KR102085570B1

KR102085570B1 - 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102085570B1
Application number: KR1020170103191A
Authority: KR
Inventors: 김동선; 이윤미; 손은정
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2020-03-06
Also published as: KR20190018337A; WO2019035597A1

Abstract

본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 유효성분인 아파민은 통풍성 관절염이 유도된 동물모델에서 염증성 사이토카인의 발현을 낮추고, 통풍성 관절염으로 인해 부은 발의 두께가 줄어들며, 낮아진 체중 부하율(%)을 높여주는 효과가 있는 것이다.

Description

아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating gouty arthritis comprising apamin as effective component}

본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

통풍은 음식을 통해 섭취되는 퓨린(purine)이라는 물질을 인체가 대사하고 남은 산물인 요산의 혈액 내 농도가 높아져 생성된 요산염(Monosodium ureate) 결정이 관절의 연골, 힘줄, 주위 조직에 침착되는 질병이다. 이와 같은 통풍 관절염의 유병률 증가의 원인으로는 식생활의 서구화, 비만의 증가, 인구의 고령화, 신장질환과 고혈압 유병률의 증가, 티아지드(Thiazide) 등의 이뇨제와 저용량 아스피린 사용의 증가 등을 들 수 있다.

또한, 통풍은 성인 남성에게서 매우 흔한 염증성 관절염이다. 서구에서 약 1~2%의 유병률을 보이며, 서양인에 비해 동양인에서는 질병 빈도가 낮은 것으로 알려져 왔으나, 최근 서구화된 식생활이나 생활 습관에 의해 서구와 아시아권 모두 유병률이 증가하는 것으로 보고되고 있다. 국내에서도 성인의 9.3%(남자의 14.3%, 여자의 2.2%)가 고요산혈증을 가지는 것으로 파악되고 있다. 통풍은 비만인 남자에서 호발하는 성인병의 일종으로 혈중 내에 증가한 요산이 관절이나 주위조직에 요산염 결정 형태로 침착되어 염증반응을 유발하여 통증, 부종, 심하면 관절의 변형을 일으킨다. 병의 경과는 혈중 내에 요산농도가 증가하나 증상이 없는 시기부터 급성으로 간헐성의 관절염이 발생하다 관절의 변형을 동반하는 만성 통풍성 관절염으로 진행된다.

통풍은 그 치료법이 명확하고 성공적으로 치료될 수 있는 질병으로 알려져 있으나 고혈압, 만성 신부전 등 다른 질병과 동반되는 경우가 흔하여 약제 부작용을 세심하게 고려해야 하는 경우가 많고 비 약물적 치료로서 생활습관을 변화시키는 환자의 노력이 장기 치료에 예후를 좋게 하는데 필수적이다. 통풍과 고 요산 혈증은 고혈압, 고지혈증, 혈당증가, 복부 비만 등의 임상양상을 보이며 동맥경화성 심질환과 제2형 당뇨병 등의 성인병의 위험도 증가를 가져오는 복합적인 병증인 대사증후군의 진단기준에는 들어가지 않으나 대사증후군은 밀접한 관계를 가지는 것으로 생각된다. 국내에서는 통풍 환자의 44%에서 대사증후군이 동반된 것으로 보고되었다. 통풍은 대개 급성 단관절염 형태로 나타나나 소수관절 또는 드물게 다관절을 침범하기도 한다. 급성 통풍의 치료에 쓰이고 있는 비스테로이드성 항염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)는 염증반응을 억제하는 것으로 잘 알려져 있으며, 백혈구의 활성 및 이동을 억제하여 항염증작용을 나타내는 콜키친(colchicine), 스테로이드는 모두 통풍발작을 효과적으로 치료할 수 있는 약제이며, 선택적 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase; COX-2) 억제제 역시 기존의 비스테로이드성 항염제와 같은 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 아파민은 봉독의 신경독 성분으로, 두 개의 사슬 간에 이황화 결합을 가진 헤테로데틱 고리형의 분지된 18개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.

아파민에 관한 선행기술로는 한국공개특허 제2012-0074352호에 아파민을 유효성분으로 포함하는 동맥경화 예방 및 치료용 약학 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0137314호에 봉독, 멜리틴 또는 아파민 성분을 포함하는 신장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1472574호에 아파민을 유효성분으로 함유하는 급성 췌장염의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용에 대해서는 언급된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고, 본 발명의 유효성분인 아파민이 통풍성 관절염이 유도된 동물모델에의 조직에서 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시고, 통풍성 관절염이 유발된 발의 두께가 줄어들며, 낮아진 체중 부하율(%)도 정상 수준으로 증가시킨 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아파민을 유효성분으로 함유하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아파민을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 약침을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아파민을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 주사제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아파민을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 패취제를 제공한다.

본 발명은 아파민을 유효성분으로 포함하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 통풍성 관절염이 유도된 동물모델에서 IL-1β의 감소, 발의 두께 감소 및 체중 부하율(%)의 증가 효과를 나타내므로, 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 봉독(A)과 본 발명의 아파민(B)을 각각 농도별(100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5㎍/㎖)로 처리한 후, LPS 처리군에 대비한 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 2는 통풍성 관절염에 의해 증가된 발의 두께가 본 발명에 따른 아파민 또는 봉독의 투여에 의해 감소한 정도를 확인한 결과이다. Con은 정상군이며, MSU는 통풍성 관절염 유도군이고, CBV는 통풍성 관절염의 유도 및 봉독을 투여한 군이며, APM은 통풍성 관절염의 유도 및 아파민을 투여한 군이고, COL은 양성대조군으로, 통풍성 관절염의 유도 및 콜히친을 투여한 군이다. ###은 정상군에 비해 MSU 유도군이 통계적으로 유의미하게 발의 두께가 증가하였다는 것으로, p<0.001임을 의미하며, **는 MSU 유도군 대비 MSU 유도 및 봉독을 투여한 군, MSU 유도 및 아파민(APM)을 투여한 군 또는 MSU 유도 및 콜히친(COL)을 투여한 군의 발 두께가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01을 의미한다.
도 3은 통풍성 관절염에 의해 낮아진 체중 부하율(%)이 본 발명에 따른 아파민 또는 봉독의 투여에 의해 증가한 정도를 확인한 결과이다. Con은 정상군이며, MSU는 통풍성 관절염 유도군이고, CBV는 통풍성 관절염 유도 및 봉독을 투여한 군이며, APM은 통풍성 관절염의 유도 및 아파민을 투여한 군이고, COL은 양성대조군으로, 통풍성 관절염의 유도 및 콜히친을 투여한 군이다. ###은 정상군에 비해 MSU 유도군이 통계적으로 유의미하게 체중 부하율(%)이 감소하였다는 것으로, p<0.001임을 의미하며, ****는 MSU 유도군 대비 MSU 유도 및 아파민(APM)을 투여한 군의 체중 부하율(%)이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01을 의미한다.
도 4는 통풍성 관절염에 의해 증가된 IL-1β의 발현량이 본 발명에 따른 아파민 또는 봉독의 투여에 의해 감소한 정도를 확인한 결과이다. Con은 정상군이며, MSU는 통풍성 관절염 유도군이고, CBV는 통풍성 관절염의 유도 및 봉독을 투여한 군이며, APM은 통풍성 관절염의 유도 및 아파민을 투여한 군이고, COL은 양성대조군으로, 통풍성 관절염의 유도 및 콜히친을 투여한 군이다. ####은 정상군에 비해 MSU 유도군이 통계적으로 유의미하게 IL-1β의 발현량이 증가하였다는 것으로, p<0.00001임을 의미하며, *, **는 MSU 유도군 대비 MSU 유도 및 봉독을 투여한 군, MSU 유도 및 아파민(APM)을 투여한 군 또는 MSU 유도 및 콜히친(COL)을 투여한 군의 IL-1β의 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05이고 **는 p<0.01을 의미한다.

본 발명은 아파민을 유효성분으로 함유하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 아파민은 봉독으로부터 유래한 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 상기 아파민은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것이지만, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입을 갖고, 통풍성 관절염을 예방 또는 치료할 수 있는 펩티드라면 제한하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 아파민(apamin) 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크 및 마그네슘 스테아레이트 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구의 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 약침에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 주사제에 관한 것이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

1. 시료의 준비

본 발명의 실시예에서 사용된 아파민(A1289)은 시그마알드리치코리아로부터, 및 봉독은 청진바이오텍(Chungjin Biotec)으로부터 구입하여 정제 없이 사용하였다.

실시예 1. 세포독성 확인

생쥐 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 1×10⁵로 분주한 후, 봉독과 아파민을 각각 농도별(100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5㎍/㎖)로 처리하였다.

2시간 후에 LPS(1㎍/㎖)를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 MTT 용액을 첨가하여 4시간 반응시킨 후, ELISA 리더를 이용하여 540nm의 흡광도를 측정하였고, 이후 LPS 처리군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였다.

그 결과 도 1에 개시한 바와 같이, 봉독의 경우 5㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포 독성이 나타났으나, 아파민을 처리한 경우는 100㎍/㎖의 고농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다.

실시예 2. MSU (Monosodium ureate )로 유도한 통풍성 관절염 동물모델에서 발 두께 및 뒷다리 체중부하 감소 효능 확인

(1) 발 두께 감소 확인

본 실시예 1에서는 MSU(Monosodium ureate)로 유도한 통풍성 관절염 동물모델에서의 발 두께 및 뒷다리 체중부하 감소 효능을 확인하였다. 상기 아파민(APM) 및 봉독(CBV)을 각각 1mg/kg 농도로 7주령 C57BL6 마우스에 경구 투여하였다. 상기 아파민(APM) 및 봉독(CBV)을 투여하고 1시간 후에 4mg의 MSU를 2.5% 트윈(tween) 80이 포함된 PBS 50㎕에 현탁하여 오른쪽 발조직(paw tissue)에 주사하여 통풍성 관절염을 유도하였다. 양성 대조군인 콜히친(cholchicine)을 사용하였다. 1일 1회 4일 동안 약물 투여한 후 MSU 유도 5일째에 발 두께 및 뒷다리 체중부하를 측정하였다.

그 결과 도 2에 개시한 바와 같이, MSU 유도 동물모델에서는 발의 두께가 현저하게 증가하였으나, 본 발명의 아파민 또는 봉독을 투여한 군에서는 MSU 유도 동물모델에 비해 발의 두께가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

(2) 뒷다리 체중부하 감소 확인

한편, 뒷다리 체중부하는 체중 부하율 측정기(dynamic weight bearing(DWB) device (Bioseb, Boulogne, France)를 사용하여 측정하였다. 측정기 안에서 마우스가 자유롭게 움직이는 동안 측정기 상단에 부착된 카메라를 이용해 촬영한 후, 소프트웨어를 이용해 마우스의 앞, 뒷발을 인식하여 각 발의 체중의 부하율이 측정된 값을 분석하였다. 통풍성 관절염이 유발된 마우스는 통증으로 인해 MSU를 투여하지 않은 정상적인 발에 의지하여 움직이게 되므로, 양쪽 발의 무게가 균형을 잃어 정상적인 발의 무게 대비 MSU를 투여한 발의 무게가 상대적으로 가볍게 측정되었다. 상기 측정된 발의 무게(g)를 이용하여, 체중 부하율(%)을 계산하였다. 상기 체중부하는 발로 지탱하여 누르는 힘으로, 정상적인 경우 양쪽 발의 무게가 균형을 이루어 한쪽 발의 체중 부하율(%)은 50%로 나타나지만, MSU를 주사한 발은 통증이 심해질수록 체중 부하율(%)이 낮아진다.

체중 부하율(%) = [통풍이 유발된 뒷다리의 무게/(양발 뒷다리의 무게 합)]×100

그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 MSU 유도에 의해 체중 부하율이 약 15% 정도 감소한 35% 수준으로 나타나 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것을 확인하였고, 이에 대비하여 아파민을 투여한 군에서는 정상 수준의 체중 부하율을 확인할 수 있었다.

실시예 3. MSU (Monosodium ureate )로 유도한 통풍성 관절염 동물모델에서 아파민의 효능 평가

MSU(Monosodium ureate)로 유도한 통풍성 관절염 질환 동물모델에서 본 발명의 유효성분인 아파민과 봉독의 투여에 따른 염증 사이토카인 IL-1β의 감소 효과를 확인하였다.

상기 아파민(APM) 및 봉독(CBV)을 각각 1mg/kg 농도로 7주령 C57BL6 마우스에 복강 투여하였다. 상기 아파민(APM) 및 봉독(CBV)을 투여하고 1시간 후에 4mg의 MSU를 2.5% 트윈(tween) 80이 포함된 PBS 50㎕에 현탁하여 오른쪽 발조직(paw tissue)에 주사하여 통풍성 관절염을 유도하였다. 1일 1회 4일 동안 약물 투여한 후 MSU 유도 5일째에 부검하였다.

이후, 상기 부검에서 채취한 발 조직(paw tissue)을 RIPA 완충용액에 담그고 조직을 파쇄하여 상층액에서 염증성 지표인 IL-1β 단백질의 발현량을 ELISA법으로 측정하였고, 양성 대조군인 콜히친(cholchicine)을 사용하였다.

그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 통풍성 관절염으로 인해 증가된 IL-1β를 아파민 또는 봉독의 투여에 의해 IL-1β가 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 아파민의 투여에 의해 IL-1β가 감소한 정도가 봉독에 의해 감소한 것과 비교하여도 통계적으로 유의미한 차이를 보여, 아파민이 봉독 대비 현저한 효과가 있다는 것을 확인하였다.

<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for preventing or treating gouty arthritis comprising apamin as effective component <130> PN17225 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> from Bee venom <400> 1 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His

Claims

아파민을 유효성분으로 함유하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아파민은 봉독으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 아파민은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 통풍성 관절염의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 약침.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 주사제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 통풍성 관절염의 치료용 패취제.