BR122020001644B1 - Composição compreendendo hormônio folículo estimulante recombinante e uso do mesmo para o tratamento de infertilidade - Google Patents
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
Abstract
A presente invenção refere-se a preparações incluindo FSH, por exemplo, FSH recombinante, para uso no tratamento de infertilidade.
Description
[001] A presente invenção refere-se a composições e produtos farmacêuticos para o tratamento de infertilidade.
[002] Técnicas de tecnologia de reprodução assistida (ART) tais como fertilização em vitro (IVF) são bem conhecidas. As referidas técnicas de ART em geral requerem uma etapa de estimulação ovariana controlada (COS), em que um grupo de folículos é estimulado até a completa maturidade. Regimes de COS padrão incluem a administração de gonadotrofinas, tais como hormônio folículo estimulante (FSH) isoladamente ou em combinação com a atividade do hormônio luteini- zante (LH) para estimular o desenvolvimento folicular, normalmente com a administração de um análogo de GnRH antes de e/ou durante a estimulação para evitar ondeamento prematuro de LH. As composições farmacêuticas em geral usadas para COS incluem hormônio folí- culo estimulante recombinante (rFSH), HSF derivado de urina, preparações de FSH recombinante + LH, menotrofina derivada de urina [go- nadotrofina de menopausa humana (hMG)] e gonadotrofina de menopausa humana altamente purificada (HP-hMG). IVF pode estar associado ao risco de síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS), que pode ser prejudicial á vida em casos graves.
[003] A capacidade de prever o potencial de resposta da mulher à estimulação ovariana controlada (COS) pode permitir o desenvolvimento de protocolos de COS individualizados. Isso pode, por exemplo, reduzir o risco de OHSS em mulheres previstas terem uma excessiva resposta à estimulação, e/ou aprimorar as respostas à gravidez em mulheres classificadas como com respostas pobres. A concentração no soro de hormônio anti-Müllerian (AMH) é agora estabelecida como um marcador confiável de reserva ovariana. Níveis reduzidos de AMH estão correlacioandos com reduzida resposta ovariana a gonadotrofi- nas durante COS. Adicionalmente, níveis elevados de AMH são uma boa previsão de excessiva resposta ovariana, e um indicador de risco de OHSS.
[004] Em um estudo preliminar de mulheres abaixo de 35 anos de idade se submetendo a ART, o algoritmo de dodagem de CONSORT (incorporando FSH basal, BMI, idade e AFC) foi usado para prever a dose de partida ótima de FSH para COS em mulher em risco de desenvolver OHSS (Olivennes et. al., 2009). A individualização da dose levou a um rendimento adequado de oócito e boa taxa de gravidez. Entretanto, houveram altos coeficientes de cancelamentos no grupo de baixa dose (75 IU FSH) em virtude de resposta inadequada, e OHSS ocorreu em uma significante proproção dose pacientes.
[005] Há portanto uma necessidade de uma composição para uso em protocolos de COS individualizados que proporcionam resposta adequada a estimulação, e/ou reduzido risco de OHSS.
[006] Como idnicado acima, protocolos COS padrão podem incluir a administração de FSH. FSH é naturalmente secretado pela glândula pituitária anterior e funciona para suportar o desenvolvimento folicu- lar e a ovulação. FSH compreende uma sub-unidade alfa de 92 amino ácidos, também comum aos outros hormônios de glicoproteína LH e CG, e uma sub-unidade beta de 111 amino ácidos única de FSH que confere a especificidade biológica do hormônio (Pierce e Parsons, 1981). Cada sub-unidade é modificada por pós translação pela adição de resíduos de carbohidrato complexos. Ambas as sub-unidades portam 2 campor para a fixação de glicano n-ligado, a sub-unidade alfa nos amino ácidos 52 e 78 e a sub-unidade beta nos resíduos de amino ácido 7 e 24 (Rathnam e Saxena, 1975, Saxena e Rathnam, 1976). FSH é assim glicosilado em cerca de 30% por massa (Dias e Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).
[007] FSH purificado a partir de urina humana pós menopausa foi usado por muitos anos em tratamento de infertilidade; não só para promover a ovulação em reprodução natural mas também para proporcionar oócitos para tecnologias de reprodução assistida. Os produtos de FSH recombinante (rFSH) atualmente aprovados para estimulação ovariana, tais como folitropina alfa (GONAL-F, Merck Serono / EMD Serono) e folitropina beta (PUREGON / FOLLISTIM, MSD / Schering-Plough), são derivados a partir de linhagem celular de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Atualmente, nenhum produto rFSH a partir de uma linhagem celular humana está comercialmente oferecido.
[008] Há considerável heterogeneidade associada com as preparações de FSH que se refere às diferenças nas quantidades das várias isoformas presentes. Isoformas de FSH individuais exibem idênticas sequências de amino ácido mas diferem na extensão de que as mesmas são pós-translacionalmente modificadas; isoformas particulares são caracterizadas por heterogeneidade das estruturas de ramificação de carboidrato e quantidades diferentes de incorporação de ácido siá- lico (um açúcar terminal), ambas as quais parecem influenciar a bioati- vidade da isoforma específica.
[009] A glicosilação do FSH natural é altamente complexa. Os glicanos em FSH de pituitária naturalmente derivados podem conter uma ampla faixa de estruturas que podem incluir combinações de gli- canos mono-, bi-, tri- e tetra-ramificados (Pierce e Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger e Green, 1988). Os glicanos podem portar modificações adicionais: fucosilação de núcleo, bisecção de gluco- samina, cadeias estendidas com acetil lactosamina, sialilação parcial ou completa, sialilação com ligações α2,3 e α2,6, e galactosamina sulfatada substituída por galactose (Dalpathado et al., 2006). Adicional- mentemore, há diferenças entre as distribuições de estruturas de gli- cano em campos de glicosilação individuais. Um nível de complexidade de glicano comparável foi observado em derivados de FSH a partir do soro de indivíduos e a partir da urina de mulher pós-menopausa (Wide et al., 2007).
[0010] A glicosilação de produtos de FSH recombinante reflete a faixa de glicosil-transferases presentes na linhagem da célula hospedeira. Os produtos rFSH comercialmente oferecidos são derivados a partir de engineered Células ovarianas de Hamster Chinês (Células CHO). A faixa de modificações de glicano em rFSH derivado de célula CHO é mais limitada do que as encontradas nos produtos naturais. Exemplos da heterogeneidade de glicano reduzida encontrada em rFSH derivado de célula CHO incluem a falta de bisecção de Gluco- samina e um teor reduzido de fucosilação de núcleo e extensões de acetil lactosamina (Hard et al., 1990). Em adição, células CHO são apenas capazes de adicionar ácido siálico usando a ligação α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); rFSH derivado de célula CHO apenas inclui ácido siálico ligado a α2,3 e não inclui acido siálico ligado a α2,6.
[0011] Assim FSH derivado de célula CHO é diferente a partir de FSH produzido naturalmente (por exemplo, FSH de pituitária humana/ de soro/ urinário) que contém glicanos com uma mistura de ácido siáli- co ligado a α2,3 e α2,6, com a predominance do formador.
[0012] Adicionalmente, foi também demonstrado que a preparação de FSH recombinante comercialmente oferecido difere nas quantidades de FSH com um ponto isoelétrico (pI) de abaixo de 4 (considerado as isoformas acídicas) quando comparado ao FSH de pituitária, de soro ou de urina pós-menopausa (Ulloa-Aguirre et al. 1995). A quantidade de isoformas acídicas nas preparações urinárias foi muito mais alta em comparação aos produtos recombinantes derivados de célula CHO, Gonal-f (Merck Serono) e Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004). Isso deve refletir um baixo teor molar de ácido siálico no FSH recombinante uma vez que o teor de glicano negativamente carregado modificado com sulfato é baixo em FSH recombinante. O mais baixo teor de ácido siálico, comparado ao FSH natural, é uma característica de ambos os produtos de FSH recombinante comercialmente oferecidos e pode refletir uma limitação no processo de fabricação.
[0013] A vida na circulação do FSH foi documentada para os materiais a partir de uma variedade de fontes. Alguns dos referidos materiais foram fracionados com base na carga molecular geral, como caracterizado por sua pI, na qual mais ácido equivale a uma carga negativa mais alta. Como anteriormente determinado o maior contribuinte para carga molecular geral é o teor siálico total teor de cada molécula de FSH. Por exemplo, rFSH (Organon) tem um teor de ácido siálico de em torno de 8 mol/mol, enquanto que FSH derivado de urina tem um teor de ácido siálico mais elevado (de Leeuw et al. 1996). Os coeficientes de depuração plasmática correspondentes no rato são 0,34 e 0,14 mL/min (Ulloa-Aguirre et al. 2003). Em outro exemplo onde uma amostra de FSH recombinante foi fracionada em frações de pl alta e baixa, a potência em vivo da fração de pl alta (teor mais baixo de ácido siálico) foi reduzida e a mesma tinha uma meia vida plasmática mais curta (D’Antonio et al. 1999). Foi também reportado que o FSH mais básico circulando durante os últimos estágios do ciclo de ovulação é em virtude da regulação a menor de α2,3 sialil-transferase na pituitária anterior que é caused por níveis mais altos de estradiol (Damian- Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). Resultados para a α2,6 sialil-transferase não foram reportados.
[0014] Assim, como determinado acima, proteínas recombinants expressas usando o sistema CHO vão diferir a partir de suas contra- partes naturais em seus tipos de ligações de ácido siálico terminal. Es- sa é uma importante consideração na produção de produtos biológicos para uso farmacêutico uma vez que as frações de carboidrato podem contribuir para os atributos farmacológicos da molécula.
[0015] As presentes requerentes desenvolveram um FSH recom- binante derivado de humano que é o assunto do Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB2009/000978, publicada como WO2009/127826A. FSH recombinante com uma mistura de ambos ácido siálico ligado a α2,3 e α2,6 foi produzido por engenharia genética da linhagem celular humana para expressar não só rFSH mas também α2,3 sialiltransferase. O produto expressado é altamente acídico e porta uma mistura de ambos os ácidos siálicos ligados a α2,3- e α2,6; o último proporcionado apfa atividade de sialil transferase endógena. Foi observado que o tipo de ligação a ácido siálico, α2,3- ou α2,6-, pode ter uma dramática influência na depuração biológica de FSH. FSH recombinante com uma mistura de ambos ácido siálico ligado a α2,3 e α2,6 tem duas vantagens em relação ao rFSH expresso em células CHO convencionais: primeiro o material é mais altamente sialilada em virtude das atividades combinadas das duas sialiltransfe- rases; e segundo o material mais proximamente se assemelha ao FSH natural. Isso deve ser mais biologicamente apropriado comparado um produtos recombinantes derivados de célula CHO que produziram apenas ácido siálico ligado a α2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) e têm reduzido teor de ácido siálico (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).
[0016] O produto rFSH descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB2009/000978 contém frações de glicano ramificadas. FSH compreende glicanos (fixados ás glicoproteínas de FSH) e os referidos glicanos podem conter uma grande variedade de estruturas. Como é bem conhecido na técnica, a ramificação (de um glicano) pode ocorrer com o resultado de que o glicano pode ter 1, 2, 3, 4 ou mais resíduos terminais de açúcar ou "ramificação"; glicanos com 1, 2, 3 ou 4 resíduos terminais de açúcar ou "ramificação" são referidos respectivamente como estruturas mono-ramificadas, di-ramificadas, tri- ramificadas ou tetra-ramificadas. Glicanos podem ter presença de siali- lação nas estruturas mono-ramificadas e/ou di-ramificadas e/ou tri- ramificadas e/ou tetra-ramificadas. Um exemplo de rFSH descrito no Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB2009/000978 inclui as estruturas mono-sialiladas, di-sialiladas, tri- sialiladas e tetra-sialiladas de glicano com relativas quantidades como a seguir: 9-15% de mono- sialilada; 27 - 30% de di--sialilada; 30 - 36% de tri--sialilada e 25 - 29 % de tetra--sialilada. Como é bem conhecido, uma estrutura de glicano mono-sialilada porta um resíduo de ácido siálico; uma estrutura de gli- cano di-sialilada porta dois resíduos de ácido siálico; uma estrutura de glicano tri-sialilada porta três resíduos de ácido siálico; e uma estrutura de glicano tetra-sialilada porta quatro resíduos de ácido siálico. Aqui, a terminologia tal como "X% de mono-sialilada", "X% de di-sialilada", "X% de tri-sialilada" ou "X% de tetra-sialilada" se refere ao número de estruturas de glicano em FSH que são mono-, di, tri ou tetra sialilada (respectivamente), expresso como um percentual (X%) do número total de estruturas de glicano no FSH que são sialiladas em qualquer modo (porta ácido siálico). Assim, a frase "estruturas de glicano 30 - 36% de tri-sialiladas" quer dizer que, do número total de estruturas de glicano no FSH que porta resíduos de ácido siálico (ou seja, são siali- ladas), 30 a 36% das referidas estruturas de glicano são tri sialiladas (portam três resíduos de ácido siálico). As requerentes surpreendentemente observaram que FSH tendo uma quantidade específica de estruturas de glicano tetra-sialiladas (que é diferente daquela do exemplo do produto rFSH descrito em PCT/GB2009/000978 mencionado acima) é marcadamente mais potente do que os produtos de FSH recombinantes que estão atualmente no mercado. A sequência de amino ácido dos produtos das requerentes é a sequência nativa e é idêntica ao FSH humano natural e produtos de rFSH derivados de CHO existentes. Entretanto, as presentes requerentes observaram que produtos de FSH recombinante derivados de humano (isto é, FSH re- combinante produzido ou expresso em uma linhagem celular humana por exemplo, produzido por engenharia genética da linhagem celular humana) que tem uma mistura de ambos ácido siálico ligado a α2,3 e α2,6 e/ou a quantidade específica de estruturas de glicano tetra- sialiladas pode ser particularmente eficaz quando utilisada em protocolos COS (por exemplo, individualizada).
[0017] De acordo com a presente invenção em um primeiro aspecto é proporcionado um produto (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente (por exemplo, um paciente tendo um nível de AMH no soro de 0,05 pmol/L ou acima, por exemplo, 0,5 pmol/L ou acima), em que o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a, 1-24 μg, por exemplo, 2-24 μg, por exemplo, 2 a 15 μg, de FSH recombinante derivado de humano. Preferivelmente o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a, 4,5 a 12,5 μg, por exemplo, 5 a 12,5 μg, por exemplo, 6 a 12,5 μg, por exemplo, 6,3 a 10,5 μg, de FSH recombinante derivado de humano.
[0018] De acordo com a presente invenção é proporcionado um produto (por exemplo, a composição farmacêutica) compreendendo hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L (por exemplo, 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L), em que o produto compreende uma dose (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 9 a 14 μg, por exemplo, 11 a 13 μg, por exemplo, 12 μg de FSH recombinan- te derivado de humano. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinan- te ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS. Preferivelmente o tratamento de infertilidade compreendendo uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L (por exemplo, 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L).
[0019] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicio nal é proporcionado um produto (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L, em que o produto compreende uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12,5 μg, por exemplo, 6 a 10,5 μg de FSH recombinante derivado de humano. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS. Preferivelmente o tratamento de infertilidade compreendendo uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L. Em uma modalidade, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12 μg, por exemplo, 7 a 12 μg, por exemplo, 8,7 a 10 μg, de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 9 a 10 μg de FSH recombinante derivado de humano). Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L. Em outra modalidade, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12 μg, por exemplo, 6 a 9 μg, por exemplo, 7 a 8 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 7,3 a 8 μg de FSH recombinante derivado de humano). Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L. Em outra modalidade, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 11 μg, por exemplo, 6,3 a 7 μg, de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 6 a 7 μg de FSH recombinante derivado de humano). Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L.
[0020] As doses acima podem ser para o tratamento de infertilidade no primeiro protoclo de estimulação do paciente (indivíduo). Será observado que para ciclos de estimulação adicionais, as doses podem ser ajustadas de acordo com a resposta ovariana atual no primeiro ciclo.
[0021] As requerentes observaram que é em geral necessário se recuperar na região de nove oócitos de modo a permitir a seleção de dois oócitos de alta qualidade para transferência.
[0022] As requerentes observaram que para indivíduos tendo baixo AMH (AMH < 15 pmol/L por litro) uma dose relativamente alta de FSH recombinante é necessária (por exemplo, 12 μg) para alcançar isso. Nessa dose, 8 a 14 oócitos serão recuperados a partir de 60% dos indivíduos com baixo AMH. Isso é um aprimoramento inesperado e significativo no tratamento dos indivíduos com baixo AMH tratados com 150 IU Gonal-f, onde 8 a 14 oócitos são recuperados a partir de apenas 33% dos indivíduos. As requerentes observaram que não há necessidade de ajustar a referida dose de acordo com o peso corporal do paciente.
[0023] Entretanto, 60 % da população (e 80% de mulheres abaixo dos 30 tratados por infertilidade) têm alta AMH (ou seja, AMH de >15 pmol/L). Para os referidos indivíduos é em geral relativamente certo se recuperar uma média de 9 a 11 oócitos; o problema com os protocolos de estimulação é o risco de OHSS. As requerentes observaram que em pacientes dosados com baixas doses de FSH recombinante humano há uma relação entre oócitos recuperados e peso corporal do indivíduo. Isso quer dizer que pode haver um risco associado com o tratamento com uma dose fixa de FSH (que é usual na técnica). As presentes requerentes estabeleceram uma relação entre dose de FSH e nível de AMH e peso do indivíduo que proporciona um perfil de segu-rança aprimorado (reduzido risco de OHSS) com aceitável ou aprimorada recuperação de oócito comparado aos protocolos de tratamento conhecidos (vide exemplo 10).
[0024] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um produto (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L, em que o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,09 a 0,19 μg (por exemplo, 0,09 a 0,17 μg) de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente. Preferivelmente o tratamento de infertilidade compreende uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L. Em uma modalidade, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,15 a 0,16 μg de FSH recombi- nante derivado de humano) por kg de peso corporal do paciente. Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L. Em outra modalidade, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,12 a 0,13 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do paciente. Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L. Em ainda uma modalidade adicional, o produto é para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L, e o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH re- combinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente. Na presente modalidade, o tratamento de infertilidade pode compreender uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. As doses proprocionam uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimizam o risco de OHSS.
[0025] As doses acima podem ser para o tratamento de infertilidade no primeiro protoclo de estimulação do paciente (indivíduo). Será observado que para ciclos de estimulação adicionais, as doses podem ser ajustadas de acordo com a resposta ovariana atual no primeiro ciclo.
[0026] De acordo com a presente invenção em aidna um aspect adicional é proporcionado um produto (por exemplo, uma composição farmacêutica) compreendendo hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L, em que o produto é para administração a uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,15 a 0,21 μg, (por exemplo, 0,19 a 0,21 μg) de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente. Preferivelmente o tratamento de infertilidade compreende uma etapa de determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro do paciente, e administrar a dose a um paciente tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L.
[0027] Entretanto, não é necessário que pacientes tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L sejam dosados por peso corporal. Será observado que as referidas doses podem ser prontamente convertidas para tratar pacientes com dosagem de acordo com seu BMI, usando conversões bem conhecidas na técnica.
[0028] O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro de 5,0 - 14,9 pmol/L, em que o produto compreende uma dose de, ou dose equivalente a, 6 a 18 μg, por exemplo, 8 a 11 μg, por exemplo, 8,5 a 10,2 μg de FSH recombinante derivado de humano. O produto pode ser para uso no tratamento de infertilidade em um paci- ente tendo AMH no soro 15,0 - 29,9 pmol/L, em que o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a, 4,8 a 15 μg, por exemplo, 6 a 9 μg, por exemplo, 6,8 a 8,5 μg de FSH recombinante derivado de humano. O produto pode ser para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro 30 - 44,9 pmol/L, em que o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a, 3,6 a 12 μg, por exemplo, 4 a 7 μg, por exemplo, 5,1 a 6,8 μg de FSH recombinante derivado de humano. O produto pode ser para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro 45 pmol/L ou mais, em que o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a, 2 a 9 μg, por exemplo, 2,4 a 9 μg (por exemplo, 3,4 a 5,1 μg) ou 2 a 5 μg de FSH recombinante derivado de humano. O produto pode compreender hormônio folículo estimulante (FSH) para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro de 5 pmol/L ou menos, em que o produto compreende uma dose de, ou uma dose equivalente a 7,2 a 24 μg, por exemplo, 10 a 15 μg por exemplo, 10,2 a 13,6 μg, de FSH recombinante derivado de humano. O produto pode ser para uso no tratamento de infertilidade em um paciente em que o produto compreende uma dose de, ou dose equivalente a, 4,8 a 18 μg, por exemplo, 6 a 11 μg, por exemplo, 6,8 a 10,2 μg de FSH recombinante derivado de humano. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano.
[0029] Preferivelmente o rFSH (por exemplo, linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano) inclui α2,3- e α2,6 sialilação. O FSH (rFSH) para uso de acordo com a presente invenção pode ter 1% a 99% da sialilação total sendo a2,3-sialilação. O FSH (rFSH) de acordo com a presente invenção pode ter 1% a 99% da sialilação total sendo a2,6-sialilação. Preferivelmente, 50 a 70%, por exemplo, 60 a 69%, por exemplo, cerca de 65%, da sialilação total é a2,3-sialilação. Preferivelmente 25 a 50%, por exemplo, 30 a 50 %, por exemplo, 31 a 38%, por exemplo, cerca de 35%, da sialilação total é asialilação 2,6.
[0030] Preferivelmente o rFSH (por exemplo, linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano) inclui estruturas de glicano mono-, di-, tri- e tetra-sialiladas, em que 15-24%, por exemplo, 17-23% das estruturas de glicano sialilada são estruturas de glicano tetrasiali- ladas (por exemplo, como mostrado por análise de WAX de glicanos carregados, como determinado nos Exemplos abaixo). O FSH compreende glicanos (fixados às glicoproteínas de FSH). É bem conhecido que os glicanos em FSH podem conter uma grande variedade de estruturas. As referidas podem incluir combinações de glicanos mono, bi, tri e tetra-ramificados. Aqui, a terminologia tal como "X% das estruturas de glicano sialilada são estruturas de glicano tetrasialiladas" se refere ao número de estruturas de glicano no FSH que são tetra sialila- das, isto é, portam quatro resíduos de ácido siálico, expresso como o percenetual (X%) do número total de estruturas de glicano no FSH que são sialiladas em qualquer modo (portam ácido siálico). Assim, a frase "15-24% das estruturas de glicano sialilada são estruturas de glicano tetrasialiladas" quer dizer que, do número total de estruturas de glicano no FSH que porta resíduos de ácido siálico (ou seja, são sialiladas), 15 a 24% das referidas estruturas de glicano são tetra sialiladas (portam quatro resíduos de ácido siálico).
[0031] O rFSH pode estar presente como uma única isoforma ou como uma mistura de isoformas.
[0032] As requerentes observaram que protocolos COS "individualizados" em que doses específicas de FSH recombinante tendo características específicas são usadas para tratar pacientes com base em seus níveis específicos de AMH, desse modo qumentando a probabilidade de resposta adequada à estimulação (por exemplo, em pacientes tendo uma baixo resposta potential), e/ou reduzido risco de OHSS (por exemplo, em pacientes classificados como de resposta elevada ou ex-cessiva).
[0033] O nível de AMH no soro pode ser determinado (por exem plo, medido) por qualquer método conhecido na técnica. Preferivelmente o nível de AMH no soro é medido usando o teste de imunoab- sorção ligado a enzima AMH Gen-II, um kit (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Esse teste pode detectar as concentrações de AMH de mais do que 0,57 pmol/L com um limite mínimo de quantificação de 1,1 pmol/L. Outros testes podem ser usados.
[0034] Aqui, os valores de AMH no soro são em geral recitados em termos de pmol/L. Isso pode ser convertido em ng/mL usando a equação de conversão 1ng/mL AMH = 7.1 pmol/L AMH.
[0035] Aqui os termos "paciente" e "indivíduo" são usados inter- cambiavelmente.
[0036] O produto (por exemplo, composição farmacêutica) preferivelmente compreende uma dose diária de, ou uma dose diária equivalente a, as quantidades de derivados de rFSH humano definidos acima, aqui, e nas reivindicações. A dose (diária) pode ser uma dose inicial (isto é, a mesma pode ser reduzida, aumentada, ou mantida durante o tratamento).
[0037] O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para a administração (diária) de FSH iniciando no dia um do tratamento e continuando por sete a treze dias, por exemplo, nove a treze dias, por exemplo, 10 a 13 dias, por exemplo, 10 a 11 dias. O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para administração 12 a 16, por exemplo, 13 a 15, por exemplo, 14 dias após a administração de (por exemplo, após o início da administração de, por exemplo, após o início da administração diária) de um agonista GnRH (por exemplo, Synarel, Lupron, Decapeptil). O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para administração com um agonista GnRH. O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para administração antes da administração de um antagonista GnRH (por exemplo, ganirelix, cetrorelix), por exemplo, para administração cinco ou seis dias antes da administração de um antagonista GnRH. O produto (por exemplo, composição farmacêutica) pode ser para administração com um antagonista GnRH. Preferivelmente o produto (por exemplo, composição farmacêutica) é para administração antes da administração de uma alta dose (ovulatória) de hCG (por exemplo, 4,000 a 11,000 IU hCG, por exemplo, 5,000 IU hCG, 10,000 IU hCG etc.; ou 150 a 350 microgramas de hCG recombinante, por exemplo, 250 microgramas de hCG recombinante) para induzir a maturação foli- cular final.
[0038] Será observado que o produto pode ser para dosagem em frequências mais (ou menos) do que diária, em cujo caso as doses relevantes serão equivalentes às doses (diárias) especificadas aqui.
[0039] Aqui o termo "tratamento de infertilidade" inclui tratamento de infertilidade por estimulação ovariana controlada (COS) ou métodos que incluem uma etapa ou estágio de estimulação ovariana controlada (COS), por exemplo, Inseminação Intra Uterina (IUI), fertilização em vitro (IVF), ou injeção de esperma intracitoplasmático (ICSI). O termo "tratamento de infertilidade" inclui tratamento de infertilidade por indução de ovulação (OI) ou por métodos que incluem uma etapa ou estágio de indução de ovulação (OI). O termo "tratamento de infertilidade" inclui tratamento de infertilidade em um indivíduo tendo infertilidade tubal ou inexplicada, incluindo tratamento de infertilidade em um indivíduo tendo endometriose, por exemplo, endometrioses de estágio I ou estágio II, e/ou em um indivíduo tendo infertilidade anovulatória, por exemplo, infertilidade anovulatória do tipo II WHO, e/ou em um indivíduo com um parceiro com infertilidade de fator masculino. O produto (ou composição) pode ser for (uso em) o tratamento de infertilidade (e/ou para estimulação ovariana controlada) em um indivíduo tendo endometriose, por exemplo, em um indivíduo tendo endometrioses de estágio I ou estágio II, como definido pelo Sistema de classificação da The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) para os vários estágios de endometriose, (stage IV o mais severo; estágio I o menos severo) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril 1997; 67,817 821.].
[0040] O produto (composição) pode ser para (uso em) o trata mento de infertilidade (e/ou para estimulação ovariana controlada) em um indivíduo tendo nível de FSH normal no soro de 1 a 16 IU/L, por exemplo, 1 a 12 IU/L, na fase folicular precose.
[0041] O produto (composição) pode ser para (uso em) o trata mento de infertilidade (e/ou para estimulação ovariana controlada) em um indivíduo com idade de 18 a 42 anos, por exemplo, 25 a 37 anos. O produto pode ser para (uso em) o tratamento de infertilidade (e/ou para estimulação ovariana controlada) em um indivíduo tendo BMI >1 e BMI < 35 kg/m2, por exemplo, um indivíduo tendo BMI >18 e BMI < 25 kg/m2, por exemplo, um indivíduo tendo BMI >20 e BMI < 25 kg/m2.
[0042] O rFSH pode preferivelmente incluir 27 - 33%, por exemplo, 30 - 32%, estruturas de glicano trisialiladas. O rFSH pode preferivelmente incluir 24 - 33%, por exemplo, 26 - 30%, estruturas de glica- no disialiladas. O rFSH pode preferivelmente incluir 12 - 21%, por exemplo, 15 - 17%, estruturas de glicano mono-sialiladas. O rFSH preferivelmente inclui estruturas de glicano mono- sialiladas, di- sialila- das, tri- sialiladas e tetra- sialiladas com quantidades relativas como a seguir: 15 a 17% de mono-sialilada; 26 - 30% de di--sialilada; 27 - 33% (por exemplo, 29 a 32%, por exemplo, 30-32%, por exemplo, 30 a 31%) tri--sialilada e 17 - 23 % de tetra--sialilada (por exemplo, como mostrado por análise de WAX de glicanos carregados, como determi- nado nos Exemplos). O rFSH pode incluir a partir de 0 a 7%, por exemplo, 0,1 a 7%, por exemplo, 3 a 6%, por exemplo, 5 a 6%, estruturas sialiladas neutras. O FSH compreende glicanos (fixados às gli- coproteínas de FSH). Aqui, terminologia tal como "X% de mono- sialilada", "X% de di-sialilada", "X% de tri-sialilada" ou "X% de tetra- sialilada" se refere ao número de estruturas de glicano em FSH que são mono-, di, tri ou tetra sialiladas (respectivamente), expressas como o percenetual (X%) do número total de estruturas de glicano no FSH que são sialiladas em qualquer modo (portam ácido siálico). Assim, a frase "27 - 33% de estruturas de glicano trisialilada" quer dizer que, do número total de estruturas de glicano em FSH que porta resíduos de ácido siálico (ou seja, são sialiladas), 27 a 33% das referidas estruturas de glicano são tri sialiladas (portam três resíduos de ácido siálico).
[0043] O rFSH pode ter um teor de ácido siálico [expresso em termos de uma proporção de moles de ácido siálico para moles de proteína] de 6 mol/mol ou mais, por exemplo, entre 6 mol/mol e 15 mol/mol, por exemplo, entre 8 mol/mol e 14 mol/mol, por exemplo, entre 10 mol/mol e 14 mol/mol, por exemplo, entre 11 mol/mol e 14 mol/mol, por exemplo, entre 12 mol/mol e 14 mol/mol, por exemplo, entre 12 mol/mol e 13 mol/mol. O rFSH pode ser produzido ou expresso em a linhagem celular humana.
[0044] O FSH (rFSH) para uso de acordo com a presente invenção pode ter 1% a 99% da sialilação total sendo a2,3-sialilação. O rFSH pode ter 10% ou mais da sialilação total sendo a2,3-sialilação. Por exemplo, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% ou mais da sialilação total pode ser a2,3-sialilação. O rFSH pode preferivelmente incluir α2,3- sialilação em uma quantidade que é a partir de 50 a 70% da sialilação total, por exemplo, a partir de 60 a 69% da sialilação total, por exemplo, a partir de 63 a 67%, por exemplo, em torno de 65% da sialilação total. O FSH (rFSH) para uso de acordo com a presente invenção pode ter 1% a 99% da sialilação total sendo a2,6-sialilação. O rFSH (ou preparação de rFSH) da presente invenção pode ter 5% ou mais, por exemplo, 5% a 99%, da sialilação total sendo a2,6-sialilação. O rFSH pode ter 50% ou menos da sialilação total sendo a2,6-sialilação. O rFSH pode preferivelmente incluir a2,6-sialilação em uma quantidade que é a partir de 25 a 50% da sialilação total, por exemplo, a partir de 30 a 50% da sialilação total, por exemplo, a partir de 31 a 38%, por exemplo, em torno de 35% da sialilação total. Por sialilação se quer dizer a quantidade de resíduos siálicos presentes nas sstruturas de carboidratos de FSH. a2,3-sialilação quer dizer sialilação na posição 2,3 (como é bem conhecido na técnica) e α2,6 sialilação na posição 2,6 (também bem conhecido na técnica). Assim "% da sialilação total pode ser α 2,3 sialilação" se refere ao % do número total de resíduos de ácido siálico presente no FSH que são sialilados na posição 2,3. O termo "% da sialilação total sendo a2,6-sialilação" se refere a the % do número total de resíduos de ácido siálico presente no FSH que são sialiladas na posição 2,6.
[0045] O rFSH pode ter um teor de ácido siálico (quantidade de sialilação por molécula de FSH) de (com base na massa de proteína, em vez do que a massa de proteína mais carboidrato) de 6% ou mais (por exemplo, entre 6% e 15%, por exemplo, entre 7% e 13%, por exemplo, entre 8% e 12%, por exemplo, entre 11% e 15%, por exemplo, entre 12% e 14%) por massa.
[0046] O rFSH pode ser rFSH ou uma preparação de rFSH na qual 16 % ou menos (por exemplo, 0,1 a 16%) dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) bisecção de N-acetilglucosamina (bisecção de GlcNAc ou de bisGlcNAc). Preferivelmente o rFSH (ou preparação de rFSH) é um rFSH ou preparação de rFSH na qual 8 a 14,5% dos gli- canos compreendem (por exemplo, portam) a bisecção de N- acetilglucosamina (bisecção de GlcNAc ou de bisGlcNAc).
[0047] Será entendido que FSH compreende glicanos fixados às glicoproteínas de FSH. Será também entendido que 100% dos glica- nos se refere a ou significa todos os glicanos fixados às glicoproteínas de FSH. Assim, aqui, a terminologia "8 a 14,5% dos glicanos compreendem (portam) bisecção de N-acetilglucosamina" quer dizer que 8 a 14,5% do número total de glicanos fixados às glicoproteínas de FSH incluem/portam bisecção de N-acetilglucosamina; "16% ou menos dos glicanos compreendem (portam) bisecção de N-acetilglucosamina" quer dizer que 16 % ou menos do número total de glicanos fixados às glicoproteínas de FSH incluem/portam bisecção de N- acetilglucosamina, e assim por diante.
[0048] As requerentes observaram que FSH recombinante (preparação de rFSHs; composições de rFSH) nas quais 16% ou menos (por exemplo, 8 a 14,5%) dos glicanos não compreendendo glicoproteínas de FSH portando bisecção de GlcNac podem ter propriedades farma- cocinéticas vantajosas. Acredita-se que as propriedades vantajosas possam susrgir em virtude da quantidade de glicanos que portam bi- secção de GlcNac ser similar àquela nos produtos derivados da urina humana Bravelle, que é relativamente menor do que aquela das outras preparações de FSH recombinante tais como as descritas em WO2012/017058.
[0049] O rFSH (ou preparação de rFSH) pode ser um rFSH ou preparação de rFSH na qual 20% ou mais dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) N-Acetilgalactosamina (GalNAc), por exemplo, na qual 20% ou mais dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) um GalNAc terminal. Preferivelmente o rFSH (ou preparação de rFSH) é um FSH ou preparação de FSH na qual 40 a 55%, por exemplo, 42% a 52%, dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) GalNAc. Preferivelmente o rFSH (ou preparação de rFSH) é um FSH ou preparação de FSH na qual 40 a 55%, por exemplo, 42% a 52%, dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) GalNAc terminal.
[0050] Será entendido que FSH compreende glicanos fixados às glicoproteínas de FSH. Será também entendido que 100% dos glica- nos se refere a ou significa todos os glicanos fixados às glicoproteínas de FSH. Assim, aqui, a terminologia "em que 20% ou mais dos glica- nos compreendem (por exemplo, portam) GalNAc" quer dizer que 20% ou mais do número total de glicanos fixados às glicoproteínas de FSH incluem/portam N-Acetilgalactosamina (GalNAc); "40 a 55%, por exemplo, 42% a 52%, dos glicanos compreendem (por exemplo, portam) GalNAc terminal" quer dizer que 40 a 55 %, por exemplo, 42% a 52%, do número total de glicanos fixados às glicoproteínas de FSH incluem/portam GalNAc terminal, e assim por diante.
[0051] Parece que a disponibilidade da ligação de α2,6 aumenta o número de estruturas tetra sialiladas, comparadas aos produtos derivados de célula CHO que têm apenas a ligação de α2,3 disponível. As requerentes também observaram que o seu rFSH é distinto dos outros produtos aprovados em virtude da composição de açúcar: a mesma inclui, ou pode incluir, uma quantidade específica de GalNac. Essa pode estar ligada a tetrasialilação e potencia pelo fato de que a sialilação 2,6 está associada com GalNac. Em outras palavras, as presentes requerentes desenvolveram um produto rFSH que inclui características específicas (campos de ligação 2,6, GalNac) que proporcionam rFSH com alto grau de sialilação, o que parece levar a potência aprimorada em vivo.
[0052] O rFSH (ou preparação de rFSH) pode ter 16 a 24% dos glicanos compreendendo (por exemplo, terminal) 1 fucose-lewis, por exemplo, 16,5 a 18% dos glicanos compreendendo (por exemplo, terminal) 1 fucose-lewis. O rFSH (ou preparação de rFSH) pode ter 1,5 a 4,5%, por exemplo, 2 a 4%, por exemplo, 3,7%, dos glicanos compre-endendo (por exemplo, terminal) 2 fucose -lewis.
[0053] O teor de fucose-lewis pode ter um efeito na potência.
[0054] O rFSH pode ser produzido ou expresso em uma linhagem celular humana, por exemplo, uma linha celular Per.C6, uma linhagem celular HEK293, uma linhagem celular HT1080 etc.. Isso pode simplificar (e tornar mais eficiente) o método de produção em virtude da manipulação e controle de, por exemplo, o meio de desenvolvimento de célula para reter a sialilação pode ser menos fundamental do que os processos conhecidos. O método pode também ser mais eficiente pelo fato de que há pouco rFSH básico produzido comparado à produção dos produtos conhecidos rFSH; rFSH mais acídico é produzido e a se- paração/remoção do FSH básico é menos problemático. O rFSH pode ser produzido ou expresso em uma linhagem celular PER.C6®, uma linhagem celular derivada de PER.C6® ou uma linhagem celular modificada por PER.C6®. rFSH que é produzido ou expresso em uma linhagem celular humana (por exemplo, Linhagem celular de PER.C6®, Linhagem celular de HEK293, linhagem celular de HT1080 etc.) incluirá alguns ácido siálicos α2,6-ligados (α2,6 sialilação) proporcionados por atividade endógena de sialil transferase [da linhagem celular] e incluirá alguns ácidos siálicos α2,3-ligados (α2,3 sialilação) proporcionados por atividade endógena de sialil transferase. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,3-sialiltransferase. A linhagem celular pode ser modificada usando α2,6-sialiltransferase. Alternativamente ou adicionalmente, o rFSH pode incluir ácidos siálicos α2,6-ligados (α2,6 sialilação) proporcionados por atividade endógena de sialil transferase [da linhagem celular]. Aqui, o termo "FSH recombinante derivado de humano" quer dizer FSH recombinante que é produzido ou expresso em uma linhagem celular humana (por exemplo, FSH recombinante produzido por engenharia genética da linhagem celular humana).
[0055] O rFSH pode ser produzido usando α2,3- e/ou α2,6- sialiltransferase. Em um exemplo, rFSH é produzido usando α2,3- sia- liltransferase. O rFSH pode incluir ácidos siálicos α2,6-ligados (α2,6 sialilação) proporcionados por atividade endógena de sialil transferase.
[0056] O produto pode ser uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica é para o tratamento de infertilidade. O tratamento de infertilidade pode compreender tecnologias de reprodução assistida (ART), indução de ovulação ou intrauterine insemination (IUI). A composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo, em indicações médicas onde as preparações conhecidas de FSH são usadas.
[0057] O produto ou composição pode ser formulado em composições bem conhecidas para qualquer via de administração de fármaco, por exemplo, oral, retal, parenteral, transdermal (por exemplo, tecnologia de adesivo), intravenosa, intramuscular, subcutânea, intrasuster- nal, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, unguentos ou gotas) ou como um spray bucal ou nasal. Uma típica composição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como solução aquosa, excipientes não tóxicos, incluindo sais e conservantes, tampões e semelhante, como descrito em Remington’s Pharmaceutical Sciences décima quinta edição (Matt Publishing Company, 1975), nas páginas 1405 a 1412 e 1461 - 87, e na décima quarta edição do national formulary XIV (American Phaarmaceutical Association, 1975), entre outros.
[0058] Exemplos de veículos diluentes, solventes ou veículos farmacêuticos aquosos e não aquosos adequados, incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e semelhante), carboximetilcelulose e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais (tais como óleo de oliva), e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila.
[0059] As composições da presente invenção também podem conter aditivos tais como mas não limitados a conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, tensoativos e agentes dispersan- tes. Agentes antibacterianos e antifúngicos podem ser incluídos para evitar o desenvolvimento de micróbios e inclui, por exemplo, m-cresol, álcool benzílico, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e semelhante. Se um conservante é incluído, álcool benzílico, fenol e/ou m- cresol são preferidos; entretanto, o conservante é de modo algum limitado aos referidos exemplos. Adicionalmentemore, pode ser desejável se incluir agentes isotônicos tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhante.O produto ou composição pode adicionalmente compreender um sal compreendendo um cátiond e metal alcalino farmaceuti- camente aceitável selecionado a partir do grupo que consiste de Na+- ou K+- sais, ou a combinações dos mesmos. Preferivelmente o sal é um sal de Na+-, por exemplo, NaCl ou Na2SO4.
[0060] Preferivelmente o produto ou composição compreende FSH recombinante e um ou mais de Polisorbate 20, L-metionina, fenol, sulfato dissódico e tampão de fosfato de sódio.
[0061] Em alguns casos, para efetuar a ação prolongada é desejável se reduzir a absorção de FSH (e outros ingredientes ativos, se presentes) a partir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isso pode ser realizado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com pobre solubilidade a água. O coeficiente de absorção de FSH então depende de seu coeficiente de dissolução o qual, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de FSH administrada por via parenteral é realizada ao dissolver ou suspender a combinação de FSH em um veículo de óleo. Formas de depot injetáveis podem ser produzidas ao formar matrizes de microcápsulas do FSH (e outros agentes, se presentes) em polímeros biodegradáveis tais como polilactida-poliglicolídeo. Dependendo da relação de FSH para polímero e da natureza do polímero particular empregado, o coeficiente de liberação de FSH pode ser controlado. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), po- li(anidridos) etc. Formulações injetáveis de depot são também preparadas ao aprisionar o FSH em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais.
[0062] Formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtragem através de um filtro de retenção bacteriana, ou ao se incorporar agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersadas em água estéril ou outro meio injetável estéril logo antes do uso. Formulações injetáveis podem ser fornecidas em qualquer recipiente adequado, por exemplo, frasco, seringa pré-preenchida, cartuchos de injeção, e semelhante.
[0063] O produto ou composição pode ser formulada para uso único ou para uso múltiplo (dose múltipla). Se o produto ou composição é formulada para uso múltiplo, é preferido que um conservante seja incluído. Se um conservante é incluído, álcool benzílico, fenol e/ou m- cresol são preferidos; entretanto, o conservante é de modo algum limitado aos refefridos exemplos. O produto ou composição formulado para uso único ou para uso múltiplo pode adicionalmente compreender um sal compreendendo um cátion de metal alcalino farmaceuticamen- te aceitável selecionado a partir do grupo consistindo de sais de Na+- ou K+-, ou uma combinação dos mesmos. Preferivelmente o sal é um sal de Na+-, por exemplo, NaCl ou Na2SO4.
[0064] O produto ou composição pode ser incluído em um recipient tal como um frasco, cartucho pré-preenchido (por exemplo, para adminis-tração única ou uso múltiplo) ou um dispositivo de injeção tal como uma "caneta", por exemplo, para administração de doses múltiplas.
[0065] O produto ou composição pode ser uma formulação (por exemplo, formulação injetável) incluindo FSH (opcionalmente com atividade de hCG, LH, LH etc.). A atividade de LH, se presente, pode se originar a partir de LH ou de gonadotropina coriônica humana, hCG. Se houver mais do que um ingrediente ativo (isto é, FSH e, por exemplo, hCG ou LH) os referidos podem ser adequados para a administração em separado ou junto. Se administrados separadamente, a administração pode ser sequencial. O produto pode ser fornecido em qualquer embalagem apropriada. Por exemplo, um produto pode incluir um número de recipientes (por exemplo, seringas pré-preenchidas ou frascos) contendo ou FSH ou hCG, ou uma combinação (ou combinação) de ambos FSH e hCG. A hCG pode ser hCG recombinante ou hCG urinária. Se o produto inclui um número de recipientes (por exemplo, seringas pré-preenchidas ou frascos) contendo FSH, por exemplo, FSH recombinante, cada recipiente pode incluir a mesma quantidade de FSH. Um ou mais recipientes podem incluir diferentes quantidades de FSH. As seringas ou frascos podem ser embaladas em uma embalagem do tipo blister ou outro meio para manter a esterilidade. Qualquer produto pode opcionalmente conter instruções para uso das formulações de FSH (e por exemplo, hCG se presente). O pH e a concentração exata dos diversos components da composição farmacêutica são ajustados de acordo com a prática da rotina nesse campo. Vide GOODMAN e GILMAN’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7th ed. Em uma modalidade preferida, as composições da presente invenção são fornecidas como composições para administração parenteral. Métodos gerais para a preparação das formulações parenterais são conhecidos na técnica e são descritos em REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, nas páginas 780-820. As composições parenterais podem ser fornecidas em uma formulação líquida ou como uma sólida que será misturada com um meio injetável estéril logo antes da administração. Em uma modalidade especialmente preferida, as composições parenterais são fornecidas em forma de undiade de dosagem para fa- cilidade de administração e uniformidade da dosagem.
[0066] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) medir o nível de AMH no soro de um indivíduo; e (b) administrar ao indivíduo uma dose de, ou uma dose equivalente a, 1-24 μg, por exemplo, 2-24 μg, por exemplo, 2 a 15 μg, de FSH recombinante derivado de humano. Preferivelmente a dose é, ou é equivalente a, 4,5 a 12,5 μg, por exemplo, 5 a 12,5 μg, por exemplo, 6 a 12,5 μg, por exemplo, 6,3 a 12 μg, de FSH recombinante derivado de humano.
[0067] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro de um indivíduo; e (b) administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 9 a 14 μg, por exemplo, 11 a 13 μg, por exemplo, 12 μg de hormônio folículo estimulante recombinante derivado de humano (FSH) a um (o) indivíduo tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L (por exemplo, 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L). Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[0068] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro de um indivíduo; e (b) administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12,5 μg de hormônio folículo estimulante recombinante derivado de humano (FSH) a um (o) indivíduo tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L. The dose (por exemplo, diária) pode ser, ou ser equivalente a, 6 a 10 μg de hormônio folículo estimulante recombinante derivado de humano (FSH). Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[0069] Em uma modalidade, o método inclui uma etapa de admi nistrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12 μg, por exemplo, 7 a 12 μg, por exemplo, 8,7 a 10 μg, de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 9 a 10 μg de FSH recombinante derivado de humano) a um (o) indivíduo tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L em outra modalidade, o método inclui uma etapa de administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 12 μg de FSH recombinante derivado de humano (por exemplo, 7 a 12 μg, por exemplo, 6 a 9 μg, por exemplo, 7 a 8 μg, por exemplo, 7,3 a 8 μg de FSH recombinante derivado de humano) a um (o) indivíduo tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L. Em outra modalidade, o método inclui uma etapa de administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 5 a 11 μg de FSH recombinante derivado de humano (por exemplo, 6 a 7 μg, por exemplo, 6,3 a 7 μg, de FSH recombinante derivado de humano) a um (o) indivíduo tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L.
[0070] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro de um indivíduo; e (b) administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,09 a 0,19 μg (por exemplo, 0,09 a 0,17 μg) de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do indivíduo, em que o indivíduo tem um nível de AMH no soro de >15 pmol/L. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH re- combinante derivado de humano. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[0071] Em uma modalidade, o método inclui uma etapa de admi nistrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,15 a 0,16 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do indivíduo, o indivíduo tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L. Em outra modalidade, o método inclui uma etapa de administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,12 a 0,13 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do indivíduo, o indivíduo tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L. Em outra modalidade, o método inclui uma etapa de administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do indivíduo, o indivíduo tendo um nível de AMH no soro de >35 pmol/L. Preferivelmente o FSH é um FSH recombinante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. As referidas doses proprocionam uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[0072] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro de um indivíduo; e (b) administrar uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,15 a 0,21 μg (por exemplo, 0,19 a 0,21 μg) de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do indivíduo, em que o indivíduo tem um nível de AMH no soro de <15 pmol/L.
[0073] A administração preferivelmente compreende uma dose diária de, ou a dose diária equivalente à, quantidade de FSH definida acima e nas reivindicações. A dose (diária) pode ser uma dose inicial (a mesma pode ser reduzida, aumentada, ou mantida durante o tratamento).
[0074] O método pode ser um método de tratamento de infertilidade no primeiro protoclo de estimulação do paciente (indivíduo). Será observado que para ciclos de estimulação adicionais, as doses podem ser ajustadas de acordo com resposta ovariana atual no primeiro ciclo.
[0075] De acordo com a presente invenção em um aspecto adicional é proporcionado um método de tratamento de infertilidade compreendendo: (a) determinar (por exemplo, medir) o nível de AMH no soro de um indivíduo;
[0076] e (b) se o indivíduo tem um nível de AMH no soro de <15 pmol/L (por exemplo, 0,05 pmol/L a 14,9 pmol/L), administrar ao indivíduo uma dose de, ou dose equivalente a, 10 a 14 μg, por exemplo, 11 a 13 μg, por exemplo, 12 μg, de hormônio folículo estimulante re- combinante derivado de humano (FSH); ou
[0077] se o indivíduo tem um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L, administrar ao indivíduo uma dose de, ou dose equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,15 a 0,16 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do indivíduo; ou
[0078] se o indivíduo tem um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L pmol/L, administrar ao indivíduo uma dose de, ou dose equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,12 a 0,13 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do indivíduo; ou
[0079] se o indivíduo tem um nível de AMH no soro de >35 pmol/L pmol/L, administrar ao indivíduo uma dose de, ou dose equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do indivíduo.
[0080] Para um paciente (indivíduo) tendo AMH no soro de 5,014,9 pmol/L, a dose de, ou dose equivalente a, 6 a 18 μg, por exemplo, 8 a 11 μg, por exemplo, 8,5 a 10,2 μg de FSH recombinante derivado de humano podem ser administrados. Para um paciente (indivíduo) tendo AMH no soro 15,0-29,9 pmol/L, a dose de, ou uma dose equivalente a, 4,8 a 15 μg, por exemplo, 6 a 9 μg, por exemplo, 6,8 a 8,5 μg de FSH recombinante derivado de humano podem ser administrados. Para um paciente (indivíduo) tendo AMH no soro 30-44,9 pmol/L, a dose de, ou uma dose equivalente a, 3,6 a 12 μg, por exemplo, 4 a 7 μg, por exemplo, 5,1 a 6,8 μg de FSH recombinante derivado de humano podem ser administrados. Para um paciente (indivíduo) tendo AMH no soro 45 pmol/L ou mais, a dose de, ou uma dose equivalente a, 2 a 9 μg, por exemplo, 2,4 a 9 μg (por exemplo, 3,4 a 5,1 μg) ou 2 a 5 μg de FSH recombinante derivado de humano podem ser administrados. Para um paciente (indivíduo) tendo AMH no soro de 5 pmol/L ou menos, a dose de, ou uma dose equivalente a 7,2 a 24 μg, por exemplo, 10 a 15 μg por exemplo, 10,2 a 13,6 μg, de FSH recombinan- te derivado de humano podem ser administrados. Em alguns exemplos, a dose de, ou dose equivalente a, 4,8 a 18 μg, por exemplo, 6 a 11 μg, por exemplo, 6,8 a 10,2 μg de FSH recombinante derivado de humano é administrada. Preferivelmente o FSH é um FSH recombi- nante ("rFSH" ou "recFSH"). Preferivelmente o FSH é uma linhagem celular de FSH recombinante derivado de humano. A administração preferivelmente compreende uma dose diária de, ou a dose diária equivalente à, quantidade de FSH definida acima e nas reivindicações. A dose (diária) pode ser uma dose inicial (a mesma pode ser reduzida, aumentada, ou mantida durante o tratamento).
[0081] A presente invenção será agora descrita em mais detalhes com referência aos desenhos em anexo, nos quais:
[0082] A Figura 1 mostra um mapa de plasmídeo do vetor de ex pressão pFSHalfa/beta;
[0083] A Figura 2 mostra o vetor de expressão α2,3- sialiltransferase (ST3GAL4);
[0084] A Figura 3 mostra o vetor de expressão α2,6- sialiltransferase (ST6GAL1);
[0085] A Figura 4 mostra % de abundância distribuição de ácido siálico dos exemplos de FSH recombinante produzido por células PER.C6® que expressam de modo estável FSH após engenharia genética com α2,3- sialiltransferase;
[0086] A Figura 5 mostra % de abundância de distribuição de carga de glicano dos exemplos de FSH recombinante produzido por células PER.C6® que expressam de modo estável FSH após engenharia genética com α2,3- sialiltransferase;
[0087] A Figura 6 mostra uma comparação da concentração de inibina-B em seguida da administração de 225IU Gonal f (linha de fundo, linha pontilhada) e 225 IU do Exemplo (linha de topo, linha inteira) da presente invenção;
[0088] A Figura 7 mostra o efeito do peso corporal nos oócitos recuperados no grupo de tratamento de baixo teor de AMH (Exemplo 10,10A); e
[0089] A Figura 8 mostra o efeito do peso corporal nos oócitos re-cuperados no grupo de tratamento de alto teor de AMH.
[0090] A região de codificação do gene para o polipeptídeo alfa de FSH foi usada de acordo com Fiddes e Goodman. (1981). A sequência é agrupada como AH007338 e no momento da construção não houveram outras variantes da referida sequência de proteína. A sequência é referida aqui como SEQ ID NO:1.
[0091] A região de codificação do gene para o polipeptídeo beta de FSH foi usada de acordo com Keene et al (1989). A sequência é agrupada como NM_000510 e no momento da construção não houveram outras variantes da referida sequência de proteína. A sequência é referida aqui como SEQ ID NO: 2
[0092] α2,3-Sialiltransferase - A região de codificação do gene for beta-galactoside alfa-2,3-sialiltransferase 4 (α2,3-sialiltransferase,ST3GAL4) foi usada de acordo com Kitagawa e Paulson (1994). A sequência é agrupada como L23767 e referida aqui como SEQ ID NO: 3.
[0093] α2,6-Sialiltransferase - A região de codificação do gene para beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferase 1 (α2,6-sialiltransfera se, ST6GAL1) foi usada de acordo com Grundmann et al. (1990). A sequência é agrupada como NM_003032 e referida aqui como SEQ ID NO: 4.
[0094] Exemplo 1 Construção do vetor de expressão de FSH
[0095] Uma sequência de codificação de polipeptídeo alfa de FSH (AH007338, SEQ ID NO: 1) e polipeptídeo beta de FSH (NM_003032, SEQ ID NO: 2) foram amplificadas por PCR usando as combinações de primer FSHa-fw e FSHa-rev e FSHb-fw e FSHb-rec respectivamente.
[0096] FSHa-fw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGA AAAATATGC-3’ (SEQ ID NO:9)
[0097] FSHa-rev 5’-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAA C-3’ (SEQ ID NO:10)
[0098] FSHb-fw 5’-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAG TTTTTC-3’ (SEQ ID NO: 11)
[0099] FSHb-rev 5’-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCAC CAAAGG-3’ (SEQ ID NO: 12)
[00100] O DNA de beta FSH amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição AscI e HpaI e inserido nos campos AscI e HpaI no vetor de expressão de mamífero orientado a CMV portando um marcador de seleção de neomicina. De modo similar o DNA de FSH alfa foi digerido com BamHI e NheI e inserido nos campos BamHI e NheI no vetor de expressão já contendo o polipeptídeo beta do DNA de FSH.
[00101] O DNA do vetor foi usado para transformar a cepa DH5α de E.coli. Colônias foram captadas para amplificação. As colônias contendo o vetor contendo ambos os FSHs alfa e beta foram selecionados para sequenciamento e todos continham as sequências corretas de acordo com SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. O Plasmídeo pFSH A+B#17 foi selecionado para transfecção (Figura 1).
[00102] Exemplo 2 Construção do vetor de expressão ST3
[00103] A sequência de codificação de beta-galactoside alfa-2,3- sialiltransferase 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) foi amplificada por PCR usando a combinação de primer 2,3STfw e 2,3STrev.
[00104] 2,3STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGG CTGGAAGC-3’ (SEQ ID NO: 13)
[00105] 2,3STrev 5’-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGT TCTTG-3’ (SEQ ID NO: 14)
[00106] O DNA ST3 amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e AflII e inserido nos campos BamHI e AflII no vetor de expressão de mamífero orientado a CMV portando um marcador de resistência a higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. Clone pST3#1 (Figura 2) continha a sequência correta de acordo com SEQ ID NO: 3 e foi selecionado para transfecção.
[00107] Exemplo 3 Construção do vetor de expressão ST6
[00108] A sequência de codificação de beta-galactosamida alfa-2,6- sialiltransferase 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) foi amplificada por PCR usando a combinação de primer 2,6STfw e 2,6STrev.
[00109] 2,6STfw 5’-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAA CCTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 15)
[00110] 2,6STrev 5’-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCC GG-3’ (SEQ ID NO: 16)
[00111] O DNA ST6 amplificado resultante foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e AflII e inserido nos campos BamHI e AflII no vetor de expressão de mamífero orientado a CMV portando um marcador de resistência a higromicina. O vetor foi amplificado como anteriormente descrito e sequenciado. Clone pST6#11 (Figura 3) continha a sequência correta de acordo com SEQ ID NO: 4 e foi selecionado para transfecção.
[00112] Exemplo 4 expressão estável de pFSH α+β em células PER.C6®. Isolamenteo de transfecção e leitura de clones.
[00113] FSH produzindo clones PER.C6® foram gerados pela expressão de ambas as cadeias de polipeptídeo de FSH a partir de um único plasmídeo (vide Exemplo 1).
[00114] Para se obter clones estáveis um agente de transfecção com base em lipossomo com o construtor pFSH α+β. Clones estáveis foram selecionados em VPRO suplementado com 10% de FCS e contendo G418. Três semanas após a transfecção os clones resistentes a G418 se desenvolveram. Clones foram selecionados para isolamento. Os clones isolados foram cultivados em meio de seleção até 70-80% confluentes. Os sobrenadantes foram testados quanto ao teor de proteína FSH usando um teste ELISA seletivo para FSH e atividade farmacológica no receptor de FSH na linhagem celular clonada, usando um teste de acúmulo cAMP. Os clones que expressam proteína funci-onal foram progredidos para expansão de cultura em frascos de 24 cavidades, 6 cavidades e T80.
[00115] Estudos para determinar a produtividade e a qualidade do material a partir de sete clones foram iniciados em frascos T80 para gerar material suficientee. Células foram cultivadas em meio suplementado como anteriormente descrito por 7 dias e o sobrenadante coletado. A produtividade foi determinada usando o ELISA seletivo para FSH. O perfil isoelétrico do material foi determinado por foco isoelétri- co (IEF), por métodos conhecidos na técnica. Clones com suficiente produtividade e qualidade foram selecionados para engenharia genética sialiltransferase.
[00116] Exemplo 5 Nível de sialilação é aumentada em células que super expressam α2,3- sialiltransferase. A expressão estável de pST3 em FSH que expressam células PER.C6®; isolamento de transfecção e leitura de clones.
[00117] Clones PER.C6® produzindo FSH altamente sialilado foram gerados pela expressão de α2,3 sialiltransferase a partir de plasmí- deos separados (Exemplo 2) em células PER.C6® que já expressam ambas as cadeias de polipeptídeo de FSH (a partir do Exemplo 4). Clones produzidos a partir de células PER.C6® como determinado no Exemplo 4 foram selecionados por suas características incluindo produtividade, bom perfil de desenvolvimento, produção de proteína funcional, e produzido FSH que incluiu alguma sialilação. Clones estáveis foram gerados como anteriormente descrito no Exemplo 4. Clones foram isolados, expandidos e testados. Os clones de α2,3- sialiltransferase foram adapted ao meio livre de soro e condições de suspensão.
[00118] Como antes, os clones foram testados usando a ELISA seletivo para FSH, resposta funcional em uma Linhagem celular receptora de FSH, IEF, coeficiente de depuração metabólica e análise de Steelman Pohley. Os resultados foram comparados a um FSH recom- binante comercialmente oferecido (Gonal-f, Serono) e às linhagens celulares de FSH PER.C6® parental. O FSH produzido pela maioria dos clones apresentou sialilação significantemente aprimorada (isto é em média mais isoformas de FSH com altos números de ácidos siáli- cos) comparado a FSH expresso sem α2,3- sialiltransferase. Em conclusão a expressão de FSH junto com sialiltransferase em células PER.C6® resultou em aumentados níveis de FSH sialilado comparado ás células que expressam apenas FSH.
[00119] Exemplo 6 visão geral da Produção e purificação
[00120] Um procedimento foi desenvolvido para produzir FSH em Células PER.C6® que foram cultivadas em suspensão em meio livre de soro. O procedimento é descrito abaixo e foi aplicado a diversas linhagens celulares de PER.C6® produzindo FSH.
[00121] FSH a partir de α2,3- clone (Exemplo 5) foi preparado usando uma modificação do método descrito por Lowry et al. (1976).
[00122] Para a produção de PER.C6®-FSH, linhagens celulares foram adaptadas a um meio livre de soro, isto é, Excel 525 (JRH Bios-ciences). As células foram primeiro cultivadas para formar uma mono- camada 70%-90% confluente em um frasco de cultura T80. Na passagem as células foram re-suspensas no meio livre de soro, Excel 525 + 4 mM L-Glutamina, a uma densidade de célula de 0,3 x 106 célu- las/mL. Uma suspensão celular de 25 mL foi posta em um frasco de agitação de 250 mL e agitada a 100 rpm a 37°C em 5% CO2. Após alcançar a densidade de célula de > 1 x 106 células/mL, as células foram sub-cultivadas a uma densidade de célula de 0,2 ou 0,3 x 106 célu- las/mL e adicionalmente cultivadas em frascos de agitação a 37°C, 5% de CO2 e 100 rpm.
[00123] Para a produção de FSH, as células foram transferidas a um meio de produção livre de soro, isto é, VPRO (JRH Biosciences), que suporta o desenvolvimento de Células PER.C6® a densidades celulares muito altas (em geral > 107 células/mL em uma cultura de lote). As células foram primeiro cultivadas a > 1 x 106 células/mL em Excel 525, então centrifugadas por 5 min a 1000 rpm e subsequentemente suspensas em meio VPRO + 6 mM L-glutamina a uma densidade de 1 x 106 células/mL. As células foram então cultivadas em um frasco agitador por 7-10 dias a 37°C, 5% CO2 e 100 rpm. Durante esse período, as células se desenvolveram a uma densidade de > 107 célu- las/mL. O meio de cultura foi coletado após a viabilidade celular ter começado a declinar. As células foram centrifugadas por 5 min a 1000 rpm e o sobrenadante foi usado para a quantificação e purificação de FSH. A concentração de FSH foi determinada usando ELISA (DRG EIA 1288).
[00124] Posteriormente, a purificação de FSH foi realizada usando a modificação do método descrito por Lowry et al. (1976). Purificação usando cromatografia de carga seletiva foi realizada para enriquecer as formas altamente sialiladas por métodos bem conhecidas na técnica.
[00125] Durante todos os procedimentos cromatográficos, o enriquecimento das formas sialiladas de FSH como aqui reivindicadas foi confirmado por RIA (DRG EIA 1288) e/ou IEF.
[00126] Exemplo 7 Quantificação de quantidades relativas de ácido siálico α2,3 e α2,6
[00127] As quantidades percentuais relativas de ácido siálico α2,3 e α2,6 em rFSH purificado (Exemplo 6) foram medidas usando técnicas conhecidas.
[00128] N-Glicanos foram liberados a partir das amostras usando PNGase F sob condições de desnaturação e então marcadas com 2- aminobenzamida. As formas de glicano liberadas foram então separadas e analisadas por coluna de Troca de Anion Fraco (WAX) para determinação de distribuição de carga. Os glicanos marcados tratados com 2,3,6,8 sialidase para determinação do ácido siálico total e 2,3 sialidase para determinação de 2,3 ácido siálico, foram adicionalmente analisados por coluna wax.
[00129] Os percentuais relativos dos glicanos carregados foram calculados a partir das estruturas presentes nos grupos de glicanos não digeridos e digeridos e são mostrados na Figura 4 (para 8 amostras). Os referidos foram observados estar nas faixas 50% - 70% (por exemplo, cerca de 60% ou 65%) para sialilação de α2,3 e 28 a 50%, em geral 30 a 35% (por exemplo, cerca de 31% ou 35%), para sialila- ção de α2,6.
[00130] Exemplo 8 Quantificação de quantidades relativas de mono, di, tri e tetra estruturas de glicano sialiladas
[00131] As quantidades de percentual relativo de estruturas mono, di, tri e tetra sialiladas em glicanos extraídos a partir de rFSH purificado (Exemplo 6) foram medidas usando técnicas conhecidas.
[00132] N Glicanos foram liberados a partir das amostras usando PNGase F sob condições de desnaturação e então foram marcados com 2-aminobenzamida. Glicanos foram liberados a partir das amostras usando PNGase F sob condições de desnaturação e então marcados com 2-aminobenzamida. As formas de glicano liberadas foram então separadas e analisadas por coluna de Troca de Anion Fraco (WAX) para determinação de distribuição da sialilação. As quantidades relativas de estruturas neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas e tetra-sialiladas são mostradas na Figura 5 (para as 8 amostras mostradas na Figura 4).
[00133] O rFSH inclui estruturas de glicano neutras, mono- sialila- das, di- sialiladas, tri- sialiladas e tetra- sialiladas com quantidades relativas como a seguir: 5-6 % de neutra; 15-17% de mono-sialiladas; 26-30% de di--sialiladas; 30-32% de tri--sialiladas e 17-23 % de tetra— sialiladas.
[00134] Exemplo 8A
[00135] As quantidades de percentual relativo de ácido siálico α2,6 em rFSH purificado extraído a partir de nove amostras de rFSH purifi- cado (produzido pelos métodos de Exemplo 6) foram medidas usando técnicas conhecidas.
[00136] Os N-Glicanos foram liberados a partir das amostras usando PNGase F sob condições de desnaturação e então marcados com 2-aminobenzamida. As formas de glicano liberadas foram então separadas e analisadas por coluna de Troca de Anion Fraco (WAX) para determinação de distribuição de carga. Glicanos marcados tratados com 2,3,6,8 sialidase para determinação de ácido siálico total e 2,3 sialidase para determinação de 2,3 ácido siálico, foram adicionalmente analisados por coluna wax (vide Exemplo 8). A análise permite o cálculo de ácido siálico α2,6.
[00137] Os percentuais relativos dos glicanos carregados foram calculados a partir de estruturas presente nos grupos de glicanos não digeridos e digeridos e são mostrados na tabela a seguir. Os referidos foram observados estar em uma faixas 25 a 50%, em geral 30 a 35% para α2,6 sialilação.
[00138] As quantidades de percentual relativo de bisecção de Glc- Nac, GalNac e 1-Fucose Lewis em glicanos extraídos a partir de nove amostras de rFSH purificado (produzidas pelos métodos de Exemplo 6) foram medidas usando técnicas conhecidas. N-Glicanos foram liberados a partir da glicoproteína usando PNGase F e marcados com 2- aminobenzamida (2AB). A análise foi realizada por análise HPLC bidimensional (2D) em combinação com a degradação enzimática de gli- canos. Para a verificação, os glicanos foram analisados por MALDI-MS As quantidades relativas de alfa 2,6-ácido siálico e de resíduos terminais são mostrados na tabela a seguir, junto com as para Gonal F (FSH recombinante derivado de célula CHO) e Bravelle (FSH urinário humano).
[00139] 1 Valor de 3.1 é total ^ Fucose Lewis. 2 Não determinado.
[00140] Pode ser observado que a quantidade de GalNac no FSH da presente invenção varia entre cerca de 44,9 e 51%, média de cerca de 47,1%.
[00141] Pode ser observado que a quantidade de bisecção de Glc- Nac no FSH da presente invenção varia entre 8,7 e 13,9%, média de aproximadamente a 10,9%.
[00142] Pode ser observado que a quantidade de 1 Fucose Lewis no FSH da presente invenção varia entre 161 e 23,3%, média aproximadamente a 19%.
[00143] Pode ser observado que a quantidade de 2 Fucose Lewis no FSH da presente invenção varia entre 1,9 e 4,4%, média aproximadamente a 3,7%.
[00144] Exemplo 9 - Um estudo de dose múltipla investigando a segurança, tolerabilidade, farmacocinéticas, farmacodinâmicas, e imu- nogenicidade de FE 999049 em comparação a GONAL-F.
[00145] A total de 48 (24 em cada fármaco) mulheres saudáveis receberam doses diárias de 14,6 μg de FE 999049 (a composição de acordo com a presente invenção, produzida de acordo com Exemplo 6) ou 16,5 μg de Gonal-F por sete dias.
[00146] A administração de dose múltipla de FE 999049 e GONAL- F foi segura e em geral bem tolerada como avaliado por Eventos Adversos (AEs), sinais vitais, ECG, medições de laboratório clínico, e exame físico. Nenhum efeito adverso sério ou morte ocorreu durante o estudo.
[00147] Em seguida da administração de FE 999049 e GONAL-F por 7 dias, os valores de concentração de FSH como avaliados imediatamente antes da próxima inbjeção aumentaram e pareceram al- cançar um nível de estado estável após 6-7 dias. Entretanto a exposição (AUC e Cmax) de FE 999049 foi 60% mais alta em comparação a Gonal-F.
[00148] As concentrações de inibina-B (vide a Figura 6), oestradiol, e progesterona todas aumentaram subsequente à administração de FE 999049 e GONAL-F, entretanto em uma maior extensão em seguida da administração de FE 999049 comparado a GONAL-F. não só o número mas também a distribuição de tamanho dos folículos mostraram uma maor resposta a FE 999049 comparado a GONAL-F.
[00149] Exemplo 9 demonstra que FSH tendo uma quantidade específica (17-23%) de estruturas de glicano tetra-sialiladas e por exemplo, quantidades específicas de α2,3 sialilação e α2,6 sialilação é mar- cadamente mais potente do que os produtos de FSH recombinante que estão atualmente no mercado.
[00150] Exemplo 10 - Um estudo de dose múltipla investigando FE 999049 em comparação a GONAL-F.
[00151] O a seguir descreve grupos de testes paralelos aleatoriza- dos, controlados, adjunto-cego, multinacionais, multicentrais avaliando a relação de resposta de dose de FE 999049 em pacientes que se submetem a estimulação ovariana controlada para fertilização em vitro (IVF) / injeção de esperma intracitoplasmático (ICSI). A população de pacientes foi de 265 pacientes de IVF com idade entre 18 a 37 anos, com BMI 18,5 a 32,0 kg/m2.
[00152] O teste foi projetado como um teste de resposta de dose com o número de oócitos recuperados como o ponto final principal. Os pontos finais secundários irão explorar o impacto qualitativo e quantitativo de diferentes doses de FE 999049 com relação ao perfil endócri- no, desenvolvimento folicular, fertilização de oócito, qualidade do embrião e eficiência do tratamento (isto é, consume de gonadotropina to- tal e duração da estimulação). O teste é projetado para avaliar a eficácia de FE 999049 a estabelecer gravidez quando usado em estimulação ovariana controlada para os ciclos de IVF/ICSI.
[00153] Indivíduos foram avaliados dentro de 3 meses antes da aleatorização para estar de acordo com os critérios de inclusão e ex-clusão, incluindo uma avaliação do hormônio anti-Mülleriano (AMH) para aumentar a homogeneidade da população em teste em relação à resposta ovariana e minimizar o número de respondedores potenciais pobres e hiper às doses de FE 999049 e dose de GONAL-F usada no teste. A avaliação de AMH foi medida usando o kit de teste de imuno- absorção ligado a enzima AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). O referido teste pode detectar Concentrações de AMH maiores do que 0,57 pmol/L com um limite mínimo de quantificação de 1,1 pmol/L.
[00154] No dia 2-3 de seu ciclo menstrual, os indivíduos foram aleato- rizados em um modo de 1:1:1:1:1:1 para tratamento com ou 90 IU, 120 IU, 150 IU, 180 IU ou 210 IU FE 999049 ou 150 IU GONAL-F, e a estimu-lação ovariana iniciada. A aleatorização foi estratificada de acordo com o nível de AMH em leitura [5,0-14,9 pmol/L (low AMH) e 15,0 a 44,9 pmol/L (alto AMH)).
[00155] Gonal-F é preenchido por massa (FbM) em solicitação de FDA; a referência a μg dose é portanto apropriada. A marcacao Gonal -F label indica 600 IU/44 μg, o que indica que 150 IU é 11 μg. Entretanto, há alguma variação e o certificado de lote para esse teste indicou que 11,3 μg de Gonal-F foi equivalente a 150 IU. As doses de FE999049 são apresentadas por teor de proteína (μg) em vez de atividade biológica. Assim as doses de FE999049 foram 5,2 μg (90 IU), 6,9 μg (120 IU), 8,6 μg (150 IU), 10,3 μg (180 IU) ou 12,1 μg (210 IU).
[00156] O indivíduo e a distribuição de dose é determinado como a seguir (dados são números dos indivíduos):Tabela 1
[00157] O nivel de dose diária de FE 999049 ou GONAL-F é fixado através de todo o período de estimulação. Durante a estimulação, indi-víduos são monitorados no dia de estimulação 1, 4 e 6 e daqui em diante pelo menos a cada dois dias. Quando 3 folículos de >15 mm são observados, visitas são realizadas diariamente. Os indivíduos são tra-tados com FE 999049 ou GONAL-F por um máximo de 16 dias.
[00158] Para evitar uma onda premature de LH, um antagonista GnRH (acetate de ganirelix, ORGALUTRAN, MSD / Schering-Plough) pode ser iniciado no 6 dia de estimulação a uma dose diária de 0,25 mg e continuado através do período de estimulação. O engatilhamento da maturação folicular final é realizado no dia quando >3 folículos com um diâmetro >17 mm são observados. Se há <25 folículos com um diâmetro >12 mm, 250 μg hCG recombinante (coriogonadotropina alfa, OVITRELLE, Merck Serono / EMD Serono) é administrada. Se há 2535 folículos com um diâmetro >12 mm, 0,2 mg de agonista GnRH (aceetato de triptorelina, DECAPEPTIL / GONAPEPTIL, Ferring Phar- maceuteicals) é administrada. Em caso de excessive resposta ovaria- na, definida como >35 folículos com um diâmetro >12 mm, o tratamento é cancelado. Em caso de uma pobre resposta ovariana, definida como <3 folículos com um diâmetro >10 mm observado no 10 dia de estimulação, o ciclo pode ser cancelado.
[00159] A recuperação de oócitos ocorre 36h (± 2h) após engati- lhamento da maturação folicular final e os oócitos inseminados por IVF e/ou ICSI. A Fertilização e desenvolvimento do embrião são avaliados a partir de recuperação de oócito para o dia da transferência. Para in-divíduos que se submeteram a engatilhamento de maturação folicular final com hCG, um blastocisto da melhor qualidade disponível é trans-ferido no dia 5 após a recuperação de oócito enquanto os blastocistos restantes são congelados. Para indivíduos que se submetem a engati- lhamento de maturação folicular final com agonista GnRH, nenhuma transferência de embriao ocorre no ciclo novo e blastocistos são em vez disso congelados no 5 dia. Tablets de progesterona vaginal (LU- TINUS, Ferring Pharamaceuticals) 100 mg 3 vezes ao dia são proporcionados para o suporte da fase lútea a partir do dia após a recuperação de oócito até o dia da visita clínica da gravidez. Um teste βhCG é realizado 13-15 dias após transferência do embrião e a gravidez clínica será confirmada por ultrassom transvaginal (TVU) 5-6 semanas após a transferência do embrião.
[00160] O número de oócitos recuperados (ponto final principal) é mostrado na tabela a seguir.Tabela 2
[00161] Os dados são médias (SD)
[00162] O objetivo principal foi alcançado: uma relação significante de dose-resposta foi estabelecida para FE 999049 com respeito ao número de oócitos recuperados. Esse achado foi observed não só para a população de teste teotal, mas também para cada um dos dois estratos de AMH usados em aleatorização.
[00163] Uma significante resposta a dose para FE 999049 foi de-monstrada para todos os objetivos chaves dos parâmetros farmacodi- nâmicos, por exemplo, estradiol, inibina B e inibina A. em um nivel de dose de micrograma similar, as respostas farmacodinâmicas com FE 999049 foram maiores do que com GONAL-F (os referidos resulados não são mostrados).
[00164] As concentrações de FSH no soro após exposição a FE 999049 foram significantemente mais altas do que para GONAL-F. Os resultados confirm que o perfil PK de FE 999049 difere a partir daquele de GONAL-F.
[00165] Os coeficientes de fertilização, o desenvolvimento de blas- tocistos e os coeficientes de gravidez em pacientes IVF/ICSI tratados com FE 999049 foram dentro das expectativas.
[00166] Não houveram preocupações de segurança com o uso de FE 999049. Uma boa tolerabilidade local foi documentada.
[00167] As requerentes analisaram adicionalmente os dados para identificar a(s) dose(s) de FE 999049 que preencheram todos os critérios a seguir com relação ao número de oócitos recuperados:
[00168] Oócitos recuperados na faixa 8-14
[00169] Minimisar proproção de pacientes com <8 oócitos
[00170] Minimisar proproção de pacientes com >20 oócitos
[00171] As requerentes também investigaram o impacto do peso corporal. Se relevante, a dose é convertida em μg/kg para um indivíduo médio. O referido valor de μg/kg e ±0,01 μg/kg é avaliado em um modelo com relação à distribuição de oócitos recuperados assim como o perfil de segurança, e a dose ótima é identificada.
[00172] Como visto na Tabela 2, a dose de FE999049 que preencheu o primeiro critério (Oócitos recuperados em uma faixa de 8-14) foi 12,1 μg (media de 9,4 oócitos recuperados). A distribuição de oóci- tos é mostrada na Tabela 3 abaixo.Tabela 3
[00173] Os dados são % dos indivíduos
[00174] Como mostrado pela caixa e seta, a dose de 12,1 μg de FE999049 proporciona a recuperação do número mais desejavel de oócitos em 60% dos indivíduos no grupo de baixo AMH. Isso é um aprimoramento significante em Gonal-F (número mais desejável de oócitos em apenas 33% dos indivíduos).
[00175] A Tabela 4 abaixo mostra a análise de sinais de resposta excessive no estrato de baixo AMH (os dados são números de indiví-duos). Pode ser observado que não houveram indicações de OHSS precoce de uma natureza moderada ou severa e não houveram inci- dencias de ação preventativa sendo necessária; não houve preocupação associada com a dose de 12,1 μg de FE999049 em um paciente tendo baixo AMH. Tabela 4
[00176] A Figura 7 mostra o efeito do peso corporal em oócitos re-cuperados (para o estrato de baixo AMH), para as várias doses. As setas indicam o número de oócitos recuperados a partir dos indivíduos de peso corporal entre 45 kg e 90 kg tratados com a dose de 12,1 μg. Como pode ser visto (caixa de texto) a variação entre os pacientes de peso corporal 45kg e os de 90kg é menos do que em torno de 0,5 oó- citos; em outras palavras a dosagem por peso corporal não é necessária em pacientes com baixo AMH quando a dose de FE999049 é pelo menos 12 μg, pelo fato de que não é uma significante variação em oó- citos recuperados com peso corporal, nessa dose.
[00177] Assim as requerentes observaram que a dose de, ou dose equivalente a, 6 a 18 μg, por exemplo, 9 a 14 μg, por exemplo, 12 μg, de FSH recombinante derivado de humano é adequada para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro <15 pmol/L, por exemplo, 0,05-14,9 pmol/L por exemplo, 5,0-14,9 pmol/L. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[00178] Como visto na Tabela 2, três doses de FE999049 preencheu o primeiro critério (oócitos recuperados em uma faixa de 8-14): 6.9 μg (médida de 9,1 oócitos recuperados), 8,6 μg (media de 10,6 oó- citos recuperados), e 10,3 μg (media de 13,6 oócitos recuperados).
[00179] A Figura 8 mostra o efeito do peso corporal on oócitos re-cuperados (para o estrato de alto AMH), para as diversas doses. As setas indicam o número de oócitos recuperados a partir dos indivíduos de peso corporal entre 45 kg e 9 0kg tratados nas doses de 6,9 μg, 8,6 μg e 10,3 μg. Como pode ser visto (caixas de texto) a he variação é significante: para a dose de 6,9 μg 6 oócitos adicionais serão recupe-rados a partir de um paciente de 45 kg comparado a um paciente de 90 kg; para a dose de 8,6 μg 4 oócitos adicionais serão recuperados a partir de um paciente de 45 kg comparado a um paciente de 90 kg; e para a dose de 10,1 μg 2,5 oócitos adicionais serão recuperados a partir de um paciente de 45 kg comparado a um paciente de 90 kg. Em outras palavras a dosagem por peso corporal tem um impacto em pacientes com alto AMH quando a dose de FE999049 é menos do que 12 μg, pelo fato de que há uma significante variação em oócitos recuperados com peso corporal, nas referidas doses.
[00180] A Tabela 5a abaixo mostra uma rupture adicional de oócitos recuperados (a partir da Tabela 2) por AMH. Isso mostra as doses que preencheram o primeiro critério (oócitos recuperados em uma faixa de 8-14) para cada sub estrato de AMH (caixas).Tabela 5a
[00181] A Tabela 5 b abaixo mostra a análise de pacientes onde o tratamento foi cancelado em virtude de ou de excessiva resposta ou de engatilhamento de agonista, para os referidos subgroups. Por exemplo, one o paciente no estrato de AMH de 25-34 pmol/L cancelou em virtude de excessiva resposta em seguida da dose de 10,3 μg e um paciente no estyrato de AMH de 25-34 pmol/L cancelou em virtude de excessiva resposta em seguida da dose de 12,1 μg; um paciente no estyratod e AMH de 35-45 pmol/L cancelou em seguida do engatilha- mento do agosnista em seguida da dose de 10,3 μg; e um paciente no estrato de AMH de 35-45 pmol/L cancelou em seguida do engatilha- mento do agonista em seguida da dose de 6.9 μg.Tabela 5b
[00182] Pode ser visto portanto que ao se confeccionar a dose por peso corporal (Fig 8) e nível de AMH é util no estrato de alto AMH, para minimizar cancelamentos e maximizar a recuperação de oócito.
[00183] As requerentes observaram que as doses a seguir propro- cionam uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS (kg é kg de peso corporal de paciente).
[00184] O a seguir é apropriado se dosagem por peso corporal não for desejada.
[00185] O a seguir é apropriado se menos categorias de AMH forem necessárias.
[00186] O a seguir é apropriado se dosagem por peso corporal não for desejada. .
[00187] Assim as requerentes observaram que a dose de, ou dose equivalente a, 9 a 14 μg, por exemplo, 12 μg, de FSH recombinante derivado de humano é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro <15 pmol/L, por exemplo, 0,0514,9 pmol/L por exemplo, 5,0-14,9 pmol/L. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[00188] As requerentes observaram que a dose de, ou dose equivalente a, 5 a 12,5 μg, por exemplo, 6 a 10,5 μg, de FSH recombinante derivado de humano é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo AMH no soro >15 pmol/L. A dose proporciona uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[00189] As requerentes observaram que uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,09 a 0,19 μg de FSH recombinan- te derivado de humano por kg de peso corporal do paciente é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de >15 pmol/L. As requerentes observaram que uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,15 a 0,16 μg de FSH recombinante derivado de humano) por kg de peso corporal do paciente é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 15 a 24,9 pmol/L. As requerentes observaram que uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivado de humano (preferivelmente 0,12 a 0,13 μg de FSH recombi- nante derivado de humano) por kg de peso corporal do paciente é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de 25 a 34,9 pmol/L. As requerentes observaram que uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente é adequado para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de > 35 pmol/L. As referidas doses proprocionam uma resposta eficaz ao mesmo tempo em que minimiza o risco de OHSS.
[00190] As requerentes observaram que uma dose de (por exemplo, diária), ou dose equivalente a, 0,15 a 0,21 μg (por exemplo, 0,16 μg) de FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente é adequada para uso no tratamento de infertilidade em um paciente tendo um nível de AMH no soro de <15 pmol/L, por exemplo, para o primeiro ciclo de estimulação com FSH recombinante derivado de humano. Entretanto, não é necessário que pacientes sejam dosados por peso corporal nesse nível de AMH.
[00191] Exemplo 10 A - Protocolo COS Individualizado (baixo AMH)
[00192] Os pacientes selecionados estão para se submeter a COS para fertilização em vitro (IVF) / injeção de esperma intracitoplasmático (ICSI) por métodos conhecidos na técnica. O protocolo de pré- tratamento inclui avaliação/leitura do AMH no soro do paciente usando o kit de teste de imunoabsorção ligado à enzima AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Esse teste pode detectar as concentrações de AMH mais do que 0,57 pmol/L com um limite mínimo de quantificação de 1,1 pmol/L. AMH pode ser medido usando outros kits de Teste (por exemplo, disponível a partir de Roche).
[00193] O protocolo de COS prossegue de modo usual independente da administração da dose inicial de FE 999049 de acordo com nível de AMH na leitura. Um paciente com um nível de AMH de <14,9 pmol/L seria administrado com uma dose inicial diária de aproximadamente 12 μg FE 999049, um produto de FSH recombinante derivado de humano fabricado de acordo com o método de Exemplo 6. Um paciente com um nível de AMH de 15 a 24,9 pmol/L receberia uma dose inicial diária de 0,15 a 0,19 μg do FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente. Um paciente com um nível de AMH de 25 a 34,9 pmol/L receberia uma dose inicial diária de 0,11 a 0,13 μg do FSH recombinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente. Um paciente com um nível de AMH de > 35 pmol/L receberia uma dose inicial diária de 0,10 a 0,11 μg do FSH re- combinante derivado de humano por kg de peso corporal do paciente.
[00194] Exemplo 11 - Protocolos de COS individualizados.
[00195] As doses nesse protocolo são menos preferidas do que no Exemplo 10A.
[00196] Os pacientes selecionados estão para se submeter a COS para fertilização em vitro (IVF) / injeção de esperma intracitoplasmático (ICSI) por métodos conhecidos na técnica. O protocolo de pré- tratamento inclui avaliação/leitura do AMH no soro do paciente usando o kit de teste de imunoabsorção ligado a enzima AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Esse teste pode detectar concentrações de AMH maiores do que 0,57 pmol/L com um limite mínimo de quantificação de 1,1 pmol/L.
[00197] O protocolo de COS prossegue de modo usual independente da administração da dose incial de FE 999049 de acordo com nível de AMH na leitura em linnha com a tabela a seguir. Assim um paciente com um nível de AMH de 5-14,8 pmol/L seria administrado com 180 IU FSH na forma de aproximadamente 8-11 μg FE 999049, um produto a FSH recombinante derivado de humano fabricado de acordo com o método de Exemplo 6. Um paciente com um nível de AMH de 30-44,9 pmol/L seria administrado com 120 IU FSH na forma de aproximadamente 4-7 μg FE 999049, um produto a FSH recombinante derivado de humano fabricado de acordo com o método de Exemplo 6. Se o nível de AMH não está disponível, o paciente recombinante seria administrado com 120-180 IU FSH na forma de aproximadamente 6-11 μg FE 999049, um produto a FSH recombinante derivado de hu- mano fabricado de acordo com o método de Exemplo 6.
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Claims (5)
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH) incluindo α2,3- e α2,6 sialilação, em que o rFSH inclui estruturas de glicano mono-, di-, tri- e tetra-sialiladas, em que 15 a 24% das estruturas de glicanos sialiladas são estruturas de glicanos tetrasialiladas.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os glicanos da rFSH compreendem ainda 20% ou mais de N-Acetilgalactosamina (GalNAc).
3. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende 12 μg, 15 μg, 18 μg ou 24 μg de FSH recombinante, como definido na reivindicação 1 ou 2.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antagonista GnRH.
5. Uso de hormônio folículo estimulante recombinante (rFSH), como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento de infertilidade.
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