KR101915815B1 - 카세인 미셀 및 트립토판-풍부 펩티드를 포함하는 포장된 열-보존된 수성 음료의 제조 방법 및 제조된 제품 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 카세인 미셀(예를 들어, 유제품 단백질로부터), 및 트립토판이 풍부한 펩티드 분획을 포함하는 저온살균되거나 멸균된 포장된 수성 음료 제품의 제조 방법, 및 제조된 제품에 관한 것이다. 이러한 방법은 특정 pH에서의 열-보존을 필요로 한다.
Description
본 발명은 카세인 미셀(예를 들어, 낙농 제품으로부터), 및 트립토판이 풍부한 펩티드 분획을 포함하는 열-보존된(예를 들어, 저온살균되거나 멸균된) 포장된 수성 음료 제품의 제조 방법, 및 제조된 제품에 관한 것이다.
최근에, 트립토판이 뇌에 흡수되는 경우, 이러한 트립토판이 인간 거동, 기분, 뇌 기능, 뇌 발달의 수개의 양상에 대해 갖는 것으로 여겨지는 이익에 대한 다양한 보고서가 존재한다. 이러한 보고서의 예는 국제특허공개 제WO 99/55174호, 제WO 00/42868호, 제WO 2005/023017호이다.
트립토판은 많은 단백질, 예를 들어, 유장 단백질에 존재하는 아미노산일 뿐만 아니라, 동물 단백질도 트립토판을 함유한다. 트립토판은 트립토판을 함유하는 단백질의 섭취 후에 혈액내에 흡수될 수 있고, 혈액으로부터 뇌에 흡수될 수 있다. 그러나, 트립토판은 흡수되는 유일한 아미노산이 아니고, 사실 평균적인 동물 단백질 조성물이 섭취되는 경우, 뇌에 흡수되는 트립토판의 수준은 다른 아미노산의 경쟁적인 흡수에 기인하여 매우 낮아서, 통상적으로 트립토판에 의한 유의한 효과가 전혀 관찰될 수 없다. 따라서, 상기 언급된 대부분의 보고서는 트립토판이 풍부한 단백질 또는 단백질-분획, 또는 유리 아미노산 트립토판(후자는 임의적으로(optionally) 다른 유리 아미노산 및/또는 단백질과 조합됨)을 사용한다.
유리 아미노산으로서 트립토판의 사용은 많은 국가의 식품 법률이 식료품내 유리 아미노산으로서의 트립토판의 사용을 제한한다는 점에서 불리하다.
트립토판-풍부 단백질은 트립토판의 수준 및 거대 중성 아미노산에 대한 이의 비에 대한 자연적인 제한을 가지고, 이는 뇌에 의한 트립토판의 흡수와 관련이 있다.
최근에, 트립토판이 풍부한 펩티드가 목적 효과를 위해 뇌에서 충분한 트립토판을 얻을 수 있는 양호한 공급원일 수 있고, 유리 아미노산보다 식료품에 보다 용이하게 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 트립토판이 풍부한 펩티드는 바람직하게는 아미노산이 적고, 뇌로의 흡수의 경쟁이 높은 것으로 여겨진다: 소위 거대 중성 아미노산(LNAA), 예를 들어 류신, 이소류신, 발린, 티로신, 페닐알라닌(또한, LNAA의 정의에 따라서 메티오닌이 사용됨). 따라서, 높은 수준의 트립토판을 함유하고, 높은 비의 트립토판/LNAA를 갖는 펩티드 제제를 제조하고 사용하는 것이 바람직하다. 메티오닌은 본 발명의 맥락에서 어떠한 이로운 대사 효과도 갖지 않는 것으로 간주되고, 이에 따라, 본 발명의 목적을 위한 LNAA중 하나로서 간주되지 않는다.
국제특허공개 제WO 02/46210호는, 예를 들어 알파-락트알부민의 가수분해 및 선택적인(selective) 침전에 의한, 중량을 기준으로 0.3 이상의 트립토판/LNAA 비를 갖는 트립토판-풍부 펩티드의 제조 방법을 기술한다.
예를 들어, 상기한 바와 같은 트립토판-풍부 펩티드 제제는 식료품에 사용될 수 있다. 이러한 식료품은 스낵 바, 또는 조식용 시리얼, 또는 물 또는 우유와 같은 액체에 분산/용해되어 음료 제품을 생성할 수 있는 분말과 같은 건조 형태일 수 있다.
예를 들어, 유럽에서 즉석 음용 음료의 형태로 기능성 식품을 제공하는 경향이 증가하고 있으므로, 예를 들어 즉석 음료(ready to drink: RTD) 제품으로서, 트립토판-공급원( 및 바람직하게는 트립토판-풍부 펩티드 분획으로서 바람직하게는 이로운 트립토판/LNAA 비를 갖는 트립토판-공급원)을 함유하는 액체 제품을 제조하기 위한 요구가 또한 존재한다. 영양상의 이유, 및/또는 어린이에 의해 소비(또는 아마도 소비될 예정임)되고/되거나 자신의 아이들에게 제공하기 위하여 부모가 가져오는 음료로의 제형화의 용이함을 위하여, 상기 RTD 제형내의 카세인 미셀과 같은 유제품 성분의 존재가 바람직하다.
구체적으로, 우유와 관련되거나 유사한 구강내의 감촉 및/또는 입맛을 갖는 RTD 제품에 대한 요구가 존재하는데, 이는, 예를 들어, 이러한 RTD 제품이 어린이(예를 들어, 6 내지 12세의 학동)를 겨냥할 수 있고, (적어도 입맛 및/또는 감촉에 있어서) 우유를 (어느 정도) 모방하는 제품(즉, 예컨대 과일 쥬스 또는 소프트 드링크보다는 우유에 더 유사함)이 이러한 어린이 및/또는 이들의 부모에 의해 영양 제품으로 일반적으로 인정되기 때문이다. 색 및 향은 착색제 및/또는 향미제에 의해 보충될 수 있지만(그리고, 이는, 예컨대 초콜렛, 바나나 또는 딸기 향이 나는 어린이를 겨냥한 우유-유사 건강 음료에 매우 통상적이지만), 우유 또는 우유-유사 음료의 입맛에 가깝기가 다소 어렵다. 침전물의 형성이 바람직하게는 최소화되고, 더욱 바람직하게는 회피되는 것이 또한 요구된다. 향미제가 첨가될 수 있지만, 조리되는 듯한 이취(cooked off-flavour)의 존재는 바람직하게는 회피된다.
우유-유사 입맛 또는 구강내의 감촉 외에, RTD가 포장되고, (예를 들어, 열-저온살균 또는 열-멸균에 의해) 열-보존되는 것이 또한 요구된다. 이외에, 생성물이 제조 시 최소 침전물을 나타내고, 바람직하게는 제조 시 침전을 전혀 나타내지 않는 것이 요구된다.
독일특허 제4130284호는 높은 영양상 가치를 갖는 단백질의 제조 방법을 개시한다. 이러한 방법은 트립토판 및 시스테인이 많은 알파-락트알부민을 함유하는 유장을 펩신에 의해 가수분해하고, 생성된 제품을 단백질, 예컨대 카세인과 배합하는 방법을 개시한다.
따라서, 트립토판-함유 펩티드, 바람직하게는 바람직한 트립토판/LNAA 비를 갖는 트립토판-함유 펩티드가 풍부한 즉석 음료(RTD) 조성물로서, RTD가 열-보존되고, 우유 또는 우유-유사 제품의 입맛 또는 감촉을 모방하거나 이에 유사한 카세인 미셀을 함유하고, 제품은 열-보존(예컨대, 열-저온살균 또는 열-멸균) 시 최소한의 침전(12% 미만의 단백질 침전, 바람직하게는 6% 미만의 침전, 더욱 바람직하게는 침전의 부존재)을 나타내는 조성물의 개발에 대한 요구가 존재한다.
따라서, 침전물의 형성은 바람직하게는 회피되거나 최소화된다. 이를 달성하기 위하여, 0.5% 이상의 카세인 미셀(우유내에서처럼 이들이 응집하는 경우)의 존재가 적어도 부분적으로 우유 또는 우유-유사 음료의 입맛 및/또는 구강내의 감촉을 모방할 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 바람직한 보존 및/또는 저장 안정성을 달성하고 조리되는 듯한 이취를 회피하기 위하여, 바람직하게는 열-저온살균 또는 열-멸균, 가장 바람직하게는 초고온(UHT) 멸균 처리에 의한 열-보존 처리가 필요하다.
이는 물(바람직하게는 전체 조성물을 기준으로 50 내지 97중량%), 0.5 내지 4중량%(건조 중량)의 카세인 미셀, 및 0.1 내지 5중량%(건조 중량)의 트립토판-함유 펩티드 조성물로서, 1 내지 10중량%(트립토판-함유 펩티드를 기준으로)의 트립토판의 수준을 갖는 트립토판-함유 펩티드 조성물을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물을 80 내지 150℃, 바람직하게는 120 내지 150℃의 온도에서 열-보존 처리하는 단계; 및 생성된 액체 생성물을 무균 포장에 의해 포장하는 단계를 포함하되, 열-보존 처리되는 혼합물이 8.1 미만의 pH를 갖고, 상기 pH가 하기 수학식 I의 관계를 갖는, 0.5 내지 4중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 카세인 미셀, 및 0.1 내지 5중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 트립토판-함유 펩티드 조성물로서, 1 내지 10중량%(트립토판-함유 펩티드를 기준으로)의 트립토판의 수준을 갖는 트립토판-함유 펩티드 조성물을 포함하는, 포장된 수성 액체 조성물의 제조 방법에 의해 (적어도 부분적으로) 달성된다:
[수학식 I]
pH > 0.02 x T (℃) + 0.23 x (카세인 미셀의 중량%(건조 중량)) + 3.8
상기 식에서,
카세인 미셀은 전체 제형을 기준으로 중량%로서 나타낸다.
본 발명은 또한 50 내지 97중량%(전체 조성물을 기준으로)의 물; 0.5 내지 4중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 카세인 미셀; 및 0.1 내지 5중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 트립토판-함유 펩티드 조성물로서, 1 내지 10중량%(트립토판-함유 펩티드를 기준으로)의 트립토판의 수준을 갖는 트립토판-함유 펩티드 조성물을 포함하되, 6 내지 8.1, 바람직하게는 6.2 내지 7.5, 더욱 바람직하게는 6.5 내지 7의 pH를 갖는 열-보존된(바람직하게는 열-저온살균되거나 열-멸균된, 더욱 바람직하게는 열-멸균된) 포장된 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 열-보존 처리는 열에 의한 저온살균, 또는 열에 의한 멸균, 가장 바람직하게는 UHT 멸균 처리를 포함한다.
또한, 상기 RTD 제형에 사용하기 위한 트립토판-함유 펩티드 조성물로서, 바람직한 수준의 트립토판 및 바람직한 수준의 트립토판/LNAA(LNAA는 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신 및 발린의 합으로 표현됨)를 갖는 트립토판-함유 펩티드 조성물, 및 이러한 트립토판 공급원의 제조 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명에 따른 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 수용성 트립토판-함유 펩티드, 바람직하게는 2개 이상의 수용성 트립토판-함유 펩티드를 포함하고, 바람직하게는 0.15 초과, 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 트립토판/LNAA 비를 갖는 조성물을 제조하는 방법으로서, 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임을 가수분해하여 5 내지 45의 가수분해도(DH)를 갖는 가수분해물을 제조하는 단계, 및 임의적으로 아르기닌-함유 펩티드 또는 리신-함유 펩티드를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 트립토판-함유 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 RTD 제형에 사용하기 위한 이러한 트립토판-함유 펩티드는 알라닌-트립토판(AW) 또는 글리신-아스파라긴-트립토판(GNW), 더욱 바람직하게는 AW 및 GNW를 포함한다. 상기 가수분해물은 바람직하게는 10 내지 40의 DH를 갖는다.
본 발명에 따른 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 2개 이상의 상이한 수용성 펩티드를 포함하되, 조성물의 몰 트립토판/LNAA 비가 0.15 이상, 바람직하게는 0.15 내지 1.8인 조성물의 형태이다. 바람직하게는, 이러한 트립토판-함유 펩티드 조성물은 AW 또는 GNW, 바람직하게는 AW 및 GNW, 가장 바람직하게는 AW 및 GNW를 1:2 내지 10:1, 바람직하게는 1:2 내지 5:1의 AW:GNW의 몰 비로 포함한다. 따라서, 본 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 트립토판이 풍부한 수용성 펩티드의 조성물의 형태이다. 유리하게는, 본 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 2개 이상의 상이한 다이- 또는 트라이펩티드를 포함하되, 다이- 및 트라이펩티드로부터 선택된 2개의 펩티드는 다이- 및 트라이펩티드의 총량의 5몰% 이상의 양으로 존재하고, 트립토판-함유 펩티드 조성물에서, 30몰% 초과, 바람직하게는 40몰% 초과, 더욱 바람직하게는 50몰% 초과, 더욱 더 바람직하게는 60몰% 초과, 더욱 더 바람직하게는 70몰% 초과, 가장 바람직하게는 80몰% 초과의 펩티드-결합된 트립토판은 다이- 또는 트라이펩티드의 형태로 존재하고, 바람직하게는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 0.15 초과, 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 트립토판/LNAA 비를 갖는다. 펩티드-결합된 트립토판은 펩티드내의 아미노산으로서 존재하는 트립토판을 의미한다.
본 발명에 따른 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 리소자임 가수분해물 또는 정제된 리소자임 가수분해물이다. 바람직하게는, 상기 리소자임 가수분해물은 특히 아르기닌 잔기가 풍부하다. 아르기닌은 거대 중성 아미노산(LNAA)에 속하지 않지만, 이의 인슐린 자극 효과는 공지되어 있다. 본원에 개시된 가수분해물이 생체내에서 높은 혈장 트립토판/LNAA 비를 초래할 수 있음이 밝혀졌다. 혈장에서 검출된 트립토판/LNAA 비는 가수분해물의 트립토판/LNAA 비보다 높은 것으로 밝혀졌다. 본원에 기술된 트립토판-함유 펩티드 조성물의 또 다른 이점은 트립토판-함유 펩티드가 매우 작아서, 보다 덜 선호되는 트립토판/LNAA 비를 갖는 단백질-풍부 생성물과 조합되는 경우에도, 가수분해물이 높은 혈장 트립토판/LNAA 비를 즉시 초래하는 것이다. 이에 따라, 이러한 트립토판-함유 펩티드 조성물은 본 발명의 RTD 제형에 매우 적합하게 된다. 본 발명의 RTD 제형에 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 유리 트립토판을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 트립토판-함유 펩티드 조성물의 가수분해물은 (건조 물질을 기준으로) 1중량% 초과의 유리 트립토판을 함유하지 않는다.
매우 놀랍게도, 침전물의 형성을 회피하기 위한 열-보존 전에 요구되는 pH는 카세인 미셀(또는 이의 공급원)의 존재 또는 부재뿐만 아니라, 이러한 카세인 미셀의 농도에 의존한다. 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 이러한 요인 및 변수가 pH 요건의 상대적인 복잡성을 야기하는 것으로 여겨진다.
본 발명에 따른 방법에서, 열-보존(예컨대, 저온살균, 멸균, 예를 들어 UHT 처리)되는 혼합물의 pH는 특정 한계내에 있어야 한다. 선택된 성분에 따라서, pH는 이미 목적 범위내일 수 있지만, 많은 경우에, 열-보존(예컨대, 저온살균, 멸균, 바람직하게는 UHT 처리)되는 물체의 pH를 상기 특정된 값으로 조정하는 것이 요구된다. 이러한 조정은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 열-보존(바람직하게는 열-저온살균 또는 열-멸균, 가장 바람직하게는 UHT 멸균) 단계 전에, 열-보존(예컨대, 저온살균, 멸균, 가장 바람직하게는 UHT 멸균)되는 혼합물, 또는 이러한 혼합물에 사용되는 하나 이상의 성분에 알칼리제 또는 완충제를 첨가함으로써 달성될 수 있다. UHT 멸균은 본원에서 당해 분야에 공지된 것으로 이해된다: 3 이상, 바람직하게는 5 이상의 F0 값을 달성하기에 충분한 길이의 시간 동안, 120 내지 150℃의 온도.
카세인 미셀의 농도 및 열-보존 처리 온도(예를 들어, UHT 조건)에 따라서, 열-보존(바람직하게는 UHT 멸균) 처리되는 혼합물의 pH는 바람직하게는 6.2 내지 7.5, 바람직하게는 6.5 내지 7이다.
본 발명에 따른 방법 및 제품에서, 조성물은 바람직하게는 0.5 내지 3중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로), 바람직하게는 0.6 내지 2중량%의 카세인 미셀을 포함한다.
6.2 내지 7.5, 바람직하게는 6.5 내지 7의 pH와 0.5 내지 3중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로), 바람직하게는 0.6 내지 2중량%의 카세인 미셀의 농도의 조합이 또한 바람직하다. 특히, 0.5 내지 2중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.6 내지 2중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 농도와 조합되는 6.5 내지 7의 pH가 본 발명에서 바람직하다.
본 발명에 따른 방법 및 제품에서, 조성물은 바람직하게는 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 증점 검을 0.01 내지 0.1중량%(바람직하게는 0.01 내지 0.08중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.05중량%(전체 조성물을 기준으로))의 양으로 추가로 포함하고, 따라서, 우유 또는 낙농 제품과 유사한(즉, 예를 들어, 과일 쥬스 또는 소프트 드링크보다 우유 또는 낙농 제품에 더 유사한) 입맛 및/또는 구강내 감촉을 더욱 지지할 수 있다. 이에 관하여, 상기 농도로 카라기난을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 증점 검(바람직하게는 카라기난)을 0.01 내지 0.1중량%(바람직하게는 0.01 내지 0.08중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.05중량%(전체 조성물을 기준으로)의 양으로, 6.2 내지 7.5, 바람직하게 6.5 내지 7의 멸균되는 혼합물 및/또는 RTD 제형의 pH, 및/또는 0.5 내지 3중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로), 바람직하게는 0.6 내지 2중량%의 카세인 미셀의 농도와 조합하여, 특히 6.5 내지 7의 (멸균되는 혼합물 및/또는 최종 제품의) pH, 및 0.5 내지 2중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.6 내지 2중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 카세인 미셀의 농도와 조합하여 사용하는 것이 본 발명의 방법 및 조성물에 바람직하다. 상기 제시된 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 검(바람직하게는 카라기난)의 사용 또는 존재 외에 또는 대신에, 조성물은 0.5 내지 5중량%(바람직하게는 0.5 내지 3중량%, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 2중량%(전체 조성물을 기준으로))의 전분, 전분 유도체 또는 전분 가수분해물, 바람직하게는 말토덱스트린을 포함할 수 있다. 이때, 이러한 범위의 하한치가 전분에 더욱 적용가능한 반면에, 말토덱스트린은 보다 큰 범위에 걸쳐 사용될 수 있다. 전분, 또는 전분 유도체 또는 가수분해물, 예컨대 말토덱스트린의 존재가 상기 제시된 검의 적용과 동일한 이유로, 바람직한 pH 범위 및/또는 카세인 미셀 농도와의 동일한 조합으로 바람직할 수 있다.
카세인 미셀은 임의의 적합한 공급원, 예컨대 농축유, 우유, 분유, 탈지 분유, 버터유, 버터유 분말, 유단백질 농축물, 유단백질 단리물 및/또는 이들의 혼합물로부터 유래할 수 있다.
열-보존된(바람직하게는 UHT-처리된) 제품은 무균적으로 포장되어야 하고, 이는 임의의 적합한 포장에 존재할 수 있고, 바람직하게는 이러한 포장은 테트라팩(Tetrapak), 도이(DOY) 팩(파우치), 병, 백 또는 캔이다.
본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 매우 짧은 시간 간격으로 혈장내의 트립토판/LNAA 비의 효과적인 증가를 제공하기에 매우 적합한 펩티드 형태로 존재하는 트립토판을 포함하는 조성물을 제공한다. 트립토판을 포함하는 다이- 및 트라이펩티드는 이러한 증가에 유리하게 공헌한다. 본 발명의 RTD 제형내의 트립토판-함유 펩티드 조성물에 대한 한 양태에서, 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임은 산업적인 방법에서 효소에 의해 (예비-)가수분해된다(즉, (달걀) 리소자임은 가수분해물의 형태로 바람직하게 제공된다). 가수분해물의 형태로 제공되는 경우, 트립토판-함유 펩티드의 위장관 흡수가 상당히 촉진된다. 다른 양태에서, 본원의 RTD 제형을 위한 트립토판-함유 펩티드 조성물의 경우, 달걀 리소자임은 양으로 하전된 아르기닌 및 리신 잔기를 포함하는 펩티드의 수준이 저하된 가수분해물로 전환된다. 후자의 가수분해물은 0.15 초과의 분자 트립토판/LNAA 비에 의해 특징지어 진다. 바람직한 트립토판-함유 펩티드 조성물을 포함하는 본원의 RTD 제형의 또 다른 양태에서, 달걀 리소자임은 존재하는 펩티드의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 더욱 바람직하게는 75% 초과가 500Da 미만의 분자량을 갖는 펩티드 집단을 포함하는 가수분해물로 전환된다. 이는 가수분해물에 존재하는 펩티드의 분자량 분포가 본원의 재료 및 방법 부분에 기술된 바와 같이 수행되는 것을 조건으로 한다. 바람직한 (0.15 이상의) 트립토판/LNAA 비에 관하여: 가수분해물의 아미노산 분석은 본원의 재료 및 방법 부분에 기술된 바와 같이 수행된다.
"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 30개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄로서 본원에 정의된다.
"펩티드" 또는 "올리고펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 아미노산의 쇄로서 본원에 정의된다. 용어 "펩티드" 및 "올리고펩티드"는 동의어로서 간주되고(통상적으로 인식되는 바와 같음), 각각의 용어는 내용상 필요하면 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"수용성" 펩티드는 pH 5.0의 물에 가용성인 펩티드이다.
본원의 모든 (올리고)펩티드 및 폴리펩티드 구조식 또는 서열은 일반적인 관행에 따라 아미노 말단에서 카복시 말단의 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기술된다. 본원에서 사용되는 아미노산의 1-문자 코드는 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에서 발견될 수 있다.
단백질 가수분해물, 가수분해물 또는 가수분해된 단백질은 단백질의 효소 가수분해에 의해 형성된 생성물을 의미하고, 풍부화된 가수분해물은, 예를 들어 선택된 펩티드가 풍부하거나, 펩티드 또는 폴리펩티드가 가수분해물에서 제거된 단백질 가수분해물의 분획이다. 따라서, 풍부화된 가수분해물은 바람직하게는 펩티드의 혼합물(또는 펩티드 혼합물)이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 혼합물은 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 트립토판-함유 펩티드의 혼합물이다. 더욱 바람직하게는, 혼합물은 존재하는 펩티드의 50% 초과, 더욱 바람직하게는 60% 초과, 가장 바람직하게는 75% 초과가 500Da 미만의 분자량을 갖는 펩티드 집단을 포함한다. 트립토판-함유 펩티드는 1개 이상의 L-트립토판 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 의미한다. 트립토판/LNAA 비는 다른 거대 중성 아미노산(LNAA, 즉, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신 및 발린의 합)의 수준에 대한 트립토판의 몰 비를 나타낸다. 혈장 트립토판/LNAA 비를 제외하고는, 트립토판/LNAA 비는 단지 펩티드-결합된 아미노산에만 관련된다. 따라서, 유리 트립토판, 티로신, 페닐알라닌, 류신, 이소류신 및 발린은 트립토판/LNAA 비에서 고려되지 않는다.
펩티드-결합된 아미노산은 펩티드의 일부인 아미노산으로서, 유리 아미노산이 아니다.
Tyr/BCAA 비는 분지쇄 아미노산(BCAA; 즉, 류신, 이소류신 및 발린의 합)의 수준에 대한 티로신의 몰 비를 나타낸다. 바람직한 Tyr/BCAA 비는 0.1 초과, 바람직하게는 0.12 초과이다.
본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 본원에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있고, 단백질 트립토판을 기준으로 30% 초과의 트립토판 수율을 갖고, 트립토판을 포함하는 수용성 펩티드 조성물을 생성시킨다. 트립토판 잔기의 보다 큰 부분이 다이- 및 트라이펩티드에 포함된다는 사실은 혈류로의 즉각적인 흡수를 의미한다. 본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 상기 트립토판-함유 펩티드 조성물은 또한 실제 가수분해물의 트립토판/LNAA 비보다 높은 혈장 트립토판/LNAA 비를 야기할 수 있다. 최종적으로, 본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 또한 매우 낮은 항원성에 의해 특징지어 진다.
본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물에서, 달걀 리소자임은 제제에 높은 트립토판/LNAA 비를 제공하기 위한 적절한 기질로서 바람직하게 사용된다. 리소자임은 달걀 흰자위에 3 내지 4%의 농도로 존재한다. 이의 예외적으로 높은 등전점을 이용함으로써, 리소자임은 간단한 양이온 크로마토그래피 정제 단계에 의해 달걀 흰자위로부터 산업적으로 단리된다. 생성된 생성물은 거의 순수하고, 이의 산업적으로 이용가능한 제품은 7.8%의 분자 트립토판 함량 및 0.15 이상의 분자 트립토판/LNAA 비를 가진다. 따라서, 순수한 리소자임은 순수한 알파-락트알부민 및/또는 베타-락토글로불린보다 상당히 높은 트립토판/LNAA 비를 가진다. 따라서, 본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물을 위한 리소자임 가수분해물(및 이에 따라 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물 자체)은 0.15 초과의 몰 트립토판/LNAA 비, 더욱 바람직하게는 0.20 초과의 트립토판/LNAA 비, 더욱 더 바람직하게는 0.23 초과의 트립토판/LNAA 비, 더욱 더 바람직하게는 0.25 초과의 트립토판/LNAA 비, 가장 바람직하게는 0.30 초과의 트립토판/LNAA 비를 가질 수 있다. 일반적으로, 몰 트립토판/LNAA 비는 3.0 미만이다. 이와 같이, 리소자임이 트립토판-함유 펩티드 또는 조성물을 위한 바람직한 출발점을 제공한다. 리소자임(EC3.2.1.17)은 박테리아 세포 벽에서 특정 펩티도글리칸 결합을 가수분해하여 세포 용해를 야기할 수 있는 효소이다.
본 발명에 따른 RTD 제형내의 트립토판-함유 펩티드 조성물에 바람직하게 사용되는 가수분해물은 또한, 예를 들어 낙농 제품에 의해 제공된 고 단백질-함유 식품 매트릭스에 혼입되는 경우에 효과적이다. 이는 단백질-함유 식품 매트릭스가 높은 LNAA 적재를 나타내고, 이에 따라 높은 트립토판/LNAA 비를 갖는 제품의 효과를 감소시키는 것으로 기대될 수 있으므로 매우 놀랍다. 이러한 예기치 않은 현상에 대한 가능한 설명은 통상적인 식품 제품이 광범위하게 가수분해된 단백질보다는 손상되지 않은 단백질을 혼입하는 것이다. 바람직한 트립토판-함유 펩티드 조성물의 다수의 트립토판 및 티로신을 혼입하는 펩티드는 500Da 미만의 분자량을 갖는다. 트립토판(MW = 186) 및 티로신(MW = 163)의 매우 높은 분자량, 및 단지 매우 낮은 수준의 유리 트립토판이 존재한다는 사실의 관점에서, 이러한 의미는 다수의 상기 펩티드가 트라이- 또는 다이펩티드일 것이라는 것이다.
바람직한 방법에서, 리소자임, 바람직하게는 달걀 리소자임은 산업적인 방법에서 효소에 의해 (예비-)가수분해된다(즉, (달걀) 리소자임은 가수분해물 또는 풍부화된 가수분해물의 형태로 바람직하게 제공된다). 이러한 (풍부화된) 가수분해물의 형태로 제공되는 경우, 트립토판-함유 펩티드의 창자 흡수는 상당히 촉진된다. 본원의 다른 양태에서, 달걀 리소자임은 존재하는 펩티드의 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 더욱 바람직하게는 75% 초과가 500Da 미만의 분자량을 갖는 트립토판-함유 펩티드 집단을 포함하는 가수분해물 또는 풍부화된 가수분해물로 전환된다. 바람직하게는, 이러한 (풍부화된) 가수분해물은 (건조 물질을 기준으로) 1중량% 초과의 유리 트립토판을 함유하지 않는다. 가수분해물에 존재하는 트립토판-함유 펩티드의 분자량 분석은 재료 및 방법 부분에 기술된 바와 같이 수행된다.
본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물의 경우, (달걀) 리소자임 가수분해물이 가수분해물의 분획의 트립토판 함량을 증가시키기 위하여 분별증류되는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 이러한 분획 또는 풍부화된 가수분해물은 바람직하게는 분별증류 전의 가수분해물에 비해 증가된 트립토판/LNAA 비를 갖는다. 부가적인 유리 트립토판에 의한 가수분해물 또는 풍부화된 가수분해물의 풍부화가 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 풍부화된 가수분해물을 제조하기 위한 바람직한 옵션에서, 리소자임이 특별히 많은 양의 염기성 아르기닌 및 리신 잔기를 혼입한다는 관찰이 사용된다. 놀랍게도, 선택된 효소 항온처리 조건의 결과로서, 즉 트립토판을 혼입하는 다이- 및 트라이펩티드의 많은 양을 생산하지만 아르기닌 또는 리신 잔기를 거의 생산하지 않는 항온처리 조건과의 조합으로 옳은 분열 선호도를 갖는 엔도프로테아제(예컨대, 서브틸리신)를 선택한 결과로서, 본 발명에 따른 풍부화된 리소자임 가수분해물이 제조될 수 있다. 따라서, 아르기닌 또는 리신 잔기를 혼입하는 LNAA-함유 펩티드가 이러한 염기성 잔기를 갖지 않는 트립토판-함유 펩티드로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 가수분해물의 pH를 4 내지 6, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 5.5의 값으로 조정함으로써, 이러한 염기성 잔기가 없는 펩티드가 전하를 갖지 않고, 이에 따라 감소된 친수성을 갖는다. 이러한 특징은, 예를 들어 큰 비율의 아르기닌 또는 리신을 함유하는 펩티드를 선택적으로(selectively) 제거하는 크로마토그래피 또는 다른 분리 공정에 사용될 수 있다. 따라서, 트립토판-함유 펩티드의 함량 및 임의적으로 이러한 풍부화된 가수분해물의 트립토판/LNAA 비는 극적으로 증가된다. 하전된 아르기닌 또는 리신을 혼입하는 펩티드는 공지된 기술, 예컨대 이온 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 전기투석에 의해 제거될 수 있다. 관련된 펩티드의 크로마토그래피 분리에서의 이러한 특징의 사용에 대한 실질적인 배경은 문헌[a.o. the Protein Purification Handbook, issued by Amersham Pharmacia Biotech, nowadays GE Healthcare Bio-Sciences, Diegem, Belgium]에서 찾을 수 있다. 높은 트립토판 함량을 높은 트립토판/LNAA 비와 조합하는 제제를 향한 더욱 더 진보한 정제 경로에서, 산 측기(side group)를 갖는 아미노산의 존재, 예컨대 리소자임내의 글루타메이트(Glu) 및 아스파르테이트(Asp) 잔기의 존재가 유리하게 사용된다. 이러한 접근법에서, 본 발명에 따른 리소자임 가수분해물의 pH는 먼저 3.0으로 조정되고, 이어서 양이온 수지상에서 크로마토그래피된다. 이러한 pH 값에서, Glu 또는 Asp를 혼입하는 펩티드가 컬럼을 통해 진행하고, 다른 펩티드가 결합한다. pH 5 완충액에 의한 후속 용리는 상기한 바와 같은 리신 또는 아르기닌 잔기가 없는 모든 결합된 펩티드를 탈리한다. 다수의 트립토판-함유 펩티드가 이러한 탈리된 분획에 존재한다. 이어서, 잔류하는 결합된 펩티드가 더욱 높은 pH 값을 갖는 완충액을 사용하는 용리에 의해 컬럼으로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 트립토판-함유 펩티드 조성물의 제조를 위하여, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피가 사용되지만, 다른 적합한 크로마토그래피 분리 방법, 예컨대 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피가 또한 이용가능하다. 생성된 수성 분획으로부터의 트립토판-풍부화된 펩티드의 회수는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 농축된 저장 안정성 제품을 수득하기 위하여, 회수는 바람직하게는 증발 및 (분무) 건조 단계를 포함한다. 또한, 유기 용매를 포함하는 나노여과 및 추출 공정, 및 이어지는 증발/침전 단계는 목적하는 정제를 위한 옵션을 제공한다. 유기 용매로부터의 트립토판-풍부화된 펩티드의 회수는 바람직하게는 용매의 증발에 의해 수행된다.
리소자임이 생리적인 조건하에, 즉 산성 pH에서 프로테아제로서 펩신, 트립신 및 키모트립신을 사용하는 단백질분해성 가수분해에 매우 저항성인 것으로 증명된 사실에도 불구하고, 본 발명의 RTD 제형에 바람직하게 사용되는 리소자임 가수분해물이 또한 이러한 덜 우호적인 산성 조건하에 수득될 수 있다. 그러나, 이러한 조건하에서, 비교적 엄격한 항온처리 조건, 예컨대 훨씬 높은 효소 농도, 보다 높은 온도 및 임의적인 추가의 엔도프로테아제가 요구된다. 서브틸리신과 함께 알칼리성 pH에서 리소자임을 항온처리함으로써 수득된 리소자임 가수분해물은 Ala-Trp(AW) 다이펩티드가 특히 풍부한 것으로 밝혀졌다.
재료 및 방법
재료
상표명 "프로텍스(Protex) 6L"의 서브틸리신은 제넨커(Genencor; 네덜란드 라이덴 소재)에서, 펩신은 시그마에서, 트립신/키모트립신(돼지 PEM)의 혼합물은 노보자임스(Novozymes; 덴마크 배그스바에르드 소재)에서 입수하였다. 리소자임은 디에스엠 푸드 스페셜티즈(DSM Food Specialties; 네덜란드 델프트 소재)에서 델보자임(Delvozyme) L(22% 건조 물질)로서 수득하였다.
SDS-PAGE
사용된 리소자임 제제의 순도를 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. SDS-PAGE 및 염색에 이용된 모든 재료를 인비트로겐(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 구입하였다. 제조자의 지시에 따른 SDS 완충액을 이용하여 샘플을 제조하고, 제조자의 지시에 따라 MES-SDS 완충 시스템을 이용하여 12% 비스-트리스 겔상에서 분리하였다. 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)(콜로이드성 쿠마시(Coomassie) G250)을 이용하여 염색하였다. 가수분해 전에, 리소자임은 겔상에서 약 14kDa의 분자량을 갖는 단일 밴드로 나타났다.
LC/MS/MS 분석
P4000 펌프(써모 일렉트론(Thermo Electron; 네덜란드 브레다 소재))에 커플링된 이온 트랩 질량 분광계(써모 일렉트론, 네덜란드 브레다 소재)를 이용한 HPLC를 이용하여 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 효소적 단백질 가수분해물중에서 트립토판-함유 펩티드(주로 다이- 및 트라이펩티드)의 존재를 측정하였다. 형성된 펩티드를 용리를 위한 밀리(Milli)Q 물(밀리포어(Millipore; 미국 매사추세츠주 베드포드 소재))중 0.1% 폼산(용액 A) 및 아세토나이트릴중 0.1% 폼산(용액 B)의 구배와 조합된 인에르트실(Inertsil) 3 ODS 3, 3㎛, 150x2.1mm 컬럼(배리언 벨지움(Varian Belgium; 벨기에 소재))을 이용하여 분리하였다. 100%의 용액 A에서 구배를 시작하여, 이를 10분 동안 유지시키고, 25분 동안 20% B로 선형 증가시키고, 직후에 출발 조건으로 돌아가고, 안정화를 위해 15분 동안 유지시켰다. 사용된 주입 부피는 50㎕이고, 유속은 분 당 200㎕이고, 컬럼 온도는 55℃에서 유지되었다. 주입된 샘플의 단백질 농도는 약 50㎍/㎖이었다. 해당 펩티드의 확인은 체류 시간, 양성자화된 분자에 근거하고, 약 30%의 최적 충돌 에너지를 이용한 해당 펩티드에 대한 전용 MS/MS를 이용하였다. 특정한 트립토판-함유 펩티드의 정량을 외부 표준 방법을 이용하여 수행하였다.
테트라펩티드인 VVPP(M=410.2)를 이용하여 MS 방식에서의 최적의 민감성에 대해, 그리고 MS/MS 방식에서의 최적 단편화를 위해 조정하고, 5㎍/㎖의 일정한 주입을 수행하여, MS 방식에서 양성자화된 분자를 수득하고, MS/MS 방식에서 약 30%의 최적 충돌 에너지를 이용하여 B- 및 Y-이온 시리즈를 생성하였다.
LC/MS/MS 전에, 효소적 단백질 가수분해물을 상온 및 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 밀리포어 물 여과 장치를 통해 여과된 탈염수(밀리Q 물)로 1:100으로 희석하였다.
가수분해도
다양한 양성자분해 혼합물과의 항온처리중에 수득된 가수분해도(DH)를 신속한 OPA 시험(문헌[Nielsen, P.M.; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66, 642-646])을 이용하여 모니터링하였다.
켈달 질소
총 켈달 질소를 유동 주입 분석에 의해 측정하였다. TKN 방법 카세트 5000-040이 장착된 테케이터 피아스타(Tecator FIASTAR) 5000 유동 주입 시스템, 소피아(SOFIA) 소프트웨어가 있는 펜티엄 4 컴퓨터 및 테케이터 5027 오토샘플러(Autosampler)를 이용하여, 단백질-함유 용액으로부터 방출된 암모니아를 590nm에서 정량하였다. 방법의 동적 범위에 상응하는 샘플 양(0.5 내지 20mg N/ℓ)을 95 내지 97% 황산과 함께 소화 튜브에 위치시키고 켈탭(Kjeltab)이 200℃에서 30분 및 이어서 360℃에서 90분의 소화 프로그램을 거치게 하였다. 피아스타 5000 시스템에 주입한 후, 질소 피크를 측정하고, 이로부터 측정된 단백질의 양을 추정할 수 있다.
가수분해물에 존재하는 펩티드 및 단백질의 분자량 분포
프로테아제-처리된 단백질 샘플의 펩티드 크기 분포를 고압 펌프, 10 내지 100㎕의 샘플을 주입할 수 있는 주입 장치 및 컬럼 용리액을 214nm에서 모니터링할 수 있는 자외선(UV) 검출기가 장착된 자동화된 HPLC 시스템상에서 분석하였다.
이 분석에 사용된 컬럼은 20mM 인산 나트륨/250mM 염화 나트륨 pH 7.0 완충액으로 평형화된 수퍼덱스 펩티드(Superdex Peptide) HR 10/300 GL(아머샴(Amersham))이었다. 샘플(전형적으로 50㎕)을 주입한 후, 0.5㎖/분의 유속에서 90분 동안 완충액을 이용하여 컬럼으로부터 다양한 성분을 용리하였다. 분자량 마커로서 사이토크롬 C(분자량: 13,500Da), 아프로티닌(분자량: 6,510Da) 및 테트라글리신(분자량: 246Da)의 혼합물을 이용하여 시스템을 보정하였다.
따라서, 본 발명에 따른 방법 및 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 0.1 이상, 바람직하게는 0.15 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 LNAA에 대한 트립토판의 (중량) 비를 갖는 펩티드 조성물을 포함하고, 바람직하게는 리소자임, 더욱 바람직하게는 달걀 리소자임을 가수분해하여 5 내지 45의 DH를 갖는 가수분해물을 제조하는 단계, 및 임의적으로 아르기닌 또는 리신을 함유하는 펩티드를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다. 이때, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 AW 또는 GNW, 바람직하게는 AW 및 GNW(이때, AW:GNW의 몰 비는 바람직하게는 1:2 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 5:1임)를 포함한다.
이에 관하여, 본 발명에 따른 방법 및 RTD 제형에서, 트립토판-함유 펩티드 조성물은 0.1 이상, 바람직하게는 0.15 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 LNAA에 대한 트립토판의 (중량) 비를 갖는 펩티드 조성물을 포함하고, 바람직하게는 리소자임, 더욱 바람직하게는 달걀 리소자임을 가수분해하여 5 내지 45의 DH를 갖는 가수분해물을 제조하는 단계, 및 임의적으로 아르기닌 또는 리신을 함유하는 펩티드를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고/되거나 바람직하게는 트립토판-함유 펩티드 조성물은 바람직하게는 AW 또는 GNW, 더욱 바람직하게는 AW 및 GNW(이때, AW:GNW의 몰 비는 바람직하게는 1:2 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 5:1임)를 포함하고, 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 증점 검을 0.01 내지 0.1중량%(바람직하게는 0.01 내지 0.08중량%, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.05중량%(전체 조성물을 기준으로))의 양으로 추가로 포함할 수 있고, 따라서, 우유 또는 낙농 제품과 유사한(즉, 예를 들어, 과일 쥬스 또는 소프트 드링크보다 우유 또는 낙농 제품에 더 유사한) 입맛 및/또는 구강내 감촉을 더욱 지지할 수 있다. 이에 관하여, 상기 농도로 카라기난을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 0.1 이상, 바람직하게는 0.15 이상, 더욱 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 LNAA에 대한 트립토판의 (중량) 비를 갖는 펩티드 조성물을 포함하고, 6.2 내지 7.5, 바람직하게 6.5 내지 7의 열-보존되는(바람직하게는 멸균되는) 혼합물 및/또는 RTD 제형의 pH, 및/또는 0.5 내지 3중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로), 바람직하게는 0.6 내지 2중량%의 카세인 미셀의 농도와 조합으로, 특히 6.5 내지 7의 pH, 및 0.5 내지 2중량%, 더욱 더 바람직하게는 0.6 내지 2중량%(건조 중량; 전체 액체 조성물을 기준으로)의 카세인 미셀의 농도와 조합으로, 리소자임을 가수분해하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 트립토판-함유 펩티드 조성물이 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 바람직하다. 상기 제시된 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 검(바람직하게는 카라기난)의 사용 또는 존재 외에 또는 대신에, 조성물은 0.5 내지 5중량%(바람직하게는 0.5 내지 3중량%, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 2중량%(전체 조성물을 기준으로))의 전분, 전분 유도체 또는 전분 가수분해물, 바람직하게는 말토덱스트린을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 이러한 범위의 하한치(0.5 내지 2중량%)가 전분에 더욱 적용가능한 반면에, 말토덱스트린은 보다 큰 범위(0.5 내지 5중량%)에 걸쳐 사용될 수 있다. 전분, 또는 전분 유도체 또는 가수분해물, 예컨대 말토덱스트린의 존재가 상기 제시된 검의 적용과 동일한 이유로 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 따른 RTD에서, 트립토판-함유 펩티드 제제가 다이- 및 트라이펩티드로부터 선택된 2개 이상의 상이한 펩티드를 포함하되, 다이- 및 트라이펩티드로부터 선택된 2개의 펩티드가 각각 다이- 및 트라이펩티드의 총량의 5몰% 이상의 양으로 존재하고, 총 트립토판의 30몰% 초과가 펩티드-결합된 트립토판으로서 존재하고, 바람직하게는 40몰% 초과, 더욱 바람직하게는 50몰% 초과, 더욱 더 바람직하게는 60몰% 초과, 더욱 더 바람직하게는 70몰% 초과, 가장 바람직하게는 80몰% 초과의 펩티드-결합된 트립토판이 다이- 또는 트라이펩티드의 형태로 존재하고, 바람직하게는 조성물이 0.15 초과, 바람직하게는 0.15 내지 1.8의 트립토판/LNAA 비를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법 및 RTD 제형에서, 바람직하게는 상기 트립토판-함유 펩티드 제형은 바람직하게는 리소자임, 더욱 바람직하게는 달걀 리소자임을 가수분해하여 5 내지 45의 DH를 갖는 가수분해물을 제조하는 단계, 및 임의적으로 아르기닌 또는 리신을 함유하는 펩티드의 부분을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되고/되거나, 바람직하게는 상기 트립토판-함유 펩티드 조성물은 AW 또는 GNW, 더욱 바람직하게는 AW 및 GNW(이때, AW:GNW의 몰 비는 바람직하게는 1:2 내지 10:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 5:1임)를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 RTD 제형을 포함하는 식품, 애완동물용 먹이, 사료, 식이 보충제 또는 기능식품 조성물, 및/또는 장용 조성물에 관한 것이다.
하기 실시예가 본 발명을 추가로 예시한다.
실시예
실시예 1
프로텍스를 이용한 리소자임 가수분해 및 형성된 펩티드의 확인
10%(w/w)의 순수한 리소자임을 함유하는 용액을 NaOH를 이용하여 pH 8.2로 조정하고, 52℃까지 가열하였다. 존재하는 단백질 1g 당 25㎕의 프로텍스를 첨가함으로써 가수분해를 시작하였다. 연속적으로 교반하고, pH를 8.2로 유지하면서, 5.5시간 동안 계속 가수분해하여 보이는 침전물이 없는 거의 투명한 용액을 수득하였다. 프로텍스 활성을 불활성화시키기 위한 가열 단계 후에, DH 분석을 위해 샘플을 취하였다. 용액의 DH는 약 30%로 밝혀졌다. 열-처리된 용액을 10kDa 필터상에서 한외여과하여 완전히 투명한 용액을 수득하였다. 이러한 투명한 용액을 LC/MS 분석, 존재하는 펩티드와 단백질의 분자량 분포, 및 이온 교환 크로마토그래피에 이용하였다.
존재하는 펩티드와 단백질의 분자량 분포에 대한 결과를 얻기 위해서, 투명한 용액이 재료 및 방법 부분에 기술된 분자량 크기 분석을 거치게 하였다. 수득된 결과는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(즉, 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌)이 혼입된 거의 모든 펩티드가 500kDa 미만의 분자량을 가짐을 명확하게 나타냈다. 이러한 아미노산의 고 분자량을 고려하면, 결과는 이러한 작은 펩티드가 대부분 트라이펩티드 또는 다이펩티드임을 의미한다.
재료 및 방법 부분에 기술된 과정에 따라 LC/MS 분석을 수행하였다. 트립토판("W")을 함유하는 펩티드를 선택함으로써, 펩티드 AW, GNW, WIR, NAW, WVA, VAW, AWR, SLGNW 및 소량의 WW 및 SRWW가 검출될 수 있다. 항온처리 후의 가수분해물중 유리 트립토판의 수준은 존재하는 전체 (리소자임) 트립토판의 1% 미만을 나타내는 것이 입증되었다.
다이- 및 트라이펩티드가 창자 벽에 존재하는 펩티드 전달자에 의해 쉽게 흡수되기 때문에, 이러한 펩티드에 존재하는 트립토판 잔기가 신속하게 흡수되고, 본 발명의 리소자임 가수분해물의 경구 흡수 시 증가된 혈장 트립토판 수준을 야기할 것이라는 것은 의심할 여지가 없다.
실시예 2
가수분해물의 트립토판 함량 증가
리소자임에는 매우 많은 양의 염기성 아르기닌 및 리신 잔기가 혼입되어 있다. 또한, 리소자임 분자에는 상당한 수의 산성 글루타메이트 및 아스파테이트 잔기가 혼입되어 있다. 이러한 데이터를 이용하여 높은 트립토판/LNAA 비를 특징으로 하는 가수분해물에 대한 혁신적이고 우아한 정제 경로를 고안하여 왔다. 그러나, 이러한 정제 경로에 대한 본질적인 요건은 아르기닌 또는 리신 잔기나 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기를 또한 함유하는 펩티드에 단지 매우 소수의 트립토판 잔기가 나타난다는 것이다. 실시예 1에 제시된 바와 같이, 여기에 이용되는 특정한 가수분해 경로는 아르기닌 잔기를 함유하는 트립토판-함유 펩티드를 매우 적게 생성하고, 리신, 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기를 함유하는 펩티드를 생성하지 않는다.
이론은 글루타메이트 또는 아스파테이트 잔기가 있는 펩티드와 없는 펩티드 사이의 최대 전하 차이가 약 pH 3에서 달성될 수 있다고 예측한다. 아르기닌 또는 리신 잔기가 있는 펩티드와 없는 펩티드 사이의 최대 전하 차이는 약 pH 5에서 달성될 수 있다.
이 접근법의 선별력을 예증하기 위해, 리소자임 가수분해물을 실시예 1에 특정된 과정에 따라 제조하였다. 이어서, 상기 가수분해물의 pH를 아세트산을 이용하여 pH 3.1로 조정하였고, 약 0.5g의 단백질을 20mM 나트륨 시트레이트 pH 3.1로 평형화된 15㎖ 베드 부피의 SP 세파로스 FF(지이 헬스케어(GE Healthcare; 벨기에 디에겜 소재))에 적용하였다. 컬럼을 1 컬럼 부피의 나트륨 시트레이트 완충액으로 세척하여, 글루타메이트 또는 아스파테이트가 혼입되어 있는 펩티드 대부분을 제거한 후, 용리 완충액을 20mM 나트륨 시트레이트 완충액 pH 5.1로 변화시켰다. 컬럼을 3 컬럼 부피의 후자의 완충액으로 세척하는 동안, 일정 범위의 트립토판-함유 펩티드가 용리되었다. LC/MS 분석에 따르면, 다이펩티드 AW, 및 트라이펩티드 GNW, NAW, WVA, VAW가 다량으로 존재하고, 소량의 펜타펩티드 SLGNW가 존재한다. 다양한 pH 5.1 분획의 아미노산 분석은 선택적인 통합(pooling)이 1.75의 분자 트립토판/LNAA 비 및 약 30%의 트립토판 수율을 갖는 용액을 생성하였음을 보여주었다. 덜 선택적인 통합은 0.4의 분자 Trp/LNAA 비 및 70%의 트립토판 수율을 갖는 용액을 생성하였다. 후속적으로, 컬럼을 3 컬럼 부피의 20mM 나트륨 시트레이트 pH 7.1로 세척하였다. LC/MS 데이터에 따르면, 이러한 단계는 아르기닌-함유 펩티드인 WIR, AWIR 및 놀랍게도 펩티드 WW를 용리하였다. 컬럼을 1M의 NaOH, 물 및 1M의 아세트산으로 최종 세척함으로써, 후속 단계를 위해 컬럼을 준비시켰다.
실시예 3
대규모 리소자임 가수분해
대규모 리소자임 가수분해 과정에서, 본질적으로 실시예 1에 개시된 과정을 일부 사소하게 변화시켜 수행하였다. 7.3%(w/w) 순수한 리소자임을 함유한 용액을 65℃로 가열시킨 후, NaOH를 이용하여 pH를 8.2로 조정하였다. 건조 물질 1g 당 25㎕의 프로텍스 6L을 첨가함으로써 가수분해를 시작하였다. 연속적으로 교반하고, pH 8.2 및 온도 53℃를 유지하면서, 2시간 동안 계속 가수분해하였다. 이어서, pH 값을 9.0으로 증가시키고, 추가로 3.5시간 동안 항온처리하여 일부 침전물이 있는 용액을 수득하였다. 이어서, 용액의 pH를 4.5로 낮추고, 용액을 4℃ 미만으로 냉각시켰다. 완전히 투명한 생성물을 수득하기 위해서, 액체를 Z 2000 필터(폴(Pall))상에서 여과한 후, 과량의 물과 염을 나노여과를 통해 제거하였다. 이어서, 생성된 농축액을 120℃에서 7초 동안 UHT 처리하고, 증발시키고, 최종적으로 분무 건조하여 건조 형태의 리소자임 가수분해물을 수득하였다. 이렇게 수득된 생성물은 약 0.19의 몰 트립토판/LNAA 비를 가졌다.
실시예 4
트립토판을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드 조성물을 실시예 3에 설명된 바와 같이 제조하였다. 수득된 제품은 약 83%의 펩티드 수준, 약 5.5%의 펩티드-결합된 트립토판 함량, 및 약 0.19의 TRP/LNAA 비를 갖는 수성 액체이었다. 상기 제품은 연황색 분말의 외관을 가졌고, 물중에 1% 용해 시 약 4.3의 pH를 갖는 용액을 제공하였다.
상기 펩티드 제제를 사용하여, 하기 표 1의 조성(수성 기제내의 성분의 중량%(건조 중량). 나머지는 물임)을 갖는 음료를 제조하고, 이때 표는 나트륨 하이드록사이드 및 시트르산을 사용하여 설정된 조성물의 pH를 또한 제공한다. 이러한 조성물의 제조 방법은 다음과 같았다:
- 물중 모든 성분의 프리-믹스를 제조하는 단계(물 외의 모든 성분은 미립자 물질이었다);
- 이를 10분 동안 교반하고, 필요에 따라 교반의 끝무렵에 pH를 조정하는 단계;
- UHT 공정을 거치게 하는 단계;
- 고압 균질화기에 의해 균질화하는 단계; 및
- 무균 충전하는 단계.
또한, 트립토판-함유 펩티드 제제의 존재의 영향을 확인하기 위하여 트립토판-함유 펩티드 제제를 전혀 함유하지 않는 2개의 제제(대조군 A 및 B)를 제조하였다. 또한, 청구된 범위 외의 pH를 갖는 제제(대조군 C)를 제조하였다.
| 대조군 A | 대조군 B | 실시예 4a | 실시예 4b | 실시예 4c | 대조군 C | |
| 트립토판을 함유하는 펩티드 제제(중량%) | 0 | 0 | 1.14 | 1.14 | 1.14 | 1.14 |
| 탈지 분유(%) | 2.1 | 2.1 | 4.2 | 2.1 | 2.1 | 10 |
| 카라기난(중량%) | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 말토덱스트린 (중량%) |
2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 수크로스(중량%) | 6.6 | 6.6 | 6.6 | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| pH | 6.0 | 7.0 | 7.0 | 6.5 | 7 | 7 |
| SMP로부터의 카세인 미셀 함량(중량%) | 0.84 | 0.84 | 1.68 | 0.84 | 0.84 | 4 |
이러한 모든 조성물은 약 8 내지 8.5초 동안 143℃(±1℃)까지 가열하는 인-라인 초고온(UHT) 멸균을 거치고, 이는 6 내지 8의 F0 값을 위해 충분하다.
UHT 처리 직후에, 생성물을 350㎖ 부피의 투명한 병에 충전하고(약 250㎖의 액체), 24시간 후에, 침전물이 형성됐는지, 그리고 형성되었다면 어느 정도인지 확인하였다(cm 단위로 측정되고, 병내의 음료의 높이에 대한 백분율로 계산되었음).
| 대조군 A | 대조군 B | 실시예 4a | 실시예 4b | 실시예 4c | 대조군 C | |
| 형성된 침전물(cm) | 0 | 0 | 0.8 | 0.5 | 0 | 3.5 |
| 침전율(높이%) | 0 | 0 | 10% | 5% | 0 | 30% |
실시예 5
트립토판을 갖는 펩티드를 포함하는 펩티드 조성물을 UHT 처리를 125℃(±1℃)의 보다 낮은 온도에서 수행한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의해 제조하는 실시예 4에 제시된 바와 같이 제조하였다.
| 실시예 5a | 실시예 5b | 실시예 5c | 실시예 5d | |
| 트립토판을 함유하는 펩티드 제제(중량%) | 1.14 | 1.14 | 1.14 | 1.14 |
| 탈지 분유(%) | 4.2 | 2.1 | 2.1 | 10 |
| 카라기난(중량%) | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 말토덱스트린(중량%) | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
| 수크로스(중량%) | 6.6 | 6.6 | 6.6 | 6.6 |
| pH | 7.0 | 6.5 | 7 | 7.0 |
| SMP로부터의 카세인 미셀 함량(중량%) | 1.68 | 0.84 | 0.84 |
침전을 실시예 4와 동일한 방식으로 확인하였다. 결과를 하기 표 4에 제시한다.
| 실시예 5a | 실시예 5b | 실시예 5c | 실시예 5d | |
| 형성된 침전물(cm) | 0 | 0 | ||
| 침전율(높이%) | 0% | 1.1% | 0% | 9.1% |
Claims (27)
- 전체 액체 조성물을 기준으로 0.5 내지 2중량%(건조 중량)의 카세인 미셀, 및 전체 액체 조성물을 기준으로 0.1 내지 5중량%(건조 중량)의 트립토판-함유 펩티드 조성물(트립토판-함유 펩티드를 기준으로 1 내지 10중량%의 트립토판의 수준을 가짐)을 포함하는 포장된 수성 액체 조성물의 제조 방법으로서,
(a) 전체 혼합물을 기준으로 0.5 내지 2중량%(건조 중량)의 카세인 미셀, 전체 혼합물을 기준으로 0.1 내지 5중량%(건조 중량)의 트립토판-함유 펩티드 조성물(트립토판-함유 펩티드를 기준으로 1 내지 10중량%의 트립토판의 수준을 가짐), 및 나머지의 물을 포함하는 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 상기 혼합물을 80 내지 150℃의 온도에서 열-보존 처리하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 수득된 액체 생성물을 무균 포장에 의해 포장하는 단계를 포함하되,
상기 단계 (b)에 따라 열-보존 처리되는 단계 (a)의 혼합물이 8.1 미만의 pH를 갖고, 상기 pH가 하기 수학식 I의 관계를 갖는 제조 방법:
수학식 I
pH > 0.02 x T (℃) + 0.23 x (카세인 미셀의 중량%(건조 중량)) + 3.8
상기 식에서,
카세인 미셀은 전체 혼합물을 기준으로 중량%로서 나타낸다. - 제 1 항에 있어서,
단계 (b)에 따른 열-보존 처리 전에, 열-보존 처리되는 단계 (a)의 혼합물의 pH를 하기 수학식 I의 관계를 갖는 pH로 조정하는 제조 방법:
수학식 I
pH > 0.02 x T (℃) + 0.23 x (카세인 미셀의 중량%(건조 중량)) + 3.8 - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 (b)에 따른 열-보존 처리 전에, 알칼리제 또는 완충제를 단계 (a)의 혼합물 또는 그의 하나 이상의 성분에 첨가하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 (b)에 따라 열-보존 처리되는 단계 (a)의 혼합물이 6.2 내지 7.5의 pH를 갖는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
단계 (b)에 따른 열-보존 처리가 열에 의한 저온살균, 열에 의한 멸균, 또는 초고온(UHT) 멸균 처리를 포함하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
액체 조성물이 전체 액체 조성물을 기준으로 0.6 내지 2중량%의 카세인 미셀을 포함하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
카세인 미셀이 유제품 단백질, 농축유, 우유, 분유, 탈지 분유, 버터유, 버터유 분말, 유단백질 농축물 및/또는 이들의 혼합물의 형태인 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
액체 조성물이 테트라팩, 파우치, 병, 백 또는 캔으로 포장되는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
액체 조성물이 카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 증점 검을 0.01 내지 0.1중량%의 양으로 추가로 포함하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
액체 조성물이 전분, 전분 유도체 또는 전분 가수분해물을 0.5 내지 5중량%의 양으로 추가로 포함하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 0.1 내지 1.8의 거대 중성 아미노산(LNAA)에 대한 트립토판의 (중량) 비를 갖는 펩티드 조성물을 포함하는 제조 방법. - 제 11 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 리소자임을 가수분해하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 제조 방법. - 제 12 항에 있어서,
리소자임이 5 내지 45의 가수분해도(DH)로 가수분해되는 제조 방법. - 제 12 항에 있어서,
가수분해 후에, 아르기닌 또는 리신을 함유하는 펩티드를 제거하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 2개 이상의 상이한 다이- 또는 트라이펩티드를 포함하되, 다이- 및 트라이펩티드로부터 선택된 2개의 펩티드가 다이- 및 트라이펩티드의 총량의 5몰% 이상의 양으로 존재하고, 트립토판-함유 펩티드 조성물에서, 30몰% 초과의 펩티드-결합된 트립토판이 다이- 또는 트라이펩티드의 형태로 존재하는 제조 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
액체 조성물이 아미노산 서열 알라닌-트립토판(AW) 또는 글리신-아스파라긴-트립토판(GNW)을 함유하는 펩티드를 포함하는 제조 방법. - 전체 액체 조성물을 기준으로 0.5 내지 2중량%(건조 중량)의 카세인 미셀;
전체 액체 조성물을 기준으로 0.1 내지 5중량%(건조 중량)의 트립토판-함유 펩티드 조성물(트립토판-함유 펩티드를 기준으로 1 내지 10중량%의 트립토판의 수준을 가짐); 및
나머지의 물을 포함하되,
6 내지 8.1의 pH를 갖는 열-저온살균되거나 열-멸균된, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항에 있어서,
카세인 미셀의 양이 전체 액체 조성물을 기준으로 0.6 내지 2중량%(건조 중량)인, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
카세인 미셀이 농축유, 우유, 분유, 탈지 분유, 버터유, 버터유 분말, 유단백질 농축물, 유단백질 단리물 및/또는 이들의 혼합물의 형태인, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
카라기난, 로커스트 빈 검, 구아 검, 타라 검 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 증점 검을 0.01 내지 0.1중량%의 양으로 추가로 포함하는, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
전분, 전분 유도체 또는 전분 가수분해물을 0.5 내지 5중량%의 양으로 추가로 포함하는, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 0.1 내지 1.8의 LNAA에 대한 트립토판의 중량 비를 갖는 펩티드 조성물을 포함하는, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드가 리소자임의 가수분해에 의해 수득되는, 포장된 액체 조성물. - 제 23 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드가 5 내지 45의 DH를 갖는, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 2개 이상의 상이한 다이- 또는 트라이펩티드를 포함하되, 다이- 및 트라이펩티드로부터 선택된 2개의 펩티드가 다이- 및 트라이펩티드의 총량의 5몰% 이상의 양으로 존재하고, 트립토판-함유 펩티드 조성물에서, 30몰% 초과의 펩티드-결합된 트립토판이 다이- 또는 트라이펩티드의 형태로 존재하는, 포장된 액체 조성물. - 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
트립토판-함유 펩티드 조성물이 아미노산 서열 AW 또는 GNW를 함유하는 펩티드 조성물을 포함하는, 포장된 액체 조성물. - 제 26 항에 있어서,
AW:GNW의 몰 비가 1:2 내지 10:1인, 포장된 액체 조성물.
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