KR102098914B1 - 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물 - Google Patents
낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물이 높은 항염증 및 항산화 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명의 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물을 이용해 염증성 질환 또는 산화물질에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 염증성 질환 또는 산화물질에 의해 기인하는 질환의 개선용 건강기능식품을 개발 할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 낫토 및 캐피어(kefir) 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물에 관한 것이다.
현대적 산업의 발달과 더불어 풍요로운 경제적, 문화적 혜택을 누리고 있지만, 평균 수명의 연장과 함께 성인 질환과 고령화 사회에 따른 삶의 질에 대한 인식이 동반되고 있다.
염증 반응(inflammation)은 비염 및 기관지염, 간염, 관절염 등 다양한 질환의 원인으로 인간의 건강과 밀접한 관련을 가지고 있다. 특히 평균 수명의 연장으로 인한 인구의 노령화로 그 문제가 심각한 퇴행성질환의 경우, 그 병태 생리가 염증 ·면역 반응과 밀접한 관계가 있다는 연구보고들이 증가하고 있어 염증 반응의 기전 및 역할에 대한 관심이 급격하게 증가하고 있으며, 염증 치료를 위한 치료제 개발에도 관심이 증가하고 있다.
염증 반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응이지만 지속적이고 과도한 염증반응은 조직을 손상시키게 된다. 대식세포는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 활성화된 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE2(prostaglandin E2), NO(nitric oxide), ROS(reactive oxygen species) 등과 같은 다양한 염증 관련 인자를 분비한다(Laskin, D. L. et al., 2011). 한편, 이러한 염증 관련 인자의 과발현은 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관 질환, 암 등을 유도한다(Lawrence, T. et al., 2002).
생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화과정 중에 상당량의 유해한 활성산소(reactive oxygen species, ROS)들이 생성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거 기작에 의해 대부분 소멸 되지만 순간적으로 활성산소가 발생되어 항산화 방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다(Aruoma O.I., et al., 1998). 또한 생체 내에서 산화와 관련된 현상으로 노화의 원인을 산소에서 유래되는 활성산소의 역할이 대두되어 이들의 제거에 대한 관심이 높아지고 있다(Fridorich I., 1978).
활성산소 생성의 생체 내적 요인으로는 세포 대사 작용, 산화효소, 박테리아 작용 등을 들 수 있고, 생체 외적 요인으로는 오염된 공기, 대사율 증가, 흡연, 발암물질, 특정 항생제, 자외선, 열, 인스턴트 음식의 과량섭취 등을 들 수 있다.
활성산소의 종류로는 일반적으로 리피드 라디칼(lipid radical), 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical) 및 히드록시 라디칼(hydroxy radical, ·OH)과 같은 라디칼 뿐만 아니라 비라디칼인 과산화수소(hydrogen peroxidase, H2O2), 리피드 퍼옥시드(lipid peroxide), 차아염소산(hypochlorous acid), N-클로라민(N-chloramine) 성분들을 포함한다. 이들 활성산소들은 단백질, 불포화 지방산 등과 결합하여 과산화 지질을 생성하고, DNA, RNA 등에 손상을 일으키며, 생체막의 손상, 면역능력의 약화와 함께 고혈압, 동맥경화, 심부전, 류미티스 관절염, 알레르기, 암과 같은 각종 질병과 노화를 유발시키게 된다(Chung H.Y., 1992; Yagi K., 1987; Lopaczyski W., et al., 2001; Yu B.P., 1994; Cooke M.S., et al., 1997). 또한 활성산소는 산화스트레스의 주요 요인으로 노화와 깊게 관련되어 있으며 이는 노화 관련 퇴행성질환 뿐만 아니라 만성염증 질환의 주요 원인이기도 하다. 여러 동물에서 활성산소의 비율은 개체 수명과 상관관계가 있으며 활성산소의 양은 개체의 노화 진행 상태를 결정짓는 요인이 된다(Yu B.P., 1994).
세포 내 항산화 효과에 의한 항상성 유지는 세포의 기능을 회복할 수 있으며, 이는 노화의 진행을 예방 또는 지연시킬 뿐만 아니라 만성염증제어 및 면역력을 향상시켜 건강한 삶의 질을 높일 수 있다. 노화 과정에서 항산화 물질은 결함이 나타난 미토콘드리아의 활성을 도모할 수 있고 항상성을 유지시켜 궁극적으로 세포의 생존력을 높이는 것으로 알려져 있다(Lee Y.H., et al., 2015; Yang T.K., et al., 2013).
낫토(Natto)는 삶은 콩을 발효시켜 만든 일본의 전통음식으로 한국의 청국장과 비슷한 발효식품이다. 냄새가 독특하고 집으면 실타래처럼 끈적끈적하게 늘어난다. 혈전용해, 혈압강하작용, 항암작용 등이 인정되어 새로운 영양음식으로 부각되고 있다.
낫토의 기능성에 관해서는 낫토균 자체를 비롯하여 폴리글루타민산, 발효에 의해 강화되는 각종 비타민류가 미용에서 항암, 노화방지까지 매우 광범위한 효과가 있다고 알려져 있지만, 과학적 뒷받침이 충분하지는 않다. 낫토의 발효과정에서 생기는 유익한 성분은 바실러스균이 대표적이다. 바실러스균은 장 건강을 좋게 해 변비와 설사에 도움을 주고 바실러스 균이 분비하는 효소인 나토키나아제(nattokinase)는 혈관을 막는 노폐물인 혈전이 생기는 것을 막고 혈전을 용해시키는 능력이 있어 심혈관질환에 도움이 된다. 또한, 낫토는 면역력을 높이는데 효과적이고 뼈를 건강하게 하는 비타민 K, 칼슘, 무기질 등이 풍부해 골다공증 예방에 좋다.
캐피어(Kefir, 케피어)는 약한 신맛과 크림 같은 점조성을 가지는 산성의 유산-알코올 발효유로 발칸, 동유럽, 코카서스 산맥(caucasus) 지역에서 유래되었다(Son J.Y., et al., 2016). 캐피어는 캐피어 그레인(kefir grain)을 접종 발효하기 때문에 유산균에 의한 발효유보다도 캐피어 그레인 중의 효모와 초산균에 의해 비타민 B군을 다량 생산하며, 우유 성분 이외에 소화 촉진 작용과 항암 작용도 있다고 보고되었다. 또한, 캐피어는 혈당치의 저하를 비롯하여 면역 증강 작용, 항종양 작용, 항알러지 작용의 효능이 인정되어 러시아에서는 환자식으로도 이용되고 있다(Lee J.I., et al., 2011).
이에 본 발명자는, 낫토와 캐피어 발효물을 이용한 항염증 또는 항산화 활성을 연구하는 과정에서, 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물이 항염증 또는 항산화 활성이 현저히 증가되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한편, 한국등록특허 제0685285호에는 캐피어 분말 또는 그 추출물의 항알러지, 항염증 및 항천식 효과가 기재되어 있고, 일본등록특허 제5222747호에는 캐피어를 이용한 항산화제가 기재되어 있으나, 양 발명 모두 본 발명의 낫토와의 혼합물은 기재되어 있지 않아 그 구성에 있어서 본 발명과 차이가 있다. 또한, 한국공개특허 제2014-0141181호에는 청국장 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 개선용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 캐피어 발효물과의 혼합물이 기재되어 있지 않으며, 한국등록특허 제0742185호에는 펩타이드 함유 청국장 추출물의 항산화 활성이 기재되어 있어, 본 발명의 구성과 유사하나, 본 발명의 캐피어 발효물은 전혀 기재되어 있지 않다.
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본 발명의 목적은 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 낫토(natto) 및 캐피어(kefir) 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 낫토 및 캐피어 발효물이 1:1~2.3 중량비율로 혼합되어 있을 수 있다.
상기 낫토는 서리태로부터 제조할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 염증에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.
상기 염증에 의한 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 전신성 홍반성 낭창, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 활성 산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.
상기 활성 산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환은 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작, 아토피성 피부염, 기관지염, 간질, 만성폐쇄성 질환, 당뇨병성 혈관합병증 및 심근경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 일 수 있다.
상기 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조첨가제를 포함하는 건강기능식품 일 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 낫토는 삶은 콩을 발효시켜 만든 발효 식품을 의미하며, 본 발명의 낫토는 서리태를 이용하여 제조한다.
상기 서리태는 껍질은 검은색이고 속은 파란색이 검은 콩으로, 안토시아닌 색소가 많아서 검은콩의 대명사로 꼽힌다. 상기 서리태는 단백질과 식물성 지방질이 풍부하고, 신체의 각종 대사에 필요한 비타민 B가 풍부하다.
상기 낫토는 낫토로부터 분리된 바실러스 서브틸리스 NRU0927(Bacillus subtilis NRU0927, 수탁번호 KACC 92143P)를 이용하여 발효시킬 수 있다.
상기 낫토는 발효를 통해 콩 단백질이 분해되어 다양한 생리활성 기능을 나타내는 낮은 분자량의 단백질(펩타이드 또는 아미노산)을 다량으로 함유할 수 있다.
상기 캐피어 발효물은 탈지유에 균을 접종하여 제조할 수 있다. 여기서 탈지유는 지방성분이 제거된 우유이며, 균은 캐피어로부터 분리된 균을 이용할 수 있다. 바람직하게는 류코노스톡 메센로이데스 KNRU0927(Leuconostoc mesentroides KNRU0927, 수탁번호 KACC 92142P), 락토바실러스 플란타럼 CRNB-22(Lactobacillus plantarum CRNB-22, 수탁번호 KCTC 11931BP) 및 사카로미세스 세레비시에 MNRU0927(Saccharomyces cerevisiae MNRU0927, 수탁번호 KACC 93265P)일 수 있다.
상기 캐피어 발효물은 균에 의한 발효에 의해 우유 단백질이 분해되어 다양한 생리활성 기능을 나타내는 낮은 분자량의 단백질(펩타이드 또는 아미노산)을 다량으로 함유할 수 있다.
상기 조성물은 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물일 수 있다.
상기 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물은 낫토 분말 및 캐피어 발효물의 분말을 혼합하고, 증류수로 희석한 후 원심 분리하여 얻은 상등액 일 수 있다.
상기 혼합물은 낫토 분말 및 캐피어 발효물의 분말이 1:1~2.3중량비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:1 이다.
상기 증류수는 낫토 분말 및 캐피어 발효물의 분말 혼합물의 중량 대비 15~25배를 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 20배이다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
상기 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조첨가제를 포함하는 건강기능식품 일 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물에 관한 것으로, 낫토 및 캐피어 발효물이 혼합된 혼합물이 높은 항염증 및 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통해, 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물을 이용하여 염증성 질환 또는 산화물질에 의해 기인하는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 염증성 질환 또는 산화물질에 의해 기인하는 질환의 개선용 건강기능식품을 개발 할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 낫토 단백질을 확인한 결과이다.
도 2는 낫토(2C)의 유기산 생성을 확인한 결과로, 대조군으로 생콩(2A) 및 삶은 콩(2B)의 유기산을 분석하였다.
도 3은 낫토(2C)의 당 및 당 알코올 생성을 확인한 결과로, 대조군으로 생콩(2A) 및 삶은 콩(2B)의 당 및 당 알코올을 분석하였다.
도 4는 캐피어 발효를 통한 우유 단백질의 분해를 확인한 결과로, 우유 단백질을 카세인(4A)과 유청 단백질(4B)로 나누어 단백질의 분해 정도를 확인하였다.
도 5는 캐피어 발효물의 발효 시간에 따른 유기산 생성을 확인한 결과이다.
도 6은 캐피어 발효물의 당 분해 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물을 포함하는 조성물의 항산화 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 낫토(2C)의 유기산 생성을 확인한 결과로, 대조군으로 생콩(2A) 및 삶은 콩(2B)의 유기산을 분석하였다.
도 3은 낫토(2C)의 당 및 당 알코올 생성을 확인한 결과로, 대조군으로 생콩(2A) 및 삶은 콩(2B)의 당 및 당 알코올을 분석하였다.
도 4는 캐피어 발효를 통한 우유 단백질의 분해를 확인한 결과로, 우유 단백질을 카세인(4A)과 유청 단백질(4B)로 나누어 단백질의 분해 정도를 확인하였다.
도 5는 캐피어 발효물의 발효 시간에 따른 유기산 생성을 확인한 결과이다.
도 6은 캐피어 발효물의 당 분해 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합물을 포함하는 조성물의 항산화 활성을 확인한 결과이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1 내지 실시예 3. 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물의 제조>
1. 낫토 제조
1-1. 낫토 제조
서리태 콩을 삶은 후 낫토로부터 분리한 1.4×106 cfu/ml 바실러스 서브틸리스 NRU0927(Bacillus subtilis NRU0927, 수탁번호 KACC 92143P)를 접종하였다. 이때, 콩 중량 대비 5%의 균을 접종하고, 45℃에서 24시간 동안 배양하여 낫토를 제조하였다. 제조한 낫토를 동결 건조하여 믹서기를 이용하여 분말로 제조하였다.
1-2. 낫토의 생균수 측정
상기 1-1에서 제조한 낫토 분말을 TSB(trypticase soy agar)에 넣은 후 45℃에서 24시간 동안 배양한 후 배지에 생성된 콜로니(colony) 수를 세어, 생균수를 확인하였다.
생균수를 측정한 결과, 배양 시작시에 1.4×106cfu/㎖이었던 생균수가, 배양 후에는 3.86×107cfu/㎖로, 약 28배 정도가 증가하였다.
1-3. 낫토 단백질 확인
상기 1-1에서 제조한 낫토의 발효과정 중 단백질의 변화를 확인하기 위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다.
상기 1-1의 낫토 분말을 증류수에 10배 희석하고 4℃에서 7,500 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 상등액을 회수하고, 상등액을 분자량 5,000Da 투석막(dialysis membrane)에 넣고 증류수로 투석 후 동결 건조하였다. 동결 건조한 시료를 1㎎/㎖이 되도록 녹인 후, 이중 10㎕를 취하여 전기영동 시료로 사용하였고, 전기영동한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 알 수 있듯이, 대조군인 생콩 및 삶은 콩의 단백질들에 비해 낫토의 단백질들은 분자량이 작은 것들이 많이 나타났다. 이를 통해, 발효를 통해 콩 단백질이 작은 분자량의 단백질인 펩타이드(peptide) 또는 아미노산으로 분해된 것을 알 수 있었다.
1-4. 낫토의 유기산 생성 확인
상기 1-1에서 제조한 낫토의 유기산 생성정도를 확인하기 위해, 낫토 분말을 증류수에 10배 희석하고 4℃에서 7,500rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수하고, 회수한 상등액을 0.2㎛의 필터로 여과하였다. 여과액에 12% TCA(trichloroacetic acid)를 첨가하고 4℃에서 7,500rpm으로 20분간 원심 분리 한 후, 상등액을 0.2㎛의 필터로 여과하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(컬럼종류: Supelcogel C610H, 컬럼크기: 38㎝×7.8㎜, 유속: 0.5㎖/min, UV detection: 210㎚)를 수행하였다. 이때, 이동상인 0.1% 인산(phosphoric acid) 등용매를 30분간 흘려주어 유기산을 분석하였고, 20㎕의 낫토 샘플을 주입하였다. 분석 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 알 수 있듯이, 생콩(2A) 또는 삶은 콩(2B)에 비해, 낫토(2C)에서 옥살산, 포름산 및 벤조산의 양이 증가된 반면에, 아세트산의 경우에는 감소되는 것을 확인하였다.
1-5. 낫토의 당 및 당 알코올 생성 확인
상기 1-1에서 제조한 낫토의 당 및 당 알코올 생성정도를 확인하기 위해 낫토 분말을 증류수에 10배 희석하고 4℃에서 7,500rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수하고, 회수한 상등액을 0.2㎛의 필터로 여과한 후 0.1% 인산(phosphoric acid) 등용매를 이동상으로 하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(컬럼종류: Supelcogel C610H, 컬럼크기: 38 ㎝×7.8㎜, 유속: 0.5㎖/min, UV detection: 210㎚)를 수행하여 당 및 당 알코올을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 컬럼에 주입한 샘플은 20㎕를 이용하였다.
도 3에서 알 수 있듯이, 생콩(3A) 또는 삶은 콩(3B)에 비해, 낫토(3C)에서 말토오스는 증가한 반면, 프룩토오스 및 리보오스의 양이 감소된 것을 확인하였다. 또한, 글리세롤의 경우 생콩(3A) 및 삶은 콩(3B)에서는 검출되지 않았고, 낫토(3C)에서만 검출되었다. 이를 통해, 낫토 제조과정에서 발효에 의해 글리세롤이 생성된다는 것을 알 수 있었다.
2. 캐피어 발효물의 제조
2-1. 캐피어 발효물의 제조
캐피어 발효물을 제조하기 위해 캐피어로부터 분리한 류코노스톡 메센트로이데스 KNRU0927(Leuconostoc mesentroides KNRU0927, 수탁번호 KACC 92142P), 락토바실러스 플란타럼 CRNB-22(Lactobacillus plantarum CRNB-22, 수탁번호 KCTC 11931BP) 및 사카로미세스 세레비시에 MNRU0927(Saccharomyces cerevisiae MNRU0927, 수탁번호 KACC 93265P)를 이용하였고, 이때, 상기 3종류의 미생물을 스타터용 배지인 10% 탈지유에 배양하여 미생물을 확보하였다.
캐피어 발효물을 제조하기 위해 10% 탈지유(skim milk) 200㎖에 탈지유 부피의 3%에 해당되는 6㎖의 배양한 미생물을 접종한 후 26℃에서 48시간 동안 배양하여 캐피어 발효액을 확보하였다. 확보한 발효액을 동결건조하여 캐피어 발효물을 제조하였다.
2-2. 캐피어 발효에 따른 우유 단백질 분해 확인
캐피어 발효에 의한 우유 단백질 분해를 확인하기 위해 상기 2-1. 캐피어 발효물의 제조와 동일한 방법으로 캐피어 발효를 진행하였다. 배양 과정에서 0, 4, 8, 16, 24 및 48시간에 배양액을 일부 채취하여 pH 4.6 등전점으로 조절하고 4℃에서 7,500rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 상등액(유청단백질, whey protein)과 침전물(카세인, casein)을 얻었다. 얻은 상등액(유청단백질)과 침전물(카세인)을 분자량 5,000Da의 투석막에 넣고 증류수를 이용하여 투석시킨 후 동결 건조하여 캐피어 발효물 샘플을 확보하였다.
확보한 캐피어 발효물 샘플을 이용하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 통해 알 수 있듯이, 캐피어 발효된 카세인(4A) 및 유청단백질(4B)은 배양 시간이 경과함에 따라 단백질 대부분이 펩타이드 또는 아미노산과 같은 작은 분자량의 단백질로 분해되는 것을 확인하였다.
2-3. 캐피어 발효물의 유기산 생성 확인
상기 2-1. 캐피어 발효물 제조 과정 중 48시간 동안 배양하여 발효시키는 과정에서 0, 4, 8, 16, 24 및 48시간에 배양액을 일부 채취하여 캐피어 발효물 샘플을 확보하였다. 확보한 캐피어 발효물 샘플에 12% TCA(trichloroacetic acid)를 첨가하고 4℃에서 7,500rpm으로 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 0.2㎛의 필터로 여과하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(컬럼종류: Supelcogel C610H, 컬럼크기: 38㎝×7.8㎜, 유속: 0.5㎖/min, UV detection: 210㎚)를 수행하였다. 이때, 이동상인 0.1% 인산(phosphoric acid) 등용매를 30분간 흘려주어 유기산을 분석하였고, 20㎕의 캐피어 발효물 샘플을 주입하였다. 분석 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에서 알 수 있듯이, 발효 시간이 경과함에 따라 젖산 및 아세트산이 조금씩 증가하였고, 발효 48시간에는 젖산이 급격히 증가되었다. 이는 발효가 진행됨에 따라 유산균이 우유의 유당을 이용하여 발효대사산물로 젖산을 생산하기 때문이다. 생산된 젖산은 장내의 pH를 저하시켜 유해미생물의 성장을 억제하고 장의 연동운동을 촉진하여 변비 개선 효과 등 다양한 기능을 할 것으로 사료된다.
2-4. 캐피어 발효물의 당 분해 확인
상기 2-1. 캐피어 발효물 제조 과정 중 48시간 동안 배양하여 발효시키는 과정에서 0 및 48시간에 배양액을 일부 채취하여 캐피어 발효물 샘플을 확보하였다. 확보한 캐피어 발효액 샘플을 4℃에서 7,500rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등액을 회수하고, 회수한 상등액을 0.2㎛의 필터로 여과한 후 0.1% 인산(phosphoric acid) 등용매를 이동상으로 하여 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)(컬럼종류: Supelcogel C610H, 컬럼크기: 38 ㎝×7.8㎜, 유속: 0.5㎖/min, UV detection: 210㎚)를 수행하여 당을 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 컬럼에 주입한 샘플은 20㎕를 이용하였다.
도 6에서 알 수 있듯이, 발효 0시간에는 락토스가 대부분이었으나, 발효 48시간에는 락토스의 양이 감소하고, 글루코스 및 갈락토스가 증가한 것을 확인하였다. 이는, 락토스가 미생물이 분비하는 락토스 분해 효소(lactase)에 의해 분해되어 글루코스와 갈락토스가 생성되기 때문이다. 또한 글루코스의 경우 유산균에 의해 이용되어져 갈락토스에 비해 그 양이 적게 나타났다.
3. 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물의 제조
상기 1-1의 낫토 분말과 2-1의 캐피어 발효물을 총 중량이 20g이 되도록 하기 표 1의 중량에 따라 혼합하고, 이 혼합물에 증류수를 넣어 현탁하였다. 이때, 증류수는 혼합물 중량의 20배 정도를 이용하였다. 혼합물을 현탁한 현탁액을 4℃에서 8,000rpm으로 15분간 원심 분리하여 상등액을 채취하여 실시예 1 내지 실시예 3의 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물을 제조하였다.
| 구분 | 혼합 중량(g) | 혼합 비율 | ||
| 낫토 | 캐피어 발효물 | 낫토 | 캐피어 발효물 | |
| 실시예 1 | 6 | 14 | 3 | 7 |
| 실시예 2 | 8 | 12 | 4 | 6 |
| 실시예 3 | 10 | 10 | 5 | 5 |
<
비교예
1 내지
비교예
6. 비교 대상의 조성물의
제조>
비교 대상의 조성물을 제조하기 위해 상기 1-1의 낫토, 2-1의 캐피어 발효물, 서리태 생콩 분말, 탈지유를 이용하였고, 하기 표 2에 따라 비교 대상의 조성물을 제조하였다. 제조 방법은 상기 3. 낫토 및 캐피어 발효물의 조성물의 제조와 동일하게 수행하였다.
| 구분 | 혼합 중량(g) | 혼합비율 | ||||||
| 생콩 | 탈지유 | 낫토 | 캐피어 발효물 |
생콩 | 탈지유 | 낫토 | 캐피어 발효물 |
|
| 비교예 1 | 20 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 비교예 2 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| 비교예 3 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 비교예 4 | 0 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| 비교예 5 | 0 | 0 | 12 | 8 | 0 | 0 | 6 | 4 |
| 비교예 6 | 0 | 0 | 14 | 6 | 0 | 0 | 7 | 3 |
<
실시예
4. 산화 억제 활성 확인>
상기 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1 내지 비교예 6의 산화 억제 활성을 확인하기 위해 ABTS(2, 2'-azinodi[3-ethlbenzthiazolne-6-sulfonic acid］) 어세이를 수행하였다.
상기 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1 내지 비교예 6를 ABTS 용액과 1:1 비율로 희석하여 바로 734㎚에서 흡광도를 측정하여 대조(control) 값을, 희석 후 실온에서 10분간 방치한 후 흡광도를 측정한 것을 실험값으로 확보하였다. 확보한 대조값과 실험값을 이용하여 하기식에 적용하여 산화억제율을 계산하였고, 그 결과를 표 3 및 도 7에 나타내었다.
산화억제율 = ((대조값-실험값)/대조값)×100
| 구분 | 산화억제율(%) |
| 실시예 1 | 59.0 |
| 실시예 2 | 69.3 |
| 실시예 3 | 82.7 |
| 비교예 1 | 8.5 |
| 비교예 2 | 5.1 |
| 비교예 3 | 23.8 |
| 비교예 4 | 36.3 |
| 비교예 5 | 30.9 |
| 비교예 6 | 30.55 |
상기 표 3 및 도 7을 통해 알 수 있듯이, 발효 전의 생콩 또는 탈지유에 비해 발효 된 낫토 또는 캐피어 발효물이 항산화 활성이 증가되었다. 이를 통해, 발효 과정에서 항산화 활성과 관련된 유효물질들이 생성 또는 증가됨을 알 수 있었다.
또한, 실시예 1 내지 실시예 3이 비교예 3 내지 비교예 6에 비해 항산화 활성이 현저히 높은 것을 확인하였다. 특히나, 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물이라고 하더라도 낫토 및 캐피어 발효물이 6:4 및 7:3으로 혼합된 비교예 5 및 비교예 6이 낫토 및 캐피어 발효물이 3:7, 4:6 및 5:5로 혼합된 실시예 1 내지 실시예 3에 비해 항산화 활성이 낮은 것을 알 수 있다. 이를 통해, 낫토 및 캐피어 발효물을 포함하는 조성물의 항산화 활성은 낫토 및 캐피어 발효물의 혼합비율에 의해 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물을 조리용 양념에 1중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물을 밀가루에 0.1중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물을 육즙에 0.1중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물을 우유에 0.1중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 낫토 및 캐피어 추출물을 포함하는 조성물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.
Claims (9)
- 낫토(natto) 및 유청단백질과 카세인으로 이루어진 캐피어(kefir) 발효물을 포함하는 항산화 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품에 있어서, 상기 조성물은 낫토 및 캐피어 발효물이 1:1~2.3 중량비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 낫토는 서리태로부터 제조된 것을 특징으로 하는 건강기능식품., - 삭제
- 삭제
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