KR102001701B1 - 세포 프로세싱을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본원 발명은 조직으로부터 세포를 효율적으로 그리고 비용-효과적으로 추출하고 수집한다. 발명자는, 복수 구성요소를 가지는 시스템 또는 키트를 이용하여, 조직이 효과적으로 단편화될 수 있고 그리고 결과적인 세포가 정제될 수 있다는 것을 발견하였다. 본원 발명의 장점은, 예를 들어 밸브, 클램프, 및 열 밀봉의 이용을 통해서, 특정 구성요소가 프로세싱 중에 제거되는 경우에도, 무균성이 프로세스 전체를 통해서 유지될 수 있도록, 조직 프로세싱이 폐쇄된 시스템 내에서 이루어진다는 것이다. 또한, 사용자 또는 적용예의 구체적인 요구에 따라서, 임의의 또는 모든 단계가 자동화될 수 있거나 수작업으로 달성될 수 있다.

Description

세포 프로세싱을 위한 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR PROCESSING CELLS}
관련 출원의 교차-참조
본원은, 2011년 11월 8일자로 출원되고 여기에서 전체가 참조로서 포함된 미국 가특허출원 제 61/557,127 호를 기초로 우선권을 주장하고 그 이익 향유를 주장한다.
여러 실시예에서, 본원 발명은 표적 세포를 격리시키고 수집하기 위한 조직 프로세싱 시스템 및 방법에 관한 것이다.
조직 샘플로부터의 독자 생존형(viable) 세포를 정제하는 것(purification)은, 절단과 다른 수작업 조작 및 프로세싱 단계뿐만 아니라, 일부 경우에, 세포 배양(culturing)을 포함하는 고도의(laborious) 프로세스일 수 있다. 정제 프로세스 중에 세포의 무균성(sterility)을 유지하는 것 또한 중요한 관심사이다. 무균성을 유지하기 위해서 층상형 후드(laminar hood)가 사용될 수 있지만, 그러한 후드는 많은 수의 단점을 가진다. 예를 들어, 그러한 후드가 고가이고, 비교적 이동 불가능하고, 작업이 까다로우며, 그리고 유효 실험 공간을 차지한다. 세포 정제 프로세스의 효율은 정제 프로세스를 더욱 복잡하게 만드는 다른 관심사이다. 줄기 세포와 같은 희소 세포(rare cell)를 조직 샘플로부터 격리시키는 것은 가능한 한 많은 세포를 회수하기 위한 효율적인 프로세스를 필요로 한다.
줄기 세포와 같은 세포의 관리(administration)에 의존하는 발전 중인 잠재적인 치료법(therapy)을 위해서, 줄기 세포와 같은 세포를 추출하고 수집하기 위한 실용적이고, 비용-효과적이고, 무균적이며, 그리고 효율적인 메커니즘 및 방법이 요구되고 있다.
본원 발명은 조직으로부터 세포를 효율적으로 그리고 비용-효과적으로 추출하고 수집한다. 발명자는, 복수 구성요소를 가지는 시스템 또는 키트를 이용하여, 조직이 효과적으로 단편화될(fragmented) 수 있고 그리고 결과적인 세포가 정제될 수 있다는 것을 발견하였다. 본원 발명의 장점은, 예를 들어 밸브, 클램프, 및 열 밀봉(heat seal)의 이용을 통해서, 특정 구성요소가 프로세싱 중에 제거되는 경우에도, 무균성이 프로세스 전체를 통해서 유지될 수 있도록, 조직 프로세싱이 폐쇄된 시스템 내에서 이루어진다는 것이다. 또한, 본원 발명의 단계들 중 임의 또는 모든 단계는 애플리케이션 또는 사용자의 특별한 요구에 따라 자동화되거나 수동으로 달성될 수 있다.
그에 따라, 하나의 양태에서, 발명이 조직 민싱 툴(mincing tool)과 관련된다. 조직 민싱 툴은 조직 샘플을 위한 격실, 상기 격실의 일 단부에서의 컷팅 표면, 및 무균성의 밀봉된 컨테이너를 포함한다. 상기 컷팅 표면은 상기 격실을 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너로부터 격리시키고, 그에 따라 상기 컷팅 표면을 통과하는 조직 샘플이 상기 컨테이너 내에 배치될 수 있다. 4 평방 밀리미터 이하의 평균 횡단면을 가지는 단편들로 상기 조직 샘플을 민싱하도록 상기 컷팅 표면의 크기가 결정될 수 있다. 예를 들어, 발명의 여러 실시예에서, 상기 평방 밀리미터의 숫자가 3, 2, 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 또는 0.05 이하일 수 있을 것이다. 상기 조직 민싱 툴은 또한 상기 단편의 평균 횡단면을 추가적으로 감소시키기 위한 제 2 컷팅 표면을 포함할 수 있다. 상기 조직 민싱 툴의 컷팅 표면이 자동화된 컷팅 시스템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 컷팅 표면이 반-자동 가위를 포함할 수 있을 것이다. 하나 이상의 민서 스크린이 상기 컷팅 표면에 근접하여 배치될 수 있을 것이다. 상기 조직 민싱 툴이 동작 중에 툴을 안정화시키기 위한 흡입 컵을 더 포함할 수 있을 것이다. 상기 조직 민싱 툴이, 부가적으로 또는 대안적으로, 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너와 소통하는 유체 도관, 및 상기 유체 도관 내의 하나 이상의 필터와 같은 분리기 유닛을 포함할 수 있다. 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너가 상기 컨테이너 내로의 유체의 무균적인 도입을 허용하는 적어도 하나의 밀봉된 접근 포트를 선택적으로 포함한다.
조직 민싱 툴에서, 상기 조직 샘플을 위한 격실이 조직 샘플로 힘을 인가하는 것을 돕기 위한 하나 이상의 특징부(feature)를 포함할 수 있고, 그에 따라 상기 조직 샘플을 상기 컷팅 표면을 지나서 그리고 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너 내로 압박(impelling)할 수 있다. 예를 들어, 상기 격실의 일부가 상기 조직 샘플을 프레스하기 위한 중실형(solid) 부재를 수용하도록 성형될 수 있다. 그러한 중실형 부재가 조직 민싱 툴과 함께 선택적으로 포함될 수 있고, 상기 중실형 부재가 상기 조직 민싱 툴에 연결되거나 또는 분리된 구성요소로서 제공될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 컷팅 표면에 인접한 격실의 부분이 실질적으로 일정한 횡단면을 가지고, 그에 따라, 조직 샘플을 컷팅 표면 내로 또는 컷팅 표면을 통해서 프레싱하는 동안, 동등하게(comparably) 성형된 중실형 부재가 상기 격실 내로 도입될 수 있고 그리고 해당 부분을 충전할 수 있을 것이다. 다른 실시예에서, 상기 컷팅 표면에 인접한 격실이 테이퍼형의 또는 원뿔-형상의 단부를 가진다. 일부 실시예에서, 상기 격실의 내부 표면이 나사산형이 되고(threaded), 그에 따라 나사산형의 중실형 부재가 상기 격실 내로 안내될 수 있을 것이다. 일부 실시예에서, 상기 격실이 또한 가스켓을 포함하고, 상기 가스켓은 중실형 부재가 상기 격실 내로 도입될 때 개선된 밀봉을 제공할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 조직 민싱 툴이 상기 조직 샘플을 향해서 상기 컷팅 표면을 이동시키기 위한 샤프트 크랭크를 포함한다.
발명은 또한, 툴의 컷팅 표면을 통해서 조직 샘플을 압박함으로써, 전술한 조직 민싱 툴 중 임의의 조직 민싱 툴을 이용하는 방법을 제공한다. 발명은, 조직 샘플을 민싱하는 단계 및 효소가 민싱된 조직의 소화(digestion)를 향상시키도록 효소를 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너 내로 선택적으로 주입하는 단계로 이루어진 방법을 제공한다. 상기 효소는, 독립적인 또는 조합된, 콜라게나아제(collagenase), 히알루로니다아제(hyaluronidase), 또는 디스파아제(dispase)와 같은 프로테아제(protease)일 수 있다. 이러한 단계가, 조직 샘플을 민싱 및/또는 소화시키는 것 그리고 약 40 마이크로미터 보다 큰 단편을 제거하는 것(예를 들어, 약 500 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는(retained) 단편, 또는 약 300 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편, 또는 약 250 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편, 또는 약 150 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편, 또는 약 100 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편, 또는 약 70 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편, 또는 약 40 마이크로미터의 기공 크기를 가지는 필터에 의해서 걸러지는 단편)에 의해서 조직 샘플로부터 세포를 분리하는 방법 내로 선택적으로 포함될 수 있다. "소화되지 않은 조직"으로 여기에서 지칭되는 이러한 보다 큰 단편이 여과 또는 침전에 의해서 제거될 수 있다. 이러한 방법은 임의의 다양한 고체(solid) 조직으로부터 세포를 정제하는데 있어서 효과적이다. 예를 들어, 여기에서 개시된 방법은 줄기 세포와 같은 세포를 태반(placental) 또는 탯줄(umbilical cord) 조직과 같은 지방 조직 또는 후산(afterbirth) 조직, 보다 구체적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)을 포함하는 조직으로부터 분리할 수 있다. 일부 실시예에서, 조직 샘플이, 조직이 격실 내에 배치되기에 앞서서 조직으로부터 선택적으로 절개될 수 있는, 실질적으로 혈관이 조직 샘플이다.
다른 양태에서, 발명은 세포 수집 장치 내에서 세포를 침전시키는 단계를 포함하는 세포 수집 방법에 관한 것이다. 세포 수집 장치는 세포를 포함하는 유체를 위한 무균성 컨테이너 및 상기 무균성 컨테이너와 소통하는 유체 통로를 포함한다. 세포 포획 구역의 부피가 무균성 컨테이너의 부피의 5% 미만이 될 수 있도록 유체 통로가 세포 포획 구역을 포함하고 그리고 무균성 컨테이너 내의 유체로부터의 세포의 침전이 세포 포획 구역 내에서 세포를 농축하도록 무균성 컨테이너 및 세포 포획 구역이 구성될 수 있다. 이러한 양태 또는 이하의 양태 중 임의의 양태가 이하의 실시예 중 임의의 실시예를 가질 수 있다. 세포 수집 장치가 유체 통로와 소통하는 제 2 무균성 컨테이너 및/또는 상기 제 2 무균성 컨테이너 내로의 재료의 통과를 조절하기 위한 제거가능한 클램프를 더 포함한다. 상기 제 2 무균성 컨테이너가 열-밀봉될 수 있고 및/또는 백(bag)일 수 있다. 세포 수집 방법이 또한 세포의 침전을 가속하기 위해서 세포 수집 장치를 원심분리하는 단계를 포함할 수 있고, 그리고 세포가 와튼 젤리 줄기 세포일 수 있다. 유체가 기계적으로 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 탯줄 조직을 포함한다. 세포 수집 방법이 세포로 냉동보호제(cryoprotectant)를 부가하는 단계를 더 포함할 수 있으며; 상기 냉동보호제가 DMSO, 알부민, 및/또는 덱스트란(dextran)을 포함한다. 상기 방법이 또한 자가수혈 혈장(autologous plasma)을 세포로 부가하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 발명은 세포를 가지는 유체, 세포를 수용하기 위한 무균성 컨테이너, 및 상기 무균성 컨테이너와 소통하는 유체 통로를 가지는 세포 수집 장치에 관한 것이다. 유체 통로가 세포 포획 구역을 포함하고, 상기 세포 포획 구역의 부피가 무균성 컨테이너의 부피의 5% 미만일 수 있고 그리고 무균성 컨테이너 내의 유체로부터의 세포의 침전이 세포 포획 구역 내에서 세포를 농축하도록 무균성 컨테이너 및 세포 포획 구역이 구성될 수 있다. 이러한 양태 및 이하의 양태 중 임의의 양태가 이하의 실시예 중 임의의 실시예를 가질 수 있다. 세포 수집 장치가, 부가적으로 또는 대안적으로, 유체 통로와 소통하는 제 2 무균성 컨테이너 및/또는 상기 제 2 무균성 컨테이너 내로의 재료의 통과를 조절하기 위한 제거가능한 클램프를 포함한다. 상기 제 2 무균성 컨테이너가 열-밀봉될 수 있고 및/또는 백일 수 있다.
또 다른 양태에서, 발명은, 침전에서의 이용을 위해서 구성될 수 있는, 세포를 포함하는 유체를 위한 무균성 컨테이너, 그리고 상기 무균성 컨테이너와 소통하는 유체 통로를 가지는 세포 수집 장치에 관한 것이다. 유체 통로는, 세포 포획 구역을 그 사이에 형성하는 제 1 및 제 2 밸브를 포함하고, 그에 따라 상기 세포 포획 구역의 부피가 무균성 컨테이너의 부피의 5% 미만일 수 있고 그리고 무균성 컨테이너 내의 유체로부터의 세포의 침전이 세포 포획 구역 내에서 세포를 농축하도록 무균성 컨테이너 및 세포 포획 구역이 구성될 수 있다. 이러한 양태 및 이하의 양태 중 임의의 양태가 이하의 실시예 중 임의의 실시예를 가질 수 있다. 무균성 컨테이너가 원심분리에서의 이용을 위해서 구성될 수 있다. 세포 수집 장치가, 부가적으로 또는 대안적으로, 제 2 밸브와 소통하는 제 2 무균성 컨테이너 및/또는 상기 제 2 무균성 컨테이너 내로의 재료의 통과를 조절하기 위한 제거가능한 클램프를 포함한다. 상기 제 2 무균성 컨테이너가 열-밀봉될 수 있고 및/또는 백일 수 있다.
또 다른 양태에서, 발명이 세포를 수용하기 위한 무균성 컨테이너, 상기 무균성 컨테이너와 소통하는 유체 통로, 및 상기 유체 통로와 소통하는 제 2 무균성 컨테이너를 가지는 세포 수집 장치에 관한 것이다. 세포 포획 구역의 부피가 무균성 컨테이너의 부피의 5% 미만이 되도록 유체 통로가 세포 포획 구역을 포함하고 그리고 무균성 컨테이너 내의 유체로부터의 세포의 침전이 세포 포획 구역 내에서 세포를 농축하도록 무균성 컨테이너 및 세포 포획 구역이 구성될 수 있다. 상기 제 2 무균성 컨테이너가 백, 열-밀봉가능 컨테이너, 및 제거가능한 클램프로 이루어진 그룹으로부터 선택된 요소를 포함한다.
다른 양태에서, 발명은 세포 수집 장치에 관한 것이고, 상기 세포 수집 장치가 조직을 수용하기 위한 격실; 4 평방 밀리미터 이하의 평균 횡단면을 가지는 단편으로 조직 샘플을 민싱하도록 치수가 결정된 컷팅 표면; 상기 민싱된 조직의 현탁체(suspension)를 홀딩하기 위한 무균성의 밀봉된 컨테이너로서, 상기 무균성 컨테이너가 상기 조직을 수용하기 위한 격실의 부피 보다 적어도 10배 더 큰 부피를 가지는, 무균성의 밀봉된 컨테이너; 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너와 유체 소통하는 필터 백; 및 상기 필터 백과 유체 소통하는 침전 백을 포함한다. 상기 필터 백은 약 250 ㎛ 보다 큰 입자들을 거를 수 있을 정도로 충분히 작은 기공 크기를 가지는 적어도 하나의 필터를 포함한다. 상기 침전 백이 침전된 세포의 농축을 촉진하기 위한 테이퍼형 부분을 포함한다.
첨부 도면과 함께 고려할 때, 여러 실시예에 관한 이하의 설명으로부터, 발명의 다른 특징 및 장점뿐만 아니라, 발명 자체가 보다 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 발명의 실시예에 따른, 조직 민싱 툴을 개략적으로 도시한다.
도 2는 발명의 실시예에 따른, 조직 민싱 툴의 중실형 부재의 개략적인 사시도이다.
도 3은 도 2의 중실형 부재의 개략적인 사시도이다.
도 4는 발명의 실시예에 따른, 컷팅 표면을 부분적으로 도시한 개략적인 사시도이다.
도 5a 및 5b는 발명의 실시예에 따른, 중실형 부재 및 그 상보적인 격실을 부분적으로 도시한 개략도이다.
도 6a는 발명의 다른 실시예에 따른, 조직 민싱 툴의 측면도이다.
도 6b는 도 6a의 조직 민싱 툴의 선 E-E를 따른 횡단면도이다.
도 6c는 도 6a의 조직 민싱 툴의 분해도이다.
도 7은 발명의 또 다른 실시예에 따른, 조직 민싱 툴의 개략적인 사시도이다.
도 8은 발명의 실시예에 따른, 조직 샘플로부터의 희망하는 세포를 수집 및 격리하기 위한 과정 단계의 개관을 제공한 도면이다.
도 9는 발명의 실시예에 따른, 조직 샘플로부터의 희망하는 세포를 수집 및 격리하기 위한 과정 단계의 개관을 제공한 도면이다.
도 10a-10g는 조직 샘플로부터 희망하는 세포를 수집 및 격리하기 위한 과정을 도시한 도면이다.
발명의 전체적인 이해를 제공하기 위해서, 세포를 프로세싱하기 위한 시스템 및 방법을 포함하는 특정의 예시적인 실시예를 이제 설명할 것이다. 그러나, 여기에서 개시된 시스템 및 방법이 다루어지는 적용예에 맞춰서 구성되고 수정될 수 있다는 것, 그리고 여기에서 개시된 시스템 및 방법이 다른 적합한 적용예에서 채용될 수 있다는 것을 당업자가 이해할 수 있을 것이다. 그러한 구성 및 수정 모두가 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 또한, 여기에서 개시된 여러 실시예의 특징이 상호 배타적인 것이 아니고 그리고 여러 조합 및 치환 형태로 존재할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
조직 민싱 툴
도 1은 발명의 일 실시예에 따른 조직 민싱 툴(10)을 개략적으로 도시한다. 조직 민싱 툴(10)이 격실(12), 및 무균성의 밀봉된 컨테이너(14)를 포함하고, 상기 격실 내에서 조직 샘플이 받아들여질 수 있고 그리고 초기에 수용될 수 있다. 상기 격실(12)이 제 1 및 제 2 단부들(16, 18) 사이에서 연장하는 한편, 무균성의 밀봉된 컨테이너(14) 자체는 제 1 및 제 2 단부들(18, 20) 사이에서 연장한다. 컷팅 표면(108)이 격실(12)의 제 2 단부(18)에 또는, 균등하게, 무균성의 밀봉된 컨테이너(14)의 제 1 단부(18)에 위치되고, 그에 따라 상기 격실(12)을 무균성의 밀봉된 컨테이너(14)로부터 분리한다. 도시된 바와 같이, 조직 민싱 툴(10)이 또한 중실형 부재(100)를 포함한다. 상기 중실형 부재(100)는 상기 격실(12) 내에 부분적으로 위치되는 것으로서 도시되어 있다(점선으로 도시된 바와 같음). 또한, 중실형 부재(100)의 일부가 격실(12)의 외부에 위치되는 것으로 도시되어 있다. 나사산(105)이 중실형 부재(100)의 해당되는 외부 부분 상에 도시되어 있다.
도 2는 조직 민싱 툴(10)의 중실형 부재(100)의 실시예를 도시한다. 조직 민싱 툴(10)의 다른 부분(예를 들어, 격실(12) 및 무균성의 밀봉된 컨테이너(14))은 도시되어 있지 않다. 중실형 부재(100)는 큰 직경의 플런저(104)(나사산(105)과 함께 도시됨) 및 작은 직경의 스크류 샤프트(106)를 포함한다. 핸들(114)이 중실형 부재(100)의 일 단부에 배치된다. 중실형 부재(100)의 대향 단부에서, 컷팅 표면(108)이 작은 직경의 스크류 샤프트(106)의 단부에 부착된다. 도시된 바와 같이, 작은 직경의 스크류 샤프트(106)가 컷팅 표면(108)으로부터 핸들(114)까지 연장하고(상기 핸들에 작은 직경의 스크류 샤프트(106)가 또한 커플링된다) 그리고, 그렇게 함으로써, 작은 직경의 스크류 샤프트(106)가 큰 직경의 플런저(104)의 중공형 (예를 들어, 중앙) 부분(107)을 통해서 연장한다. 일 실시예에서, 스크류 샤프트(106)는 그 특정 길이를 따른 나사산(109)을 특징으로 하고 그리고 상기 플런저(104)는 그 중공형 부분(107) 내에 상보적인 홈(111)을 포함한다. 이러한 방식에서, 플런저(104)가 스크류 샤프트(106)와 나사식으로 결합된다. 따라서, 핸들(114)이 회전될 때, (선택적으로) 스크류 샤프트(106)의 단부에 부착된 컷팅 표면(108)과 같이, 스크류 샤프트(106)가 또한 회전 유도된다. 또한, 스크류 샤프트(106)의 회전이, 예를 들어 컷팅 표면(108)을 향한, 플런저(104)의 병진운동을 유도한다. 그에 따라, 플런저(104)와 컷팅 표면(108) 사이의 격실(12) 내에 수용된 조직 샘플이 컷팅 표면(108)과 접촉(선택적으로 회전)되도록 프레스될 수 있고 그리고, 이하에서 추가적으로 설명하는 바와 같이, 그에 의해서 컷팅될 수 있을 것이다.
큰 직경의 플런저(104)의 나사산형 부분(105)이 조직 샘플을 수용하는 격실(12)의 상보적인 나사산형의 내부 부분과 결합하고 짝을 이룰 수 있다. 플런저(104)와 격실(12) 사이의 나사산형 결합은 지레 작용 및 제어를 제공하고, 그에 따라 사용자가 핸들(114)을 이용하여 격실(12) 내에서 플런저(104)를 보다 용이하게 병진운동시킬 수 있을 뿐만 아니라, 컷팅 표면(108)을 향해서 그리고 컷팅 표면을 통해서 조직 샘플을 슬라이드 또는 푸싱(push)할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 격실(12)의 내부 중공형 공동과 짝을 이루고 실질적으로 충전하도록 플런저(104)의 크기가 결정된다. 실시예에서, 도 2를 다시 참조하면, 가스켓(118)이 플런저(104)의 일 단부에 배치될 수 있을 것이다. 가스켓(118) 및 플런저(104)가, 함께, 격실(12)의 내부 중공형 공동의 내경을 실질적으로 충전할 수 있고, 그에 의해서 격실(12) 내에서 기밀(氣密)의 진공 밀봉을 생성할 수 있다. 가스켓(118)이 컷팅 표면(108)에 대해서 실질적으로 상보적인 형상을 가질 수 있을 것이다. 예를 들어, 가스켓의 하단부 표면 및 컷팅 표면(108)의 상단부 표면이 모두 둥글거나 편평할 수 있을 것이다. 일 실시예에서, 가스켓(118)이 편평한 표면을 형성한다. 조직 샘플이 컷팅 표면(108)을 통해서 압박되고, 그에 따라, 가스켓(118)이 접촉하고 조직 샘플을 구동할(drive) 때 민싱된다.
컷팅 표면(108)은, 조직 샘플이 컷팅 표면(108)을 통해서 푸싱될 때 조직 샘플로부터의 세포를 손상하지 않고, 조직 샘플을 컷팅, 분석(parse), 또는 분리하도록 구성된 임의 표면일 수 있다. 예를 들어, 컷팅 표면(108)이 조직 샘플을 4 평방 밀리미터 이하, 또는 1 평방 밀리미터의 평균 횡단면을 가지는 작은 부분으로 민싱할 수 있으나, 조직 샘플을 보다 큰 또는 보다 작은 부분으로 민싱할 수 있는 컷팅 표면도 고려할 수 있다. 조직 민싱 툴이, 민싱된 조직 샘플의 평균 횡단면을 보다 더 감소시키기 위한 제 2 컷팅 표면을 포함할 수 있다. 컷팅 표면의 예에는, 날카로운 엣지를 가지는 강판(grate), 개구부에 걸친 복수의 날카로운 와이어, 격실 내부의 립(lip) 상에 놓인 복수의 홀을 가지는 스틸 플레이트 또는 디스크, 오프셋되고 날카로운 엣지를 가지는 플레이트 내의 홀, 및 개구를 형성하는 날카로운 표면의 메시(mesh)가 포함된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 컷팅 표면이 개구를 형성하는 실시예에서, 플런저(104)의 단부가, 컷팅 표면(108)을 통해서 조직 샘플을 푸싱하는 것을 보조하기 위해서 컷팅 표면(108)의 개구와 짝을 이루는, 핑거와 같은 복수의 돌출부를 형성할 수 있다. 대안적인 실시예에서, 플런저(104)의 단부가 편평할 수 있다. 또한, 컷팅 표면(108)이 텍스쳐 가공될(textured) 수 있고 또는 복수의 돌출부(예를 들어, 쐐기(cleat))를 형성하여, 압력이 조직 샘플로 인가될 때, 마찰 표면을 생성하거나 조직 샘플을 컷팅 표면(108) 상에서 유지할 수 있다. 추가적인 실시예에서, 컷팅 표면(108)이 반-자동 가위와 같은 자동화된 컷팅 시스템을 포함할 수 있을 것이다.
실시예에서 선택적인 노우즈 너트(nose nut)(미도시)가 컷팅 표면(108) 주위에 배치되어, 조직 샘플이 통과 압박될 때, 컷팅 표면(108)을 제 위치에서 유지할 수 있을 것이다. 예를 들어, 선택적인 노우즈 너트가 조직 샘플을 수용하는 격실(12)에 제거가능하게 부착될 수 있다. 선택적인 노우즈 너트가 격실(12)의 리세스형(recessed) 표면과 결합하는 돌출부를 포함하여 스냅-핏(snap-fit) 연결을 형성할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 선택적인 노우즈 너트의 나사산형 부분이 격실(12)의 유사한 그리고 상보적인 나사산형 부분과 결합할 수 있다. 선택적인 노우즈 너트가 격실(12)과 완전히 결합될 때, 컷팅 표면(108)이 선택적인 노우즈 너트의 립에 의해서 제 위치 배치되고 제 위치에서 유지된다.
도 3은 조직 민싱 툴(10)의 중실형 부재(100)의 사시도를 도시한다. 조직 민싱 툴의 다른 부분(예를 들어, 격실(12) 및 무균성의 밀봉된 컨테이너(14))은 도시되어 있지 않다. 앞서서 기재한 바와 같이, 중실형 부재(100)가 큰 직경의 플런저(104)(나사산(105)과 함께 도시됨) 및 작은 직경의 스크류 샤프트(106)를 포함한다. 핸들(114)이 중실형 부재(100)의 일 단부에 배치된다. 중실형 부재(100)의 대향 단부에서, 컷팅 표면(108)이 작은 직경의 스크류 샤프트(106)의 단부에 부착된다. 일 실시예에서, 도시된 바와 같이, 컷팅 표면(108)이 민싱 디스크(112)에 인접한 컷팅 블레이드(110)를 포함한다.
도 4는 조직 민싱 툴(10)의 예시적인 컷팅 표면(108)의 사시도를 도시한다. 상기 컷팅 표면(108)은 컷팅 블레이드(110)를 포함한다. 부가적으로, 컷팅 표면(108)은 조직 샘플이 통과하여 압박되도록 허용하는 개구(116)를 가지는 민싱 디스크(112)를 포함한다.
도 5a 및 5b는 조직 민싱 툴(10)의 중실형 부재(100)의 2개의 실시예를 도시한다. 도 5a에 도시된 일 실시예에서, 중실형 부재(100)의 플런저(104)가 그 단부에 인접하여 실질적으로 원통형 형상을 가진다. 도 5b에 도시된 제 2 실시예에서, 중실형 부재(100)의 플런저(104)가 테이퍼형의 또는 원뿔-형상의 단부를 가진다. 각각의 실시예에서, 중실형 부재(100)가 상보적으로 형성된 격실(12)과 짝을 이루어 충전하도록 성형되고, 그에 따라 중실형 부재(100)가 격실(12) 내에서 이동가능하여 격실(12) 내에 배치된 조직 샘플을 컷팅 표면(108)을 통해서 압박할 수 있다. 조직 샘플이 컷팅 표면(108)을 통과함에 따라, 조직 샘플의 컷팅 부분이, 예를 들어, 백일 수 있는 무균성의 밀봉된 컨테이너(14) 내에 배치된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 격실(12)의 내부 공동이 플런저(104)로부터 돌출하는 돌출부와 결합하기 위한 리세스형 채널 또는 표면(예를 들어, 캠 표면)을 형성할 수 있고, 그에 따라 중실형 부재(100)가 격실(12)에 대해서 제거가능하게 고정될 수 있고 그리고 사용자는 중실형 부재(100)를 격실(12)(미도시) 내로 병진운동시키기 위한 지레 작용 및 제어를 여전히 가진다.
도 6a는 발명의 다른 실시예에 따른 조직 민싱 툴(200)의 측면도를 도시한다. 도 6b는 도 6a에 도시된 조직 민싱 툴(200)의 선 E-E를 따른 횡단면도를 도시하는 한편, 도 6c는 도 6a에 도시된 조직 민싱 툴(200)의 분해도를 도시한다. 조직 민싱 툴(200)은 베이스(204), 저장용기(208), 및 핸들(212)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 베이스(204)가 저장용기(208)와 나사산식으로 결합하기 위한 나사산형 부분(216)을 포함할 수 있을 것이다. 예를 들어, 저장용기(208)의 내부 표면이, 베이스(204)의 나사산형 부분(216)과 상보적인 홈(218)을 특징으로 할 수 있을 것이다. 그에 따라, 조직 민싱 툴(200)의 조립 중에, 저장용기(208)가 베이스(204) 상으로 나사체결될 수 있을 것이다.
도시된 바와 같이, 흡입 컵(220)이 베이스(204)의 하단부 부분(224)에 커플링될 수 있을 것이다. 일 실시예에서, 흡입 컵(220)이 조직 민싱 툴(200)에 대한 안정성을 제공한다. 예를 들어, 동작 중에, 사용자가 흡입 컵(220)을 이용하여 조직 민싱 툴(200)을 테이블(또는 다른 지지 표면)에 커플링시킬 수 있을 것이다. 그에 의해서, 예를 들어, 이하에서 추가적으로 설명되는 바와 같이 사용자가 핸들(212)을 회전시킬 때 또는 조직 민싱 툴(200)로 달리 힘을 부여할 때, 조직 민싱 툴(200)로 안정성이 제공된다.
도 6b에 가장 명료하게 도시된 바와 같이, 조직 샘플을 초기에 수용하기 위한 격실(228)이 저장용기(208) 내에 포함된다. 또한, 적어도 하나의 컷팅 표면(샤프트 크랭크(232)를 통해서 핸들(212)로 커플링된다)이 저장용기(208) 내에서 이동가능하다. 예를 들어, 도 6c에 가장 명료하게 도시된 바와 같이, 제 1 컷팅 표면(236), 제 1 민서 스크린(240), 제 2 컷팅 표면(244), 및 제 2 민서 스크린(248)(이들 각각이 샤프트 크랭크(232)를 통해서 핸들(212)에 커플링된다)이 샤프트 크랭크(232)의 작동(예를 들어, 회전)을 통해서 저장용기(208) 내에서 이동될 수 있을 것이다. 샤프트 크랭크(232)가, 예를 들어, 핸들(212)을 통해서 사용자에 의해서 수작업으로 작동될 수 있고, 또는, 대안적으로, 분리된 장치를 통해서 자동적으로 기계-작동될 수 있을 것이다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244)이 전술한 예시적인 컷팅 표면 중의 임의의 컷팅 표면일 수 있을 것이다. 또한, 제 1 및 제 2 민서 스크린(240, 248)이, 도시된 바와 같이, 상이한-크기의 개구를 포함할 수 있을 것이다.
동작 중에, 샤프트 크랭크(232)가 회전됨에 따라, 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244)이 유사하게 회전되고 그리고 저장용기(208) 내에서 격실(228) 내에 수용된 조직 샘플을 향해서 하향 이동된다. 제 1 컷팅 표면(236)이 조직 샘플과 접촉하고 그리고 조직 샘플을 하나 이상의 보다 작은 부분으로 컷팅한다. 이어서, 그러한 보다 작은 조직 부분이 제 1 민서 스크린(240)의 개구를 통과하고, 제 2 컷팅 표면(244)에 의해서 보다 더 작은 부분으로 다시 컷팅되고, 그리고 최종적으로 제 2 민서 스크린(248)의 개구를 통과한다. 실질적으로 모든 조직 샘플(또는 적어도 주어진 적용예를 위한 충분한 양의 조직 샘플)이 민싱되고 제 2 스크린(248)을 통과할 때까지, 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244)이 회전되고 그리고 저장용기(208) 내에서 하향 이동된다. 제 2 스크린(248)을 통과하면, 민싱된 조직 샘플이 저장용기(208)의 컨테이너(252) 내에서 수집되고 수용된다. 비록 도 6a-6c에서와 같이 도시되지는 않았지만, 저장용기(208)의 상단부 부분이 사실상 캡핑될(capped) 수 있고 그리고 저장용기(208)의 내부 부분이 무균처리될 수 있고, 그에 따라 컨테이너(252)가 무균성의 밀봉된 컨테이너(252)가 된다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 그리고 전술한 바와 같이, 저장용기(208)의 격실(228)이, 도 6b에 도시된 바와 같이, 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244) 그리고 제 1 및 제 2 민서 스크린(240, 248) 아래에 위치되는 한편, 저장용기(208)의 무균성의 밀봉된 컨테이너(252)가 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244) 그리고 제 1 및 제 2 민서 스크린(240, 248) 위에 위치된다. 따라서, 도 6a-6c에 도시된 조직 민싱 툴(200)의 실시예에서, 격실(228)의 크기 및 무균성의 밀봉된 컨테이너(252)의 크기는, 제 1 및 제 2 컷팅 표면(236, 244)이 하향(또는 상향) 회전됨에 따라, 변화된다.
또한, 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 도 6a-6c의 조직 민싱 툴(200)의 묘사는 비제한적이다. 사실상, 변경, 수정 및 다른 구현예가 고려될 수 있다. 예를 들어, 2 보다 적은 또는 2 보다 많은 컷팅 표면(236, 244) 및/또는 민서 스크린(240, 248)이 채용될 수 있을 것이다. 다른 예로서, 핸들(212)이 수평 평면(도시된 바와 같음) 대신에 수직 평면 내에서 회전될 수 있도록, 샤프트 크랭크(232) 및 핸들(212)이 커플링될 수 있을 것이다.
도 7은 발명의 다른 실시예에 따른 조직 민싱 툴(300)을 도시하고, 그러한 조직 민싱 툴의 동작 원리는 도 6a-6c에 도시된 조직 민싱 툴(200)의 동작 원리와 유사하다. 전술한 바와 같이, 조직 민싱 툴(300)이 베이스(304), 저장용기(308), 및 핸들(312)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 저장용기(308)의 상단부 부분이 스크류(315) 및 윙 너트(317)의 이용을 통해서 저장용기의 하단부 부분에 커플링된다. 또한, 조직 민싱 툴(300)이 흡입 컵(320)을 포함하여, 동작 중에 툴(300)로 전술한 안정성을 제공한다. 예를 들어 제 2 스크린(348)을 통과한 후에 민싱된 조직 샘플이 내부에 수집되는 저장용기(308)의 컨테이너(352)가 또한 도시되어 있다. 전술한 바와 같이, 저장용기(308)의 상단부 부분이 캡핑되고 그리고 저장용기(308)의 내부 부분이 무균처리되고, 그에 따라 컨테이너(352)가 무균성의 밀봉된 컨테이너(352)가 된다.
세포 격리 및 수집 방법
발명은 또한 표적 세포를 격리 및 수집하기 위한 조직의 효과적이고 무균적인 프로세싱을 제공한다. 도 8은 세포를 격리 및 수집하기 위한 과정 단계의 개관을 제공한다. 일반적으로, 툴의 컷팅 표면을 통해서 그리고 무균성의 밀봉된 컨테이너 내로 조직 샘플을 압박함으로써, 임의의 전술한 조직 민싱 툴을 이용하여 조직 샘플이 초기에 민싱될 수 있다. 발명은 또한 화학물질 또는 효소에 노출시키는 것에 의해서 조직 샘플을 추가적으로 소화시키는 선택적인 방법을 제공한다. 예를 들어, 효소가 민싱된 조직을 소화시키도록 효소를 컨테이너 내로 주입함으로써 민싱된 조직이 소화될 수 있을 것이다. 효소가, 독립적인 또는 조합된, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 또는 디스파아제와 같은 프로테아제일 수 있다. 이러한 단계가, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직 샘플을 보다 큰 단편(전술한 바와 같이, "소화되지 않은 조직")으로부터 분리하는 방법으로, 예를 들어, 디캔팅(decanting), 흡기(aspiration), 침전, 또는 바람직하게 필터링으로 부가적으로 또는 선택적으로 통합된다. 일부 실시예에서, 점성적일 수 있는, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직이, 분리 단계에 앞서서, 세척되거나 희석된다. 표적 세포를 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 분리하는 것이, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직을 포함하는 혼합물로부터 세포를 침전시키는 것에 의해서, 달성될 수 있다. 비록 중력 침전이 이용될 수 있지만, 침전 프로세스가, 예를 들어, 원심분리에 의해서 가속될 수 있다. 부가적으로 그리고 대안적으로, 표적 세포가 추후의 이용을 위해서 극저온-보전되도록 무균성 컨테이너 내로 이동된다.
실시예에서, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직 샘플을 소화되지 않은 조직으로부터 분리하기 위한 방법이 도 9에 도시된 바와 같은 2 이상의 여과 단계를 포함할 수 있을 것이다. 예를 들어, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직 샘플에 대해서 크기가 다른 필터를 이용하는 복수의 여과 단계가 적용될 수 있을 것이다. 실시예에서, 조대한 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해서, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직 샘플에 대해서, 예를 들어, 약 500 마이크로미터, 약 250 마이크로미터, 약 150 마이크로미터, 또는 약 100 마이크로미터의 큰-기공 필터를 이용하는 제 1 여과 단계가 초기에 적용된다. 부가적으로, 콜라겐 섬유와 같은 부가적인 오염물질을 제거하기 위해서, 예를 들어, 약 70 마이크로미터 또는 약 40 마이크로미터의 작은-기공 필터를 이용하여 제 2 여과 단계를 실시하여 제 1 여과 단계로부터의 용출액(eluate)을 필터링한다. 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직이 일반적으로 점성적이기 때문에, 조직이 프로세스 중의 임의의 스테이지에서 적절한 무균성 용액(예를 들어, 버퍼링된 염 용액)으로 세척 또는 희석될 수 있다. 예를 들어, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직이 소화되지 않은 조직으로부터 분리된 후에, 제 1 여과 단계에 이어서, 추가적인 세척을 실시하여 제 2 여과 단계에 앞서서 상기 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직을 추가적으로 세정할 수 있다. 복수의 여과 순회과정(round)에 이어서, 조직 샘플을 실질적으로 가지지 않는 표적 세포가 침전에 의해서 수집될 수 있다.
도 10a는 조직 샘플로부터 희망하는 세포를 수집 및 격리하기 위한 예시적인 과정을 도시한다. 조직 샘플이 격실 내에 초기에 배치될 수 있고, 상기 격실에서 조직 샘플이 보다 작은 부분으로 민싱, 분석 또는 분리될 수 있다. 임의의 효소적인 소화 이전에 조직 샘플을 민싱하는 것의 장점은, 효소가 작용할 수 있는 조직 샘플의 전체 표면적이 증가된다는 것이다. 격실이 컨테이너(예를 들어, 소화 백)의 하나의 포트(예를 들어, 개구)에 피팅되고 부착될 수 있고, 그에 따라 격실 내로 도입된 조직 샘플이 컨테이너 내로 직접적으로 통과될 수 있다. 격실이 컨테이너에 분리가능하게 부착될 수 있고 또는 분리가능하게 부착되지 않을 수 있을 것이다.
컨테이너는, 민싱된 조직 및 유체를 홀딩하는 무균성의 밀봉된 내부 공간을 형성한다. 컨테이너가, 재료 및 유체를 컨테이너 내외로 도입 또는 분배하기 위한 밀봉된 포트를 포함할 수 있을 것이다. 예를 들어, 컨테이너가 유체를 도입하기 위한 하나 이상의 주입 포트 및 컨테이너로부터 유체 및 재료를 분배 또는 흡입하기 위한 하나 이상의 회수 포트를 포함할 수 있을 것이다. 또한, 대안적인 실시예에서, 유체 및 재료가 컨테이너로 그리고 컨테이너로부터 하나의 방향만을 따라서 이동될 수 있도록, 주입 포트 및 회수 포트의 각각이 구성될 수 있다. 또한, 포트가 격실로부터의 컨테이너의 대향 단부에 배치될 수 있으나, 포트가 또한 컨테이너의 둘레의 임의 부분을 따라서 배치될 수 있다. 실시예에서, 포트가 컨테이너에 대해서 제거가능하게 고정되지 않는다. 부가적으로 또는 대안적으로, 주사기, 공기 환기부(vent), 캡핑된 공기 환기부, 또는 루어(luer) 연결부와 짝을 이루는 다른 장치가 포트에 부착될 수 있다. 무균성이 유지될 수 있도록, 모든 포트가 소독될(swabbable) 수 있을 것이다.
후속하여, 예를 들어 민싱된 조직을 화학물질 또는 효소에 노출시킴으로써, 민싱된 조직이 선택적으로 소화될 수 있다. 실시예에서, 민싱된 조직이 효소에 의해서, 예를 들어, 독립적인 또는 조합된, 콜라게나아제, 히알루로니다아제, 또는 디스파아제와 같은 프로테아제에 의해서 소화될 수 있을 것이다. 효소가 민싱된 조직을 소화시키도록, 효소가 컨테이너 내로 직접적으로 도입될 수 있을 것이다. 예를 들어, 주사기, 또는 유체, 재료, 또는 공기를 수용할 수 있는 임의의 다른 장치가 (예를 들어, 루어 연결부를 통해서) 컨테이너에 연결될 수 있고 그리고, 예를 들어, 프로테아제를 컨테이너 내로 분배하여 민싱된 조직 샘플을 소화시키기 위해서 이용될 수 있다. 민싱된 조직 샘플의 소화를 향상시키기 위해서, 효소를 컨테이너 주위로 순환시키기 위해서 컨테이너가 반전될 수 있다. 민싱된 조직 샘플의 효소적인 파괴의 레이트(rate)에 의존하여, 컨테이너가 정지 상태로(at rest) 배치되고 그리고 민싱된 조직 샘플이 민싱된 조직 샘플을 소화시키기 위한 소정 시간의 기간 동안, 예를 들어 약 1 내지 3 시간 동안(그러나, 그보다 길거나 짧은 시간이 고려될 수 있다) 37 ℃에서 효소와 함께 인큐베이트(incubate)될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 인큐베이션 프로세스를 보조하기 위해서, 컨테이너가 선택적으로 궤도 셰이커(shaker)로 주기적으로 혼합되거나 일련의 롤러 또는 컨테이너 내의 민싱된 조직 샘플의 파괴를 보조하기 위한 다른 압축-타입 장치를 통해서 이동될 수 있다. 조직 샘플이 약 10 mL인 예에서, 사용자가 약 10 mL의 효소를 컨테이너 내로 주입할 수 있으나, 그보다 많거나 적은 효소가 고려될 수 있을 것이다. 민싱된 조직 샘플이 소화되면, 약 20-30 mL의 소화된 조직 샘플이 초래된다.
세포가 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 분리되기 전에, 세포의 후속 정제를 돕기 위해서, 소화되지 않은 조직의 임의의 잔류 단편이 선택적으로 제거된다. 소화되지 않은 조직의 크기에 의존하여, 소화되지 않은 조직이, 예를 들어, 물리적 추출, 디캔팅, 흡기, 침전, 또는 바람직하게, 여과에 의해서 제거될 수 있다. 선택적으로, 제거되는 소화되지 않은 조직이 줄기 세포의 증식(expansion)을 위한 시딩(seeding) 공급원과 같은 다른 목적을 위해서 저장 및/또는 이용될 수 있을 것이다.
도 10a-10d는 여과에 의해서 분리가 달성되는 여러 가지 실시예를 도시한다. 구체적으로, 도 10a-10d는 소화된 조직 샘플을 홀딩하는 컨테이너를 컨테이너에 제거가능하게 부착될 수 있는 필터 유닛에 연결하는 유체 통로를 도시한다. 필터 유닛이 단일 필터, 또는 선택적으로 크기가 감소되는 복수의 필터를 이용할 수 있을 것이다. 대안적으로, 컨테이너가 2개의 하위-공간으로 분할되도록, 필터가 컨테이너 내에 피팅되고 배치될 수 있다. 필터가 대칭적으로 또는 비대칭적으로 컨테이너 내에 배치될 수 있을 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 필터가 포트, 예를 들어, 회수 포트 내에 피팅될 수 있을 것이다. 필터의 크기가, 적용예에 의존하여, 약 500 마이크로미터, 약 250 마이크로미터, 약 150 마이크로미터, 약 100 마이크로미터, 약 70 마이크로미터, 약 40 마이크로미터, 또는 그 임의의 범위일 수 있다. 점성적일 수 있는 소화된 조직 샘플이 필터링에 앞서서 희석될 수 있을 것이고, 그에 따라 결과적인 조직 샘플이 필터를 통해서 추가적인 프로세싱을 위한 하류 컨테이너 또는 구성요소 내로 보다 용이하게 이동할 수 있다. 희석 용액의 예에는, 인산염 버퍼링된 함염물(phosphate buffered saline)(PBS), 5% 인간 혈청 알부민, 함염물, 헤타-스타치(heta-starch), 및 신선한 혈장(예를 들어, 자가수혈 혈장)이 포함된다. 실시예에서, 주사기, 또는 유체를 수용할 수 있는 임의의 다른 장치를 이용하여, 주입 포트를 통해서 컨테이너 내로 희석 용액을 분배한다. 소화된 조직 샘플이 약 20-30 mL인 예에서, 사용자가 약 250 mL의 희석 용액을 컨테이너 내로 주입할 수 있으나, 그보다 많거나 적은 용액도 고려될 수 있다. 결과적으로, 컨테이너가 약 250-300 mL의 희석된, 소화된 조직 샘플을 홀딩한다. 여과 후에, 용출액이, 예를 들어, 진공, 흡입, 또는 중력에 의해서, 바람직하게 라인 클램프(예를 들어, 버터플라이 라인 클램프)에 의해서 조절되는 유체 통로를 통해서 제 2 무균성 컨테이너(예를 들어, 세척/원심분리 백) 내로 추진될 수 있을 것이다.
희석되고, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 세포를 격리시키는 것이 여러 가지 메커니즘에 의해서 달성될 수 있다. 실시예에서, 표적 세포가 희석되고, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 침전에 의해서 격리된다. 비록 중력 침전이 이용될 수 있지만, 침전 프로세스가 예를 들어 원심분리에 의해서 가속될 수 있다. 본원 발명은 시스템의 적절한 원심분리를 보장하기 위해서 맞춤형의 원심분리 버킷, 삽입체, 및 밸런스 중량체를 포함할 수 있다.
침전은 표적 세포를 희석된, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직 샘플로부터 분리시킨다. 세포 수집을 돕기 위해서, 세포를 실질적으로 포함하지 않는 상청액이 배출구 포트 및 바람직하게 라인 클램프에 의해서 조절되는 유체 통로를 통해서 선택적으로 제거된다. 상청액이, 예를 들어, 디캔팅 또는 흡기에 의해서 제거될 수 있을 것이다. 제 2 무균성 컨테이너가 압축가능한 백인 예에서, 상청액이 백을 물리적으로 프레싱하는 것에 의해서 디킨팅될 수 있을 것이다. 대안적으로, 상청액이, 예를 들어, 진공, 흡입, 또는 중력에 의해서 제거될 수 있을 것이다. 선택적으로, 상청액이 배출구 포트 및 라인 클램프에 의해서 조절되는 유체 통로를 통해서 제 2 무균성 컨테이너로 연결된 폐기물 컨테이너 내로 제거될 수 있다. 실시예에서, 제거된 상청액이 (배양에서의) 세포 유지와 같은 다른 목적을 위해서 저장 및/또는 사용될 수 있을 것이다.
표적 세포를 수집하기 위해서, 제 2 무균성 컨테이너의 하단부에 수집될 수 있는 세포 펠릿(pellet)을 재현탁(resuspend)시키기 위해서, 적은 부피의 희석 용액(예를 들어, 20 mL의 자가수혈 혈장)이 부가될 수 있다. 도 10a에 도시된 실시예에서 제시된 바와 같이, 제 2 무균성 컨테이너가, 컨테이너의 하단부에 위치된 유체 통로 내로의, 그리고 선택적으로 이송 컨테이너(예를 들어, 이송 백) 내로의 표적 세포의 이동을 돕기에 충분한 각도로 테이퍼링된 하단부를 가질 수 있다. 대안적으로, 도 10b에 도시된 바와 같이, 표적 세포가 컨테이너의 측부에 위치된 유체 통로 내로, 그리고 선택적으로 이송 컨테이너 내로 이동될 수 있을 것이다. 제 2 무균성 컨테이너의 외부로 그리고 유체 통로 내로 그리고 선택적으로 이송 컨테이너 내로 세포가 이동하는 것이 진공 또는 흡입에 의해서 촉진될 수 있고 그리고 라인 클램프에 의해서 조절될 수 있을 것이다.
필요한 경우에, 정제된 표적 세포가 즉시 이용될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 세포가 추후의 이용을 위해서 극저온 보전된다. 장기간의 저장을 달성하기 위해서, 세포가 선택적인 이송 컨테이너로부터 냉동에 적합한 밀봉가능한 무균성 컨테이너(예를 들어, 극저온-백) 내로 이송될 수 있다. 대안적으로, 세포가 제 2 무균성 컨테이너로부터 추후의 이용을 위한 냉동가능한 컨테이너 내로 직접적으로 수집될 수 있다. 냉동보호제가 표적 세포의 저장 및 보전에 도움을 주기 위해서 부가될 수 있고, 그리고, 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO), 알부민, 및/또는 덱스트란을 독립적으로 또는 조합적으로 포함할 수 있다. 냉동보호제가 침전 이후에 제 2 무균성 컨테이너 내의 세포로 부가될 수 있을 것이다. 대안적으로, 냉동보호제가 선택적인 이송 컨테이너 내의 또는 장기간 저장 및 추후 이용을 위한 냉동가능한 컨테이너 내의 세포로 부가되고 혼합될 수 있을 것이다.
실시예에서, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직을 소화되지 않은 조직으로부터 분리하는 방법이 도 10c-10d에 도시된 바와 같은 둘 이상의 여과 단계를 포함할 수 있을 것이다. 예를 들어, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직에 대해서 조대한, 소화되지 않은 조직을 제거하기 위한 제 1 여과 단계가 적용될 수 있을 것이다. 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직이 일반적으로 점성을 가지기 때문에, 조직이 프로세스의 임의 스테이지에서 적합한 무균성 용액으로 세척 또는 희석될 수 있다. 예를 들어, 제 1 여과 단계에 이어서 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직이 소화되지 않은 조직으로부터 분리된 후에, 추가적인 세척을 실시하여 제 2 여과 단계에 앞서서 조직을 추가적으로 세정할 수 있다. 실시예에서, 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 콜라겐 섬유와 같은 오염물질을 제거하기 위해서, 제 2 여과 단계가 보다 작은 크기의 필터를 이용할 수 있을 것이다. 제 2 여과 단계 이후에, 표적 세포가 침전에 의해서 수집되고 그리고 컨테이너의 하단부에(도 10c) 또는 컨테이너의 측부에(도 10d) 위치된 유체 통로를 통해서 선택적인 이송 백 내로 이동된다. 대안적으로, 세포가 장기간의 저장 및 추후의 이용을 위해서 무균성 극저온-백 내로 직접적으로 수집될 수 있을 것이다.
민싱된 조직 샘플을 분리하기 위한 부가적인 예시적 프로세스가 도 10e-10g에 도시되어 있다. 이러한 프로세스의 각각에서, 조직 샘플이 도 7의 민서와 같은 민서 내에 배치된다. 동작 중에, 민서가 하나 이상의 컷팅 표면을 통해서 조직 샘플을 강제하고 그리고 미세하게 민싱된 조직을 컷팅 표면(들)의 다른 측부 상에 배치한다. 함염물 백이 제공되어 민서의 외부로의 조직의 플러싱(flushing)을 허용하고; 전형적으로, 500 mL까지의 함염물이 이러한 목적을 위해서 사용될 수 있을 것이다. 민서로부터 플러싱될 때, 민싱된 조직이 선택적인 소화 백(도시된 바와 같음) 내로 유동할 수 있을 것이고, 그러한 소화 백에서 민싱된 조직이 추가적인 프로세싱에 앞서서 효소적으로 소화될 수 있을 것이다(도 10a-10d를 참조하여 설명한 바와 같다). 선택적인 소화 백이 희석 백과 유체 소통한다. 대안적으로, 기계적인 민싱으로 인해서 임의의 효소적인 소화 필요성이 배제되었다면, 민싱된 조직이 희석 백 내로 직접적으로 유동될 수 있다. 기계적으로 민싱된 조직(효소적인 소화가 적용되든지 또는 적용되지 않든지 간에)이 점성적일 수 있을 것이다. 희석 백을 기계적으로 조작하여 조직 및 함염물의 혼합을 촉진할 수 있다. 또한, 희석 백에 선택적인 주입 포트가 피팅되어, 필요에 따라서 부가적인 함염물을 희석 백 내로 주입하는 것을 허용한다.
이어서, 점성이 충분히 감소되면, 조직 현탁체가 필터링된다. 도 10e-10g에 도시된 바와 같이, 현탁체가 희석 백으로부터 적어도 하나의 백-내(in-bag) 필터를 가지는 필터 백 내로 전달된다. 도 10e는 약 40-70 ㎛ 보다 큰 입자들을 걸러내는 단일 백-내 필터를 가지는 실시예를 도시한다. 도 10f는 약 150-250 ㎛ 보다 큰 입자들을 걸러내는 단일 백-내 필터를 가지는 실시예를 도시한다. 도 10f에서, 백-내 필터로부터의 여과액이, 약 40-70 ㎛ 보다 큰 입자들을 걸러내는 제 2의 인-라인 필터 유닛을 통과한다. 도 10g는, 필터 백이 연속적인 2개의 백-내 필터를 포함하는 실시예를 도시하고, 상기 각각의 백-내 필터가 적어도 300 cm2 의 표면적을 가지고; 상기 제 1 필터가 약 500 ㎛ 보다 큰 입자들을 걸러내고 그리고 제 2 필터가 약 100 ㎛보다 큰 입자들을 걸러낸다. 도 10e-10g의 각각에서, 필터 백이 제 1 필터로부터 여과 잔류물(retentate)의 제거를 허용하는 포트를 포함한다. 이러한 여과 잔류물이 세포 배양을 위한 조직 외식체(explant)로서 선택적으로 이용될 수 있다.
도 10e-10g의 여과액이 도 10a-10d에 도시된 것과 같은 원심분리 백 내로 전달된다. 세포가 침전에 의해서(예를 들어, 원심분리에 의해서) 현탁체로부터 분리되고 그리고 백의 하단부 부분 내에 또는 백의 하단부 부분에 연결된 유체 통로 내에서 농축된다. 상청액이 (예를 들어, 디캔팅, 흡기, 진공, 흡입, 또는 백의 압축에 의해서) 선택적으로 폐기물 컨테이너에 연결된 튜빙을 통해서 제거될 수 있다. 이러한 상청액이 배양 중에 세포를 유지하는 것과 같은 다른 목적을 위해서 이용될 수 있을 것이다.
표적 세포를 수집하기 위해서, 적은 부피의 희석 용액(예를 들어, 20 mL의 자가수혈 혈장)이 부가되어 침전된 세포를 재현탁시킬 수 있다. 도 10e-10g에 도시된 바와 같이, 재현탁된 세포가 원심분리 백으로부터, 도 10g에 도시된 바와 같이, 선택적으로 제 2 필터 백, 예를 들어 적어도 100 cm2 의 표면적을 가지고 약 40 ㎛ 보다 큰 입자들을 걸러내는 필터를 포함하는 제 2 필터 백을 통과한 후에, 이송 백으로 전달될 수 있다. 세포가 극저온백으로 이송될 수 있고 그리고, 도 10a-10d에 대해서 전술한 바와 같이, DMSO, 알부민, 및/또는 덱스트란과 같은 하나 이상의 냉동보호제가 부가될 수 있다.
여기에서 개시된 방법은 다양한 고체 조직으로부터 세포를 정제하는데 있어서 효과적이다. 예를 들어, 여기에서 개시된 방법은 줄기 세포와 같은 세포를 태반 또는 탯줄 조직과 같은 지방 조직 또는 후산 조직, 보다 구체적으로 와튼 젤리을 포함하는 조직으로부터 분리할 수 있다. 정제된 와튼 젤리 줄기 세포가 뼈, 연골(cartilage), 지방 또는 근육과 같은 임의의 다양한 조직을 치료 또는 재생하기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 세포는 또한 조혈모세포 이식(hematopoietic engraftment)을 도울 수 있고 그리고 숙주 내의 면역 반응을 조절 및 억제할 수 있는 가능성을 가진다.
정제된 세포에 더하여, 여기에서 개시된 방법은 또한 부가적으로 유용한 생성물을 산출한다. 예를 들어, 세포가 민싱된 및/또는 효소적으로 소화된 조직으로부터 분리될 때, 남아 있는 세포-고갈된 조직은, (예를 들어, 배양에서) 세포를 유지하기 위해서 이용될 수 있는 훌륭한(rich) 무균성 용액이 된다. 또한, 소화 프로세스 이후에 잔류하는 소화되지 않은 조직의 임의 단편이 또한 유용할 수 있다. 예를 들어, 소화되지 않은 탯줄 조직이 간엽성(mesenchymal) 줄기 세포의 증식을 위한 시딩 공급원으로서 이용될 수 있다.
여기에서 채용된 용어 및 표현은 설명을 위한 용어 및 표현으로서 사용된 것이고 제한적인 것이 아니며, 그리고 그러한 용어 및 표현의 이용에 있어서, 도시되고 설명된 특징의 임의 균등물 및 그 일부를 배제하기 위한 의도를 가지지 않는다. 또한, 발명의 특정 실시예를 설명하였지만, 여기에서 개시된 개념을 포함하는 다른 실시예가 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고도 이용될 수 있다는 것을 당업자가 자명하게 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 개시된 실시예가 모든 측면에서 단지 예시적인 것이고 그리고 제한적이지 않은 것으로 간주될 수 있을 것이다. 또한, 여기에서 개시된 구성은 예시적인 것으로 그리고 어떠한 방식으로도 제한적이지 않은 것으로 의도되었다. 유사하게, 비록 물리적인 설명이 설명 목적을 위해서 제공되었지만, 임의의 특별한 이론 또는 메커니즘으로 제한하고자 하는 의도 또는 그에 따라 청구항을 제한하고자 하는 의도는 가지지 않는다.
참조를 위한 포함
여기에서 인용된 특허 문헌 및 과학 논문의 각각의 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해서 그 전체가 참조로서 포함된다.
균등물
발명의 사상 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않고도, 발명이 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있을 것이다. 그에 따라, 전술한 실시예는, 모든 측면에서, 여기에서 개시된 발명을 제한하기 보다는 예시적인 것으로 간주되어야 할 것이다. 그에 따라, 발명의 범위가 전술한 설명보다는 첨부된 청구항에 의해서 표시되고, 그리고 청구항의 의미 및 균등성 범위 내의 모든 변화가 발명의 범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (50)

  1. 조직 민싱 툴로서:
    조직 샘플을 위한 격실;
    핸들로 작동가능하고 상기 격실 내에서 이동가능한 중실형 부재;
    상기 격실의 일 단부에서의 회전가능한 컷팅 표면; 및
    무균성의 밀봉된 컨테이너를 포함하고,
    상기 격실은 상기 중실형 부재와 상기 회전가능한 컷팅 표면 사이에 상기 조직 샘플을 위치시키도록 배치되고, 상기 핸들의 일 방향으로의 작동은 상기 중실형 부재가 상기 회전가능한 컷팅 표면을 향해서만 이동하도록 하고,
    또한, 상기 회전가능한 컷팅 표면은 상기 격실을 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너로부터 격리시켜, 상기 중실형 부재를 통해, 상기 회전가능한 컷팅 표면에 접촉하도록 그리고 이를 통하여 프레스된 조직 샘플이 상기 무균성의 밀봉된 컨테이너 내에 민싱된 조직으로서 배치되도록 하는, 조직 민싱 툴.
  2. 제 1 항에 있어서,
    4 평방 밀리미터 이하의 평균 횡단면을 가지는 단편들로 상기 조직 샘플을 민싱하도록 상기 회전가능한 컷팅 표면의 크기가 결정되는, 조직 민싱 툴.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 평균 횡단면이 1 평방 밀리미터 이하인, 조직 민싱 툴.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 단편의 평균 횡단면을 감소시키기 위한 제 2 컷팅 표면을 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 회전가능한 컷팅 표면이 자동화된 컷팅 시스템을 포함하는, 조직 민싱 툴.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 자동화된 컷팅 시스템이 반-자동 가위를 포함하는, 조직 민싱 툴.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 회전가능한 컷팅 표면에 근접하여 배치된 하나 이상의 민서 스크린을 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 하나 이상의 민서 스크린은 상기 조직 샘플을 향해서 이동가능한, 조직 민싱 툴.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조직 민싱 툴의 동작 중에 상기 조직 민싱 툴을 안정화시키기 위한, 상기 조직 민싱 툴에 커플링된 흡입 컵을 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무균성의 밀봉된 컨테이너와 연통하는 유체 도관, 및 상기 유체 도관 내에 배치된 필터를 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무균성의 밀봉된 컨테이너가 상기 컨테이너 내로의 유체의 무균적인 도입을 허용하는 적어도 하나의 밀봉된 접근 포트를 포함하는, 조직 민싱 툴.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 격실의 내부 표면이 나사산형인, 조직 민싱 툴.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 격실을 밀봉하기 위한 가스켓을 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 격실 단부에 인접한 상기 격실의 부분이 일정한 횡단면을 가지는, 조직 민싱 툴.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 격실 단부에 인접한 상기 격실의 부분이 테이퍼형인 또는 원뿔형-형상인, 조직 민싱 툴.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 중실형 부재가 상기 격실의 부분과 짝을 이루고 상기 격실의 부분을 충전하도록 성형된, 조직 민싱 툴.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 조직 샘플을 향해서 상기 회전가능한 컷팅 표면을 이동시키기 위한, 상기 회전가능한 컷팅 표면에 커플링된 샤프트 크랭크를 더 포함하는, 조직 민싱 툴.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 회전가능한 컷팅 표면이 상기 조직 샘플을 향해서 이동가능한, 조직 민싱 툴.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 조직 민싱 툴이 상기 격실의 상기 일 단부에 일련의 회전가능한 컷팅 표면을 포함하는, 조직 민싱 툴.
  20. 제 1 항의 조직 민싱 툴의 회전가능한 컷팅 표면과 중실 부재 사이에 위치한 조직 샘플을 민싱하는 방법으로서:
    상기 조직 샘플을, 상기 중실형 부재를 통해, 상기 조직 민싱 툴의 상기 회전가능한 컷팅 표면에 접촉하도록 그리고 이를 통하여 프레스하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 조직 샘플을 소화시키는 방법으로서:
    제 20 항의 방법에 따라서 상기 조직 샘플을 민싱하는 단계; 및
    효소의 주입 단계로서, 상기 주입 단계에 의해서 상기 효소가 민싱된 조직을 소화시키는, 주입 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 효소가 콜라게나아제인, 방법.
  23. 조직 샘플로부터 세포를 분리하는 방법으로서:
    제 20 항의 방법에 따라서 상기 조직 샘플을 민싱하는 단계; 및
    소화되지 않은 조직을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 조직 샘플을 희석하는 단계를 더 포함하고, 이어서 상기 소화되지 않은 조직이 여과에 의해서 제거되는, 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 필터링에 의해 생성된 여과액을 침전하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    침전된 세포를 재현탁하고 재현탁된 침전된 세포를 필터링하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  27. 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조직 샘플이 와튼 젤리 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 조직 샘플이 혈관을 포함하지 않는, 방법.
  29. 제 21 항에 있어서,
    상기 주입 단계 전에, 민싱된 조직을 무균성의 밀봉된 제 2 컨테이너로 이송하는 단계를 포함하는, 방법.
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