ES2950911T3 - Composición para la estimulación ovárica controlada - Google Patents
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Abstract
Preparaciones que incluyen FSH, por ejemplo FSH recombinante, para uso en el tratamiento de la infertilidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición para la estimulación ovárica controlada
La presente invención se refiere a composiciones y productos farmacéuticos para el tratamiento de la esterilidad.
Se conocen bien diversas técnicas de tecnología de reproducción asistida (TRA) tales como la fertilización in vitro (FIV). Estas técnicas de TRA generalmente requieren una etapa de estimulación ovárica controlada (EOC), en la que se estimula una cohorte de folículos hasta que alcancen la madurez completa. Los regímenes convencionales de EOC incluyen la administración de gonadotropinas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH) sola o en combinación con actividad de hormona luteinizante (LH) para estimular el desarrollo folicular, normalmente con la administración de un análogo de GnRH antes y/o durante la estimulación para prevenir el aumento de LH prematuro. Las composiciones farmacéuticas que se utilizan generalmente para EOC incluyen hormona estimulante del folículo recombinante (rFSH), FSH derivada de orina, preparaciones de FSH recombinante LH, menotropina derivada de orina [gonadotropina menopáusica humana (hMG)] y gonadotropina menopáusica humana altamente purificada (HP-hMG). La FIV puede asociarse con un riesgo de desarrollar síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO), que puede ser potencialmente mortal en casos graves.
La capacidad de predecir el potencial de respuesta de las mujeres a la estimulación ovárica controlada (EOC) puede permitir el desarrollo de protocolos de EOC individualizados. Esto podría, por ejemplo, reducir el riesgo de desarrollar SHO en mujeres en las que se ha predicho que tendrán una respuesta excesiva a la estimulación y/o mejorar los resultados de embarazo en mujeres clasificadas como pacientes que responden mal al tratamiento. La concentración en suero de hormona antimülleriana (AMH) se establece ahora como un marcador fiable de la reserva ovárica. Los niveles decrecientes de AMH se correlacionan con una respuesta ovárica reducida a las gonadotropinas durante la EOC. Además, los niveles altos de AMH son un buen factor pronóstico de una respuesta ovárica excesiva y un indicador de riesgo de desarrollar SHO.
En un estudio preliminar de mujeres menores de 35 años sometidas a TRA, se utilizó el algoritmo de dosificación CONSORT (que incorpora FSH inicial, IMC, edad y AFC) para predecir la dosis inicial óptima de FSH para EOC en mujeres con riesgo de desarrollar SHO (Olivennes et al., 2009). La individualización de la dosis dio lugar a una producción adecuada de ovocitos y a una tasa de embarazos satisfactoria. Sin embargo, hubo altas tasas de cancelaciones en el grupo de dosis baja (75 UI de FSH) debido a una respuesta inadecuada, y se produjo SHO en una proporción significativa de pacientes.
Por lo tanto, existe la necesidad de una composición para su uso en protocolos EOC individualizados que proporcione una respuesta adecuada a la estimulación y/o un riesgo reducido de desarrollar SHO.
Tal como se ha indicado anteriormente, los protocolos EOC convencionales pueden incluir la administración de FSH. La FSH se secreta de forma natural por la hipófisis anterior y su función es promover el desarrollo folicular y la ovulación. La FSH comprende una subunidad alfa de 92 aminoácidos, también común a las otras hormonas glicoproteicas LH y CG, y una subunidad beta de 111 aminoácidos exclusiva de la FSH que confiere la especificidad biológica de la hormona (Pierce y Parsons, 1981). Cada subunidad se modifica postraduccionalmente mediante la adición de residuos de carbohidratos complejos. Ambas subunidades portan 2 sitios para la unión de glicanos ligados a N, la subunidad alfa en los aminoácidos 52 y 78 y la subunidad beta en los residuos de aminoácidos 7 y 24 (Rathnam y Saxena, 1975, Saxena y Rathnam, 1976). Por lo tanto, la FSH se glicosila hasta aproximadamente el 30% en masa (Dias y Van Roey. 2001. Fox et al. 2001).
La FSH purificada a partir de orina humana posmenopáusica se ha utilizado durante muchos años en el tratamiento de la esterilidad; tanto para promover la ovulación en la reproducción natural como para proporcionar ovocitos para tecnologías de reproducción asistida. Los productos de FSH recombinante (rFSH) actualmente aprobados para la estimulación ovárica, tales como folitropina alfa (GONAL-F, Merck Serono/EMD Serono) y folitropina beta (PUREGON/FOLLISTIM, MSD/Schering-Plough), se derivan de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Actualmente, no se encuentran disponibles comercialmente productos de rFSH derivados de una línea celular humana.
Existe una considerable heterogeneidad asociada con las preparaciones de FSH, que se relaciona con las diferencias en las cantidades de las diversas isoformas presentes. Las isoformas de FSH individuales presentan secuencias de aminoácidos idénticas, pero difieren en el grado en el que se modifican postraduccionalmente; las isoformas particulares se caracterizan por la heterogeneidad de las estructuras de ramificación de carbohidratos y las diferentes cantidades de incorporación de ácido siálico (un azúcar terminal), que parecen influir ambas en la bioactividad de la isoforma específica.
La glicosilación de FSH natural es muy compleja. Los glicanos en la FSH hipofisaria derivada de forma natural pueden contener una amplia gama de estructuras que pueden incluir combinaciones de glicanos mono-, bi-, tri- y tetraantenarios (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et al., 1987. Baenziger y Green, 1988). Los glicanos pueden portar modificaciones adicionales: fucosilación del núcleo, glucosamina bisectante, cadenas extendidas con acetillactosamina, sialilación parcial o completa, sialilación con enlaces a2,3 y a2,6 y galactosamina sulfatada sustituida por
galactosa (Dalpathado et al., 2006). Además, existen diferencias entre las distribuciones de las estructuras de glicano en los sitios de glicosilación individuales. Se ha encontrado un nivel comparable de complejidad de glicanos en la FSH derivada del suero de individuos y de la orina de mujeres posmenopáusicas (Wide et al., 2007).
La glicosilación de los productos de FSH recombinante refleja el abanico de glicosiltransferasas presentes en la línea celular huésped. Los productos de rFSH disponibles comercialmente se derivan de células de ovario de hámster chino (células CHO) genomanipuladas. La diversidad de modificaciones de glicanos en rFSH derivada de células CHO es más limitada que la que se encuentran en los productos naturales. Los ejemplos de la heterogeneidad de glicanos reducida que se encuentra en la rFSH derivada de células CHO incluyen la ausencia de glucosamina bisectante y un contenido reducido de fucosilación del núcleo y extensiones de acetil-lactosamina (Hard et al., 1990). Además, las células CHO solo pueden añadir ácido siálico utilizando el enlace a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990); la rFSH derivada de células CHO solo incluye ácido siálico unido en a2,3 y no incluye ácido siálico unido en a2,6.
Por lo tanto, la FSH derivada de células CHO es diferente de la FSH producida de forma natural (por ejemplo, la FSH hipofisaria/sérica/urinaria humana) que contiene glicanos con una mezcla de ácido siálico unido en a2,3 y en a2,6, con predominio del primero.
Además, también se ha demostrado que la preparación de FSH recombinante disponible comercialmente difiere en las cantidades de FSH con un punto isoeléctrico (μl) inferior a 4 (consideradas las isoformas ácidas) en comparación con la FSH hipofisaria, sérica o urinaria posmenopáusica (Ulloa-Aguirre et al. 1995). La cantidad de isoformas ácidas en las preparaciones urinarias fue mucho mayor en comparación con los productos recombinantes derivados de células CHO, Gonal-f (Merck Serono) y Puregon (Schering Plough) (Andersen et al. 2004). Esto debe reflejar un contenido molar más bajo de ácido siálico en la FSH recombinante ya que el contenido de glicano cargado negativamente modificado con sulfato es bajo en la FSH recombinante. El menor contenido de ácido siálico, en comparación con la FSH natural, es una característica de los productos de FSH recombinante disponibles comercialmente y puede reflejar una limitación en el proceso de fabricación.
La vida útil en circulación de la FSH se ha documentado para materiales procedentes de una diversidad de fuentes. Algunos de estos materiales se han fraccionado basándose en la carga molecular global, caracterizada por su μl, en la que más ácido equivale a una carga negativa más alta. Tal como se ha expuesto anteriormente, el principal contribuyente a la carga molecular general es el contenido siálico total de cada molécula de FSH. Por ejemplo, la rFSH (Organon) presenta un contenido de ácido siálico de aproximadamente 8 mol/mol, mientras que la FSH derivada de orina presenta un contenido de ácido siálico más elevado (de Leeuw et al. 1996). Las tasas de aclaramiento plasmático correspondientes en ratas son 0,34 y 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre et al.2003). En otro ejemplo en el que se dividió una muestra de FSH recombinante en fracciones de μl alto y bajo, la potencia in vivo de la fracción de μl alto (menor contenido de ácido siálico) disminuyó y presentó una semivida plasmática más reducida (D'Antonio et al. 1999). También se ha notificado que la FSH más básica que circula durante las últimas etapas del ciclo de ovulación se debe a la regulación a la baja de la a2,3-sialiltransferasa en la hipófisis anterior que está provocada por niveles crecientes de estradiol (Damian-Matsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2001). No se han notificado resultados para la a2,6-sialiltransferasa.
Por lo tanto, tal como se ha expuesto anteriormente, las proteínas recombinantes expresadas utilizando el sistema CHO diferirán de sus homólogos naturales en su tipo de enlaces terminales de ácido siálico. Esta es una consideración importante en la producción de productos biológicos para uso farmacéutico, ya que los restos de carbohidratos pueden contribuir a los atributos farmacológicos de la molécula. Los presentes solicitantes han desarrollado una FSH recombinante derivada de ser humano que es objeto de la solicitud de patente internacional N° PCT/GB2009/000978, publicado como documento WO2009/127826A. Se preparó FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6 genomanipulando una línea celular humana para expresar tanto rFSH como a2,3-sialiltransferasa. El producto expresado es muy ácido y porta una mezcla de ácidos siálicos con enlaces tanto a2,3 como a2,6; estos últimos vienen proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. Se encontró que el tipo de enlace de ácido siálico, a2,3 o a2,6, puede tener una influencia drástica sobre el aclaramiento biológico de FSH. La FSH recombinante con una mezcla de ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6 tiene dos ventajas sobre la rFSH expresada en células CHO convencionales: en primer lugar, el material está más altamente sialilado debido a las actividades combinadas de las dos sialiltransferasas; y en segundo lugar, el material se parece más a la FSH natural. Es probable que esto sea biológicamente más apropiado en comparación con los productos recombinantes derivados de células CHO que solo producen ácido siálico unido en a2,3 (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990) y presentan un contenido de ácido siálico reducido (Ulloa-Aguirre et al. 1995., Andersen et al. 2004).
El producto rFSH divulgado en la solicitud de patente internacional N°PCT/GB2009/000978 contiene restos de glicanos ramificados. La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de FSH) y estos glicanos pueden contener una amplia diversidad de estructuras. Tal como se sabe bien en la técnica, puede producirse la ramificación (de un glicano) con el resultado de que el glicano puede tener 1,2, 3, 4 o más residuos de azúcar terminales o "antenas"; los glicanos con 1,2, 3 o 4 restos de azúcar terminales o "antenas" se denominan respectivamente estructuras mono-antenarias, di-antenarias, tri-antenarias o tetra-antenarias. Los glicanos pueden presentar sialilación en estructuras monoantenarias y/o di-antenarias y/o tri-antenarias y/o tetra-antenarias. Un ejemplo de rFSH divulgado en la solicitud de patente internacional N°PCT/GB2009/000978 incluyó estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las cantidades relativas siguientes: el 9-15% mono-sialiladas; el 27-30% di-sialiladas; el 30-36% tri-sialiladas y el 25-29% tetra-sialiladas. Como es bien sabido, una estructura de glicano mono-sialilada porta un residuo de ácido siálico; una estructura de glicano di-sialilada porta dos residuos de ácido siálico; una estructura de glicano tri-sialilada porta tres residuos de ácido siálico; y una estructura de glicano tetra-sialilada porta cuatro residuos de ácido siálico. En el presente documento, terminología tal como "X% de mono-sialiladas", "X% de di-sializadas", "X% de tri-sialiladas" o "X% de tetra-sialiladas" se refiere al número de estructuras de glicano en FSH que están monosialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como un porcentaje (X%) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de alguna forma (portan ácido siálico). Por lo tanto, la expresión "el 30-36% de estructuras de glicano tri-sialiladas" significa que, del número total de estructuras de glicano en la FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, están sialiladas), del 30 al 36% de estas estructuras de glicano están trisialiladas (portan tres residuos de ácido siálico). Los solicitantes han descubierto, sorprendentemente, que la FSH que presenta una cantidad específica de estructuras de glicano tetra-sialiladas (que es diferente a la del producto de rFSH de ejemplo divulgado en el documento PCT/GB2009/000978 mencionado anteriormente) es notablemente más potente que los productos de FSH recombinante que se encuentran actualmente en el mercado. La secuencia de aminoácidos de los productos del solicitante es la secuencia nativa y es idéntica a la FSH humana natural y a productos de rFSH derivada de CHO existentes. Sin embargo, los presentes solicitantes han descubierto que los productos de FSH recombinante derivada de ser humano (es decir, FSH recombinante producida o expresada en una línea celular humana, por ejemplo, genomanipulando una línea celular humana) que tienen una mezcla de ácido siálico unido tanto en a2,3 como en a2,6 y/o una cantidad específica de estructuras de glicano tetrasialiladas pueden ser particularmente eficaces cuando se utilizan en protocolos EOC (por ejemplo, individualizados).
Según la invención, se proporciona un producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende una hormona estimulante del folículo (FSH) derivada de ser humano para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l (por ejemplo, 0,05 pmol/l a 14,9 pmol/l), en el que el producto debe administrarse a una dosis de, o equivalente a, 11 a 13 gg, por ejemplo 12 gg, de FSH recombinante derivada de ser humano por día, incluyendo la FSH recombinante derivada de ser humano una sialilación a2,3 y a2,6 en la que del 30% al 60% de la sialilación total es una sialilación a2,3, por ejemplo en la que del 40% al 50% de la sialilación total es una sialilación a2,3. Preferentemente, el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación (por ejemplo, de medición) del nivel de AMH en suero de la paciente y la administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l (por ejemplo, de 0,05 pmol/l a 14,9 pmol/l).
Las dosis anteriores pueden ser para el tratamiento de la esterilidad en el primer protocolo de estimulación de la paciente (del sujeto). Se apreciará que, para ciclos de estimulación adicionales, las dosis se pueden ajustar según la respuesta ovárica real en el primer ciclo.
Los solicitantes han descubierto que generalmente es necesaria la recuperación de aproximadamente nueve ovocitos con el fin de permitir la selección de dos ovocitos de alta calidad para la transferencia.
Los solicitantes han descubierto que para sujetos que presentan un nivel bajo de AMH (AMH <15 pmol/l por litro) se requiere una dosis razonablemente alta de FSH recombinante (por ejemplo 12 gg) para lograr esto. A esta dosis, se recuperarán de 8 a 14 ovocitos del 60% de los sujetos con nivel bajo de AMH. Esta es una mejora inesperada y significativa con respecto al tratamiento de sujetos con nivel bajo de AMH tratados con 150 UI de Gonal-f, en el que se recuperan de 8 a 14 ovocitos de solo el 33% de los sujetos. Los solicitantes han descubierto que no es necesario ajustar esta dosis según el peso corporal de la paciente.
Sin embargo, el 60% de la población (y el 80% de las mujeres menores de 30 años tratadas por esterilidad) tienen un nivel alto de AMH (es decir, AMH > 15 pmol/l). Para estos sujetos, generalmente es bastante sencillo recuperar una media de 9 a 11 ovocitos; el problema con los protocolos de estimulación es el riesgo de desarrollar SHO. Los solicitantes han descubierto que en pacientes que reciben bajas dosis de FSH recombinante humana existe una relación entre los ovocitos recuperados y el peso corporal del sujeto. Esto significa que puede haber un riesgo asociado con el tratamiento con una dosis fija de FSH (lo que es habitual en la técnica). Los presentes solicitantes han establecido una relación entre la dosis de FSH y el nivel de AMH y el peso del sujeto que proporciona un perfil de seguridad mejorado (riesgo reducido de desarrollar SHO) con una recuperación de ovocitos aceptable o mejorada en comparación con los protocolos de tratamiento conocidos (véase el ejemplo 10).
Según la invención, en un aspecto adicional, se proporciona un producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende una hormona estimulante del folículo (FSH) derivada de ser humano para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l, en el que el producto debe administrarse a una dosis de, o equivalente a, 0,09 a 0,19 gg (por ejemplo de 0,09 a 0,17 gg) de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente por día, incluyendo la FSH recombinante derivada de ser humano una sialilación a2,3 y a2,6 en la que del 30% al 60% de la sialilación total es una sialilación a2,3, por ejemplo en la que del 40% al 50% de la sialilación total es una sialilación a2,3. Preferentemente, el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación (por ejemplo, de medición) del nivel de AMH en suero de la paciente y la administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l. En una forma de realización, el producto
se utiliza en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l, y el producto se administra a una dosis de, o equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,15 a 0,16 μg de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente por día. En esta forma de realización, el tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de determinación (por ejemplo, de medición) del nivel de AMH en suero de la paciente y la administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. En otra forma realización, el producto se utiliza en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l, y el producto se administra a una dosis de, o equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente 0,12 a 0,13 μg de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente por día. En esta forma de realización, el tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de determinación (por ejemplo, de medición) del nivel de AMH en suero de la paciente y la administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l. En otra forma de realización más, el producto se utiliza en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero > 35 pmol/l, y el producto se administra a una dosis de, o equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente por día. En esta forma de realización, el tratamiento de la esterilidad puede comprender una etapa de determinación (por ejemplo, de medición) del nivel de AMH en suero de la paciente y la administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 35 pmol/l. Las dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que minimizan el riesgo de desarrollar SHO.
Las dosis anteriores pueden ser para el tratamiento de la esterilidad en el primer protocolo de estimulación de la paciente (del sujeto). Se apreciará que, para ciclos de estimulación adicionales, las dosis se pueden ajustar según la respuesta ovárica real en el primer ciclo.
Se apreciará que estas dosis pueden convertirse fácilmente para tratar pacientes con una dosificación según su IMC, utilizando conversiones bien conocidas en la técnica.
Preferentemente, la rFSH (por ejemplo, FSH recombinante derivada de una línea celular humana) incluye estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas, en las que el 15-24%, por ejemplo, el 17-23% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetra-sialiladas (por ejemplo, tal como se muestra mediante el análisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos siguientes). La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de FSH). Es bien sabido que los glicanos en FSH pueden contener una amplia diversidad de estructuras. Estas pueden incluir combinaciones de glicanos mono-antenarios, bi-antenarios, tri-antenarios y tetra-antenarios. En el presente documento, la terminología tal como "el X% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetra-sialiladas" se refiere al número de estructuras de glicano en la FSH que están tetra-sialiladas, es decir, que portan cuatro residuos de ácido siálico, expresado como un porcentaje (X%) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de alguna forma (portan ácido siálico). Por lo tanto, la frase "el 15-24% de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetra-sialiladas" significa que, del número total de estructuras de glicano en la FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, que están sialiladas), del 15 al 24% de estas estructuras de glicano están tetra-sialiladas (portan cuatro residuos de ácido siálico).
La rFSH puede estar presente como una sola isoforma o como una mezcla de isoformas.
Los solicitantes han ideado protocolos de EOC "individualizados" en los que se utilizan dosis específicas de FSH recombinante que tienen características específicas para tratar pacientes en función de sus niveles específicos de AMH, aumentando así la probabilidad de una respuesta adecuada a la estimulación (por ejemplo, en pacientes que tienen un potencial de respuesta bajo) y/o de un riesgo reducido de desarrollar SHO (por ejemplo, en pacientes clasificados como pacientes que tienen un potencial de respuesta alto o excesivo).
El nivel de AMH en suero puede determinarse (por ejemplo, medirse) mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Preferentemente, el nivel de AMH en suero se mide utilizando el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas AMH Gen-II, (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/l con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/l. Pueden utilizarse otros ensayos.
En el presente documento, los valores del nivel de AMH en suero se indican generalmente en términos de pmol/l. Estos se pueden convertir a ng/ml utilizando la ecuación de conversión 1 ng/ml de AMH = 7,1 pmol/l de AMH.
En el presente documento, los términos "paciente" y "sujeto" se utilizan indistintamente.
El producto (por ejemplo, la composición farmacéutica) comprende preferentemente una dosis diaria de, o una dosis diaria equivalente a, las cantidades de rFSH derivada de ser humano definidas anteriormente, en el presente documento y en las reivindicaciones. La dosis (diaria) puede ser una dosis inicial (es decir, puede reducirse, aumentarse o mantenerse durante el tratamiento).
El producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede ser para la administración (diaria) de FSH comenzando el día uno del tratamiento y continuando durante siete a trece días, por ejemplo, nueve a trece días, por ejemplo, 10 a 13 días, por ejemplo, 10 a 11 días. El producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede ser
para su administración de 12 a 16, por ejemplo, de 13 a 15, por ejemplo 14 días después de la administración de (por ejemplo, después del inicio de la administración de, por ejemplo, después del inicio de la administración diaria de) un agonista de GnRH (por ejemplo, Synarel, Lupron, Decapeptyl). El producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede ser para su administración con un agonista de GnRH. El producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede ser para su administración antes de la administración de un antagonista de GnRH (por ejemplo, ganirelix, cetrorelix), por ejemplo, para su administración cinco o seis días antes de la administración de un antagonista de GnRH. El producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) puede ser para su administración con un antagonista de GnRH. Preferentemente, el producto (por ejemplo, una composición farmacéutica) es para su administración antes de la administración de una dosis alta (ovulatoria) de hCG (por ejemplo, 4.000 a 11.000 UI de hCG, por ejemplo 5.000 UI de hCG, 10.000 UI de hCG, etc.; o de 150 a 350 microgramos de hCG recombinante, por ejemplo 250 microgramos de hCG recombinante) para inducir la maduración folicular final.
Se apreciará que el producto puede dosificarse a frecuencias superiores (o inferiores) a la frecuencia diaria, en cuyo caso las dosis relevantes serán equivalentes a las dosis (diarias) especificadas en el presente documento.
En el presente documento, el término "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad mediante estimulación ovárica controlada (EOC) o procedimientos que incluyen una fase o etapa de estimulación ovárica controlada (EOC), por ejemplo, inseminación intrauterina (IIU), fertilización in vitro (FIV) o inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). El término "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad mediante inducción de la ovulación (OI) o mediante procedimientos que incluyen una fase o etapa de inducción de la ovulación (OI). El término "tratamiento de la esterilidad" incluye el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que padece esterilidad tubárica o idiopática, incluido el tratamiento de la esterilidad en un sujeto que padece endometriosis, por ejemplo, endometriosis en estadio I o II, y/o en un sujeto que padece esterilidad anovulatoria, por por ejemplo, esterilidad anovulatoria de tipo II de la OMS, y/o en un sujeto con una pareja con esterilidad por factor masculino. El producto (o la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que padece endometriosis, por ejemplo, en un sujeto que padece endometriosis en estadio I o en estadio II, tal como se define por el sistema de clasificación de The American Society for Reproductive Medicine (ASRM) para los distintos estadios de endometriosis (siendo el estadio IV el más grave y el estadio I el menos grave) [American Society for Reproductive Medicine. Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. FertilSteril 1997; 67,817821].
El producto (la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene un nivel normal de FSH en suero de 1 a 16 UI/l, por ejemplo 1 a 12 UI/l, en la fase folicular temprana.
El producto (la composición) puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto de 18 a 42 años, por ejemplo, de 25 a 37 años. El producto puede ser para (su uso en) el tratamiento de la esterilidad (y/o para la estimulación ovárica controlada) en un sujeto que tiene un IMC > 1 y IMC < 35 kg/m2, por ejemplo, un sujeto que tiene un IMC > 18 y IMC < 25 kg/m2, por ejemplo, un sujeto que tiene un IMC > 20 y IMC < 25 kg/m2.
La rFSH puede incluir preferentemente el 27-33%, por ejemplo, el 30-32%, de estructuras de glicano tri-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 24-33%, por ejemplo, el 26-30%, de estructuras de glicano di-sialiladas. La rFSH puede incluir preferentemente el 12-21%, por ejemplo, el 15-17%, de estructuras de glicano mono-sialiladas. La rFSH incluye preferentemente estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, trisialiladas y tetra-sialiladas con las cantidades relativas siguientes: del 15 al 17% mono-sialiladas; el 26-30% di-sialiladas; el 27-33% (por ejemplo, del 29 al 32%, por ejemplo el 30-32%, por ejemplo del 30 al 31%) tri-sialiladas y el 17-23% tetra-sialiladas (por ejemplo, tal como se muestra en el análisis por WAX de glicanos cargados, tal como se expone en los ejemplos). La rFSH puede incluir del 0 al 7%, por ejemplo, del 0,1 al 7%, por ejemplo, del 3 al 6%, por ejemplo, del 5 al 6%, de estructuras sialiladas neutras. La FSH comprende glicanos (unidos a las glicoproteínas de FSH). En el presente documento, terminología tal como "X% mono-sialiladas", "X% di-sializadas", "X% tri-sialiladas" o "X% tetra-sialiladas" se refiere al número de estructuras de glicano en FSH que están mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas o tetra-sialiladas (respectivamente), expresadas como un porcentaje (X%) del número total de estructuras de glicano en la FSH que están sialiladas de alguna forma (portan ácido siálico). Por lo tanto, la frase "el 27-33% de estructuras de glicano trisialiladas" significa que, del número total de estructuras de glicano en la FSH que portan residuos de ácido siálico (es decir, están sialiladas), del 27 al 33% de estas estructuras de glicano están tri-sialiladas (portan tres residuos de ácido siálico).
La rFSH puede presentar un contenido de ácido siálico [expresado en términos de una relación de moles de ácido siálico con respecto a moles de proteína] de 6 mol/mol o más, por ejemplo de entre 6 mol/mol y 15 mol/mol, por ejemplo, de entre 8 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo, de entre 10 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo de entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo de entre 12 mol/mol y 14 mol/mol, por ejemplo de entre 12 mol/mol y 13 mol/mol. La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana.
Por sialilacion se entiende la cantidad de residuos siálicos presentes en las estructuras de carbohidratos de FSH. Sialilacion a2,3 significa sialilación en la posición 2,3 (como es bien conocido en la técnica) y sialilación a2,6 en la
posición 2,6 (también bien conocida en la técnica). Por lo tanto, "el % de la sialilación total puede ser sialilación a2,3" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,3. El término "% de la sialilación total que es a2,6-sialilación" se refiere al % del número total de residuos de ácido siálico presentes en la FSH que están sialilados en la posición 2,6.
La rFSH puede tener un contenido de ácido siálico (cantidad de sialilación por molécula de FSH) de (con respecto a la masa de proteína, en lugar de a la masa de proteína más carbohidrato) del 6% o superior (por ejemplo, entre el 6% y el 15%, por ejemplo, entre el 7% y el 13%, por ejemplo, entre el 8% y el 12%, por ejemplo, entre el 11% y el 15%, por ejemplo, entre el 12% y el 14%) en masa.
La rFSH puede ser rFSH o una preparación de rFSH en la que el 16% o menos (por ejemplo, del 0,1 al 16%) de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilglucosamina bisectante (GlcNAc bisectante o bisGlcNAc). Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una rFSH o preparación de rFSH en la que del 8 al 14,5% de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una N-acetilglucosamina bisectante (GlcNAc bisectante o bisGlcNAc).
Se entenderá que la FSH comprende glicanos unidos a las glicoproteínas de FSH. También se entenderá que el 100% de los glicanos se refiere o significa todos los glicanos unidos a las glicoproteínas FSH. Por lo tanto, en el presente documento, la terminología "del 8 al 14,5% de los glicanos comprenden (portan) N-acetilglucosamina bisectante" significa que del 8 al 14,5% del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectante; "el 16% o menos de los glicanos comprenden (portan) N-acetilglucosamina bisectante" significa que el 16% o menos del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas FSH incluyen/portan N-acetilglucosamina bisectante, etc.
Los solicitantes han descubierto que la FSH recombinante (preparaciones de rFSH; composiciones de rFSH) en la que el 16% o menos (por ejemplo, del 8 al 14,5%) de los glicanos comprendidos en las glicoproteínas de FSH portan GlcNac bisectante puede tener propiedades farmacocinéticas ventajosas. Se cree que las propiedades ventajosas pueden desarrollarse debido a que la cantidad de glicanos que transportan GlcNac bisectante es similar a la del producto derivado de orina humana Bravelle, que es bastante menor que la de otras preparaciones de FSH recombinante tales como las divulgadas en el documento WO2012/017058.
La rFSH (o preparación de rFSH) puede ser una preparación de rFSH o rFSH en la que el 20% o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) N-acetilgalactosamina (GalNAc), por ejemplo, en la que el 20% o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) una GalNAc terminal. Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una FSH o preparación de FSH en la que del 40 al 55%, por ejemplo, del 42% al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc. Preferentemente, la rFSH (o preparación de rFSH) es una FSH o preparación de FSH en la que del 40 al 55%, por ejemplo, del 42% al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal.
Se entenderá que la FSH comprende glicanos unidos a las glicoproteínas de FSH. También se entenderá que el 100% de los glicanos se refiere o significa todos los glicanos unidos a las glicoproteínas de FSH. Así, por lo tanto, en el presente documento, la terminología "en la que el 20% o más de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc" significa que el 20% o más del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas de FSH incluyen/portan N-acetilgalactosamina (GalNAc); "del 40 al 55%, por ejemplo del 42% al 52%, de los glicanos comprenden (por ejemplo, portan) GalNAc terminal" significa que del 40 al 55%, por ejemplo del 42% al 52%, del número total de glicanos unidos a las glicoproteínas FSH incluyen/portan GalNAc terminal, etc.
Parece que la disponibilidad del enlace a2,6 aumenta el número de estructuras tetra-sialiladas, en comparación con los productos derivados de células CHO que solo tienen disponible el enlace a2,3. Los solicitantes también han descubierto que su rFSH se distingue sobre otros productos aprobados debido a la composición de azúcares: incluye, o puede incluir, una cantidad específica de GalNac. Esto puede estar relacionado con la tetra-sialilación y la potencia porque la 2,6-sialilación está asociada con GalNac. En otras palabras, los presentes solicitantes han desarrollado un producto rFSH que incluye características específicas (sitios de enlazador 2,6, GalNac) que proporcionan rFSH con un alto grado de sialilación, lo que parece conducir a una potencia mejorada in vivo.
La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener del 16 al 24% de los glicanos que comprenden 1 fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal), por ejemplo, del 16,5 al 18% de los glicanos que comprenden 1 fucosa-Lewis (por ejemplo, terminal). La rFSH (o preparación de rFSH) puede tener del 1,5 al 4,5%, por ejemplo, del 2 al 4%, por ejemplo, el 3,7%, de los glicanos que comprenden (por ejemplo, terminal) 2 fucosa-Lewis. El contenido de fucosa-Lewis puede afectar a la potencia.
La rFSH puede producirse o expresarse en una línea celular humana, por ejemplo, una línea celular Per.C6, una línea celular HEK293, una línea celular HT1080, etc. Esto puede simplificar (y hacer más eficaz) el procedimiento de producción ya que la manipulación y el control de, por ejemplo, el medio de crecimiento celular para mantener la sialilación puede ser menos crítico que con los procesos conocidos. El procedimiento también puede ser más eficaz porque se produce poca rFSH básica en comparación con la producción de productos de rFSH conocidos; se produce más rFSH ácida y la separación/eliminación de FSH básica es menos problemática. La rFSH puede producirse o
expresarse en una línea celular PER.C6®, una línea celular derivada de PER.C6® o una línea celular PER.C6® modificada. La rFSH que se produce o se expresa en una línea celular humana (por ejemplo, línea celular PER.C6®, línea celular HEK293, línea celular HT1080, etc.) incluirá algunos ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular] e incluirá algunos ácidos siálicos unidos en a2,3 (sialilación a2,3) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena. La línea celular se puede modificar utilizando a2,3-sialiltransferasa. La línea celular puede modificarse utilizando a2,6-sialiltransferasa. Como alternativa o adicionalmente, la rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena [de la línea celular]. En el presente documento documento, el término "FSH recombinante derivada de ser humano" significa FSH recombinante que se produce o se expresa en una línea celular humana (por ejemplo, FSH recombinante producida genomanipulando una línea celular humana).
La rFSH puede producirse utilizando a2,3- y/o a2,6-sialiltransferasa. En un ejemplo, la rFSH se produce utilizando a2,3-sialiltransferasa. La rFSH puede incluir ácidos siálicos unidos en a2,6 (sialilación a2,6) proporcionados por la actividad de sialiltransferasa endógena.
El producto puede ser una composición farmacéutica. La composición farmacéutica es para el tratamiento de la esterilidad. El tratamiento de la esterilidad puede comprender tecnologías de reproducción asistida (TRA), inducción de la ovulación o inseminación intrauterina (IIU). La composición farmacéutica puede utilizarse, por ejemplo, en indicaciones médicas en las que se utilizan preparaciones conocidas de FSH.
El producto o la composición puede formularse en composiciones bien conocidas para cualquier vía de administración de fármacos, por ejemplo, oral, rectal, parenteral, transdérmica (por ejemplo, tecnología de parches), intravenosa, intramuscular, subcutánea, intrasusternal, intravaginal, intraperitoneal, local (polvos, ungüentos o gotas) o como pulverización bucal o nasal. Una composición típica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa, excipientes no tóxicos, que incluyen sales y conservantes, tampones y similares, tal como se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición (Matt Publishing Company, 1975), páginas 1405 a 1412 y 1461 a 87, y el formulario nacional XIV decimocuarta edición (American Pharmaceutical Association, 1975), entre otros.
Los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o vehículos farmacéuticos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), carboximetilcelulosa y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (como el aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Las composiciones de la presente invención también pueden contener aditivos tales como, pero sin limitación, conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, tensioactivos y agentes dispersantes. Pueden incluirse agentes antibacterianos y antifúngicos para prevenir el crecimiento de microbios, que incluyen, por ejemplo, m-cresol, alcohol bencílico, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en modo alguno a estos ejemplos. Además, puede ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro de sodio y similares. El producto o la composición puede comprender además una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o de K+ o una combinación de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.
Preferentemente, el producto o composición comprende FSH recombinante y uno o más de polisorbato-20, L-metionina, fenol, sulfato disódico y tampón de fosfato de sodio.
En algunos casos, para lograr una acción prolongada, es deseable ralentizar la absorción de FSH (y otros ingredientes activos, si están presentes) de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción de FSH depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Como alternativa, la absorción retardada de una forma de combinación de FSH administrada por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo la combinación de FSH en un vehículo oleoso. Pueden prepararse formas de depósito inyectables formando matrices de microencapsulación de la FSH (y otros agentes, si están presentes) en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la relación de FSH con respecto al polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación de FSH. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen polivinilpirrolidona, poli(ortoésteres), poli(anhídridos), etc. Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando la FSH en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales.
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua esterilizada u otro medio inyectable esterilizado justo antes de su uso. Las formulaciones inyectables se pueden suministrar en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo, un vial, una jeringa precargada, cartuchos de inyección y similares.
El producto o la composición puede formularse para un solo uso o para múltiples usos (dosis múltiples). Si el producto o la composición se formula para múltiples usos, se prefiere que se incluya un conservante. Si se incluye un conservante, se prefieren alcohol bencílico, fenol y/o m-cresol; sin embargo, el conservante no se limita en modo alguno a estos ejemplos. El producto o la composición formulado de uso único o de uso múltiple puede comprender además una sal que comprende un catión de metal alcalino farmacéuticamente aceptable seleccionada del grupo que consiste en sales de Na+ o de K+ o una combinación de las mismas. Preferentemente, la sal es una sal de Na+, por ejemplo, NaCl o Na2SO4.
El producto o la composición puede incluirse en un recipiente tal como un vial, un cartucho precargado (por ejemplo, para una sola administración o un uso múltiple) o un dispositivo de inyección como una "pluma" para, por ejemplo, administración de múltiples dosis.
El producto o la composición puede ser una formulación (por ejemplo, formulación inyectable) que incluye FSH (opcionalmente con hCG, LH, actividad de LH, etc.). La actividad de LH, si está presente, puede originarse a partir de LH o gonadotropina coriónica humana, hCG. Si hay más de un ingrediente activo (es decir, FSH y por ejemplo hCG o LH) estos pueden ser adecuados para su administración por separado o conjuntamente. Si se administra por separado, la administración puede ser secuencial. El producto se puede suministrar en cualquier envase apropiado. Por ejemplo, un producto puede incluir varios recipientes (por ejemplo, jeringas o viales precargados) que contienen FSH o hCG, o una combinación (o combinación) de FSH y hCG. La hCG puede ser hCG recombinante o hCG urinaria. Si el producto incluye varios recipientes (por ejemplo, jeringas o viales precargados) que contienen FSH, por ejemplo, FSH recombinante, cada recipiente puede incluir la misma cantidad de FSH. Uno o más recipientes pueden incluir diferentes cantidades de FSH. Las jeringas o viales pueden envasarse en un envase de tipo blíster u otros medios para mantener la esterilidad. Cualquier producto puede contener opcionalmente instrucciones para utilizar las formulaciones de FSH (y, por ejemplo, hCG, si está presente). El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según la práctica rutinaria en este campo. Véase GOODMAN y GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7a ed. En una forma de realización preferida, las composiciones de la invención se suministran como composiciones para administración parenteral. Los procedimientos generales para la preparación de las formulaciones de uso parenteral se conocen en la técnica y se describen en REMINGTo N; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, citado anteriormente, en las páginas 780-820. Las composiciones de uso parenteral se pueden suministrar en formulación líquida o como un sólido que se mezclará con un medio inyectable estéril justo antes de la administración. En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones de uso parenteral se suministran en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra un mapa de plásmido del vector de expresión pFSHalfa/beta;
La figura 2 muestra el vector de expresión de a2,3-sialiltransferasa (ST3GAL4);
La figura 3 muestra el vector de expresión de a2,6-sialiltransferasa (ST6GAL1);
La figura 4 muestra el % de abundancia de distribución de ácido siálico de ejemplos de FSH recombinante producida por células PER.C6® que expresan FSH de manera estable después de genomanipulación con a2,3-sialiltransferasa;
La figura 5 muestra el % de abundancia de distribución de carga de glicanos de ejemplos de FSH recombinante producida por células PER.C6® que expresan FSH de manera estable después de genomanipulación con a2,3-sialiltransferasa;
La figura 6 muestra una comparación de la concentración de inhibina-B despuis de la administración de 225 UI de Gonal f (línea inferior, línea discontinua) y 225 UI del ejemplo (línea superior, línea continua) de la invención;
La figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con bajo nivel de AMH (ejemplo 10, 10A); y
La figura 8 muestra el efecto del peso corporal en los ovocitos recuperados en el grupo de tratamiento con alto nivel de AMH
Selección de secuencia
FSH humana
Se utilizó la región codificante del gen para el polipéptido de FSH alfa según Fiddes y Goodman. (1981). La secuencia se registra en el banco como AH007338 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteínas. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 1.
Se utilizó la región codificante del gen para el polipéptido de FSH beta según Keene et al (1989). La secuencia se registra en el banco como NM_000510 y en el momento de la construcción no había otras variantes de esta secuencia de proteínas. La secuencia se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 2
Sialil-transferasa
a2,3-sialiltransferasa: se utilizó la región codificante del gen de la beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (a2,3-sialiltransferasa, ST3GAL4) según Kitagawa y Paulson (1994). La secuencia se registra en el banco como L23767 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 3.
a2,6-sialiltransferasa: se utilizó la región codificante del gen de la beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (a2,6-sialiltransferasa, ST6GAL1) según Grundmann et al. (1990). La secuencia se registra en el banco como NM_003032 y se denomina en el presente documento SEQ ID NO: 4.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción del vector de expresión de FSH
La secuencia codificante del polipéptido de FSH alfa (AH007338, SEQ ID NO: 1) y el polipéptido de FSH beta (NM_003032, SEQ ID NO: 2) se amplificaron mediante PCR utilizando las combinaciones de cebadores FSHa-fw y FSHa-rev y FSHb-fw y FSHb-rec respectivamente.
FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3' (SEQ ID NO: 9)
FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3' (SEQ ID NO: 10)
FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3' (SEQ ID NO: 11)
FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)
El ADN de FSH beta amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción AscI y HpaI y se insertó en los sitios AscI y HpaI en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de selección de neomicina. De forma similar, el ADN de FSH alfa se digirió con BamHI y NheI y se insertó en los sitios BamHI y NheI en el vector de expresión que ya contenía el ADN del polipéptido beta de FSH.
El vector de ADN se utilizó para transformar la cepa DH5a de E. coli. Se seleccionaron colonias para amplificación. Las colonias que contenían el vector que contenía tanto FSH alfa como beta se seleccionaron para secuenciación y todas contenían las secuencias correctas según SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Se seleccionó el plásmido pFSH A B# 17 para transfección (figura 1).
Ejemplo 2: Construcción del vector de expresión de ST3
La secuencia codificante de beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) se amplificó mediante PCR utilizando la combinación de cebadores 2,3STfw y 2,3ST rev.
2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3' (SEQ ID NO: 13)
2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3' (SEQ ID NO: 14)
El ADN de ST3 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y AflII y se insertó en los sitios BamHI y AflII en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó tal como se ha descrito anteriormente y se secuenció. El clon pST3# 1 (figura 2) contenía la secuencia correcta según SEQ ID NO: 3 y se seleccionó para la transfección.
Ejemplo 3: Construcción del vector de expresión de ST6
La secuencia codificante de beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) se amplificó mediante PCR utilizando la combinación de cebadores 2,6STfw y 2,6STrev.
2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3' (SEQ ID NO: 15)
2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 16)
El ADN de ST6 amplificado resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y NlII y se insertó en los sitios BamHI y NlII en el vector de expresión de mamífero dirigido por CMV que porta un marcador de resistencia a higromicina. El vector se amplificó tal como se ha descrito anteriormente y se secuenció. El clon pST6# 11 (figura 3) contenía la secuencia correcta según SEQ ID NO: 4 y se seleccionó para la transfección.
Ejemplo 4: Expresión estable de pFSH a+p en células PER.C6®. Transfección, aislamiento y selección de clones.
Se generaron clones PER.C6® que producen FSH expresando ambas cadenas polipeptídicas de FSH a partir de un solo plásmido (véase el ejemplo 1).
Para obtener clones estables, un agente de transfección basado en liposomas con el constructo pFSH a+p. Se seleccionaron clones estables en VPRO suplementado con FCS al 10% y que contenía G418. Tres semanas después de la transfección, crecieron clones resistentes a G418. Se seleccionaron clones para aislamiento. Los clones aislados se cultivaron en medio de selección hasta el 70-80% de confluencia. Los sobrenadantes se analizaron para determinar el contenido de proteína FSH utilizando un ELISA selectivo de FSH y la actividad farmacológica en el receptor de FSH en la línea celular clonada, utilizando un ensayo de acumulación de AMPc. Los clones que expresan proteína funcional se llevaron adelante para la expansión del cultivo en matraces de 24 pocillos, de 6 pocillos y T80.
Se iniciaron estudios para determinar la productividad y calidad del material de siete clones en matraces T80 para generar suficiente material. Las células se cultivaron en medio suplementado tal como se ha descrito anteriormente durante 7 días y se recogió el sobrenadante. Se determinó la productividad utilizando el ELISA selectivo de FSH. Se determinó el perfil isoeléctrico del material mediante enfoque isoeléctrico (IEF), mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se seleccionaron clones con suficiente productividad y calidad para obtener por ingeniería genética sialiltransferasa.
Ejemplo 5: El nivel de sialilación aumenta en células que sobreexpresan a2,3-sialiltransferasa. Expresión estable de pST3 en células PER.C6® que expresan FSH; transfección, aislamiento y selección de clones.
Se generaron clones de PER.C6® que producían FSH altamente sialilada expresando a2,3-sialiltransferasa a partir de plásmidos separados (ejemplo 2) en células PER.C6® que ya expresaban ambas cadenas polipeptídicas de FSH (del ejemplo 4). Se seleccionaron clones producidos a partir de células PER.C6® tal como se ha indicado en el ejemplo 4 por sus características, que incluyen productividad, buen perfil de crecimiento, producción de proteína funcional y FSH producida que incluía una determinada sialilación. Se generaron clones estables tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 4. Los clones se aislaron, se expandieron y se analizaron. Los clones de a2,3-sialiltransferasa se adaptaron a medios exentos de suero y las condiciones de suspensión.
Como antes, los clones se analizaron utilizando un ELISA selectivo de FSH, respuesta funcional en una línea celular receptora de FSH, IEF, tasa de aclaramiento metabólico y análisis de Steelman Pohley. Los resultados se compararon con una FSH recombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Serono) y las líneas celulares FSH PER.C6® parentales. La FSH producida por la mayor parte de los clones presenta una sialilación significativamente mejorada (es decir, en promedio, más isoformas de FSH con un alto número de ácidos siálicos) en comparación con la FSH expresada sin a2,3-sialiltransferasa. En conclusión, la expresión de FSH junto con sialiltransferasa en las células PER.C6® dio como resultado un aumento de los niveles de FSH sialilada en comparación con las células que expresan solo FSH.
Ejemplo 6: Perspectiva general de la producción y la purificación
Se desarrolló un procedimiento para producir FSH en células PER.C6® que se cultivaron en suspensión en medio exento de suero. El procedimiento se describe a continuación y se aplicó a varias líneas celulares PER.C6® productoras de FSH.
Se preparó FSH a partir del clon a2,3 (ejemplo 5) utilizando una modificación del procedimiento descrito por Lowry et al. (1976).
Para la producción de PER.C6®-FSH, las líneas celulares se adaptaron a un medio exento de suero, es decir, Excell 525 (JRH Biosciences). Las células se cultivaron en primer lugar para formar una monocapa confluente al 70%-90% en un matraz de cultivo T80. En la pasada, las células se resuspendieron en el medio exento de suero, Excell 525 L-glutamina 4 mM, hasta una densidad celular de 0,3 x 106 células/ml. Se dispuso una suspensión celular de 25 ml en un matraz con agitación de 250 ml y se agitó a 100 rpm a 37 °C con el 5% de CO2. Después de alcanzar una densidad celular > 1 x 106 células/ml, las células se subcultivaron hasta una densidad celular de 0,2 o 0,3 x 106 células/ml y se cultivaron adicionalmente en matraces con agitación a 37 °C, el 5% de CO2 y 100 rpm.
Para la producción de FSH, las células se transfirieron a un medio de producción exento de suero, es decir, VPRO (JRH Biosciences), que soporta el crecimiento de células PER.C6® hasta densidades celulares muy altas (generalmente > 107 células/ml en un cultivo discontinuo). En primer lugar, las células se cultivaron a > 1 x 106
células/ml en Excell 525, después se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y posteriormente se suspendieron en medio VPRO L-glutamina 6 mM a una densidad de 1 x 106 células/ml. Después, las células se cultivaron en un matraz con agitación durante 7-10 días a 37 °C, el 5% de CO2 y 100 rpm. Durante este periodo, las células crecieron hasta una densidad > 107 células/ml. El medio de cultivo se recogió después de que la viabilidad celular comenzara a disminuir. Las células se centrifugaron durante 5 min a 1000 rpm y el sobrenadante se utilizó para la cuantificación y la purificación de FSH. Se determinó la concentración de FSH mediante ELISA (DRG EIA 1288).
Posteriormente, se llevó a cabo la purificación de FSH utilizando una modificación del procedimiento descrito por Lowry et al. (1976). Se llevó a cabo una purificación utilizando cromatografía de carga selectiva para enriquecer las formas altamente sialiladas mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
Durante todos los procedimientos cromatográficos, el enriquecimiento de las formas sialiladas de FSH tal como se reivindica en el presente documento se confirmó por RIA (DRG EIA 1288) y/o IEF.
Ejemplo 7: Cuantificación de cantidades relativas de ácido a2,3- y a2,6-siálico
Se midieron las cantidades porcentuales relativas de ácido a2,3- y a2,6-siálico en rFSH purificada (ejemplo 6) utilizando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras utilizando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y después se marcaron con 2-aminobenzamida. A continuación, las formas de glicanos liberadas se separaron y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para determinar la distribución de carga. Se analizaron adicionalmente mediante una columna WAX los glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinación del ácido siálico total y 2,3-sialidasa para la determinación del ácido 2,3-siálico.
Los porcentajes relativos de los glicanos cargados se calcularon a partir de las estructuras presentes en las agrupaciones de glicanos digeridos y no digeridos y se muestran en la figura 4 (para 8 muestras). Se encontró que estos se encontraban en los intervalos del 50%-70% (por ejemplo, aproximadamente el 60% o el 65%) para la sialilación a2,3 y del 28 al 50%, generalmente del 30 al 35% (por ejemplo, aproximadamente el 31% o el 35%), para la sialilación a2,6.
Ejemplo 8: Cuantificación de cantidades relativas de estructuras de glicano mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas
Se midieron las cantidades porcentuales relativas de estructuras mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetrasialiladas en glicanos extraídos de rFSH purificada (ejemplo 6) utilizando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras utilizando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y después se marcaron con 2-aminobenzamida. Se liberaron glicanos de las muestras utilizando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y después se marcaron con 2-aminobenzamida. A continuación, las formas de glicano liberadas se separaron y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para determinar la distribución de sialilación. Las cantidades relativas de estructuras neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas se muestran en la figura 5 (para las 8 muestras mostradas en la figura 4).
La rFSH incluye estructuras de glicano neutras, mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con las cantidades relativas siguientes: neutras: 5-6%; monosialiladas: 15-17%; disialiladas: 26-30%; trisialiladas: 30-32%; y tetrasialiladas: 17-23%.
Ejemplo 8a
Se midieron las cantidades porcentuales relativas de ácido a2,6-siálico en rFSH purificada extraída de nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los procedimientos del ejemplo 6) utilizando técnicas conocidas.
Se liberaron N-glicanos de las muestras utilizando PNGasa F en condiciones desnaturalizantes y después se marcaron con 2-aminobenzamida. A continuación, las formas de glicanos liberadas se separaron y se analizaron mediante una columna de intercambio aniónico débil (WAX) para determinar la distribución de carga. Los glicanos marcados tratados con 2,3,6,8-sialidasa para la determinación del ácido siálico total y 2,3-sialidasa para la determinación del ácido 2,3-siálico se analizaron adicionalmente mediante una columna wax (véase el ejemplo 8). El análisis permite calcular el ácido a2,6-siálico.
Los porcentajes relativos de los glicanos cargados se calcularon a partir de las estructuras presentes en las agrupaciones de glicanos no digeridos y digeridos y se muestran en la tabla siguiente. Se observó que se encontraban en el intervalo del 25 al 50%, generalmente del 30 al 35% para la sialilación a2,6.
Se midieron las cantidades porcentuales relativas de GlcNac bisectante, GalNac y 1-fucosa-Lewis en glicanos extraídos de las nueve muestras de rFSH purificada (producida mediante los procedimientos del ejemplo 6) utilizando
técnicas conocidas. Los N-glicanos se liberaron de la glicoprotreína utilizando PNGasa F y se marcaron con 2-aminobenzamida (2AB). El análisis se realizó mediante análisis HPLC bidimensional (2D) en combinación con la degradación enzimática de los glicanos. Para su verificación, los glicanos se analizaron por MALDI-MS. Las cantidades relativas de ácido alfa 2,6-siálico y los residuos terminales se muestran en la tabla siguiente, junto con las de Gonal F (FSH recombinante derivada de células CHO) y Bravelle (FSH urinaria humana).
1 El valor de 3,1 es / de fucosa-Lewis total. 2 No determinado
Puede observarse que la cantidad de GalNac en la FSH de la invención varía entre aproximadamente el 44,9 y el 51%, promediando aproximadamente el 47,1%.
Puede observarse que la cantidad de GlcNac bisectante en la FSH de la invención varía entre el 8,7 y el 13,9%, promediando aproximadamente el 10,9%.
Puede observarse que la cantidad de 1-fucosa-Lewis en la FSH de la invención varía entre el 16,1 y el 23,3%, promediando aproximadamente el 19%.
Puede observarse que la cantidad de 2-fucosa-Lewis en la FSH de la invención varía entre el 1,9 y el 4,4%, promediando aproximadamente el 3,7%.
El ejemplo siguiente no forma parte de la invención pero resalta aspectos específicos del objeto reivindicado.
Ejemplo 9: Un estudio de dosis múltiples que investiga la seguridad, la tolerabilidad, la farmacocinética, la farmacodinámica y la inmunogenicidad de FE 999049 en comparación con GONAL-F.
Población de estudio
Un total de 48 mujeres sanas (24 en cada fármaco) recibieron dosis diarias de 14,6 gg de FE 999049 (una composición según la invención, producida según el ejemplo 6) o 16,5 gg de Gonal-F durante siete días.
Resultados de seguridad
La administración de dosis múltiples de FE 999049 y GONAL-F fue segura y, en general, bien tolerada según la evaluación de eventos adversos (EA), signos vitales, ECG, mediciones de laboratorio clínico y examen físico. No se produjo ningún evento adverso grave o muerte durante el estudio.
Resultados farmacocinéticos
Después de la administración de FE 999049 y GONAL-F durante 7 días, los valores de concentración de FSH evaluados inmediatamente antes de la siguiente inyección aumentaron y parecieron alcanzar un nivel de equilibrio después de 6-7 días. Sin embargo, la exposición (AUC y Cmáx) de FE 999049 fue un 60% superior en comparación con Gonal-F.
Resultados farmacodinámicos
Las concentraciones de inhibina-B (véase la figura 6), estradiol y progesterona aumentaron después de la administración de FE 999049 y GONAL-F, pero en mayor medida después de la administración de FE 999049 en comparación con GONAL-F. Tanto el número como la distribución del tamaño de los folículos mostraron una mayor respuesta a FE 999049 en comparación con GONAL-F.
El ejemplo 9 demuestra que la FSH que tiene una cantidad específica (el 17-23%) de estructuras de glicano tetrasialiladas y por ejemplo cantidades específicas de sialilación a2,3 y sialilación a2,6 es marcadamente más potente que los productos de FSH recombinante que se encuentran actualmente en el mercado.
El ejemplo siguiente no forma parte de la invención pero resalta aspectos específicos del objeto reivindicado.
Ejemplo 10: Un estudio de múltiples dosis que investiga FE 999049 en comparación con GONAL-F.
A continuación, se describe un ensayo aleatorizado, controlado, ciego para el evaluador, de grupos paralelos, multinacional y multicéntrico que evalúa la relación dosis-respuesta de FE 999049 en pacientes sometidas a estimulación ovárica controlada para fertilización in vitro (FIV)/inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). La población de pacientes fue de 265 pacientes de FIV con edades comprendidas entre 18 y 37 años, con IMC de 18,5 a 32,0 kg/m2.
El ensayo se diseñó como un ensayo de dosis-respuesta con el número de ovocitos recuperados como criterio de valoración principal. Los criterios de valoración secundarios explorarán el efecto cualitativo y cuantitativo de diferentes dosis de FE 999049 con respecto al perfil endocrino, el desarrollo folicular, la fertilización de ovocitos, la calidad del embrión y la eficacia del tratamiento (es decir, el consumo total de gonadotropinas y la duración de la estimulación). El ensayo se diseña para evaluar la eficacia de FE 999049 para establecer un embarazo cuando se utiliza en estimulación ovárica controlada para ciclos de FIV/ICSI.
Los sujetos se evaluaron dentro de los 3 meses previos a la aleatorización para determinar el cumplimiento de los criterios de inclusión y exclusión, incluida una evaluación de la hormona antimülleriana (AMH) para aumentar la homogeneidad de la población del ensayo con respecto a la respuesta ovárica y minimizar el número de posibles pacientes que tienen un potencial de respuesta bajo y muy alto a las dosis de FE 999049 y a la dosis de GONAL-F utilizadas en el ensayo. La evaluación del nivel de AMH se midió utilizando el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/l con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/l.
El día 2-3 de su ciclo menstrual, los sujetos se aleatorizadas en una forma 1:1:1:1:1:1 con respecto al tratamiento con 90 UI, 120 UI, 150 UI, 180 UI o 210 UI de FE 999049 o 150 UI GONAL-F y se inició la estimulación ovárica. La aleatorización se estratificó según el nivel de AMH en la selección [5,0-14,9 pmol/l (nivel bajo de AMH) y 15,0 a 44,9 pmol/l (nivel alto de AMH)).
Gonal-F se rellena en masa (FbM) a petición de la FDA; por lo tanto, es apropiado referirse a la dosis en μg. La etiqueta de Gonal-F indica 600 UI/44 μg, lo que indica que 150 UI son 11 μg. Sin embargo, existe alguna variación y el certificado de lote para este ensayo indicó que 11,3 μg de Gonal-F eran equivalentes a 150 UI. Las dosis de FE999049 se presentan por contenido de proteína (μg) en vez de por actividad biológica. Por lo tanto, las dosis de FE999049 fueron de 5,2 μg (90 UI), 6,9 μg (120 UI), 8,6 μg (150 UI), 10,3 μg (180 UI) o 12,1 μg (210 UI).
La distribución de sujetos y dosis se establece de la forma siguiente (los datos son el número de sujetos):
Tabla 1
El nivel de dosis diaria de FE 999049 o GONAL-F se fija durante todo el periodo de estimulación. Durante la estimulación, los sujetos se controlan los días 1, 4 y 6 de estimulación y, en lo sucesivo, al menos cada dos días. Cuando se observan 3 folículos > 15 mm, las visitas se realizan diariamente. Los sujetos se tratan con FE 999049 o GONAL-F durante un máximo de 16 días.
Para prevenir un aumento prematuro de LH, se puede comenzar con un antagonista de GnRH (acetato de ganirelix, ORGALUTRAN, MSD/Schering-Plough) el día 6 de estimulación a una dosis diaria de 0,25 mg y continuar durante todo el periodo de estimulación. La inducción de la maduración folicular final se realiza el día en que se observan > 3 folículos con un diámetro > 17 mm. Si hay < 25 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 250 μg de hCG recombinante (coriogonadotropina alfa, OVITRELLE, Merck Serono/EMD Serono). Si hay 25-35 folículos con un diámetro > 12 mm, se administran 0,2 mg de agonista de GnRH (acetato de triptorelina, DECAPEPTYL/GONAPEPTYL, Ferring Pharmaceuticals). En caso de respuesta ovárica excesiva, definida como > 35 folículos con un diámetro > 12 mm, se cancela el tratamiento. En caso de una respuesta ovárica escasa, definida como < 3 folículos con un diámetro > 10 mm observados el día 10 de estimulación, el ciclo podría cancelarse.
La recuperación de los ovocitos tiene lugar 36 h (± 2 h) después de la inducción de la maduración folicular final y los ovocitos se inseminan por FIV y/o ICSI. La fertilización y el desarrollo embrionario se evalúan desde la recuperación de los ovocitos hasta el día de la transferencia. Para sujetos que se sometieron a inducción de la maduración folicular final con hCG, se transfiere un blastocisto de la mejor calidad disponible el día 5 después de la recuperación de los ovocitos, mientras que los blastocistos restantes se congelan. Para sujetos que se sometieron a inducción de la maduración folicular final con agonista de GnRH, no tiene lugar transferencia de embriones en el nuevo ciclo y, en lugar de ello, los blastocistos se congelan el día 5. Se proporcionan 100 mg de comprimidos vaginales de progesterona (LUTINUS, Ferring Pharmaceuticals) 3 veces al día para apoyar la fase lútea desde el día posterior a la recuperación de los ovocitos hasta el día de la visita de embarazo clínico. Se realiza una prueba de phCG 13-15 días después de la transferencia de embriones y el embarazo clínico se confirmará mediante ecografía transvaginal (TVU) 5-6 semanas después de la transferencia de embriones.
Resultados
El número de ovocitos recuperados (criterio de valoración principal) se muestra en la tabla siguiente.
Tabla 2
Se cumplió el objetivo principal: se estableció una relación dosis-respuesta significativa para FE 999049 con respecto al número de ovocitos recuperados. Este hallazgo se observó no solo para la población global del ensayo, sino también para cada uno de los dos estratos de nivel de AMH utilizados en la aleatorización.
Se demostró una dosis-respuesta significativa para FE 999049 para todos los parámetros farmacodinámicos objetivo clave, por ejemplo, estradiol, inhibina B e inhibina A. A un nivel de dosis de microgramos similar, las respuestas farmacodinámicas con FE 999049 fueron mayores que con GONAL-F (estos resultados no se muestran).
Las concentraciones de FSH en suero después de la exposición a FE 999049 fueron significativamente más elevadas que para GONAL-F. Los resultados confirman que el perfil PK de FE 999049 difiere del de GONAL-F. Las tasas de fertilización, el desarrollo de blastocistos y las tasas de embarazo en pacientes con FIV/ICSI tratadas con FE 999049 se mantuvieron dentro de las expectativas.
No hubo problemas de seguridad con el uso de FE 999049. Se documentó una buena tolerabilidad local.
Análisis adicional
Los solicitantes han analizado adicionalmente los datos para identificar la(s) dosis de FE 999049 que cumplen los criterios con respecto al número de ovocitos recuperados siguientes:
- Ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14
- Minimizar la proporción de pacientes con < 8 ovocitos
- Minimizar la proporción de pacientes con > 20 ovocitos
Los solicitantes también investigaron el efecto del peso corporal. Si es relevante, la dosis se convierte en μg/kg para un sujeto promedio. Este valor de μg/kg y ± 0,01 μg/kg se evalúa en un modelo con respecto a la distribución de los ovocitos recuperados, así como al perfil de seguridad, y se identifica la dosis óptima.
Estratos con nivel bajo de AMH
Tal como se observa en la tabla 2, la dosis de FE999049 que cumplió con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14) fue de 12,1 μg (media de 9,4 ovocitos recuperados). La distribución de ovocitos se muestra en la tabla 3 siguiente.
Tabla 3
Los datos son % de sujetos
Tal como se muestra mediante el recuadro y la flecha, una dosis de 12,1 μg de FE999049 proporciona la recuperación del número más deseable de ovocitos en el 60% de los sujetos del grupo de nivel bajo de AMH. Esta es una mejora significativa con respecto al Gonal-F (el número más deseable de ovocitos en solo el 33% de los sujetos).
La tabla 4 siguiente muestra el análisis de signos de respuesta excesiva en los estratos con nivel bajo de AMH (los datos son el número de sujetos). Puede observarse que no hubo indicios de SHO temprano de naturaleza moderada o grave y no hubo incidencias de que se requirieran acciones preventivas; no existen problemas asociados con la dosis de 12,1 μg de FE999049 en una paciente con nivel bajo de AMH.
Tabla 4
La figura 7 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con nivel bajo de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el número de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados con la dosis de 12,1 gg. Como puede observarse (cuadro de texto) la variación entre pacientes de 45 kg de peso corporal y de 90 kg es inferior a 0,5 ovocitos; en otras palabras, no se requiere la dosificación por peso corporal en pacientes con nivel bajo de AMH cuando la dosis de FE999049 es de al menos 12 gg, porque no existe una variación significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal, a esta dosis.
Por lo tanto, los solicitantes han descubierto que una dosis de, o una dosis equivalente a, 6 a 18 gg, por ejemplo, 9 a 14 gg, por ejemplo 12 gg, de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l, por ejemplo 0,05-14,9 pmol/l, por ejemplo 5,0-14,9 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que minimiza el riesgo de desarrollar SHO.
Estratos con nivel alto de AMH
Tal como se muestra en la tabla 2, tres dosis de FE999049 cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14): 6,9 gg (media de 9,1 ovocitos recuperados), 8,6 gg (media de 10,6 ovocitos recuperados) y 10,3 gg (media de 13,6 ovocitos recuperados).
La figura 8 muestra el efecto del peso corporal sobre los ovocitos recuperados (para los estratos con nivel alto de AMH), para las diversas dosis. Las flechas indican el número de ovocitos recuperados de sujetos de peso corporal entre 45 kg y 90 kg tratados con las dosis de 6,9 gg, 8,6 gg y 10,3 gg. Como puede observarse (cuadros de texto), la variación es significativa: para la dosis de 6,9 gg, se recuperarán 6 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg; para la dosis de 8,6 gg, se recuperarán 4 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg; y para la dosis de 10,1 gg, se recuperarán 2,5 ovocitos adicionales de una paciente de 45 kg en comparación con una paciente de 90 kg. En otras palabras, la dosificación por peso corporal tiene un efecto sobre pacientes con nivel alto de AMH cuando la dosis de FE999049 es inferior a 12 gg, porque existe una variación significativa en los ovocitos recuperados con el peso corporal a estas dosis.
La tabla 5a siguiente muestra un desglose adicional de los ovocitos recuperados (de la tabla 2) según el nivel de AMH. Esta muestra las dosis que cumplieron con el primer criterio (ovocitos recuperados en el intervalo de 8-14) para cada subestrato de nivel de AMH (recuadros).
Tabla 5a
La tabla 5b siguiente muestra el análisis de pacientes en los que se canceló el tratamiento debido a una respuesta excesiva o a la inducción con agonista, para estos subgrupos. Por ejemplo, una paciente en el estrato de nivel de AMH de 25-34 pmol/l canceló el tratamiento debido a una respuesta excesiva después de la dosis de 10,3 gg y una paciente en el estrato de nivel de AMH 25-34 pmol/l canceló el tratamiento debido a una respuesta excesiva después de la dosis de 12,1 gg; una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l canceló el tratamiento después de
inducción con agonista después de una dosis de 10,3 μg; y una paciente en el estrato de nivel de AMH de 35-45 pmol/l canceló el tratamiento después de inducción con agonista después de una dosis de 6,9 μg.
Tabla 5b
Por lo tanto, se puede observar que el ajuste de la dosis según el peso corporal (figura 8) y el nivel de AMH sería útil en los estratos con nivel alto de AMH, para minimizar las cancelaciones y maximizar la recuperación de ovocitos. Los solicitantes han descubierto que las dosis siguientes proporcionan una respuesta eficaz a la vez que minimizan el riesgo de SHO (kg son kg de peso corporal de paciente).
Las siguientes son apropiadas si no se desea la dosificación según el peso corporal.
Las siguientes son apropiadas si se requieren menos categorías de nivel de AMH.
Las siguientes son apropiadas si no se desea una dosificación por peso corporal.
Por lo tanto, los solicitantes han descubierto que una dosis de, o una dosis equivalente a, 9 a 14 μg, por ejemplo 12 μg, de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una
paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l, por ejemplo 0,05-14,9 pmol/l, por ejemplo 5,0-14,9 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que minimiza el riesgo de desarrollar SHO.
Los solicitantes han descubierto que una dosis de, o una dosis equivalente a, de 5 a 12,5 μg, por ejemplo de 6 a 10,5 μg, de FSH recombinante derivada de ser humano es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l. La dosis proporciona una respuesta eficaz a la vez que minimiza el riesgo de desarrollar SHO.
Los solicitantes han descubierto que una dosis (por ejemplo, diaria) de, o una dosis equivalente a, 0,09 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l. Los solicitantes han descubierto que una dosis (por ejemplo, diaria) de, o una dosis equivalente a, 0,14 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada ser humano (preferentemente de 0,15 a 0,16 μg de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de la paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que presenta un nivel de AMH en suero de 15 a 24,9 pmol/l. Los solicitantes han descubierto que una dosis (por ejemplo, diaria) de, o una dosis equivalente a, 0,11 a 0,14 μg de FSH recombinante derivada de ser humano (preferentemente de 0,12 a 0,13 μg de FSH recombinante derivada de ser humano) por kg de peso corporal de paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de esterilidad en una paciente que presenta un nivel de AMH en suero de 25 a 34,9 pmol/l. Los solicitantes han descubierto que una dosis (por ejemplo, diaria) de, o una dosis equivalente a, 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 35 pmol/l. Estas dosis proporcionan una respuesta eficaz a la vez que minimizan el riesgo de desarrollar SHO.
Los solicitantes han descubierto que una dosis (por ejemplo, diaria) de, o una dosis equivalente a, 0,15 a 0,21 μg (por ejemplo, 0,16 μg) de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de paciente es adecuada para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que presenta un nivel de AMH en suero de < 15 pmol/l, por ejemplo para el primer ciclo de estimulación con FSH recombinante derivada de ser humano. Sin embargo, no es necesario que se dosifique a las pacientes por peso corporal a este nivel de AMH.
El ejemplo siguiente no forma parte de la invención pero resalta aspectos específicos del objeto reivindicado.
Ejemplo 10 A: Protocolo EOC individualizado (nivel bajo de AMH)
Las pacientes seleccionadas están a punto de someterse a EOC para fertilización in vitro (FIV)/inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) mediante procedimientos conocidos en la técnica. El protocolo de pretratamiento incluye la evaluación/detección del nivel de AMH en suero de la paciente utilizando el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/l con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/l. El nivel de AMH se puede medir utilizando otros kits de ensayo (por ejemplo, disponibles en Roche).
El protocolo EOC se efectúa de la forma habitual, aparte de la administración de la dosis inicial de FE 999049 según el nivel de AMH en la selección. A una paciente con un nivel de AMH de < 14,9 pmol/l se le administraría una dosis diaria inicial de aproximadamente 12 μg de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el procedimiento del ejemplo 6. Una paciente con un nivel de AMH de 15 a 24,9 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,15 a 0,19 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH de 25 a 34,9 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,11 a 0,13 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente. Una paciente con un nivel de AMH > 35 pmol/l recibiría una dosis diaria inicial de 0,10 a 0,11 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por kg de peso corporal de la paciente.
El ejemplo siguiente no forma parte de la invención pero resalta aspectos específicos del objeto reivindicado.
Ejemplo 11: Protocolos EOC individualizados
Las dosis en este protocolo son menos preferidas que en el ejemplo 10A.
Las pacientes seleccionadas están a punto de someterse a EOC para fertilización in vitro (FIV)/inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) mediante procedimientos conocidos en la técnica. El protocolo de pretratamiento incluye la evaluación/detección de la AMH en suero de la paciente utilizando el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas AMH Gen-II (Beckman Coulter, Inc., Webster, Texas). Este ensayo puede detectar concentraciones de AMH superiores a 0,57 pmol/l con un límite mínimo de cuantificación de 1,1 pmol/l.
El protocolo EOC se efectúa de la forma habitual, aparte de la administración de la dosis inicial de FE 999049 según el nivel de AMH en la selección según la tabla siguiente. Por lo tanto, a una paciente con un nivel de AMH de 5-14,8 pmol/l se le administrarán 180 UI de FSH en forma de aproximadamente 8-11 μg de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el procedimiento del ejemplo 6. A una paciente con un nivel
de AMH de 30-44,9 pmol/l se le administrarían 120 UI de FSH en forma de aproximadamente 4-7 μg de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el procedimiento del ejemplo 6. Si el nivel de AMH no está disponible, a la paciente se le administrarán 120-180 UI de FSH en forma de aproximadamente 6-11 μg de FE 999049, un producto de FSH recombinante derivada de ser humano fabricado según el procedimiento del ejemplo 6.
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Claims (9)
1. Un producto que comprende una hormona estimulante del folículo (FSH) derivada de ser humano para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l, en el que el producto debe administrarse a una dosis de, o equivalente a, 11-13 μg de FSH recombinante derivada de ser humano por día, incluyendo la FSH recombinante derivada de ser humano una sialilación a2,3 y a2,6 en la que del 30% al 60% de la sialilación total es una sialilación a2,3, por ejemplo en la que del 40% al 50% de la sialilación total es una sialilación a2,3.
2. Un producto para su uso según la reivindicación 1, en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente y una etapa de administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l.
3. Un producto que comprende una hormona estimulante del folículo (FSH) derivada del ser humano para su uso en el tratamiento de la esterilidad en una paciente que tiene un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l, en el que el producto debe administrarse a una dosis de, o equivalente a, 0,09 a 0,19 μg de FSH humana recombinante por kg de peso corporal de la paciente por día, incluyendo la FSH recombinante derivada de ser humano una sialilación a2,3 y a2,6 en la que del 30% al 60% de la sialilación total es una sialilación a2,3, por ejemplo en la que del 40% al 50% de la sialilación total es una sialilación a2,3.
4. Un producto para su uso según la reivindicación 3, en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente y una etapa de administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l.
5. Un producto para su uso según cualquier reivindicación anterior, en el que la FSH recombinante derivada de ser humano es una FSH recombinante que incluye estructuras mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas, en las que del 15 al 24%, de las estructuras de glicano sialiladas son estructuras de glicano tetra-sialiladas
6. Un producto para su uso según la reivindicación 1, en el que la FSH recombinante derivada de ser humano incluye estructuras mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas.
7. Un producto para su uso según la reivindicación 6, en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente y una etapa de administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero < 15 pmol/l.
8. Un producto para su uso según la reivindicación 3, en el que la FSH recombinante derivada de ser humano incluye estructuras mono-sialiladas, di-sialiladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas.
9. Un producto para su uso según la reivindicación 8, en el que el tratamiento de la esterilidad comprende una etapa de determinación del nivel de AMH en suero de la paciente y una etapa de administración de la dosis a una paciente que presenta un nivel de AMH en suero > 15 pmol/l.
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