KR102014469B1 - 과배란 유도 조성물 - Google Patents

Abstract

불임 치료에 사용하기 위한, FSH, 예컨대, 재조합 FSH를 포함하는 조제물.

Description

과배란 유도 조성물 {COMPOSITION FOR CONTROLLED OVARIAN STIMULATION}

본 발명은 불임 치료용 조성물 및 약학 제품에 관한 것이다.

시험관내 수정 (IVF)과 같은 보조 생식술(Assisted reproduction technology)(ART) 기법들이 잘 알려져 있다. 이들 ART 기법들은, 일반적으로, 난포 코호트 (cohort)를 완전히 성숙되도록 자극하는 과배란 유도 (COS: controlled ovarian stimulation) 단계가 요구된다. 표준 COS 요법은, LH의 조기 상승을 방지하기 위해 자극 전 및/또는 자극시, 통상 GnRH 유사체의 투여와 더불어, 난포 발달을 자극하기 위해, 난포 자극 호르몬 (FSH)과 같은 고나도트로핀을 단독으로 또는 황체 형성 호르몬 (LH) 활성과 조합하여 투여하는 것이다. COS에 일반적으로 사용되는 약학 조성물은 난포 자극 호르몬 (rFSH), 뇨 유래 FSH, 재조합 FSH + LH 조제물, 뇨 유래 메노트로핀 [인간 폐경기 고나도트로핀 (hMG)] 및 고도로 정제된 인간 폐경기 고나도트로핀 (HP-hMG)을 포함한다. IVF는 심각할 경우 생명을 위협할 수 있는 난소 과잉자극 증후군 (OHSS)의 발병 위험성과 연관될 수 있다.

여성의 과배란 유도 (COS)에 대한 반응 가능성을 예측하는 예측력은 개별 맞춤형 COS 프로토콜 개발을 가능케 할 수 있다. 이는, 예를 들어, 과도한 자극 반응을 나타낼 것으로 예측되는 여성에서 OHSS 발병 위험도를 낮출 수 있거나, 및/또는 미약 반응자로서 분류된 여성의 임신 가능성을 개선시킬 수 있다. 혈청내 항-뮐러 호르몬 (AMH) 농도가 현재 난소 예비력(ovarian reserve)에 대한 신뢰성있는 마커로서 확립되어 있다. AMH 농도 감소는 COS 시술시의 고나도트로핀에 대한 난소 반응 감소와 연관되어 있다. 나아가, 고수준의 AMH는 과도한 난소 반응에 대한 양호한 예측인자이고, OHSS 발병 위험의 지표이다.

ART 시술 중인 35세 미만의 여성에 대한 예비 실험에서, CONSORT 투약 알고리즘 (dosing algorithm) (기초 FSH, BMI, 연령 및 AFC 통합)을 이용하여 OHSS 발병 위험성이 있는 여성에서 COS에 대한 최상의 FSH 개시 용량을 예측한다 (Olivennes et. al., 2009). 개체별 용량 맞춤은 충분한 난모 세포 수율과 양호한 임신율로 이어진다. 그러나, 저용량군 (75 IU FSH)은 부적절한 반응으로 인해 실패율이 높고, 상당수의 환자들에서 OHSS가 발생한다.

따라서, 자극에 대해 알맞은 반응을 제공하거나, 및/또는 OHSS 발병 위험성 저하를 제공하는, 개별 맞춤형 COS 프로토콜에 이용하기 위한 조성물이 필요한 실정이다.

전술한 바와 같이, 표준 COS 프로토콜들은 FSH 투여를 포함할 수 있다. FSH는 천연적으로 뇌하수체 전엽에서 분비되며, 난포 발달과 배란을 지원하는 기능을 한다. FSH는, 다른 당단백질 호르몬인 LH와 CG에서도 공통적인 92개의 아미노산 α 서브유닛과, 호르몬에 생물학적 특이성을 부여하는 FSH에 고유한 111개의 아미노산 β 서브유닛을 포함한다 (Pierce and Parsons, 1981). 각각의 서브유닛은 컴플렉스 탄수화물 잔기들이 부가되어 번역 후 수정된다. 이들 서브유닛 둘다 N-연결되는 글리칸 결합부 2곳을 가지고 있는데, α 서브유닛은 아미노산 52번 및 78번 위치에, β 서브유닛은 아미노산 7번 및 24번 위치에 결합부가 존재한다 (Rathnam and Saxena, 1975, Saxena and Rathnam, 1976). 이에, FSH는 중량 (mass)의 약 30%까지 당화된다 (Dias and Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).

폐경기 이후의 인간 뇨로부터 정제된 FSH는, 자연 임신에서 배란을 촉진하고, 보조 생식술에 난모 세포를 제공하기 위해, 다년간 불임 치료에 사용되고 있다. 현재 승인된 난소 자극용 재조합 FSH (rFSH) 제품들, 예컨대 폴리트로핀 α (follitropin alfa) (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) 및 폴리트로핀 β (follitropin beta) (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough)는, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주로부터 유래된 것이다. 현재, 인간 세포주로부터 유래된 rFSH 제품은 시판되지 않고 있다.

FSH 조제물들은 존재하는 다양한 이소형들의 양적 차이와 관련있는 상당한 이질성 (heterogeneity)이 존재한다. 개개 FSH 이소형들은 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 번역 후 수정되는 정도에는 차이가 있으므로, 개개 이소형들은 탄수화물 분지 구조체들의 이질성과 시알산 (말단의 당) 병합의 양적 차이로 특정되며, 이 2가지 모두 특이적인 이소형의 생활성에 영향을 미치는 것으로 보인다.

천연 FSH의 당화는 매우 복잡하다. 천연적으로 유래되는 뇌하수체 FSH에 존재하는 글리칸들은 모노-, 바이-, 트리 및 테트라-안테나형 글리칸들의 조합을 포함할 수 있는 매우 다양한 범위의 구조체들을 함유할 수 있다 (Pierce and Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger and Green, 1988). 글리칸은 다른 변형, 즉 코어 푸코실화 (fucosylation), 바이섹팅 글루코스아민 (bisecting glucosamine), 아세틸 락토스아민을 이용한 체인 연장, 부분 또는 전체 시알산화, α2,3 및 α2,6 연결들을 이용한 시알화, 및 갈락토스를 치환한 황산화 갈락토스아민을 포함할 수도 있다 (Dalpathado et al., 2006). 아울러, 개개 당화부들에는 글리칸 구조체들의 분포 차이가 존재한다. 상당한 수준의 글리칸 복합성은 개체의 혈청으로부터 유래된 FSH와 폐경기 여성의 뇨로부터 유래된 FSH에서도 확인된다 (Wide et al., 2007).

재조합 FSH 산물들의 당화는 숙주 세포주에 존재하는 글리코실-전이효소의 종류를 반영한다. 시판되는 rFSH 산물들은 유전자 조작된 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)로부터 유래된 것이다. CHO 세포 유래 rFSH는 글리칸 수정 범위가 천연 산물에서 확인되는 것 보다 더 한정적이다. CHO 세포 유래 rFSH에서 확인되는 글리칸 이질성 감소의 예로는 바이섹팅 글루코스아민의 부재와 코어 푸코실화 및 아세틸 락토스아민 연장에 대한 양적 감소를 포함한다 (Hard et al., 1990). 아울러, CHO 세포는 오직 α2,3 연결을 이용하여 시알산을 부가할 수 있으며 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); CHO 세포 유래 rFSH는 α2,3-연결된 시알산만을 포함하며, α2,6-연결된 시알산은 포함하지 않는다.

따라서, CHO 세포 유래 FSH는, α2,3-연결된 시알산과 α2,6-연결된 시알산의 혼합물을 가진 글리칸을 포함하며 이중 전자가 주를 이루는 천연적으로 생성되는 FSH (예, 인간 뇌하수체/혈청/뇨 FSH)와는, 차이가 있다.

나아가, 상업적으로 구입가능한 재조합 FSH 조제물은, 뇌하수체, 혈청 또는 폐경 뇨 유래 FSH와 비교하였을 때, 등전점 (pI)이 4 미만인 FSH에 양적 차이가 존재하는 것으로 확인되었다 (Ulloa-Aguirre et al. 1995). 뇨 조제물내 산성 이소형의 양은 CHO 세포로부터 유래된 재조합 제품인 Gonal-f (Merck Serono) 및 Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004)에 비해 훨씬 더 많다. 이는, 재조합 FSH에는 설페이트로 변형된 음으로 하전된 글리칸이 양적으로 적기 때문에, 재조합 FSH에서의 보다 낮은 시알산 몰 함량을 반영하는 것일 것이다. 천연 FSH 대비 낮은 시알산 함량이 상업적으로 구입가능한 재조합 FSH 제품들의 특징이며, 이런 점은 제조 공정의 한계를 보여주는 것일 수 있다.

다양한 소스로부터 유래된 물질들에서 FSH의 순환 수명은 확인되어 있다. 이들 물질들 중 일부는, 산이 증가할 수록 음 전하가 높아지는 pI로 특정되는 분자의 총 전하를 토대로 분획화된 바 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 분자의 총 전하에 가장 크게 작용하는 인자는 각 FSH 분자의 시알산 총 양이다. 예를 들어, rFSH (Organon)는 시알산을 약 8 mol/mol로 함유하고 있는 반면, 뇨 유래 FSH는 시알산을 더 많이 함유한다 (de Leeuw et al. 1996). 대응되는 혈장 소거 속도는 랫의 경우 0.34 및 0.14 ml/min이다 (Ulloa-Aguirre et al. 2003). 재조합 FSH가 고 pI 분획과 저 pI 분획으로 분할되는 예에서, 고 pI (시알산 함량 낮음) 분획은 생체내 효능이 감소되었으며, 혈장내 반감기도 짧았다 (D'Antonio et al. 1999). 또한, 배란 사이클 후기 단계에는, 에스트라디올의 수준 증가로 인한 뇌하수체 전엽에서의 α2,3-시알릴-전이효소의 하향-조절로 인해, 순환성 FSH가 더 염기성을 띄는 것으로 보고되었다 (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). α2,6 시알릴-전이효소에 대한 결과는 보고된 바 없다.

따라서, 전술한 바와 같이, CHO 시스템을 이용하여 발현시킨 재조합 단백질들은 말단의 시알산 연결 타입이 천연적인 카운터파트와는 다를 것이다. 이런 점은, 탄수화물 모이어티가 분자의 약리학적 속성에 기여할 수 있으므로, 약학적 용도의 생물제제를 제조하는데 중요한 고려사항이다.

본 출원인은 WO2009/127826A로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB2009/000978의 내용인 인간 유래 재조합 FSH를 개발한 바 있다. 재조합 FSH는 α2,3- 및 α2,6-연결된 2가지 시알산들이 혼합된 형태로, rFSH와 α2,3 시알릴 전이효소를 모두 발현하도록 인간 세포주를 조작함으로써, 제조되었다. 발현되는 산물은 산성이 강하며, α2,3- 및 α2,6-연결된 시알산들의 혼합을 함유하는데, 후자는 내인성 시알릴 전이효소 활성에 의해 제공된다. 시알산 연결 타입, 즉, α2,3- 또는 α2,6-은 FSH의 생물학적 소거에 놀라운 영향을 미칠 수 있는 것으로 확인되었다. α2,3 및 α2,6-연결된 시알산들의 혼합을 포함하는 재조합 FSH는 기존의 CHO 세포에서 발현되는 rFSH에 비해 2가지 이점을 가지고 있는데, 한가지는 2가지 시알릴 전이효소들의 조합된 활성으로 인해 이 물질이 보다 고도로 시알화된다는 것이고, 2번째는 이 물질이 천연 FSH에 매우 가깝다는 것이다. 이런 점으로 인해, α2,3 연결된 시알산만 생산되며 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) 시알산 함량이 낮은 (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004) CHO 세포 유래의 재조합 산물에 비해, 생물학적으로 더 적합할 것임은 자명하다.

국제 특허 출원 번호 PCT/GB2009/000978에 개시된 rFSH 산물은 분지형 글리칸 모이어티들을 포함한다. FSH는 (FSH 당단백질에 결합된) 글리칸을 포함하며, 이들 글리칸들은 매우 다양한 구조체를 포함할 수 있다. 당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이, (글리칸)의 분지 형성은, 글리칸이 1, 2, 3 또는 4개 이상의 말단의 당 잔기 또는 "안테나"를 가지는 결과로서 발생할 수 있으며; 1, 2, 3 또는 4개의 말단의 당 잔기 또는 "안테나"를 가진 글리칸은 각각 모노-안테나형, 다이-안테나형, 트리-안테나형 또는 테트라-안테라형 구조체로서 지칭된다. 국제 특허 출원 번호 PCT/GB2009/000978에 기술된 rFSH의 예는 다음과 같은 상대적인 양으로 모노-시알화된, 다이-시알화된, 트리-시알화된 및 테트라-시알화된 글리칸 구조체들을 포함한다: 모노-시알화 9-15%; 다이-시알화 27 - 30%; 트리-시알화 30 - 36% 및 테트라-시알화 25 - 29%. 잘 알려져 있는 바와 같이, 모노-시알화된 글리칸 구조체는 시알산 잔기 1개를 포함하며; 다이-시알화된 글리칸 구조체는 시알산 잔기 2개를 포함하며; 트리-시알화된 글리칸 구조체는 시알산 잔기 3개를 포함하며; 테트라-시알화된 글리칸 구조체는 시알산 잔기 4개를 포함한다. 여기서, "X% 모노-시알화된", "X% 다이-시알화된", "X% 트리-시알화된" 또는 "X% 테트라-시알화된"과 같은 용어는, 임의의 방식으로 시알화된 (시알산을 가진) FSH의 글리칸 구조체 총 수에 대한 퍼센트 (X%)로서 표시되는, FSH에서 (각각) 모노-, 다이, 트리 또는 테트라 시알화된 글리칸 구조체의 수를 나타낸다. 따라서, "트리-시알화된 글리칸 구조체 30 - 36%"라는 표현은, 시알산 잔기를 가진 (즉, 시알화된) FSH의 글리칸 구조체 총 수 중, 이들 글리칸 구조체들의 30 - 36%가 3번 시알화된 (시알산 잔기 3개를 가짐) 것임을 의미한다. 본 출원인은, 놀랍게도, (전술한 PCT/GB2009/000978에 기재된 rFSH 산물의 예와는 다른) 테트라-시알화된 글리칸 구조체를 특정량으로 가진 FSH가, 현재 시판되고 있는 재조합 FSH 산물에 비해 훨씬 더 강력하다는 것을 확인하게 되었다. 본 출원인의 산물은 아미노산 서열이 천연 서열이고, 천연 인간 FSH 및 기존 CHO 유래 rFSH 산물과 상동하다. 그러나, 본 출원인은, α2,3 및 α2,6-연결된 시알산들의 혼합을 포함하며 및/또는 특정량의 테트라-시알화된 글리칸 구조체를 가진, 인간 유래 재조합 FSH 산물 (즉, 예를 들어, 인간 세포주를 조작함으로써 제조된, 인간 세포주에서 생산 또는 발현시킨 재조합 FSH)이 (예, 개별 맞춤형), COS 프로토콜에서 사용되었을 때 특히 효과적일 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

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본 발명은, 일 측면에서, 환자 (예, 혈청내 AMH 수준이 0.05 pmol/L 이상, 예컨대 0.5 pmol/L 이상인 환자)의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 인간 유래 재조합 FSH를 1 - 24 ㎍, 예컨대 2 - 24 ㎍, 예컨대 2 - 15 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 포함하는, 산물 (예, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직하게는, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 4.5 - 12.5 ㎍, 예컨대 5 - 12.5 ㎍, 예컨대 6 - 12.5 ㎍, 예컨대 6.3 - 10.5 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다.

본 발명은, 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L - 14.9 pmol/L)인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 인간 유래 재조합 FSH를 9 - 14 ㎍, 예컨대 11 - 13 ㎍, 예컨대 12 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함하는, 산물 (예, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다. 바람직하게는, 상기 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L - 14.9 pmol/L)인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은, 다른 측면에서, 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 12.5 ㎍, 예컨대 6 - 10.5 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함하는, 산물 (예, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다. 바람직하게는, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 12 ㎍, 예컨대 7 - 12 ㎍, 예컨대 8.7 - 10 ㎍ (바람직하게는, 인간 유래 재조합 FSH 9 - 10 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 12 ㎍, 예컨대 6 - 9 ㎍, 예컨대 7 - 8 ㎍ (바람직하게는, 인간 유래 재조합 FSH 7.3 - 8 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 11 ㎍, 예컨대 6.3 - 7 ㎍ (바람직하게는, 인간 유래 재조합 FSH 6 - 7 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 사용하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다.

상기 용량은 환자의 (개체의) 1차 자극 프로토콜에서 불임을 치료하기 위한 것일 수 있다. 추가적인 자극 사이클에서, 용량은 1차 사이클에서 실제 난소 반응에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 출원인은, 고품질의 이식용 난모 세포 2개를 선정할 수 있도록 하기 위해, 9개 난모 세포 영역을 회수하는 것이 일반적으로 필요하다는 것을 알게 되었다.

본 출원인은, AMH 저수준 개체 (AMH < 15 pmol/L)의 경우, 이를 달성하기 위해서는, 재조합 FSH가 합리적으로 고용량 (예, 12 ㎍)으로 필요하다는 것을 알게 되었다. 이 용량에서는, AMH 저수준 개체들 중 60%에서 난모 세포 8 - 14개가 회수될 것이다. 이는, AMH 저수준 개체를 150 IU Gonal-f로 치료하면 개체의 33%에서만 난모 세포 8 - 14개가 회수되는 것에 비해, 예상치 못한 상당한 향상이다. 본 출원인은 환자의 체중에 따라 이 용량을 조정할 필요가 없다는 것을 알게 되었다.

그러나, 개체군의 60% (및 불임 치료를 받은 30세 미만 여성의 80%)는 AMH가 높다 (즉, AMH가 ≥15 pmol/L임). 이들 개체들에서, 난모 세포를 평균 9 - 11개 회수하는 것은 일반적으로 매우 쉬운 일이며; 자극 프로토콜의 문제점은 OHSS 발병 위험성이다. 본 출원인은, 인간 재조합 FSH를 저용량으로 투여한 환자에서, 회수되는 난모 세포와 개체의 체중 간에 상관성이 있다는 것을 확인하였다. 이는, (당해 기술 분야에서 통상적인) 고정 용량의 FSH를 이용하는 치료에는 위험이 있을 수 있다는 것을 의미한다. 본 출원인은, 공지의 치료 프로토콜에 비해 허용가능한 또는 개선된 난모 세포 회수율과 더불어 개선된 안전성 프로파일 (OHSS 발병 위험도 감소)을 제공하는, FSH 용량과 AMH 수준 및 개체의 체중 간에 상관성을 확립하였다 (실시예 10 참조).

본 발명에서, 다른 측면으로, 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 인간 유래 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.09 - 0.19 ㎍ (예컨대 0.09 - 0.17 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는, 산물 (예, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직하게는, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.14 - 0.19 ㎍ (바람직하게는, 인간 유래 재조합 FSH 0.15 - 0.16 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 0.11 - 0.14 ㎍ (바람직하게는, 인간 유래 재조합 FSH 0.12 - 0.13 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 환자의 체중 kg 당 투여하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 산물은 혈청내 AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 것이며, 본 발명은 인간 유래 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.10 - 0.11 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하기 위한 것이다. 이러한 구현예에서, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 이들 용량은 OHSS의 발병 위험성을 최소화하면서, 효과적인 반응을 제공한다.

상기 용량들은 환자의 (개체의) 1차 자극 프로토콜에서 불임을 치료하기 위한 것일 수 있다. 다른 자극 사이클에서는, 용량을 1차 사이클에서의 실제 난소 반응에 따라 조정할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은, 다른 추가적인 측면에서, 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 인간 유래 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.15 - 0.21 ㎍ (예컨대 0.19 - 0.21 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 산물 (예, 약학 조성물)을 제공한다. 바람직하게는, 불임 치료는, 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인(예, 측정)하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 그러나, 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자는 체중에 따라 용량 조정할 필요는 없다. 이들 용량은 당해 기술 분야의 잘 알려진 변환을 이용하여, 쉽게 변환하여 환자의 BMI에 따라 투약하여 환자를 치료할 수 있을 것으로 이해될 것이다.

본 산물 (예, 약학 조성물)은 혈청내 AMH가 5.0 - 14.9 pmol/L인 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 6 - 18 ㎍, 예컨대 8 - 11 ㎍, 예컨대 8.5 - 10.2 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 본 산물은 혈청내 AMH가 15.0 - 29.9 pmol/L인 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 4.8 - 15 ㎍, 예컨대 6 - 9 ㎍, 예컨대 6.8 - 8.5 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 본 산물은 혈청내 AMH가 30 - 44.9 pmol/L인 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 3.6 - 12 ㎍, 예컨대 4 - 7 ㎍, 예컨대 5.1 - 6.8 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 본 산물은 혈청내 AMH가 AMH 45 pmol/L 또는 그 이상인 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 2 - 9 ㎍, 예컨대 2.4 - 9 ㎍ (예컨대 3.4 - 5.1 ㎍) 또는 2 - 5 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 본 산물은 혈청내 AMH가 5 pmol/L 이하인 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 7.2 - 24 ㎍, 예컨대 10 - 15 ㎍ 예컨대 10.2 - 13.6 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 본 산물은 환자에서 불임 치료에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 상기 산물은 인간 유래 재조합 FSH를 4.8 - 18 ㎍, 예컨대 6 - 11 ㎍, 예컨대 6.8 - 10.2 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 포함한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다.

바람직하게는, rFSH (예, 인간 세포주 유래 재조합 FSH)는 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 FSH (rFSH)는 총 시알화가 1% - 99%이며 α2,3-시알화일 수 있다. 본 발명에 따른 FSH (rFSH)는 총 시알화가 1% - 99%이며 α2,6-시알화일 수 있다. 바람직하게는, 총 시알화의 50 - 70%, 예컨대 60 - 69%, 예컨대 약 65%가 α2,3-시알화이다. 바람직하게는, 총 시알화의 25 - 50%, 예컨대 30 - 50%, 예컨대 31 - 38%, 예컨대 약 35%가 α2,6-시알화이다.

바람직하게는, rFSH (예, 인간 세포주 유래 재조합 FSH)는 모노-, 다이-, 트리- 및 테트라-시알화된 글리칸 구조체를 포함하며, 시알화된 글리칸 구조체들 중 15-24%, 예컨대 17-23%가 테트라시알화된 글리칸 구조체이다 (예, 아래 실시예에 기술된 바와 같이 하전된 글리칸에 대한 WAX 분석으로 확인됨). FSH는 (FSH 당단백질에 부착된) 글리칸을 포함한다. FSH에서 글리칸이 매우 다양한 구조를 가질 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 것으로는, 모노, 바이, 트리 및 테트라-안테나형 글리칸의 조합을 포함할 수 있다. 여기서, "시알화된 글리칸 구조체들 중 X%가 테트라시알화된 글리칸 구조체이다"와 같은 기술은, 임의의 방식으로 시알화된 (시알산을 가진) FSH 상의 글리칸 구조체의 총 수에 대한 퍼센트 (X%)로서 표시되는, FSH 상의 테트라 시알화된, 즉, 4개의 시알산 잔기를 가지는 글리칸 구조체의 수를 나타낸다. 즉, "시알화된 글리칸 구조체들 중 15-24%가 테트라시알화된 글리칸 구조체이다"라는 표현은, 시알산 잔기를 가지는 (즉, 시알화된) FSH 상의 글리칸 구조체들의 총 수에서, 이들 글리칸 구조체들의 15-24%가 테트라 시알화된 (4개의 시알산 잔기를 가지는) 것을 의미한다.

rFSH는 단일 이소형 또는 이소형들의 혼합로서 존재할 수 있다.

본 출원인은, 특이적인 특징을 가진 재조합 FSH을 특정량으로 사용하여 환자의 개별 AMH 수준을 토대로 환자를 치료함으로써, (예, 반응 가능성이 낮은 환자에서) 자극에 대한 적절한 반응 가능성을 높이고, 및/또는 (예, 고도 또는 과도한 반응자로 분류되는 환자에서) OHSS 위험성을 낮추는, "개별 맞춤형" COS 프로토콜을 창안하게 되었다.

혈청내 AMH 수준은 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로 확인 (예, 측정)할 수 있다. 바람직하게는, 혈청내 AMH 수준은 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용하여 측정한다. 본 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다. 다른 분석도 사용할 수 있다.

본원에서, 혈청내 AMH 수치는 일반적으로 pmol/L로 표시된다. 이는 변환 등식 1 ng/ml AMH = 7.1 pmol/L AMH을 적용하여 ng/mL로 변환할 수 있다.

본원에서, 용어 "환자" 및 "개체"는 상호 호환적으로 사용된다.

본 산물 (예, 약학 조성물)은, 바람직하게는, 상기에서, 본원에서, 청구항에서 규정된 양의 인간 유래 rFSH를 1일 용량 또는 이와 등가인 1일 용량으로 포함한다. (1일) 용량은 개시 용량일 수 있다 (즉, 치료 중에 감소, 증가 또는 유지될 수 있음).

본 산물 (예, 약학 조성물)은, 치료 첫날부터 시작하여 7-13일간, 예컨대 9-13일간, 예컨대 10-13일간, 예컨대 10-11일간 FSH를 (1일) 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 산물 (예, 약학 조성물)은, GnRH 작용제 (예, 시나렐, 루프론, 데카펩틸)를 투여한 후 (예, 투여 개시 후, 예컨대 매일 투여 개시 후), 12-16일, 예컨대 13-15일, 예컨대 14일 후에 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 산물 (예, 약학 조성물)은 GnRH 작용제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 산물 (예, 약학 조성물)은 GnRH 길항제 (예, 가니렐릭스, 세트로렐릭스)를 투여하기 전에, 예를 들어 GnRH 길항제를 투여하기 전 5 또는 6일 동안 투여하기 위한 것일 수 있다. 본 산물 (예, 약학 조성물)은 GnRH 길항제와 함께 투여하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 산물 (예, 약학 조성물)은, 최종 난포 성숙 (final follicular maturation)을 유도하기 위해, hCG를 고 (배란성) 용량 (예컨대, 4,000 - 11,000 IU hCG, 예, 5,000 IU hCG, 10,000 IU hCG 등; 또는 150 - 350 ㎍ 재조합 hCG, 예컨대 250 ㎍ 재조합 hCG)으로 투여하기 전에, 투여하기 위한 것이다.

본 산물은 매일 보다 잦은 (또는 적은) 빈도로 투여하기 위한 것일 수 있으며, 이 경우 적정 용량은 본원에 명시된 (1일) 용량과 등가일 것이다.

본원에서, 용어 "불임 치료"는 과배란 유도 (COS) 또는 과배란 유도 (COS) 단계 또는 시기를 포함하는 방법, 예컨대 인공 수정 (IUI: Intra Uterine Insemination), 시험관 수정 (IVF) 또는 세포질내 정자 주입 (ICSI: intracytoplasmic sperm injection)을 포함한다. 용어 "불임 치료"는 배란 유도 (OI) 또는 배란 유도 (OI) 단계 또는 시기를 포함하는 방법에 의한 불임 치료를 포함한다. 용어 "불임 치료"는, 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 예컨대 1기 또는 2기 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 및/또는 무배란성 불임, 예컨대 WHO II형 무배란성 불임을 앓고 있는 개체, 및/또는 남성 요인의 불임인 파트너를 가진 개체에서의 불임 치료를 비롯하여, 난관 불임 또는 이유 불명의 불임을 가진 개체에서의 불임 치료를 포함한다. 본 산물 (또는 조성물)은, 자궁내막증을 앓고 있는 개체, 미국 생식 의학회 (ASRM)의 자궁내막증의 다양한 단계 분류 체계에 따라 정의되는 바와 같이, 예컨대 1기 또는 2기 자궁내막증을 앓고 있는 개체에서의 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (에 사용하기) 위한 것일 수 있다 (4기 가장 심각함; 1기 심각도가 가장 약함) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817 821].

본 산물 (조성물)은, 초기 난포기에 혈청내 FSH 수준이 1 - 16 IU/L, 예컨대 1 - 12 IU/L로 정상인 개체에서의 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다.

본 산물 (조성물)은 18-42세, 예컨대 25-37세 개체에서의 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다. 본 산물은 1 < BMI < 35 kg/m²인 개체, 예컨대, 18 < BMI < 25 kg/m²인 개체, 예컨대, 20 < BMI < 25 kg/m²인 개체에서의 불임 치료 (및/또는 과배란 유도)를 (사용하기) 위한 것일 수 있다.

rFSH는, 바람직하게는, 트리-시알화된 글리칸 구조체를 27 - 33%, 예컨대 30 - 32%로 포함할 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 다이-시알화된 구조체를 24 - 33%, 예컨대 26 - 30%로 포함할 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 모노-시알화된 글리칸 구조체를 12 - 21%, 예컨대 15 - 17%로 포함할 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 모노-시알화된, 다이-시알화된, 트리-시알화된 및 테트라-시알화된 글리칸 구조체들이 다음과 같은 상대적인 양으로 포함될 수 있다: 15 - 17%의 모노-시알화된 글리칸 구조체; 26 - 30%의 다이-시알화된 글리칸 구조체; 27 - 33% (예, 29 - 32%, 예로, 30 - 32%, 예로, 30 - 31%)의 트리-시알화된 글리칸 구조체 및 17 - 23%의 테트라-시알화된 글리칸 구조체 (예, 실시예들에 기술된 바와 같이, 하전된 글리칸의 WAX 분석으로 확인함). rFSH는 중성의 시알화된 구조체들을 0 - 7%, 예컨대 0.1 - 7%, 예컨대 3 - 6%, 예컨대 5 - 6%로 포함할 수 있다. FSH는 (FSH 당단백질에 결합된) 글리칸을 포함한다. 본원에서, "X% 모노-시알화된", "X% 다이-시알화된", "X% 트리-시알화된" 또는 "X% 테트라-시알화된"과 같은 기재는, 임의의 방식으로 시알화된 (시알산을 가진) FSH 상의 글리칸 구조체의 총수에 대한 퍼센트 (X%)로서 표시되는, FSH 상의 모노-, 다이, 트리 또는 테트라 시알화된 각각의 글리칸 구조체들의 수를 나타낸다. 즉, "27 - 33%의 트리-시알화된 글리칸 구조체"라는 표현은, FSH에서 시알산 잔기를 가지는 (즉, 시알화된) 글리칸 구조체들 총 수 중, 이들 글리칸 구조체들 중 27-33%가 트리 시알화된 (3개의 시알산 잔기를 가지는) 것을 의미한다.

rFSH는, [단백질 몰 수에 대한 시알산의 몰 수 비율로 표시되는] 시알산 함량이 6 mol/mol 또는 그 이상, 예컨대 6 mol/mol - 15 mol/mol, 예컨대, 8 mol/mol - 14 mol/mol, 예컨대 10 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 11 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 12 mol/mol - 14 mol/mol, 예로, 12 mol/mol - 13 mol/mol일 수 있다. rFSH는 인간 세포주에서 생산 또는 발현될 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 FSH (rFSH)는 전체 시알화의 1% - 99%가 α2,3-시알화일 수 있다. rFSH는 전체 시알화의 10% 이상이 α2,3-시알화일 수 있다. 예컨대, 전체 시알화의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% 또는 그 이상이 α2,3-시알화일 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 전체 시알화의 50 - 70%, 예컨대 전체 시알화의 60 - 69%, 예컨대 63 - 67%, 예컨대 전체 시알화의 약 65%의 함량으로 α2,3-시알화를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 FSH (rFSH)는 전체 시알화의 1% - 99%가 α2,6-시알화일 수 있다. 본 발명의 rFSH (또는 rFSH 조제물)는, 전체 시알화의 5% 또는 그 이상, 예컨대 5% - 99%가 α2,6-시알화일 수 있다. rFSH는 전체 시알화의 50% 미만이 α2,6-시알화일 수 있다. rFSH는, 바람직하게는, 전체 시알화의 25 - 50%, 예컨대, 전체 시알화의 30 - 50%, 예컨대, 31 - 38%, 예컨대 전체 시알화의 약 35%의 함량으로 α2,6-시알화를 포함할 수 있다. 시알화는, FSH 탄수화물 구조체에 존재하는 시알산 잔기의 양을 의미한다. α2,3-시알화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,3 위치에서의 시알화를 의미하며, α2,6-시알화는 (당해 기술 분야에 잘 알려진 바와 같이) 2,6 위치에서의 시알화를 의미한다. 즉, "전체 시알화의%가 α2,3-시알화일 수 있다"는, FSH에 존재하는 시알산 잔기의 총 수에 대한 2,3 위치에서의 시알화%를 나타낸다. 용어 "전체 시알화의%가 α2,6-시알화되는"은, FSH에 존재하는 시알산 잔기의 총 수에 대한 2,6 위치에서의 시알화%를 나타낸다.

rFSH는, 중량 기준으로 (단백질과 탄수화물의 중량이 아니라, 단백질 중량을 토대로) 시알산 함량 (FSH 분자 당 시알화 함유율)이 6% 이상 (예, 6% - 15%, 예로, 7% - 13%, 예로, 8% - 12%, 예로, 11% - 15%, 예로, 12% - 14%)일 수 있다.

rFSH는, 글리칸들 중 16% 이하 (예, 0.1 - 16%)가 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민 (바이섹팅 GlcNAc 또는 bisGlcNAc)을 포함하는 (예컨대, 보유하는), rFSH 또는 rFSH 조제물일 수 있다. 바람직하게는, rFSH (또는 rFSH 조제물)는, 글리칸들 중 8 - 14.5%가 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민 (바이섹팅 GlcNAc 또는 bisGlcNAc)을 포함하는 (예컨대, 보유하는), rFSH 또는 rFSH 조제물이다.

FSH는, FSH 당단백질에 부착된 글리칸을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 100%의 글리칸은 모든 글리칸이 FSH 당단백질에 부착된 것을 지칭하거나 의미하는 것으로 이해될 것이다. 즉, 본원에서, "8 - 14.5%의 글리칸이 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민을 포함한다 (보유한다)"라는 표현은, FSH 당단백질에 부착된 전체 글리칸들 중 8 - 14.5%가 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민을 포함/보유한다는 의미이며; "16% 이하의 글리칸이 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민을 포함/보유한다"는 FSH 당단백질에 부착된 전체 글리칸 중 16% 이하가 바이섹팅 N-아세틸글루코스아민을 포함/보유한다 등의 의미이다.

본 출원인은, FSH 당단백질에 포함된 16% 이하 (예, 8 - 14.5%)의 글리칸들이 바이섹팅 GlcNac를 가지는 재조합 FSH (rFSH 조제물; rFSH 조성물)이 유익한 약동학적 특성을 가질 수 있다는 것을 확인하였다. 이러한 유익한 특성은, 바이섹팅 GlcNac를 보유한 글리칸의 함량이 인간 뇨 유래 산물인 Bravelle에서의 함량과 유사하고, WO2012/017058에 기술된 바와 같이 다른 재조합 FSH 조제물 보다는 오히려 적기 때문에, 발생할 수 있는 것으로 여겨진다.

rFSH (또는 rFSH 조제물)는 20% 이상의 글리칸이 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc)을 포함 (예, 보유)하는, 예컨대 20% 이상의 글리칸이 말단 GalNAc를 포함 (예, 보유)하는, rFSH 또는 rFSH 조제물일 수 있다. 바람직하게는, rFSH (또는 rFSH 조제물)은, 40 - 55%, 예컨대 42% - 52%의 글리칸이 GalNAc를 포함 (예, 보유)하는, FSH 또는 FSH 조제물이다. 바람직하게는, rFSH (또는 rFSH 조제물)는 40 - 55%, 예컨대 42% - 52%의 글리칸이 말단 GalNAc를 포함 (예, 보유)하는, FSH 또는 FSH 조제물이다.

FSH는 FSH 당단백질에 부착된 글리칸을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 글리칸 100%는 모든 글리칸들이 FSH 당단백질에 부착된 것을 지칭 또는 의미하는 것으로 이해될 것이다. 즉, 본원에서, "20% 이상의 글리칸이 GalNAc를 포함 (예, 보유)한다"는 표현은, FSH 당단백질에 결합된 전체 글리칸들 중 20% 이상이 N-아세틸갈락토스아민 (GalNAc)을 포함/보유한다는 것을 의미하며; "40 - 55%, 예컨대 42% - 52%의 글리칸이 말단 GalNAc를 포함 (예, 보유)한다"는, FSH 당단백질에 부착된 전체 글리칸들 중 40 - 55%, 예컨대 42% - 52%가 말단 GalNAc를 포함/보유한다는 등을 의미한다.

α2,6-연결을 사용하는 것은, 테트라 시알화된 구조체의 수를, α2,3-연결만 이용가능한 CHO 세포 유래 산물과 비교하여, 높이는 것으로 보인다. 또한, 본 출원인은, 본원의 rFSH가 당 조성으로 측면에서 다른 승인된 제품들과 구별된다는 것 또한 확인하였으며: 이는, GalNac를 특정량으로 포함하거나 또는 포함할 수 있다. 이는, 2,6-시알화가 GalNac와 조합되기 때문에, 테트라시알화 및 효능과 연계될 수 있다. 다시 말해, 본 출원인은, 생체내 효능 개선을 야기하는 것으로 보이는, 시알화 수준이 높은 rFSH를 제공하는 특이적인 특징들 (2,6-링커 사이트들, GalNac)을 포함하는 rFSH를 개발하였다.

rFSH (또는 rFSH 조제물)는 (예, 말단) 1 푸코스-루이스 (fucose-lewis)를 포함하는 글리칸을 16 - 24%로, 예컨대, (예, 말단) 하나의 푸코스-루이스를 포함하는 글리칸을 16.5 - 18%로 포함할 수 있다. rFSH (또는 rFSH 조제물)는 (예, 말단) 2 푸코스-루이스를 포함하는 글리칸을 1.5 - 4.5%, 예컨대 2 - 4%, 예컨대 3.7%로 가질 수 있다.

rFSH는 인간 세포주, 예컨대 Per.C6 세포주, HEK293 세포주, HT1080 세포주 등에서 생산 또는 발현시킬 수 있다. 이런 점이 생산 방법을 단순화 (및 보다 효율적이게)시킬 수 있는데, 그 이유는 예를 들어, 시알화를 보유하기 위한 세포 배양 배지의 조작 및 조절이 공지된 프로세스를 이용한 경우 보다 덜 중요할 수 있기 때문이다. 본 방법은 또한 공지 rFSH 제품 생산에 비해 염기성인 rFSH가 생산되는 정도가 낮기 때문에, 더욱 효율적일 수 있으며; 산성인 rFSH가 더 많이 생산되므로 염기성 FSH의 분리/제거는 문제가 덜 된다. rFSH는 PER.C6^® 세포주, PER.C6^® 유래 세포주 또는 변형된 PER.C6^® 세포주에서 생산 또는 발현될 수 있다. 인간 세포주 (예, PER.C6^® 세포주, HEK293 세포주, HT1080 세포주 등)에서 생산 또는 발현되는 rFSH는 [세포의] 내인성 시알릴 전이효소 활성에 의해 제공되는 일부 α2,6-연결된 시알산 (α2,6 시알화)을 포함할 것이며, 내인성 시알릴 전이효소 활성에 의해 제공되는 일부 α2,3-연결된 시알산 (α2,3 시알화)을 포함할 것이다. 세포주는 α2,3-시알릴전이효소로 변형될 수도 있다. 세포주는 α2,6-시알릴전이효소로 변형될 수도 있다. 다른 예로 또는 부가적으로, rFSH는 [세포주의] 내인성 시알릴 전이효소 활성에 의해 제공되는 α2,6-연결된 시알산 (α2,6 시알화)을 포함할 수 있다. 본원에서, 용어 "인간 유래 재조합 FSH"는, 인간 세포주 (예, 인간 세포주를 조작함으로써 제조되는 재조합 FSH)에서 발현 또는 생산되는 재조합 FSH를 의미한다.

rFSH는 α2,3- 및/또는 α2,6-시알릴전이효소를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, rFSH는 α2,3-시알릴전이효소를 이용하여 제조된다. rFSH는 내인성 시알릴 전이효소 활성에 의해 제공되는 α2,6-연결된 시알산 (α2,6 시알화)을 포함할 수 있다.

본 산물은 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 불임 치료용이다. 불임 치료는 보조 생식술 (ART), 배란 유도 또는 인공 수정 (IUI)을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 예를 들어 공지의 FSH 조제물이 사용되는 의학 증상들에도 사용될 수 있다.

본 산물 또는 조성물은 임의의 약물 투여 경로용으로 잘 알려진 조성물로, 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 경피 (예, 패치 기술), 정맥내, 근육내, 피하, 수조내(intrasusternal), 질내, 복막내, 국소 (산제, 연고제 또는 점적제) 투여용으로 또는 볼 또는 코 스프레이제로서 제형화될 수 있다. 전형적인 조성물은, 특히 Remington's Pharmaceutical Sciences fifteenth edition (Matt Publishing Company, 1975), at pages 1405 - 1412 and 1461 - 87, 및 national formulary XIV fourteenth edition (American Pharmaceutical Association, 1975)에 기술된 바와 같이, 수계 용액, 염 및 보존제 등의 무독성 부형제, 완충제 등을 포함한다.

적합한 수계 및 비-수계 약제학적 담체, 희석제, 용매 또는 비히클로는 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로스 및 이들의 적정 혼합물, 식물성 오일 (예, 올리브 오일) 및 에틸 올리에이트 등의 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물은, 비제한적인 예로서, 보존제, 습윤제, 유화제, 계면활성제 및 분산화제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 항세균제 및 항진균제도 미생물 증식을 방지하기 위해 포함될 수 있으며, 예를 들어, m-크레졸, 벤질 알코올, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등이 포함된다. 보존제가 포함되는 경우, 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸이 바람직하지만, 보존제는 이들 예를 제한하는 것은 아니다. 아울러, 당, 소듐 클로라이드 등의 등장제가 적합할 수도 있다. 본 산물 또는 조성물은 Na⁺-염, K⁺-염 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 염은 Na+-염, 예컨대 NaCl 또는 Na₂SO₄이다.

바람직하게는, 산물 또는 조성물은 재조합 FSH와, 폴리소르베이트 20, L-메티오닌, 페놀, 디소듐 설페이트 및 소듐 포스페이트 완충액 중 하나 이상을 포함한다.

일부 경우에, 작용을 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주입으로부터 FSH (및 존재하는 경우 기타 활성 성분들)의 흡수를 서행시키는 것이 바람직하다. 이는 수용성이 불량한 결정질 또는 비결정질 물질의 액체 현탁물을 이용함으로써 달성할 수 있다. 그러면, FSH의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 결정되는데, 용해 속도는 결정의 크기와 결정 형태에 따라 결정될 수 있다. 다른 예로, 비경구로 투여되는 FSH 조합 형태의 지연 흡수는 오일 비히클에 FSH 조합을 용해 또는 현탁함으로써 달성된다. 주사가능한 데포트 형태 (depot form)는 폴리락티드-폴리글리콜리드 등의 생분해성 폴리머내에 FSH (존재하는 경우 다른 제제)의 마이크로엔캡슐 매트릭스를 형성함으로써 만들 수 있다. FSH 대 폴리머의 비율과 사용되는 특정 폴리머의 특성에 따라, FSH의 방출 속도를 조절할 수 있다. 그외 생분해성 폴리머의 예로는 폴리비닐피롤리돈, 폴리(오르토에스테르), 폴리(안하이드라이드) 등을 포함한다. 또한, 주사가능한 데포트 제형들은 또한 신체 조직과 친화적인 리포좀 또는 마이크로에멀젼 안에 FSH를 포집함으로써 제조된다.

주사가능한 제형들은, 예를 들어, 박테리아-체류 필터를 통한 여과 또는 사용 직전에 살균수 또는 기타 주사용 살균 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있는 멸균한 고체 조성물 형태로 살균제를 투입함으로써, 살균할 수 있다. 주사가능한 제형들은 임의의 적정 용기, 예컨대 바이얼, 사전 충전되는 주사기, 주입 카트리지 등의 안으로 공급될 수 있다.

본 산물 또는 조성물은 1회 사용 또는 다회 사용 (다회 용량)으로 제형화될 수 있다. 본 산물 또는 조성물이 다회 사용으로 제형화된다면, 보존제가 포함되는 것이 바람직하다. 보존제가 포함되는 경우, 벤질 알코올, 페놀 및/또는 m-크레졸이 바람직하지만, 보존제는 이러한 예들로 한정되지 않는다. 1회 사용 또는 다회 사용으로 제형화된 산물 또는 조성물은 Na⁺-염, K⁺-염 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 염은 Na+-염, 예컨대 NaCl 또는 Na₂SO₄이다.

본 산물 또는 조성물은 바이얼, 사전 충전용 카트리지 (예, 1회 투여 또는 다회 사용을 위해) 등의 용기나 또는 예를 들어 다회 용량을 투여하기 위해 "펜" 등의 주사 기구 안에 들어 있을 수 있다.

본 산물 또는 조성물은 FSH (선택적으로, hCG, LH, LH 활성 등)를 포함하는 제형 (예, 주사용 제형)일 수 있다. LH 활성은, 존재하는 경우, LH 또는 인간 융모막성 고나도트로핀 hCG로부터 기원할 수 있다. 활성 성분이 2 이상 (즉, FSH 및 예컨대 hCG 또는 LH)이라면, 이는 각각 또는 함께 투여하는 것이 적합할 수 있다. 개별 투여하는 경우, 투여는 순차적일 수 있다. 본 산물은 임의의 적절한 패키지 안에 제공될 수 있다. 예를 들어, 산물은 FSH 또는 hCG 중 하나 또는 FSH 및 hCG의 조합 (또는 조합)이 든, 복수의 용기들 (예, 사전 충전된 주사기들 또는 바이얼들)을 포함할 수 있다. hCG는 재조합 hCG 또는 뇨 hCG일 수 있다. 본 산물이 FSH, 예를 들어 재조합 FSH가 든 복수의 용기 (예, 사전 충전된 주사기들 또는 바이얼들)를 포함한다면, 각 용기는 동량의 FSH를 포함할 수 있다. 하나 이상의 용기는 FSH를 여러가지 양으로 포함할 수 있다. 시린지 또는 바이얼은 블리스터 팩키지 또는 멸균성을 유지하기 위한 다른 수단으로 포장될 수 있다. 임의의 산물은, 선택적으로, FSH (및, 존재한다면, 예컨대 hCG) 제형에 대한 사용 설명서를 포함할 수 있다. 약학 조성물의 다양한 성분들의 실제 농도와 pH는 당해 기술 분야의 일상적인 실무에 따라 조정된다. GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7^th ed을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비경구 투여용 조성물로서 제공된다. 비경구 제형을 제조하는 일반적인 방법들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, at pages 780-820에 기재되어 있다. 비경구 조성물은 액체 제형 또는 투여 직전에 멸균 주사 매질에 혼합시키는 고체로서 제공될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 비경구 조성물은 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 단위 투약 형태 (dosage unit form)로 제공된다.

본 발명은, 추가적인 측면에서, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계; 및 (b) 상기 개체에게, 인간 유래 재조합 FSH를 1 - 24 ㎍, 예컨대 2 - 24 ㎍, 예컨대 2 - 15 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 용량은 인간 유래 재조합 FSH 4.5 - 12.5 ㎍, 예컨대 5 - 12.5 ㎍, 예컨대 6 - 12.5 ㎍, 예컨대 6.3 - 12 ㎍이거나 이와 등가이다.

본 발명은, 다른 측면으로, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; 및 (b) 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L - 14.9 pmol/L)인 개체에게, 인간 유래 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)를 9 - 14 ㎍, 예컨대 11 - 13 ㎍, 예컨대 12 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

본 발명은, 다른 측면으로, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; 및 (b) 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 (상기) 개체에게, 인간 유래 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 5 - 12.5 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다. 상기 (예, 1일) 용량은 인간 유래 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH) 6 - 10 ㎍이거나 이와 등가일 수 있다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

일 구현예에서, 본 방법은 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 (상기) 개체에게, 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 12 ㎍, 예컨대 7 - 12 ㎍, 예컨대 8.7 - 10 ㎍ (바람직하게는, 9 - 10 ㎍ 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량으로 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 본 방법은, 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 (상기) 개체에게 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 12 ㎍ (예컨대 7 - 12 ㎍, 예컨대 6 - 9 ㎍, 예컨대 7 - 8 ㎍, 예컨대 7.3 - 8 ㎍의 인간 유래 재조합 FSH)의 용량 또는 이와 등가인 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 본 방법은, 혈청내 AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 (상기) 개체에게 인간 유래 재조합 FSH를 5 - 11 ㎍ (예컨대 6 - 7 ㎍, 예컨대 6.3 - 7 ㎍의 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은, 다른 측면으로, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; 및 (b) 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 개체에게, 개체의 체중 kg 당 인간 유래 재조합 FSH를 0.09 - 0.19 ㎍ (예컨대 0.09 - 0.17 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

일 구현예에서, 본 방법은, 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 개체의 체중 kg 당 인간 유래 재조합 FSH를 0.14 - 0.19 ㎍ (바람직하게는, 0.15 - 0.16 ㎍ 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 본 방법은, 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 개체의 체중 kg 당 인간 유래 재조합 FSH를 0.11 - 0.14 ㎍ (바람직하게는, 0.12 - 0.13 ㎍ 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예로, 본 방법은, 혈청내 AMH 수준이 ≥35 pmol/L인 개체의 체중 kg 당 인간 유래 재조합 FSH를 0.10 - 0.11 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 이들 용량들은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

본 발명은, 다른 측면에서, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; 및 (b) 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 개체에게, 개체의 체중 kg 당 인간 유래 재조합 FSH를 0.15 - 0.21 ㎍ (예컨대 0.19 - 0.21 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다.

투여는, 바람직하게는, 상기와 청구항에 규정된 양의 FSH인 1일 용량 또는 이와 등가인 1일 용량을 포함한다. 상기 (1일) 용량은 개시 용량일 수 있다 (치료하는 동안 감소, 증가 또는 유지될 수 있음).

본 방법은 환자의 (개체의) 1차 자극 프로토콜로 불임 치료하는 방법일 수 있다. 추가적인 자극 사이클에서는, 용량을 1차 사이클에서의 실제 난소 반응에 따라 조정할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은, 다른 측면에서, (a) 개체의 혈청내 AMH 수준을 확인 (예, 측정)하는 단계; 및

(b) 개체가 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L (예, 0.05 pmol/L - 14.9 pmol/L)인 경우, 인간 유래 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 10 - 14 ㎍, 예컨대 11 - 13 ㎍, 예컨대 12 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 개체에게 투여하는 단계, 또는

개체가 혈청내 AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 개체의 체중 kg 당 0.14 - 0.19 ㎍ (바람직하게는, 0.15 - 0.16 ㎍의 인간 재조합 FSH)의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 개체에게 투여하는 단계, 또는

개체가 혈청내 AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 개체의 체중 kg 당 0.11 - 0.14 ㎍ (바람직하게는, 0.12 - 0.13 ㎍ 인간 유래 재조합 FSH)의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 개체에게 투여하는 단계, 또는

개체가 혈청내 AMH 수준이 ≥35 pmol/L인 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 개체의 체중 kg 당 0.10 - 0.11 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 불임 치료 방법을 제공한다.

혈청내 AMH가 5.0 - 14.9 pmol/L인 환자 (개체)의 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 6 - 18 ㎍, 예컨대 8 - 11 ㎍, 예컨대 8.5 - 10.2 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여할 수 있다. 혈청내 AMH가 AMH 15.0 - 29.9 pmol/L인 환자 (개체)의 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 4.8 - 15 ㎍, 예컨대 6 - 9 ㎍, 예컨대 6.8 - 8.5 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 투여할 수 있다. 혈청내 AMH가 30 - 44.9 pmol/L인 환자 (개체)의 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 3.6 - 12 ㎍, 예컨대 4 - 7 ㎍, 예컨대 5.1 - 6.8 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 투여할 수 있다. 혈청내 AMH가 45 pmol/L 이상인 환자 (개체)의 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 2 - 9 ㎍, 예컨대 2.4 - 9 ㎍ (예컨대 3.4 - 5.1 ㎍) 또는 2 - 5 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 투여할 수 있다. 혈청내 AMH가 5 pmol/L 이하인 환자 (개체)의 경우, 인간 유래 재조합 FSH를 7.2 - 24 ㎍, 예컨대 10 - 15 ㎍ 예컨대 10.2 - 13.6 ㎍의 용량으로 또는 이와 등가의 용량으로 투여할 수 있다. 일부 예들에서, 인간 유래 재조합 FSH는 4.8 - 18 ㎍, 예컨대 6 - 11 ㎍, 예컨대 6.8 - 10.2 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량으로 투여된다. 바람직하게는, FSH는 재조합 FSH ("rFSH" 또는 "recFSH")이다. 바람직하게는, FSH는 인간 세포주 유래 재조합 FSH이다. 투여는, 바람직하게는, 상기 및 청구항에 규정된 양의 FSH를 1일 용량으로 또는 이와 등가인 1일 용량으로 포함한다. 상기 (1일) 용량은 개시 용량일 수 있다 (이는 치료 중에 감소, 증가 또는 유지될 수 있음).

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
도 1은 pFSHalpha/beta 발현 벡터의 플라스미드 지도이고;
도 2는 α2,3-시알릴전이효소 (ST3GAL4)의 발현 벡터를 도시한 것이고;
도 3은 α2,6-시알릴전이효소 (ST6GAL1)의 발현 벡터를 도시한 것이고;
도 4는 α2,3-시알릴전이효소로 조작된 후 안정적으로 FSH를 발현하는 PER.C6^® 세포에 의해 생산되는 재조합 FSH 예들의 시알산의 양적 분포%를 나타낸 것이고;
도 5는 α2,3-시알릴전이효소로 조작된 후 안정적으로 FSH를 발현하는 PER.C6^® 세포에 의해 생산되는 재조합 FSH 예들의 글리칸 전하의 양적 분포%를 나타낸 것이고;
도 6은 225IU Gonal f를 투여한 후 (아랫 선, 점선) 및 본 발명의 실시예를 225 IU로 투여한 후 (윗 선, 실선) 인히빈-B의 농도를 비교하여 나타낸 것이고;
도 7은 저 AMH 수준 처리군에서 회수되는 난모 세포에 대한 체중 효과를 나타낸 것이고 (실시예 10, 10A); 및
도 8은 고 AMH 수준 처리군에서 회수되는 난모 세포에 대한 체중 효과를 나타낸 것이다.

서열 선정

인간 FSH

FSH α 폴리펩타이드 유전자의 코딩부를 Fiddes and Goodman. (1981)에 따라 사용하였다. 이 서열은 AH007338로서 구축시 유전자은행에 수탁되었으며, 이 단백질 서열에 대한 다른 변이체는 존재하지 않았다. 이 서열은 본원에서 서열번호 1로 지칭된다.

FSH β 폴리펩타이드 유전자의 코딩부를 Keene et al (1989)에 따라 사용하였다. 이 서열은 구축시 유전자은행에 NM_000510으로 수탁되었으며, 이 단백질 서열에 대한 다른 변이체는 존재하지 않았다. 이 서열은 본원에서 서열번호 2로 지칭된다.

시알릴전이효소

α2,3-시알릴전이효소 - β-갈락토시드 α-2,3-시알릴전이효소 4 (α2,3-시알릴전이효소, ST3GAL4)에 대한 유전자 코딩부를 Kitagawa and Paulson (1994)에 따라 사용하였다. 이 서열은 L23767로 유전자은행에 수탁되었고, 본원에서 서열번호 3으로 지칭된다.

α2,6-시알릴전이효소 - β-갈락토스아미드 α-2,6-시알릴전이효소 1 (α2,6-시알릴전이효소, ST6GAL1)에 대한 유전자 코딩부를 Grundmann et al. (1990)에 따라 사용하였다. 이 서열은 NM_003032로 유전자은행에 수탁되었고, 본원에서 서열번호 4로 지칭된다.

실시예들

실시예 1. FSH 발현 벡터의 구축

FSH α 폴리펩타이드 (AH007338, 서열번호 1)와 FSH β 폴리펩타이드 (NM_003032, 서열번호 2)의 코딩 서열을 각각 FSHa-fw + FSHa-rev 및 FSHb-fw + FSHb-rec의 프라이머 조합을 이용하여 PCR로 증폭시켰다.

FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (서열번호 9)

FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (서열번호 10)

FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (서열번호 11)

FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (서열번호 12)

제조되는 증폭된 FSH β DNA를 제한 효소 AscI 및 HpaI으로 잘라, 네오마이신 선별 마커를 가지고 있는 CMV 구동의 포유류 발현 벡터 상의 AscI 및 HpaI에 삽입하였다. 마찬가지로, FSH α DNA를 BamHI 및 NheI으로 잘라, FSH β 폴리펩타이드 DNA를 이미 가지고 있는 발현 벡터 상의 BamHI 및 NheI 부위들에 삽입하였다.

벡터 DNA를 사용하여 E. coli의 DH5α 균주를 형질전환시켰다. 증폭하기 위해 콜로니를 취하였다. FSH α 및 β 둘다를 가진 벡터를 함유한 콜로니들을 서열 분석을 위해 선별하였으며, 이들 모두 서열번호 1 및 서열번호 2에 따른 올바른 서열을 함유하고 있었다. 플라스미드 pFSH A+B#17을 형질감염을 위해 선택하였다 (도 1).

실시예 2. ST3 발현 벡터의 구축

β-갈락토시드 α-2,3-시알릴전이효소 4의 코딩 서열 (ST3, L23767, 서열번호 3)을 프라이머 조합 2,3STfw + 2,3STrev를 이용하여 PCR로 증폭시켰다.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (서열번호 13)

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (서열번호 14)

제조되는 증폭된 ST3 DNA를 제한 효소 BamHI 및 AflII로 잘라, 히그로마이신 내성 마커를 가지고 있는 CMV 구동의 포유류 발현 벡터 상의 BamHI 및 AflII에 삽입하였다. 벡터를 전술한 바와 같이 증폭시켜, 서열분석하였다. 클론 pST3#1 (도 2)에는 서열번호 3에 따른 올바른 서열을 가지고 있었으며, 형질감염용으로 선택하였다.

실시예 3. ST6 발현 벡터의 구축

β-갈락토스아미드 α-2,6-시알릴전이효소 1 (ST6, NM_003032, 서열번호 4)의 코딩 서열을 프라이머 조합 2,6STfw + 2,6STrev를 이용하여 PCR로 증폭시켰다.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (서열번호 15)

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (서열번호 16)

제조되는 증폭된 ST6 DNA를 제한 효소 BamHI 및 AflII로 잘라, 히그로마이신 내성 마커를 가지고 있는 CMV 구동의 포유류 발현 벡터 상의 BamHI 및 AflII에 삽입하였다. 벡터를 전술한 바와 같이 증폭시켜, 서열분석하였다. 클론 pST6#11 (도 3)에는 서열번호 4에 따른 올바른 서열을 가지고 있었으며, 형질감염용으로 선택하였다.

실시예 4. PER.C6 ^® 세포에서 pFSH a+β의 안정적인 발현. 형질감염. 분리 및 클론 스크리닝

단일 플라스미드에서 FSH의 2가지 폴리펩타이드 체인들을 발현시킴으로써, FSH를 생산하는 PER.C6^® 클론들을 제작하였다 (실시예 1 참조).

안정적인 클론을 수득하기 위해, pFSH a+β 구조체와 리포좀 기반의 형질전환 물질을 사용하였다. 안정적인 클론들을 10% FCS가 첨가되고 G418이 포함된 VPRO에서 선별하였다. 형질감염 3주 후, G418 내성 클론들이 생장되었다. 이를 분리하기 위해 클론들을 선별하였다. 분리된 클론을 70-80% 컨플루언트가 될 때까지 선별 배지에서 배양하였다. 상층액을 FSH 선택적인 ELISA를 이용하여 FSH 단백질 함량을 분석하고, cAMP 누적 분석을 이용하여 클로닝된 세포주에서 FSH 수용체에 대한 약리학적 활성을 분석하였다. 기능성 단백질을 발현하는 클론들을 24웰, 6웰 및 T80 플라스크로의 배양 확대를 진행하였다.

7종의 클론들로부터 생산성 및 물질의 품질을 결정하기 위한 실험을 T80 플라스크에서 개시하여, 충분한 물질을 제조하였다. 세포를 7일간 전술한 바와 같이 보충된 배지에서 배양하고, 상층액을 회수하였다. 생산성은 FSH 선택적인 ELISA를 이용하여 확인하였다. 물질의 등전점 프로파일을 등전점 포커싱 (IEF)에 의해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 구하였다. 충분한 생산성과 품질을 나타내는 클론들을 시알릴전이효소 조작을 위해 선택하였다.

실시예 5. 시알화 수준은 α2,3-시알릴전이효소를 과다 발현하는 세포에서 증가된다. FSH를 발현하는 PER.C6 ^® 세포에서의 안정적인 pST3 발현; 형질감염, 분리 및 클론의 스크리닝.

FSH의 2가지 폴리펩타이드 체인을 이미 발현하고 있는 PER.C6^® 세포 (실시예 4)에서 개별 플라스미드 (실시예 2)로부터 α2,3-시알릴전이효소를 발현시킴으로써, 고도로 시알화된 FSH를 생산하는 PER.C6^® 클론들을 구축하였다. 실시예 4에 기술된 바와 같이 PER.C6^® 세포들로부터 구축된 클론들을, 기능성 단백질의 생산성, 양호한 증식 프로파일, 생산 및 일부 시알화를 포함한 FSH 생산을 비롯한 특징들에 대해 선별하였다. 안정적인 클론들을 실시예 4에 이미 기술된 바와 같이 구축하였다. 클론들을 분리하고, 증식시켜, 분석하였다. α2,3-시알릴전이효소 클론들을 무혈청 배지 및 현탁 조건에 적응시켰다.

전술한 바와 같이, 클론들을 FSH 선택적인 ELISA, FSH 수용체 세포주에서의 기능성 반응, IEF, 대사 소거 속도 및 스틸만 포흘리 분석을 이용하여 분석하였다. 결과는 시판 재조합 FSH (Gonal-f, Serono) 및 모 세포주 FSH PER.C6^®와 비교하였다. 대부분의 클론들에서 생산되는 FSH는, α2,3-시알릴전이효소 없이 발현되는 FSH와 비교하여, (즉, 다수의 시알산을 가진 평균 이상의 FSH 이소형에 대해) 현저하게 개선된 시알화를 가진다. 결론적으로, PER.C6^® 세포에서 시알릴전이효소와 더불어 FSH의 발현으로, FSH만 발현하는 세포에 비해, 시알화된 FSH 수준이 증가되었다.

실시예 6. 생산 및 정제에 대한 개괄

무혈청 배지에서 현탁 배양하여 PER.C6^® 세포에서 FSH를 생산하기 위한 공정을 개발하였다. 이 공정은 아래에 나타내며, FSH-생산 PER.C6^® 세포주 수종에 적용하였다.

Lowry et al. (1976)에 기술된 방법을 변형시켜 이용하여, α2,3-클론 (실시예 5)으로부터 FSH를 준비하였다.

PER.C6^®-FSH를 생산하기 위해, 세포주를 무혈청 배지, 즉, Excell 525 (JRH Biosciences)에 적응시켰다. 세포를 먼저 배양하여, T80 배양 플라스크에서 70% - 90% 컨플루언트로 단일층을 형성시켰다. 계대 배양시, 세포를 무혈청 배지 Excell 525 + 4 mM L-글루타민에 세포 밀도 0.3 x 10⁶ cells/ml로 재현탁하였다. 세포 현탁액 25 ml를 250 ml 셰이커 플라스크에 넣고, 37℃ 및 5% CO₂에서 100 rpm으로 교반하였다. 세포 밀도가 > 1 x 10⁶ cells/ml에 도달하면, 세포를 세포 밀도 0.2 또는 0.3 x 10⁶ cells/ml로 서브-배양하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 100 rpm으로 셰이커 플라스크에서 추가로 배양하였다.

FSH를 생산하기 위해, PER.C6^® 세포가 최고 세포 밀도 (통상, 배치 배양에서 > 10⁷ cells/ml)로 증식하는 것을 지원하는 무혈청 생산 배지, 즉 VPRO (JRH Biosciences)로 세포를 이동시켰다. 세포를 먼저 Excell 525에서 > 1 x 10⁶ cells/ml로 배양하고, 1000 rpm으로 5분간 스핀 다운한 다음, VPRO 배지 + 6 mM L-글루타민에 1 x 10⁶ cells/ml의 밀도로 현탁하였다. 그런 후, 세포를 셰이커 플라스크에서 7-10일간 37℃, 5% CO₂ 및 100 rpm으로 배양하였다. 이 기간 동안, 세포는 > 10⁷ cells/ml의 밀도로 증식되었다. 세포 생활성이 감소되기 시작하면 배양 배지를 회수하였다. 세포를 1000 rpm에서 5분간 스핀 다운하고, 상층액을 FSH 정량 및 정제에 사용하였다. FSH 농도는 ELISA (DRG EIA 1288)를 이용하여 결정하였다.

그런 후, FSH 정제를 Lowry et al. (1976)에 기술된 방법의 변형 방법을 이용하여 수행하였다. 전하 선택적인 크로마토그래피를 이용한 정제를 수행하여, 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 고도로 시알화된 형태를 농화시켰다.

모든 크로마토그래피 공정 동안에, 본원에 청구된 바와 같은 시알화된 FSH 형태의 농화를 RIA (DRG EIA 1288) 및/또는 IEF로 검증하였다.

실시예 7. α2,3 및 α2,6 시알산의 상대적인 양적 정량

정제된 rFSH (실시예 6)에서 α2,3 및 α2,6 시알산의 상대적인 함량 백분율을 공지 기법을 이용하여 측정하였다.

N-글리칸을 변성 조건 하에 PNGase F를 이용하여 샘플에서 해리시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 해리된 글리칸 형태들을 분리한 다음 약 음이온 교환 (WAX) 컬럼으로 분석하여 전하 분포를 확인하였다. 표지된 글리칸에 총 시알산을 결정하기 위해 2,3,6,8 시알리다제를, 2,3 시알산을 결정하기 위해 2,3 시알리다제를 처리하여, wax 컬럼으로 추가로 분석하였다.

하전된 글리칸의 상대적인 백분율을 비-소화 및 소화시킨 글리칸 풀에 존재하는 구조체들로부터 계산하여, 도 4 (샘플 8종)에 나타내었다. α2,3 시알화는 50% - 70% (예, 약 60% 또는 65%) 수준위이고, α2,6 시알화는 28 - 50%, 일반적으로 30 - 35% (예, 약 31% 또는 35%) 수준인 것으로 확인되었다.

실시예 8. 모노, 다이, 트리 및 테트라 시알화된 글리칸 구조체들의 상대적인 함량 정량

정제된 rFSH (실시예 6)에서 추출한 글리칸에서 모노, 다이, 트리 및 테트라 시알화된 구조체들의 상대적인 함량 백분율을 공지 기법을 이용하여 측정하였다.

N-글리칸을 변성 조건 하에 PNGase F를 이용하여 샘플에서 해리시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 글리칸을 변성 조건 하에 PNGase F를 이용하여 샘플에서 해리시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 해리된 글리칸 형태들을 분리한 다음 약 음이온 교환 (WAX) 컬럼으로 분석하여 시알화 분포를 확인하였다. 총 시알산을 결정하기 위해 2,3,6,8 시알리다제를, 2,3 시알산을 결정하기 위해 2,3 시알리다제를 처리한, 표지된 글리칸을, wax 컬럼으로 추가로 분석하였다. 중성, 모노-시알화된, 다이-시알화된, 트리-시알화된 및 테트라-시알화된 구조체들의 상대적인 양을 도 4에 나타낸다 (도 4에 나타낸 샘플 8종).

rFSH는 다음과 같은 상대적인 양으로 중성, 모노-시알화된, 다이-시알화된, 트리-시알화된 및 테트라-시알화된 글리칸 구조체들을 포함하였다: 중성 5-6%; 15-17% 모노-시알화; 26-30% 다이-시알화; 30-32% 트리-시알화 및 17-23% 테트라-시알화됨.

실시예 8a

(실시예 6의 방법으로 생산한) rFSH 정제 샘플 9종으로부터 추출되는, 정제 rFSH에서의 α2,6 시알산의 상대적인 함량 %를 공지 기법을 이용하여 측정하였다.

N-글리칸을 변성 조건 하에 PNGase F를 이용하여 샘플에서 해리시킨 다음, 2-아미노벤즈아미드로 표지하였다. 해리된 글리칸 형태들을 분리한 다음 약 음이온 교환 (WAX) 컬럼으로 분석하여 시알화 분포를 확인하였다. 총 시알산을 결정하기 위해 2,3,6,8 시알리다제를, 2,3 시알산을 결정하기 위해 2,3 시알리다제를 처리한, 표지된 글리칸을, wax 컬럼으로 추가로 분석하였다 (실시예 8 참조). 분석을 통해 α2,6 시알산을 계산할 수 있다.

하전된 글리칸의 상대적인 백분율을 비-소화된 및 소화된 글리칸 풀에 존재하는 구조체들로부터 계산하여, 아래 표에 나타낸다. α2,6 시알화가 25 - 50%, 일반적으로 30 - 35% 범위인 것으로 확인되었다.

(실시예 6의 방법으로 생산된) rFSH 정제 샘플 9종으로부터 추출된 글리칸에서, 바이섹팅 GlcNac, GalNac 및 1-푸코스 루이스의 상대적인 함량 %를 공지 기법을 이용하여 측정하였다. N-글리칸을 PNGase F를 이용하여 당단백질로부터 해리시키고, 2-아미노벤즈아미드 (2AB)로 표지하였다. 본 분석은 글리칸의 효소적 분해와 더불어 2차원의 (2D) HPLC 분석으로 행하였다. 검증을 위해, 글리칸을 MALDI-MS로 분석하였다. α-시알산과 말단 잔기들의 상대적인 양을, Gonal F (CHO 세포 유래 재조합 FSH) 및 Bravelle (인간 뇨 FSH)에서와 더불어 아래 표에 나타낸다.

¹ 수치 3.1은 총 ½ 푸코스 루이스임. ² 결정 안됨.

본 발명의 FSH에서 GalNac의 양은 약 44.9 - 51%이며, 평균적으로 약 47.1%임을 알 수 있다.

본 발명의 FSH에서 바이섹팅 GlcNac의 양은 약 8.7 - 13.9%이며, 평균적으로 약 10.9%임을 알 수 있다.

본 발명의 FSH에서 1 푸코스 루이스의 양은 약 16.1 - 23.3%이며, 평균적으로 약 19%임을 알 수 있다.

본 발명의 FSH에서 2 푸코스 루이스의 양은 약 1.9 - 4.4%이며, 평균적으로 약 3.7%임을 알 수 있다.

실시예 9 - FE 999049의 안전성, 허용성, 약동학적 특성, 약력학적 특성 및 면역원성을 GONAL-F와 비교하여 조사하는, 다중 투여 실험.

실험 개체군

총 48명 (각 약물 당 24명)의 건강한 여성에게, FE 999049 (실시예 6에 따라 제조된 본 발명에 따른 조성물) 14.6 ㎍ 또는 Gonal-F 16.5 ㎍을 7일간 1일 용량으로 투여하였다.

안전성 결과

FE 999049 및 GONAL-F의 다회 투여시 부작용 (AE), 활력 징후, ECG, 임상 실험 측정 및 신체 검사로 평가한 바와 같이 안전하였으며, 일반적으로 허용성이 우수하였다. 중증 부작용 또는 사망도 실험하는 동안 발생하지 않았다.

약동학적 결과

7일간 FE 999049 및 GONAL-F를 투여한 후, 다음번 주입 직전에 분석한 FSH 농도 수치는 증가되었으며, 6-7일 후에는 정상 상태 (steady state) 수준에 도달하는 것으로 보였다. 그러나, FE 999049에 대한 노출 (AUC 및 Cmax)은 Gonal-F에 비해 60% 더 높았다.

약력학적 결과

FE 999049와 GONAL-F를 투여한 후, 인히빈-B (도 6 참조), 오에스트라디올 및 프로게스테론 모두 농도가 증가하였지만, GONAL-F에 비해 FE 999049를 투여하였을 때의 증가 수준이 더 높았다. 난포의 수와 크기 분포는 GONAL-F에 비해 FE 999049에 대해 더 강력한 반응을 나타내었다.

실시예 9는, 특정량 (17-23%)의 테트라-시알화된 글리칸 구조체, 예컨대 특정량의 α2,3 시알화 및 α2,6 시알화를 가진 FSH가 현재 시판 중인 재조합 FSH 제품 보다 훨씬 더 강력하다는 것을 입증해준다.

실시예 10 - GONAL-F 대비 FE 999049의 다중 용량 실험 평가.

하기는, 시험관내 수정 (IVF) / 세포질내 정자 주입 (ICSI)에 대한 과배란 유도를 시술 중인 환자를 대상으로 FE 999049의 용량-반응 관계를 분석하는, 무작위, 대조 시험의, 분석자-맹검의, 병렬 군, 다국가, 다기관 실험을 기술한다. 환자 집단은 BMI가 18.5 - 32.0 kg/m²인 18-37세의 IVF 환자 265명으로 구성된다.

실험은 1차 종말점으로서 회수되는 난모 세포 갯수를 이용한 용량-반응 실험으로서 설계하였다. 2차 종말점은, 엔도크린 프로파일, 난포 발달, 난모 세포 수정, 배아 품질 및 처리 효능 (즉, 총 고나도트로핀 소비 및 자극 지속 기간)에 대해, 여러가지 용량의 FE 999049에 대한 정성적 및 정량적 효과를 조사할 것이다. 본 실험은 IVF/ICSI 사이클 동안 과배란 유도에 사용되었을 때, FE 999049의 임신 성공 효능을 평가하기 위해 설계된 것이다.

개체는, 실험에 사용되는 FE　999049 용량 및 GONAL-F 용량에 대해 잠재적인 미약 및 과도-반응자의 수를 최소화하고, 난소 반응과 관련된 실험 집단의 균질성을 높이기 위한, 항-뮐러 호르몬 (AMH) 평가를 비롯하여, 포함 및 배제 기준을 준수하는 지를 확인하기 위해, 임의 추출하기 전 3달 이내에 평가하였다. AMH 평가는 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트(Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용하여 측정하였다. 이 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다.

월경 주기 2-3일째에, 개체를 90 IU, 120 IU, 150 IU, 180 IU 또는 210 IU FE 999049, 또는 150 IU GONAL-F 중 어느 한가지로 치료하는 것으로 1:1:1:1:1:1로 무작위 할당하고, 난소 자극을 개시하였다. 무작위 할당은 스크리닝시 AMH의 수준에 따라 계층화하였다 [5.0 - 14.9 pmol/L (AMH 저수준) 및 15.0 - 44.9 pmol/L (AMH 고수준)).

Gonal-F는 FDA 요청으로 중량 (FbM)으로 제출되며; 따라서 ㎍ 용량으로 기재하는 것이 적절하다. Gonal-F 라벨은 600 IU/44 ㎍으로 표시되어 있으며, 이는 150 IU이 11 ㎍이라는 의미이다. 그러나, 일부 편차가 있으며, 본 실험에서 배치 증명서에는 11.3 ㎍ Gonal-F가 150 IU에 해당되는 것으로 표시되어 있다. FE 999049 용량은 생물 활성이 아닌 단백질 함량 (㎍)으로 표시된다. 따라서, FE 999049 용량은 5.2 ㎍ (90 IU), 6.9 ㎍ (120 IU), 8.6 ㎍ (150 IU), 10.3 ㎍ (180 IU) 또는 12.1 ㎍ (210 IU)이었다.

개체 및 용량 분할은 다음과 같이 착수하였다 (데이타는 개체의 수임):

	FE 999049					GONAL-F
	5.2 ㎍	6.9 ㎍	8.6 ㎍	10.3 ㎍	12.1 ㎍	11.3(11) ㎍	총
스크리닝							334
무작위 및 노출	42	45	44	45	46	43	265
AMH 고수준 계층 (15.0-44.9 pmol/L)	23	26	24	24	26	25	148 (56%)
AMH 저수준 계층 (5.0-14.9 pmol/L)	19	19	20	20	21	18	117 (44%)
Per-protocol	40	42	42	44	44	43	255

FE　999049 또는 GONAL-F의 1일 용량 수준은 자극 실험 전 기간 동안 고정된다. 자극하는 동안, 자극일 1, 4 및 6일째, 이후 적어도 2일 마다 개체를 모니터링한다. ≥15 mm인 난포 3개가 관찰되면 매일 방문한다. 최대 16일 동안 개체에게 FE　999049 또는 GONAL-F를 처리한다.

조기 LH 서지를 방지하기 위해, GnRH 길항제 (가니렐릭스 아세테이트, 오르가루트란 (ORGALUTRAN), MSD / 쉐링 푸라우 (Schering-Plough))를 매일 용량 0.25 mg으로 자극 6일째에 투여 개시할 수 있다. 최종 난포 성숙화 촉발은, 직경이 ≥17 mm인 난포가 3개 이상 관찰되는 당일에 행해진다. 직경이 ≥12 mm인 난포가 <25개이면, 재조합 hCG (융모막성 고나도트로핀 α, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono)를 250 ㎍ 투여한다. 직경이 ≥12 mm인 난포가 25-35개이면, GnRH 작용제 (트립토렐린 아세테이트, DECAPEPTYL / GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals)를 0.2 mg 투여한다. 직경이 ≥12 mm인 난포의 수 >35개로 정의되는 과도한 난소 반응이 발생한 경우, 처리를 중지한다. 자극 10일째 관찰되는 직경이 ≥10 mm인 난포의 수 <3개인 것으로 정의되는 미약한 난소 반응이 발생한 경우, 사이클을 중지시킬 수 있다.

최종 난포 성숙화를 촉발시킨 후 36시간 (±　2h)째에 난모 세포를 회수하고, IVF 및/또는 ICSI로 난모 세포를 수정시킨다. 수정과 배아 발생을 난모 세포 회수시부터 이식 당일까지 평가한다. hCG를 이용한 최종 난포 성숙화 촉발을 시술받은 개체는, 난모 세포 회수 후 5일째에, 이용가능한 최상의 품질을 가진 배반포 1개를 이식하고, 나머지 배반포들은 냉동시켰다. GnRH 작용제를 이용한 최종 난포 성숙화 촉발을 시술받은 개체는, 배아 이식을 새로운 사이클 (fresh cycle)로 수행하지 않고, 배반포들을 대신 5일째에 냉동시켰다. 난모 세포를 회수한 그날부터 임상 임신을 위해 방문하는 날까지 황체기 보조 요법을 위해, 질 프로게스테론 정제 (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 100 mg을 1일 3회로 제공한다. 배아 이식 후 13-15일째에 βhCG 검사를 수행하고, 배아 이식 후 5-6주째에 질을 통한 초음파 검사 (TVU)로 임상적인 임신을 확인한다.

결과

아래 표에 회수한 난모 세포의 수 (1차 종말점)를 나타낸다.

	FE 999049					GONAL-F
	5.2 ㎍	6.9 ㎍	8.6 ㎍	10.3 ㎍	12.1 ㎍	11.3 (11)㎍
회수한 난모 세포
전체	5.2 (3.3)	7.9 (5.9)	9.2 (4.6)	10.6 (7.0)	12.2 (5.9)	10.4 (5.2)
AMH 고수준	5.9 (3.9)	9.1 (6.4)	10.6 (4.8)	13.6 (7.8)	14.4 (5.8)	12.4 (5.4)
AMH 저수준	4.5 (2.2)	6.3 (4.9)	7.4 (3.8)	6.9 (3.6)	9.4 (4.9)	7.8 (3.4)

데이타는 평균 (SD)임.

1차 과제는 충족되었음: 회수되는 난모 세포의 수에 대한 FE 99049의 용량-반응의 유의한 상관성이 확립되었다. 이 결과는, 전체 실험 집단에서 관찰되었을 뿐만 아니라, 임의 추출에 사용된 2가지 AMH 계층 각각에서도 관찰되었다.

FE 999049에 대한 유의한 용량-반응은 모든 중요한 객관적인 약력학적 파라미터들, 예컨대, 에스트라디올, 인히빈 B 및 인히빈 A에서 확인되었다. 비슷한 ㎍ 용량 범위에서, FE 999049 이용시의 약력학적 반응은 GONAL-F를 이용한 경우보다 컸다 (결과는 미기재함).

FE 9909049에 노출시켰을 때, 혈청내 FSH 농도는 GONAL-F의 경우 보다 유의하게 높았다. 이러한 결과는, FE 999049의 PK 프로파일이 GONAL-F의 결과와 다르다는 것을 검증해준다.

FE 999049로 치료한 IVF/ICSI 환자에서의 수정율, 배반포 발생 및 임신율은 예상한 범위내였다.

FE 999049 이용시 안전성엔 문제가 없었다. 양호한 국소 허용성이 확인되었다.

추가 분석

본 출원인은 회수되는 난모 세포의 수와 관련하여 하기 기준을 충족시키는 FE 999049 용량(들)을 확인하기 위해 데이타를 추가로 분석하였다:

- 회수되는 난모 세포의 수가 8-14임

- 난모 세포가 <8개인 환자의 비율 최소화

- 난모 세포가 ≥20개인 환자의 비율 최소화

또한, 본 출원인은 체중의 영향도 조사하였다. 관련성이 있으면, 용량을 개체의 평균에 대해 ㎍/kg으로 변환한다. ㎍/kg ± 0.01 ㎍/kg 값은 회수되는 난모 세포 분포와 안전성 프로파일에 대해 모델에서 평가하고, 최적의 용량을 결정한다.

AMH 저수준 계층

표 2에 나타낸 바와 같이, 첫번째 기준 (회수되는 난모 세포의 수가 8-14개임)에 부합되는 FE 999049의 용량은 12.1 ㎍이었다 (회수되는 평균 난모 세포 수 9.4개). 난모 세포의 분포는 아래 표 3에 나타낸다.

데이타는 개체의%임.

박스 및 화살표로 나타낸 바와 같이, FE999049 용량 12.1 ㎍에서 AMH 저수준 그룹의 개체들 중 60%에서 가장 바람직한 수로 난모 세포가 회수된다. 이는 Gonal-F 대비 현저한 개선을 의미한다 (개체들 중 33%에서만 가장 바람직한 수의 난모 세포가 회수됨).

아래 표 4는 AMH 저수준 계층에서 과도한 반응 신호들을 분석한 결과를 나타낸다 (데이타는 개체의 수임). 보통 또는 중증 특성의 초기 OHSS 증상들은 없었으며, 필요한 예방적 조치가 발생하지 않았다는 것을 알 수 있으며, AMH 저수준 환자에서 FE999049 용량 12.1 ㎍ 투여에 따른 문제는 없었다.

	FE 999049					GONAL-F
	5.2 ㎍	6.9 ㎍	8.6 ㎍	10.3 ㎍	12.1 ㎍	11.3 (11) ㎍
모든 개체	19	19	20	20	21	18
초기 OHSS, mod/sev	0	0	0	0	0	0
GnRH 작용제 촉발	0	0	0	0	0	0
예방적 조치*	0	0	0	0	0	0
난모 세포 ≥15개	0	2	1	0	2	1
상기에 해당되는 모두	0	2	1	0	2	1

도 7은 다양한 용량들에서 (AMH 저수준 계층의 경우) 회수되는 난모 세포에 대한 체중 영향을 나타낸 것이다. 화살표는 12.1 ㎍ 용량에서, 체중이 45kg인 개체와 90kg인 개체로부터 회수한 난모 세포의 수를 나타낸다. (글자 박스에서) 볼 수 있는 바와 같이, 체중이 45 kg인 환자와 90 kg인 환자들 간의 난모 세포의 수 차이는 약 0.5개 미만이며, 즉, FE 999049의 용량이 12 ㎍ 이상일 때, 이 용량에서 체중에 따라 회수되는 난모 세포 수에는 유의한 차이가 존재하지 않기 때문에, AMH 저수준 환자에서는 체중에 따른 용량 조절은 필요치 않다.

즉, 본 출원인은, 인간 유래 재조합 FSH는 6 - 18 ㎍, 예컨대 9 - 14 ㎍, 예컨대 12 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량이, 혈청내 AMH가 <15 pmol/L, 예컨대 0.05 - 14.9 pmol/L, 예컨대 5.0 - 14.9 pmol/L인 환자에서 불임을 치료하는데 사용하기 적합하다는 것을 확인하였다. 상기 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

AMH 고수준 계층

표 2에 나타낸 바와 같이, FE999049의 3가지 용량들은 첫번째 기준 (회수되는 난모 세포의 수가 8-14개임)을 충족시킨다: 6.9 ㎍ (회수되는 평균 난모 세포 수 9.1), 8.6 ㎍ (회수되는 평균 난모 세포 수 10.6), 및 10.3 ㎍ (회수되는 평균 난모 세포 수 13.6).

도 8은 다양한 용량들에서 (AMH 고수준 계층의 경우) 회수되는 난모 세포에 대한 체중 효과를 나타낸다. 화살표는 6.9 ㎍, 8.6 ㎍ 및 10.3 ㎍ 용량들에서, 체중이 45kg인 개체와 90kg인 개체로부터 회수한 난모 세포의 수를 나타낸다. (글자 박스에서) 볼 수 있는 바와 같이, 용량 6.9 ㎍의 경우 체중이 45 kg인 환자에서는 90 kg인 환자와 비교하여 난모 세포 6개가 더 회수되며; 용량 8.6 ㎍의 경우 체중이 45 kg인 환자에서는 90 kg인 환자와 비교하여 난모 세포 4개가 더 회수되며; 용량 10.1 ㎍의 경우 체중이 45 kg인 환자에서는 90 kg인 환자와 비교하여 난모 세포 2.5개가 더 회수된다. 즉, FE 999049의 용량이 12 ㎍ 미만일 경우, 이들 용량에서 체중에 따라 회수되는 난모 세포 수에 유의한 차이가 존재하므로, AMH 고수준 환자에서는 체중이 용량에 영향을 미친다.

아래 표 5a는 AMH에 따른 회수되는 난모 세포 (표 2) 수에 대한 추가적인 브레이크다운을 나타낸다. 이는, 각각의 AMH 서브 계층 (박스)들에서 첫번째 기준에 부합되는 용량들을 보여준다 (회수되는 난모 세포의 수가 8-14개임).

표 5a

아래 표 5b는, 이들 서브그룹들에서, 과도한 반응 또는 작용제 촉발 중 어느 하나로 인해 처치가 중단된 환자들을 분석한 결과를 나타낸다. 예를 들어, 25-34 pmol/L AMH 계층의 경우, 용량 10.3 ㎍ 투여에 따른 과도한 반응으로 인해 환자 1명이 그만두었으며, 25-34 pmol/L AMH 계층에 속하는 환자 한명은 용량 12.1 ㎍ 투여에 따른 과도한 반응으로 인해 그만두었으며, 35-45 pmol/L AMH 계층에 속하는 환자 한명은 용량 10.3 ㎍ 투여에 따른 작용제 촉발로 그만두었으며, 35-45 pmol/L AMH 계층에 속하는 환자 한명은 용량 6.9 ㎍ 투여 후 작용제 촉발로 인해 그만두었다.

표 5b.

따라서, 투여 중지를 최소화하고 회수되는 난모 세포를 최대화하기 위해, 체중 (도 8) 및 AMH 수준에 따른 용량 맞춤 조절을 AMH 고농도 계층에 적용할 수 있음을 알 수 있다.

본 출원인들은 아래 용량들이 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공함을 알게 되었다 (kg은 환자의 체중 kg임).

아래 내용은 체중에 따른 용량 조절이 적절하지 않을 경우에 적합하다.

아래 내용은 AMH에 대한 보다 좁은 범위 기준이 필요할 경우에 적합하다.

아래 내용은 체중에 따른 용량 조절이 적절하지 않을 경우에 적합하다.

따라서, 본 출원인은, 혈청내 AMH가 <15 pmol/L, 예컨대 0.05 - 14.9 pmol/L 예컨대 5.0 - 14.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 9 - 14 ㎍, 예컨대 12 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 이 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

본 출원인은, 혈청내 AMH가 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 5 - 12.5 ㎍, 예컨대 6 - 10.5 ㎍의 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 이 용량은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

본 출원인은, 혈청내 AMH가 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 환자 체중 kg 당 0.09 - 0.19 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 본 출원인은, 혈청내 AMH가 15 - 24.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 환자 체중 kg 당 0.14 - 0.19 ㎍ (바람직하게는, 0.15 - 0.16 ㎍의 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 본 출원인은, 혈청내 AMH가 25 - 34.9 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 환자 체중 kg 당 0.11 - 0.14 ㎍ (바람직하게는, 0.12 - 0.13 ㎍의 인간 유래 재조합 FSH)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 본 출원인은, 혈청내 AMH가 ≥ 35 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 인간 유래 재조합 FSH가 환자 체중 kg 당 0.10 - 0.11 ㎍의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 이들 용량들은 OHSS 발병 위험성을 최소화하면서 효과적인 반응을 제공한다.

본 출원인은, 혈청내 AMH가 <15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위해서는, 예컨대 인간 유래 재조합 FSH를 이용하는 1차 자극 사이클 동안에, 인간 유래 재조합 FSH가 환자 체중 kg 당 0.15 - 0.21 ㎍ (예, 0.16 ㎍)의 (예, 1일) 용량 또는 이와 등가인 용량이 적합하다는 것을 알게 되었다. 그러나, 이러한 AMH 수준에서는 환자에게 체중에 따라 용량을 조절할 필요는 없다.

실시예 10 A - 개별 맞춤형 COS 프로토콜 (AMH 저농도)

선정된 환자들은 시험관내 수정 (IVF)/세포질내 정자 주입 (ICSI)을 위해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 COS를 시술 받을 예정인 환자이다. 전-처리 프로토콜은 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용한 환자의 혈청내 AMH 평가/스크리닝을 포함한다. 이러한 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 이의 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다. AMH는 다른 분석 키트 (예, Roche)를 이용하여 측정할 수 있다.

스크리닝시, AMH 수준에 따라, FE 999049의 개시 용량의 투여와는 별개로 통상적인 방식으로 COS 프로토콜을 진행한다. AMH 수준이 <14.9 pmol/L인 환자에게는 실시예 6의 방법에 따라 제조한 인간 유래 재조합 FSH 산물인 FE 999049를 1일 개시 용량 약 12 ㎍으로 투여한다. AMH 수준이 15 - 24.9 pmol/L인 환자에게는 인간 유래 재조합 FSH를 환자 체중 kg 당 1일 개시 용량 0.15 - 0.19 ㎍으로 투여한다. AMH 수준이 25 - 34.9 pmol/L인 환자에게는 인간 유래 재조합 FSH를 환자 체중 kg 당 1일 개시 용량 0.11 - 0.13 ㎍으로 투여한다. AMH 수준이 ≥ 35 pmol/L인 환자에게는 인간 유래 재조합 FSH를 환자 체중 kg 당 1일 개시 용량 0.10 - 0.11 ㎍으로 투여한다.

실시예 11 - 개별 맞춤형 COS 프로토콜

이 프로토콜의 용량들이 실시예 10A에서 보다 더 바람직하다.

선정된 환자들은 시험관내 수정 (IVF)/세포질내 정자 주입 (ICSI)을 위해 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 COS를 시술받을 예정이다. 전-처리 프로토콜은 AMH Gen-II 효소 연계된 면역흡착 분석 키트 (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas)를 이용한 환자의 혈청내 AMH 평가/스크리닝을 포함한다. 이러한 분석은 0.57 pmol/L 보다 높은 AMH 농도를 검출할 수 있으며, 이의 최소 정량 한계는 1.1 pmol/L이다.

스크리닝시, 아래 표의 AMH 수준에 따라, FE 999049의 개시 용량의 투여와는 별개로 통상적인 방식으로 COS 프로토콜을 진행한다. 이에, AMH 수준이 5 - 14.8 pmol/L인 환자에게는 실시예 6의 방법에 따라 제조한 인간 유래 재조합 FSH 산물인 FE 999049를 약 8 - 11 ㎍의 형태로, FSH 180 IU로 투여한다. AMH 수준이 30 - 44.9 pmol/L인 환자에게는 실시예 6의 방법에 따라 제조한 인간 유래 재조합 FSH인 FE 999049를 약 4 - 7 ㎍의 형태로, FSH 120 IU로 투여한다. AMH 수준을 활용할 수 없다면, 환자에게는 실시예 6의 방법에 따라 제조된 인간 유래 재조합 FSH 산물인 FE 999049를 약 6 - 11 ㎍의 형태로, FSH 120 - 180 IU로 투여한다.

도 1, 2 및 3: pFSHα/β, pST3 및 pST6 발현 벡터들의 플라스미드 지도. CMV = 사이토메갈로바이러스 프로모터, BGHp(A) = 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 서열, fl ori = 복제 fl 오리진, SV40 = 유인원 바이러스 40 프로모터, Neo = 네오마이신 내성 마커, Hyg = 히그로마이신 내성 마커, SV40 p(A) = 유인원 바이러스 40 폴리-아데닐화 서열, FSH A = 난포 자극 호르몬 α 폴리펩타이드, FSH B = 난포 자극 호르몬 β 폴리펩타이드, ST3GAL4 = α2,3-시알릴전이효소, ST6GAL1 = α2,6-시알릴전이효소, ColEl = 복제 ColEl 오리진, Amp = 암피실린 내성 마커.

서열번호 1

난포 자극 호르몬 α 폴리펩타이드

등재 번호 AH007338

FSH α의 뉴클레오티드 서열

FSH α 단백질 서열 (서열번호 5)

서열번호 2

난포 자극 호르몬 β 폴리펩타이드

등재 번호 NM_000510

FSH β의 뉴클레오티드 서열

FSH β의 단백질 서열 (서열번호 6)

서열번호 3

β-갈락토시드 α-2,3-시알릴전이효소 4

등재번호 L23767

ST3GAL4의 뉴클레오티드 서열

ST3GAL4의 단백질 서열 (서열번호 7)

서열번호 4

β-갈락토스아미드 α-2,6-시알릴전이효소 1

등재번호 NM_003032

ST6GAL1의 뉴클레오티드 서열

ST6GAL1의 단백질 서열 (서열번호 8)

SEQUENCE LISTING <110> Ferring B.V. <120> Composition For Controlled Ovarian Stimulation <130> P/66643.WO01 <150> EP 11176803.2 <151> 2011-08-08 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60 gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120 ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180 tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240 tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300 gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351 <210> 2 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc 60 tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120 atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 180 gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatatga aacagtgaga 240 gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt 300 cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 360 tactgctcct ttggtgaaat gaaagaataa 390 <210> 3 <211> 999 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtgtcctg caggctggaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctggt cgtcatggtg 60 tggtattcca tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120 aagaaggagc cgtgcctcca gggtgaggca gagagcaagg cctctaagct ctttggcaac 180 tactcccggg atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240 tctgcttacg agctgcccta tgggaccaag gggagtgagg atctgctcct ccgggtgcta 300 gccatcacca gctcctccat ccccaagaac atccagagcc tcaggtgccg ccgctgtgtg 360 gtcgtgggga acgggcaccg gctgcggaac agctcactgg gagatgccat caacaagtac 420 gatgtggtca tcagattgaa caatgcccca gtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480 aagaccacca tgcgtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa agtagaaaac 540 aacccagaca cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600 accatcctga gtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660 tgggatgtca atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgcagct 720 gacaaactgc tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780 ggcctgttgg ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tggtgcacat tgccggcttt 840 ggctacccag acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagca gatcacgctc 900 aagtccatgg cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960 ctggagatgg gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999 <210> 4 <211> 1221 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgattcaca ccaacctgaa gaaaaagttc agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt 60 gcagtcatct gtgtgtggaa ggaaaagaag aaagggagtt actatgattc ctttaaattg 120 caaaccaagg aattccaggt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc 180 cagtctgtat cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt 240 ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc 300 tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagatctgga agaattacct aagcatgaac 360 aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420 cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480 aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc aaggagagca ttaggaccaa ggctgggcct 540 tggggcaggt gtgctgttgt gtcgtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600 gaaatcgatg atcatgacgc agtcctgagg tttaatgggg cacccacagc caacttccaa 660 caagatgtgg gcacaaaaac taccattcgc ctgatgaact ctcagttggt taccacagag 720 aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg ggacccatct 780 gtataccact cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840 tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900 ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960 ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020 tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gacgtgtgct actactacca gaagttcttc 1080 gatagtgcct gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140 catctcaacc agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200 ttccggacca ttcactgcta a 1221 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser 1 5 10 15 Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro 20 25 30 Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu 65 70 75 80 Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly 85 90 95 Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr 100 105 110 Tyr His Lys Ser 115 <210> 6 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile 1 5 10 15 Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys 20 25 30 Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly 35 40 45 Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys 50 55 60 Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg 65 70 75 80 Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys 100 105 110 Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys 115 120 125 Glu <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile Glu 20 25 30 Leu Phe Tyr Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly 35 40 45 Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp 50 55 60 Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro 65 70 75 80 Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu 85 90 95 Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln 100 105 110 Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu 115 120 125 Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile 130 135 140 Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro 165 170 175 Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys 180 185 190 Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg 195 200 205 Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn 210 215 220 Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala 225 230 235 240 Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln 245 250 255 Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys 260 265 270 Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys 275 280 285 Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala 290 295 300 Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met 305 310 315 320 Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe 325 330 <210> 8 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu 35 40 45 Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser 50 55 60 Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser 65 70 75 80 Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp 85 90 95 Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile 100 105 110 Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly 115 120 125 Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu 130 135 140 Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe 145 150 155 160 Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr 165 170 175 Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val 195 200 205 Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly 210 215 220 Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu 225 230 235 240 Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val 245 250 255 Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn 260 265 270 Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His 275 280 285 Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu 290 295 300 Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro 305 310 315 320 Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp 325 330 335 Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val 340 345 350 Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala 355 360 365 Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln 370 375 380 Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly 385 390 395 400 Phe Arg Thr Ile His Cys 405 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHa-fw <400> 9 ccaggatccg ccaccatgga ttactacaga aaaatatgc 39 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHa-rev <400> 10 ggatggctag cttaagattt gtgataataa c 31 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHb-fw <400> 11 ccaggcgcgc caccatgaag acactccagt ttttc 35 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer FSHb-rev <400> 12 ccgggttaac ttattattct ttcatttcac caaagg 36 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,3STfw <400> 13 ccaggatccg ccaccatgtg tcctgcaggc tggaagc 37 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,3STrev <400> 14 tttttttctt aagtcagaag gacgtgaggt tcttg 35 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,6STfw <400> 15 ccaggatccg ccaccatgat tcacaccaac ctgaag 36 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 2,6STrev <400> 16 tttttttctt aagttagcag tgaatggtcc gg 32

Claims (26)

1. 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
   상기 산물이 재조합 FSH를 11 내지 13 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가의 1일 용량으로 포함하며, 상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는 산물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 산물이 재조합 FSH를 12 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가의 1일 용량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 산물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 불임 치료가 상기 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계, 및 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 산물.
4. 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
   상기 산물이 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 0.09 내지 0.19 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가의 1일 용량으로 투여하기 위한 것이며, 상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화임을 특징으로 하는 산물.
5. 제4항에 있어서,
   혈청내 AMH 수준이 15 내지 24.9 pmol/L인 환자를 치료하는데 사용하기 위한 것이며,
   상기 산물이 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 0.14 내지 0.19 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가의 1일 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 산물.
6. 제4항에 있어서,
   혈청내 AMH 수준이 25 내지 34.9 pmol/L인 환자를 치료하기 위한 것이며,
   상기 산물이 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.11 내지 0.14 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가인 1일 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 산물.
7. 제4항에 있어서,
   혈청내 AMH 수준이 ≥35 pmol/L인 환자를 치료하는데 사용하기 위한 것이며,
   상기 산물이 재조합 FSH를 환자의 체중 kg 당 0.10 내지 0.11 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가인 1일 용량으로 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 산물.
8. 제4항에 있어서,
   상기 불임 치료가 상기 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계, 및 정해진 혈청내 AMH 수준을 가진 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 산물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서,
   상기 FSH가 모노-, 다이-, 트리- 및 테트라-시알화된 글리칸 구조체를 포함하며,
   시알화된 글리칸 구조체들 중 15 - 24% 또는 17 - 23%가 테트라시알화된 글리칸 구조체인 것을 특징으로 하는 산물.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 산물이 Na⁺-염, K⁺-염 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 알칼리 금속 양이온을 포함하는 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 산물.
11. 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 재조합 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 0.09 내지 0.19 ㎍의 1일 용량 또는 이와 등가의 1일 용량으로 투여하기 위한 것이며, 상기 불임 치료가 상기 환자의 혈청내 AMH 수준을 확인하는 단계, 및 정해진 혈청내 AMH 수준을 가진 환자에게 상기 용량을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
12. 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L이며 난소 과잉자극 증후군 (OHSS)의 위험성이 있는 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 1일 0.09 내지 0.19 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 투여하기 위한 것이며, 상기 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
13. 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 GnRH 작용제의 투여 12 내지 16일 후, 재조합 FSH를 1일 11 내지 13 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 투여하기 위한 것이고,
    상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
14. 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 GnRH 작용제의 투여 12 내지 16일 후, 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 1일 0.09 내지 0.19 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 투여하기 위한 것이고,
    상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
15. 혈청내 AMH 수준이 <15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 GnRH 길항제의 투여와 함께, 재조합 FSH를 1일 11 내지 13 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 투여하기 위한 것이고,
    상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
16. 혈청내 AMH 수준이 ≥15 pmol/L인 환자의 불임 치료에 사용하기 위한 난포 자극 호르몬 (FSH)을 포함하는 산물(product)로서,
    상기 산물이 GnRH 길항제의 투여와 함께, 재조합 FSH를 상기 환자의 체중 kg 당 1일 0.09 내지 0.19 ㎍의 용량 또는 이와 등가의 용량으로 투여하기 위한 것이고,
    상기 재조합 FSH 가 α2,3- 및 α2,6-시알화를 포함하되, 총 시알화의 1% 내지 50%가 α2,6-시알화이고 총 시알화의 50% 내지 99%가 α2,3-시알화인 것을 특징으로 하는, 산물.
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