트 스코어에 상대적인 성취한 마스코트 스코어 및 랭크 1 펩티드와 랭크 2 펩티드 마스코트 스코어 사이의 차이에 기반한다. 펩티드가 iTRAQ 혼합물 내에서 단일 단백질에 합치되는 여러 팹티드 중 하나이거나 상기 펩티드가 이전에 증명된 펩티드의 카탈로그 내에 존재하는 경우, 증명에 필요한 기준은 다소 완화된다.
(iii) 펩티드 및 단백질 정량화
각 혼합물에 대한 증명된 펩티드들의 집합은 각 혼합물에 대해 사전 단백질 정량화 척도를 계산하기 위해 활용된다. 펩티드 비율은 증명된 각 펩티드에 대한 iTRAQ 라벨(즉, m/z 114, 115, 116, 118, 119, 또는 121)로부터의 피크 영역을 기준 풀(QC1 또는 QC2)의 피크 영역의 최선의 표현으로 나눔으로써 계산된다. 이러한 피크 영역은 양 표본 과정 QC 허용 기준에 의해 제공되는 113 및 117 피크의 평균이다. 사전 단백질 비율은 해당 단백질에 합치하는 모든 “유용한” 증명된 펩티드의 중간 비율을 계산함으로써 결정된다. “유용한” 펩티드는 완전하게 iTRAQ 라벨링되며(모든 N-단말이 라이신 또는 파이로글루(PyroGlu)로 라벨링됨) 완전하게 시스테인 라벨링된다(즉, 모든 Cys 잔여부가 카바미도 메틸 또는 N-단말 Pyro-cmc로써 알킬화된다).
(iv) 획득 후 처리
MS/MS 데이터 획득의 모든 일단의 절차가 프로젝트 내의 각 혼합물에 대해 완료되면, 상기 데이터는 각각의 주 표본으로부터의 결과들이 서로 간단하고 의미있게 비교되도록 하기 위한 목적을 가지는 하기 논의되는 세 단계를 사용하여 수집, 분석된다.
(v) 펩티드 염기 서열의 단백질로의 전역 지정
펩티드 염기서열을 단백질 접근 번호에 최종적으로 지정하는 것은 특정 회사의 단백질 증명 도구(PVT)로써 수행된다. 상기 PVT 절차는 프로젝트에서 식별된 펩티드의 전체 집합을 기술하기 위한 최소한으로 반복되는 최선의 단백질 집합을 결정한다. 이는 균일한 분류 체계로부터의 데이터를 다루기 위한 자동화된 절차이다.
상층액 실험을 위한 단백질 지정은 데이터베이스 내 혼합된 독성의 복잡함을 처리하기 위해 수동으로 조절된다. 자동화된 패러다임이 소와 말의 혈청 대체 매체에서 성장한 세포 배양에 대해서는 타당하지 않기 때문에, 주어진 단백질의 소스의 애매함을 최소화하기 위해 보다 광범위한 수동 조절이 필요하다.
(vi) 펩티드 비율의 정규화
각 표본에 대한 펩티드 비율은 반데좀펠(Vandesompele) 외, 게놈 생물학, 2002, 3(7), 연구 0034.1-11의 방법을 기반으로 정규화된다. 이 절차는 세포 펠릿 측정에만 적용된다. 상층액 표본에 대해서는, 매체로부터 유래하는 펩티드 식별에 대한 가장 큰 기여를 고려하여 정량적 데이터가 정규화되지 않는다.
(vii) 단백질 비율의 최종 계산
표준 통계적 극단치 제거 절차가 로그 변환 데이터 집합에서 1.96 σ 수준을 초과하는 각 단백질 매체 비율 근처로부터의 극단치를 제거하기 위해 사용된다. 이러한 제거 과정에 이어, 단백질 비율의 최종 집합이 (재)계산된다.
VI . 본 발명의 표지 인자 및 그 이용
본 발명은, 최소한 부분적으로는, 질병 과정과 같은 생물학적 시스템, 또는 치료용 제제와 같은 교란에 대한 생물학적 시스템의 반응과 관련된 신규의 생물학적 표지 인자의 식별에 기반한 것이다.
특히, 본 발명은 예에서 설명된 표지 인자(이하, “표지 인자” 또는 “본 발명의 표지 인자”라 한다)에 관한 것이다. 본 발명은 상기 표지 인자에 의해 부호화되거나 이에 해당하는 핵산 및 단백질(이하, 각각 “표지 인자 핵산” 및 “표지 인자 단백질”이라 한다)을 제공한다. 이러한 표지 인자들은 질병 상태를 진단하고, 질병 상태를 예단하며, 다양한 질병 상태에 대한 약제 타겟을 개발하고, 독성, 바람직하게는 약제로 유도되는 독성, 예를 들어, 심장 독성의 존재를 선별하며, 독성을 야기하거나 독성을 야기할 위험이 있는 제제를 식별하고, 약제로 유도되는 독성을 경감하고 예방할 수 있는 제제를 식별하며, 약제로 유도되는 심장 독성을 완화, 경감 또는 예방하고, 약제로 유도되는 심장 독성을 예측하는 표지 인자를 식별하는데 특히 유용하다.
"표지 인자"는 정상 또는 건강한 조직 또는 세포 내의 발현 수준으로부터 변경된 조직 또는 세포 내의 발현 수준이 암, 당뇨, 비만, 심장 혈관계 질병, 또는 약제로 유도되는 독성, 예를 들어, 심장 독성과 같은 독성 상태와 같은 질병 상태에 연관되는 유전자이다. “표지 인자 핵산”은 본 발명의 표지 인자에 의해 부호화되거나 해당 표지 인자인 핵산(예를 들어, mRNA, cDNA)이다. 이러한 표지 인자 핵산은 본 발명의 표지 인자인 특정 유전자의 전체 또는 일부의 염기서열, 또는 이러한 염기서열의 보완체를 포함하는 DNA(예를 들어, cDNA)를 포함한다. 이러한 염기서열은 해당 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, NIH 정부 퍼브메드(pubmed) 웹사이트에서 찾아 볼 수 있다. 상기 표지 인자 핵산은 또한 본 발명의 유전자 표지 인자의 전체 또는 일부의 염기서열 또는 이러한 염기서열의 보완체를 포함하는 RNA를 포함하며, 이때 모든 티미딘 잔여부는 우리딘 잔여부로 대체된다. “표지 인자 단백질”은 본 발명의 표지 인자에 의해 부호화된 단백질 또는 이에 해당하는 단백질이다. 표지 인자 단백질은 본 발명의 단백질의 표지 인자의 전체 또는 일부의 염기서열을 포함한다. 이러한 염기서열은 해당 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며, 예를 들어, NIH 정부 퍼브메드(pubmed) 웹사이트에서 찾아 볼 수 있다. 용어 “단백질” 및 “폴리펩티드"는 교차적으로 사용된다.
“질병 상태 또는 독성 상태 연관" 신체 체액은 환자의 신체 내에 있을 때 육종 세포를 접촉하거나 지나가는 액체, 또는 육종 세포로부터 나온 세포 또는 단백질를 지나갈 수 있는 액체이다. 예시적 질병 상태 또는 독성 상태 연관 신체 체액은 혈액(예를 들어 전체혈액, 혈청, 혈소판이 제거된 혈액)을 포함하며, 아래에서 보다 상세히 설명된다. 질병 상태 또는 독성 상태 연관 신체 체액은 전체혈액, 혈청, 혈소판이 제거된 혈액, 림프, 전립선 액, 소변 및 정액에 한정되지 않는다.
표지 인자의 "정상" 발현 수준은 인간 대상 또는 질병 상태 또는 독성 상태를 겪지 않는 환자의 세포의 표지 인자의 발현 수준이다.
표지 인자의 “과도 발현” 또는 “보다 높은 수준의 발현”은 제어 표본(예를 들어, 질병 상태 또는 독성 상태, 예를 들어, 암, 당뇨, 비만, 심장 혈관 질병, 및 심장 독성과 연관된 표지 인자를 가지지 않는 건강한 대상으로부터의 표본)내에서 발현 수준, 바람직하게는 여러 제어 표본의 표지 인자들의 평균 발현 수준과 비교하여, 발현을 분석하기 위해 채택된 분석의 표준 오류보다 큰 검사 표본에서의 발현 수준을 말하며, 바람직하게는 최소한 두 배, 보다 바람직하게는 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 배의 발현 수준을 말한다.
표지 인자의 “발현의 저수준”은 제어 표본(예를 들어, 질병 상태 또는 독성 상태, 예를 들어, 암, 당뇨, 비만, 심장 혈관 질병, 및 심장 독성과 연관된 표지 인자를 가지지 않는 건강한 대상으로부터의 표본)내에서 발현 수준, 바람직하게는 여러 제어 표본의 표지 인자들의 평균 발현 수준과 비교하여, 최소한 두 배, 보다 바람직하게는 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 배 낮은 검사 표본 내 발현 수준을 말한다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 “뉴클레오타이드 전사체”는 본 발명의 표지 인자 및 정상적 전사 후 처리(예를 들어 이어 맞추기)의 전사, 존재하는 경우, RNA 전사체의 전사, 및 RNA 전사체의 역 전사에 의해 만들어 지는 전부 또는 일부의 성숙한 mRNA와 보완 또는 상동인 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어 mRNA, hnRNA, cDNA, 또는 이러한 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
"보완"은 두 핵산 가닥의 영역 또는 동일한 핵산 가닥의 두 영역 사이의 넓은 개념의 염기서열 보완성을 말한다. 제 1 핵산 영역의 아데닌 잔여부가 제 1 영역과 역으로 평행한 제 2 핵산 영역의 잔여부와, 상기 잔여부가 티민 또는 우라실인 경우, 특정한 수소 결합("기반 페어링")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로, 제 1 핵산 가닥의 사이토신 잔여부가 제 1 가닥과 역으로 평행한 제 2 핵산 가닥의 잔여부와, 상기 잔여부가 구아닌인 경우, 기반 페어링을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 제 1 영역은 동일 핵산이나 다른 핵산의 제 2 영역에 대해, 두 영역이 역 평행한 방식으로 배열되었을 때, 제 1 영역의 최소한 하나의 뉴클레오타이드 잔여부가 제 2 영역의 잔여부와 기반 페어링을 할 수 있는 경우, 보완적이다. 바람직하게는, 제 1 영역은 제 1 부분을 포함하고 제 2 영역은 제 2 부분을 포함하며, 이에 의해 제 1 및 제 2 부분이 역으로 평행하게 배열되었을 때, 제 1 부분의 뉴클레오타이드 잔여부의 최소한 약 50%, 바람직하게는 최소한 약 75%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%가 제 2 부분의 뉴클레오타이드 잔여부와 기반 페어링을 할 수 있다. 보다 바람직하게는, 제 1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔여부가 제 2 부분의 뉴클레오타이드 잔여부와 기반 페어링을 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "상동"은 동일한 핵산 가닥의 두 영역 사이 또는 두 개의 서로 다른 핵산 가닥의 영역 사이의 뉴클레오타이드 염기서열의 유사성을 말한다. 두 영역 모두에서의 뉴클레오타이드 잔여부 위치가 동일한 뉴클레오타이드 잔여부에 의해 점유되면, 이 영역들은 이 위치에서 상동으로 된다. 두 영역에서 각 위치의 최소한 하나의 뉴클레오타이드 잔여부 위치가 동일한 잔여부에 의해 점유되는 경우, 제 1 영역은 제 2 영역에 상동이다. 두 영역 사이의 상동은 동일한 잔여부에 의해 점유되는 두 영역의 뉴클레오타이드 잔여부 위치의 전반부에 대해 표현된다. 예를 들어 설명하면, 뉴클레오타이드 염기서열 5'-ATTGCC-3'을 가지는 영역과 뉴클레오타이드 염기서열 5'-TATGGC-3'을 가지는 영역은 50%의 상동을 공유한다. 바람직하게는, 제 1 영역은 제 1 부분을 포함하고 제 2 영역의 제 2 부분을 포함하며, 이에 의해 각 부분의 최소한 약 50%, 바람직하게는 최소한 약 75%, 최소한 약 90%, 또는 최소한 약 95%의 뉴클레오타이드 잔여부 위치가 동일한 잔여부에 의해 점유된다. 보다 바람직하게는, 각 부분에서 모든 뉴클레오타이드 잔여부 위치는 동일한 뉴클레오타이드 잔여부에 의해 점유된다.
“본 발명의 단백질”은 표지 인자 단백질 및 이들의 파편; 이형 표지 인자 단백질 및 이들의 파편; 최소한 15 아미노산 세그먼트의 표지 인자 또는 이형 표지 인자 단백질을 포함하는 펩티드 및 폴리펩티드; 및 표지 인자 또는 이형 표지 인자 단백질, 또는 최소한 15 아미노산 세그먼트의 표지 인자 또는 이형 표지 인자 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다.
본 발명은 특히 본 발명의 표지 인자 단백질의 표지 인자 단백질 및 파편에 결합하는 항체, 항체 파생체 및 항체 파편을 더 제공한다. 본 명세서에서 다르게 특정되지 않는 한, 용어 “항체” 및 “항체”는 상기 기술한 모든 파편 및 파생체뿐만 아니라 넓은 범위로 자연적으로 발생하는 형태의 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE)와 단일 체인 항체와 같은 재조합 항체, 키메릭 및 인간화된 항체 및 다중-특정 항체를 포함하며, 이들 파편 및 파생체는 최소한 하나의 항원적 결합 부위를 가진다. 항체 파생체는 항체와 켤레인 단백질 또는 화학적 성분을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, CANX, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자(또는 단백질)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 표지 인자는 최소한 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물, 스물다섯, 설흔 또는 그 이상의 이전 유전자들(또는 단백질)의 조합이다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이의 상기 기술된 유전자 (또는 단백질)일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 암과 연관되거나 이에 포함된 유전자 또는 단백질이다. 이러한 암에 포함된 유전자 또는 단백질은, 예를 들어, HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및/또는 CANX를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 최소한 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물 또는 그 이상의 이전에 언급한 유전자(또는 단백질)의 조합이다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이의 상기 기술된 유전자(또는 단백질)일 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 약제로 유도되는 독성에 연관되거나 이에 포함된 유전자 또는 단백질을 포함한다. 약제로 유도되는 독성에 포함되는 이러한 유전자 또는 단백질은, 예를 들어, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및/또는 TAZ를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 최소한 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열 개의 상기 언급한 유전자(또는 단백질)의 조합이다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 1 과 20 사이, 1 과 30 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이, 1 과 20 사이, 5와 20 사이, 10과 20 사이, 10과 25 사이, 10과 30 사이의 상기 기술한 유전자(또는 단백질)일 수 있다.
A. 표지 인자와 관련된 심장 독성
본 발명은, 최소한 부분적으로는, 약제로 유도되는 심장 독성과 연관된 신규의 생물학적 표지 인자의 식별에 기반한다. 본 발명은, 최소한 부분적으로는, 코엔자임 Q10가 약제로 유도되는 심장 독성을 경감하거나 예방할 수 있 발견에 더 기반한다.
이에 따라, 본 발명은 독성을 야기하거나 이를 야기할 위험성이 있는 제제를 파악하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 제제는 약제 또는 약제 후보이다. 일 실시예에서, 상기 독성은 약제로 유도되는 독성, 예를 들어, 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 제제는 당뇨, 비만 또는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 제약 또는 제약 후보이다. 이들 방법에서는, 한 쌍의 표본(약제 치료를 겪지 않은 제 1 표본 및 약제 치료를 겪은 제2 표본) 내에서 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자/단백질의 양이 분석된다. 일 실시예에서, 제 1 표본과 비교할 때, 제 2 표본 내의 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 약제가 약제로 유도되는 독성, 예를 들어, 심장 독성을 야기하거나 야기할 위험이 있음을 나타낸다. 일 실시예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ으로 이루어지는 군에서 선택된다. 본 발명의 방법은 해당 분야의 통상의 기술자들이 약제로 유도되는 심장 독성을 야기할 위험성이 있는 약제를 식별하기 위해 사용하는 다른 방법과 함께 실시될 수 있다.
이에 따라, 한 측면에서, 본 발명은 약제로 유도되는 독성 (예를 들어, 심장 독성)을 야기하거나 야기할 위험이 있는 약제를 식별하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 약제로 치료하기 이전의 세포 표본에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준을 (ii) 약제로 치료한 이후 얻어진 제 2 세포 표본에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하며; 이때 상기 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 제 1 표본과 비교하여 제 2 표본 내 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 약제가 약제로 유도되는 독성(예를 들어, 심장 독성)을 야기하거나 야기할 위험이 있음을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 약제로 유도되는 독성은 약제로 유도되는 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 세포는 심장혈관 시스템의 세포, 예를 들어, 심장근세포이다. 일 실시예에서, 상기 세포는 당뇨성 심장근 세포이다. 일 실시예에서, 상기 약제는 당뇨, 비만 또는 심장병 치료를 위한 약제 또는 후보 약제이다.
일 실시예에서, 제 1 표본과 비교할 때, 제 2 표본 내의 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 개 모두의 생물학적 표지 인자의 발현 수준에서의 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)은 상기 약제가 약제로 유도되는 독성을 야기하거나 야기할 위험이 있음을 나타낸다.
약제로 유도되는 독성을 감소시키거나 예방할 수 있는 제제를 식별하기 위한 방법 또한 본 발명에 의해 제공된다. 일 실시예에서, 상기 약제로 유도되는 독성은 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 약제는 당뇨, 비만 또는 심장혈관 질환을 치료하기 위한 약제 또는 약제 후보이다. 이들 방법에서, 세 표본(약제 치료를 겪지 않은 제 1 표본, 약제 치료를 겪은 제2 표본, 및 약제 치료 및 제제 처리를 모두 겪은 제 3 표본) 내의 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 양이 분석된다. 제 1 표본과 비교할 때 제 3 표본 내의 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자와 거의 같은 발현 수준은 상기 제제가 약제로 유도되는 독성, 예를 들어, 약제로 유도되는 심장 독성을 감소시키거나 예방할 수 있음을 나타낸다. 일 실시예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 명세서에서 기술된 상기 방법들을 사용하여, 다양한 분자들, 특히 세포막을 통과하기에 충분히 작은 분자들을 포함하는 분자들이 예를 들어, 본 발명의 표지 인자의 발현 및/또는 활성을 증가 또는 감소시키는 등의 조절을 하는 분자들을 식별하기 위해 선별될 수 있다. 이렇게 식별된 화합물은 대상에서의 약제로 유도되는 독성을 감소시키거나, 완화시키거나 예방하기 위해 대상에 제공될 수 있다.
이에 따라, 또 다른 측면에서, 본 발명은 약제로 유도되는 독성을 감소시키거나 예방할 수 있는 제제를 식별하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 독성 유도 약제에 의한 치료 이전에 획득된 제 1 세포 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 단계; (ii) 독성 유도 약제에 의한 치료 이후에 획득된 제 2 세포 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 단계; (iii) 독성 유도 약제 및 제제에 의한 치료 이후에 획득된 제 3 세포 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 단계; 및 (iv) 상기 제 3 표본 내의 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준을 제 1 표본과 비교하는 단계로서; 상기 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택되는 단계를 포함하며; 제 1 표본과 비교하여 제 3 표본 내의 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 거의 동일한 발현 수준은 상기 제제가 약제로 유도되는 독성을 감소시키거나 예방할 수 있음을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 약제로 유도되는 독성은 약제로 유도되는 심장 독성이다. 일 실시예에서, 상기 세포는 심장혈관 시스템의 세포, 예를 들어, 심장근 세포이다. 일 실시예에서, 상기 세포는 당뇨성 심장근 세포이다. 일 실시예에서, 상기 약제는 당뇨, 비만 또는 심장병 치료를 위한 약제 또는 후보 약제이다.
일 실시예에서, 제 1 표본과 비교할 때, 제 3 표본 내의 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 개 모두의 생물학적 표지 인자와 거의 동일한 발현 수준은 상기 약제가 약제로 유도되는 독성을 감소시키거나 예방할 수 있음을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 방법을 필요로 하는 대상에서 약제로 유도되는 심장 독성을 완화, 경감 또는 예방하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 대상(예를 들어, 포유류, 인간, 또는 인간이 아닌 동물)에 본 명세서에서 제공된 선별 방법에 의해 식별된 제제를 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 대상에서 약제로 유도되는 심장 독성을 완화하거나 예방한다. 일 실시예에서, 상기 제제는 이미 심장 독성 유도 약제로 치료를 받은 대상에 투여된다. 일 실시예에서, 상기 제제는 심장 독성 유도 약제에 의한 대상의 치료와 동시에 대상에 투여된다. 일 실시예에서, 상기 제제는 심장 독성 유도 약제에 의한 대상의 치료 이전에 대상에게 투여된다.
본 발명은 본 발명의 방법을 필요로 하는 대상에서 약제로 유도되는 심장 독성을 완화, 경감 또는 예방하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 대상(예를 들어, 포유류, 인간, 또는 인간이 아닌 동물)에 코엔자임 Q10을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 의해 대상에서 약제로 유도되는 심장 독성을 완화하거나 예방한다. 일 실시예에서, 상기 코엔자임 Q10은 이미 심장 독성 유도 약제로 치료를 받은 대상에 투여된다. 일 실시예에서, 상기 코엔자임 Q10은 심장 독성 유도 약제에 의한 대상의 치료와 동시에 대상에 투여된다. 일 실시예에서, 상기 코엔자임 Q10은 심장 독성 유도 약제에 의한 대상의 치료 이전에 대상에게 투여된다. 일 실시예에서, 상기 약제로 유도되는 심장 독성은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어진 군에서 선택되는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 개 모두의 생물학적 표지 인자의 발현의 조절과 연관된다. 앞서의 목록에서 제시된 모든 값들은 또한 본 발명의 일부로서 의도된 범위의 상한 또는 하한일 수 있으며, 예를 들어, 1과 5 사이, 1 과 10 사이, 2와 5 사이, 2와 10 사이, 5와 10 사이의 상기 기술한 유전자(또는 단백질)일 수 있다.
본 발명은 예를 들어, 약제로 유도되는 심장 독성과 같은 심장 독성에 대한 예측적 표지 인자로서 유용한 생물학적 표지 인자(예를 들어, 유전자 및/또는 단백질)를 더 제공한다. 이들 생물학적 표지 인자들은 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ를 포함한다. 그러나, 해당 분야의 통상의 기술자라면 본 명세서에 제공된 방법을 채택하여, 예를 들어, 예 3에 기술된 방법을 사용하되 심장 독성을 유도하는 것으로 알려진 다른 약제를 사용하여 약제로 유도되는 심장 독성을 예측할 수 있는 추가적인 생물학적 표지 인자를 인식할 수 있을 것이다. 본 발명의 예시적 약제로 유도되는 심장 독성 생물학적 표지 인자는 아래에서 기술된다.
GRP78 및 GRP75는 글루코스 반응 단백질로도 불린다. 이들 단백질은 심장근세포의 내형질/근소포체 스트레스(ER 스트레스)와 연관되어 있다. SERCA, 또는 내형질근소포체 칼슘 ATP 분해 효소는 심장 세포 내의 Ca2+ 항상성을 조절한다. 이들 ATP 분해 효소에서 교란이 일어나면 심장 기능 이상 및 심장 질환을 일으킬 수 있다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, GRP75 와 GRP78 및 이들을 둘러싸는 간선들은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자들이다.
TIMP1은 TIMP 금속단백질 분해효소 금지 인자 1로도 불리며, MMP와 연관되어 세포 외 기질의 리모델링과 관련된다. TIMP1 발현은 심장의 섬유 형성과 상호 관련되어 있으며, 혈관 내피의 세포의 저산소 상태 또한 TIMP1 발현을 유도한다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, TIMP1은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자이다.
PTX3는 펜트락신 3로도 불리며, C군의 반응성 단백질(CRP)에 속하고, 심장의 감염 조건의 좋은 표지 인자이다. 그러나, 플라스마 PTX3 또한 패혈증 또는 기타 의학적 조건으로 인한 대표적인 체계적 감염 반응을 나타낸다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, PTX3 심장 기능 또는 심장 독성의 신규의 표지 인자일 수 있다. 또한, 네트워크 내의 PTX 3와 연관된 간선들 또한 생물학적 표지 인자의 신규의 패널을 형성할 수 있다.
HSP76는 HSPA6로도 불리며, 내피의 세포 및 B 림포사이트 내에서 유일하게 발현되는 것으로 알려져 있다. 이 단백질이 심장 기능과 관련하여 하는 역할을 알려져 있지 않다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, HSP76은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자일 수 있다.
PDIA4, PDIA1은 단백질 이황화 이성질화 효소 A 군 단백질로도 불리며, GRP와 마찬가지로 ER 스트레스 반응과 관련되어 있다. 이 단백질이 심장 기능과 관련하여 하는 역할을 알려져 있지 않다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, 이들 단백질들은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자들일 수 있다.
CA2D1는 또한 칼슘 채널, 전압 의존, 알파 2/델타 하위 단위로 불린다. 이 알파-2/델타 소단위의 전위-의존 칼슘 채널은 칼슘 흐름 밀도 및 칼슘 채널의 활성/비활성 동역학을 조절한다. CA2D1은 심장에서의 여기-수축 결합에서 중요한 역할을 한다. 이 단백질이 심장 기능과 관련하여 하는 역할을 알려져 있지 않다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, CA2D1은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자일 수 있다.
GPAT1은 네 개의 알려진 글리세롤-3-인산염 아실전달 효소 동형 단백질 중 햐나이며, 미토콘드리아의 외막에 위치하여, 카르니틴 팔미토일 전달 효소-1과의 상호 조절을 가능하게 해 준다. GPAT1은 인슐린 및 SREBP-1c에 의해 전사와 관련하여 상방으로 조절되며 AMP-활성 단백질 키나아제에 의해 급격하게 하방으로 조절되어, 트리실글리세롤 합성에서의 역할과 일관성을 유지하게 된다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, GPAT1은 약제로 유도되는 심장 독성에 대한 신규의 예측 인자들이다.
TAZ는 타파진으로도 불리며, 심장 및 골격 근육에서 고도로 발현한다. TAZ는 심장 리핀의 대사에 관련되어 있으며 인산지질-라이소인산지질 아실 전달 효소로서 기능한다. 타파진 인산지질 심장리핀(CL)의 리모델링 및 미토콘드리아 내부 막의 신호 지질에 책임이 있다. 본 명세서에서 제공된 데이터를 기반으로, TAZ는 약제로 유도되는 심장 독성의 신규의 예측 인자이다.
B. 표지 인자와 관련된 암
본 발명의 최소한 부분적으로는 암과 관련된 신규의 생물학적 표지 인자의 식별에 기반한다. 이러한 암과 관련된 표지 인자는, 예를 들어, HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및/또는 CANX를 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 표지 인자는 상기 표지 인자들 중 최소한 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물 또는 그 이상의 조합이다.
이에 따라, 본 발명은 암을 유발하거나 암을 유발할 위험이 있는 제제를 식별하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 제제는 약제 또는 약제 후보이다. 이들 방법에서는, 한 쌍의 표본(약제 치료를 겪지 않은 제 1 표본 및 약제 치료를 겪은 제2 표본) 내에서 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자/단백질의 양이 분석된다. 제 1 표본과 비교하여 제 2 표본 내 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 약제가 암을 야기하거나 암을 야기할 위험이 있음을 나타낸다. 일 실시예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 생물학적 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX로 이루어지는 군에서 선택된다. 본 발명의 방법은 해당 분야의 통상의 기술자들이 암을 야기할 위험성이 있는 약제를 식별하기 위해 사용하는 다른 방법과 함께 실시될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 치료의 효능을 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 최소한 치료 식이 요법의 일부를 대상에게 시행하기 이전에 얻어진 제 1 표본 내에 존재하며 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 최소한 치료 식이 요법의 일부를 대상에게 시행한 이후 얻어진 제 2 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이때 제 1 표본과 비교하여 제 2 표본에서의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 치료가 대상에 대한 암을 치료하는데 효과적임을 나타낸다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형 이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 대상이 암에 걸려 있는지를 분석하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하고, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX로 이루어진 군으로부터 선택되며; 또한 상기 방법은 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 제어 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 이때 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자에 상대적인 상기 대상으로부터 얻은 생물학적 표본의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 대상이 암에 걸렸는지를 나타내며, 이에 의해 상기 대상이 암에 걸렸는지를 분석한다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 대상에서 암이 발병할 지를 예단하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 대상으로부터 얻어진 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 또한 상기 방법은 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 제어 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 이때 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자에 상대적인 상기 대상으로부터 얻은 생물학적 표본의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 대상에서 암이 발병할 것으로 예단되는 것을 나타내며, 이에 의해 상기 대상에서 암이 발병할 것으로 추정되는지를 예단한다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 대상에서 암이 재발할지를 예단하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 대상으로부터 얻어진 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 또한 상기 방법은 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 제어 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 이때 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자에 상대적인 상기 대상으로부터 얻은 생물학적 표본의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 대상에서 암이 재발할 것임을 나타내며, 이에 의해 상기 대상에서 암이 재발할 것을 예단한다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 암이 걸린 대상의 생존을 예단하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 대상으로부터 얻어진 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 또한 상기 방법은 대상으로부터 얻은 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 제어 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함하고, 이때 제어 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자에 상대적인 상기 대상으로부터 얻은 생물학적 표본의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준에서의 조절은 상기 대상의 생존을 나타내며, 이에 의해 상기 암에 걸린 대상이 생존할 것으로 예단한다..
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 대상에서 암의 진전을 모니터링하기 위한 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 최소한 치료 식이 요법의 일부를 대상에게 시행하기 이전에 얻어진 제 1 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 최소한 치료 식이 요법의 일부를 대상에게 시행한 이후 얻어진 제 2 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 이에 의해 대상에서의 암의 진전을 모니터링한다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 대상에서 암을 치료하기 위한 화합물을 식별하기 위한 방법을더 제공하며, 상기 방법은 대상으로부터 생물학적 표본을 획득하는 단계; 상기 생물학적 표본을 검사 화합물과 접촉시키는 단계; 및 대상으로부터 획득한 생물학적 표본 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하는 단계로서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX로 이루어진 군으로부터 긍정적 배수 변화 및/또는 부정적 배수 변화로서 선택되는 단계; 상기 생물학적 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 적절한 제어 표본과 비교하는 단계; 및 상기 생물학적 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 부정적 배수 변화로서 감소시키는 검사 화합물 및/또는 상기 생물학적 표본 내의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 긍정적 배수 변화로서 증가시키는 검사 화합물을 선택하는 단계를 포함하며, 이에 의해 대상에서 암을 치료하기 위한 화합물을 식별할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 획득한 액체를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 액체는 혈액, 구토물, 침, 림프, 담낭액, 오줌, 기관지 세척에 의해 얻은 액체, 복막 헹굼에 의해 수집된 액체, 및 부인과 관련 액체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일 실시예에서, 상기 표본은 혈액 표본 또는 이의 성분이다.
또 다른 실시예에서, 상기 표본은 대상으로부터 얻어진 조직 또는 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 조직은 뼈, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장, 및 피부로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, 생물학적 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 표본 내 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 포함한다.
일 실시예에서, 대상 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 표본 내의 단백질 또는 그 부분을 분석함으로써 결정된다. 일 실시예에서, 상기 단백질은 특히 단백질과 결합하는 반응 제제를 사용하여 분석된다.
일 실시예에서, 표본 내 상기 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준은 상기 표본의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역 전사 효소 PCR 분석, 단일 가닥 형태 다형성 분석 (SSCP), 비합치 분열 탐지, 이형 이중가닥 분석, 남부 블로트(블롯) 분석, 북부 블로트 분석, 서부 블로트 분석, 현장 교배, 배열 분석, 디옥시리보핵산 염기서열 결정, 제한 파편 길이 다형성 분석, 및 이들의 조합 또는 하부 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 표본 내에서 상기 표지 인자의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포 계수법, ELISA 및 질량 분광학으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 결정된다.
일 실시예에서, 다수의 표지 인자의 발현 수준이 결정된다.
일 실시예에서, 상기 대상은 환경적 영향제 화합물, 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 항체 치료, 성장 요소에 의한 치료, 사이토카인, 화학치료, 타생의 줄기 세포 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 치료에 의해 치료된다. 일 실시예에서, 상기 환경적 영향제 화합물은 코엔자임 Q10 분자이다.
본 발명은 암을 치료하기 위한 치료의 효능을 분석하는 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 암을 치료하기 위한 치료의 효능을 분석하는 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 대상이 암에 걸렸는지를 분석하는 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 대상이 암에 걸렸는지를 분석하는 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 대상에서 암이 진전될 것인지를 예단하기 위한 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 대상에서 암이 진전될 것인지를 예단하기 위한 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 대상에서 암이 재발할 것인지를 예단하기 위한 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 대상에서 암이 재발할 것인지를 예단하기 위한 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 암의 재발을 예단하기 위한 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 암의 재발을 예단하기 위한 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 암에 걸린 대상이 생존할 것인지를 예단하기 위한 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 암에 걸린 대상이 생존할 것인지를 예단하기 위한 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명은 대상에서의 암의 진전을 모니터링하기 위한 키트를 더 제공하며, 상기 키트는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, 및 CANX 로 이루어지는 군에서 선택되는 최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제와 대상에서의 암의 진전을 모니터링하기 위한 키트의 사용 지침을 포함한다.
본 발명의 키트는 대상으로부터의 생물학적 표본, 제어 표본, 및/또는 환경적 영향을 미치는 화합물을 획득하는 수단을 더 포함한다.
최소한 하나의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 수단은 표본 내의 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 부분을 분석하기 위한 수단 및/또는 표본 내의 단백질 또는 이의 부분을 분석하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 키트는 다수의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 반응 제제를 포함한다.
본 발명의 여러 측면은 이하의 하부 절에서 보다 상세히 설명된다.
C. 분리된 핵산 분자
본 발명의 일 측면은 분리된 핵산 분자에 관한 것으로서, 여기에는 표지 인자 단백질 또는 그 일부를 부호화하는 핵산이 포함된다. 본 발명의 분리된 핵은 또한 표지 인자 핵산 분자, 및 표지 인자 핵산 분자의 파편를 식별하기 위한 잡종 형성 탐침으로 사용하기에 충분한 핵산 분자, 예를 들어, 표지 인자 핵산 분자의 증폭 또는 변이를 위한 PCR 프라이머로 사용하기에 적절한 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산 분자" 는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 DNA 유사체, 또는 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성된RNA를 포함하는 것으로 의도된 것이다. 상기 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 자연적 소스 내에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 분자이다. 일 실시예에서, "분리된" 핵산 분자에는 핵산이 도출되는 기관계의 게놈 DNA 내의 핵산의 측면에 자연적으로 부착되는(즉, 핵산의 5' 및 3' 단에 위치하는 염기서열) 염기서열(바람직하게는 단백질-부호화 염기서열)이 존재하지 않는다. 예를 들어, 다양한 실시예에서, 상기 분리된 핵산 분자는 약 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 핵산이 도출되는 세포의 게놈 DNA 내의 핵산 분자의 측면에 자연적으로 부착되는 뉴클레오타이드 염기서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, cDNA 분자와 갈은 "분리된" 핵산 분자는 세포 물질, 또는 재조합 기술로 생산된 경우 배양 매체가 실질적으로 존재하지 않을 수 있으며, 또는 실질적으로 화학적 전구체 또는 화학적으로 합성된 경우 다른 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 비상동 핵산을 가지는 핵산 분자(본 명세서에서 "오염 야기 핵산"으로도 불린다)의 생산을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 분자생물학 기술 및 본 명세서에서 기술된 데이터베이스 기록 내의 염기서열 정보를 사용하여 분리될 수 있다. 이러한 핵산 염기서열의 전부 또는 일부를 사용하여, 본 발명의 핵산 분자는 표준 잡종 형성 및 복제 기술 (예를 들어, 샘브룩(샘브룩(Sambrook)) 외, ed., 분자의 복제: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스프링 하버 출판사, 콜드 스프링 하버, NY, 1989, 에 설명된 기술)을 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 cDNA, mRNA, 또는 템플릿 및 적절한 올리고뉴클레오타이드 프라이머로서의 게놈 DNA를 사용하여 표준 PCR 증폭 기술에 따라 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 상기 핵산은 적절한 벡터로 복제되고 DNA 염기서열 분석에 의해 특성화될 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분자의 전부 또는 일부에 해당하는 뉴클레오타이드가 표준적 합성 기술, 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 준비될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 표지 인자 핵산의 뉴클레오타이드 염기서열 또는 표지 인자 단백질을 부호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 염기서열을 보완하는 뉴클레오타이드 염기서열을 가지는 핵산 분자를 포함한다. 주어진 뉴클레오타이드 염기서열에 보완적인 핵산 분자는 자신이 주어진 뉴클레오타이드 염기서열에 대해 잡종을 형성할 수 있는 주어진 뉴클레오타이드 염기서열에 충분히 보완적이며, 이에 의해 안정된 듀플렉스를 형성한다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 염기서열의 일부만을 포함할 수 있으며, 이때 전체 길이의 핵산 염기서열은 표지 인자 핵산을 포함하거나 표지 인자 단백질을 부호화한다. 이러한 핵산은, 예를 들어, 탐침 또는 프라이머로 사용될 수 있다. 상기 탐침/프라이머는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 엄격한 조건 하에서 최소한 약 7개, 바람직하게는 약 15개, 보다 바람직하게는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 또는 그 이상의 연속된 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드들의 잡종을 형성하는 뉴클레오타이드 염기서열의 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 염기서열에 기반한 탐침은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 표지 인자에 해당하는 전사체 또는 게놈적 염기서열을 탐지하는데 사용될 수 있다. 상기 탐침은 여기에 부착된 라벨의 그룹, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조 요소를 포함한다. 이러한 탐침은, 예를 들어, mRNA 수준을 탐지하거나 또는 단백질을 부효하하는 유전자가 변이 또는 삭제되었는지를 결정하는 등의 방법으로 대상으로부터의 세포 표본 내의 단백질을 부호화하는 핵산 분자의 수준을 측정함으로써 단백질을 잘못 발현하는 세포 또는 조직을 식별하기 위한 진단적 검사 키트의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명은, 유전학적 코드의 퇴화로 인해, 표지 인자 단백질을 부호화하며 따라서 동일한 단백질을 부호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 염기서열과 다른 핵산 분자를 더 포함한다.
해당 분야의 통상의 기술자라면 아미노산 염기서열에서의 변화에 이르게 하는 DNA 염기서열 다형성이 군집(예를 들어, 인간 군집) 내에 존재할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 유전학적 다형성은 대립 형질 변이로 인해 군집 내의 개별 객체에 존재할 수 있다. 대립 유전자는 주어진 유전학적 발생 장소에서 대체적 방법으로 발생하는 유전자 군 내의 한 유전자이다. RNA 발현 수준에 영향을 주는 DNA 다형성 또한 존재하여 해당 유전자의 전반적 발현 수준에 (예를 들어, 조절 또는 퇴화에 영향을 줌으로써) 영향을 줄 수 있다는 것 또한 인식될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 사용되는, 표현 "대립 형질 이형"은 주어진 발생 위치에서 발생하는 뉴클레오타이드 염기서열 또는 상기 뉴클레오타이드 염기서열에 의해 부호화되는 폴리펩티드를 말한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 표지 인자에 해당하는 폴리펩티드를 부호화하는 개방형 읽기 프레임을 포함하는 핵산 분자를 말한다. 이러한 자연적 대립 형질 변이는 일반적으로 주어진 유전자의 뉴클레오타이드 염기서열 내에서 1-5% 의 변이라는 결과를 가져 온다. 대체적인 대립 유전자는 관심의 대상인 유전자에 대한 다수의 다른 개별적 방법에 의한 염기서열 결정으로 식별될 수 있다. 이는 다양한 객체에서의 동일한 유전학적 발생 위치를 식별하기 위한 잡종 형성 탐침을 사용하여 쉽게 수행된다. 이러한 뉴클레오타이드 변이 및 결과적으로 나타나는 아미노산 다형성 또는 자연적 대립 형질 변이의 결과로서 기능적 활성을 변화시키지 않는 변이들의 어느 일부 또는 전부는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자 는 최소한 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500, 또는 그 이상의 길이를 가지는 뉴클레오타이드를 포함하며 엄격한 조건 하에서 표지 인자 핵산으로 또는 표지 인자 단백질을 부호화하는 핵산으로 잡종을 형성한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "엄격한 조건 하에서의 잡종 형성"는 상호 간에 최소한 60%(65%, 70%, 바람직하게는 75%)가 동일한 뉴클레오타이드 염기서열들이 상호 간에 잡종화되어 존재하는 잡종 형성 및 세척을 위한 조건을 설명하는 것으로 의도된 것이다. 이러한 엄격한 조건들은 해당 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있으며 분자생물학의 현재의 프로토콜, 존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), N.Y. (1989)의 제 6.3.1-6.3.6 절에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 잡종 형성 조건의 바람직한, 비 한정적인 예는 약 45oC의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서의 잡종 형성 및 이후의 50-65oC에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS에 의한 한 번 또는 그 이상의 세척이다.
군집 내에 존재할 수 있는 자연적으로 발생하는 본 발명의 핵산 분자의 대립 형질 변이와 더불어, 통상의 기술자는 염기서열 변화가 변이를 통해 도입되어 이에 의해 부호화된 단백질의 생물학적 활성을 변화시키지 않으면서 이로 인해 부호화된 단백질의 아미노산 염기서열에서의 변화를 야기될 수 있음을 또한 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 아미노산 대체로 이르는 뉴클레오타이드 대체를 "비본질적" 아미노산 잔여부에서 수행할 수 있다. "비본질적" 아미노산 잔여부는 가공되지 않은 유형의 염기서열로부터 생물학적 활성을 변화시키지 않고 변경될 수 있는 잔여부이며, 반면에 "본질적" 아미노산 잔여부는 생물학적 활성을 필요로 한다. 예를 들어, 보존되지 않는 아미노산 잔여부 또는 여러 종들의 상동 중 부분 보존되는 아미노산 잔여부는 활성에 대해 비본질적일 수 있으며, 따라서 변경을 위한 타겟이 될 수 있을 것이다. 대체적인 방법으로, 여러 종들의 상동(예를 들어, 쥐과 동물 및 인간) 간에 보존되는 아미노산 잔여부는 활성에 대해 본질적이며 따라서 변경을 위한 타겟이 되지 않을 것이다.
이에 따라, 본 발명의 또 다른 측면은 활성에 대해 본질적이지 않은 아미노산 잔여부에서의 변화를 포함하는 이형 표지 인자 단백질을 부호화하는 핵산 분자에 관련된 것이다. 이러한 이형 표지 인자 단백질은 아미노산 염기서열에서 자연적으로 발생하는 표지 인자 단백질과 다르지만, 여전히 생물학적 활성을 보유한다. 일 실시예에서, 이러한 이형 표지 인자 단백질은 표지 인자 단백질의 아미노산 염기서열과 최소한 40%가 동일하고, 또한 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 동일한 아미노산 염기서열이다.
이형 표지 인자 단백질을 부호화하는 분리된 핵산 분자는 표지 인자 핵산의 뉴클레오타이드 염기서열에 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 대체, 추가 또는 삭제를 도입하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔여부 대체, 추가, 또는 삭제가 부호화된 단백질에 도입되도록 함으로써 생성될 수 있다. 변이는 부위 방향성의 돌연변이 유발 및 PCR-중재 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게는, 보수적인 아미노산 대체는 하나 또는 그 이상의 예측된 비본질적 아미노산 잔여부에서 일어난다. "보존적인(conservative) 아미노산 대체"는 아미노산 잔여부가 유사한 사이드 체인을 가지는 아미노산 잔여부로 교체되는 대체이다. 유사한 사이드 체인을 가지는 아미노산 잔여부의 군들이 해당 분야에서 정의되어 있다. 이들 군들은 기본 사이드 체인(예를 들어, 라이신, 아르지닌, 히스티딘), 산성 사이드 체인(예를 들어, 아스파르트 산, 글루타민 산), 대전되지 않은 극섬 사이드 체인(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 사이드 체인(예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지 사이드 체인(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 사이드 체인(예를 들어, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가지는 아미노산을 포함한다. 대체적 방법으로, 변이는 포화 돌연변이 유발 등에 의해 부호화 염기서열의 전부 또는 일부를 따라 임의적으로 도입될 수 있으며, 그 결과로 나타나는 변이는 활성을 유지하는 변이를 식별하기 위해 생물학적 활성에 대해 선별될 수 있다. 돌연변이 유발에 이어, 부호화된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있으며 단백질의 활성이 결정될 수 있다.
본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉, 본 발명의 센스 핵산에 보완적인분자, 예를 들어, 이중 가닥 표지 인자 cDNA 분자의 부호화 가닥에 보완적이거나 표지 인자 mRNA 염기서열에 보완적인 분자를 포괄한다. 이에 따라, 본 발명의 안티센스는 본 발명의 센스 핵산에 수소 결합(즉, 아닐링)될 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 부호화 가닥, 또는 이의 일부에만, 예를 들어, 단백질 부호화 영역의 전부 또는 일부(또는 개방 판독 프레임)에 보완적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 표지 인자 단백질을 부호화하는 뉴클레오타이드 염기서열의 부호화 가닥의 비부호화 영역의 전부 또는 일부에도 안티센스일 수 있다. 상기 비부호화 영역("5' 및 3' 비번역 영역")은 부호화 영역 측면에 부착되며 아미노산으로 번역되지 않는 5' 및 3' 염기서열이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 길이에서 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 또는 그 이상인 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산은 해당 분야에서 알려진 화학적 합성 및 효소 결찰(ligation) 반응을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키도록 또는 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 수정된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예를 들어, 포스페트로티오이트 파생체 및 아크리딘 대체 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 수정된 뉴클레오타이드의 예는5-불화우라실, 5-브롬화우라실, 5-염화우라실, 5-요오드화우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에신, 이노신, N6-아이소펜텐이레이드나인, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2- 메틸라데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-마노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-아이소펜텐이레이드나인, 우라실-5-옥시아세틱산(v), 와이부톡소신, 수도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세틱 한 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세틱 산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실, (acp3)w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대체적 방법으로, 상기 안티센스 핵산은 그 안에서 핵산이 안티센스 방향으로 하위 복제되는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생산될 수 있다(즉, 다음 절에서 더 설명되는 것 처럼 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA가 관심 대상 타겟 핵산으로 안티센스 방향이다).
본 명세서에서 사용되는, “핵산” 금지 인자는 타겟의 발현의 감소의 결과를 가져오는 타겟 유전자로부터의 최소한 일부의 RNA 전사체의 잡종을 형성함으로써 타겟의 발현에서의 감소를 야기하는 임의의 핵산 기반 금지 인자이다. 핵산 금지 인자는, 예를 들어, 단일 가닥 핵산 분자, 예를 들어, 안티센스 핵산, 및 siRNA, shRNA, dsiRNA와 같은 이중 가닥핵산(예를 들어, 미국 특허 공보 제 20070104688호 참조)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 이중 가닥 핵산 분자는 최소한 12 개, 바람직하게는 최소한 15개 이상의 뉴클레오타이드 이중 가닥으로 설계된다. 이중 가닥 핵산 분자는 자기 자신을 잡종화하기 위해 설계된 단일 핵산 가닥, 예를 들어, shRNA일 수 있다. 타겟의 핵산 금지 인자는 분리된 핵산으로 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 대체적 방법으로, 상기 핵산 금지 인자는 세포 내에 금지 인자를 생산하기 위한 발현 구조체로서 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 핵산 금지 인자는 활성 및/또는 핵산 금지 인자의 안정성을 개선하기 위한 하나 또는 그 이상의 화학적 수정을 포함한다. 이러한 수정은 해당 분야에서 잘 알려져 있다. 사용되는 상기 특정한 수정은, 예를 들어, 핵산 금지 인자의 유형에 따라 달라질 것이다.
안티센스 핵산 치료용 제제인 단일 가닥 핵산 치료제는 일반적으로 16 내지 30의 길이를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며, 배양 또는 기관계 내의 타겟 세포에서의 타겟 핵산 염기서열에 보완적이다.
안티센스 핵산, 화학적 수정, 및 치료적 사용에 대한 특허가 제공되며, 예를 들어, 화학적으로 수정된 RNA-포함 치료적 화합물에 대한 미국 특허 제 5,898,031호, 및 이들 화합물을 치료용 제제로 사용하는 방법에 대한 미국 특허 제 6,107,094호가 있다. 단일 가닥으로 화학적으로 수정된 RNA 유사 화합물을 투여하여 환자를 치료하는 방법에 대한 미국 특허 제 7,432,250호; 및 단일 가닥으로 화학적으로 수정된 RNA 유사 화합물을 포함하는 약학 성분에 대한 미국 특허 제 7,432,249호. 미국 특허 제 7,629,321호는 다수의 RNA 뉴클레오시드 및 최소한 하나의 화학적 수정을 가지는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 타겟 mRNA를 쪼개는 방법에 대한 것이다. 본 단락에 기술된 이들 각 특허들은 참조에 의해 본 명세서에 통합된다.
많은 실시예에서, 상기 듀플렉스 영역은 길이가 15-30인 뉴클레오타이드 쌍이다. 일부 실시예에서, 상기 듀플렉스 영역은 길이가 17-23인 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17-25인 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 23-27인 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19-21인 뉴클레오타이드 쌍, 또는 길이가 21-23인 뉴클레오타이드 쌍이다.
특정 실시예에서, 각 가닥은 15-30개의 뉴클레오타이드를 가진다.
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 RNAi 제제는 예를 들어, in 2011년 11월 18일에 출원된 미국 예비 출원 제 61/561,710호, 2010년 9월 15일에 출원된 국제 출원 제 PCT/US2011/051597호, 및 PCT 국제 공개 WO 2009/073809에 개시된 화학적 수정이 가해진 제제를 포함하며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 통합된다.
“RNAi 제제,” “이중 가닥 RNAi 제제,” 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자는 “dsRNA 제제,” “dsRNA”, “siRNA”, “iRNA 제제”로도 불리고, 본 명세서에서 교차적으로 사용되며, 두 개의 반대로 평행하고 실질적으로 보완적인 하기에서 정의 되는 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 가지는 리보핵산 분자 복합체를 말한다. 본 명세서에서 사용되는, RNAi 제제는 또한 dsiRNA(예를 들어, 본 명세서에 참조로써 통합된 US 특허 공고 20070104688 참조)를 포함한다. 일반적으로, 각 가닥의 대다수의 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드이지만, 본 명세서에서 기술된 각 가닥 또는 양 가닥은 또한 하나 또는 그 이상의 비 리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 디옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 수정된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 “RNAi 제제”는 화학적으로 수정된 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며; RNAi 제제는 다중 뉴클레오타이드에서의 실질적 수정을 포함할 수 있다. 이러한 수정은 본 명세서에서 개시되거나 해당 분야에서 알려진 모든 유형의 수정을 포함할 수 있다. siRNA 유형 분자에 사용되는 이러한 모든 수정이 본 명세서 및 청구항의 목적을 위한 “RNAi 제제”에 포괄적으로 포함된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥은 하나의 큰 RNA 분자의 서로 다른 부분이거나, 이들 각각이 분리된 RNA 분자일 수 있다. 이러한 두 가닥이 하나의 큰 분자의 일부인 경우, 따라서 한 가닥의 3' 종단과 듀플렉스 구조를 형성하는 각각의 다른 가닥의 5'종단 사이에서 끊기지 않는 뉴클레오타이드 체인으로 연결되어 있는 경우, 이러한 연결 RNA 체인은 “헤어핀 루프”라 불린다. 두 가닥이 3'종단의 한 가닥과 듀플렉스 구조를 형성하는 각각의 다른 가닥의 5'종단 사이의 끊기지 않는 뉴클레오타이드 체인이 아닌 다른 수단으로 공유결합적으로 연결되어 있는 경우, 이러한 연결 구조는 “링커”라 불린다. RNA 가닥들은 동일하거나 다른 개수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 기반 쌍의 최대 개수는 dsRNA의 가장 짧은 가닥 내의 뉴클레오타이드의 개수에서 듀플렉스 내에 존재하는 모든 오버행을 뺀 수이다. 듀플렉스 구조와 더불어, RNAi 제제는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. 용어 “siRNA”는 또한 본 명세서에서 상기 기술한 RNAi 제제를 말하는 것으로 사용된다.
또 다른 측면에서, 상기 제제는 단일-가닥의 안티센스 RNA 분자이다. 안티센스 RNA 분자는 타겟 mRNA 내의 염기서열에 보완적이다. 안티센스 RNA는 mRNA에 염기 짝짓기를 함으로써 화학양론적 방식으로 번역을 억제하고 번역 체계를 물리적으로 차단할 수 있다. Dias, N. 외, (2002) Mol 암 Ther 1:347-355 참조. 상기 안티센스 RNA 분자는 약 15-30개의 타겟 mRNA에 보완적인 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 안티센스 RNA 분자는 표 1의 안티센스 염기서열 중 하나로부터의 최소한 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 인접한 뉴클레오타이드의 염기서열을 가질 수 있다.
용어 “안티센스 가닥”은 실질적으로 타겟 염기서열에 보완적인 영역을 포함하는 이중 가닥 RNAi 제제의 가닥을 말한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 관심 대상 단백질을 “부호화하는 mRNA 부분에 보완적인 영역”은 단백질을 부호화하는 타겟 mRNA 염기서열 부분에 실질적으로 보완적인 안티센스 가닥 상의 영역을 말한다. 보완성의 영역이 타겟 염기서열에 완전히 보완적이지 않은 경우, 이러한 비합치는 대부분 단말 영역에서 감수하게 되며, 이것이 존재하는 경우, 일반적으로 단말 영역 또는 영역들, 예를 들어, 5'및/또는 3'단말의 6, 5, 4, 3, 또는 2 뉴클레오타이드 내에 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “센스 가닥”은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 보완적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 말한다.
다양한 실시예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 예를 들어, 분자의 안정성, 잡종 형성, 또는 용해성을 개선하기 위해 염기 비결합 성분, 당 비결합 성분 또는 인산염 백본에서 수정될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 데옥시리보스 인산염 백본이 펩티드 핵산을 생성하기 위해 수정될 수 있다(Hyrup 외, 1996, Bio 기관 ic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23 참조). 본 명세서에서 사용되는, 용어 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"는 그 안에서 데옥시리보스 인산염 백본이 수도펩티드 백본으로 교체되고 네 개의 자연적 핵 염기만이 유지되는 핵산 모방체, 예를 들어, DNA 모방체를 말한다. PNA의 중성 백본은 낮은 이온 강도의 조건에서 DNA 및 RNA에 대한 특정한 잡종 형성을 허용하는 것으로 밝혀 졌다. PNA 올리고머의 합성은 Hyrup 외 (1996), 상기 설명과 같음; Perry-O'Keefe 외 (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:14670-675에 기술된 표준 고체 상태 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행될 수 있다.
PNA는 치료적 및 진단적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA는, 예를 들어, 전사 또는 번역 억제 또는 금지형 복제를 유도함으로써 유전자 발현의 염기서열-특정한 조절을 위한 항센스 또는 항유전자 제제로서 사용될 수 있다. PNA는 또한, 다른 효소들과 조합하여 사용되는 경우 인위적 제한 효소, 예를 들어, S1 뉴클레아제(Hyrup (1996), 상기 설명과 같음)로서 또는 DNA 염기서열 및 잡종 형성을 위한 탐침 또는 프라이머(하이럽(Hyrup), 1996, 상기 설명과 같음; 피에리오키페(Perry-O'Keefe) 외, 1996, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 93:14670-675)로서, 예를 들어, 유전자 내에서 예를 들어, PNA 방향적 PCR 클램핑에 의한 단일 염기 쌍 변이를 분석하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, PNA는, 예를 들어, 이들의 안정성 또는 세포 흡수를 개선시키기 위해 친유성 또는 기타 도움이 되는 군을 PNA에 부착시킴으로써, PNA-DNA 키메라를 형성함으로써, 또는 리포솜 또는 해당 분야에서 알려진 약 전달에 관한 기타 기술을 사용함으로써 수정될 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 유익한 특성을 결합시킬 수 있는 PNA-DNA 키메라가 생성될 수 있다. 이러한 키메라는 DNA 식별 효소, 예를 들어, PNA 부분이 고 결합 친화성 및 특정성을 제공하면서 리보뉴클레아제 H 및 DNA 중합효소가 DNA 부분과 반응할 수 있게 해 준다. PNA-DNA 키메라는 염기 스태킹, 핵염기 사이의 결합의 개수 및 방향의 관점에서 선택된 적절한 길이의 링커를 사용하여 결합될 수 있다(하이럽(Hyrup), 1996, 상기 설명과 같음). PNA-DNA 키메라의 합성은 하이럽(Hyrup)(1996), 상기 설명과 같음, 및 핀(Finn) 외 (1996) Nuclear Acids Res. 24(17):3357-63에 설명된 대로 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 체인이 고체 지지체 상에 표준 인산라미다이트 결합 화학 및 수정된 뉴클레오시드 유사체를 사용하여 합성될 수 있다. 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 인산라미다이트와 같은 화합물은 PNA와 DNA의 5' 단말 사이의 링크로 사용될 수 있다(마그(Mag) 외, 1989, Nuclear Acids Res. 17:5973-88). PNA 단량체는 5' PNA 세그먼트 및 3' DNA 세그먼트와 키메릭 분자를 생성하기 위해 다시 단계별로 결합될 수 있다(핀(Finn) 외, 1996, Nuclear Acids Res. 24(17):3357-63). 대체적 방법으로, 키메릭 분자는 5' DNA 세그먼트 및 3' PNA 세그먼트로 합성될 수 있다(피터세르(Peterser) 외, 1975, Bioorganic Med . Chem . Lett . 5:1119-11124).
다른 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 펩티드(예를 들어, 생체 내 숙주 세포 수용기 타겟팅을 위해)와 같은 다른 부착된 그룹 또는 세포 막 사이의 이동을 쉽게 해 주는 제제(예를 들어, 레스팅거(Letsinger) 외, 1989, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:6553-6556; 라마이트리(Lemaitre) 외, 1987, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:648-652; PCT 국제 공개 WO 88/09810 참조), 또는 혈액-뇌 장막(예를 들어, PCT 국제 공개 WO 89/10134 참조)을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 잡종 형성-촉발 분리 제제(예를 들어, 크롤(Krol) 외, 1988, Bio /기술s 6:958-976 참조) 또는 삽입 제제(예를 들어, 존(Zon), 1988, Pharm . Res . 5:539-549 참조)로 수정될 수 있다. 이러한 목적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 또 다른 분자, 예를 들어, 펩티드, 잡종 형성 촉발 교차 연결 제제, 이송 제제, 잡종 형성 촉발 분리 제제 등과 켤레를 이룰 수 있다.
본 발명은 또한 분자의 비컨이 표본 내 본 발명의 핵산의 존재를 정량 측정하기에 유용하도록 본 발명의 핵산에 보완적인 최소한 하나의 영역을 가지는 분자의 비컨 핵산을 포함한다. "분자의 비컨" 핵산은 한 쌍의 보완 영역을 포함하며 형광단 및 이와 연관된 형광 소광제를 가지는 핵산이다. 상기 형광단 및 소광제는 보완 영역이 서로 아닐링될 때 형광단의 형광이 소광제에 의해 소광되는 방향으로 핵산의 다른 부분과 연관되어 있다. 핵산의 보완 영역이 서로 아닐링되지 않을 때는, 형광단의 형광은 감소된 정도로 소광된다. 분자의 비컨 핵산은, 예를 들어, 미국 특허 5,876,930에 기술되어 있다.
D. 분리된 단백질 및 항체
본 발명의 일 측면은 표지 인자 단백질 또는 이의 파편에 대하여 항체를 높이기 위한 면역원으로 사용하기에 적절한 폴리펩티드 파편뿐만 아니라 분리된 표지 인자 단백질 및 이의 생물학적으로 활성화된 부분에 관한 것이다. 일 실시예에서, 상기 본래의 표지 인자 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 방법을 사용하여 세포 또는 조직 소스로부터 분리될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 표지 인자 단백질의 전체 또는 세그먼트를 포함하는 단백질 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 단백질 또는 펩티드와 같은 재조합 발현에 대한 대체적 방법이 표준 펩티드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성화된 부분은 이로부터 단백질이 도출되는 세포 물질 또는 세포 또는 조직 소스로부터의 기타 오염 단백질이 실질적으로 존재하지 않거나, 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. "세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는다"는 언어 표현은 단백질이 자신이 분리된 세포의 세포 성분으로부터 분리되거나 재조합적으로 생산되는 단백질의 준비를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 존재하지 않는 단백질은 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량 기준)의 비상동 단백질(본 명세서에서는 "오염 단백질"로도 불림)을 가지는 단백질의 준비를 포함한다. 단백질 또는 이의 생물학적으로 활성화된 부분이 재조합적으로 생산되는 경우, 배양 매체가 실질적으로 없는 것, 즉, 배양 매체가 준비된 단백질 부피의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만을 나타내는 것이 또한 바람직하다. 단백질이 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 실질적으로 없는 것, 즉, 단백질이 단백질의 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질로부터 분리되는 것이 바람직하다. 이에 따라 이러한 단백질의 준비는 화학적 전구체 또는 관심있는 폴리펩티드가 아닌 다른 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5% (건조 중량 기준) 미만으로 포함하도록 한다.
표지 인자 단백질의 생물학적으로 활성화된 부분은 표지 인자 단백질의 아미노산 염기서열에 충분히 동일하거나 이로부터 도출되는 아미노산 염기서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 완전한 길이의 단백질보다 적은 수의 아미노산을 포함하고 해당하는 완전한 길이의 단백질의 최소한 하나의 활성을 보인다. 일반적으로, 생물학적으로 활성화된 부분은 자신과 상응하는 완전한 길이의 단백질의 최소한 하나의 활성의 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명의 단백질의 표지 인자에서 생물학적으로 활성화된 부분은 예를 들어, 10, 25, 50, 100 또는 그 이상의 길이를 가지는 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 표지 인자 단백질의 다른 영역이 삭제되는 다른 생물학적으로 활성화된 부분이 재조합 기술로 제조되고 표지 인자 단백질의 자연적 형태의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 표지 인자 단백질은 상기 예들에서 기술된 임의의 유전자를 부호화하는 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드 염기서열에 의해 부호화된다. 다른 유용한 단백질들은 실질적으로 이러한 염기서열 중 하나와 동일하며(예를 들어, 최소한 약 40%, 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 상응하는 자연적으로 발생하나 자연적 대립 형질 변이 또는 돌연변이 유발로 인해 다른 아미노산 염기서열을 가지는 표지 인자 단백질의 기능적 활성을 가진다.
두 아미노산 염기서열 또는 두 핵산의 백분율 유사성을 결정하기 위해, 상기 염기서열들은 최적의 비교를 위한 목적으로 정렬된다(예를 들어, 제 2 아미노산 또는 핵산 염기서열과의 최적의 정렬을 위해 제 1 아미노산 또는 핵산 염기서열의 염기서열에 간격이 도입될 수 있다). 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치의 아미노산 잔여부 또는 뉴클레오타이드가 이후 비교될 수 있다. 제 1 염기서열 내의 위치가 제 2 염기서열 내 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔여부 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되었을 때는, 상기 분자들은 해당 위치에서 동일하다. 바람직하게는, 두 염기서열 사이의 백분율 유사성은 전역 정렬을 이용하여 계산된다. 대체적 방법으로, 두 염기서열 사이의 백분율 유사성은 국지적 정렬을 이용하여 계산된다. 두 염기서열 사이의 백분율 유사성은 염기서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 개수/전체 위치 개수(예를 들어, 중첩 위치) x100). 일 실시예에서 상기 두 염기서열은 동일한 길이를 가진다. 또 다른 실시예에서, 상기 두 염기서열은 동일한 길이를 갖지 않는다.
두 염기서열 사이의 백분율 유사성 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다. 두 염기서열의 비교를 위해 사용되는 바람직한, 비한정적인 수학적 알고리즘의 예는 다음과 같다: 칼린(Karlin)과 (Altschul)의 알고리즘(1990) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87:2264-2268, 칼린(Karlin)과 (Altschul)의 수정된 알고리즘(1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:5873-5877. 이러한 알고리즘은 BLASTN 및 BLASTX 프로그램, 알스철(Altschul) 외 (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410에 통합되었다. BLAST 뉴클레오타이드 탐색은 본 발명의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오타이드 염기서열을 얻기 위해 BLASTN 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12,을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 염기서열을 얻기 위해 BLASTP 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3,으로 수행될 수 있다. 비교의 목적으로 간격을 가지는 정렬을 얻기 위해서는, Gapped BLAST라 불리는 새로운 버전의 BLAST 알고리즘을 알스철(Altschul) 외 (1997) Nuclear Acid Res . 25:3389-3402에 설명된 대로 활용할 수 있으며, 이 알고리즘은 프로그램 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX에 대해 간격을 가지는 국지적 정렬을 수행할 수 있다. 대체적 방법으로, 분자들 사이의 먼 관계를 탐지하는 PSI-Blast가 반복적 탐색을 수행하기 위해 사용될 수 있다. BLAST Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 활용할 때, 각 프로그램들의 기본 매개변수들(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)이 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov 참조. 염기서열의 비교를 위해 활용되는 또 다른 바람직한 비 한정적인 수학적 알고리즘의 예는 마이어스(Myers)와 밀러(Miller)(1988) CABIOS 4:11-17의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 염기서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되었다. 아미노산 염기서열의 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때는, PAM120 중량 잔여부 테이블, 12의 간격 길이 벌칙, 및 4의 간격 벌칙이 사용될 수 있다. 국지적 염기서열 유사성 및 정렬의 영역을 식별하기 위한 또 다른 유용한 알고리즘으로 FASTA 알고리즘이 있으며, 피어슨(Pearson)과 (Lipman) (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444-2448에 설명되어 있다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 염기서열의 비교를 위해 FASTA 알고리즘을 사용할 때는, PAM120 중량 잔여부 테이블이, 예를 들어, k-tuple 값을 2로 하여 사용될 수 있다.
두 염기서열 사이의 백분율 유사성은 상기 설명한 것과 유사한 기술을 사용하여 또는 간격을 허용하거나 허용하지 않으면서 결정될 수 있다. 백분율 유사성을 계산함에 있어, 정확히 합치되는 것만 계수된다.
본 발명은 또한 표지 인자 단백질 또는 이의 세그먼트를 포함하는 키메릭 또는 융합 단백질을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는, "키메릭 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비상동 폴리펩티드(즉, 표지 인자 단백질이 아닌 폴리펩티드)에 서로 작용하도록 연결된 표지 인자 단백질의 전부 또는 일부(바람직하게는 생물학적으로 활성화된 부분)를 포함한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작용하도록 연결된"이란 표지 인자 단백질 또는 이의 세그먼트 및 비상동 폴리펩티드가 프레임 내에서 서로 융합되어 있음을 나타내기 위한 것이다. 상기 비상동 폴리펩티드는 표지 인자 단백질 또는 세그먼트의 아미노-단말 또는 카르복실-단말에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 표지 인자 단백질 또는 세그먼트가 GST 염기서열의 카르복실 단말로 융합되는 GST 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제를 쉽게 하도록 할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 융합 단백질은 자신의 아미노 단말에서 비상동 신호 염기서열을 포함한다. 예를 들어, 표지 인자 단백질의 자연적인 신호 염기서열은 제거되고 또 다른 단백질의 신호 염기서열로 교체될 수 있다. 예를 들어, 바큐로바이러스 덮개 단백질의 gp67 분비성 염기서열이 비상동 신호 염기서열(아우스벨(Ausubel) 외, ed., 분자생물학에서의 현재 프로토콜, 존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), NY, 1992)로 사용될 수 있다. 진핵 세포 비상동 신호 염기서열의 다른 예는 멜리틴 및 인간 태반의 알칼리 포스타파아제(스트라타 유전자; 라 졸라(La Jolla), 캘리포니아)의 분비성 염기서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 유용한 원핵 세포 비상동 신호 염기서열은 phoA 분비성 신호(샘브룩(Sambrook) 외, 상기 설명과 같음) 및 상기 단백질 A 분비성 신호(Pharmacia Biotech; 피카타웨이, 뉴저지)를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 융합 단백질은 표지 인자 단백질의 전부 또는 일부가 면역 글로불린 단백질 군의 소속 단백질로부터 도출된 염기서열로 융합되는 면역 글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 상기 면역 글로불린 융합단백질들은 약학적 성분으로 통합되어 세포(수용기)의 표면에서 리간드 (용해성 또는 막 부착성)와 단백질 사이의 상호 반응을 억제하기 위해 대상에게 투여될 수 있으며, 이로써생체 내 신호 형질 도입을 억제한다. 상기 면역 글로불린 융합 단백질은 표지 인자 단백질의 유사한 리간드의 생물학적 유용성에 영향을 주기 위해 사용될 수 있다. 리간드/수용기 상호 반응의 금지는 증식성 및 분할성 질환을 치료하고 세포 생존을 조절(예를 들어 촉진 또는 억제)하는데 모두 치료적으로 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 면역 글로불린 융합 단백질들은 대상 내의 표지 인자 단백질 에 대한 항체를 생산하고 리간드를 정제하며 및 선별 분석에서 리간드에 의한 표지 인자 단백질의 상호 반응을 억제하는 분자를 식별하기 위해 면역원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키메릭 및 융합단백질들은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 대체적 방법으로, 유전자 파편의 PCR 증폭이 두 연속된 유전자 파편 간의 보완적 오버행을 일으키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있으며, 이들은 다시 아닐링되고 재증폭되어 키메릭 유전자 염기서열을 생성할 수 있다(예를 들어, Ausubel 외, 상기 설명과 같음 참조). 또한, 융합 비결합 성분(예를 들어, GST 폴리펩티드)을 부호화하는 많은 발현 벡터들이 이미 상용으로 사용 가능하다. 핵산을 부호화하는 본 발명의 폴리펩티드는 융합 비결합 성분이 프레임 내에서 본 발명의 폴리펩티드에 결합되도록 이러한 발현 벡터로 복제될 수 있다.
신호 염기서열이 표지 인자 단백질의 분비 및 분리를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 신호 염기서열은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 쪼개지는 이벤트에서 분비되는 동안 일반적으로 성숙한 단백질로부터 쪼개지는 소수성 아미노산의 스코어에 의해 특징지워진다. 이러한 신호 펩티드는 성숙한 단백질로부터의 신호 염기서열이 분비성 경로를 통과하면서 쪼개지는 것을 허용하는 처리 부위를 포함한다. 따라서, 본 발명은 신호 염기서열이 이로부터 단백질 가수 분해적으로 쪼개진 단백질(즉, 분리 산물)뿐만 아니라 표지 인자 단백질, 융합 단백질 또는 이의 신호 염기서열을 가지는 세그먼트에 관한 것이다. 일 실시예에서, 신호 염기서열을 부호화하는 핵산 염기서열은 발현 벡터 내에서 표지 인자 단백질 또는 이의 세그먼트와 같은 관심 대상 단백질에 작용 가능하게 연결된다. 이러한 상기 신호 염기서열은 발현 벡터가 변환되어 가는 진핵 세포 숙주 등으로부터 단백질의 분비를 일으키며, 상기 신호 염기서열은 이후에 또는 동시에 쪼개진다. 이 단백질은 세포외 매체로부터 해당 분야에 알려진 방법으로 쉽게 정제될 수 있다. 대체적 방법으로, 상기 신호 염기서열은 GST 도메인과 같이 정제를 촉진하는 염기서열을 사용하여 관심 대상 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 표지 인자 단백질의 이형에 관한 것이다. 이러한 이형은 작용 물질(mimetics) 또는 억제 물질 중의 하나로서 작용하는 변경된 아미노산 염기서열을 가지고 있다. 이형은, 예를 들어, 비연속적 점 변이 또는 절단과 같은 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 작용 물질은 자연적으로 발생하는 형태의 단백질의 생물학적 활성과 실질적으로 동일하거나 이의 부분 집합인 활성을 가진다. 단백질의 억제 물질은 자연적으로 발생하는 형태의 단백질의 하나 또는 그 이상의 활성, 예를 들어, 관심 대상 단백질을 포함하는 세포 신호 전달 캐스케이드의 하향 또는 상향 요소로의 완전한 결합을 억제할 수 있다. 따라서, 제한된 기능의 이형에 의한 치료를 통해 특정한 생물학적 효과를 이끌어 낼 수 있다. 이형에 의한 자연적으로 발생하는 형태의 단백질의 생물학적 활성의 부분 집합에 의한 대상의 치료는 자연적으로 발생하는 형태의 단백질에 의한 치료에 비해 대상에서 일어나는 부작용을 줄일 수 있다.
작용 물질(mimetics) 또는 억제 물질 중 하나로서 기능하는 표지 인자 단백질의 이형은 작용 물질 또는 억제 물질 활성에 대한 본 발명의 단백질의 변이, 예를 들어, 절단 변이의 조합적 라이브러리의 선별에 의해 식별될 수 있다. 일 실시예에서, 다양화된 이형의 라이브러리가 조합적 돌연변이 유발에 의해 핵산 수준에서 생성되며 다양화된 유전자 라이브러리에 의해 부호화된다. 이형의 다양화된 라이브러리는, 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 잠재적 단백질 염기서열의 디제너레이트 집합이 개별적 폴리펩티드, 또는, 대체적 방법으로, 보다 큰 융합 단백질(예를 들어, 파지 전시)의 집합으로 발현되도록 유전자 염기서열로 효소적으로 묶어냄으로써 생산될 수 있다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드 염기서열로부터 표지 인자 단백질의 잠재적 이형의 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 디제너레이트 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법이 해당 분야에서 알려져 있다(예를 들어, 나랑(Narang), 1983, Tetrahedron 39:3; 이타쿠라(Itakura) 외, 1984, Annu . Rev . Biochem. 53:323; 이타쿠라(Itakura) 외, 1984, 사이언스 198:1056; 이케(Ike) 외, 1983 Nucliear Acid Res . 11:477 참조).
추가적으로, 표지 인자 단백질의 세그먼트의 라이브러리가 이형 표지 인자 단백질 또는 이의 세그먼트의 선별 및 이후의 선택을 위한 폴리펩티드의 다양화된 군집을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 부호화 염기서열 파편의 라이브러리가 상성이 분자 당 오직 한 번만 일어나는 조건에서 관심의 대상인 부호화 염기서열의 이중 가닥 PCR 파편을 뉴클레아제에 의해 처리함으로써 생성될 수 있으며, 이에 따라 이중 가닥 DNA를 변성시키고, 서로 다른 상성의 제품으로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 DNA를 재생하며, S1 뉴클레아제에 의한 치료에 의해 재형성된 듀플렉스로부터 단일 가닥 부분을 제거하고, 결과적으로 발생하는 파편 라이브러리를 발현 벡터로 묶어 준다. 이 방법에 의해, 여러 크기의 관심이 있는 단백질의 아미노 단말 및 내부 파편을 부호화하는 발현 라이브러리가 도출될 수 있다.
해당 분야에서 점 변이 또는 절단에 의해 만들어진 조합적 라이브러리의 유전자 산물을 선별하고, 선택된 특성을 가지는 유전자 산물을 위한 cDNA 라이브러리를 선별하기 위한 다양한 기술이 알려져 있다. 대형 유전자 라이브러리의 선별을 위해 가장 널리 사용되는 기술은 고성능 출력 분석에 알맞은 방법으로서, 일반적으로 유전자 라이브러리의 복제 가능 발현 벡터로의 복제, 결과적으로 벡터의 라이브러리를 생산하는 적절한 세포 변형, 및 조합적 유전자를 원하는 활성의 탐지가 이로부터의 산물이 탐지되는 유전자를 부호화하는 벡터의 분리를 촉진시키는 조건에서 발현시키는 것을 포함한다. 돌연변이 유발(REM)의 재귀적 모임은, 라이브러리 내의 기능적 변이의 빈도를 향상시키는 기술로서, 본 발명의 단백질의 이형을 식별하기 위해 선별 분석과 조합되어 사용할 수 있다(아킨(Arkin) 및 유르반(Yourvan), 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:7811-7815; 델그레이브(Delgrave) 외, 1993, 단백질 엔지니어링 6(3):327- 331).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 상기 항체는 특히 표지 인자 단백질 또는 이의 파편에 결합한다. 본 명세서에서 교차적으로 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"은 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성화된 부분을 포함하는 파편 및 이의 파생체(즉, 이러한 부분은 특히 표지 인자 단백질, 예를 들어, 표지 인자 단백질의 항원 결정 부위와 같은 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다)뿐만 아니라 면역 글로불린 분자를 말한다. 특히 본 발명의 단백질에 결합하는 항체는 단백질에 결합하는 항체이지만, 실질적으로 표본 내 다른 분자, 예를 들어, 자연적으로 단백질을 포함하는 생물학적 표본에는 결합하지 않는다. 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성화된 부분의 예는 단일 체인 항체(scAb), F(ab) 및 F(ab')2 파편을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 분리된 단백질 또는 이의 파편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 완전한 길이의 단백질이 사용되거나, 대체적 방법으로, 본 발명은 면역원으로 사용할 수 있는 항원적 펩티드 파편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 상기 항원적 펩티드는 본 발명의 단백질들 중 하나의 아미노산 염기서열의 최소한 8(바람직하게는 10, 15, 20, 또는 30 또는 그 이상)개의 아미노산 잔여부를 포함하며, 단백질의 최소한 하나의 항원 결정 부위를 포괄하여 펩티드에 대해 올라간 항체가 단백질과 특정한 면역 복합체를 형성하도록 한다. 항원적 펩티드가 포괄하는 바람직한 항원 결정 부위는 단백질의 표면상에 위치한 영역, 예를 들어, 친수성 영역이다. 소수성 염기서열 분석, 친수성 염기서열 분석, 또는 유사한 분석들이 친수성 영역을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 분리된 표지 인자 단백질 또는 이의 파편이 면역원으로 사용된다.
면역원은 일반적으로 토끼, 염소, 생쥐 또는 기타 포유류 또는 척추 동물과 같이 적절한(즉, 면역 능력을 가진) 대상이 면역력을 가지게 함으로써 항체를 준비하는데 사용된다. 적절한 면역원의 준비는, 예를 들어, 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 상기 준비는 프로인드(Freund)의 완전하거나 불완전한 보조제와 같은 보조제, 또는 유사한 면역 자극 인자의 제제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 면역원 성분은, 예를 들어, 본 발명의 단백질의 재조합 발현을 위한 비인간 숙주 세포를 사용하여 만들어진 면역원 성분과 같은 인간 단백질 외에는 포함하지 않는 성분이다. 이러한 방식에서, 결과적인 항체 성분이 감소하거나 본 발명의 단백질외의 다른 어떠한 인간 단백질의 결합도 가지지 않는다.
본 발명은 다중 복제 및 단일 복제 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 복제 항체" 또는 "단일 복제 항체 성분"은 특정한 항원 결정 부위와 면역적으로 반응할 수 있는 오직 한 종의 항원 결합 부위만을 포함하는 항체 분자의 군집을 말한다. 바람직한 다중 복제 및 단일 복제 항체 성분은 본 발명의 단백질에 대한 항체에 대해서 선택된 성분이다. 특히 바람직한 다중 복제 및 단일 복제 항체 준비는 표지 인자 단백질 또는 이의 파편에 대한 항체만을 포함하는 것이다.
다중 복제 항체는 적절한 대상을 면역원으로서의 본 발명의 단백질에 고정시킴으로써 제조될 수 있다. 면역화된 대상에서 상기 항체의 시간이 지남에 따른 역가는 고정화된 폴리펩티드를 사용하는 효소 결합 면역 흡수 분석(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 모니터링될 수 있다. 면역화 후 적절한 시간 후, 예를 들어, 상기 특정한 항체 역가가 최고일 때, 항체 생산 세포가 대상으로부터 획득되어, 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein) (1975) 네이처 256:495-497에 원래 기술된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(코즈보르(Kozbor) 외, 1983, Immunol . Today 4:72 참조), EBV-하이브리도마 기술 (콜(Cole) 외, pp. 77-96 In 단일 복제 항체 및 암 치료, Alan R. Liss, Inc., 1985 참조) 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 의해 단일 복제 항체(mAb)를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 상기 기술은 잘 알려져 있다(일반적으로 면역학에서의 현재 프로토콜, 콜리건(Coligan) 외 ed., 존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), 뉴욕, 1994 참조). 단일 복제 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포들이, 예를 들어, 표준 ELISA 분석을 사용하여, 관심있는 폴리펩티드에 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상층액을 선별함으로써 탐지된다.
단일 복제 항체-분비 하이브리도마를 생산하는 것에 대한 대체적 방법으로, 본 발명의 단백질에 대항하는 단일 복제 항체가 식별될 수 있으며, 재조합으로 조합된 면역 글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 전시 라이브러리)를 관심있는 폴리펩티드로 선별함으로써 분리될 수 있다. 파지 전시 라이브러리를 생성하고 선별하기 위한 키트가 상업적으로 사용 가능하다(예를 들어, 파마시아의 재조합 파지 항체 시스템, 카탈로그 제 27-9400-01호; 및 스트라타 유전자 SurfZAP 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 제 240612호). 추가적으로, 방법 및 반응 제제의 예, 특히 항체 디스플레이 라이브러리의 생성과 선별에 사용할 수 있는 예는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,223,409호; PCT 국제 공개 WO 92/18619; PCT 국제 공개 WO 91/17271; PCT 국제 공개 WO 92/20791; PCT 국제 공개 WO 92/15679; PCT 국제 공개 WO 93/01288; PCT 국제 공개 WO 92/01047; PCT 국제 공개 WO 92/09690; PCT 국제 공개 WO 90/02809; 푸쉬(Fuchs) 외(1991) Bio /기술 9:1370-1372; 헤이(Hay) 외(1992) Hum . Antibod . Hydromas 3:81-85; 휴즈(Huse) 외(1989) 사이언스 246:1275- 1281; 그리피스(Griffiths) 외(1993) EMBO J. 12:725-734에서 찾아 볼 수 있다.
본 발명은 또한 특히 본 발명의 단백질에 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 바람직한 실시예에서, 상기 재조합 항체는 특히 표지 인자 단백질 또는 이의 파편에 결합한다. 재조합 항체는 인간 및 비인간 부분을 모두 포함하는 키메릭 및 인간화된 단일 복제 항체, 단일 체인 항체 및 다중 특정 항체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 키메릭 항체는 쥐과 동물 mAb로부터 도출된 변수 영역과 인간 면역 글로불린 상수 영역과 같이 다른 부분들이 다른 동물 종으로부터 도출되는 분자이다. (예를 들어, 참조에 의해 전체적으로 본 명세서에 통합된 카빌리(Cabilly) 외, 미국 특허 제 4,816,567호; 및 보스(Boss) 외, 미국 특허 제 4,816,397호 참조). 단일 체인 항체는 하나의 항원 결합 부위를 가지며 단일 폴리펩티드를 포함한다. 이들은 해당 분야에 알려진 기술, 예를 들어 다음 문헌 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다: 래드너(Ladner) 외, 미국 특허 제 4,946,778호(본 명세서에서 참조에 의해 전체적으로 통합된다); 버드(Bird) 외, (1988) 사이언스 242:423-426; 위트로우(Whitlow) 외, (1991) 효소학의 방법 2:1-9; Whitlow 외, (1991) 효소학의 방법 2:97-105; 및 허스튼(Huston) 외, (1991) 효소학의 방법 분자 설계 및 모델링 : 개념 및 적용 203:46-88. 다중 특정 항체는 특히 다른 항원에 결합하는 최소한 둘 항원-결합 부위를 가지는 항체 분자이다. 이러한 분자는 해당 분야에 알려진 기술, 예를 들어 다음 문헌 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다: 세갈(Segal), 미국 특허 제 4,676,980호(문헌의 개시는 참조에 의해 전체적으로 본 명세서에 통합되었다); 홀링거(Holliger) 외, (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448; 위트로우(Whitlow) 외, (1994) Protein Eng . 7:1017-1026 및 미국 특허 제 6,121,424호.
인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 비인간 종으로부터의 보완성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역 글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 가지는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다. (예를 들어, 참조에 의해 전체적으로 본 명세서에 통합된 미국 특허 제 5,585,089호 참조.) 인간화된 단일 복제 항체는 해당 분야에 알려진 기술, 예를 들어 다음 문헌 기술된 방법을 사용하여 생성될 수 있다: PCT 국제 공개 WO 87/02671; 유럽 특허 출원 제 184,187호; 유럽 특허 출원 제 171,496호; 유럽 특허 출원 제 173,494호; PCT 국제 공개 WO 86/01533; 미국 특허 제 4,816,567호; 유럽 특허 출원 제 125,023호; 베터(Better) 외(1988) 사이언스 240:1041-1043; 리우(Liu)외 (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:3439-3443; 리우(Liu) 외(1987) J. Immunol . 139:3521- 3526; 선(Sun) 외(1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:214-218; 니시무라(Nishimura) (1987) Cancer Res . 47:999-1005; 우드(Wood) 외 (1985) 네이처 314:446-449; 및 쇼(Shaw) 외(1988) J. Natl . Cancer Inst . 80:1553-1559); 모리슨(Morrison)(1985) 사이언스 229:1202-1207; 오이(Oi) 외 (1986) Bio /Technics 4:214; 미국 특허 제 5,225,539호; 존스(Jones) 외 (1986) 네이처 321:552-525; 베르호이언(Verhoeyan) 외 (1988) 사이언스 239:1534; 및 바이들러(Beidler) 외 (1988) J. Immunol . 141:4053-4060.
보다 특정적으로, 인간화된 항체는, 예를 들어, 내생 면역 글로불린의 무겁고 가벼운 체인 유전자를 발현할 능력을 가지지 않으나 인간의 무겁고 가벼운 체인 유전자를 발현할 수 있는 형질 전환 생쥐를 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 형질 전환 생쥐는 정상적 방법으로 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 표지 인자에 해당하는 전부 또는 일부의 폴리펩티드로 면역화된다. 항원에 대한 단일 복제 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 사용하여 획득할 수 있다. 상기 인간 면역 글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화 동안 재정렬되는 상기 형질 전환 생귀에 의해 자리를 잡으며, 이후 종류 변환 및 신체적 변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 제조하는 것이 가능하다. 인간 항체 제조를 위한 이러한 기술에 대한 검토는 론버그(Lonberg)와 허스자르(Huszar) (1995) Int . Rev . Immunol . 13:65-93를 참조할 수 있다. 인간 항체와 인간 단일 복제 항체 및 이러한 항체를 제조하기 위한 프로토콜에 대한 이러한 기술의 상세한 설명은, 예를 들어, 미국 특허 5,625,126; 미국 특허 5,633,425; 미국 특허 5,569,825; 미국 특허 5,661,016; 및 미국 특허 5,545,806을 참조할 수 있다. 또한, 아브제닉스(Abgenix, Inc. (Freemont, CA)) 사와 같은 회사들이, 상기 기술된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하기 위해 협력을 맺을 수 있다.
선택된 항원 결정 부위를 인식하는 완전히 인간적인 항체는 "안내된 선택"으로 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근 방식에서 선택된 비인간 단일 복제 항체, 예를 들어, 쥐과 동물 항체가 동일한 항원 결정 부위를 인식하는 완전히 인간적인 항체의 선택을 안내하기 위해 사용된다(제스퍼스(Jespers) 외, 1994, Bio /Technics 12:899-903).
본 발명의 항체는 생산 이후에 분리될 수 있으며(예를 들어, 대상의 혈액 또는 혈청으로부터) 또는 해당 분야에 잘 알려진 기술에 의해 합성 및 더 정제될 수 있다. 예를 들어, IgG 항체는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명의 단백질에 특정한 항체는 선택되거나(예를 들어, 부분적인 정제), 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 재조합적으로 발현되고 정제된(또는 부분적으로 정제된) 본 발명의 단백질은 본 명세서에 설명된 대로, 또한, 예를 들어, 크로마토그래피 기둥과 같은 고체 지지체에 공유 결합적으로 또는 비공유 결합적으로 결합되어 생산된다. 상기 기둥은 많은 수의 서로 다른 항원 결정 부위에 대한 항체를 포함하는 표본으로부터의 본 발명의 단백질들에 특정한 항체를 정제하여 친화성을 가지게 하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 실질적으로 정제된 항체 성분, 즉, 실질적으로 오염 항체가 없는 항체 성분을 생성한다. 실질적으로 정제된 항체 성분은, 본 발명의 맥락에서, 항체 표본이 원하는 본 발명의 단백질이 아닌 항원 결정 부위에 대한 오염 항체를 최대 30%(건조 중량 기준) 이하로 포함하며, 바람직하게는 표본의 최대 20%, 보다 바람직하게는 최대 10%, 및 가장 바람직하게는 최대 5%(건조 중량 기준)가 오염 항체인 것을 의미한다. 정제된 항체 성분은 성분 내의 최소한 99%의 항체가 본 발명의 바람직한 단백질에 대한 것임을 의미한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 상기 실질적으로 정제된 항체는 특히 본 발명의 단백질의 신호 펩티드, 분비된 염기서열, 외부세포 영역, 막 관통이나 세포질막 영역, 또는 세포질막에 결합될 수 있다. 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명의 상기 실질적으로 정제된 항체는 특히 본 발명의 단백질의 아미노산 염기서열의 분비된 염기서열 또는 외부 세포 영역에 결합된다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 실질적으로 정제된 본 발명의 항체는 특히 표지 인자 단백질의 아미노산 염기서열의 분비된 염기서열 또는 외부 세포 영역에 결합된다.
본 발명의 단백질에 대항하는 항체는 친화성 크로마토그래피 또는 면역 침강법과 같은 표준 기술에 의해 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 더구나, 이러한 항체는 표지 인자의 발현의 수준 및 패턴을 평가하기 위해, (예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상층액 내의) 표지 인자 단백질 또는 이의 파편을 탐지하는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 주어진 치료 식이 요법의 효능을 결정하기 위한 임상적 절차의 일부로서 조직 또는 체액 내의 단백질 수준(예를 들어 체액과 연관된 질병 상태 또는 독성 상태에서)을 진단적으로 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 탐지는 항표지 인자 항체를 탐지 가능물질에 결합하는 본 발명의 항체를 포함하는 항체 파생체를 사용하여 쉽게 수행될 수 있다. 탐지 가능물질의 예는 여러 효소, 보족기, 형광 물질, 발광성 물질, 생물발광 물질, 및 방사능 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스타파아제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸촐린에스테라제를 포함하며; 적절한 보족기 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오딘 및 아비딘/비오딘을 포함하며; 적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐라민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리티린을 포함하며; 발광성 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시퍼린, 및 아에쿼린을 포함하며; 적절한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 항체는 암을 치료하기 위한 치료용 제제로 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 완전하게 인간적인 본 발명의 항체는 특히 암을 가지는 인간의 암 환자의 치료적 치료제로서 사용될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 항체, 특히 표지 인자 단백질 또는 이의 파편에 결합하는 항체는 치료적 처리를 위해 사용된다. 또한, 이러한 치료적 항체는 세포 독소와 같은 치료적 비결합 성분과 켤레를 이루는 항체를 포함하는 항체 파생체 또는 면역 독소, 치료용 제제 또는 방사성 금속 이온이다. 세포 독소 또는 세포 독성 제제는 세포에 해가 되는 모든 제제를 포함한다. 그 예는 탁솔, 산이토찰라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트란마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토테론, 글루코코티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로파놀롤, 및 퓨로마이신 및 유사체 또는 이의 상동. 치료용 제제는 항대사 물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-불화우라실 데카바자인), 알킬화 제제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 메팔란, 카르머스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이콘덴세호스파마이드, 부설판, 디브로모마니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로나아민 플라티늄(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신(이전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 댁티노마이신(이전의 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신(AMC)), 및 항유사 분열 제제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 켤레 항체는 주어진 생물학적 반응을 변화시키기 위해 사용될 수 있으며, 약제의 비결합 성분은 고전적 화학적 치료용 제제에 한정되지 않는 것으로 추정되어야 한다. 예를 들어, 약제 비결합 성분은 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 리보좀 억제 단백질(베터(Better) 외, 미국 특허 제 6,146,631호 참조, 상기 문헌의 개시는 본 명세서에 전체적으로 통합된다), 아브린, 리신 A, 수도모나스 엑소독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 요소, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 신경 성장 요소, 혈소판 도출 성장 요소, 조직 플라스미노겐 활성 인자와 같은 단백질; 또는, 예를 들어, 림포킨, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 그래뉼로사이트 마크로파제 군체 자극 요소("GM-CSF"), 그래뉼로사이트 군체 자극 요소("G-CSF")와 같은 생물학적 반응 변경 인자, 또는 기타 성장 요소를 포함할 수 있다.
이러한 치료적 비결합 성분을 항체에 켤레로 만드는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 다음 문헌을 참조할 수 있다: 아르논(Arnon) 외, "암 치료에서 약제의 면역 타게팅을 위한 단일 복제 항체", in 단일 복제 항체 및 암 치료, 라이스필드(Reisfeld) 외(eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); 헬스트롬(Hellstrom) 외, " 약 전달을 위한 항체", 제어된 약 전달(제 2판), 로빈슨(Robinson) 외(eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); 소르페(Thorpe), "암 치료에서 세포 독성 제제의 항체 담체: 리뷰", 단일 복제 항체 '84: 생물학적 및 임상적 적용, 핀체라(Pinchera[ 외(eds.), pp. 475-506 (1985); "암 치료에서 방사성 라벨링된 항체의 치료적 사용의 분석, 결과, 및 향후 전망", 암 탐지 및 치료를 위한 단일 복제 항체, 볼드윈(Baldwin) 외 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 소르페(Thorpe) 외, "항체-독소 켤례의 준비 및 세포 독성 특성", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
이에 따라, 한 측면에서, 본 발명은 실질적으로 정제된 항체, 항체 파편 및 파생체를 제공하며, 이들 모두는 특히 본 발명의 단백질 및 바람직하게는, 표지 인자 단백질에 결합한다. 다양한 실시예에서, 상기 실질적으로 정제된 본 발명의 항체, 또는 파편 또는 이의 파생체는 인간, 비인간, 키메릭 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 비인간 항체, 항체 파편 및 파생체를 제공하며, 이들 모두는 특히 본 발명의 단백질, 바람직하게는, 표지 인자 단백질에 결합한다. 이러한 비인간 항체는 염소, 생쥐, 양, 말, 닭, 쥐 또는 쥐의 항체일 수 있다. 대체적 방법으로, 본 발명의 상기 비인간 항체는 키메릭 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 또한, 상기 비인간 본 발명의 항체는 다중 복제 항체 또는 단일 복제 항체일 수 있다. 또 다른 부가적인 측면에서, 본 발명은 단일 복제 항체, 항체 파편 및 파생체를 제공하며, 이들 모두는 특히 본 발명의 단백질, 바람직하게는, 표지 인자 단백질에 결합한다. 상기 단일 복제 항체는 인간 및 인간화된 항체, 키메릭 및/또는 비인간 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 탐지 가능 물질에 짝지어질 수 있는 본 발명의 항체를 포함하는 키트, 및 사용 지침을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 성분을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 약학적 성분은 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
E. 예측적 의약품
본 발명은 진단적 분석, 예후의 분석, 약물 유전체학, 및 검사 및 임상적 조사가 예후의(예측적) 목적으로 사용되어 이에 의해 개별적 예방적 활동을 수행하는 예측적 의약품의 분야에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명의 한 측면은 개체가 특정 질병 또는 약제로 유도되는 독성을 진전시킬 위험이 있는 지를 결정하기 위하여 단백질 또는 핵산의 하나 또는 그 이상의 표지 인자의 발현 수준을 결정하기 위한 진단적 분석에 관한 것이다. 이러한 분석은 예후의 또는 예측적 목적으로 사용될 수 있으며, 이에 의해 질환이 시작되기 이전에 개체를 예방적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상적 시도에서 제제(예를 들어, 질환 또는 약제로 유도되는 독성을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 목적 중 하나로 투여되는 약제 또는 기타 화합물{즉 이러한 치료가 가지는 약제로 유도되는 독성 효과를 이해하기 위해})의 본 발명의 표지 인자의 발현 또는 활성에 대한 영향을 모니터링하는 것에 대한 것이다. 이들 및 기타 다른 제제들은 이후의 절에서 보다 상세히 설명된다.
F. 진단적 분석
생물학적 표본 내 표지 인자 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부존재를 결정하기 위한 예시적 방법은 검사 대상으로부터 생물학적 표본(예를 들어 독성 관련 체액 또는 조직 표본)을 획득하는 단계 및 생물학적 표본을 폴리펩티드 또는 핵산(예를 들어, mRNA, 게놈 DNA, 또는 cDNA)를 탐지할 수 있는 화합물 또는 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 따라서 본 발명의 탐지 방법은, 예를 들어, 생체 내 생물학적 표본뿐만 아니로 생체 외 생물학적 표본에 대해서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈 DNA를 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 탐지를 위한 생체 외 기술은 북부 잡종 형성 및 부위 내 잡종 형성을 포함한다. 표지 인자 단백질의 탐지를 위한 생체 외 기술은 효소 결합 면역 흡수 분석(ELISA), 서부 블롯, 면역 침강법 및 면역 형광법을 포함한다. 게놈 DNA 탐지를 위한 생체 외 기술은 남부 잡종 형성을 포함한다. mRNA 탐지를 위한 생체 내 기술은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 북부 잡종 형성 및 부위 내 잡종 형성을 포함한다. 또한, 표지 인자 단백질의 탐지를 위한 생체 내 기술은 대상으로 단백질 또는 이의 파편에 대한 라벨링된 항체를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 항체는 대상 내에서의 존재 및 위치가 표준 영상화 기술로 탐지될 수 있는 방사성 표지 인자로 라벨링될 수 있다.
이러한 진단적 및 예후의 분석의 일반적 원리는 표지 인자를 포함할 수 있는 표본 또는 반응 혼합물을 준비하고, 및 표지 인자 및 탐침이 반응하고 결합하기에 충분한 적절한 조건하에서 적절한 시간 동안 탐색하여, 반응 혼합물 내에서 제거되고, 또한/또는 탐지될 수 있는 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 이러한 분석들은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다.
예를 들어, 이러한 분석을 수행하는 한 방법은 표지 인자 또는 탐침을 기질으로도 불리는 고체 상 지지체에 안착시키는 단계, 및 반응의 마지막에 상기 고체 상 지지체에 안착된 타겟 표지 인자/탐침 복합체를 탐지하는 단계를 포함할 수 있을 것이다. 이러한 방법의 일 실시예에서, 표지 인자의 존재 및/또는 농도에 대해 분석될 대상으로부터의 표본은 담체 또는 고체 상 지지체에 안착될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 탐침이 고체 상에 안착될 수있고 대상으로부터의 표본이 분석에서 안착되지 않은 성분으로서 반응할 수 있는 반대의 상황도 가능하다.
분석 성분을 고체 상에 안착시키기 위한 많은 방법이 확립되어 있다. 이러한 방법은 한정되지 않으면서, 비오딘 및 스트렙타비딘의 켤레 결합을 통해 고정되는 표지 인자 또는 탐침 분자를 포함한다. 이러한 비오딘화딘 분석 성분은 해당 분야에 알려진 기술(예를 들어, 비오딘화 키트, 피어스(Pierce) 케미컬, 록포드, IL)을 사용하여 비오딘-NHS (N-하이드록시-석시니마이드)으로부터 제조될 수 있으며, 스트렙타비딘-코팅된 96 개의 웰 플레이트(Pierce 케미컬)의 웰에 고정될 수 있다. 특정 실시예에서, 고정된 분석 성분을 가지는 상기 표면은 미리 준비되어 저장될 수 있다.
이러한 분석을 위한 다른 적절한 담체 또는 고체 상태 지지체는 상기 표지 인자 또는 탐침이 속하는 분자의 계열을 결합할 능력이 있는 어떠한 물질도 포함한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라아제, 자연적 및 수정된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 가브로, 및 마그네타이트를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
상기 언급된 접근 방식으로 분석을 수행하기 위해, 고정되지 않은 성분이 제 2 성분이 그 위에 장착되는 고체 상태에 추가된다. 반응이 완료되고 난 후, 복합되지 않은 성분들은 형성된 모든 복합물이 고체 상태 상에 고정되어 유지된다는 조건 하에 (예를 들어, 세척에 의해) 제거될 수 있다. 고체 상에 안착한 표지 인자/탐침 복합체의 탐지는 본 명세서에 개략적으로 설명된 다수의 방법에 의해 성취될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 탐침은, 안착되지 않은 분석 성분인 경우, 본 명세서에서 논의된 탐지 가능 라벨 및 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 라벨을 사용하여 직접적 또는 간접적으로 분석의 탐지 및 해독의 목적으로 라벨링될 수 있다.
표지 인자/탐침 복합체 형성을, 추가적으로 조작하거나 또는 양 성분(표지 인자 또는 탐침)을 라벨링하지 않고, 예를 들어 형광 에너지 이전(예를 들어, 라코윅즈(Lakowicz) 외, 미국 특허 제 5,631,169호; 스타브리아노포울로스(Stavrianopoulos) 외, 미국 특허 제 4,868,103호 참조) 방법을 활용하여 탐지하는 것도 가능하다. 제 1 '도너' 분자 상의 형광단 라벨은 적절한 파장 길이의 입사광이 여과될 때, 이로부터 방출된 형광 에너지가 제 2 '수용기' 분자의 형광 라벨에 흡수되도록 선택되며, 이는 다시 흡수된 에너지로 인해 형광을 발생시킬 수 있다. 대체적 방법으로, '도너' 단백질 분자는 단순히 트립토판 잔여부의 자연적 형광 에너지를 활용할 수 있다. 라벨은 '수용기' 분자 라벨이 '도너' 분자 라벨로부터 구분될 수 있게 하기 위해 다른 파장 길이의 빛을 방출하도록 선택된다. 라벨들 사이의 에너지 전달 효율이 분자를 분리시키는 거리에 관계되기 때문에, 분자들 사이의 공간적 관계가 평가된다. 결합이 분자들 간에 일어나는 상황에서는, 분석 내의 '수용기' 분자 라벨의 형광 방출이 최대로 되어야 한다. FET 결합 이벤트는 해당 분야에서 잘 알려져 있는 표준 형광 검출 탐지 수단을 통해 간편하게 측정될 수 있다(예를 들어, 형광 검출기를 사용).
또 다른 실시예에서, 표지 인자를 인식할 수 있는 탐침의 능력의 결정은 두 분석 성분(탐침 또는 표지 인자)을 라벨링하지 않고 실시간 바이오분자 상호 반응 분석(BIA)(예를 들어, 스졸랜더(Sjolander, S.) 및 우르바닉스키(Urbaniczky, C.), 1991, Anal . Chem . 63:2338-2345 및 스자보(Szabo) 외, 1995, Curr . Opin . Struct . Biol . 5:699-705 참조)과 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, “BIA” 또는 “표면 플라스몬 공명”은 어떠한 반응물(예를 들어, BIA 코어)도 라벨링하지 않으면서 생물학적 특정 상호 반응을 실시간으로 연구하기 위한 기술이다. 결합 표면 (결합 이벤트를 나타냄)에서의 질량 변화는 결과적으로 표면 근처에서의 빛의 굴절률 변화로 나타나며(표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학적 성질), 결과적으로 생물학적 분자 사이의 실시간 반응을 나타내는 것으로 사용될 수 있는 탐지 가능 신호로 나타난다.
대체적 방법으로, 또 다른 실시예에서, 유사한 진단적 및 예후의 분석이 액상에서 표지 인자 및 탐침을 용질로 하여 수행될 수 있다. 이러한 분석에서, 상기 복합화된 표지 인자 및 탐침은 복합화되지 않은 성분으로부터 다수의 표준 기술 중 하나로 분리되며, 이러한 기술은 분별 원심 분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역 침강법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 분별 원심 분리에서, 표지 인자/탐침 복합체는 복합되지 않은 분석 성분으로부터 자신들의 서로 다른 크기 및 밀도를 기반으로 침착의 평형이 다른 점을 이용하여 일련의 원심분리 단계를 통해 분리될 수 있다(예를 들어, 리바스(Rivas, G.) 및 민튼(Minton, A.P.), 1993, Trends Biochem Sci . 18(8): 284-7 참조). 복합된 분자를 복합되지 않은 분자로부터 분리하기 위해 표준 크로마토그래피 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 크기를 기반으로 분자를 분리하며, 예를 들어, 기둥 양식 내에서 적절한 겔 여과 수지를 활용함으로써, 상대적으로 큰 복합 분자가 상대적으로 작은 비복합 성분으로부터 분리될 수 있다. 마찬가지로, 표지 인자/탐침 복합체의 비복합 성분과 비교하여 상대적으로 다른 전하의 성질을 사용하여, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 수지의 활용을 통해 복합 성분을 비복합 성분으로부터 구분할 수 있다. 이러한 수지와 크로마토그래피 기술은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 히가드(Heegaard, N.H.), 1998, J. Mol . Recognit . 윈터(Winter) 11(1-6):141-8; 하지(Hage, D.S.), 및 트위드(Tweed, S.A.) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525 참조). 겔 전기영동 또한 복합환된 분석 성분을 결합되지 않은 성분과 분리하기 위해 채택될 수 있다(예를 들어, 아우수벨(Ausubel) 외, ed., 분자생물 학에서의 현 재 프로토콜, 존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), 뉴욕, 1987-1999 참조). 이러한 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합제는, 예를 들어, 크기 또는 전하를 기반으로 분리될 수 있다. 전기영동 과정 동안 결합 상호 반응을 유지하기 위해, 일반적으로 환원 제제가 없는 비 변성 겔 매트릭스 물질 및 조건들이 바람직하다. 특정한 분석 및 이의 성분에 적절한 조건들은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
특정한 실시예에서, 상기 표지 인자 mRNA의 수준은 생물학적 표본 내의 부위 상 및 생체 외 양식에 의해 해당 분야에서 알려진 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 용어 "생물학적 표본"은 조직, 세포, 생체액 및 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 액체뿐만 아니라 대상으로부터 분리된 이들의 분리물을 포함하도록 의도된 것다. 많은 발현 탐지 방법은 분리된 RNA를 사용한다. 생체 외 방법에 대해, mRNA의 분리와 반대로 선택하지 않는 어떠한 RNA 분리 기술도 세포로부터 RNA를 분리하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 아우수벨(Ausubel) 외, ed., 분자생물학에서의 현재 프로토콜, 존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), 뉴욕 1987-1999 참조). 또한, 많은 수의 조직 표본들이 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술, 예를 들어, 촘크진스키(Chomczynski)(1989, 미국 특허 제 4,843,155호)의 단일 단계 RNA 분리 과정을 사용하여 쉽게 처리될 수 있다.
상기 분리된 mRNA는 잡종 형성 또는 증폭 분석에서 사용될 수 있으며, 이는 남부(Southern) 또는 북부(Northern) 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 탐침 배열을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. mRNA 수준의 탐지를 위한 바람직한 한 진단적 방법은 분리된 mRNA를 탐지되고 있는 유전자에 의해 부호화된 mRNA에 잡종을 형성할 수 있는 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 핵산 탐침은, 예를 들어, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 표지 인자를 부호화하는 mRNA 또는 게놈적 DNA에 잡종을 형성할 수 있는 최소한 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 길이의 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드와 같은 완전한 길이의 cDNA, 또는 이의 부분일 수 있다. 본 발명의 진단적 분석을 위해 사용할 수 있는 다른 적절한 탐침이 본 명세서에 기술되어 있다. 탐침에 의한 mRNA의 잡종 형성은 문제가 되는 표지 인자가 발현되고 있음을 나타낸다.
한 양식에서, 상기 mRNA는 고체 표면 상에 고정되고, 예를 들어, 분리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 작동하게 하고 mRNA를 겔로부터 니트로셀룰로오즈와 같은 막으로 이동시킴으로써 탐침에 접촉된다. 또 다른 양식에서는, 탐침(들)이 고체 표면 상에 고정되고 mRNA가, 예를 들어, 아피메트릭스(Affymetrix) 사의 유전자 칩 배열 내의 탐침(들)에 접촉된다. 해당 분야의 통상의 기술자라면 알려진 mRNA 탐지 방법을 본 발명의 표지 인자에 의해 부호화된 mRNA의 수준을 탐지하기 위해 적응시킬 수 있을 것이다.
표본 내 mRNA 표지 인자의 수준을 결정하기 위한 한 대체적 방법은 핵산 증폭 과정, 예를 들어, RT-PCR(멀리스(Mullis), 1987, 미국 특허 제 4,683,202호에 개시된 실험적 실시예), 리가아제 연쇄 반응(바라니(Barany), 1991, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 88:189-193), 자체 지지 염기서열 복제(구아텔리(Guatelli) 외, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87:1874-1878), 전사적 증폭 시스템(쿼(Kwoh) 외, 1989, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:1173-1177), Q-베타 복제 효소(리자디(Lizardi) 외, 1988, Bio /Technics:1197), 구르는 원 복제(리자디(Lizardi) 외, 미국 특허 제 5,854,033호) 또는 기타 다른 핵산 증폭 방법에 의해 수행될 수 있고, 이후 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 증폭된 분자의 탐지가 이어진다. 이러한 탐지 기술 체계는 핵산 분자가 매우 적은 개수로 존재하는 경우에 핵산 분자의 탐지에 특히 유용하다. 본 명세서에서 사용되는, 증폭 프라이머는 유전자의 5'또는 3'영역(각각 플러스 및 마이너스 가닥, 또는 그 반대)에 아닐링될 수 있으며 사이의 짧은 영역을 포함하는 핵산 분자의 쌍인 것으로 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10 내지 30의 길이를 가지는 뉴클레오타이드이며 영역 약 50 내지 20의 길이를 가지는 뉴클레오타이드로부터의 측면 영역을 포함한다. 적절한 조건 및 적절한 반응 제제 하에서, 이러한 프라이머는 프라이머에 의해 측면 부착된 뉴클레오타이드 염기서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 가능케 한다.
부위 내(in situ) 방법을 위해, mRNA는 탐지 이전에 분리될 필요가 없다. 이러한 방법에서, 세포 또는 조직 표본이 알려진 조직학적 방법을 사용하여 준비/처리된다. 이 표본은 이후 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드 상에 고정되고, 다시 표지 인자를 부호화하는 mRNA로 잡종을 형성할 수 있는 탐침에 접촉된다.
표지 인자의 절대적 발현 수준을 기반으로 결정을 내리는 방법에 대한 대안으로, 이러한 결정은 표지 인자의 정규화된 발현 수준을 기반으로 내릴 수 있다. 발현 수준은 표지 인자의 절대적 발현 수준을 표지 인자가 아닌 유전자, 예를 들어, 구성요소로서 발현되는 항존(housekeeping) 유전자의 발현과 비교하여 교정함으로써 정규화된다. 정규화를 위한 적절한 유전자는 액틴 유전자와 같은 항존 유전자 또는 상피 세포 특정 유전자를 포함한다. 이러한 정규화를 통해 하나의 표본, 예를 들어, 환자 표본에서 다른 표본, 예를 들어, 비 질병 또는 비독성 표본으로, 또는 다른 소스로부터의 표본들 사이에서의 발현 수준의 비교가 가능하다.
대체적인 방법으로, 상기 발현 수준은 상대적 발현 수준을 제공할 수 있다. 표지 인자의 상대적 발현 수준을 결정하기 위해, 문제가 되는 표본의 발현 수준을 결정하기 이전에, 상기 표지 인자의 발현 수준은 정상 대비 분리된 질병 또는 독성 세포의 10개 또는 그 이상의 표본, 바람직하게는 50 또는 그 이상의 표본에 대해 결정된다. 많은 개수의 표본 내에서 분석된 유전자의 평균 발현 수준이 결정되며 이는 표지 인자에 대한 기준치 발현 수준으로 사용된다. 검사 표본에 대해 결정된 표지 인자의 발현 수준(절대적 발현 수준)은 이후 해당 표지 인자로부터 획득한 평균 발현 값으로 나누어진다. 이는 상대적 발현 수준을 제공한다.
바람직하게는, 기준치 결정에 사용된 표본은 비질병 또는 비독성 세포로부터 유래된 것이어야 한다. 세포 소스의 선택은 상대적 발현 수준의 사용에 따라 달라진다. 정상 조직에서 발견되는 발현을 평균 발현 스코어로 사용하는 것은 분석된 표지 인자가 질병 또는 독성에 특정한지(정상 세포 대비)를 증명하는데 도움이 된다. 또한, 보다 많은 데이터가 축적됨에 따라, 평균 발현 값이 개정될 수 있으며, 축적된 데이터를 기반으로 보다 개선된 상대적 발현 값을 제공하게 된다. 질병 세포 또는 독성 세포로부터의 발현 데이터는 질병 또는 독성 상태의 심각성에 대한 단계를 판별하는 수단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 표지 인자 단백질이 탐지된다. 본 발명의 단백질의 표지 인자를 탐지하기 위한 바람직한 제제는 이러한 단백질 또는 이의 파편에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 탐지 가능 라벨을 가진 항체이다. 항체는 다중 복제될 수 있으며, 또는 보다 바람직하게는, 단일 복제될 수 있다. 순수한 항체, 또는 파편 또는 이의 파생체(예를 들어, Fab 또는 F(ab')2)가 사용될 수 있다. 용어 탐침 또는 항체에 대해 "라벨링된"은, 직접적으로 라벨링된 반응 제제와 반응시킴으로써 탐침 또는 항체를 간접적으로 라벨링시키는 것뿐만 아니라, 탐지 가능물질을 탐침 또는 항체에 커플링(즉, 물리적 연결)시킴으로써 탐침 또는 항체의 직접적 라벨링을 포괄하도록 의도된 것이다. 간접적 라벨링의 예는 형광적으로 라벨링된 이차 항체를 사용한 일차 항체의 탐지 및 비오딘에 의한 DNA 탐침의 종단 라벨링하여 형광적으로 라벨링된 스트렙타비딘으로 탐지될 수 있도록 하는 것을 포함한다
세포로부터의 단백질은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 채택된 단백질 분리 방법으로는, 예를 들어, 할로우(Harlow)와 레인(Lane)(할로우(Harlow)와 레인(Lane), 1988, 항체: A Laboratory Manual, 콜드 스프링 하버 출판사, 콜드 스프링 하버, 뉴욕)에 기술된 방법이 채택될 수 있다.
다양한 양식들이 표본이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 포함하는 지를 결정하기 위해 채택될 수 있다. 이러한 양식의 예는 효소 면역 분석 (EIA), 방사선 면역 분석 (RIA), 서부 블롯 분석 및 효소 연관 면역 흡수체 분석 (ELISA)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자라면 알려진 단백질/항체 탐지 방법을 세포가 본 발명의 표지 인자를 발현하는지를 결정하기 위해 적응시킬 수 있을 것이다.
한 양식에서, 항체, 또는 항체 파편 또는 파생체가 서부 블롯 또는 면역 형광법 기술과 같은 방법에서 발현된 단백질을 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 사용에 있어서, 일반적으로 항체 또는 단백질 중 하나를 고체 지지체 상에 고정시키는 것이 뱌람직하다. 적절한 고체 지지체 또는 담체는 항원 또는 항체를 결합시킬 수 있는 지지체를 포함한다. 잘 알려진 지지체 또는 담체는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에틸렌, 덱스트란, 아밀라아제, 자연적 및 수정된 셀룰로오즈, 폴리아크릴아미드, 가브로, 및 마그네타이트를 포함한다.
해당 분야의 통상의 기술자라면 결합 항체 또는 항원을 위한 적절한 담체를 알고 있을 것이며, 이러한 담체를 본 발명을 위해 사용할 수 있도록 적응시킬 수 있을 것이다. 예를 들어, 질병 또는 독성 세포로부터 분리되 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에서 구동될 수 있으며 니트로셀룰로오즈와 같은 고체 상태 지지체에 고정될 수 있다. 이 지지체는 이후 적절한 버퍼로 세척된 후 탐지 가능하도록 라벨링된 항체로 처리될 수 있다. 상기 고체 상태 지지체는 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 버퍼로 수회 세척될 수 있다. 이 후 고체 지지체 상의 결합 라벨의 양이 통상적인 수단에 의해 탐지될 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 표본 내 표지 인자 단백질 또는 핵산의 존재를 탐지할 수 있는 키트를 포괄한다. 이러한 키트는 대상이 특정한 질병 또는 약제로 유도되는 독성을 겪고 있거나 이를 개발할 위험성에 처해 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 생물학적 표본 내의 표지 인자 단백질 또는 핵산을 탐지할 수 있는 라벨링된 화합물 또는 제제, 및 단백질 또는 표본 내 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단(예를 들어, 단백질 또는 이의 파편에 결합하는 항체, 또는 단백질을 부호화하는 DNA 또는 mRNA 에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 탐침)을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 상기 키트를 사용하여 획득한 결과를 해석하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
항체 기반 키트에 대해, 이러한 키트는, 예를 들어: (1) 표지 인자 단백질에 결합되는 제 1 항체 (예를 들어, 고체 지지체에 부착); 및, 선택적으로, (2) 상기 단백질 또는 제 1 항체에 결합되며 탐지 가능 라벨의 켤레가 되는 제 2의 다른 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 기반 키트에 대해, 상기 키트는, 예를 들어: (1) 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 표지 인자 단백질을 부호화하는 핵산 염기서열로 잡종을 형성하는 탐지 가능하게 라벨링된 올리고뉴클레오타이드, 또는 (2) 표지 인자 핵산 분자를 증폭하기에 유용한 프라이머의 쌍을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한, 예를 들어, 버퍼링 제제, 보존제, 또는 단백질 안정 제제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 탐지 가능 라벨(예를 들어, 효소 또는 기질)을 탐지하기 위해 필요한 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 분석되어 검사 표본에 비교될 수 있는 제어 표본 또는 일련의 제어 표본들을 포함할 수 있다. 상기 키트의 각 성분은 개별적 컨테이너에 수용될 수 있으며, 다수의 컨테이너 모두가 키트를 사용하여 수행된 분석의 결과를 해석하기 위한 지침과 함께 단일 패키지 내에 있을 수 있다.
G. 약물 유전체학
본 발명의 표지 인자는 또한 약물 유전체학적 표지 인자로서 유용하다. 본 명세서에서 사용되는 “약물 유전체학적 표지 인자”는 그 발현 수준이 환자 내의 특정한 임상적 약 반응 또는 민감도와 상호 관련되는 객관적인 생화학적 표지 인자이다(예를 들어, 맥레오드(McLeod) 외 (1999) Eur . J. Cancer 35(12): 1650-1652 참조). 약물 유전체학적 표지 인자 발현의 존재 또는 양은 환자의 예측된 반응, 보다 특정적으로는 특정한 약제 또는 약제의 종류에 의한 치료에 대한 질병에 걸린 환자 또는 독성 세포의 반응과 관련된다. 환자 내에서 하나 또는 그 이상의 약물 유전체학적 표지 인자의 발현의 존재 또는 그 양을 분석함으로써, 환자에 대해 가장 적절한 약제 치료, 또는 성공의 정도가 가장 클 것으로 예상되는 치료가 선택될 수 있다. 예를 들어, 환자 내에서 특정한 종양 표지 인자에 의해 부호화된 RNA 또는 단백질의 존재 또는 양을 기반으로, 환자 내에 존재할 수 있는 특정한 종양의 치료에 최적화된 약제 또는 치료 과정이 선택될 수 있다. 따라서, 약물 유전체학적 표지 인자의 사용은 다른 약제나 치료 체계를 사용하지 않고도 각 암 환자에 대한 가장 적절한 치료를 선택하거나 설계할 수 있게 해 준다.
약물 유전체학의 또 다른 측면은 신체가 약제에 반응하는 양식을 변경시키는 유전학적 조건을 다루는 것이다. 이러한 약학적, 유전학적 조건은 희귀한 결함 또는 다형성으로서 발생할 수 있다. 예를 들어, 글루코스-6-인산염 디하이드로제나제(G6PD) 결핍은 흔한 유전적 효소 질환으로서 주요 임상적 합병증은 옥시던트 약제(항 말라리아 제, 설폰아마이드, 진통제, 니트로퓨란)의 섭취 또는 잠두(fava bean)의 소모 이후의 혈액 용균이다.
예시적 실시예로서, 대사 활동 효소의 약제 활성은 강도 및 약제의 작용 기간 모두를 결정하는 주요 요소이다. 약제 대사 효소(예를 들어, N-아세틸기 전이효소 2 (NAT 2) 및 시토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전학적 다형성의 발견은 왜 일부 환자들에게 기대되었던 약의 효과가 나타나지 않는지, 또는 왜 약제를 표준 양으로 안전하게 투여한 이후에 과도한 약제 반응 및 심각한 독성이 나타나는지에 대한 설명을 제공하였다. 이러한 다형성은 군집 내의 두 표현형인 확장된 대사 인자(EM) 및 빈약한 대사 인자(PM)로 표현된다. PM의 우열은 다른 군집들 사이에서 다르게 나타난다. 예를 들어, CYP2D6를 위한 유전자 부호화는 고도의 다형성을 보이며 다양한 변이가 PM에서 식별되었는데, 이는 모두 기능적 CYP2D6의 부재를 초래하였다. CYP2D6 및 CYP2C19의 빈약한 대사 인자는 이들이 표준 투여량을 수용할 때 매우 자주 과도한 약제 반응 및 부작용을 경험한다. 대사 물질이 능동적인 치료적 비결합 성분이라면, PM은 치료적 반응을 보이지 않을 것이며, 이는 이의 CYP2D6 형성 대사 물질 모르핀에 의한 코데인 중재의 진통제 효과에서 보여진다. 다른 극단적 상태는 소위 매우 빠른 대사 인자라 불리는 것으로 표준 투약에 반응하지 않는 것이다. 최근에, 매우 빠른 대사의 분자적 기반이 CYP2D6 유전자 증폭 덕분에 식별되었다.
따라서, 본 발명의 표지 인자의 발현 수준의 결정은 이에 의해 개인의 치료제 또는 예방적 치료제를 위한 적절한 제제(들)을 선택할 수 있도록 개별적으로 결정될 수 있다. 또한, 약제 대사 효소를 부호화하는 다형성 대립 유전자의 유전 형질 분석을 개별적 약제의 반응성 표현형의 식별에 적용하기 위해, 약제 유전학적 연구가 사용될 수 있다. 이러한 지식이 약제의 투여 또는 이의 선택에 적용되는 경우, 부작용이나 또는 치료에서의 실패를 피할 수 있으며, 따라서 대상을 본 발명의 표지 인자의 발현의 조절 인자로 치료할 때 치료제 또는 예방제의 효율을 향상시킬 수 있다.
H. 임상적 시도의 모니터링
제제(예를 들어, 약제 화합물)가 본 발명의 표지 인자의 발현 수준에 미치는 영향을 모니터링하는 것은 기본적인 약제 선별뿐만 아니라, 임상적 시도에도 적용할 수 있다. 예를 들어, 표지 인자 발현에 영향을 미치는 제제의 효율성은 암, 당뇨, 비만, 심장 혈관 질병, 및 심장 독성, 또는 약제로 유도되는 독성과 같은 특정 질병에 대한 치료를 받는 환자의 임상적 시도에서 모니터링될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 제제(예를 들어, 작용 물질, 억제 물질, 펩티도미메트릭, 단백질, 펩티드, 핵산, 소형 분자, 또는 기타 약제 후보)를 사용한 대상의 치료의 효율성을 모니터링하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 제제의 투여 이전에 대상으로부터을 획득하는 단계; (ii) 투여 전 표본 내의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 선택된 표지 인자의 발현 수준을 탐지하는 단계; (iii) 대상으로부터 하나 또는 그 이상의 투여 후 표본을 획득하는 단계; (iv) 투여 후 표본 내의 표지 인자의 발현 수준(들)을 탐지하는 단계; (v) 상기 투여 전 표본 내의 표지 인자의 발현 수준(들)을 투여 후 표본 또는 표본 내의 표지 인자의 발현 수준(들)과 비교하는 단계; 및 (vi) 상기 결과에 따라 투여 대상에 대한 제제의 투여를 변경하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 치료 과정 중의 표지 인자 유전자(들)의 증가된 발현은 효과적인 투여를 나타낼 수 있으며 투여량을 늘리는 것이 바람직함을 보일 수 있다. 반대로, 표지 인자 유전자(들)의 감소된 발현은 효과적인 치료를 나타낼 수 있으며 투여량을 변화시킬 필요가 없음을 보일 수 있다.
H. 배열
본 발명은 또한 본 발명의 표지 인자로 이루어진 배열을 포함한다. 상기 배열은 배열 내에서 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 배열은 배열 내의 유전자의 조직 특정성을 확인하기 위해 조직 내의 유전자 발현을 분석하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식에서, 약 760개까지의 유전자가 발현에 대해 동시에 분석될 수 있다. 이는 특히 하나 또는 그 이상의 조직들에서 발현된 유전자의 배터리를 보여 주는 프로필을 개발하게 해 준다.
이러한 정성적 결정과 더불어, 본 발명은 유전자 발현의 정량 측정을 가능케 한다. 따라서, 조직 특정성뿐만 아니라, 조직 내 유전자의 배터리의 발현 수준 또한 확인이 가능하다. 따라서, 유전자는 이들의 조직 발현 자체 및 해당 조직 내 발현 수준을 기반으로 군을 형성할 수 있다. 이는, 예를 들어, 조직 사이 또는 이들 중의 유전자 발현의 관계를 확인하는데 유용하다. 따라서, 하나의 조직이 교란되고 다른 조직에서의 유전자 발현에 대한 효과가 결정될 수 있다. 이러한 맥락에서, 생물학적 자극에 대한 반응으로서, 한 세포 유형의 또 다른 세포 유형에 대한 효과가 결정된다. 이러한 결정은, 예를 들어, 유전자 발현 수준에서 세포-세포 상호 반응을 알아 내는데 유용하다. 제제가 하나의 세포 유형을 치료하기 위해 치료적으로 투여되었으나 다른 세포 유형에서는 바람직하지 못한 효과를 보이는 경우, 본 발명은 상기 바람직하지 못한 효과에 대한 분자 기반의 분석을 제공하며, 따라서 이에 대처할 수 있는 제제를 보조적으로 투여하거나 상기 바람직하지 못한 효과를 다른 방법으로 치료할 수 있는 기회를 제공한다. 마찬가지로, 단일 세포 유형 내에서도, 바람직하지 않은 생물학적 효과가 분자 수준에서 결정될 수 있다. 따라서, 타겟 유전자 이외의 발현에 대한 제제의 효과가 확인되고 이에 대한 대책이 마련될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 배열은 배열 내 하나 또는 그 이상의 유전자의 발현의 시간적 전개를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이는 본 명세서에서 개시된 여러 생물학적 맥락에서 발생할 수 있으며, 예를 들어 약제로 유도되는 독성의 전개, 약제로 유도되는 독성의 진전 및 약제로 유도되는 독성과 관련된 세포 변형과 같은 과정을 포함한다.
상기 배열은 동일한 세포 내의 다른 유전자 또는 서로 다른 세포 내에서의 발현에 대한 유전자의 발현 효과를 확인하는데도 유용하다. 이는, 예를 들어, 최종적 또는 하향 타겟이 조절될 수 없는 경우에 치료적 시술을 위한 대안적 분자의 타겟의 식별을 제공한다.
상기 배열은 또한 정상 및 비정상 세포 내의 하나 또는 그 이상의 유전자의발현 패턴을 확인하는데 유용하다. 이는 진단 또는 치료적 시술을 위한 분자의 타겟으로 작용할 수 있는 유전자의 배터리를 제공한다.
VII . 표본 획득을 위한 방법
본 발명의 방법에서 유용한 표본은 본 발명의 표지 인자를 표현하는 조직, 세포, 생체 검사, 또는 신체의 액체 표본을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 표본은 조직, 세포, 전체 혈액, 혈청, 플라스마, 구강 내 표본, 침, 뇌척수액, 오줌, 기관, 또는 기관지 폐포 세척액이다. 바람직한 실시예에서, 상기 조직 표본은 질병 상태 또는 독성 상태 표본이다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 조직 표본은 암 표본, 당뇨 표본, 비만 표본, 심장혈관 표본 또는 약제로 유도되는 독성 표본이다.
신체 표본은 해당 분야에서 알려진 다양한 기술, 예를 들어, 생체 검사에 의해, 또는 부위를 긁거나 문지름으로써, 또는 바늘을 사용하여 체액을 추출하는 등의 기술을 사용하여 대상으로부터 획득할 수 있다. 여러 신체 표본을 수집하는 방법은 해당 분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 표지 인자를 탐지하고 정량 측정하기에 적절한 조직 표본은 신선하거나, 냉동되거나, 해당 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법에 따라 고정될 수 있다. 적절한 조직 표본은 바람직하게는 절개되고 추가 분석을 위해 현미경 슬라이드 상에 놓여진다. 대체적 방법으로, 고체 표본, 즉, 조직 표본이 용액화되고, 또한/또는 균일화되고 이후 용해성 추출물로서 분석된다.
일 실시예에서, 신선하게 획득되는 생체 검사 표본은, 예를 들어, 액체 질소 또는 디플로로디클로로메탄을 사용하여 냉동된다. 상기 냉동된 표본은, 예를 들어, OCT를 사용하여 구획하기 위해 장착되며, 저온 유지 장치 내에 일련 구획을 제공한다. 상기 일련의 구획들은 유리 현미경 슬라이드 상에 수집된다. 면역 조직화학 검사 염색을 위해 상기 슬라이드들은 구?牡? 슬라이드 상에 고정되어 유지되도록 하기 위해, 예를 들어, 크롬-알룸, 겔라틴 또는 폴리-L-라이신으로 코팅될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 표본들은 고정되고 구획 전에 삽입된다. 예를 들어, 조직 표본은, 탈수되어, 예를 들어, 파라핀에 삽입된, 예를 들어, 포르말린으로 고정될 수 있다.
일단 표본이 획득되면 본 발명의 표지 인자를 탐지하고 정량 측정하기에 적절한 해당 분야에서 알려진 방법이 사용될 수 있다(핵산 또는 단백질 수준 중 하나에서). 이러한 방법은 해당 분야에서 잘 알려져 있으며, 서부 블롯, 북부 블롯, 남부 블롯, 면역조직화학, ELISA, 예를 들어, 증폭된 ELISA, 면역 침강법, 면역 형광법, 유동 세포 계수법, 면역세포화학, 질량 분광계 분석, 예를 들어, MALDI-TOF 및 SELDI-TOF, 핵산 잡종 형성 기술, 핵산 역 전사 방법, 및 핵산 증폭 방법을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시예에서, 본 발명의 표지 인자의 발현은, 예를 들어, 특히 이들 단백질에 결합하는 항체를 사용하여 단백질 수준에서 탐지된다.
표본은 항체 결합에 접근할 수 있는 본 발명의 표지 인자를 만들기 위해 수정될 수 있다. 면역세포화학 또는 면역조직화학 방법의 특정한 측면에서, 슬라이드들은 치료 전 버퍼로 옮겨 지고, 항원 접근성을 높이기 위해 선택적으로 가열될 수 있다. 치료 전 버퍼 내에서의 표본의 가열은 세포의 지질 이중 레이어를 빠르게 교란시키며, 항원(신선한 표본의 경우에 해당할 수 있으나, 고정된 표본에서는 일반적으로 발생하지 않음)에 항체 결합을 위해 보다 쉽게 접근되도록 한다. 용어 "치료 전 버퍼" 및 "준비 버퍼"는 특히 항체 결합에 대한 본 발명의 표지 인자의 접근성을 증가시킴으로써 면역 염색을 위한 세포학 또는 조직학 표본을 준비하기 위해 본 명세서에서 사용되는 버퍼를 말하기 위해 교차적으로 사용되었다. 치료 전 버퍼는 pH-특정 염 용액, 중합체, 세제, 또는 비이온성 또는 음이온성 계면활성제, 예를 들어, 알카노염 또는 알콕시염 또는 이들 계면활성제들의 혼합물까지를 포함하는 에틸록시화 음이온 또는 비이온 계면활성제, 또는 담즙염의 사용까지도 포함할 수 있다. 치료 전 버퍼는, 예를 들어, 0.1% 내지 1%의 데옥시콜릭 산 용액, 나트륨 염, 또는 나트륨 라우레스-13-카르복실염(예를 들어, 산도판(Sandopan) LS) 용액 또는 및 에톡시화 음이온 복합체일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 사전 치료 버퍼는 슬라이드 저장 버퍼로도 사용될 수 있다.
표지 인자 본 발명의 단백질들을 항체 결합을 위해 보다 접근하기 쉽게 만드는 어떠한 방법도 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있으며, 여기에는 항원 확보를 위해 해당 분야에서 알려진 방법들이 포함된다. 예를 들어, 비보(Bibbo) 외 (2002) Acta . Cytol. 46:25-29; Saqi, 외 (2003) Diagn . Cytopathol. 27:365-370; 비보(Bibbo) 외 (2003) Anal. Quant . Cytol . Histol. 25:8-11을 참조할 수 있으며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 통합된다.
표지 인자 단백질 접근성을 증가시키기 위한 사전 치료에 뒤이어, 표본들을 적절한 차단 제제, 예를 들어, 수소 퍼옥사이드와 같은 퍼옥시다제 반응 차단 제제를 사용하여 차단할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 표본은 항체의 비특정 결합을 방지하기 위한 반응 제제를 차단하는 단백질을 사용하여 차단할 수 있다. 상기 단백질 차단 반응 제제는, 예를 들어, 정제된 카세인을 포함할 수 있다. 항체, 특히 본 발명의 표지 인자에 결합하는 단일 복제 또는 다중 복제 항체는 표본과 함께 배양된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 일부 경우에 보다 정확한 예단 또는 진단이 환자 표본 내의 표지 인자 본 발명의 단백질 상의 다중 항원 결정 부위를 탐지함으로써 획득될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 표지 인자의 서로 다른 항원 결정 부위에 작용하는 최소한 두 항체가 사용된다. 하나를 초과하는 항체가 사용되는 경우, 이들 항체는 단일 표본에 개별적 항체 반응 제제로서 연속적으로, 또는 항체 칵테일로서 동시에 추가될 수 있다. 대체적 방법으로, 각각의 개별적 항체가 동일한 환자로부터 분리된 표본에 추가될 수 있으며, 그 결과가 데이터 풀 내에 보관된다.
항체 결합을 탐지하는 기술은 해당 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명의 표지 인자에 대한 항체 결합은 항체 결합의 수준에 해당하는 탐지 가능 신호를 생성하는 화학적 반응 제제의 사용을 통해 탐지될 수 있으며, 이에 따라, 표지 인자 단백질 발현의 수준을 탐지할 수 있다. 본 발명의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법 중 하나에서, 항체 결합은 라벨링된 중합체의 켤레가 되는 이차 항체의 사용을 통해 탐지된다. 라벨링된 중합체의 예는 중합체-효소 켤레를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 복합체 내의 상기 효소는 일반적으로 항원-항체 결합 부위에서의 발색체의 침착을 촉진시키기 위해 사용되며, 이에 의해 결과적으로 관심 대상 생물학적 표지 인자결과의 발현 수준에 해당하는 세포 염색을 가져 온다. 특별한 관심 대상 효소는 호스래디시 퍼옥시다제 (HRP) 및 알칼리 포스타파아제(AP)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 특정한 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법에서, 본 발명의 표지 인자에 대한 항체 결합은 제 2 항체의 켤레가 되는 HRP-라벨링된 중합체의 사용을 통해 탐지된다. 항체 결합은 또한 종에 특정한 탐침 반응 제제를 사용하여 탐지될 수 있으며, 이때 이 제제는 종에 특정한 탐침 반응 제제에 결합하는 HRP의 켤레인 단일 복제 또는 다중 복제 항체, 및 중합체에 결합한다. 슬라이드는 항체 결합을 위해 임의의 발색제, 예를 들어, 발색제 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 착색되고, 이후 헤마톡실린으로 대응 착색되며, 선택적으로, 암모늄 하이드록사이드 또는 TBS/Tween-20과 같은 청색화 제제로 착색된다. 다른 적절한 발색체는, 예를 들어, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 포함한다. 본 발명의 일부 측면에서, 슬라이드는 세포 염색 분석을 위해 세포화학자 및/또는 병리학자에 의해 현미경을 이용한 방법, 예를 들어, 형광 염색(즉, 표지 인자 발현)으로 검토된다. 대체적 방법으로는, 표본은 자동화된 현미경 관찰법을 통해 또는 긍정적 염색 세포의 식별을 빠르게 해 주는 컴퓨터 소프트웨어의 도움을 받는 요원에 의해 검토될 수 있다.
항체 결합의 탐지는 항표지 인자 항체를 탐지 가능물질에 결합함으로써 보다 쉽게 수행될 수 있다. 탐지 가능물질의 예는 여러 효소, 보족기, 형광 물질, 발광성 물질, 생물발광 물질, 및 방사능 물질을 포함한다. 적절한 효소의 예는 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스타파아제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸촐린에스테라제를 포함하며; 적절한 보족기 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오딘 및 아비딘/비오딘을 포함하며; 적절한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐라민 플루오레세인, 염화단실 또는 피코에리티린을 포함하며; 발광성 물질의 예는 루미놀을 포함하며; 생물 발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시퍼린, 및 아에쿼린을 포함하며; 적절한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 냉동된 표본은 상기 기술된 방법으로 준비되어, 이후, 예를 들어, 삼중-버퍼링된 염분(TBS)를 사용하여 적절한 농도로 희석된 본 발명의 표지 인자에 대한 항체로 착색된다. 일차 항체는 슬라이드를 비오딘화 항면역 글로불린 내에서 배양함으로써 탐지될 수 있다. 이 신호는 선택적으로 증폭되고 항원의 디아미노벤지딘 침착을 사용하여 시각화될 수 있다. 또한, 슬라이드는 세포를 시각화하기 위해 선택적으로, 예를 들어 헤마톡실린으로 대응 착색될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 고정되고 삽입된 표본이 본 발명의 표지 인자에 대한 항체로 착색되고 냉동 부분에서 상기 기술된대로 대응 착색된다. 또한, 표본은 항체 염색을 시각화를 위해 신호를 증폭하기 위해 선택적으로 제제로 처리될 수 있다. 예를 들어, 비오디닐(biotinyl)-티라미드의 퍼옥시다제-촉매 침착을 수행하고, 이후 퍼옥시다제-켤레 스트렙타비딘(효소화된 신호 증폭(CSA) 시스템, DAKO, 카핀테리아, CA)을 사용할 수 있다.
조직-기반 분석(즉, 면역조직화학)은 본 발명의 표지 인자를 탐지하고 정량화하기 위한 바람직한 방법이다. 일 실시예에서, 본 발명의 표지 인자의 존재 또는 부재는 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 면역 조직화학 검사 분석은 표지 인자가 결여된 세포가 착색되지 않도록 저 농도의 항표지 인자 항체를 사용한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 표지 인자의 존재 또는 부재가 표지 인자 단백질 착색이 심하게 결여된 세포와 같은 고농도의 항표지 인자 항체를 사용하는 면역 조직화학 검사 방법을 사용하여 결정된다. 착색하지 않는 세포는 변이된 표지 인자 및 항원적으로 인식 가능한 표지 인자 단백질을 생산할 수 없는 세포이거나, 또는 표지 인자 수준을 조절하는 경로에 조절 장애가 일어나, 결과적으로 무시할 수 있는 표지 인자 단백질의 안정 상태 발현이 발생하는 세포이다.
해당 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 특정한 항체의 농도가 결합의 시간, 본 발명의 표지 인자에 대한 항체의 특정성의 수준, 및 표본의 준비 방법과 같은 요소에 따라 변화할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 다중 항체가 사용될 때, 요구되는 농도는 항체가 표본에 적용되는 순서, 예를 들어, 칵테일로서 동시에 적용되는지 또는 개별적 항체 반응 제제로서 연속적으로 적용되는지에 따라 영향을 받을 수 있다. 또한, 본 발명의 표지 인자의 항체 결합을 시각화하기 위해 사용된 탐지 화학 방법은 또한 노이즈 비율에 대해 원하는 신호를 생성하기 위해 최적화되어야 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 단백질체의 방법, 예를 들어, 질량 분광학이 표지 인자 본 발명의 단백질들을 탐지하고 정량화하기 위해 사용된다. 예를 들어, 단백질-결합 칩에 대해, 혈청과 같은 생물학적 표본의 적용을 포함하는 매트릭스-연관 레이저 탈착/이온화 비행 시간(time-of-flight) 질량 분광학 (MALDI-TOF MS) 또는 표면-개선 레이저 탈착/이온화 비행 시간(time-of-flight) 질량 분광학 (SELDI-TOF MS)(라이트 주니어(Wright, G.L., Jr.) 외(2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; 리(Li, J.), 외 (2002) Clin Chem 48:1296; 라롱가(Laronga, C.) 외(2003) Dis markers 19:229; 페트리코인(Petricoin, E.F.) 외(2002) 359:572; 아담(Adam, B.L.) 외(2002) 암 Res 62:3609; 톨슨(Tolson, J.) 외(2004) Lab Invest 84:845; 지아오(Xiao, Z.) 외(2001) Cancer Res 61:6029)을 사용하여 PY-Shc 및/또는 p66-여성 단백질을 탐지하고 정량화할 수 있다. 질량 분광학적 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제 5,622,824호, 제5,605,798호 및 제 5,547,835호에 기술되어 있으며, 그 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 각각 통합된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 표지 인자의 발현은 핵산 수준에서 탐지된다. 발현을 분석하기 위한 핵산-기반 기술은 해당 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 대상으로부터의 표본 내의 표지 인자 mRNA의 수준을 결정하는 방법을 포함한다. 많은 발현 탐지 방법이 분리된 RNA를 사용한다. mRNA의 분리에 반해 선택을 하지 않는 모든 RNA 분리 기술이 본 발명의 표지 인자를 발현하는 세포로부터의 RNA 정제를 위해 사용할 수 있다(예를 들어, 오수벨(Ausubel) 외, ed., (1987-1999) 분자생물학에서의 현재 프로토콜(존 와일리 앤 선스(John Wiley & Sons), 뉴욕, 참조). 또한, 많은 수의 조직 표본들이, 예를 들어, 촘크진스키(Chomczynski) (1989, 미국 특허 제 4,843,155호)의 단일 단계 RNA 분리 과정과 같은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 쉽게 처리될 수 있다.
용어 "탐침"은 본 발명의 표지 인자에 선택적으로 결합할 수 있는 모든 분자, 예를 들어, 뉴클레오타이드 전사체 및/또는 단백질을 말한다. 탐침은 해당 분야에서 알려진 방법 중 하나, 또는 적절한 생물학적 준비로부터 도출된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 탐침은 특히 라벨링되도록 설계될 수 있다. 탐침으로 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체, 및 기관계 분자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
분리된 mRNA는 잡종 형성 또는 증폭 분석에서 사용될 수 있으며, 남부 또는 북부 분석, 중합효소 연쇄 반응 분석 및 탐침 배열을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. mRNA 수준의 탐지를 위한 한 방법은 분리된 mRNA를 표지 인자 mRNA로 잡종을 형성할 수 있는 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 핵산 탐침은, 예를 들어 최소한 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500의 길이를 가지는 뉴클레오타이드로서 특히 표지 인자 게놈적 DNA에 엄격한 조건에서 잡종을 형성하기에 충분한 올리고뉴클레오타이드와 같은 완전한 길이의 cDNA, 또는 이의 부분일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 mRNA는 고체 표면 상에 고정되고, 예를 들어, 분리된 mRNA를 아가로세 겔 상에서 구동시켜 mRNA를 겔로부터 니트로셀룰로오즈와 같은 막으로 이전시킴으로써 탐침과 접촉되게 한다. 대체적인 실시예에서, 상기 탐침(들)은 고체 표면 상에 고정되고, 예를 들어, 아피메트릭스(Affymetrix) 유전자 칩 배열 내의 탐침(들)과 접촉되게 한다. 통상의 기술자라면 알려진 mRNA 탐지 방법을 표지 인자 mRNA의 수준을 탐지하기 위해 사용할 수 있도록 쉽게 적응시킬 수 있을 것이다.
표본 내의 표지 인자 mRNA의 수준을 결정하는 대체적 방법은, 예를 들어, RT-PCR(실험 실시예는 Mullis, 1987, 미국 특허 제 4,683,202호에 개시되어 있음), 리가아제 연쇄 반응(바라니(Barany)(1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:189-193), 자체 지지 염기서열 복제(구아텔리(Guatelli) 외(1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:1874-1878), 전사적 증폭 시스템(쿼(Kwoh) 외(1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:1173-1177), Q-베타 복제 효소(리자디(Lizardi) 외 (1988) Bio /Technics 6:1197), 구르는 원(rolling circle) 복제(Lizardi 외, 미국 특허 제 5,854,033호) 또는 기타 핵산 증폭 방법에 의한 핵산 증폭의 과정, 및 여기에 이어지는 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 기술을 사용한 증폭된 분자의 탐지를 포함한다. 이러한 탐지 방법은 이들 분자가 매우 작은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 탐지에 특히 유용하다. 본 발명의 특별한 측면에 따르면, 표지 인자 발현은 정량적 형광 RT-PCR (즉, TaqManTM 시스템)에 의해 분석된다. 이러한 방법은 일반적으로 본 발명의 표지 인자에 특정한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 쌍을 활용한다. 알려진 염기서열에 특정한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하는 방법은 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
본 발명의 표지 인자의 발현 수준은 (북부, 남부, 도트 등에 사용된 것과 같은 및 잡종 형성 분석과 같은)막 블롯, 또는 마이크로웰, 표본 튜브, 겔, 구슬 또는 섬유질(또는 결합 핵산을 포함하는 기타 고체 지지체)을 사용하여 모니터링될 수 있다. 참조에 의해 본 명세서에 통합된 미국 특허 제 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934호 참조. 표지 인자 발현의 탐지는 용액 내에서 핵산 탐침을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 미세 배열은 본 발명의 표지 인자의 발현을 탐지하기 위해 사용된다. 미세 배열은 서로 다른 실험에서의 재생성 때문에 특히 이러한 목적에 적합하다. DNA 미세 배열은 많은 수의 유전자의 발현 수준을 동시에 측정하는 하나의 방법을 제공한다. 각 배열은 고체 지지체에 부착된 포획 탐침의 재생 가능 패턴으로 구성된다. 라벨링된 RNA 또는 DNA는 배열 상에서 보완 탐침에 대해 잡종을 형성하고 레이저 스캐닝에 의해 탐지된다. 배열 상의 각 탐침의 잡종 형성 강도가 결정되어 상대적 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적 값으로 변환된다. 이에 대해서는, 참조에 의해 본 명세서에 통합된 미국 특허 제 6,040,138호, 제 5,800,992호와 제 6,020,135호, 제 6,033,860호, 및 제 6,344,316호를 참조한다. 고밀도 올리고뉴클레오타이드 배열은 표본 내 많은 개수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로필을 결정하는데 특히 유용하다.
표지 인자의 양, 및/또는 본 발명의 표지 인자의 양의 수학적 관계는 질병 상태 또는 독성 상태에 대해 치료되고 있는 대상에서의 질병 상태, 예를 들어 암, 당뇨, 비만, 심장병, 또는 독성 상태, 예를 들어, 약제로 유도되는 독성 또는 심장 독성의 재발의 위험, 질병 상태 또는 독성 상태에 대해 치료되고 있는 대상의 생존 가능성, 질병 상태 또는 독성 상태가 악성인지의 여부, 질병 상태 또는 독성 상태를 치료하기 위한 치료 식이 요법의 효능 등을 해당 분야의 통상의 기술자에게 알려진 회귀 분석 방법을 포함하는 본 발명의 방법을 사용하여 계산하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 회귀 모델은 CART(예를 들어, 힐(Hill, T), 및 루위키(Lewicki, P.) (2006) “STATISTICS 방법 및 적용” StatSoft, Tulsa, OK), 콕스(Cox)(예를 들어, www.evidence-based-medicine.co.uk), 지수, 정규 및 로그 정규 (예를 들어, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 병참적(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), 매개 변수적, 비매개변수적, 반매개변수적(예를 들어, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), 또는 첨가적(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/generalized_additive_model) 모델을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일 실시예에서, 회귀 분석은 표지 인자의 양을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 회귀 분석은 표지 인자의 수학적 관계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 표지 인자의 양 및/또는 표지 인자의 수학적 관계의 회귀 분석은 추가적인 임상적 및/또는 분자의 보조 변량을 포함할 수 있다. 이러한 임상적 보조 변량은 노드의 상태, 종양 단계, 종양 등급, 종양의 크기, 예를 들어, 화학 치료 및/또는 방사선 치료와 같은 치료 방법 체계, 임상적 결과(예를 들어, 재발, 질병에 특정한 생존, 치료 실패) 및/또는 진단 이후 시간, 초기 치료 이후의 시간 및/또는 치료의 완료 이후의 시간의 함수로서의 임상적 결과를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
VIII . 키트
본 발명은 또한 질병 상태 또는 독성 상태에 대한 치료를 받는 대상의 질병 상태, 예를 들어 암, 당뇨, 비만, 심장병, 또는 독성 상태, 예를 들어, 약제로 유도되는 독성 또는 심장 독성, 질병 상태의 재발 또는 독성 상태, 또는 생존을 예단하기 위한 구성 요소 및 키트를 제공한다. 이들 키트들은 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 특히 본 발명의 표지 인자에 결합하는 탐지 가능항체, 특히 염색에 사용하기 위한 대상의 조직 표본의 획득 및/또는 준비를 위한 본 발명의 표지 인자, 반응 제제에 결합하는 탐지 가능항체, 및 이의 사용을 위한 지침.
본 발명의 키트는 선택적으로 본 발명의 방법을 수행하기에 유용한 추가적 성분을 포함할 수 있다. 예로써 설명하면, 상기 키트는 보완 핵산을 아닐링하기에 적합하거나 항체를 상기 항체가 특히 결합되는 단백질에 결합하기에 적합한액체(예를 들어, SSC 버퍼), 하나 또는 그 이상의 표본 구획, 본 발 명의 방법 및 조직 특정한 제어/표준수행을 설명하는 지침 문서를 포함할 수 있다.
IX . 선별 분석
본 발명의 타겟은 본 명세서에 열거된 유전자 및/또는 단백질을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 출원인들이 본 명세서에 기술한 실험의 결과를 기반으로, 질병 상태 또는 독성 상태에서 조절되는 핵심 단백질은 세포 골격 성분, 전사 요소, 세포 사멸제 반응, 오탄당 인산염 경로, 생체 합성 경로, 산소 첨가 스트레스(친 옥시던트), 막 변경, 및 산소 첨가 인산화 대사를 포함하는 서로 다른 경로 또는 분자의 군에 연관되거나 이들로 분류될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에서, 표지 인자는 HSPA8, FLNB, PARK7, HSPA1A/HSPA1B, ST13, TUBB3, MIF, KARS, NARS, LGALS1, DDX17, EIF5A, HSPA5, DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1, CANX, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 유전자(또는 단백질)를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 표지 인자는 GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1, GPAT1 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자(또는 단백질)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 표지 인자는 상기 기술한 유전자(또는 단백질)들 중 최소한 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯, 열일곱, 열여덟, 열아홉, 스물, 스물-다섯, 서른, 또는 그 이상의 조합이다.
식별된 표지 인자의 조절 인자를 식별하기에 유용한 선별 분석은 아래에서 설명된다.
본 발명은 또한 조절 인자, 즉, 후보 또는 검사 화합물 또는 제제(예를 들어, 단백질, 펩티드, 펩티도미메트릭, 펩토이드, 소형 분자 또는 기타 약제)를 식별하는 방법(본 명세서에서 "선별 분석"으로도 불림)을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 표지 인자의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 질병 상태 또는 독성 상태를 치료하고 예방하는데 유용하다. 이러한 분석은 일반적으로 본 발명의 표지 인자 및 하나 또는 그 이상의 분석 성분 간의 반응을 포함한다. 상기 기타 성분은 검사 화합물 자체, 또는 검사 화합물의 조합 및 본 발명의 표지 인자의 자연적 결합 파트너 중 하나일 수 있다. 본 명세서에서 기술된 것과 같은 분석을 통해 식별된 화합물은, 예를 들어, 질병 상태 또는 독성 상태의 공격성을 억제, 완화, 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 선별 분석에서 사용된 상기 검사 화합물은 자연적 및/또는 합성 화합물의 체계적 라이브러리를 포함하는 어떠한 가용한 소스로부터도 획득할 수 있다. 검사 화합물 또한 다음을 포함하는 해당 분야에서 알려진 조합적 라이브러리방법 내의 다수의 접근 방식 중 어느 하나에 의해 획득될 수 있다: 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(펩티드의 기능성을 가지나, 효소 퇴화에 대해 저항성이 있으나 그럼에도 생체 활성을 유지하는 신규의 비 펩티드 백본을 가지는 분자들의 라이브러리; 예를 들어, 주커만(Zuckermann) 외, 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85 참조); 공간적으로 배치될 수 있는 병렬 고체 상 또는 용액 상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 요하는 합성 라이브러리 방법; '일-구슬 일-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용한 합성 라이브러리 방법. 상기 생물학적 라이브러리 및 펩토이드 라이브러리 접근 방식은 펩티드 라이브러리에 제한되며, 반면에 다른 네 개의 접근 방식은 펩티드, 비 펩티드 올리고머 또는 소형 분자 화합물의 라이브러리에 적용할 수 있다(램(Lam), 1997, AntiCancer Drug Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법들의 예는, 예를 들어, 다음과 같은 해당 분야의 기술에서 찾아 볼 수 있다: 드위트(DeWitt) 외(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국. 90:6909; 어브(Erb) 외(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 91:11422; 주커만(Zuckermann) 외(1994). J. Med. Chem. 37:2678; 조(Cho) 외(1993) 사이언스 261:1303; 카렐(Carrell) 외(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; 카렐(Carrell) 외(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 갤럽(Gallop) 외(1994) J. Med. Chem. 37:1233.
화합물의 라이브러리는 용액으로 제공되거나(예를 들어, 후텐(Houghten), 1992, Biotechniques 13:412-421), 또는 구슬(램(Lam), 1991, 네이처 354:82-84), 칩(포더(Fodor), 1993, 네이처 364:555-556), 박테리아 및/또는 포자(라드너(Ladner), USP 5,223,409), 플라스미드(컬(Cull) 외, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파지(스코트(Scott) 및 스미스(Smith), 1990, 사이언스 249:386-390; 데블린(Devlin), 1990, 사이언스 249:404-406; 스월라(Cwirla) 외, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; 펠리치(Felici), 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; 라드너(Ladner), 상기와 동일)로 제공된다.
본 발명의 선별 방법은 질병 상태 세포 또는 독성 상태 세포를 검사 화합물과 접촉시키는 단계, 및 검사 화합물이 세포 내 본 발명의 표지 인자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 표지 인자의 발현 및/또는 활성은 본 명세서에 기술된 바에 따라 결정될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 표지 인자 또는 이의 생물학적으로 활성화된 부분의 기질인 후보 또는 검사 화합물의 선별을 위한 분석을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 표지 인자 또는 이의 생물학적으로 활성화된 부분에 결합하는 후보 또는 검사 화합물의 선별을 위한 분석을 제공한다. 표지 인자에 직접 결합할 수 있는 검사 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어, 화합물의 표지 인자로의 결합이 복합체 내 라벨링된 표지 인자 화합물을 탐지함으로써 결정될 수 있도록 화합물을 방사성 동위원소 또는 효소 라벨에 결합 시킴으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 화합물(예를 들어, 표지 인자 기질)은 131I, 125I, 35S, 14C, 또는 3H로, 직접적 또는 간접적으로 라벨링될 수 있으며, 상기 방사성 동위원소는 방사성 방출의 직접적 계수 또는 섬광을 계수함으로써 탐지될 수 있다. 대체적 방법으로, 분석 성분은, 예를 들어, 호스래디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스타파아제, 또는 루시퍼라제, 및 적절한 기질에서 생산물로의 변환에 대한 결정에 의해 탐지된 효소 라벨로서 효소적으로 라벨링될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 선별 분석에 의해 식별된 신규의 제제에 관한 것이다. 이에 따라, 상기 기술된 바에 따라 식별된 제제를 적절한 동물 모델에 대해 추가적으로 이용하는 것 또한 본 발명의 범위 내에 있는 것이다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 바에 의해 식별된 본 발명의 표지 인자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있는 제제는 동물 모델에서 이러한 제제를 통한 치료의 의 효능, 독성, 또는 부작용을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 대체적 방법으로, 본 명세서에서 기술된 대로 식별된 제제는 동물 모델에서 이러한 제제의 활동의 메커니즘을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 기술된 대로의 치료를 위한 상기 기술된 선별 분석에 의해 식별된 신규의 제제의 사용에 관한 것이다.
예를 통한 발명의 설명
예 1: 암 합치 및 시뮬레이션 네트워크 구축을 위한 플랫폼 기술 채택
본 예에서는, 필요에 따라 구축된 생체 외 암 모델로부터 얻어진 데이터를 통합하고, 이에 의해 암의 발병을 추진시키는 신규의 단백질/경로를 식별하기 위해 위에서 상세히 설명한 플랫폼 기술이 채택되었다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 암과 관련된 진단적/예후의 표지 인자와 더불어 암 치료 타겟을 제공하였다.
연구 설계는 도 18에서 묘사된다. 간단히 설명하면, 두 개의 암 세포 라인(PaCa2, HepG2) 및 하나의 정상 세포 라인(THLE2)이 생체 내 암 세포가 경험하는 환경을 모의하는 일곱 조건 중 하나의 조건을 겪도록 하였다. 특히, 세포들은 고혈당 조건, 저산소 상태 조건, 젖산 조건, 고혈당 + 저산소 상태 조합 조건, 고혈당 + 젖산 조합 조건, 저산소 상태 + 젖산 조합 조건, 또는 고혈당 + 저산소 상태 + 젖산 조합 조건에 노출되었다. 이들 서로 다른 조건들은 다음과 같이 생성되었다:
--고혈당 조건은 세포를 22 mM 글루코스를 함유하는 매체에서 배양함으로써 생성되었다.
--저산소 상태 조건은 세포를 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, 빌럽-로덴버그 사(Billups-Rothenberg Inc). 델 마, 캘리포니아) 내에 위치시킴으로써 유도되었으며, 이때 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업용 기체 혼합물로 넘치게 했다.
--젖산 조건은 세포를 12.5 mM 젖산을 함유하는 매체에서 배양함으로써 생성되었다.
--고혈당 + 저산소 상태 조합 조건은 세포를 22 mM 글루코스를 포함하는 매체에서 배양하여 생성되었고, 상기 세포는 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업 기체 혼합물로 넘쳐나는 모듈라 배양기 챔버에 위치시켰다.
--고혈당 + 젖산 조합 조건이 세포를 22 mM 글루코스 및 12.5 mM 젖산을 함유하는 매체에서 배양함으로써 생성되었다.
--저산소 상태 + 젖산 조합 조건은 세포를 12.5 mM 젖산을 포함하는 매체에서 배양하여 생성되었고, 상기 세포는 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업 기체 혼합물로 넘쳐나는 모듈라 배양기 챔버에 위치시켰다.
--고혈당 + 저산소 상태 + 젖산 조합 조건은 세포를 22 mM 글루코스 및 12.5 mM 젖산을 포함하는 매체에서 배양하여 생성되었고, 상기 세포는 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업 기체 혼합물로 넘쳐나는 모듈라 배양기 챔버에 위치시켰다.
상기 언급한 세포들을 포함하는 세포 모델에서, 상기 세포들은 위에 언급한 각 조건에 노출되며, 세포를 코엔자임 Q10로 처리하여 환경적 교란에 노출시킴으로써 추가적으로 조사된다. 특히, 세포들은 0, 50μM, 또는 100μM에서 코엔자임 Q10로 처리된다.
각각의 조건을 가지며 각각의 코엔자임 Q10 로 처리된 세포 라인에 대해 매체 표본과 더불어 세포 표본이 처리 후 24시간 및 처리 후 48시간을 포함하여 처리 이후에 수 회 수집되었다.
또한, 두 개의 다른 암 세포인 PaCa2 및 HepG2 세포 사이의 상호 대화 실험이 수행되었으며, 이때 PaCa2 및 HepG2 세포는 공생 배양되었다. 이러?h 공생 배양 접근 방식은 세포 외 세크리톰(ECS) 실험이라 불린다. 제 1 세포 시스템(PaCa2)이 먼저 웰 내의 웰 간 유형 성장 챔버의 삽입기에 뿌려 졌다. 여섯 개의 웰 플레이트가 보다 나은 통계적 분석을 위해 사용되었다. 삽입기 내의 제 1 세포 시스템을 뿌리는 동안, 상기 삽입기는 별도의 6 개의 웰 플레이트 상에 위치한다. 제 2 세포 시스템(HepG2)은 주 트레이에 뿌려 졌다. 제 1 세포 시스템, 및 제 2 세포 시스템을 포함하는 주 트레이를 포함하는 삽입 트레이가 37˚C에서 하루 밤 동안 배양되었다. 각각의 세포 시스템은 각 세포에 특정한 매체 (이때 대체적인 방법으로, 각각의 세포 시스템이 두 세포 유형 모두의 성장을 지지하는 매체에서 성장될 수 있다)에서 성장되었다. 두 번째 날에, 매체 교환에 의한 소정의 처리를 하였다. 특히, 제 1 세포 시스템을 포함하는 삽입기는 제 2 세포 시스템을 포함하는 주 트레이 내에 위치하였다. 이 트레이는 이후 소정의 기간, 예를 들어, 24 시간 또는 48 시간 동안 배양되었다. 복사된 웰이 동일한 조건으로 설정되었으며 세포들을 저장하여 2D 분석을 위한 충분한 물질들이 생산되도록 하였다. 상기 매체(1 ml 부분 표본)와 삽입기로부터의 세포 및 주 트레이의 웰로부터의 세포들은 별도의 표본으로 수확되었다. 보다 나은 통계적 분석력을 제공하기 위해 상기 실험은 삼회 반복 수행되었다.
상호 대화(cross talk) 실험 또한 “매체 교환(swap)” 실험에 의해 수행되었다. 특히, 제 1 세포 시스템 (PaCa2)으로부터 배양된 매체 또는 “세크리톰”이 상기 기술한 교란 또는 조건을 겪은 후 24시간 또는 48시간 이후에 수집되었으며, 이후 제 2 세포 시스템 (HepG2)에 24-48시간 동안 추가되었다. 제 2 세포 시스템으로부터 최종 배양된 매체 또는 “세크리톰” 이 다시 수집되었다. 모든 최종 세크리톰은 단백질체의 분석을 거쳤다.
정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현에서의 변화에 대한 아이프로파일링(iprofiling)이 각 세포 라인에 각 조건에서, 또 각 “환경적 교란”, 즉, 코엔자임 Q10을 사용한 치료에 대해 상기 상세한 설명에서 설명한 기술을 사용하여 수집된 세포 및 매체 표본에 대해 수행되었다. 정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현에서의 변화에 대한 아이프로파일링은 마찬가지로 각 조건 및 치료에서 각각의 공생 배양된 세포 라인에 대하여 수집된 세포 및 매체 표본에 대해 수행되었다.
또한, 암, 정상 세포 및 상호 대화 실험 내에서 코엔자임 Q10 교란의 존재 또는 부존재 하에서 각 조건에 노출된 세포들의 생명 에너지론적 프로파일링이 Seahorse 분석기를 본질적으로 제조사가 권장한 대로 채택하여 생성되었다. OCR (산소 소모율) 및 ECAR(세포외 공간 산화율)이 상기 시호스(seahorse) 배양 플레이트에 대해 밀어 넣어지는 카트리지로서 생성된 7 μl 챔버 내의 전극에 의해 기록되었다.
각 세포 라인(상호 대화 실험 내의 세포를 포함)에 대해 각 조건(들) 및 각 교란의 존재 하에서 수집된 단백질체학 데이터, 및 각 세포 라인에 대해 각 조건(들) 및 각 교란의 존재 하에서 수집된 생명 에너지론 프로파일링 데이터가 이후 REFS™ 시스템에 의해 처리되었다. Paca2, HepG2, THLE2 및 상호 대화 실험에 대한 미가공 데이터가 다시 표준화된 명명법을 사용하여 조합되었다. 15% 이상의 단백질체학 데이터가 결여된 유전자는 필터링하여 제거되었다. 데이터 산입 적략이 개발되었다. 예를 들어, 복제 오류 내에서 모델이 복제를 가지는 실험적 조건으로부터의 데이터를 산입하기 위해 사용되었다. 10 개의 이웃에 기반한 K-NN 알고리즘이 복제를 가지지 않는 데이터를 산입하기 위해 사용되었다. 세 개의 생물학적 시스템 모두에 대해, Paca2 시스템에 대해서만, 또는 표현형 데이터에 링크된 HepG2 시스템만에 대해 서로 다른 REFS™ 모델들이 구축되었다.
곡선 아래의 넓이 및 시뮬레이션 네트워크 내에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각 간선에 대한 배수 변화가 R 프로그램밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 추출되며, 이때 상기 R 프로그램밍 언어는 통계적 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 오픈 소스 소프트웨어 환경이다.
R 프로그램으로부터의 출력은 합치된 네트워크의 시각적 표현을 생성하기 위한 오픈 소스 프로그램인 사이토스케이프(Cytoscape)로 입력된다.
구축된 모든 모델 중에서, 70% 파편 빈도에서 예시적 단백질 상호 반응의 REFS 합치된 네트워크가 도 21에 도시된다.
도 21에 도시된 합치된 네트워크 내의 각 노드는 상기 상세한 설명에서 상세히 설명한 대로 REFS™을 사용하여 시뮬레이션 네트워크를 생성하기 위해 LDHA의 발현을 4배 증가 또는 감소시킴으로써 모의된다.
도 21에 도시된 예시적 합치된 네트워크 내의 고 수준에서의 PARK7과 연관되어, PARK7 및 단백질에 대한 모의된 LDHA 발현 변화의 효과가 조사되었다. 두 개의 암 세포 라인, 즉, Paca2 및 HepG2에서 LDHA 시뮬레이션에 반응하는 단백질이 REFS™을 사용하여 식별되었다(도 22 참조). 이들 수들은 특정한 단백질 발현 수준의 배수 변화를 나타낸다.
상기 방법을 사용하여 식별된 단백질 연결을 증명하기 위해, 시뮬레이션 네트워크 내의 LDHA에 직접적 근접성을 가지는 식별될 표지 인자가 이전에 출간된 문헌들에 기반한 네트워크들 사이의 실험적 출력들 사이의 분자의 연관을 결정하기 위해 신경망 네트워크를 활용하는 소프트웨어 프로그램인 IPA에 입력되었다. IPA 프로그램의 출력은 도 23에 도시되었으며, 이때 회생 모양의 표지 인자는 플랫폼에 의해 생성된 시뮬레이션 네트워크 내 LDHA에 직접적 근접성을 가지는 것으로 식별되었으며 채워지지 않은 형태의 표지 인자는 이전에 출간된 문헌 내의 알려진 지식에 기반한 IPA에 의해 식별된 연결이다.
조사적 생물학 플랫폼 기술로부터의 출력에서 식별된 표지 인자들(도 21에 도시), 즉 DHX9, HNRNPC, CKAP4, HSPA9, PARP1, HADHA, PHB2, ATP5A1 및 CANX는 IPA로 생성된 네트워크 내에서 TP53 및 PARK7와 같은 잘 알려진 암 표지 인자와 연결되어 있는 것으로 관찰되었다(도 23에 도시). 본 발명의 조사적 생물학 플랫폼에 의해 식별된 요소들이 과학 문헌들에 발표된 알려진 요소들과 연결성을 공유한다는 사실은 본 발명의 조사적 생물학 플랫폼을 사용하여 생성된 네트워크의 정확성을 증명하는 것이다. 또한, 본 발명의 조사적 생물학 플랫폼 출력을 사용하여 생성된 LDHA 하위 네트워크 내의 이러한 네트워크 연관은, 분자 개체들 사이의 연결이 반응하는 노드들 사이의 기능적인 방향성을 제공하지 않는 IPA 네트워크와는 반대로, 각 요소에 대한 방향적 영향이 존재함을 입증한다. 따라서, 데이터 생성, 통합 및 역 엔지니어링에 대해 편향되지 않은 접근 방식을 채택하여 계산 모델을 생성하고, 이어서 시뮬레이션 및 분별 네트워크 분석을 수행함으로써, 상기 조사적 생물학의 발견 플랫폼은 아직까지 알려지지 않은 암 생리병리학에서의 메커니즘을 질병 생리병리학의 잘 확립된 과학적 이해와 조화를 이루어 이해할 수 있게 해 준다.
도 19는 아이프로파일링으로부터의 단백질 발현 데이터에 기반한 하향 노드(퍼브메드(pubmed) 단백질 접근 번호는 도 19에 열거된다)에 대한 CoQ10 치료의 효과를 도시한다. 단백질 접근 번호 P00338은 LDHA이다. 수중 실험에 의한 단백질체 데이터의 증명은 LDHA 발현에 대해 HepG2 세포 내에서 수행되었다(도 20 참조). 도 20에서 보인 바와 같이, LDHA 발현 수준은 HepG2 가 50 uM CoQ10 또는 100 uM CoQ10으로 24 또는 48 시간 동안 처리하였을 때 감소한다.
잘 알려진 암 표지 인자인 TP53, Bcl-2, Bax 및 카스파제3에 대해, SKMEL 28 세포 내의 이들 표지 인자의 발현 수준에 대한 CoQ10 치료 효과의 증명이 수중 실험을 통해 수행되었다 (도 24 및 도 25 참조).
예 2: 암 델타-델타 네트워크를 구축하기 위한 플랫폼 기술의 채택
본 예에서는, 필요에 따라 구축된 생체 외 암 모델로부터 얻어진 데이터를 통합하고, 이에 의해 암의 발병을 추진시키는 신규의 단백질/경로를 식별하기 위해 위에서 상세히 설명한 플랫폼 기술이 채택되었다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 암과 관련된 진단적/예후의 표지 인자와 더불어 암 치료 타겟을 제공하였다.
간단히 설명하면, 네 개의 암 라인(PaCa2, HepG2, PC3 및 MCF7) 및 두 개의 정상 세포 라인(THLE2 및 HDFa)이 생체 내 암 세포가 경험하는 환경을 모의하는 여러 조건들을 겪도록 하였다. 특히, 세포들은 고혈당 조건, 혈중 산소 감소 조건 및 젖산에 의한 처리 각각에 별도로 노출되었다. 예를 들어, 고혈당 조건은 세포를 22 mM 글루코스를 함유하는 매체에서 배양함으로써 생성되었다. 혈중 산소 감소 조건은 세포를 모듈라 인큐베이터 챔버(MIC-101, 빌럽-로덴버그 사(Billups-Rothenberg Inc). 델 마, 캘리포니아) 내에 위치시킴으로써 유도되었으며, 이때 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업용 기체 혼합물로 넘치게 했다. 젖산 처리를 위해, 각 세포 라인은 0 또는 12.5 mM 젖산에서 처리되었다. 세포들을 위의 셋 조건에 별도로 노출시키는 것과 더불어, 세포들은 또한 상기 조건들의 둘의 조합 또는 세 조건 모두(즉, 고혈당 및 혈중 산소 감소 조건; 고혈당 조건 및 젖산; 혈중 산소 감소 조건 및 젖산; 및 고혈당 및 혈중 산소 감소 조건 및 젖산)에 노출되었다.
상기 언급한 세포들을 포함하는 세포 모델에서, 상기 세포들은 위에 언급한 각 조건에 노출되며, 세포를 코엔자임 Q10로 처리하여 환경적 교란에 노출시킴으로써 추가적으로 조사된다. 특히, 세포들은 0, 50μM, 또는 100μM에서 코엔자임 Q10로 처리된다.
각각의 조건(또는 조건들의 조합)에 노출되고 코엔자임 Q10 로 처리되거나 처리되지 않은 세포 라인에 대해 세포로부터의 세크리톰을 함유하는 세포매체 표본과 더불어 세포 표본이 처리 후 24시간 및 처리 후 48시간를 포함하여 처리 이후에 수 회 수집되었다.
또한, 두 개의 다른 암 세포인 PaCa2 및 HepG2 세포 사이의 상호 대화 실험이 수행되었으며, 이때 PaCa2 및 HepG2 세포는 공생 배양되었다. 이러한 공생 배양 접근 방식은 세포 외 세크리톰(ECS) 실험이라 불린다. 제 1 세포 시스템(PaCa2)이 먼저 웰 내의 웰 간 유형 성장 챔버의 삽입기 에 뿌려 졌다. 여섯 개의 웰 플레이트가 보다 나은 통계적 분석을 위해 사용되었다. 삽입기 내의 제 1 세포 시스템을 뿌리는 동안, 상기 삽입기는 별도의 6 개의 웰 플레이트 상에 위치한다. 제 2 세포 시스템(HepG2)은 주 트레이에 뿌려 졌다. 제 1 세포 시스템, 및 제 2 세포 시스템을 포함하는 주 트레이를 포함하는 삽입기를 포함하는 6개의 웰 플레이드가 37˚C에서 하루 밤 동안 배양되었다. 각각의 세포 시스템은 각 세포에 특정한 매체 (이때 대체적인 방법으로, 각각의 세포 시스템이 두 세포 유형 모두의 성장을 지지하는 매체에서 성장될 수 있다)에서 성장되었다. 두 번째 날에, 매체 교환에 의한 소정의 처리를 하였다. 특히, 제 1 세포 시스템 및 제 1 세포 시스템의 각 매체를 포함하는 삽입기는 제 2 세포 시스템 및 제 2 세포 시스템의 각 매체를 포함하는 주 트레이 내에 위치하였다. 그러나, 모든 경우의 공생 배양에서 공생 배양된 세포는 공생 배양 전의 제 1일 중에 별도로이긴 하지만 동일한 “암 조건”(예를 들어, 고혈당증, 저산소 상태, 젖산, 또는 이들의 조합)에 노출된 바 있다. 다시 말해, 삽입부 내의 제 1 세포 시스템 및 트레이 내의 제 2 세포 시스템은 “공생배양” 설정으로 옮겨지기 전에 동일한 조건에 노출되었다. 이 트레이는 이후 소정의 기간, 예를 들어, 24 시간 또는 48 시간 동안 배양되었다. 복사된 웰이 동일한 조건으로 설정되었으며 세포들을 저장하여 이후의 단백질체의 분석을 위한 충분한 물질들이 생산되도록 하였다. 세크리톰(1 ml 부분 표본)을 함유하는 상기 매체, 삽입기로부터의 세포 및 주 트레이의 웰로부터의 세포들은 별도의 표본으로 수확되었다. 보다 나은 통계적 분석력을 제공하기 위해 상기 실험은 3회 반복 수행되었다.
상호 대화 실험 또한 “매체 교환(swap)” 실험에 의해 수행되었다. 특히, 제 1 세포 시스템 (PaCa2)으로부터 배양된 매체 또는 “세크리톰”이 상기 기술한 교란 또는 조건을 겪은 후 24시간 또는 48시간 이후에 수집되었으며, 이후 제 2 세포 시스템 (HepG2)에 24-48시간 동안 추가되었다. 제 2 세포 시스템으로부터 최종 배양된 매체 또는 “세크리톰”이 다시 수집되었다. 모든 최종 세크리톰은 단백질체의 분석을 거쳤다.
상기 세포 시스템을 상기 기술된 “암 조건”과 공생 배양 실험으로부터의 쌍을 이루는 세포의 세크리톰 내에서 생산된 교란(즉, 코엔자임 Q10 치료), 및/또는 조건에 노출시키고 나서, 세포의 반응이 세포 시스템으로부터의 여러 해독의 분석에 의해 분석되었다. 상기 해독은 세포 배양 매체로 분비된 단백질 및 특히 세포 생명 에너지론의 기능적 데이터뿐만 아니라, 단백질체의 데이터, 특히 세포 내 단백질 발현을 포함하였다.
정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현에서의 변화에 대한 아이프로파일링(iprofiling)이 각 조건(또는 조건들의 조합)에 노출되고, 또 각 “환경적 교란”, 즉, 코엔자임 Q10을 사용한 치료가 존재하거나 존재하지 않는 각 세포 라인(정상 및 암 세포 라인)에 대하여 수집된 세포 및 매체 표본에 대해 상기 상세한 설명에서 설명한 기술을 사용하여 수행되었다.
또한, 암, 정상 세포 및 상호 대화 실험 내에서 “환경적 교란”, 즉, 코엔자임 Q10 치료의 존재 또는 부존재 하에서 각 조건(또는 조건들의 조합)이 노출된 각세포 라인들(정상 및 암 세포 라인들)의 생명 에너지론적 프로파일링이 시호스(seahorse) 분석기를 본질적으로 제조사가 권장한 대로 채택하여 생성되었다. OCR (산소 소모율) 및 ECAR(세포외 공간 산화율)이 상기 시호스(Seahorse) 배양 플레이트에 대해 밀어 넣어지는 카트리지로서 생성된 7 μl 챔버 내의 전극에 의해 기록되었다.
각 세포 라인에 대해 각 조건(들) 및 각 교란의 존재/부존재 하에서 수집된 단백질체학 데이터, 및 각 세포 라인에 대해 각 조건(들) 및 각 교란의 존재/부존재 하에서 수집된 생명 에너지론 프로파일링 데이터가 이후 REFS™ 시스템에 의해 처리되었다. “복합체 암 교란 네트워크”가 모든 암 세포 라인으로부터 획득한 각각의 특정한 조건 (및 조건들의 조합)에 노출된 후, 교란(CoQ10)에 더 노출된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. “복합체 암 비교란 네트워크”가 모든 암 세포 라인으로부터 획득한 각각의 특정한 조건 (및 조건들의 조합)에 노출되고, 교란(CoQ10)에는 노출되지 않은 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 마찬가지로, “복합체 정상 교란 네트워크” 가 모든 암 세포 라인으로부터 획득한 각각의 특정한 조건 (및 조건들의 조합)에 노출되고, 추가적으로 교란(CoQ10)에 더 노출된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. “복합체 정상 비교란 네트워크”가 모든 암 세포 라인으로부터 획득한 각각의 특정한 조건 (및 조건들의 조합)에 노출되고, 교란(CoQ10)에는 노출되지 않은 데이터의 결합으로부터 생성되었다.
이후, “시뮬레이션 합성 네트워크”(본 명세서에서 “시뮬레이션 네트워크”로도 불림)가 상기 설명된 네 개의 복합체 네트워크 각각에 대해 REFS™을 사용하여 생성되었다. 이를 성취하기 위해, 상기 상세한 설명에서 상세히 설명한 대로, 주어진 합치된 복합체 네트워크 내의 각 노드가 시뮬레이션 네트워크를 생성하기 위해 REFS™을 사용하여 모의(10배 증가 또는 감소시킴으로써) 되었다.
곡선 아래의 넓이 및 시뮬레이션 네트워크 내에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각 간선에 대한 배수 변화가 R 프로그램밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 추출되며, 이때 상기 R 프로그램밍 언어는 통계적 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 오픈 소스 소프트웨어 환경이다.
최종적으로, 델타 네트워크가 생성되며, 이때 상기 델타 네트워크는 둘 시뮬레이션 합성 네트워크 사이의 분별을 나타낸다. 상기 델타 네트워크는 시뮬레이션 합성 네트워크로부터 생성된다. 코엔자임 Q10 에 반응하는 암 대 정상 분별 네트워크(델타-델타 네트워크)를 생성하기 위해, 도 26에 도시된 것과 같은 연속적인 비교 단계가 PERL 프로그래밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 수행되었다.
먼저, 처리되지 않은 암 네트워크(T0)와 처리된 암 네트워크(T1)가 R 프로그램을 사용하여 비교되고, 고유의 처리된 암 T1 네트워크가 분리되었다(도 26의 진한 회색 부분의 초승달 모양 참조). 이는 암 T1 ∩ (교집합) 암 T0 “델타” 네트워크를 나타낸다. 이 델타 네트워크 내에서의 단백질 상호 반응 / 연관은 코엔자임 Q10 치료에 대한 고유한 암 반응을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
마찬가지로, 처리되지 않은 정상 네트워크(T0)와 처리된 정상 네트워크(T1)가 R 프로그램을 사용하여 비교되었으며, 고유한 정상의 처리된 T1 네트워크가 분리되었다(도 26의 밝은 회색 부분의 초승달 모양 참조). 이는 정상 T1 ∩ 정상 T0 “델타” 네트워크를 나타낸다. 이 델타 네트워크 내에서의 단백질 상호 반응 / 연관은 코엔자임 Q10 치료에 대한 고유한 정상 세포 반응을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
최종적으로, 고유한 암 T1 네트워크(도 26에서 진한 회색의 초승달 형 모양 참조) 및 고유한 정상 T1 네트워크(도 26에서 밝은 회색의 초승달 형 모양 참조)가 R 프로그램을 사용하여 비교되고, 코엔자임 Q10에 대한 반응으로 오직 암에만 고유하고 정상 세포에는 존재하지 않는 네트워크가 생성된다(도 26 참조). 이러한 단백질 상호 반응 / 연관의 수집은 코엔자임 Q10 치료에 대해 정상 세포에는 존재하지 않는 암 세포 내의 고유한 경로를 나타낸다. 이러한 단백질 상호 반응 / 연관의 수집은 암 세포로부터의 분별 맵과 정상 제어 세포로부터의 분별 맵 사이의 비교로부터 생성된 분별 맵이기 때문에 “델타-델타 네트워크”라 불린다.
PERL 및 R 프로그램으로부터의 출력은 델타-델타 네트워크의 시각적 표현을 위한 오픈 소스 프로그램인 사이토스케이프(Cytoscape)로 입력된다.
본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 식별된 이러한 델타-델타 네트워크는 암 치료를 위한 타겟을 식별하는데 매우 유용하다. 예를 들어, 도 27에 제시된 델타-델타 네트워크에 따르면, 단백질 A는 OCR3(산화적 인산화의 측정)을 억제하고 ECAR3(해당 과정에 대한 측정)을 향상시킨다. 이러한 상호 반응은 암 세포 내에서 고유하기 때문에(델타-델타 네트워크는 코엔자임 Q10 치료에서 정상 세포에 통상적으로 존재하는 상호 반응을 뺀 것이므로), 단백질 A 발현의 억제가 암 대사 경로의 전형적 특징인 해당 과정-기반의 에너지 대사를 감소시키고 세포를 정상 세포에 보다 밀접히 연관된 표현형인 산소 첨가 인산화-기반의 에너지 대사 쪽으로 이동시킬 것으로 기대된다. 따라서, 코엔자임 Q10 및 단백질 A 금지 인자를 사용하는 조합 치료가 암 세포의 에너지 대사 프로필을 정상 세포에 유사한 프로필로 이동시킴으로써, 암을 치료하는데 최소한 부분적으로는 효과적일 것으로 기대된다.
본 발명의 조사적 생물학 플랫폼 기술의 이점은 실제적 예를 사용하여 더 예시되며, 이 예에서는 인과 네트워크로 도출된 하위 네트워크가 이전에 발표된 문헌에 기반한 네트워크로의 실험적 출력들 사이의 분자의 연결을 결정하기 위해 신경 네트워크를 활용하는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 IPA를 사용하는 분자의 네트워크와 비교된다. 조사적 생물학 플랫폼을 사용하여 생성된 PARK7을 포함하는 상기 인과적 하위 네트워크(도 29에 도시)가 실제적 예에서 사용된다. 조사적 생물학 플랫폼로부터의 PARK7 네트워크의 모든 분자 서명은 알려진/기존의 문헌 증거에 기반한 네트워크를 생성하기 위해 IPA로 통합된다. 이후 상기 조사적 생물학 출력과 IPA를 사용하여 생성된 출력 사이의 네트워크 출력이 비교된다.
조사적 생물학 플랫폼 기술의 출력으로부터 식별된 여섯 개의 표지 인자(도 29에 도시), 즉 도 27-29의 A, B, C, X, Y 및 Z는, IPA 생성 네트워크 내의 TP53에 연결된 것으로 관측되었다(도 28). 여섯 개의 표지 인자 가운데, A, B 및 C는 문헌에서 HSPA1A/HSPA1B뿐만 아니라 암과 연관된 것으로 보고되었다. X, Y 및 Z는 “허브” 또는 암 상태의 핵심 추진 인자로서 식별되며, 따라서 신규의 암 표지 인자로서 식별된다. 또한, MIF1 및 KARS 역시 “허브” 또는 암 상태의 핵심 추진 인자로서 식별되며, 따라서 신규의 암 표지 인자로서 식별된다. 조사적 생물학 플랫폼의 사용에 의해 식별된 요소가 과학 문헌에 발표된 알려진 요소와 연결성을 공유한다는 사실은 조사적 생물학 플랫폼에 의해 생성된 네트워크의 정확성을 증명하는 것이다. 추가적으로, 조사적 생물학 플랫폼 출력의 사용을 통해 생성된 PARK7 하위-네트워크 내에서의 상기 네트워크 연관(도 29에 도시)은, 분자 개체들 사이의 연결이 반응하는 노드들 사이의 기능적 방향성을 제공하지 않는 IPA 네트워크(도 28에 도시)와는 반대로, 각 요소의 방향적 영향을 예시한다. 또한, 조사적 생물학 플랫폼로부터의 출력(도 29에 점선으로 도시)은 이러한 성분들의 연관이 PARK7을 통한 잠재적 메카니즘으로 이어진다는 것을 예시한다. 단백질 C, 단백질 A 및 PARK7의 기타 노드들은 암 대사의 핵심 추진 인자인 것으로 관측되었다(도 27).
본 예에 의해 증명되는 것처럼, 데이터 생성, 통합 및 역 엔지니어링에 대해 편향되지 않은 접근 방식을 채택하여 계산 모델을 생성하고 뒤이어 시뮬레이션과 분별 네트워크 분석을 수행함으로써, 상기 조사적 생물학의 발견 플랫폼은 아직까지 알려지지 않은 암 생리병리학에서의 메커니즘을 질병 생리병리학의 잘 확립된 과학적 이해와 조화를 이루어 이해할 수 있게 해 준다.
예 3: 당뇨/비만/ 심장병 델타-델타 네트워크를 구축하기 위한 플랫폼 기술의 채택
본 예에서는, 필요에 따라 구축된 당뇨/비만/심장병 (CVD) 모델로부터 얻어진 데이터를 통합하고, 당뇨/비만/CVD의 발병을 추진시키는 신규의 단백질/경로를 식별하기 위해 상세한 설명에서 상세히 설명한 플랫폼 기술이 채택되었다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 당뇨/비만/CVD과 관련된 진단적/예후의 표지 인자와 더불어 당뇨/비만/CVD 치료 타겟을 제공하였다.
다섯 개의 인간 세포 라인, 즉 지방 세포, 근관 세포, 간 세포, 대동맥의 평활근 세포(HASMC), 및 기부 관상 세포(HK2)들이 이들 생체 내 질병 관련 세포가 경험하는 환경을 모의하는 다섯 조건 중 한 조건을 겪도록 하였다. 특히, 다섯 세포 라인이 다음과 갈은 조건들에 각각 별도로 노출되었다: 고혈당 조건, 고지질증 조건, 고인슐린증 조건, 혈중 산소 감소 조건 및 젖산에 대한 노출. 상기 고혈당 조건은 세포를 22 mM 글루코스를 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도되었다. 상기 고지질증 조건은 세포를 0.15 mM 나트륨 팔미테이트를 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도되었다. 상기 고인슐린 증 조건은 세포를 1000 nM 인슐린을 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도되었다. 상기 혈중 산소 감소 조건은 세포를 5% CO2, 2% O2 및 93% 질소를 함유하는 산업용 기체로 흘러 넘치게 할 수 있는 모듈라 배양기 챔버(MIC-101, Billups-Rothenberg Inc. Del Mar, CA) 상에 위치시킴으로써 유도되었다. 각 세포 라인은 또한 0 또는 12.5 mM 젖산으로 처리되었다.
또한, 두 개의 다른 암 세포인 HASMC(세포 시스템 1) 및 HK2 세포(세포 시스템 2) 또는 간 세포(세포 시스템 1) 및 지방 세포(세포시스템 2)사이의 상호 대화 실험이 수행되었으며, 이때 상기 쌍의 세포들은 공생 배양되었다. 이러한 공생 배양 접근 방식은 세포 외 세크리톰(ECS) 실험이라 불린다. 제 1 세포 시스템(예를 들어, HASMC)이 먼저 웰 내의 웰 간 유형 성장 챔버의 삽입기 에 뿌려 졌다. 여섯 개의 웰 플레이트가 보다 나은 통계적 분석을 위해 사용되었다. 삽입기 내의 제 1 세포 시스템을 뿌리는 동안, 상기 삽입기는 별도의 6 개의 웰 플레이트 상에 위치한다. 제 2 세포 시스템(예를 들어, HK2)은 주 트레이에 뿌려 졌다. 제 1 세포 시스템, 및 제 2 세포 시스템을 포함하는 주 트레이를 포함하는 삽입기가 37˚C에서 하루 밤 동안 배양되었다. 각각의 세포 시스템은 각 세포에 특정한 매체 (이때 대체적인 방법으로, 각각의 세포 시스템이 두 세포 유형 모두의 성장을 지지하는 매체에서 성장될 수 있다)에서 성장되었다. 두 번째 날에, 매체 교환에 의한 소정의 처리를 하였다. 특히, 제 1 세포 시스템을 포함하는 삽입기는 제 2 세포 시스템을 포함하는 주 트레이 내에 위치하였다. 이 트레이는 이후 소정의 기간, 예를 들어, 24 시간 또는 48 시간 동안 배양되었다. 복사된 웰이 동일한 조건으로 설정되었으며 세포들을 저장하여 2D 분석을 위한 충분한 물질들이 생산되도록 하였다. 상기 매체(1 ml 부분 표본), 삽입기로부터의 세포 및 주 트레이의 웰로부터의 세포들은 별도의 표본으로 수확되었다. 보다 나은 통계적 분석력을 제공하기 위해 상기 실험은 3회 반복 수행되었다.
상호 대화 실험 또한 “매체 교환(swap)” 실험에 의해 수행되었다. 특히, 제 1 세포 시스템 (PaCa2)으로부터 배양된 매체 또는 “세크리톰”이 상기 기술한 교란 또는 조건을 겪은 후 24시간 또는 48시간 이후에 수집되었으며, 이후 제 2 세포 시스템 (HepG2)에 24-48시간 동안 추가되었다. 제 2 세포 시스템으로부터 최종 배양된 매체 또는 “세크리톰” 이 다시 수집되었다. 모든 최종 세크리톰은 단백질체의 분석을 거쳤다.
상기 언급한 세포들을 포함하는 세포 모델에서, 상기 세포들은 위에 언급한 각 조건에 노출되며, 세포를 코엔자임 Q10로 처리하여 “환경적 교란”에 노출시킴으로써 추가적으로 “조사”된다. 특히, 세포들은 0, 50μM, 또는 100μM에서 코엔자임 Q10로 처리된다.
각각의 조건을 가지며 각각의 코엔자임 Q10 로 처리된 세포 라인에 대해 매체 표본과 더불어 세포 표본이 처리 후 24시간 및 처리 후 48시간를 포함하여 처리 이후에 수 회 수집되었다. 특정한 세포 및 특정 조건하에서, 매체 표본이 또한 수집되고 분석되었다.
정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현에서의 변화에 대한 아이프로파일링(iprofiling)이 각 조건, 또 각 “환경적 교란”, 즉, 코엔자임 Q10을 사용한 치료에 대해 각 세포 라인에 대하여 수집된 세포 및 매체 표본에 대해 상기 상세한 설명에서 설명한 기술을 사용하여 수행되었다.
상기 열거된 각 세포 라인에 대해 각 조건 및 각 교란의 존재 하에서 수집된 단백질체학 데이터, 및 각 세포 라인에 대해 각 조건 및 각 교란의 존재 하에서 수집된 생명 에너지론 프로파일링 데이터가 이후 REFS™ 시스템에 의해 처리되었다. Paca2, HepG2, THLE2 및 상호 대화 실험에 대한 미가공 데이터가 다시 표준화된 명명법을 사용하여 조합되었다. 교란된 합성 네트워크가 교란 (CoQ10)에 노출된 하나의 특정한 조건(예를 들어, 고혈당증)에 대해 모든 세포 라인으로부터 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 교란되지 않은 합성 네트워크가 교란에 노출되지 않은(CoQ10가 없는) 동일한 하나의 특정한 조건(예를 들어, 고혈당증)에 대해 모든 세포 라인으로부터 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 마찬가지로, 교란된 합성 네트워크가 교란 (CoQ10)에 노출된 제 2 제어 조건(예를 들어, 정상 혈당 상태)에 대해 모든 세포 라인으로부터 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 교란되지 않은 합성 네트워크가 교란에 노출되지 않은(CoQ10가 없는) 제 2 제어 조건(예를 들어, 정상 혈당 상태)에 대해 모든 세포 라인으로부터 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다.
시뮬레이션 네트워크를 생성하기 위해 상기 기술된 합치된 합성 네트워크에서의 각 노드들이 상기 상세한 설명에서 상세하게 설명된 REFS™를 사용하여 (10 배 증가시키거나 감소시킴으로써) 모의되었다.
곡선 아래의 넓이 및 시뮬레이션 네트워크 내에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 각 간선에 대한 배수 변화가 R 프로그램밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 추출되며, 이때 상기 R 프로그램밍 언어는 통계적 컴퓨팅 및 그래픽을 위한 오픈 소스 소프트웨어 환경이다.
델타 네트워크가 모의된 합성 네트워크로부터 생성되었다. 코엔자임 Q10 에 반응하는 당뇨/비만/심장병 조건 대 정상 조건의 분별 네트워크(델타-델타 네트워크)를 생성하기 위해, 비교의 단계들이 도 30에 도시된 대로, PERL 프로그램에 의해 작성된 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 수행되었다.
특히, 도 30에서 보인 바와 같이, 치료 T1 은 코엔자임 Q10 치료를 말하며 NG와 HG는 조건으로서 정상 및 고혈당증을 말한다. NG in the NG∩HG 델타 네트워크로부터의 고유한 간선들은 HG∩HGT1 델타 네트워크 내의 HGT1의 고유한 간선들과 비교되었다. NG와 HGT1의 교집합 내의 간선들은 T1에 의해 NG로 회복된 HG이다. T1에 의해 NG로 회복된 HG의 간선들은 NG∩HG 델타 네트워크 상에 중첩되었다(도 31에서 진한 색의 원으로 도시됨)
특히, 시뮬레이션된 정상 혈당(NG) 조건의 복합 맵과 시뮬레이션된 고혈당(HG) 조건의 복합 맵이 정상 혈당 조건의 고유한 간선들을 생성하기 위해 필요에 따라 제작된 Perl 프로그램을 사용하여 비교되었다. 코엔자임 Q10 치료(HG)가 없는 시뮬레이션된 고혈당(HG) 조건의 복합 맵과 코엔자임 Q10 치료(HG)가 있는 시뮬레이션된 고혈당 조건의 복합 맵이 코엔자임 Q10 치료(HGT1)에 의한 고혈당 조건의 고유한 간선들을 생성하기 위해 필요에 따라 제작된 Perl 프로그램을 사용하여 비교되었다. 정상 혈당 조건(NG)으로부터의 고유한 간선들과 코엔자임 Q10 치료가 행해진 고혈당증 조건으로부터의 고유한 간선들의 교집합 내의 간선들이 Perl 프로그램에 의해 식별되었다. 이 간선들은 코엔자임 Q10 치료에 의해 고혈당증 조건으로부터 정상 혈당 조건으로 회복된 요소/네트워크를 나타낸다. 코엔자임 Q10 치료에 의해 정상 혈당 조건으로 회복된 고혈당 간선들의 델타-델타 네트워크가 정상 혈당 ∩ 고혈당 델타 네트워크 상에 중첩되었다. 중첩된 네트워크의 표본이 도 31에 도시된다. 도 31은 코엔자임 Q10(델타-델타 네트워크)에 반응하는 예시적인 당뇨/비만/심장병 조건 대 정상 조건의 분별 네트워크이다. 도 31에서 진한 색의 원은 코엔자임 Q10 치료에 의해 고혈당증 조건으로부터 정상 혈당 조건으로 회복된 것으로 식별된 간선들이다. 도 31에서 옅은 색의 원은 고유한 정상 혈당으로 식별된 간선이다.
PERL 및 R 프로그램으로부터의 출력은 델타-델타 네트워크의 시각적 표현을 위한 오픈 소스 프로그램인 사이토스케이프(Cytoscape)로 입력된다.
고혈당증 대 정상 혈당 조건에 대해 상기 설명한 실험과 마찬가지로, 코엔자임 Q10에 의한 치료가 없는 치료고지혈증 조건의 시뮬레이션된 복합 네트워크(상기 기술된 당뇨/비만/심장혈관 관계 세포로부터의 데이터를 결합)와 코엔자임 Q10에 의한 치료가 행해진 고지혈증 조건의 시뮬레이션된 복합 네트워크(상기 기술된 당뇨/비만/심장혈관 관계 세포로부터의 데이터를 결합)가 코엔자임 Q10 치료에 의한 고지혈증 조건의 고유한 간선들을 생성하기 위해 Perl 프로그램을 사용하여 비교되었다. 정상 지질 조건으로부터의 고유한 간선들과 코엔자임 Q10 치료가 행해진 고지질 조건으로부터의 고유한 간선들의 교집합 내의 간선들이 Perl 프로그램에 의해 식별되었다. 이 간선들은 코엔자임 Q10 치료에 의해 고지혈증 조건으로부터 정상 지질 조건으로 회복된 요소/네트워크를 나타낸다. 코엔자임 Q10 치료에 의해 정상 지질 조건으로 회복된 고지혈증 간선들의 델타-델타 네트워크가 정상 지질 ∩ 고지혈증 델타 네트워크 상에 중첩되었다. 중첩된 네트워크의 표본이 도 32에 도시된다. 도 32에서 진한 색의 원은 코엔자임 Q10 치료에 의해 고지혈증 조건으로부터 정상 지질 조건으로 회복된 것으로 식별된 간선들이다. 도 32에서 옅은 색의 원은 고유한 정상 지질 로 식별된 간선이다. FASN이 고지혈증에서 정상 지질 조건으로의 회복에 대한 코엔자임 Q10의 효과를 조절하는 신호 전달 경로의 중요한 요소로서 식별되었다.
FASN과 같은 지방산 합성 효소는 비만, 인슐린 저항성 또는 지질 대사 장애와 같은 인간의 대사적 변이의 거의 모든 측면에 관계되어 왔다. FASN 금지 인자는 분자의 메커니즘은 알려져 있지 않지만, 비만의 치료를 위한 주요 분자로 제안되었다(몹스(Mobbs) 외, 2002). 세룰레닌 및 합성 화합물 C75- FASN 금지 인자가 음식 섭취를 줄이는 효과가 있고 체중 감소를 일으키는 것으로 밝혀 졌다(로퍼스(Loftus) 외, 2000).
도 32에서 보인 바와 같이, FASN이 본 명세서에서 기술된 플랫폼 기술에 의해 코엔자임 Q10의 당뇨 상태에서 정상적 상태로 회복시키는 효과를 조절하는 신호 경로 상에서의 중요한 요소로서 식별된다는 사실은 본 델타-델타 네트워크의 정확성을 증명하는 것이다. 따라서, 본 델타-델타 네트워크에서 식별된 다른 신규의 요소들이 잠재적 치료적 요소 또는 추가적인 조사를 위한 약제 타겟이 될 수 있을 것이다.
예 4: 약제로 유도되는 심장 독성의 모델을 구축하기 위한 플랫폼 기술의 채택
본 예에서는, 필요에 따라 구축된 심장 독성 모델로부터 얻어진 데이터를 통합하고, 약의 발병/ 독성을 추진시키는 신규의 단백질/경로를 식별하기 위해 상세한 설명에서 상세히 설명한 플랫폼 기술이 채택되었다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 독성 생물학적 표지 인자를 제공하였다.
건강한 심장에서 수축 기능은 지방산 및 탄수화물 산화의 균형에 따라 달라진다. 만성 섭취 불균형, 사용, 기관의 생물 발생 및 비지방질 조직(심장 및 간)에서의 분비가 미토콘드리아의 손상 및 기능 장애의 핵심에 있으며, 약제로 유도되는 심장 독성에 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. 여기서 출원인들은 특히 세포 생명 에너지론 및 미토콘드리아의 막 기능을 살펴 보기 위해 단백질 및 지질 서명을 기능적 종단점 분석과 결합하는 시스템적 접근 방식을 기술한다. 과도 지방산 및 고혈당증에 의해 보완되는 당뇨성 및 정상 심장근 세포를 포함하는 생체 외 모델이 독성의 서명 및 잠재적 메커니즘을 생성하기 위해 일단의 약제들로 처리되었다. 출원인들은 다음 열거된 단계를 포함하여 여러 수준에서 에너지 대사 성분을 교란시킴으로써 미토콘드리아를 불안정하게 하는 약제의 다양한 효과를 예증하였다: (i) 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자의 발현을 제어하는 전사적 네트워크의 조절의 장애; (ii) 당뇨성 심장근 세포 내 GPAT1 와 타파진의 유도 및 이에 의한 데노보 인산지질 합성 의 개시와 미토콘드리아 막에서의 리모델링; 및 (iii) 섭취, 지방산 산화 및 ATP 합성에 영향을 미치는 당뇨성 심장근 세포 내 지방산 운명의 변화. 또한, 출원인들은 수중 실험실 생물학 및 AI 기반 데이터 마이닝 플랫폼의 파워를 결합하여 베이지안(Bayesian) 모델에 기반한 인과 네트워크를 생성하였다. 정상 세포 기능의 손실과 인과적 관계를 가지는 단백질 및 지질의 네트워크가 세포보호 메커니즘으로부터 약제 유도 독성의 메커니즘을 알아내기 위해 사용되었다. 이러한 신규의 접근 방식은 변경된 표현형을 교정하는 보다 안전한 치료제의 개발을 가능케 하는 한편으로, 독성의 메커니즘을 이해하기 위한 강력한 새로운 도구로 작용할 것이다
인간 심장근 세포를 생체 내 질병 관련 세포가 경험하는 당뇨성 환경을 모의하는 조건을 겪게 하였다. 특히, 상기 세포는 고혈당 조건 및 고지혈증 조건에 노출되었다. 고혈당 조건은 세포를 22 mM 글루코스를 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도되었다. 고지혈증 조건은 세포를 1mM L-카르니틴, 0.7mM 올레산 및 0.7mM 리놀레산을 함유하는 매체에서 배양함으로써 유도되었다.
상기 언급한 세포들을 포함하는 세포 모델에서, 상기 세포들은 위에 언급한 각 조건에 노출되며, 세포를 심장 독성을 야기하는 것으로 알려진 당뇨 치료제(T)와 구조 분자 (R). 또는 당뇨 치료제와 구조 분자 모두(T+R)로 처리하여 환경적 교란에 노출시킴으로써 추가적으로 “조사”된다. 특히, 상기 세포는 당뇨 치료제로 처리되거나; 구조 분자 코엔자임 Q10으로 0, 50μM 또는 100μM에서 처리되거나; 당뇨 치료제와 구조 분자 코엔자임 Q10 모두로 처리되었다.
각각의 조건에서 각각 교란 처리된 세포 라인에 대해 세포 표본이 처리 후 6시간를 포함하여 처리 이후에 수 회 수집되었다. 특정 조건을 위해 매체 표본이 또한 수집되고 분석되었다.
정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현 에서의 변화에 대한 아이프로파일링이 각 조건에 대해 각 “환경적 교란”, 즉, 당뇨 치료제 치료, 코엔자임 Q10 치료 또는 두 치료 모두를 가하여 수집된 세포 및 매체 표본에 대해 상세한 설명에서 기술된 기술을 사용하여 수행된다. 전사적 프로파일링 실험이 바이오래드(Biorad) cfx-384 증폭 시스템을 사용하여 수행되었다. 데이터 수집(Ct)에 이어, 제어 표본에 대한 최종 배수 변화가 δCt 방법을 사용하여 제조사의 프로토콜에서 제시된 대로 수행되었다. 리피도믹스 실험이 질량 분광학을 사용하여 수행되었다. 산소 소모율(OCR)과 같은 기능적 분석이 시호스(Seahorse) 분석기를 ??택하여 기본적으로 제조사가 권장하는 방식으로 수행되었다. OCR은 전극에 의해 시호스(Seahorse) 배양 플레이트에 밀어 넣어지는 카트리지로 생성된 7 μl 챔버에 기록되었다.
도 35에서 보인 바와 같이, 당뇨성 심장근 세포(고혈당 및 고지혈증 조건을 겪은 심장근 세포) 내에서 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자의 전사 네트워크 및 발현이 교란된 치료와 교란되지 않은 치료 사이에서 비교되었다. 특히, 전사적 네트워크 및 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자의 발현 데이터가 당뇨 치료제로 처리된 당뇨성 심장근 세포(T) 및 처리되지 않은 당뇨성 심장근 세포 표본(UT) 사이에서 비교되었다. 전사적 네트워크 및 인간 미토콘드리아의 에너지 대사 유전자 발현 데이터가 당뇨 치료제와 구조 분자 코엔자임 Q10 모두로 처리된 당뇨성 심장근 세포(T+R)와 처리되지 않은 당뇨성 심장근 세포 표본(UT) 사이에서 비교되었다. 처리되지 않은 당뇨성 심장근 세포로부터의 데이터를 비교한 결과, 당뇨성 심장근 세포가 당뇨 치료제로 처리되었을 때 특정한 유전자 발현 및 전사가 변화되었다. 구조 분자 코엔자임 Q10은 당뇨 치료제의 독성 효과를 역전시키고 유전자 발현 및 전사를 정규화하는 것으로 예시되었다.
도 36A에서 보인 바와 같이, 심장근 세포가 정상 혈당(NG) 또는 고 혈당(HG) 조건 중 하나에서 배양되고 당뇨 치료제 단독으로(T) 또는 당뇨 치료제와 구조 분자 코엔자임 Q10 모두(T+R)로 처리되었다. 각 조건 및 각 치료에 대한 GPAT1과 TAZ의 단백질 발현 수준이 서부 블로팅으로 검사되었다. GPAT1 과 TAZ 모두 고혈당증 조건을 겪고 당뇨 치료제로 처리된 심장근 세포에서 상향 조절되었다. 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 당뇨 치료제와 구조 분자 코엔자임 Q10 모두로 처리되었을 때, GPAT1 과 TAZ의 상향 조절된 단백질 발현 수준이 정규화되었다.
도 37A에서 보인 바와 같이, 미토콘드리아의 산소 소모율(%) 실험이 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포 표본에 대해 수행되었다. 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포는 처리되지 않거나(UT), 심장 독성을 야기하는 것으로 알려진 당뇨 치료제 T1으로 처리되거나, 심장 독성을 야기하는 것으로 알려진 당뇨 치료제 T2로 처리되거나, 당뇨 치료제 T1 및 구조 분자 코엔자임 Q10 모두(T1+R)로 처리되거나, 당뇨 치료제 T2와 구조 분자 코엔자임 Q10 모두(T2+R)로 처리되었다. 처리되지 않은 제어 표본와 비교한 결과, 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 당뇨 치료제 T1 또는 T2로 처리되었을 때 미토콘드리아의 OCR이 감소하였다. 그러나, 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 당뇨 치료제 및 구조 분자 코엔자임 Q10 모두(T1 + R, 또는 T2 + R)로 처리되었을 때는 미토콘드리아의 OCR이 정상화되었다.
도 37B에서 보인 바와 같이, 미토콘드리아 ATP 합성 실험이 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포 표본에 대해 수행되었다. 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 처리되지 않거나(UT), 당뇨 치료제로 처리되거나(T), 또는 당뇨 치료제 및 구조 분자 코엔자임 Q10 모두(T+R)로 처리되었다. 처리되지 않은 제어 표본와 비교한 결과, 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 당뇨 치료제(T)로 처리되었을 때 미토콘드리아의 ATP 합성이 억제되었다.
도 38에서 보인 바와 같이, 수집된 단백질체 데이터를 기반으로, 약제 치료에 의해 하향 조절된 단백질이 GO 항으로 주석되었다. 고혈당증 조건을 겪은 심장근 세포가 심장 독성을 야기하는 것으로 알려진 당뇨 치료제로 처리되었을 때, 미토콘드리아의 에너지 대사에 관련된 단백질이 하향 조절되었다.
각 조건에서 각 교란을 가하여 수집된 단백질체학, 리피도믹스, 전사적 프로파일링, 기능적 분석, 및 서부 블로팅 데이터가 REFS™ 시스템에 의해 처리되었다. 복합 교란 네트워크가 각 교란 (예를 들어, 당뇨 치료제, CoQ10, 또는 둘 모두)에 노출된 특정한 조건 (예를 들어, 고혈당증, 또는 고지혈증)으로부터 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 교란되지 않은 복합 네트워크가 동일한 하나의 특정 조건(예를 들어, 고혈당증, 또는 고지혈증)에서 교란없이(비교란) 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 마찬가지로, 교란된 복합 네트워크가 제 2 제어 조건(예를 들어, 정상 혈당 상태)에서 각 교란(예를 들어, 당뇨 치료제, CoQ10, 또는 둘 모두)에 노출되어 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다. 교란되지 않은 복합 네트워크가 동일한 제 2 제어 조건(예를 들어, 정상 혈당 상태)에서 교란없이(비교란) 획득된 데이터의 결합으로부터 생성되었다.
시뮬레이션 네트워크를 생성하기 위해 상기 기술된 합치된 합성 네트워크 내의 각 노드가 (10 배 증가 또는 감소시킴으로써) 상기 상세한 설명에서 상세히 설명된 대로 REFS™을 사용하여 모의되었다.
시뮬레이션 네트워크 내에서 부모 노드를 자식 노드에 연결하는 곡선 아래 면적과 배수 변화가 R 프로그래밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 추출되었으며, 이때 상기 R 프로그래밍 언어는 통계적 계산과 그래픽을 위한 오픈 소스 소프트웨어 환경이다.
모의된 합성 네트워크로부터 델타 네트워크가 생성되었다. 당뇨 치료제에 대한 반응으로 약제 유도 독성 조건 대 정상 조건 분별 네트워크(델타 네트워크)를 생성하기 위해, 비교 단계들이 R 프로그래밍 언어를 사용하는 필요에 따라 구축된 프로그램에 의해 도 39에 도시된 대로 수행되었다.
특히, 도 39에서 보인 바와 같이, UT는 고혈당증 조건에서 처리되지 않은 제어 심장근 세포의 단백질 발현 네트워크를 말한다. 치료 T는 고혈당증 조건에서 처리된 심장근 세포의 당뇨 치료제의 단백질 발현 네트워크를 말한다. UT∩T 델타 네트워크에서 T로부터의 고유한 간선이 도 40에 제시된다.
특히, 고혈당증 조건 내 당뇨 치료제로 치료된 심장근 세포의 고유한 간선을 생성하기 위해, 고혈당증 조건 내 처리되지 않은 심장근 세포의 모의된 복합 맵과 고혈당증 조건 내 당뇨 치료제로 처리된 심장근 세포의 모의된 복합 맵이 필요에 따라 제작된 Perl 프로그램을 사용하여 비교되었다. 델타 네트워크의 시각적 표현을 생성하기 위해 PERL 및 R 프로그램으로부터의 출력이 오픈 소스 프로그램인 사이토스코프(Cytoscape)로 입력되었다. 도 40에서 보인 바와 같이, 상기 네트워크는 고혈당증 조건에서의 당뇨 치료제 대 처리되지 않은 심장근 세포/ 심장 독성 모델에 의해 추진된 델타 네트워크를 나타낸다.
도 40에 도시된 약제 유도 독성 조건 대. 정상 조건 분별 네트워크로부터, GRP78, GRP75, TIMP1, PTX3, HSP76, PDIA4, PDIA1, CA2D1와 같은 약제로 유도되는 심장 독성의 생리병리학을 추진하는 단백질이 식별되었다. 이러한 단백질들은 다른 심장 독성 유도 약제를 식별하기 위한 생물학적 표지 인자로서 작용할 수 있다. 이러한 단백질들은 또한 심장 독성을 완화시킬 수 있는 제제를 식별하기 위한 생물학적 표지 인자로서 작용할 수 있다.
본 예에서 설명한 실험은 교란된 막 생물학 및 약제 치료에 노출된 당뇨성 심장근 세포 내 자유 지방산의 운명의 변화가 약제 유도 독성의 핵심을 나타냄을 보여 준다. 데이터 통합 및 네트워크 생물학을 통해 심장 독성에 대한 이해를 증진할 수 있었으며, 심장 독성의 예후를 나타내는 신규의 생물학적 표지 인자를 식별할 수 있었다.
예 5: 효소 활성을 밝히기 위한 다중 단백질체학 모델의 구현을 위한 플랫폼 기술의 채택.
일반적으로, 위의 예 1-4에서 설명된 플랫폼 기술은 생물학적 시스템 또는 질병 과정의 조절 인자를 식별하기 위한 방법을 더 구현하기 위해 적응될 수 있다. 상기 방법은 생물학적 시스템의 특징적 측면을 나타내기 위해생물학적 시스템과 연관된 세포를 사용하여 생물학적 시스템에 대한 모델을 채택한다. 상기 모델은 최소한 세 개의 수준의 데이터, 즉 (i) 생물학적 시스템과 연관된 세포에서의 효소의 전역적 활성을 나타내는 제 1 데이터 집합, (ii) 생물학적 시스템과 연관된 세포에서의 효소 대사 물질 또는 기질 상의 효소의 전역적 활성을 나타내는 제 2 데이터 집합, 및 (iii) 생물학적 시스템과 연관된 세포에서의 단백질체의 전역적 변화를 나타내는 제 3 데이터 집합을 획득하기 위해 사용된다. 상기 데이터는 효소의 전역적 활성, 효소의 전역적 활성의 영향, 및 단백질체의 전역적 변화 사이의 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된다. 상기 합치 인과 관계 네트워크는 프로그래밍된 컴퓨터 장치를 사용하여(즉, 알려진 어떠한 생물학적 관계에도 기반하지 않고) 제 1, 제 2 및 제 3 데이터 집합에만 기반한다. 상기 합치 인과 관계 네트워크는 다시 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 식별하기 위해 사용되며, 이때 상기 고유한 인과 관계와 연관된 최소한 하나의 유전자 또는 단백질이 생물학적 시스템 또는 질병 과정의 조절 인자로서 식별된다.
본 예에서, 상기 플랫폼 기술은 효소 활성 및 단백질체에 대한 이 활성의 직접적 효과를 측정하기 위한 다중 단백질체학 기술을 구현하기 위해 적응되었으며, 이에 의해, 세포 단백질체 내에서의 전역 변화의 맥락에서, 효소들과 이들의 대사 물질/기질 사이의 인과 관계를 이해하기 위해 사용될 수 있는 시스템을 제공한다. 본 예에서 예증되었듯이, 효소 활성이 효소 발현과 직교할 수 있기 때문에(예를 들어, 하향 조절된 활성과 조절되지 않은 발현), 이러한 기술은 귀중한 통찰을 제공할 수 있다. 이러한 분석의 결과로 얻어지는 관계적 맵은 질병과 연관된 진단적/예후의 표지 인자뿐만 아니라 질병 치료 타겟을 제공할 수 있다. 이러한 타겟 및 표지 인자는 치료적 성분 및 이를 위한 방법을 제공할 수 있다. 모델을 수립하고, 데이터 집합을 획득하며, 합치 인과 관계 네트워크를 생성하고, 생물학적 시스템에 고유한 인과 관계를 식별하기 위한 기술들이 발명의 요약, 상세한 설명, 및 상기 예에서 기술된다. 모델을 수립하고 효소의 전역적 활성 및 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 효소의 전역적 활성의 효과를 나타내는 데이터 집합을 획득하기 위한 추가적인 기술들이 이하에서 제공된다.
도 41A는 효소(예를 들어, 키나아제) 활성을 밝히기 위한 다중 단백질체 기술을 채택하는 생물학적 시스템 또는 질병 과정의 조절 인자를 식별하기 위한 방법을 도시한다. 먼저, 본 플랫폼 기술에 따라 세포 라인이 질병을 모의하는 조건을 겪게 되는 모델이 수립되고 환경적 교란(예를 들어, 하기 제공된 간세포 암종들의 특정한 예에서 넥사바(Sorafenib)에 대한 노출)에 노출시킴으로써 조사된다. 제어 표본이 비교를 위해 제공된다. 두 번째로, 효소 활성 및 그 하향 효과가 (i) 효소의 전역적 활성, (ii) 단백질체(예를 들어, 효소 활성의 대사 물질/기질)에 대한 효소 활성의 특정 효과, 및 (iii) 세포 단백질체에 대한 전역 효과를 분석함으로써, 전역 단백질체 변화의 맥락에서 추적된다. 세 번째로, 관심있는 조절 인자를 식별하기 위해 상기 데이터 집합이 본 플랫폼 기술에 따라 분석된다. 예를 들어, 암 모델은 알려진 항암 약제 키나아제 금지 인자에 의해 조사될 수 있으며, 시스템에 대한 이러한 교란 전역 키나아제 활성에 미치는 효과가 인산 단백질체 및 전체 단백질체에 대한 결과적인 효과와 함께 분석될 수 있고, 데이터 집합이 AI 기반 REFS™ 시스템에 의해 분석될 수 있다.
본 예에서, 에파토세포 암종 (HCC)이 본 플랫폼 기술의 예시적 구현을 제공하기 위해 선택되었다. HCC는 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며, 폐 및 위의 암종에 이어 세 번째로 가장 치명적인 암의 위치를 차지하고 있다. 다양한 원인론, 높은 질병률/사망률, 초기 진단을 위한 진단적 표지 인자의 부족 및 HCC의 변동성 높은 임상 과정으로 인해 이의 진단 및 치료가 부진하였다. HCC를 연구한 후 몇 년 뒤에도, HCC 내에서의 분자의 메카니즘 작동에 대한 이해는 불완전하였다. 게놈, 전사체, 및 비교적 단백질체의 프로필이 HCC 재탐구를 위한 어느 정도 중요한 통찰을 제공하였다. 그러나, 많은 연구들이 HCC와 연관된 세포 변화의 단일 측면에만 초점을 맞추고 있어서 생물학적 시스템의 진정한 복잡성과 동적 특성에 대한 이해가 완전히 이루어지지 못했다.
이러한 예시적 예는 (i) 세포 생물학, 및 (ii) 인과적 단백질 네트워크를 생성하는 통합된 단백질체학 플랫폼과 정보학 플랫폼의 파워를 결합하여, 예를 들어, 인산화, 및, 예를 들어, 키나아제와 같이 이러한 메커니즘에 참여하는 효소와 같은 HCC의 생리병리학에서 번역 후 수정의 역할을 구분한다. 특히, 이 접근 방식은 ATP 결합 도메인 농축 탐침 및 HCC 세포 모델 내 전체 단백질의 인산-단백질체 매핑을 채택하는 활성 기반 단백질체학을 통합한다.
병이 진전된 HCC 환자에 대한 첫 번째 라인의 화학 치료용 제제인 다중 키나아제 금지 인자 넥사바(Sorafenib)가 이 치료와 연관된 전역 키나아제 활성 및 단백질 인산화 변화의 역할을 탐침하기 위해 사용되었다. HepG2 (ATCC 접근 번호 HB-8065) 세포 라인이 HCC 세포를 모델링하기 위해 선택되었으며 THLE2 (ATCC 접근 번호 CRL-10149)세포 라인이 모델 정상 간 세포를 모델링하기 위해 선택되었다.
도 41B은 전역 효소(예를 들어, 키나아제) 농축 프로파일링을 위한 방법을 도시한다. 먼저, 타겟이된 효소(예를 들어, 키나아제)를 포함하는 세포 용해물이 준비된다. 제 2 단계는 탐침 결합(예를 들어, 키나아제의 경우에는 ATP 탐침)이다. 이후, 상기 효소는 소화되고 탐침에 결합된 파편들이 포획된다. 이들 파편들은 (예를 들어, LC-MS/MS에 의해) 분석될 수 있으며 이에 따라 해당하는 단백질이 (예를 들어, LC-Ms/MS 데이터의 데이터베이스 탐색을 통해) 식별된다.
THERMO SCIENTIFICⓒ PIERCE® 키나아제 농축 키트 및 ACTIVXⓒ 탐침(사용 지침은 다음 웹 사이트의 THERMO SCIENTIFICⓒ 및 PIERCE® Bio기술에서 볼 수 있다: www.thermoscientific.com/pierce)이 효소의 전역적 활성 분석을 위해 사용되었다. 간단히 말해, 이들 키트들 및 유사한 키트들은 키나아제, 셰프론 및 대사적 효소를 포함하는 ATP 분해 효소의 선택적 라벨링 및 농축을 가능하게 한다. ATP 및 ADP 탐침은 일반적으로 뉴클레오타이드 파생체이며, 이들은 효소의 활성 부위를 뉴클레오타이드-결합 부위 내의 보존된 라이신 잔여부로서 공유 결합적으로 수정한다. 예를 들어, 데스티오비오틴-ATP 및 ?ADP의 구조는 라빌 아크릴-인산염 결합에 의해 뉴클레오타이드에 부착된 수정된 바이오틴으로 구성된다. 효소 활성 부위 내 라이신의 위치에 따라, 데스티오비오틴-ATP 또는 -ADP 중 하나가 라벨링 특유의 ATP 분해 효소로서 뱌람직하다.
데스티오비오틴-ATP 및 -ADP 모두 표본 내 타겟 효소 클라스들을 선택적으로 농축, 식별 또는 프로파일링하거나, 효소 금지 인자의 특정성 및 친화성을 분석할 수있다. 많은 ATP 분해 효소 및 기타 뉴클레오타이드-결합 단백질은 이들이 효소적으로 비활성인 상태에서도 뉴클레오타이드 또는 금지 인자를 결합시킨다; 이러한 반응 제제들은 복잡한 표본 내에서 비활성 및 활성 효소들을 결합시킨다. 표본을 활성 부위 탐침을 위해 경쟁하는 작은 분자 금지 인자로 사전 배양함으로써 결합 친화성 및 타겟 특정성에 대한 금지 인자 결합의 결정에 사용할 수있다.
활성 부위 라벨링에 대한 평가는 서부 블롯 또는 질량 분광학(MS) 중 하나에 의해 성취될 수 있다. 서부 블롯 작업 흐름에 대해 설명하면, 데스티오비오틴으로 라벨링된 단백질이 SDS-PAGE 분석을 위해 농축되고 이어서 특정한 항체로 탐지된다. MS 작업 흐름에 대해 설명하면, 데스티오비오틴으로 라벨링된 단백질이 환원, 알킬화 및 효소전으로 펩티드로 소화된다. 데스티오비오틴으로 라벨링된 활성 부위 펩티드만이 LC-MS/MS에 의한 분석을 위해 농축된다. 두 작업 흐름 모두가 금지 인자 타겟 결합을 결정하기 위해 사용될 수 있으나, MS 작업 흐름만이 전역 금지 인자 타겟 및 비타겟을 식별할 수 있다.
인산 단백질체 분석을 위해 THERMO SCIENTIFICⓒ PIERCE® TiO2 인산펩티드 농축 및 정리키트(지침은THERMO SCIENTIFICⓒ 및 PIERCE® Bio기술 웹사이트에서 볼 수 있다. www.thermoscientific.com/pierce)가 사용되었다. 간단히 말해서, 이들 키트 및 이와 유사한 키트들은 질량 분광학(MS)에 의한 분석에 의해 복합체 및 분할된 단백질 소화물로부터 인산화된 펩티드를 효율적으로 분리할 수 있게 해 준다. 최적화된 버퍼와 결합된 구 형상의 다공성 이산화티타늄(TiO2)은 최소한의 비특정적 결합을 가지는 인산펩티드의 농축과 식별에 대한 개선을 제공한다. 스핀 기둥 양식은 빠르고 쉽게 사용할 수 있으며 300-1000μg의 소화된 단백질 표본으로부터 100μg까지의 인산펩티드를 농축할 수 있다. 상기 키트의 최적화된 프로토콜, 버퍼 성분 및 흑연 스핀 기둥은 결과적으로 MS 분석에 사용할 수 있는 고수율의 깨끗한 인산펩티드 표본을 생산한다.
인산화는 세포 신호 전달, 성장, 분화와 분리, 및 예정된 세포 사멸과 같은 생물학적 기능에 필수적인 단백질 수정 과정이다. 그러나, 인산펩티드는 높은 친수성을 가지고 있고 적은 양으로 존재하며, 결과적으로 크로마토그래피, 이온화 및 파편화가 빈약하다. 따라서, 인산펩티드 농축은 성공적인 MS 분석을 위해 필수적이다. 인산펩티드 농축 및 정리 키트는 인산펩티드 농축 및 식별을 위한 완전한 작업 흐름을 제공하기 위한 용균, 환원, 알킬화, 소화 및 흑연 스핀 기둥에 호환될 수 있다.
비교(comparative) 단백질체학, 인산 단백질체 및 효소 활성 데이터가 AI 기반 REFS™ 정보학 플랫폼으로 통합된다. 특히 기능적 관점에서의 단백질 상호 반응의 인과 네트워크, 즉 키나아제/효소 활성 및 이 키나아제의 잠재적 타겟이 인산화되고 생성될 수 있다. 또한, 세포의 기능적 판독을 사용하여, 타겟의 인산화를 조절하고 병리생리학적 세포 거동을 기계적으로 추진하는 효소/ 키나아제가 결정된다. 본 명세서에서 개략적으로 설명된 예시적 구현을 통해 세포 반응의 전역적 특성화, 화학적 반응도의 메커니즘에 대한 이해, 및 HCC의 임상적 운영을 위한 잠재적 타겟/생물학적 표지 인자를 쉽게 성취할 수 있다.
물질 및 방법
세포들은 다음 프로토콜에 따라 배양되었다. 제 1일: HepG2/Hep3B -3.2x106개의 세포를 T-75 배양 플라스크 내에; 7.4x106개의 세포를 T-175 배양 플라스크 내에; 또는 9.5x106개의 세포를 T-225 배양 플라스크 내에 뿌린다. THLE-2 - 1.3x106개의 세포를 T-75 배양플라스크 내에 뿌린다. 제 2일: 16-24시간 후에, 50-70% 융합에서 - 치료를 가한다. 제어: 0.01%의 최종 농도에서 DMSO. EGF: 10 mM 아세트 산 내 500 ng/mL. 넥사바(Sorafenib): DMSO 내 0.1% 부피에서 1 μM. 제 3일: 치료 후 24시간 이후, 세포들을 트립신화에 의해 수확한다. 펠릿을 동결 이전에 PBS로 2회 세척한다.
전반적 효소 활성 분석은 다음 프로토콜에 따라 수행되었다.
세포 용균:
신선하게 준비된 용균 버퍼 -5 M 요소, 50 mM 트리-HCL pH 8.4, 0.1% SDS, 1% 프로테아제 금지 인자 칵테일, 1% 포스타파아제 금지 인자 칵테일
1) 2000 g에서 5 분간 원심분리하고 상층액을 제거한 1.5-2 mL 에펜도르프 마이크로 튜브 내의 펠릿 세포.
2) 세포를 PBS 내의 재현탁 펠릿으로 세척한다. 세척을 한 번 더 반복한다.
3) 적절한 양의 용균 버퍼를 각 표본 및 보텍스에 첨가한다.
4) 주기적으로 혼합하면서 얼음 위에서 10분간 배양한다.
5) 용균이 완전해 질 때까지 각 표본을 초음파 처리한다.
6) 최고 속도로 15분 간 원심 분리한다
7) 용해물(상층액)을 새로운 튜브로 옮긴다.
용균 버퍼-교환:
피어스(Pierce) 사의 사전에 제작된 반응 버퍼를 사용.
반응 버퍼 - 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% TritonX-100
1) 제바(Zeba) 스핀 제염 기둥의 바닥 마감부를 비틀어 뚜껑을 느슨하게 한다.
2) 15 mL 콘 모양 튜브 내에 넣는다.
3) 기둥을 실온의 1000 g에서 2분 간 원심분리하여 저장 용액을 제거한다.
4) 3 mL의 반응 버퍼를 기둥에 추가한다. 1000 g에서 2분 간 원심분리하여 버퍼를 제거한다. 이 과정을 2회 더 반복하고, 버퍼를 제거한다.
a. 최종 세척 후에 과잉 버퍼가 있는 경우, 추가적으로 1000 g에서 2-3분간 원심분리한다.
5) 기둥을 새로운 콘 모양 튜브로 옮긴다.
6) 전체 표본을 수지 베드의 중앙에 천천히 가한다.
7) 1000 g에서 2분 간 원심분리하여 표본을 수집한다. 기둥을 제거한다.
8) 1:100 프로테아제/포스타파아제 금지 인자 칵테일을 표본에 추가하고 얼음 상에 위치시킨다.
a. 표본은 냉동고에서 -80 ℃로 냉동될 수 있다.
중단 포인트
탐침을 사용한 표본 라벨링:
사전 제작된 피어스(Pierce) 제 1 M MgCl2을 사용하였음.
신선한 1 M MnCl2를 제조.
1) 브래드포드(Bradford) 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정한다.
2) 용해물을 물을 사용하여 가능하면 2 mg/mL(2 μg/μL)로 희석한다.
3) 2 mg을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다.
4) 20 μL의 1 M MgCl2을 각 표본에 추가하고, 혼합한 후, 실온에서 1분 간 배양한다.
주: 최종 농도는 0.02 M MgCl2이다.
5) 10 μL의 1 M MgCl2을 각 표본에 추가하고, 혼합한 후, 실온에서 1분 간 배양한다.
주: 최종 농도는 10 mM MgCl2 이다.
6) ATP/ADP 반응 제제를 실온에서 건조제로 평형을 맞춘다. 나머지를 -80℃에서 보관한다.
7) 20 μM 반응에 대해 -10 μL의 초순수 물을 반응 제제에 추가하여 1 mM 재고 용액을 제조한다.
8) 20 μL의 ATP/ADP 스톡을 각 표본에 추가하고, 혼합한 후, 실온에서 1시간 동안 배양한다.
라벨링된 단백질 환원 및 알킬화:
신선한 10 M 요소/50 mM 트리-HCL pH 8.4를 준비한다.
1) 1 mL의 10 M 요소/50 mM 트리-HCL을 각 반응에 첨가한다.
2) 100 μL of 200 mM TCEP 을 각 반응에 첨가한다. 55 ℃에서 1시간 동안 배양한다.
3) 100 μL의 375 mM 이오도 아세타마이드를 각 표본에 첨가한다. 실온에서 30분 간 어둠 속에서 배양한다.
버퍼 교환:
신선한 소화 버퍼를 준비한다 - 2 M 요소, 200 mM 트리-HCL pH 8.4
1) 제바(Zeba) 스핀 제염 기둥의 바닥 밀폐부를 비틀어 뚜껑을 느슨하게 한다.
2) 15 mL 콘 모양 튜브를 삽입한다.
3) 기둥을 실온의 1000 g에서 2분간 원심분리하여 저장 용액을 제거한다.
4) 3 mL의 소화 버퍼를 기둥에 추가한다. 1000 g에서 2분간 원심분리하여 버퍼를 제거한다. 이 과정을 2회 더 반복하고, 버퍼를 제거한다.
a. 마지막 세척 후 과잉 버퍼가 있는 경우 추가적으로 1000 g에서 2-3분간 원심분리한다.
5) 기둥을 새로운 콘 형 튜브로 옮긴다.
6) 전체 표본을 수지 베드의 중앙에 천천히 가한다.
7) 1000 g에서 2분간 원심분리하여 표본을 수집한다. 기둥을 제거한다.
라벨링된 단백질 소화:
1) 트립신을 1:50 비율(트립신: 단백질)로 첨가한다.
2) 37℃에서 흔들면서 하루밤 배양한다.
라벨링된 펩티드 포획 및 용출:
신선한 용출 버퍼(50% ACN; 0.1% 포름산)를 준비한다.
1) 50 μL의 슬러리를 소화된 각 표본에 첨가한다. 실온에서 1.5시간 동안 일정한 혼합으로 배양한다.
2) 표본을 피어스(Pierce) 스핀 기둥으로 옮긴다. 1000 g에서 1분간 원심분리한다. 통과된 유량을 수집하고 저장한다.
3) 각 세척에 대해 1000 g에서 1분 간:
a. 수지를 500 μL의 4 M 요소/50 mM 트리-HCl pH 8.4로 3회 세척한다.
b. 수지를 500 μL의 PBS로 4회 세척한다.
c. 수지를 500 μL의 물로 4회 세척한다.
4) 펩티드를 75 μL의 용출 버퍼로 녹여 분리하고 3 분 간 배양한다. 이 과정을 2회 더 반복하여, 분리된 부분을 결합한다.
5) 표본을 진공 농축기 내에서 감압 하에 동결 건조한다.
LCMSMS 분석을 위한 무 라벨, 1-D 분리
1) 표본이 감압 동결 건조에 의해 건조되면, 각 표본을 25 μL의 0.1% 포름산에서 재현탁한다.
2) LCMSMS 을 위해 10 μL을 유리병으로 옮긴다.
iTRAQ 라벨링
1) 남아 있는 15 μL 표본이 완전히 건조되었다.
2) 표본을 30 μL의 200 mM TEAB 내에서 재현탁한다.
3) 15 μL의 표본이 30 μL의 iTRAQ 반응 제제로 라벨링되었고 실온에서 2시간 동안 배양되었다.
a. 표본 당 6 μL이 QCP를 위해 풀로 보관되었다.
4) 라벨링 이후, 8 μL의 5% 히드록사민이 냉각을 위해 4℃에서 15분 간 추가되었다.
5) 모든 MP가 풀에 함께 저장된 후, 건조, 제염되고20 μL의 0.1% 포름산 내에서 재현탁되었다.
엑시겐트(Eksigent)/LTQ 오비트랩(오비트랩) 기구가 문제를 일으켜서 MP가 건조되고 18 μL의 20 mM 암모늄 포름산염 내에서 재현탁되었다.
표본 당 왼쪽(leftvovers):
200 mM TEAB 내 9 μL의 분리물 -80℃
기구 상 20 mM암모늄 포름산염 내 MP
인산 단백질 분석이 다음 프로토콜에 따라 수행되었다.
표본 준비 프로토콜:
1. 세포 용균
a. 용균 버퍼 - 5 M 요소, 50 mM 트리-HCL, 0.1% SDS, 1% 프로테아제 금지 인자 칵테일, 1% 포스타파아제 금지 인자 칵테일
b. 펠릿을 적절한 양의 용균 버퍼에 현탁시킨다.
c. 얼음 상에서 와류시켜 10 분간 배양한다. 반복한다.
d. 얼음 상에서 초음파를 쪼이고 10 분간 배양한다.
e. 최고 속도로 15분간 원심분리한다.
f. 용해물이 여전히 점성이 있고 끈적거릴 때는 초음파를 다시 쪼여 준다.
g. 용해물을 새로운 튜브로 옮긴다.
2. 단백질 농도를 결정하기 위한 브래드포드(Bradford) 분석을 수행한다.
3. 700 μg의 단백질(THLE-2에 대한 400 μg)을 45 μL의 200 mM TEAB로 새로운 마이크로튜브로 옮긴다.
4. 5 μL TCEP 에서 200 mM TCEP로 환원되었다: 55℃ 에서 1시간, 100 μL 부피.
5. 5 μL 요오드에서 375 mM 요오드 아세타마이드로 알킬화한다: 실온에서 100 μL 부피, 어둠에서 30 분간.
6. 7배 부피 에서 아세톤 침착 -20℃에서 하루밤 동안.
7. 단백질을 50 μg/μL의 200 mM TEAB내에서 재현탁. 1:40 (트립신:단백질) 비율로 37℃에서 하루밤 동안 트립신으로 소화
기둥을 준비하는 동안, 펩티드 표본을 150 μL의 버퍼 B에 재현탁시킨다.
기둥 준비:
1. 원심분리 기둥 어댑터를 수집 튜브 내에 위치시키고 TiO2 스핀 팁을 어댑터에 삽입한다.
2. 20 μL의 버퍼 A를 추가한다. 3000 g에서 2분간 원심분리한다. FT를 제거한다.
3. 20 μL의 버퍼 B를 추가한다. 3000 g에서 2분간 원심분리한다. FT를 제거한다.
인산펩티드 결합:
1. 스핀 팁을 깨끗한 마이크로튜브로 옮긴다.
2. 현탁된 표본을 스핀 팁에 가한다. 1000 g에서 10분간 원심분리한다.
3. 표본을 스핀 팁에 다시 가하고 1000 g에서 10분간 원심분리한다. FT를 저장한다.
4. 스핀 팁을 새로운 마이크로튜브로 옮긴다.
5. 20 μL의 버퍼 B를 추가하여 기둥을 세척한다. 3000 g에서 2분간 원심분리한다.
6. 20 μL의 버퍼 A를 추가하여 기둥을 세척한다. 3000 g에서 2분간 원심분리한다. 이 과정을 한번 더 반복한다.
용출:
1. 스핀 팁을 새로운 수집 튜브에 위치시킨다. 50 μL의 용출 버퍼 1을 추가한다. 1000 g에서 5분간 원심분리한다.
2. 동일한 수집 튜브를 사용하여, 50 μL의 용출 버퍼 2를 스핀 팁에 추가한다. 1000 g에서 5분간 원심분리한다.
3. 100 μL의 2.5% 포름산을 첨가하여 용출 부분을 산화시킨다.
인산펩티드의 흑연에 의한 정리
**이는 LC/MS/MS 분석 이전의 최종 정리이므로 TFA를 포름산과 교체한다.
기둥 준비:
1. 흑연 스핀 기둥의 상단 및 하단 덮개를 제거한다. 기둥을 1.5 mL의 마이크로튜브 내에 놓는다. 2000 g에서 1분간 원심분리하여 저장 버퍼를 제거한다.
2. 100 μL의 1 M NH4OH를 첨가한다. 2000 g에서 1분간 원심분리한다. FT를 제거한다. 이 과정을 한번 더 반복한다.
3. 100 μL의 아세토니트릴을 첨가하여 흑연을 활성화시킨다. 2000 g에서 1분간 원심분리한다. FT를 제거한다.
4. 100 μL의 1% 포름산을 첨가한다. 2000 g에서 1분간 원심분리한다. FT를 제거한다. 이 과정을 한번 더 반복한다.
표본 결합 및 용출:
용출 = 0.1% FA + 50% ACN
1. 기둥을 새로운 수집 튜브에 넣는다. 표본 수지 베드의 상단에 가한다. 10분간 주기적으로 휘저어 혼합시키면서 결합이 되도록 한다.
2. 1000 g에서 3분간 원심분리한다. FT를 제거한다.
3. 기둥을 새로운 수집 튜브에 위치시킨다. 200 μL의 1% FA를 가하여 기둥을 세척한다. 2000 g에서 1분간 원심분리한다. FT를 제거한다. 이 과정을 한 번 더 반복한다.
4. 기둥을 새로운 수집 튜브에 위치시킨다. 100 μL의 0.1% FA/50% CAN을 가하여 표본을 녹여 분리한다. 2000 g에서 1분간 원심분리한다. 400 μL의 완전한 용출을 위해 이 과정을 3회 더 반복한다.
5. 표본을 진공 증발기(SpeedVac) 내에서 건조시킨다.
HepG2 및 Hep3B:
700 μg의 단백질로 시작한다
TiO2 농축 및 흑연 정리 후, 인산펩티드가 400 μL의 0.1% 포름산/50% CAN에서 용해되어 분리된다.
(400/700)* 비율의 400 μL 부분 표본이 용해 분리물로부터 취해져서 완전히 건조된다. 이는 20 μL의 200 mM TEAB에서 iTRAQ 라벨링을 위해 재현탁된다.
라벨링 이후, 표본은 제염, 건조, 및 20 μL의 0.1% 포름산에서 재현탁된다.
남아 있는 부분 표본은 완전히 건조되고 20 μL의 0.1% 포름산 내에서 재현탁된다.
10 μL가 라벨 없는 LCMSMS 분석을 위한 유리병으로 이송된다.
THLE-2:
400 μg의 단백질만이 수확된다.
모든 단백질이 TiO2 기둥으로 농축되며 흑연 기둥으로 세척된다.
용해 분리물이 건조되고, 20 μL의 200 mM TEAB에서 iTRAQ 라벨링을 위해 재현탁된다.
라벨링 이후, 표본은 제염, 건조, 및 20 μL의 0.1% 포름산에서 재현탁된다.
표본 상에서의 왼쪽:
iTRAQ 표본 - 20 mM 암모늄 포름산염 내 기구 상
라벨링 없는 HepG2/Hep3B - 0.1% 포름산 내 10 μL, -80℃; 기구 상의 0.1% 포름산 내 10 μL
결과
도 42는 ENO1 활성에서의 상당한 감소를 도시하지만 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서의 ENO1 발현에 대해서는 그렇지 않다. 도 43은 PGK1 활성에서의 상당한 감소를 도시하지만 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서의 PGK1 단백질 발현에 대해서는 그렇지 않다. 도 44는 넥사바(Sorafenib)로 처리한 HepG2에서 LDHA 활성의 상당한 감소를 도시한다. 각 경우에 있어서, ENO1 발현은 QC 표본에 대해 상대적인 단위로 측정되며 ENO1 활성 변화는 제어된 비처리 표본에 대해 상대적인 단위로 측정된다.
도 42-44에서의 데이터는 HCC 질병 모델 내의 ENO1, LDHA, 및 PGK1에 대해 넥사바(Sorafenib)를 사용한 세포의 치료 결과, 단백질의 효소 활성의 하향 조절을 수반하면서 단백질 발현의 상향 조절이 일어남을 보여 준다. 따라서, 상기 인산 단백질체는 키나아제 활성 및 전체 세포 단백질에 대한 세포외 신호(예를 들어, 약 분자) 사이의 복잡한 관계를 밝히기 위해 사용될 수 있는 추가적인 레이어의 정보를 부여하며, 이를 통해 질병과 연관된 진단적/예후의 표지 인자뿐만 아니라 질병 치료 타겟의 식별을 용이하게 할 수 있다.
도 45는 AI 기반 REFS™ 시스템을 사용하여 결과적인 데이터 집합을 분석함으로써 생산될 수 있는 인과적 분자의 상호 반응 네트워크를 예시한다(왼쪽 프레임 참조). 상기 네트워크는, 예를 들어, 정상 및 암 세포(각각 중앙 및 오른 쪽 프레임 참조)에서 분별적으로 조절된 관심 대상 네트워크를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 정보는 HCC와 연관된 진단적/예후의 표지 인자뿐만 아니라 HCC 치료 타겟을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
도 46-51은 종양 형성 시스템의 이차원 화학적 조사 및 서명의 다중-체학적 통합이 어떻게 암의 생리병리학에 관련된 신규의 신호 전달 경로를 밝혀 주며, 이에 의해 어떻게 치료적 타겟, 관련된 생물학적 표지 인자, 및/또는 치료제를 식별하는지를 도시한다. 특히, 도 46-51은 도 41 및 본 명세서에서 기술된 여러 방법에 따라 보여진 일반적인 방법론의 구현을 예시한다. 도 41에서 보인 바와 같이, 상기 접근 방식은 생체 외 암 및 제어 모델이 일차원에서 키나아제 금지 인자 (넥사바(Sorafenib))에 의해 조사되는 “이차원적 화학적 조사”에 의해 보강된다. 키나아제 활성에서의 전체적 변화는 활성 기반 키나아제 농축 탐침을 채택하는 이차원 화학적 조사에 의해 포획되었다. 키나아제는 LC-MS에 의해 식별되었다. 또한, 키나아제 금지 인자에 대한 반응으로서의 인산 단백질체에서의 변화는 인산 단백질 농축 방법 및 뒤이은 단백질의 식별을 위한 LC-MS를 사용하여 식별되었다. 최종적으로, 전체 단백질 발현에서의 정량적 변화가 획득되었다. 결과적으로 얻어진 다중-체학 데이터는 AI 기반 정보학을 사용하여 통합되었으며, 데이터에 의해 추진되며 “정상” 모델에서는 작동하지 않으나 암 모델에서는 작동하는 단백질의 인산화를 추진하는 분별 키나아제 활성을 나타내는 인과 네트워크의 생성으로 귀결되었다. 이러한 보완 분석의 통합은 도 46 및 47의 추정된 경로에서 도시되었다. 상기 기술은 결과적으로 신규의 키나아제 및 암의 생리병리학에 기계적으로 관련된 관계에 대한 발견을 가져 온다(예를 들어, 도 48-50).
도 46은 베이지안(Bayesian) 네트워크 추정 알고리즘을 채택하는 다중체적 데이터의 통합이 어떻게 간세포 암종에서의 신호 전달 경로의 이해로 귀결되는지를 예시한다. 노란색 사각형은 전사후 수정(인산) 데이터를 나타내며, 파란색 삼각형은 활성 기반(키나아제) 데이터를, 녹색 원은 단백질체학 데이터를 나타낸다. 도 47은 간세포 암종에서의 신호 전달 경로에서의 자동 조절과 역 피드백 조절이 어떻게 플랫폼에 의해 추정될 수 있는지를 예시한다. 사각형은 PMT(인산) 데이터(회색/어두움 = 키나아제, 노란색/밝음 - 키나아제 활성 없음)를 나타내며, 사각형은 활성 기반(키나아제) + 단백질체학 데이터 (회색/어두움 = 키나아제, 노란색/밝음 - 키나아제 활성 없음)를 나타낸다. 이러한 분석들은 상기 설명되고 도 41에 예시된 세 개의 레이어된 다중-단백질체학 방법론을 사용하여 수행되었다. 이러한 분석들의 결과는 도 48-51에 도시되며 이하에서 자세히 설명된다.
도 48-50은 플랫폼에 의해 추정된 신호 전달 경로에서의 도출된 인과적 연관의 예를 예시한다. 키나아제 이름은 대표적인 사각형과 원으로 나타내어 졌으며, 연결기에 의해 나타나는 인과적 연관을 보여 준다. 도 48은 CLTCL1, MAPK1, NME1, HIST1H2BA, RPS5, TMED4, 및 MAP4 키나아제 동형 단백질의 식별을 보여 주며 이들 사이의 추정된 관계를 나타낸다. 도 49은 HNRPDL, HNRNPK, RAB7A, RPL28, HSPA9, MAP2K2, RPS6, FBL, TCOF1, PGK1, SLTM, TUBB, PGK2, CDK1, MARCKS, HDLBP, 및 GSK3B 키나아제 동형 단백질의식별을 보여 주며 이들 사이의 추정된 관계를 나타낸다. 도 50은 RPS5, TNRCBA, CLTCL1, NME1, MAPK1, RPL17, CAMK2A, NME2, UBE21, CLTCL1, HMGB2, 및 NME2 키나아제 동형 단백질의식별을 보여 주며 이들 사이의 추정된 관계를 나타낸다. 이들 키나아제 동형 단백질은 잠재적 치료적 타겟, 표지 인자, 및 치료제를 제시한다.
도 51은 플랫폼에 의해 도출된 인과적 연관의 예시도이다. 특히, 도 51은 EIF4G1, MAPK1, 및 TOP2A 키나아제 동형 단백질의 식별을 보여 주며 이들 사이의 추정된 관계를 나타낸다. 이 관계는 EIF, MAPK, 및 TOP 키나아제 사이의 공개된 관계에 부합하기 때문에 모델 및 방법에 대한 증명을 제공한다.
결론적으로, 효소(예를 들어, 키나아제)활성 다중체학 기반 분석은 세포 활동의 함수로서 대사 물질과 기질 사이의 하향 인과 관계를 결정하는데 있어 유용한 방법으로 나타난다. 마찬가지로, 치료적 치료에 대한 반응으로서 효소의 전역적 활성에서의 변화를 모니터링하는 활성 기반 단백질체는 단백질(예를 들어, 효소)의 전반적 세포 발현만을 모니터링하는 방법에 비해 세포 신호 전달의 동적 작용에 대한 핵심 통찰력을 제공할 수 있다. 또한, 상기 플랫폼은 신호 전달 경로를 견고하게 추정할 수 있고 종양 형성 대 정상 환경에서의 피드백 조절을 역전시킬 수 있으며, 따라서, 종양 형성 신호 전달 경로에서의 신규의 인과적 연관을 식별할 수 있음이 밝혀 졌다. 이에 따라, 본 기술은 신규의 키나아제 식별과 키나아제 금지 인자의 활동에 대한 메커니즘의 판독을 제공한다.
예 6: CoQ10 에 의한 신생 혈관 생성 및 조절의 생체 외 모델
서론: 종양 크기가 2-5mm으로 진전되기 위해서는 종양에 산소 및 영양분을 공급하기 위한 신생 혈관 생성의 유도를 필요로 한다. 신생 혈관 생성은 저산소 상태 또는 유전학적 변이에 대한 반응으로 내피의 미토겐 요소의 종양 내 세포 분비로 인해 발생하며, 현재, 예를 들어 VEGF 및 PlGF와 같은 몇 개의 단백질이 치료적 항신생 혈관 생성 타겟으로서 임상적 개발 단계에 있다. 본 명세서에서, 우리는 현재 암 전개의 인간 연구에서 조사되고 있는생체 외 코엔자임 Q10(CoQ10)을 조사하였다.
방법: 혈관 형성 표현형을 조절하는 인간 배꼽의 정맥 내피의 세포(HUVEC) 운명 결정이 100 또는 1500μM CoQ10 또는 부형제의 존재 하에 조사되었으며 처리되지 않은 제어 세포와 비교되었다. 마트리겔(MATRIGEL®) 내의 세포 자살, 증식, 이주 및 3-D 관 형성에 대한 내피의 세포 운명 분석이 수행되었다.
결과: 아넥신 V/요오드화프로피디움 양성 세포에 대한 형태학적 혈구 흐름 계산 분석 결과 부형제 또는 제어 세포와 비교하여 1500μM CoQ10의 존재 하에 HUVEC 세포 자살이 증가함이 밝혀 졌다. CoQ10C로 인한 세포 사멸에 수반하여, HUVEC 세포의 개수가 1500μM CoQ10의 존재 하에서 상당히 감소하였다. 내피의 이주에 대한 CoQ10의 잠재적 효과를 분석하기 위해, HUVEC 이주가 세포 정리 후 5시간 후에 내피의 스크래치 분석에서 조사되었다. CoQ10와 부형제 모두 100 및 1500μM 농도에서 HUVEC 이주를 상당히 저해하였으며, 이는 부형제와 CoQ10 모두에서의 항 이주 활성을 보여 주는 것이다. CoQ10 항종양 활성이 내피의 분출 신생 혈관 생성에 대한 효과로 인한 것인지를 결정하기 위해, 우리는 3-D 마트리겔(MATRIGEL®) 배양에서 시간에 따른 내피의 관 형성을 조사하였다. 겔 및 그 위의 매체 모두에 부형제를 첨가하면 제어 표본에 비해 관 형성이 저해되었다. 또한, 1500μM CoQ10을 첨가하면 부형제 및 제어 표본의 처리되지 않은 세포 모두에 비해 HUVEC 관 형성이 더 저해되었다. 이러한 효과는 산포 후 24 시간 만에 관측되어 배양에서 96 시간까지 지속되었다. 종합적으로 말하면, 이들 연구를 통해 CoQ10의 효과는, 최소한 부분적으로는, 신생 혈관 형성을 위한 국지적 혈액 공급의 종양 모집이 금지된 때문일 가능성이 있다는 것이 밝혀 졌다.
내피의 형태에 대한 CoQ10 의 효과: 인간 배꼽의 정맥 내피 세포(HUVEC 세포)가 CoQ10 농도의 범위에서 24시간 동안 처리되었다. '정상' 세포에 매우 닮은 융합성 세포와 또한 증식 세포의 혈관 형성 표현형을 매우 유사하게 나타내는 하위-융합성 세포에 약제를 가하였다. 융합성 배양에서는, 점점 증가하는 첨가된 CoQ10의 농도로 인해 EC들에 대한 보다 가까운 연관, 길이 증가 및 정렬이 발생하였다. 5000μM의 첨가가 둘러싸는 세포들에 대한 미묘한 증가를 가져 왔다(도 52A). 하위-융합성 내피의 세포의 CoQ10에 대한 반응은 융합성 세포 반응에 대해 다양하게 나타났다(도 52B). 1000μM CoQ10 및 그 이상에서 내피는 외견 상 건강하지 않아 보였다. 증가한 세포 사멸은 CoQ10의 농도가 증가함에 따라 보다 가시화되었다.
CoQ10은 내피의 세포 생존에 분기(divergent) 효과가 있다: HUVEC 세포의 융합성 및 하위 융합성 배양이 100 또는 1500μM CoQ10으로 24시간 동안 처리되고 요오드화프로피디엄 양성 세포 사멸제 세포에 대해 분석되었다. 그 결과는 도 53A 및 53B에 각각 도시되었다. CoQ10 융합에서 처리된 EC를 보호하는 경향이 있으며, 반면에 하위 융합성 세포는 CoQ10에 민감하고 1500μM CoQ10에서 증가하는 세포 자살을 보여 주었다. CoQ10의 농도가 증가함에 따라 세포 자살 수준이 높아지는 것을 보여 주는 하위 융합성 제어 EC(왼쪽), 100μM CoQ10(중앙) 및 1500μM CoQ10(오른쪽)의 대표적인 히스토그램이 도 53C에서 도시된다.
CoQ10 이 내피의 세포의 개수 및 증식을 감소시킨다: HUVEC 세포의 하위 융합성 배양이 100 또는 1500μM CoQ10으로 72시간 동안 처리되고 요오드화프로피디엄 통합 분석(G2/M 위상 DNA를 탐지)을 사용하여 세포의 개수(도 54A) 및 증식(도 54B) 모두에 대해 분석되었다. 높은 농도의 CoQ10는 세포의 개수에서 상당한 감소를 가져 왔으며 EC 증식에 대한 투여량에 의존하는 효과를 보여 주었다. CoQ10의 농도가 증가함에 따라 세포 증식이 낮아지는 것을 보여 주는 세포 사이클의 G2/M 위상 내의 세포에 대한 대표적인 세포 증식 게이팅의 히스토그램이 도시되었다[도 54C, 제어 EC(왼쪽), 100μM CoQ10(중앙) 및 1500μM CoQ10(오른쪽)].
CoQ10 이 내피의 세포 이주를 감소시킴: HUVEC 세포가 "스크래치" 분석을 사용하여 이주에 대해 검사될 수 있도록 융합되어 성장하였다. 100 또는 1500μM CoQ10이 스크래치 시 가해졌으며 정리된 부분의 폐쇄가 48 시간에 걸쳐 모니터링되었다. 100μM CoQ10는 제어 표본에 비해 내피의 폐쇄를 지연시켰다. 0, 12, 24, 및 36 시간에서의 대표적인 영상들이 도 55에 제공된다. 1500μM CoQ10을 48시간까지도 폐쇄가 방지되었다(데이터 미도시).
CoQ10 이 내피의 관 형성을 저해함: 3-D 마트리겔에서 성장하는 내피 세포는 시간이 지남에 따라 관을 형성한다. 100μM 및 1500 μM CoQ10의 관 형성에 대한 분별 효과가 관찰되었다. 저해된 세포에서 세포로의 연관 및 초기 관 구조의 붕괴는 1500 μM CoQ10에서 상당 규모로 일어난다. 흥미롭게도, 1500μM CoQ10의 존재 하에서는 관 형성이 시작되지 않았으나, 이 과정은 48 시간에서 관 성장 및 형성을 저해하였다. 도 56에 도시된 영상은 72시간에 획득되었다.
결과 및 결론:
우리는 CoQ10의 잠재적 신생 혈관 생성 조절 효과를 조사하였다. CoQ10은 인간 고형 종양 연구에서 조사되고 있는 세포 에너지 대사를 조절하는 항암 제제이다.
CoQ10은 적은 양을 투여하면 융합성 내피의 세포를 보호하지만, 반면에 CoQ10를 하위-융합성 세포에 투여하면 세포 자살이 증가하고, 세포의 개수가 감소하며 내피의 증식에 대한 강력한 금지 인자가 된다. 우리는 '정상' 맥관 구조를 보호할 수 있는 융합성 및 하위융합성 세포에 대한 다변적 효과를 증명하였다.
2-D 스크래치 분석에서의 내피의 이주 능력에 대한 기능적 평가를 통해 내피의 이주에 대한 강력한 금지 인자가 밝혀졌다. 시간을 두고 촬영한 사진을 통해 2일의 배양/치료에 걸쳐 정리된 영역을 폐쇄하는데 실패하는 동적인 내피의 '전면'이 밝혀졌다.
내피의 세포를 3-D 마트리겔에서 현탁시킨 결과 시간에 지남에 따른 관 형성이 관찰되었다. 종양 신생 혈관 생성에서 역할을 하는 많은 요소들을 재확인해주는 이러한 양호하게 특성화된 분석을 사용함으로써, 우리는 내피의 관 형성에 대한 CoQ10의 효과를 조사하였다. 100μM CoQ10의 추가는 관 형성에 다소의 효과를 주었으나, 1500μM CoQ10의 추가는 내피의 관 형성이 극적으로 파괴되는 결과를 가져 왔다.
요약하면, 이들 결과들은 내피의 분출, 이주 및 증식에 대한 CoQ10의 영향을 보여 주며, 혈관 형성 내피의 세포 내 세포의 선택적 사멸을 유도하는 것을 나타낸다.
예 7: 융합성 및 하위융합성 HUVEC 세포에서 코엔자임 Q10의 분별적으로 조절된 기능적 반응
융합성 및 하위융합성 조건에서 성장한 HUVEC 세포 내의 세포 증식 및 이주에 대한 CoQ10의 분별적 효과를 예증한 후, HUVEC 세포 상의 생화학적 경로에 대한 CoQ10의 효과가 조사되었다.
CoQ10의 존재 또는 부재 하에서 정상 산소 상태 및 저산소 상태에 대한 HUVEC 세포의 반응이 분석되었다. 특히, HUVEC 세포가 본 명세서에서 기술된 노목식 또는 혈중 산소 감소 조건 하의 융합성 및 융합성 배양에서 성장되었다. 상기 세포는 또한 0, 100, 또는 1500 μM CoQ10에 노출되었다. 산화질소(NO) 및 반응성 산소 종(ROS) 수준이 본 명세서에서 제공된 방법을 사용하여 결정되었다. 도 57에서 보인 바와 같이, HUVEC 세포는 CoQ10 및 저산소 상태에 대한 반응으로서 산화질소(NO) 및 반응성 산소 종(ROS)의 생성에 따라 구분된 투여량을 예시한다.
HUVEC 세포의 생명 에너지론이 여러 농도의 CoQ10의 존재 하에 분석되었다. 특히, HUVEC 세포가 융합성 또는 융합성 조건에서 CoQ10(10, 100, 1500 μM)의 부재 또는 존재 하에 성장되었다. 산소 소모율(OCR), 전체 및 미토콘드리아 모두에서의 ATP 생산, 및 세포외 산화 비율(ECAR)이 시호스(Seahorse) 분석을 사용하여 분석되었다. 하위-융합성 배양에서 성장하는 HUVEC 세포는 도 58A-D에서 보인 바와 같이, 융합성 배양과 비교하여 미토콘드리아의 산소 소모를 제한한다((A) 전체 OCR; (B) 미토콘드리아의 OCR; (C) ATP; (D) ECAR_. 하위-융합성 배양에 CoQ10를 추가하면 융합성 수준 OCR 에 대한 미토콘드리아의 OCR을 역전시킨다(도 58B).
예 8: 항 CoQ10 의 혈관 형성 메커니즘을 밝히기 위한 기능적 단백질체학 및 리피도믹스의 적용
신생 혈관 생성은 종양 세포 성장에 필요한 산소 및 영양분을 제공하여 종양 발전을 가능케 하는 핵심 특징이다. 우리는 현재 조사되고 있는 인간에서의 암 전개에 대한 항종양 약제인 CoQ10의 항혈관 형성 특성을 조사하였다. CoQ10은 '스크래치' 분석에서의 내피의 이주 및 3-D 마트리겔(MATRIGEL®) 관 형성 분석에서의 관 형성을 저해하였다. CoQ10의 추가는 또한 내피의 증식을 저해하며, 이는 G2/M 상 세포 및 증식 세포 핵 항원 (pCNA) 단백질로서 알 수 있다. CoQ10은 카스파제 3의 활성을 유도하고 혈관 형성/증식 내피 세포의 세포 자살을 증가시키며, 반면에 비 증식 융합성 내피의 세포 배양의 세포 사멸은 제어에 비해 감소하였다.
I혈관 형성 증식 내피 세포 및 비증식 내피 세포의 세포 내 단백질체의 프로필을 결정하기 위해, 우리는 단백질체, 지질체, 및 기능적 단백질체의 접근 방식을 사용하였다. 단백질체 및 단발(shotgun) 지질체 분석이 LTQ-오비트랩-벨로스(Velos) 및 Vantage-QqQ 상에서 각각 수행되었다. 채택된 기능적 단백질체학 접근 방식은 비교적 단백질체학에 의한 조합 내의 활성-기반 탐침이다. 키나아제 및 기타 ATP 분해 요소가 특히 효소의 활성 부위와 이들의 자연적 형태에서 반응하는 ATP-결합 도메인 농축 탐침으로 라벨링되었다. 농축은 스트렙타비딘 수지를 사용하여 면역 침강법으로 수행되었다.
인과적 지질/ 단백질/ 기능적 단백질체학 네트워크를 생성하는 통합된 리피도믹스 및 단백질체의 플랫폼 및 AI 기반 베이지안(Bayesian) 정보학 플랫폼을 사용하여, 신생 혈관 생성을 조절하는 신규의 단백질, 지질 및 효소가 식별되었다. CoQ10로 처리된 세포와 정상 및 혈관 형성 내피의 세포와의 비교가 전역 키나아제 활성을 탐구하기 위해 사용되었다. 신생 혈관 생성의 복잡함과 동적 특성을 밝혀 내기 위해 비교학적 단백질체학 및 효소 활성 데이터가 AI 기반 베이지안(Bayesian) 정보학 플랫폼으로 통합되어 기능적 단백질-단백질 상호 반응의 인과 네트워크를 조사하였다. 인과적 상호 반응성 네트워크는 도 59A-C에 도시된다. 특히, 도 59A는 지질, 단백질 및 키나아제의 완전한 다중 체학적 인과적 상호 반응 네트워크이다. 도 59B 단백질 농축 네트워크의 허브를 도시하며, 도 59C는 키나아제, 지질체 및 기능적 종단점 네트워크의 허브를 도시한다. 네트워크 내의 단백질은 원으로 표시되며, 키나아제는 사각형으로, 지질은 다이아몬드로, 기능적 활성 또는 세포 반응은 8각형으로 표시된다. 일부 단백질 및 키나아제 이름이 제공된다. 이러한 플랫폼으로부터의 출력이 알려진 단백질 상호 반응을 확인하였다.
요약하면, 본 발명의 플랫폼 기술을 사용하여, CoQ10의 항혈관 형성 메카니즘 및 증식적 내피 세포의 고유한 특성이 통합된 기능적 단백질체의 분석을 적용하여 효소 활성에서의 전역 변화를 결정함으로써 조사되었다. 조사적 “체학(omic)” 기반 플랫폼은 세포적 지능을 견고히 추정한다. 인과성을 추정하기 위한 데이터 마이닝에 대한 이러한 AI 기반 네트워크 엔지니어링 접근 방식은 결과적으로 작용 가능한 생물학적 지능을 가져 온다. 또한, 상기 발견 플랫폼을 통해 환경적 도전, 대사적 상태의 변화, 및 병리학적 교란을 완화하기 위한 적응적 분자의 생산에 대한 반응으로서의 내피 세포의 생리병리학에 대한 이해를 향상시킬 수 있다.
예 9: 신생 혈관 생성의 모델을 구축하기위한 플랫폼 기술의 채택
본 예에서, 신생 혈관 생성 모델로부터 획득한 데이터를 통합하고, 신생 혈관 생성을 추진하는 신규의 단백질/경로를 식별하기 위해 상기 상세한 설명에서 상세히 설명된 플랫폼 기술이 채택되었다. 이러한 분석의 결과로 생성되는 관계적 맵은 신생 혈관 생성 생물학적 표지 인자를 제공한다.
신생 혈관 생성은 완전히 이해되지 않는 복잡한 일련의 신호 전달 경로들의 결과이다. 신생 혈관 생성은 다수의 병리학적 조건에서 역할을 하며, 이러한 조건은 암을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특히 세포 생명 에너지론 및 미토콘드리아의 막 기능을 알아 보기 위해, 단백질 및 지질 신호를 기능적 종단점 분석과 결합하는 시스템 접근 방식이 본 명세서에서 제시되었다. 상기 예시한 바와 같이, 하위-융합성 HUVEC 세포가 신생 혈관 생성 상태를 모방하기 위해 사용될 수 있으며, 반면에 융합성 HUVEC 세포는 비혈관 형성, 즉, 정상 상태를 모방하기 위해 사용될 수 있다.
생체 외 모델에서, HUVEC 세포는 신생 혈관 생성의 잠재적 메커니즘의 신호를 창출하고 또 이를 밝히기 위해, 신생 혈관 생성 금지 인자, 예를 들어, CoQ10와 같은 환경적 영향 인자의 존재 또는 부재 하에서, 접촉 금지 조건(예를 들어, 융합성 배양) 또는 접촉 금지가 없는 조건(예를 들어, 하위-융합성 배양, 예를 들어, 약 60% 미만의 융합성, 약 70% 미만의 융합성, 약 80% 미만의 융합성, 약 90% 미만의 융합성; 삼차원적 배양; 또는 세포의 패치가 배양물을 “스크래치”하는 배양)을 겪도록 하였다. 단백질체 및 지질체의 신호는 본 명세서에서 제공된 플랫폼 방법을 사용하여 분석되었다. 신생 혈관 생성의 생물학적 표지 인자가 수중 실험실 방법을 사용하여 추가로 확인되었다. 이러한 접근 방식은 신생 혈관 생성의 메커니즘을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공하며, 새로운 혈관 형성 생물학적 표지 인자를 식별하고 신생 혈관 생성을 조절하는 제제를 개발, 검사할 수 있게 해 준다.
인간 배꼽의 정맥 내피의 세포는 생체 내 질병 관련 세포가 경험하는 혈관 형성 환경을 모의하는 조건을 겪게 된다. 특히, 상기 세포는 접촉 금지로 인해 성장이 억제는 조건이나(즉, 정상 세포), 접촉 금지로 인해 배양, 성장이 최소한 부분적으로 억제되지 않는 조건(즉, 혈관 형성 세포) 하에서 성장한다. 설명을 간단하게 하기 위해, 배양, 성장이 최소한 부분적으로 억제되지 않는 조건하에서 성장한 세포를 비융합성 배양이라 부르기로 한다.
상기 언급된 세포를 포함하며 세포가 융합성 또는 비융합성 배양에서 성장하는 상기 세포 모델은 상기 세포를 “환경적 교란”에 노출시키고 신생 혈관 생성을 조절하는 제제, 예를 들어, 신생 혈관 생성을 억제하는 제제로 처리함으로써 추가적으로 “조사”된다. 예를 들어, 상기 세포는 여러 농도, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 0, 50μM, 100μM, 250μM, 500μM, 750μM, 1000μM, 1250μM, 또는 1500μM의 농도에서 코엔자임 Q10으로 처리된다. 본 명세서에서 제공되는 교란은, 예를 들어, 배양을 “스크래칭”하거나 세포를 낮은 밀도에서 하위 배양하는 등의 세포의 기계적 교란을 포함한다.
각각의 교란 치료를 겪은 조건으로부터의 세포 표본이 치료 후, 예를 들어, 치료 이후 6, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 또는 120 시간 이후에, 또는 이들 사이의 시간에 수 회 수집되었다. 특정 조건에 대해서, 매체 표본이 수집되어 분석되었다. 표본은 이후 단백질 발현 또는 활성, 유전자 발현, 및 지질 수준의 하나 또는 그 이상의 수준에 대해 분석될 수 있다.
정량적 단백질체학에 의한 전체 세포 단백질 발현에서의 변화에 대한 아이프로파일링이 각 조건 및 각 “환경적 교란”, 즉, 코엔자임 Q10 치료에 대해 수집된 세포 및 매체 표본을 대상으로 상기 상세한 설명에서 설명된 기술을 사용하여 수행되었다. 전사 프로파일링 실험이, 예를 들어, Biorad® CFX-384 증폭 시스템을 사용하여 수행되었다. 데이터 수집(Ct)에 이어, 제어에 대한 최종 배수 변화가, 예를 들어, 제조사의 프로토콜에서 제시되는 δCt 방법을 사용하여 결정되었다. 리피도믹스 실험이 질량 분광학을 사용하여 수행되었다. 산소 소모율(OCR)과 같은 기능적 분석이, 예를 들어, 시호스(Seahorse) 분석기를 채택하여 기본적으로 제조사가 권장하는 방법에 따라 측정되었다. OCR은 시호스(seahorse) 배양 플레이트에 대해 밀어 넣어지는 카트리지에 의해 생성된 7 μl 챔버 내의 전극에 의해 기록될 수 있다.
요약하면, 형태학적, 효소 관련, 및 흐름 혈구 계산 분석을 통해 세포 자살, 이주, 산화질소 및 ROS 생성 및 CoQ10 치료에 대한 반응에서의 생체 에너지 용량에서의 극적인 변화가 밝혀 졌다. 지질체적 분석을 통해 미토콘드리아의 기능 및 세포 밀도를 변화시킴으로써 완화될 수 있는 지질 경로에서의 신규의 변화가 밝혀 졌다. 본 플랫폼 방법을 활용한 단백질체의 통합을 통해 미토콘드리아의 조절을 위한 특성화되지 않은 세포 내 적응 및 신호 전달이 밝혀 졌다. 모두 종합하면, 이들 연구들을 통해 CoQ10가 내피의 이주, 증식, 세포 자살, 산화질소, ROS, 및 단백질/지질 구조를 변화시킨다는 사실이 밝혀 졌다. 신규의 메커니즘이 본 명세서에서 제시되었으며, 여기에서 신생 혈관 형성을 위한 국지적 혈액 공급의 종양 발생을 억제하기 위해 CoQ10의 항종양 활성은 혈관 형성 및 세포 사멸제 요소의 대사적 상호 대화로 인한 것이다. 추가적으로, 단백질체 및 지질체적 적응은 환경적 자극에 반응하는 내피 세포의 생리학적 요건을 지지하는 상호 반응적 네트워크와 연관되었다. 이들 데이터는 조절 장애를 겪은 미토콘드리아의 대사적 제어 요소로 인한 종양 신생 혈관 생성의 선택적 적응에 대한 특징적 통찰을 제공한다.
예 10: 플랫폼 기술을 채택하여 효소 활성을 설명하기 위한 다중 단백질체학 모델의 구현.
일반적으로, 상기 예 5에서 설명된 효소 플랫폼 기술은 신생 혈관 생성과 같은 생물학적 시스템 또는 질병 과정의 조절 인자를 식별하기 위한 방법을 더 구현하기 위해 적응시킬 수 있다. 상기 방법은 신생 혈관 생성의 특징적 측면을 나타내기 위해 신생 혈관 생성과 연관된 세포를 포함하는 신생 혈관 생성을 위한 모델을 채택한다. 상기 모델은 다음과 같은 최소한 세 수준의 데이터를 획득하기 위해 사용된다: 즉 (i) 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내에서의 효소의 전역적 활성을 나타내는 제 1 데이터 집합, (ii) 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 효소의 전역적 활성의 영향을 나타내는 제 2 데이터 집합, 및 (iii) 신생 혈관 생성과 연관된 세포 내에서의 단백질체의 전역적 변화를 나타내는 제 3 데이터 집합. 지질체, 전사체, 대사체, 및 SNP 데이터와 같은 부가적 데이터 집합. 상기 데이터는 효소의 전역적 활성, 효소의 전역적 활성의 효과, 및 단백질체의 전역적 변화 중에서 합치 인과 관계 네트워크를 생성하기 위해 사용된다. 상기 합치 인과 관계 네트워크는 프로그램된 컴퓨터 장치를 사용하여 제 1, 제 2, 및 제 3 데이터 집합에만 기반한다(즉, 알려진 다른 생물학적 관계에는 기반하지 않는다). 상기 합치 인과 관계 네트워크는 이후 고유한 인과 관계에 연관된 최소한 하나의 유전자 또는 단백질이 신생 혈관 생성의 조절 인자로서 식별되는 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하기 위해 사용된다.
본 예에서, 상기 플랫폼 기술은 신생 혈관생성과 관련된 효소 활성 및 단백질체에 대한 이 활성의 직접적 영향을 측정하기 위한 다중 단백질체학 기술을 구현하기 위해 적응되며; 이에 의해, 효소들(예를 들어, 키나아제 및/또는 프로테아제) 및 이들의 대사 물질/기질 사이의 인과 관계를 신생 혈관 생성 중의 세포 단백질체의 전역 변화의 문맥에서 이해하기 위해 사용될 수 있는 시스템을 제공한다. 효소 활성이 효소 발현과 직교하기 때문에(예를 들어, 하향 조절된 활성 및 조절되지 않은 발현), 이러한 기술들은 귀중한 통찰을 제공할 수 있다. 이러한 분석의 결과로 만들어지는 관계적 맵은 신생 혈관 생성과 관련된 진단적/예후의 표지 인자뿐만 아니라 신생 혈관 생성을 조절함으로써 질병 치료 타겟을 제공할 수 있다. 이러한 타겟 및 표지 인자는 치료적 성분 및 방법을 제공할 수 있다. 모델을 수립하고, 데이터 집합을 획득하며, 합치 인과 관계 네트워크를 생성하고, 신생 혈관 생성에 고유한 인과 관계를 식별하기 위한 기술은 상기 발명의 요약, 상세한 설명 및 예에서 설명된다. 모델을 수립하고, 효소의 전역적 활성 및 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 효소의 전역적 활성의 효과를 나타내는 데이터 집합을 획득하기 위한 추가적인 기술들은 이하에서 기술된다.
먼저, 본 플랫폼 기술에 따라 모델이 수립되며, 이때, 예를 들어, 세포 라인들이 질병을 모의하는 조건을 겪게 되며 환경적 교란(예를 들어, 신생 혈관 생성의 조절 인자, 예를 들어, CoQ10, 아바스틴, VEGF 금지 인자, 안지오스타틴, 베바씨주마브, HUVEC 세포의 융합도의 변화에 대한 노출)에 대한 노출에 이해 조사된다. 비교를 위한 제어가 제공된다. 두 번 째로, (i) 효소의 전역적 활성, (ii) 단백질체 (예를 들어, 효소 활성의 대사 물질/기질)에 대한 효소의 특별한 효과, 및 (iii) 세포 단백질체의 전역 효과를 분석함으로써 효소 활성 및 그의 하향적 효과가 단백질체의 전역적 변화의 문맥에서 추적된다. 세 번째로, 상기 데이터 집합이 관심 있는 조절 인자를 식별하기 위해 본 플랫폼 기술에 따라 분석된다. 예를 들어, 혈관 형성 모델 신생 혈관 생성의 알려진 조절 인자에 의해 조사되고; 시스템에서 전역 키나아제 활성에 대한 이 교란의 효과가 인산 단백질체 및 전체 단백질체에 대한 결과적인 효과와 더불어 분석되며; 또한 상기 데이터 집합이 AI 기반 REFS™ 시스템에 의해 분석될 수 있다.
예를 들어, 여러 조건 하에서 성장한 HUVEC 세포는 혈관 형성 및 정상(예를 들어, 신생 혈관 비생성) 상태를 모의하기 위해 사용될 수 있다. 신생 혈관 생성은 예를 들어, 임신, 부상 회복 등과 같은 특별한 환경을 제외하고는 성체에서 발생하지 않기 때문에, 이러한 접근 방식으로 식별한 혈관 형성 표지 인자의 존재는 질병 상태, 예를 들어, 암, 류머티스 관절염, 노화 관련 황반 변성, 또는 당뇨성 망막증을 나타내는 표지 인자로서 유용할 수 있다.
본 예시적 예는 (i) 세포 생물학, (ii) 예를 들어, 신생 혈관 생성에서 이러한 메커니즘에 참여하는 인산화 및 효소, 예를 들어, 키나아제와 같이 번역 이후 수정의 역할을 구분하기 위해 인과적 단백질 네트워크를 생성하는 통합된 단백질체학 플랫폼 및 정보학 플랫폼의 능력들을 결합한다. 특히, 이 접근 방식은 신생 혈관 생성 모델 내 ATP 결합 도메인 농축 탐침 및 전체 단백질의 인산-단백질체 매핑을 통합하는 활성 기반 단백질체학을 채택한다.
비교적 단백질체학, 인산 단백질체 및 효소 활성 데이터가 AI 기반 REFS™ 정보학 플랫폼에 통합된다. 기능적 지점 즉 키나아제가 인산화할 수 있는 키나아제/효소 활성 및 잠재적 타겟으로부터의 단백질 상호 반응의 인과 네트워크가 이후 생성된다. 추가적으로, 타겟의 인산화를 조절하고 병리생리학적 세포 거동을 기계적으로 구동하는 세포의 기능적 판독을 이용하여, 효소/ 키나아제가 결정된다. 본 명세서에 개략적으로 설명된 예시적 구현은 신생 혈관 생성의 임상적 관리를 위한 세포 반응, 신생 혈관 생성 메커니즘 및 잠재적 타겟/생물학적 표지 인자에 대한 통찰을 용이하게 한다.
예시적 예로서, 정상 세포 및 혈관 형성 세포를 나타내는 세포가 비교를 위해 선택된다. 본 명세서에서 예시된 바와 같이, HUVEC 세포가 하위-융합성 배양에서 성장하면 신생 혈관 생성의 특성을 보이며, 반면에 융합성 HUVEC 세포는 이를 보이지 않는다. 하위-융합성 배양에서 HUVEC 세포를 CoQ10로 처리하면 본 명세서에서 예시된 바와 같이 HUVEC 세포가 비-신생 혈관 생성 상태로 이동한다. 상기 단백질체학 방법이 제공하는 바와 같이, 효소 활성의 분석 방법은 임의의 조건에서 성장한 HUVEC 세포에 대한 쌍의 분석을 포함할 수 있으며, 선택적으로 제 3 데이터 집합으로부터의 결과를 쌍으로 비교한 결과에 대한 분석을 더 포함할 수 있다.
예시적 실시예로서, 동등한 개수의 HUVEC 세포들이 융합성으로 배양되고 비융합성 배양이 수확되며, 세포들이 예를 들어, 인산펩티드와 같은 관심있는 펩티드의 존재 하에서 농축된다. 신생 혈관 생성과 관련된 효소 활성을 탐지하기 위해 비교적 분석이 예 5와 같이 수행된다.
참조에 의한 통합
본 출원 전체에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참조 문헌(문헌에 의한 참조, 특허, 특허 출원, 본 출원의 출원일에 사용할 수 있는 버전의 젠뱅크(GenBank) 번호, 및 웹사이트를 포함)의 내용은 본 명세서에서 그 전체로서 참조에 의해 그 안에 인용된 참조 문헌을 포함하여 명시적으로 통합된다. 본 발명의 실시는 다르게 기술되지 않는 한, 해당 분야에 잘 알려져 있는 통상적인 단백질 형성 기술을 채택한다.
균등 사항
본 발명은 본 발명의 사상 또는 본질적 특성을 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구현될 수 있다. 따라서 상기 실시예들은 모든 측면에서 본 명세서에서 기술된 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주 되어야 한다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 첨부된 청구항에 의해 이해되어야 하며, 이에 따라 청구항의 의미와 범위 내에서의 모든 변화는 본 명세서에 포함되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
부록 A: 관련된 단백질에 대한 아미노산 및 cDNA 염기서열
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SEQUENCE LISTING <110> BERG PHARMA LLC <120> INTERROGATORY CELL-BASED ASSAYS AND USES THEREOF <130> 119992-06120 <140> PCT/US2012/054321 <141> 2012-09-07 <150> 61/678,590 <151> 2012-08-01 <150> 61/678,596 <151> 2012-08-01 <150> 61/668,617 <151> 2012-07-06 <150> 61/665,631 <151> 2012-06-28 <150> 61/620,305 <151> 2012-04-04 <150> 61/619,326 <151> 2012-04-02 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1411 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Ala Arg Lys Arg Arg Glu Leu Leu Pro Leu Ile Tyr His 1 5 10 15 His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Val Arg Ala Ala Arg Glu Val Lys Glu 20 25 30 Gln Ser Gly Gln Lys Cys Phe Leu Ala Gln Pro Val Thr Leu Leu Asp 35 40 45 Ile Tyr Thr His Trp Gln Gln Thr Ser Glu Leu Gly Arg Lys Arg Lys 50 55 60 Ala Glu Glu Asp Ala Ala Leu Gln Ala Lys Lys Thr Arg Val Ser Asp 65 70 75 80 Pro Ile Ser Thr Ser Glu Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ala 85 90 95 Glu Thr Ala Lys Ala Thr Pro Arg Leu Ala Ser Thr Asn Ser Ser Val 100 105 110 Leu Gly Ala Asp Leu Pro Ser Ser 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Ser Asp Ser Ala Asp Ser Glu 530 535 540 Glu Ala Pro Ala Ala Met Thr Ala Ala Gln Ala Lys Pro Ala Leu Lys 545 550 555 560 Ile Pro Gln Thr Lys Ala Cys Pro Lys Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ser 565 570 575 Ala Lys Val Ala Pro Val Arg Val Gly Thr Gln Ala Pro Arg Lys Ala 580 585 590 Gly Thr Ala Thr Ser Pro Ala Gly Ser Ser Pro Ala Val Ala Gly Gly 595 600 605 Thr Gln Arg Pro Ala Glu Asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Ser Asp Ser 610 615 620 Glu Glu Glu Lys Thr Gly Leu Ala Val Thr Val Gly Gln Ala Lys Ser 625 630 635 640 Val Gly Lys Gly Leu Gln Val Lys Ala Ala Ser Val Pro Val Lys Gly 645 650 655 Ser Leu Gly Gln Gly Thr Ala Pro Val Leu Pro Gly Lys Thr Gly Pro 660 665 670 Thr Val Thr Gln Val Lys Ala Glu Lys Gln Glu Asp Ser Glu Ser Ser 675 680 685 Glu Glu Glu Ser Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Gln Val 690 695 700 Lys Thr Ser Val Lys Lys Thr Gln Ala Lys Ala Asn Pro Ala Ala Ala 705 710 715 720 Arg Ala Pro Ser Ala Lys Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Lys Val Val 725 730 735 Thr Ala Ala Ala Gln Ala Lys Gln Arg Ser Pro Ser Lys Val Lys Pro 740 745 750 Pro Val Arg Asn Pro Gln Asn Ser Thr Val Leu Ala Arg Gly Pro Ala 755 760 765 Ser Val Pro Ser Val Gly Lys Ala Val Ala Thr Ala Ala Gln Ala Gln 770 775 780 Thr Gly Pro Glu Glu Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Glu Ser Asp Ser 785 790 795 800 Glu Glu Glu Ala Glu Thr Leu Ala Gln Val Lys Pro Ser Gly Lys Thr 805 810 815 His Gln Ile Arg Ala Ala Leu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro Arg Lys 820 825 830 Gly Ala Ala Pro Thr Pro Pro Gly Lys Thr Gly Pro Ser Ala Ala Gln 835 840 845 Ala Gly Lys Gln Asp Asp Ser Gly Ser Ser Ser Glu Glu Ser Asp Ser 850 855 860 Asp Gly Glu Ala Pro Ala Ala Val Thr Ser Ala Gln Val Ile Lys Pro 865 870 875 880 Pro Leu Ile Phe Val Asp Pro Asn Arg Ser Pro Ala Gly Pro Ala Ala 885 890 895 Thr Pro Ala Gln Ala Gln Ala Ala Ser Thr Pro Arg Lys Ala Arg Ala 900 905 910 Ser Glu Ser Thr Ala Arg Ser Ser Ser Ser Glu Ser Glu Asp Glu Asp 915 920 925 Val Ile Pro Ala Thr Gln Cys Leu Thr Pro Gly Ile Arg Thr Asn Val 930 935 940 Val Thr Met Pro Thr Ala His Pro Arg Ile Ala Pro Lys Ala Ser Met 945 950 955 960 Ala Gly Ala Ser Ser Ser Lys Glu Ser Ser Arg Ile Ser Asp Gly Lys 965 970 975 Lys Gln Glu Gly Pro Ala Thr Gln Val Ser Lys Lys Asn Pro Ala Ser 980 985 990 Leu Pro Leu Thr Gln Ala Ala Leu Lys Val Leu Ala Gln Lys Ala Ser 995 1000 1005 Glu Ala Gln Pro Pro Val Ala Arg Thr Gln Pro Ser Ser Gly Val 1010 1015 1020 Asp Ser Ala Val Gly Thr Leu Pro Ala Thr Ser Pro Gln Ser Thr 1025 1030 1035 Ser Val Gln Ala Lys Gly Thr Asn Lys Leu Arg Lys Pro Lys Leu 1040 1045 1050 Pro Glu Val Gln Gln Ala Thr Lys Ala Pro Glu Ser Ser Asp Asp 1055 1060 1065 Ser Glu Asp Ser Ser Asp Ser Ser Ser Gly Ser Glu Glu Asp Gly 1070 1075 1080 Glu Gly Pro Gln Gly Ala Lys Ser Ala His Thr Leu Gly Pro Thr 1085 1090 1095 Pro Ser Arg Thr Glu Thr Leu Val Glu Glu Thr Ala Ala Glu Ser 1100 1105 1110 Ser Glu Asp Asp Val Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Leu Ser Gly 1115 1120 1125 Tyr Met Thr Pro Gly Leu Thr Pro Ala Asn Ser Gln Ala Ser Lys 1130 1135 1140 Ala Thr Pro Lys Leu Asp Ser Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr 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Asp Gln Ser Asn Pro Lys Ser Lys Lys Glu Lys Lys Lys Ser 1355 1360 1365 Asp Lys Arg Lys Lys Asp Lys Glu Lys Lys Glu Lys Lys Lys Lys 1370 1375 1380 Ala Lys Lys Ala Ser Thr Lys Asp Ser Glu Ser Pro Ser Gln Lys 1385 1390 1395 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Ala Glu Gln Thr Val 1400 1405 1410 <210> 2 <211> 4882 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaaagaggag ccggaagtgt ggcgcgcgag gtctaagggc gcgagggaag tggcgggcgg 60 ggactaaggc ggggcgtgca ggtagccggc cggccggggg tcgcgggtat ggccgaggcc 120 aggaagcggc gggagctact tcccctgatc taccaccatc tgctgcgggc tggctatgtg 180 cgtgcggcgc gggaagtgaa ggagcagagc ggccagaagt gtttcctggc tcagcccgta 240 acccttctgg acatctatac acactggcaa caaacctcag agcttggtcg gaagcggaag 300 gcagaggaag atgcggcact gcaagctaag aaaacccgtg tgtcagaccc catcagcacc 360 tcggagagct cggaagagga ggaagaagca gaagccgaaa ccgccaaagc caccccaaga 420 ctagcatcta ccaactcctc agtcctgggg gcggacttgc catcaagcat gaaagaaaaa 480 gccaaggcag agacagagaa agctggcaag actgggaatt ccatgccaca ccctgccact 540 gggaagacgg tggccaacct 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gcttatgcag gattccaggt tatatctcat ctttgagttt ctttccatgg atctgaagaa 420 atacttggat tctatccctc ctggtcagta catggattct tcacttgtta aggtaaaagc 480 ttaactaatt ttattaatat ttatgcactg tggatataaa gggactatat atagaagtcc 540 ctgcattttg tgggaatatg cttggaaaaa gtgttagaat aagaaaaagt atttcatttt 600 tctccctcat ggttagttta tacaggttag agatacccat gttattacca gatagtgttt 660 ctagtaagta aaaattagtg cctgagataa catagaactg gtaggtattg ttggaagcta 720 gggtagtctg gtctttcttt ggctgtcaga tacatgtaaa acaaagtaat gaaagcctag 780 ggcagagtgg tggttgtagg tgttttattc cagttttgaa catgttttgg tcaatttatt 840 gtagacattt attatatttc aggtaaatta taaaattgta tagttttaag tactgaagta 900 tataaaagtg tcttattctt gcaccagttc taccaaacca ctctgcagag gtagcgctgt 960 tagttttatt tgtaatctta cacttgtatg tatgttcact ttgtatgtat ataaagattt 1020 ttttttttac acaaggtgga cttatttgca tatgtatata tacatatttt cccttttttg 1080 tgtaaaacat tatcaagacg tagatctacc tatgtctatt tacatttttg atataattaa 1140 accacttcca tattgatgaa catttaaatt attttccaac ttggttattg ttgctcttat 1200 taacagtact 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Ser Leu Gln Asp Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu Ile Phe 65 70 75 80 Glu Phe Leu Ser Met Asp Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Tyr Met Asp Ser Ser Leu Val Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile 100 105 110 Leu Gln Gly Ile Val Phe Cys His Ser Arg Arg Val Leu His Arg Asp 115 120 125 Leu Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Asp Lys Gly Thr Ile Lys Leu 130 135 140 Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Ile Arg Val Tyr 145 150 155 160 Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ser Pro Glu Val Leu Leu 165 170 175 Gly Ser Ala Arg Tyr Ser Thr Pro Val Asp Ile Trp Ser Ile Gly Thr 180 185 190 Ile Phe Ala Glu Leu Ala Thr Lys Lys Pro Leu Phe His Gly Asp Ser 195 200 205 Glu Ile Asp Gln Leu Phe Arg Ile Phe Arg Ala Leu Gly Thr Pro Asn 210 215 220 Asn Glu Val Trp Pro Glu Val Glu Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr 225 230 235 240 Phe Pro Lys Trp Lys Pro Gly Ser Leu Ala Ser His Val Lys Asn Leu 245 250 255 Asp Glu Asn Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Ile Tyr Asp Pro 260 265 270 Ala Lys 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1560 tgagaaatga tgctaaattt ataggagttt tcagtaactt aaaaagctaa catgagagca 1620 tgccaaaatt tgctaagtct tacaaagatc aagggctgtc cgcaacaggg aagaacagtt 1680 ttgaaaattt atgaactatc ttatttttag gtaggttttg aaagcttttt gtctaagtga 1740 attcttatgc cttggtcaga gtaataactg aaggagttgc ttatcttggc tttcgagtct 1800 gagtttaaaa ctacacattt tgacatagtg tttattagca gccatctaaa aaggctctaa 1860 tgtatattta actaaaatta ctagctttgg gaattaaact gtttaacaaa taaaaaaaaa 1920 aaa 1923 <210> 13 <211> 240 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Glu Asp Tyr Thr Lys Ile Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly 1 5 10 15 Val Val Tyr Lys Gly Arg His Lys Thr Thr Gly Gln Val Val Ala Met 20 25 30 Lys Lys Ile Arg Leu Glu Ser Glu Glu Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala 35 40 45 Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Leu Arg His Pro Asn Ile Val 50 55 60 Ser Leu Gln Asp Val Leu Met Gln Asp Ser Arg Leu Tyr Leu Ile Phe 65 70 75 80 Glu Phe Leu Ser Met Asp Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Ser Ile Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Tyr Met Asp Ser Ser Leu Val Lys Val Val Thr Leu Trp 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gacaagtacg aggagtatga caatgctgtg 4200 ctcaccatga tgagccaccc cactgaggcc tggaaggagg gtcagttcaa ggacatcatt 4260 accaaggttg ccaacgtcga gctctgttac agagccctgc agttctattt ggattacaaa 4320 ccactgctca tcaatgacct gctgctggtg ctttcacccc ggctggacca cacctggaca 4380 gtcagtttct tttcaaaggc aggtcagctg cccctggtga agccttacct gcggtcagtc 4440 cagagccaca acaacaagag tgtgaatgag gcactcaacc acctgctgac agaggaggag 4500 gactatcagg gcttaagggc atctatcgat gcctatgaca actttgacaa catcagcctg 4560 gctcagcagc tggagaagca tcagctgatg gagttcaggt gcattgcggc ctatctgtac 4620 aagggcaata actggtgggc ccagagcgtg gagctctgca agaaggatca tctctacaag 4680 gatgccatgc agcatgctgc agagtcgcgg gatgctgagc tggcccagaa gttgctgcag 4740 tggttcctgg aggaaggcaa gagggagtgc ttcgcagctt gtctcttcac ctgctatgac 4800 ctgcttcgcc cagacatggt gcttgagctg gcctggaggc acaacctcgt ggacttggcc 4860 atgccctact tcatccaggt gatgagggag tacctgagca aggtggacaa actggatgcc 4920 ttggagagtc tgcgcaagca agaggagcat gtgacagagc ctgcccctct cgtgtttgat 4980 tttgatgggc atgaatgaga cccagctgat 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catatcgcct ctctccagaa cccactcctc tcgccgaacc 1260 catactggaa gtagaagtga cacttagcaa accggttcca gaatctgagt tttcttccag 1320 tcctctccag gctcccaccc ctttggcatc tcacacagtg gaaattcatg agcctaatgg 1380 catggtccca tctgaagatc tggaaccaga ggtggagtca agcccagagc ttgctcctcc 1440 cccagcttgc ccctccgaat cccctgtgcc cattgctcca actgcccaac ctgaggaact 1500 gctcaacgga gccccctcgc caccagctgt ggacttaagc ccagtcagtg agccagagga 1560 gcaggccaag gaggtgacag catcaatggc gccccccacc atcccctctg ctactccagc 1620 tacggctcct tcagctactt ccccagctca ggaggaggaa atggaagaag aagaagaaga 1680 ggaagaagga gaagcaggag aagcaggaga agctgagagt gagaaaggag gagaggaact 1740 gctcccccca gagagtaccc ctattccagc caacttgtct cagaatttgg aggcagcagc 1800 agccactcaa gtggcagtat ctgtgccaaa gaggagacgg aaaattaagg agctaaataa 1860 gaaggaggct gttggagacc ttctggatgc cttcaaggag gcgaacccgg cagtaccaga 1920 ggtggaaaat cagcctcctg caggcagcaa tccaggccca gagtctgagg gcagtggtgt 1980 gcccccacgt cctgaggaag cagatgagac ctgggactca aaggaagaca aaattcacaa 2040 tgctgagaac atccagcccg 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cagtggaagc ctctaaacct agaggagaaa 1860 aaacgttacg accgtgagtt cctgcttggt tttcagttca tctttgccag tatgcagaag 1920 ccagagggat tgccacatat cagtgacgtg gtgctggaca aggccaataa aacaccactg 1980 cggccactgg atcccactag actacaaggc ataaattgtg gcccagactt cactccatcc 2040 tttgccaacc ttggccggac aacccttagc acccgtgggc ccccaagggg tgggccaggt 2100 ggggagctgc cccgtgggcc ggctggcctg ggaccccggc gctctcagca gggaccccga 2160 aaagaaccac gcaagatcat tgccacagtg ttaatgaccg aagatataaa actgaacaaa 2220 gcagagaaag cctggaaacc cagcagcaag cggacggcgg ctgataagga tcgaggggaa 2280 gaagatgctg atggcagcaa aacccaggac ctattccgca gggtgcgctc catcctgaat 2340 aaactgacac cccagatgtt ccagcagctg atgaagcaag tgacgcagct ggccatcgac 2400 accgaggaac gcctcaaagg ggtcattgac ctcatttttg agaaggccat ttcagagccc 2460 aacttctctg tggcctatgc caacatgtgc cgctgcctca tggcgctgaa agtgcccact 2520 acggaaaagc caacagtgac tgtgaacttc cgaaagctgt tgttgaatcg atgtcagaag 2580 gagtttgaga aagacaaaga tgatgatgag gtttttgaga agaagcaaaa agagatggat 2640 gaagctgcta cggcagagga acgaggacgc 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cacaaaatac atgcagaaga tggtggcaga tctggtggaa aatagctatt 1920 caatttctgt tccgatcttc aaacagtttc acaagaatat cattgggaaa ggaggcgcaa 1980 acattaaaaa gattcgtgaa gaaagcaaca ccaaaatcga ccttccagca gagaatagca 2040 attcagagac cattatcatc acaggcaagc gagccaactg cgaagctgcc cggagcagga 2100 ttctgtctat tcagaaagac ctggccaaca tagccgaggt agaggtctcc atccctgcca 2160 agctgcacaa ctccctcatt ggcaccaagg gccgtctgat ccgctccatc atggaggagt 2220 gcggcggggt ccacattcac tttcccgtgg aaggttcagg aagcgacacc gttgttatca 2280 ggggcccttc ctcggatgtg gagaaggcca agaagcagct cctgcatctg gcggaggaga 2340 agcaaaccaa gagtttcact gttgacatcc gcgccaagcc agaataccac aaattcctca 2400 tcggcaaggg gggcggcaaa attcgcaagg tgcgcgacag cactggagca cgtgtcatct 2460 tccctgcggc tgaggacaag gaccaggacc tgatcaccat cattggaaag gaggacgccg 2520 tccgagaggc acagaaggag ctggaggcct tgatccaaaa cctggataat gtggtggaag 2580 actccatgct ggtggacccc aagcaccacc gccacttcgt catccgcaga ggccaggtct 2640 tgcgggagat tgctgaagag tatggcgggg tgatggtcag cttcccacgc tctggcacac 2700 agagcgacaa 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ttatgtatat 1140 tatttctatt gtctttgtct taatatgcta agttaatttt cactttaaaa aagccatttg 1200 aagaccagag ctatgttgat ttttttcggt atttctgcct agtagttctt agacacagtt 1260 gacctagtaa aatgtttgag aattaaaacc aaacatgctc atatttgcaa aatgttcttt 1320 aaaagttaca tgttgaactc agtgaacttt ataagaattt atgcagtttt acagaacgtt 1380 aagttttgta cttgacgttt ctgtttatta gctaaattgt tcctcaggtg tgtgtatata 1440 tatatacata tatatatata tatatat 1467 <210> 49 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ser Glu His 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gcaagatatt ttttcttttt tatagtgtga agcagtattc tggaaagttt ttctaagact 1680 agtgaagaac tgaaggagtc ctgcatcttt ttttttttat ctgcttctgt ttaaaaagcc 1740 aacattcctc tgcttcatag gtgttctgca tttgaggtgt agtgaaatct ttgctgttca 1800 ccagatgtaa tgttttagtt ccttacaaac agggttgggg gggggaaggg cgtgcaaaaa 1860 ctaacattga aattttgaaa cagcagcaga gtgagtggat tttatttttc gttattgttg 1920 gtggtttaaa aaattccccc catgtaatta ttgtgaacac cttgctttgt ggtcactgta 1980 acatttgggg ggtgggacag ggaggaaaag taacaatagt ccacatgtcc ctggcatctg 2040 ttcagagcag tgtgcagaat gtaatgctct tttgtaagaa acgttttatg atttttaaaa 2100 taaatttagt gaacctattt ttggtggtca tttttttttt aagacagtca ttttaaaatg 2160 gtggctgaat ttcccaaccc acccccaaac taaacactaa gtttaatttt cagctcctct 2220 gttggacata taagtgcatc tcttgttgga cataggcaaa ataacttggc aaacttagtt 2280 ctggtgattt cttgatggtt tggaagtcta ttgctgggaa gaaattccat catacatatt 2340 catgcttata ataagctggg gattttttgt ttgtttttgc aaatgcttgc ccctactttt 2400 caacaatttt ctatgttagt tgtgaagaac taaggtgggg agcagtacta caagttgagt 2460 aatggtatga gtatatacca gaattctgat tggcagcaag ttttattaat cagaataaca 2520 cttggttatg gaagtgacta atgctgaaaa aattgattat ttttattaga taatttctca 2580 cctatagact taaactgtca atttgctcta gtgtcttatt agttaaactt tgtaaaatat 2640 atatatactt gtttttccat tgtatgcaaa ttgaaagaaa aagatgtacc atttctctgt 2700 tgtatgttgg attatgtagg aaatgtttgt gtacaattca aaaaaaaaaa agatgaaaaa 2760 agttcctgtg gatgttttgt gtagtatctt ggcatttgta ttgatagtta aaattcactt 2820 ccaaataaat aaaacaccca tgatgctaga tttgatgtgt gcccgatttg aacaagggtt 2880 gattgacacc tgtaaaattt gttgaaacgt tcctcttaaa aggaaatata gtaatcttat 2940 gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2960 <210> 59 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Met Glu Val Pro Pro Arg Leu Ser His Val Pro Pro Pro Leu Phe Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Thr Leu Ala Ser Arg Ser Leu Ser His Trp Arg Pro 20 25 30 Arg Pro Pro Arg Gln Leu Ala Pro Leu Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ser 35 40 45 Ser Ala Arg Gln Gly Ala Arg Arg Ala Gln Arg His Val Thr Ala Gln 50 55 60 Gln Pro Ser Arg Leu Ala Gly Gly Ala Ala Ile Lys Gly Gly 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ctgtgccatc 480 agtatcttaa tgaaggactt ggcagatgaa cttgctcttg ttgatgtcat cgaagacaaa 540 ttgaagggag agatgatgga tctccaacat ggcagccttt tccttagaac accaaagatt 600 gtctctggca aagactataa tgtaactgca aactccaagc tggtcattat cacggctggg 660 gcacgtcagc aagagggaga aagccgtctt aatttggtcc agcgtaacgt gaacatcttt 720 aaattcatca ttcctaatgt tgtaaaatac agcccgaact gcaagttgct tattgtttca 780 aatccagtgg atatcttgac ctacgtggct tggaagataa gtggttttcc caaaaaccgt 840 gttattggaa gcggttgcaa tctggattca gcccgattcc gttacctaat gggggaaagg 900 ctgggagttc acccattaag ctgtcatggg tgggtccttg gggaacatgg agattccagt 960 gtgcctgtat ggagtggaat gaatgttgct ggtgtctctc tgaagactct gcacccagat 1020 ttagggactg ataaagataa ggaacagtgg aaagaggttc acaagcaggt ggttgagagt 1080 gcttatgagg tgatcaaact caaaggctac acatcctggg ctattggact ctctgtagca 1140 gatttggcag agagtataat gaagaatctt aggcgggtgc acccagtttc caccatgatt 1200 aagggtcttt acggaataaa ggatgatgtc ttccttagtg ttccttgcat tttgggacag 1260 aatggaatct cagaccttgt gaaggtgact ctgacttctg aggaagaggc ccgtttgaag 1320 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tggaaagtaa cattctatat gtaaatgtaa aatttatttg ccaactgaat ataggcaatg 2220 atagtgtgtc actataggga acacagattt ttgagatctt gtcctctgga agctggtaac 2280 aattaaaaac aatcttaagg cagggaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2323 <210> 71 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 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tacagttgtt ggggttggtg 360 ctgttggcat ggcctgtgcc atcagtatct taatgaagga cttggcagat gaacttgctc 420 ttgttgatgt catcgaagac aaattgaagg gagagatgat ggatctccaa catggcagcc 480 ttttccttag aacaccaaag attgtctctg gcaaagacta taatgtaact gcaaactcca 540 agctggtcat tatcacggct ggggcacgtc agcaagaggg agaaagccgt cttaatttgg 600 tccagcgtaa cgtgaacatc tttaaattca tcattcctaa tgttgtaaaa tacagcccga 660 actgcaagtt gcttattgtt tcaaatccag tggatatctt gacctacgtg gcttggaaga 720 taagtggttt tcccaaaaac cgtgttattg gaagcggttg caatctggat tcagcccgat 780 tccgttacct aatgggggaa aggctgggag ttcacccatt aagctgtcat gggtgggtcc 840 ttggggaaca tggagattcc agtgtgcctg tatggagtgg aatgaatgtt gctggtgtct 900 ctctgaagac tctgcaccca gatttaggga ctgataaaga taaggaacag tggaaagagt 960 gcagatacac tttgggggat ccaaaaggag ctgcaatttt aaagtcttct gatgtcatat 1020 catttcactg tctaggctac aacaggattc taggtggagg ttgtgcatgt tgtccttttt 1080 atctgatctg tgattaaagc agtaatattt taagatggac tgggaaaaac atcaactcct 1140 gaagttagaa ataagaatgg tttgtaaaat ccacagctat atcctgatgc tggatggtat 1200 taatcttgtg tagtcttcaa ctggttagtg tgaaatagtt ctgccacctc tgacgcacca 1260 ctgccaatgc tgtacgtact gcatttgccc cttgagccag gtggatgttt accgtgtgtt 1320 atataacttc ctggctcctt cactgaacat gcctagtcca acattttttc ccagtgagtc 1380 acatcctggg atccagtgta taaatccaat atcatgtctt gtgcataatt cttccaaagg 1440 atcttatttt gtgaactata tcagtagtgt acattaccat ataatgtaaa aagatctaca 1500 tacaaacaat gcaaccaact atccaagtgt tataccaact aaaaccccca ataaaccttg 1560 aacagtgact actttggtta attcattata ttaagatata aagtcataaa gctgctagtt 1620 attatattaa tttggaaata ttaggctatt cttgggcaac cctgcaacga ttttttctaa 1680 cagggatatt attgactaat agcagaggat gtaatagtca actgagttgt attggtacca 1740 cttccattgt aagtcccaaa gtattatata tttgataata atgctaatca taattggaaa 1800 gtaacattct atatgtaaat gtaaaattta tttgccaact gaatataggc aatgatagtg 1860 tgtcactata gggaacacag atttttgaga tcttgtcctc tggaagctgg taacaattaa 1920 aaacaatctt aaggcaggga aaaaaaaaaa aaaaaaa 1957 <210> 73 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Met Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Thr Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Lys Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Glu Arg Val Phe Thr 225 230 235 240 Glu <210> 74 <211> 2102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 gtctgccggt cggttgtctg gctgcgcgcg ccacccgggc ctctccagtg ccccgcctgg 60 ctcggcatcc acccccagcc cgactcacac gtgggttccc gcacgtccgc cggccccccc 120 cgctgacgtc agcatagctg ttccacttaa ggcccctccc gcgcccagct cagagtgctg 180 cagccgctgc cgccgattcc ggatctcatt gccacgcgcc cccgacgacc gcccgacgtg 240 cattcccgat tccttttggt tccaagtcca atatggcaac tctaaaggat cagctgattt 300 ataatcttct aaaggaagaa cagacccccc agaataagat tacagttgtt ggggttggtg 360 ctgttggcat ggcctgtgcc atcagtatct taatgaagga cttggcagat gaacttgctc 420 ttgttgatgt catcgaagac aaattgaagg gagagatgat ggatctccaa catggcagcc 480 ttttccttag aacaccaaag attgtctctg gcaaagacta taatgtaact gcaaactcca 540 agctggtcat tatcacggct ggggcacgtc agcaagaggg agaaagccgt cttaatttgg 600 tccagcgtaa cgtgaacatc tttaaattca tcattcctaa tgttgtaaaa tacagcccga 660 actgcaagtt gcttattgtt tcaaatccag tggatatctt gacctacgtg gcttggaaga 720 taagtggttt tcccaaaaac cgtgttattg gaagcggttg caatctggat tcagcccgat 780 tccgttacct aatgggggaa aggctgggag ttcacccatt aagctgtcat gggtgggtcc 840 ttggggaaca tggagattcc agtgtgcctg tatggagtgg aatgaatgtt gctggtgtct 900 ctctgaagac tctgcaccca gatttaggga ctgataaaga taaggaacag tggaaagagg 960 ttcacaagca ggtggttgag agggtcttta cggaataaag gatgatgtct tccttagtgt 1020 tccttgcatt ttgggacaga atggaatctc agaccttgtg aaggtgactc tgacttctga 1080 ggaagaggcc cgtttgaaga agagtgcaga tacactttgg gggatccaaa aggagctgca 1140 attttaaagt cttctgatgt catatcattt cactgtctag gctacaacag gattctaggt 1200 ggaggttgtg catgttgtcc tttttatctg atctgtgatt aaagcagtaa tattttaaga 1260 tggactggga aaaacatcaa ctcctgaagt tagaaataag aatggtttgt aaaatccaca 1320 gctatatcct gatgctggat ggtattaatc ttgtgtagtc ttcaactggt tagtgtgaaa 1380 tagttctgcc acctctgacg caccactgcc aatgctgtac gtactgcatt tgccccttga 1440 gccaggtgga tgtttaccgt gtgttatata acttcctggc tccttcactg aacatgccta 1500 gtccaacatt ttttcccagt gagtcacatc ctgggatcca gtgtataaat ccaatatcat 1560 gtcttgtgca taattcttcc aaaggatctt attttgtgaa ctatatcagt agtgtacatt 1620 accatataat gtaaaaagat ctacatacaa acaatgcaac caactatcca agtgttatac 1680 caactaaaac ccccaataaa ccttgaacag tgactacttt ggttaattca ttatattaag 1740 atataaagtc ataaagctgc tagttattat attaatttgg aaatattagg ctattcttgg 1800 gcaaccctgc aacgattttt tctaacaggg atattattga ctaatagcag aggatgtaat 1860 agtcaactga gttgtattgg taccacttcc attgtaagtc ccaaagtatt atatatttga 1920 taataatgct aatcataatt ggaaagtaac attctatatg taaatgtaaa atttatttgc 1980 caactgaata taggcaatga tagtgtgtca ctatagggaa cacagatttt tgagatcttg 2040 tcctctggaa gctggtaaca attaaaaaca atcttaaggc agggaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aa 2102 <210> 75 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Thr Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 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ccctgcgccc cgcccctccg gctagctcgc tggctcccgg 420 ctcctcccga cgtctcctac ctcctcacgg ctcttcccgg cgctctcctg gctcccttct 480 gccccagctc cgtctcggcg gcggcgggca gttgcagtgg tgcagaatgg ctgacctcag 540 tcttgcagat gcattaacag aaccatctcc agacattgag ggagagataa agcgggactt 600 cattgccaca ctagaggcag aggcctttga tgatgttgtg ggagaaactg ttggaaaaac 660 agactatatt cctctcctgg atgttgatga gaaaaccggg aactcagagt caaagaagaa 720 accgtgctca gaaactagcc agattgaaga tactccatct tctaaaccaa cactcctagc 780 caatggtggt catggagtag aagggagcga tactacaggg tctccaactg aattccttga 840 agagaaaatg gcctaccagg aatacccaaa tagccagaac tggccagaag ataccaactt 900 ttgtttccaa cctgagcaag tggtcgatcc tatccagact gatcccttta agatgtacca 960 tgatgatgac ctggcagatt tggtctttcc ctccagtgcg acagctgata cttcaatatt 1020 tgcaggacaa aatgatccct tgaaagacag ttacggtatg tctccctgca acacagctgt 1080 tgtacctcag gggtggtctg tggaagcctt aaactctcca cactcagagt cctttgtttc 1140 cccagaggct gttgcagaac ctcctcagcc aacggcagtt cccttagagc tagccaagga 1200 gatagaaatg gcatcagaag agaggccacc agcacaagca ttggaaataa tgatgggact 1260 gaagactact gacatggcac catctaaaga aacagagatg gccctcgcca aggacatggc 1320 actagctaca aaaaccgagg tggcattggc taaagatatg gaatcaccca ccaaattaga 1380 tgtgacactg gccaaggaca tgcagccatc catggaatca gatatggccc tagtcaagga 1440 catggaacta cccacagaaa aagaagtggc cctggttaag gatgtcagat ggcccacaga 1500 aacagatgta tcttcagcca agaatgtggt actgcccaca gaaacagagg tagccccagc 1560 caaggatgtg acactgttga aagaaacaga gagggcatct cctataaaaa tggacttagc 1620 cccttccaag gacatgggac cacccaaaga aaacaagaaa gaaacagaga gggcatctcc 1680 tataaaaatg gacttggctc cttccaagga catgggacca cccaaagaaa acaagatagt 1740 cccagccaag gatttggtat tactctcaga aatagaggtg gcacaggcta atgacattat 1800 atcatccaca gaaatatcct ctgctgagaa ggtggctttg tcctcagaaa cagaggtagc 1860 cctggccagg gacatgacac tgcccccgga aaccaacgtg atcttgacca aggataaagc 1920 actaccttta gaagcagagg tggccccagt caaggacatg gctcaactcc cagaaacaga 1980 aatagccccg gccaaggatg tggctccgtc cacagtaaaa gaagtgggct tgttgaagga 2040 catgtctcca ctatcagaaa cagaaatggc tctgggcaag gatgtgactc cacctccaga 2100 aacagaagta gttctcatca agaacgtatg tctgcctcca gaaatggagg tggccctgac 2160 tgaggatcag gtcccagccc tcaaaacaga agcacccctg gctaaggatg gggttctgac 2220 cctggccaac aatgtgactc cagccaaaga tgttccacca ctctcagaaa cagaggcaac 2280 accagttcca attaaagaca tggaaattgc acaaacacaa aaaggaataa gtgaggattc 2340 ccatttagaa tctctgcagg atgtggggca gtcagctgca cctactttca tgatttcacc 2400 agaaaccgtc acaggaacgg ggaaaaagtg cagcttgccg gccgaggagg attctgtgtt 2460 agaaaaacta ggggaaagga aaccatgcaa cagtcaacct tctgagcttt cttcagagac 2520 ctcaggaata gccaggccag aagaaggaag gcctgtggtg agtgggacag gaaatgacat 2580 caccacccca ccgaacaagg agctcccacc aagcccagag aagaaaacaa agcctttggc 2640 caccactcaa cctgcaaaga cttcaacatc gaaagccaaa acacagccca cttctctccc 2700 taagcagcca gctcccacca ccattggtgg gttgaataaa aaacccatga gccttgcttc 2760 aggcttagtg ccagctgccc cacccaaacg ccctgccgtc gcctctgcca ggccttccat 2820 cttaccttca aaagacgtga agccaaagcc cattgcagat gcaaaggctc ctgagaagcg 2880 ggcctcacca tccaagccag cttctgcccc agcctccaga tctgggtcca agagcactca 2940 gactgttgca aaaaccacaa cagctgctgc tgttgcctca actggcccaa gcagtaggag 3000 cccctccacg ctcctgccca agaagcccac tgccattaag actgagggaa aacctgcaga 3060 agtcaagaag atgactgcaa agtctgtacc agctgacttg agtcgcccaa agagcacctc 3120 caccagttcc atgaagaaaa ccaccactct cagtgggaca gcccccgctg caggggtggt 3180 tcccagccga gtcaaggcca cacccatgcc ctcccggccc tccacaactc ctttcataga 3240 caagaagccc acctcggcca aacccagctc caccaccccc cggctcagcc gcctggccac 3300 caatacttct gctcctgatc tgaagaatgt ccgctccaag gttggctcca cggaaaacat 3360 caagcatcag cctggaggag gccgggccaa agtagagaaa aaaacagagg cagctgctac 3420 aacccgaaag cctgaatcta atgcagtcac taaaacagcc ggcccaattg caagtgcaca 3480 gaaacaacct gcggggaaag tccagatagt ctccaaaaaa gtgagctaca gccatattca 3540 gtccaagtgt ggttccaagg acaatattaa gcatgtccct ggaggtggta atgttcagat 3600 tcagaacaag aaagtggaca tctctaaggt ctcctccaag tgtgggtcta aggctaacat 3660 caagcacaag cctggtggag gagatgtcaa gattgaaagt cagaagttga acttcaagga 3720 gaaggcccag gccaaggtgg gatccctcga 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gacaccatgt ccctagctcc ccaagcacac 5460 accaggaaac tgcaggggct cacggaggaa gtgctgcctg ggccaggggg accagctttc 5520 ctccgtagag accatgtgca gaacacttct gctgtgccaa gaacatgagg gagccagtgt 5580 tttgtcagca ggaagaaagg gcctgctggg atgaaagtgg gaaggaaaca gggttgcgta 5640 gtcaggagac acctcagggg caacagcaca ggcccagagt acctgctgcc tccactgcgt 5700 ctgtcctggg gtcatgagga tgctgaggtt gacgacaggt tccaggtcct ttcactcctt 5760 tggccaaagg ttgggggtag gtggcccaag tggcgtgctc tctaggtaga caacaggagt 5820 ggtcagagtt ccctcaaagg atcctccact ccagagcacc tgagaaggcc gggaccagag 5880 gccctgtgtg atgtgtactc cgcagctgtt tggggtggga catttctgta cttctcgatt 5940 tgcttatggc tcagccatta cctgtgtcag tccatgattc tgttgtaaca gttttaagag 6000 taaataaata aagctgcctg atgtcccatc acgcagaaaa aaaaaa 6046 <210> 79 <211> 1152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Ala Asp Leu Ser Leu Ala Asp Ala Leu Thr Glu Pro Ser Pro Asp 1 5 10 15 Ile Glu Gly Glu Ile Lys Arg Asp Phe Ile Ala Thr Leu Glu Ala Glu 20 25 30 Ala Phe Asp Asp Val Val Gly Glu Thr Val Gly Lys Thr Asp Tyr 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gaagagggag ccaagatcgt taaagatatc 960 atggccaaag cacaaaagaa tggtgtaagg attacttttc ctgttgattt tgttactggg 1020 gacaagtttg acgagaacgc tcaggttgga aaagccactg tagcatctgg catatctcct 1080 ggctggatgg gtttggactg tggtcctgag agcaacaaga atcatgctca agttgtggct 1140 caagcaaggc taattgtttg gaatgggccg ttaggagtat ttgaatggga tgcctttgct 1200 aagggaacca aagccctcat ggatgaaatt gtgaaagcca cttccaaggg ctgcatcact 1260 gttatagggg gtggagacac tgctacttgc tgtgccaaat ggaacactga agataaagtc 1320 agccatgtca gcactggagg cggtgccagt ctagagcttc tggaaggtaa aatccttcct 1380 ggagtagagg ccctcagcaa catgtagtta atatagtgtt acttccttct gttttctgtc 1440 catggccctt aagtcagctt aatgctttta catctcgatg tgacttttgt taaaatctac 1500 tcctagatca agacctatgt aatggacaag cagcaggcca tcaggaactc ttaatatcag 1560 cacagcaatt cattttagtt tggtcacgca tttgcctgtt caagttctca tttgaacttc 1620 accattgtgc tatctaggga ggacatattc ttaagttgcc tattaaagaa agtgagctga 1680 agaaactgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1721 <210> 107 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 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tattcacttg acccggagaa ccccacgaaa tcatgcaaat caagaggttc 360 caatcttcgt gttcacttta agaacactcg tgaaactgct caggccatca agggtatgca 420 tatacgaaaa gccacgaagt atctgaaaga tgtcacttta cagaaacagt gtgtaccatt 480 ccgacgttac aatggtggag ttggcaggtg tgcgcaggcc aagcaatggg gctggacaca 540 aggtcggtgg cccaaaaaga gtgctgaatt tttgctgcac atgcttaaaa acgcagagag 600 taatgctgaa cttaagggtt tagatgtaga ttctctggtc attgagcata tccaagtgaa 660 caaagcacct aagatgcgcc gccggaccta cagagctcat ggtcggatta acccatacat 720 gagctctccc tgccacattg agatgatcct tacggaaaag gaacagattg ttcctaaacc 780 agaagaggag gttgcccaga agaaaaagat atcccagaag aaactgaaga aacaaaaact 840 tatggcacgg gagtaaattc agcattaaaa taaatgtaat taaaaggaaa agaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaa 916 <210> 121 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Met Val Arg Tyr Ser Leu Asp Pro Glu Asn Pro Thr Lys Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ser Arg Gly Ser Asn Leu Arg Val His Phe Lys Asn Thr Arg Glu Thr 20 25 30 Ala Gln Ala Ile Lys Gly Met His Ile Arg Lys Ala Thr Lys Tyr Leu 35 40 45 Lys Asp 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cattaagcgg 240 agatccggtg agttttgtct ggtttgggcc agagagcggc ccctttcccg ggtctgggag 300 ctgtgatttt ttactgtcag gcaggaagag cggtaactgc catcgcggcg ggcatccctg 360 gcgccagggt gttggtctgg gtaccggctt ccctctcggc cgacttgtca gctctgtgag 420 ccgcgcgcgt ctgagcccgt gtcctcacct gtaaagtgga gaaatgaaaa aggacctgaa 480 cttcctcggt ggttgttgag agttaaggca cggggttgat gttttcagat gaaattctca 540 aagcaagtca gggtggggat ggatggtttc atcccacagg tgggaagatt gagg 594 <210> 133 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Met Ser Ala His Leu Gln Trp Met Val Val Arg Asn Cys Ser Ser Phe 1 5 10 15 Leu Ile Lys Arg Asn Lys Gln Thr Tyr Ser Thr Glu Pro Asn Asn Leu 20 25 30 Lys Ala Arg Asn Ser Phe Arg Tyr Asn Gly Leu Ile His Arg Lys Thr 35 40 45 Val Gly Val Glu Pro Ala Ala Asp Gly Lys Gly Val Val Val Val Ile 50 55 60 Lys Arg Arg Ser Glu 65 <210> 134 <211> 682 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 ctctttccgt ctcaggtcgc cgctgcgaag ggagccgccg ccatgtctgc gcatctgcaa 60 tggatggtcg tgcggaactg ctccagtttc ctgatcaaga ggaataagca gacctacagc 120 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<213> Homo sapiens <400> 152 gcccgcgcca gggtcctcgg agctgctctg gctgcgcgcg gagcgggctc cggagggaag 60 tcccgagaca aagggaagcg ccgccgccgc cgccccgctc ggtcctccac ctgtccgcta 120 cgctcgccgg ggctgcggcc gcccgaggct gccctgagga tctgtgtttg gtgaaaagga 180 gccaaattca cctgcagggc aggcggctct agcagcttca gaagcctggt gccctggcga 240 cactggacct gccttggctt ctttgatccc aaccccaccc ccgatttctg ctctgctgac 300 tggggaagtc atcgtgccac ccagaacctg agtgcgggcc tctcagagct ccttcgtccg 360 tgggtctgcc ggggactggg ccttgtctcc ctaacgagtg ccagggactt tgaacatgtc 420 ggggatcgcc ctcagcagac tcgcccagga gaggaaagca tggaggaaag accacccatt 480 tggtttcgtg gctgtcccaa caaaaaatcc cgatggcacg atgaacctca tgaactggga 540 gtgcgccatt ccaggaaaga aagggactcc gtgggaagga ggcttgttta aactacggat 600 gcttttcaaa gatgattatc catcttcgcc accaaaatgt aaattcgaac caccattatt 660 tcacccgaat gtgtaccctt cggggacagt gtgcctgtcc atcttagagg aggacaagga 720 ctggaggcca gccatcacaa tcaaacagat cctattagga atacaggaac ttctaaatga 780 accaaatatc caagacccag ctcaagcaga ggcctacacg atttactgcc 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gagcgctggg 1680 cagctaagat ctgcataggt cgggattggc atcgagaccc tggcaactgc accggtgcca 1740 gctgtcttgg gggccacaag gccaggtcca gaccagggct gggggctgcc tgaggactcc 1800 tatccgggca gcctgctggc gggggttccc ctcttcagtg gccaggtcac agggatggag 1860 ctgcgctgtg catagggtgc cacctcaggt gtctgtccct tgtgtcctca ggaggcagcc 1920 ttgctaccac ccgtggcaaa cgccaggtgc tttttctggg agagcccaca gccgtggccc 1980 tccagggctt ccccgaccct tagcgccagg tagagggccc tgggcagcct gtgtctggaa 2040 ttcttcgtcc tgaggccacc tgagtgtggt ctgtcctggg gaggctgtgc gcctcagcag 2100 ccgtcctgac gctgagccct ctgcaaaggt tgggccggcc aggcctcttg gggctgcctg 2160 agccactgca ggaagtggcc tggctgggaa gttgggtgcc ggtcacctcc cagcaggaag 2220 gcacagtgga cagagatggg aagccctggg ggacacagcc cggtgctccc agccctccaa 2280 cctctggctc ccaacccagt ctccccatcc tagcgagctt ggccctcctc agtttcgttt 2340 caagccttgg ggctggagct ggccctgctg ccctggcacc ccccggtggc tggagctggg 2400 tccccgtggc ccaagtgcag ggtcccaaga gggcagggcg gggctcccca aaggagcaaa 2460 gaatgcaggg agggcggtcc agggccctgg gaaggggagc tcggcaccct ccaggtccgt 2520 gtgggactcc agccgctgtt ggctgggaat cgaagttaga ggtgacttcc aaaggccccc 2580 cgagccggca gtgcccccca ccacccctcc agcgactctg cggtgccagt gccttgttgg 2640 cttttccggc tacgcaccct gcagtcactg agctctcggt ctgacgtctg atgtttgtgg 2700 tttgtttata acacggggcc ttacctgggg aattcagctg gtttgaatat ttgtagcccg 2760 ctcccagaat gtcttatttt gtaatgactg aactacattt agtaatagtt acacatgtat 2820 atggttaata catatggaaa ttcaatatat tttgtagtta acgtattctg aagtaacgga 2880 tgtttctcgc caatcgtagt gacttcagct aacgaaatgt tcttttgtag taccacggtc 2940 ctcggcctaa cgaaggacgt gaaccttgta agaggagagc tctgaaacgc ggtcaccttt 3000 gtttagtgga agggaaagtg tgttcccggc atgaggtgcc tcggaattag taaagaattg 3060 tgggcaatgg attaaccact gtatctaaga atccaccatt aaagcatttg cacagacaaa 3120 aaaaaaaa 3128 <210> 153 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Met Ser Gly Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gln Glu Arg Lys Ala Trp 1 5 10 15 Arg Lys Asp His Pro Phe Gly Phe Val Ala Val Pro Thr Lys Asn Pro 20 25 30 Asp Gly Thr Met Asn Leu Met Asn Trp Glu Cys Ala Ile Pro Gly Lys 35 40 45 Lys Gly Thr Pro Trp Glu Gly Gly Leu Phe Lys Leu Arg Met Leu Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Tyr Pro Ser Ser Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro 65 70 75 80 Leu Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Asp Lys Asp Trp Arg Pro Ala Ile Thr Ile Lys Gln Ile 100 105 110 Leu Leu Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asn Glu Pro Asn Ile Gln Asp Pro 115 120 125 Ala Gln Ala Glu Ala Tyr Thr Ile Tyr Cys Gln Asn Arg Val Glu Tyr 130 135 140 Glu Lys Arg Val Arg Ala Gln Ala Lys Lys Phe Ala Pro Ser 145 150 155 <210> 154 <211> 2991 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 aactcgcggg agcgtcaccg tcctgcgacg cttcagagga tccttaggcc tcagtggtct 60 ttgacccccg gccccaggac ctgaccccaa ggaaacctcc gggacctgtg gctggagagg 120 tgaccgccag gcatccgggg agcctttgga gatctcggct tcctttttcc cccgctgctt 180 gccggcgtgt cctcgggtgg acgcgggcag cccgaagggg agtttacaga cgctccctca 240 catcggggac gcggctcctt taagggcgga ctttgaacat gtcggggatc gccctcagca 300 gactcgccca ggagaggaaa gcatggagga aagaccaccc 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gggctgtgct 1200 gcttttgagc ctcagacccc aggtcagcat ctcggttctg cgccacttcc tttgtgttta 1260 tatggcgttt tgtctgtgtt gctgtttaga gtaaataaac tgtttatata aaggttttgg 1320 ttgcattatt atcattgaaa gtgagaggag gcggcctccc agtgcccggc cctccccacc 1380 cacctgcagc cccaccgcgg gccaggacca ggctctccat ctgcttcgga tgcacgcagg 1440 ctgtgaggct ctgtcttgcc ctggatcttt gtaaacaggg ctgtgtacaa agtgctgctg 1500 aggtttctgt gctccccgca tctgcgggct gtagagcgct gggcagctaa gatctgcata 1560 ggtcgggatt ggcatcgaga ccctggcaac tgcaccggtg ccagctgtct tgggggccac 1620 aaggccaggt ccagaccagg gctgggggct gcctgaggac tcctatccgg gcagcctgct 1680 ggcgggggtt cccctcttca gtggccaggt cacagggatg gagctgcgct gtgcataggg 1740 tgccacctca ggtgtctgtc ccttgtgtcc tcaggaggca gccttgctac cacccgtggc 1800 aaacgccagg tgctttttct gggagagccc acagccgtgg ccctccaggg cttccccgac 1860 ccttagcgcc aggtagaggg ccctgggcag cctgtgtctg gaattcttcg tcctgaggcc 1920 acctgagtgt ggtctgtcct ggggaggctg tgcgcctcag cagccgtcct gacgctgagc 1980 cctctgcaaa ggttgggccg gccaggcctc ttggggctgc ctgagccact gcaggaagtg 2040 gcctggctgg gaagttgggt gccggtcacc tcccagcagg aaggcacagt ggacagagat 2100 gggaagccct gggggacaca gcccggtgct cccagccctc caacctctgg ctcccaaccc 2160 agtctcccca tcctagcgag cttggccctc ctcagtttcg tttcaagcct tggggctgga 2220 gctggccctg ctgccctggc accccccggt ggctggagct gggtccccgt ggcccaagtg 2280 cagggtccca agagggcagg gcggggctcc ccaaaggagc aaagaatgca gggagggcgg 2340 tccagggccc tgggaagggg agctcggcac cctccaggtc cgtgtgggac tccagccgct 2400 gttggctggg aatcgaagtt agaggtgact tccaaaggcc ccccgagccg gcagtgcccc 2460 ccaccacccc tccagcgact ctgcggtgcc agtgccttgt tggcttttcc ggctacgcac 2520 cctgcagtca ctgagctctc ggtctgacgt ctgatgtttg tggtttgttt ataacacggg 2580 gccttacctg gggaattcag ctggtttgaa tatttgtagc ccgctcccag aatgtcttat 2640 tttgtaatga ctgaactaca tttagtaata gttacacatg tatatggtta atacatatgg 2700 aaattcaata tattttgtag ttaacgtatt ctgaagtaac ggatgtttct cgccaatcgt 2760 agtgacttca gctaacgaaa tgttcttttg tagtaccacg gtcctcggcc taacgaagga 2820 cgtgaacctt gtaagaggag agctctgaaa cgcggtcacc tttgtttagt 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<400> 156 aactcgcggg agcgtcaccg tcctgcgacg cttcagagga tccttaggcc tcagtggtct 60 ttgacccccg gccccaggac ctgaccccaa ggaaacctcc gggacctgtg gctggagagg 120 gactttgaac atgtcgggga tcgccctcag cagactcgcc caggagagga aagcatggag 180 gaaagaccac ccatttggtt tcgtggctgt cccaacaaaa aatcccgatg gcacgatgaa 240 cctcatgaac tgggagtgcg ccattccagg aaagaaaggg actccgtggg aaggaggctt 300 gtttaaacta cggatgcttt tcaaagatga ttatccatct tcgccaccaa aatgtaaatt 360 cgaaccacca ttatttcacc cgaatgtgta cccttcgggg acagtgtgcc tgtccatctt 420 agaggaggac aaggactgga ggccagccat cacaatcaaa cagatcctat taggaataca 480 ggaacttcta aatgaaccaa atatccaaga cccagctcaa gcagaggcct acacgattta 540 ctgccaaaac agagtggagt acgagaaaag ggtccgagca caagccaaga agtttgcgcc 600 ctcataagca gcgaccttgt ggcatcgtca aaaggaaggg attggtttgg caagaacttg 660 tttacaacat ttttgcaaat ctaaagttgc tccatacaat gactagtcac ctgggggggt 720 tgggcgggcg ccatcttcca ttgccgccgc gggtgtgcgg tctcgattcg ctgaattgcc 780 cgtttccata cagggtctct tccttcggtc ttttgtattt ttgattgtta tgtaaaactc 840 gcttttattt taatattgat gtcagtattt caactgctgt aaaattataa acttttatac 900 ttgggtaagt cccccagggg cgagttcctc gctctgggat gcaggcatgc ttctcaccgt 960 gcagagctgc acttggcctc agctggctgt atggaaatgc accctccctc ctgccgctcc 1020 tctctagaac cttctagaac ctgggctgtg ctgcttttga gcctcagacc ccaggtcagc 1080 atctcggttc tgcgccactt cctttgtgtt tatatggcgt tttgtctgtg ttgctgttta 1140 gagtaaataa actgtttata taaaggtttt ggttgcatta ttatcattga aagtgagagg 1200 aggcggcctc ccagtgcccg gccctcccca cccacctgca gccccaccgc gggccaggac 1260 caggctctcc atctgcttcg gatgcacgca ggctgtgagg ctctgtcttg ccctggatct 1320 ttgtaaacag ggctgtgtac aaagtgctgc tgaggtttct gtgctccccg catctgcggg 1380 ctgtagagcg ctgggcagct aagatctgca taggtcggga ttggcatcga gaccctggca 1440 actgcaccgg tgccagctgt cttgggggcc acaaggccag gtccagacca gggctggggg 1500 ctgcctgagg actcctatcc gggcagcctg ctggcggggg ttcccctctt cagtggccag 1560 gtcacaggga tggagctgcg ctgtgcatag ggtgccacct caggtgtctg tcccttgtgt 1620 cctcaggagg cagccttgct accacccgtg gcaaacgcca ggtgcttttt ctgggagagc 1680 ccacagccgt ggccctccag ggcttccccg acccttagcg ccaggtagag ggccctgggc 1740 agcctgtgtc tggaattctt cgtcctgagg ccacctgagt gtggtctgtc ctggggaggc 1800 tgtgcgcctc agcagccgtc ctgacgctga gccctctgca aaggttgggc cggccaggcc 1860 tcttggggct gcctgagcca ctgcaggaag tggcctggct gggaagttgg gtgccggtca 1920 cctcccagca ggaaggcaca gtggacagag atgggaagcc ctgggggaca cagcccggtg 1980 ctcccagccc tccaacctct ggctcccaac ccagtctccc catcctagcg agcttggccc 2040 tcctcagttt cgtttcaagc cttggggctg gagctggccc tgctgccctg gcaccccccg 2100 gtggctggag ctgggtcccc gtggcccaag tgcagggtcc caagagggca gggcggggct 2160 ccccaaagga gcaaagaatg cagggagggc ggtccagggc cctgggaagg ggagctcggc 2220 accctccagg tccgtgtggg actccagccg ctgttggctg ggaatcgaag ttagaggtga 2280 cttccaaagg ccccccgagc cggcagtgcc ccccaccacc cctccagcga ctctgcggtg 2340 ccagtgcctt gttggctttt ccggctacgc accctgcagt cactgagctc tcggtctgac 2400 gtctgatgtt tgtggtttgt ttataacacg gggccttacc tggggaattc agctggtttg 2460 aatatttgta gcccgctccc agaatgtctt attttgtaat gactgaacta catttagtaa 2520 tagttacaca tgtatatggt taatacatat ggaaattcaa tatattttgt agttaacgta 2580 ttctgaagta acggatgttt ctcgccaatc gtagtgactt cagctaacga aatgttcttt 2640 tgtagtacca cggtcctcgg cctaacgaag gacgtgaacc ttgtaagagg agagctctga 2700 aacgcggtca cctttgttta gtggaaggga aagtgtgttc ccggcatgag gtgcctcgga 2760 attagtaaag aattgtgggc aatggattaa ccactgtatc taagaatcca ccattaaagc 2820 atttgcacag acaaaaaaaa aaa 2843

Claims (111)

  1. 생물학적 시스템의 조절 인자 식별 방법에 있어서,
    (1) 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제1데이터 집합을 얻는 단계, 여기서 상기 모델은 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포를 포함하고, 여기서 상기 제1데이터 집합은 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포 내의 단백질체의 전역적 변화를 나타낸다;
    (2) 상기 생물학적 시스템을 위한 모델로부터 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계, 여기서 상기 제 2 데이터 집합은 상기 생물학적 시스템과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서, 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및 상기 생물학적 시스템에 연관된 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과 중 적어도 어느 하나를 포함한다;
    (3) 상기 단백질체의 전역적 변화 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 사용하여 상기 제 1 및 제 2 데이터 집합만을 기반으로 하나 이상의 인과 관계의 베이지안 네트워크에 기반한 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1 및 제2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는다;
    (4) 상기 제1인과 관계 네트워크 모델로부터 분별 인과 관계 네트워크를 생성하고 제어 세포 데이터에 기반한 제2인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계; 및
    (5) 상기 인과 관계 네트워크로부터 상기 생물학적 시스템에 고유한 분별 인과 관계를 식별하는 단계, 여기서 상기 고유한 인과 관계에 연관된 적어도 하나의 효소는 상기 생물학적 시스템의 조절 인자로서 식별되는 방법.
  2. 질병 과정의 조절 인자 식별 방법에 있어서,
    (1) 상기 질병 과정을 위한 모델로부터 제1데이터 집합을 얻는 단계, 여기서 상기 모델은 상기 질병 관련 세포를 포함하고, 여기서 상기 제1데이터 집합은 상기 질병 관련 세포 내의 단백질체의 전역적 변화를 나타낸다;
    (2) 상기 질병 과정을 위한 모델로부터 제 2 데이터 집합을 획득하는 단계, 여기서 상기 제 2 데이터 집합은 상기 질병 과정과 연관된 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내며, 여기서, 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및 상기 질병 관련 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과 중 적어도 어느 하나를 포함한다;
    (3) 상기 세포의 단백질체의 전역적 변화 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 프로그래밍된 컴퓨터 시스템을 사용하여 상기 제 1 및 제 2 데이터 집합만을 기반으로 하나 이상의 인과 관계의 베이지안 네트워크에 기반한 제1인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계, 여기서 상기 제1인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1 및 제2 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는다; 및
    (4) 상기 제1인과 관계 네트워크 모델로부터 분별 인과 관계 네트워크를 생성하고 제어 세포 데이터에 기반한 제2인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계; 및
    (5) 상기 인과 관계 네트워크로부터 상기 질병 과정에 고유한 분별 인과 관계를 식별하는 단계, 여기서, 상기 고유한 인과 관계에 연관된 적어도 하나의 효소는 상기 질병 과정의 조절 인자로서 식별되는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 데이터 집합은 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 과정과 연관된 세포를 특징 지우는 지질체 데이터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 단백질체의 전역적 변화, 지질체 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 이때 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및 적어도 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 데이터 집합은 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 과정과 연관된 세포를 특징지우는 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터를 더 포함하며,
    선택적으로, 여기서 상기 제1 데이터 집합은 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 과정과 연관된 세포를 특징지우는 둘 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈 및 SNP 데이터를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈, 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며, 여기서 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및 적어도 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 영향 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소의 전역적 활성은 전역 키나아제 활성을 포함하며;
    선택적으로 여기서 상기 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 효과는 세포의 인산 단백질체를 포함하며;
    선택적으로 여기서 상기 고유 인과 관계와 연관된 상기 적어도 하나의 키나아제는 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 과정의 조절 인자로 식별되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 2 데이터 집합은 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포외 기질 퇴화, 분출, 및 ATP, ROS, OXPHOS 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 단백질체의 전역적 변화, 상기 하나 또는 그 이상의 지질체, 대사체, 전사체, 게놈, 및 SNP 데이터, 및 상기 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응 중에서 생성되며,
    상기 세포의 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응은 효소의 전역적 활성 및 최소한 하나의 효소 대사 물질 또는 기질에 대한 상기 효소의 전역적 활성의 영향 중 적어도 어느 하나를 포함하며, 하나 또는 그 이상의 생명 에너지론, 세포 증식, 세포 자살, 기관적 기능, 세포 이주, 관 형성, 주화성, 세포 외 기질 퇴화, 분출, ATP, ROS, OXPHOS, 및 시호스(Seahorse) 분석으로부터 선택되는 기능적 모델에 의해 실현되는 유전자형-표현형 연관을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 질병 과정은 암, 당뇨, 비만, 심장병, 노화 관련 황반 변성, 당뇨성 망막증, 또는 감염성 질병; 또는
    여기서 상기 질병 과정은 신생 혈관 생성을 포함; 또는
    여기서 상기 질병 과정은 간세포 암종, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 비늘형의 세포암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 자궁 내막암, 방광암, 신장암, 고형 종양, 백혈병, 비 호지킨(non-Hodgkin) 림프종, 또는 약제 저항형 암; 또는
    여기서 상기 질병 과정의 특징적 측면은 저산소 상태 조건, 고혈당 조건, 젖산 풍부 배양 조건, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 과정의 모델은 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 관련 세포의 생체 외 배양을 포함하며, 선택적으로 제어 세포 또는 정상 세포의 합치되는 생체 외 배양을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 관련 세포의 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪으며, 합치되는 상기 제어 세포의 상기 생체 외 배양은 환경적 교란을 겪지 않은 동일한 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 환경적 교란은 생체 작용 제제와의 한 번 또는 그 이상의 접촉, 배양 조건에서의 변화, 유전학적 수정 / 변이의 도입, 및 유전학적 수정 / 변이를 야기하는 매개 수단의 도입을 포함; 또는
    여기서 상기 환경적 교란은 세포와 효소 활성 억제 인자와의 접촉을 포함, 선택적으로, 상기 환경적 교란은 상기 세포와 CoQ10과의 접촉을 더 포함; 또는
    여기서 상기 상기 효소 활성 억제 인자는 키나아제 억제 인자; 또는
    여기서 상기 환경적 교란은 상기 세포와 CoQ10과의 접촉을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (3)은,
    베이지안 파편 목록 처리를 통해 상기 제1데이터 집합 및 제2데이터 집합에 기반한 네트워크 파편의 라이브러리를 생성;
    시도 네트워크의 앙상블을 생성, 각 시도 네트워크는 상기 라이브러리 내의 상기 네트워크 파편의 다른 부분 집합으로부터 만들어진다; 및
    국지적 변환을 통해 상기 각 시도 네트워크를 진화시켜 상기 시도 네트워크의 앙상블을 최적화;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생성 단계에서 수립된 상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 제1인과 관계 네트워크 모델 내의 하나 또는 그 이상의 인과 관계의 예측에 대한 신뢰 수준을 제공하기 위해, 상기 식별 단계 이전에, 입력 데이터에 기반한 컴퓨터 모의 시뮬레이션에 의해 시뮬레이션 인과 관계 네트워크로 더 개량되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 고유한 인과 관계는 상기 생물학적 시스템 또는 상기 질병 관련 세포에 고유하게 존재하고 상기 합치된 제어 세포에 존재하지 않는 상기 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별되고; 또는
    상기 고유한 인과 관계는 환경적 교란을 겪은 세포에 고유하게 존재하고 상기 합치된 제어 세포에 존재하지 않는 상기 분별 인과 관계 네트워크의 일부로서 식별되는 것을 특징으로 하는 방법.
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  19. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제어 세포 데이터는 상기 제어 세포의 단백질체의 전역적 변화를 나타내는 제1제어 데이터 집합과 상기 제어 세포의 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응을 나타내는 제2제어 데이터 집합을 포함하며, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 제어 세포의 기능적 활성 또는 세포 반응은 전역적 효소 활성 및 상기 제어 세포 내의 효소 대사 물질 또는 기질에 미치는 영향 중 적어도 어느 하나를 포함한다; 및
    여기서 상기 단계 (3) 이후에 프로그램된 컴퓨터 장치를 이용하여 상기 제1제어 데이터 집합 및 상기 제2제어 데이터 집합에만 기반하여 상기 단백질체의 전역적 변화 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능적 활성 또는 세포 반응과 관련된 상기 제2인과 관계 네트워크 모델을 생성하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 제2인과 관계 네트워크 모델의 생성은 상기 제1 및 제2 제어 데이터 집합을 제외한 다른 어떠한 알려진 생물학적 관계에도 기반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고유한 인과 관계는 유전자의 발현 및 지질의 수준; 유전자의 발현 및 전사체의 수준; 유전자의 발현 및 대사 물질의 수준; 제 1 유전자의 발현 및 제 2 유전자의 발현; 유전자의 발현 및 SNP의 존재; 유전자의 발현 및 기능적 활성; 지질의 수준 및 전사체의 수준; 지질의 수준 및 대사 물질의 수준; 제 1 지질의 수준 및 제 2 지질의 수준; 지질의 수준 및 SNP의 존재; 지질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 전사체의 수준 및 제 2 전사체의 수준; 전사체의 수준 및 대사 물질의 수준; 전사체의 수준 및 SNP의 존재; 제 1 전사체의 수준 및 기능적 활성의 수준; 제 1 대사 물질의 수준 및 제 2 대사 물질의 수준; 대사 물질의 수준 및 SNP의 존재; 대사 물질의 수준 및 기능적 활성; 제 1 SNP의 존재 및 제 2 SNP의 존재; 및 SNP의 존재 및 기능적 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 최소한 한 쌍 사이의 관계로 식별; 또는
    여기서 상기 고유한 인과 관계는 지질의 수준, 유전자의 발현 및 하나 또는 그 이상의 기능성 활성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 사이의 관계로 식별되며, 여기서 상기 기능적 활성은 전역 키나아제 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
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  62. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 시도 네트워크의 앙상블을 진화시켜 생성된 합치 인과 관계 네트워크에 기반한 방법
  63. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 인과관계의 베이지안 앙상블에 기반한 방법.
  64. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1인과 관계 네트워크 모델은 상기 관계에 대한 정량적 확률적 방향 정보를 포함하는 인과 관계의 베이지안 네트워크를 포함하는 방법.
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