KR101854540B1 - 지속성이 우수한 안면성형용 plla 필러의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체 적합성이 우수하고, 인체에 무해한 락틱산으로 가수분해 되는 특징으로 인하여 다양한 형태 PLLA(poly-L-lactic acid)를 사용하여 지속성이 우수하며, 주사기를 이용하여 주입이 가능한 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체 적합성이 우수하고, 인체에 무해한 락틱산으로 가수분해 되는 특징으로 인하여 다양한 형태 PLLA(poly-L-lactic acid)를 사용하여 지속성이 우수하며, 주사기를 이용하여 주입이 가능한 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고령인구의 증가, 외모 중시 풍토 심화 및 소득 증대로 인해 미용 목적의 얼굴 성형 및 피부 재건술에 대한 사회적 관심이 집중되고 있다. 과거에는 이러한 성형/재건술이 외과적 성형 수술로 다루어졌으나, 성형 수술의 경우 회복 시간이 길고, 수술한 부위의 통증이 심하며, 비싼 가격 등 환자에게 큰 부담일 뿐만 아니라, 결과 또한 항상 긍정적이지 않았다. 외과적 성형 수술 후 피부는 수축될 수 있지만 위축되거나 줄어든 입체감은 회복될 수 없기 때문에 예전의 얼굴 윤곽을 다시 살리기에는 한계가 있다고 알려져있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 최근 주사주입이 가능한 안면성형용 필러가 개발되어 사용되고 있다. 안면성형용 필러는 얼굴의 입체감을 주며, 얼굴의 윤곽을 다시 살려줄 뿐 만 아니라 특별한 회복기간이 필요 없고, 통증이 적으며, 성형수술에 비해 저렴한 가격으로 큰 효과를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있다. 따라서 부피 유지 및 조직 재생을 위한 안면성형용 필러에 대한 연구가 급증하고 있으며, 다른 외과적 수술에 비하여 조직의 파괴가 덜하고, 비 침습적인 장점을 갖기 때문에 오랜 기간 동안 폭 넓게 사용되고 있다. 이상적인 안면성형용 필러는 최소한의 절개, 이식부위에 쉽게 주입될 수 있어야 하고, 전신적 혹은 국소적인 염증 반응이나 이물반응이 없어야 하며, 주입된 부위에서 오랜 시간 동안 부피효과가 유지되어야 한다고 알려져 있다 .
이러한 필러 중에는 대표적으로 가장 많이 사용되는 것은 히알루론산 필러이다. 히알루론산은 체내 관절액·연골·피부 등 인체에 존재하는 성분으로 히알루론산 필러는 시술된 피부 주위의 물 분자를 끌어당겨 볼륨과 수분을 채워 주는 방식이며, 피부에 볼륨을 줄 뿐 아니라 피부 보습에도 도움을 주어 주로 이마와 코, 눈밑, 애교살, 무턱, 입술 등에 사용된다.
하지만, 히알루론산 필러는 수명이 3~12개월로 짧아 시간이 지나면 효과가 떨어져 주기적으로 시술을 받아야 하는 단점이 있었다.
또한, 미세입자를 포함하는 주사방식은 다양한 여러방법들이 시도되고 있는데, 높은 점도를 이용한 주사 주입 방법은 조작이 어렵고 미세입자와 고분자 용액의 균일한 혼합이 어려워 주입 시 입자의 손상을 가져올 수 있고 이에 반해 낮은 점도를 이용한 주사 주입 방법은 주사 주입은 용이하나 주사기 바늘이 미세입자에 의해 막혀 미세입자의 일부 또는 용액만 분리되어 주입될 뿐만 아니라 미세입자가 일그러지는 문제점이 있어 효과적으로 살리지 못하고 있는 실정이다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 종래기술로 한국공개특허 10-2010-0067909호 "주사 주입이 용이한 미세입자 필러 시스템"이 제시되었다.
종래기술은 저온에서 졸상으로 미세입자와 고분자 용액이 균일하게 혼합되어 체내에 균일하게 주입되고 안전하게 유지할 수 있다.
하지만, 효과가 발생하는 기간이 길며, 필러를 주입 후 3~12개월로 유지 기간이 짧아 효과적으로 시술을 받기 위해서는 짧은 기간에 여러번 시술해야 하는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은, 진피층 내로 주입돼 구형의 다공성 PLLA 입자 표면과 입자 사이로 세포의 유입 및 성장을 유도해 콜라겐 형성을 통한 볼륨감을 유지하는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 주름에 주입한 이후 3개월이나 6개월이 지났을 때 자기 콜라겐을 스스로 합성하도록 촉진해 최초 주입 후 2년 이상 효과가 지속되어 장기간 유지할 수 있으며, 자체적으로 피부재생과 탄력을 개선하여 자연스러운 아름다움을 표현하는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 연골세포의 콜라겐이 혼합되어 피부재생과 탄력에 효율적이며, 주사주입이 가능한 30-150 ㎛ 크기의 입자를 가지고 있어 시술이 용이한 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid)를 마이크로 입자로 만드는 생성단계; 상기 생성단계를 통해 마이크로 입자로 생성된 PLLA에 연골세포의 콜라겐을 첨가/혼합하는 혼합단계; 상기 혼합단계에서 생성된 연골세포가 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러의 주사주입이 가능한 적합성을 분석하는 분석단계; 상기 분석단계를 통해 주사주입에 적합한 마이크로 입자인 연골세포가 혼합된 PLLA를 현탁액으로 변환한 후 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조하는 제조단계(S40);로 이루어지되, 상기 분석단계(D30)를 통해 주사주입에 적합하다고 분석된 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러를 현탁액으로 변환한 후 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조하는 제조단계(S40);로 이루어지되, 상기 혼합단계는, 마이크로 입자로 이루어진 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 연골세포 콜라겐 0.1g 내지 0.5g을 혼합한 후 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조하는 단계; 제조된 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA가 혼합된 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 제조하는 단계; 상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시키는 단계; 상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA 마이크로 입자를 제조하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법.
상기 생성단계는, 생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조하는 단계; 제조된 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA가 혼합된 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 제조하는 단계; 상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시키는 단계; 상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 PLLA 마이크로 입자를 제조하는 단계;로 이루어지는 것이 바람직하다.
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상기 분석단계는, 연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA 마이크로 입자에서 주사주입이 가능한 30~150㎛ 크기와 구형입자를 가지도록 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 제조단계는, 연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA 입자에 3wt% CMC(carboxylic methyl cellulose)용액과 혼합하여 현탁액을 만든 후 주사기에 주입하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 따르면, 진피층 내로 주입돼 구형의 다공성 PLLA 입자 표면과 입자 사이로 세포의 유입 및 성장을 유도해 콜라겐 형성을 통한 볼륨감을 유지하는 효과가 있다.
본 발명에 따르면, 주름에 주입한 이후 3개월이나 6개월이 지났을 때 자기 콜라겐을 스스로 합성하도록 촉진해 최초 주입 후 2년 이상 효과가 지속되어 장기간 유지할 수 있으며, 자체적으로 피부재생과 탄력을 개선하여 자연스러운 아름다움을 표현해내는 장점이 있다.
본 발명에 따르면, 연골세포의 콜라겐이 혼합되어 피부재생과 탄력에 효율적이며, 주사주입이 가능한 30-150 ㎛ 크기의 입자를 가지고 있어 시술이 용이한 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법을 도시한 순서도,
도 2는 본 발명에 따른 PLLA입자의 제조방법을 도시한 순서도,
도 3은 본 발명에 따른 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러의 제조방법을 도시한 순서도,
도 4는 본 발명에 따른 마이크로 입자 PLLA 필러의 제조 공정도,
도 5는 본 발명에 따른 PLLA를 chloroform 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 6은 본 발명에 따른 PLLA를 DCM 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진
도 7은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 15분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 8은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 30분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 9는 본 발명에 따른 혼합 비율의 변경에 의한 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 10은 본 발명에 따른 진피세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경 사진
도 11은 본 발명에 따른 연골세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경 사진,
도 12는 본 발명에 따른 진피세포가 담지된 PLLA 마이크로 입자의 FT-IR 스펙트럼,
도 13은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 14는 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 15는 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 16은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진.
도 17은 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진.
도 18은 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 PLLA입자의 제조방법을 도시한 순서도,
도 3은 본 발명에 따른 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러의 제조방법을 도시한 순서도,
도 4는 본 발명에 따른 마이크로 입자 PLLA 필러의 제조 공정도,
도 5는 본 발명에 따른 PLLA를 chloroform 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 6은 본 발명에 따른 PLLA를 DCM 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진
도 7은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 15분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 8은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 30분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 9는 본 발명에 따른 혼합 비율의 변경에 의한 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 10은 본 발명에 따른 진피세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경 사진
도 11은 본 발명에 따른 연골세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경 사진,
도 12는 본 발명에 따른 진피세포가 담지된 PLLA 마이크로 입자의 FT-IR 스펙트럼,
도 13은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 14는 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 15는 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진,
도 16은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진.
도 17은 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진.
도 18은 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진이다.
이하에서는 본 발명에 따른 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관하여 첨부된 도면과 함께 더불어 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명에 따른 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법을 도시한 순서도이며, 도 2는 본 발명에 따른 PLLA입자의 제조방법을 도시한 순서도이고,
도 3은 본 발명에 따른 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자로 이루어진 PLLA입자의 제조방법을 도시한 순서도이다.
도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이 본 발명은 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체 적합성이 우수하고, 인체에 무해한 락틱산으로 가수분해 되는 특징으로 인하여 다양한 형태 PLLA(poly-L-lactic acid)를 사용하여 지속성이 우수하며, 주사기를 이용하여 주입이 가능한 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법에 관한 것이다.
이러한 주사 주입이 가능하고 지속성이 우수한 PLLA 필러를 제조하기 위해서는 생성단계(S10), 혼합단계(S20), 분석단계(S30) 및 제조단계(S40)로 이루어진다.
상기 생성단계(S10)는 생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid)를 마이크로 입자로 만든다.
따라서, 상기 생성단계(S10)는 다음과 같이 이루어진다.
생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조한다.(S11)
이렇게 제조한 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA를 혼합하여 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 상태를 유지한다.(S12)
그리고 상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여
를 증발시킨다.(S13)
를 증발시킨다.(S13)
마지막으로 상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 마이크로 입자로 이루어진 PLLA를 제조한다.(S14)
이를 통해 마이크로 입자 PLLA가 주사 주입가능한 입자크기를 가질 수 있도록 이루어진다.
상기 혼합단계(S20)는 상기 생성단계(S10)를 통해 마이크로 입자로 생성된 PLLA에 연골세포의 콜라겐를 첨가 및 혼합한다.
이러한 상기 혼합단계(S20)는 다음과 같이 이루어진다.
먼저, 상기 생성단계(S10)에서 제조된 마이크로 입자로 이루어진 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 연골세포 콜라겐 0.1g 내지 0.5g을 혼합한 후 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조한다.(S21)
이렇게 제조된 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA가 혼합된 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 상태를 유지한다.(S22)
그리고 상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시킨다.(S23)
마지막으로 상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA를 제조한다.(S24)
따라서, 상기 마이크로 입자 PLLA는 생성단계(S10)와 혼합단계(S20)가 유사하게 진행되며, 상기 생성단계(S10)를 통해 주사주입이 적합한 상태의 마이크로 입자 PLLA를 제조하고, 이 후 연골세포의 콜라겐을 혼합하여 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA를 제조하여, 각각의 상태에서 주사주입이 가능한지를 분석할 수 있도록 하였다.
상기 분석단계(S30)는 상기 혼합단계(S20)에서 생성된 연골세포가 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 주사주입이 가능한 적합성을 분석한다.
따라서 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA에서 주사주입이 가능한 30~150㎛ 크기와 구형입자를 가지는지 확인한다.
이를 통해 주사주입이 가능하며, 콜라겐의 지속성을 향상시킬 수 있는 입자형태의 구조를 분석하여 확인할 수 있다.
상기 제조단계(S40)는 상기 분석단계(S30)를 통해 주사주입에 적합한 연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA를 현탁액으로 변환한 후 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조한다.
여기서 연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA에 3wt% CMC(carboxylic methyl cellulose)용액과 혼합하여 현탁액을 만들어 주사기에 주입한다.
이때, 3wt% CMC 용액의 점도가 높으므로 3 wt% CMC 용액 3g과 3 wt% PVA 용액 3g 및 PLLA 마이크로 입자 1g을 혼합하여 10분 동안 교반하는 것이 바람직하다.
<실험 조건>
1. 실험물질
안면성형용 필러 제조를 위한 생분해성 고분자는 poly-L-lactide(PLLA, EVONIK Ind.)를 사용하였으며 solvent evaporation(용매 증발법)에 적합한 PLLA의 용매로는 유기용매인 dichloromethane (DCM, Samchen Chem., 99.8%)과 chloroform(Samchen Chem., 99.8%)을 사용하였고, 안정화제로는 PVA(poly vinyl alcohol)을 사용하였다.
그 밖에 PLLA 필러의 콜라겐 생성을 촉진시키기 위하여 유전자를 사멸 처리한 돼지의 연골세포 콜라겐과 진피세포 콜라겐이 사용되었다.
2) 용매증발법
30-200㎛ 크기의 연골세포 또는 진피세포가 함유된 Matrix type의 마이크로 입자를 제조하고자 하였다.
따라서 PLLA 필러는 용매증발법(solvent-evaporation법)에 의해 제조되었으며, 고분자인 PLLA를 유기 용매(methylene chloride)에 용해시킨 oil상과 안정화제를 함유한 water상을 혼합한 후 homogenizer를 이용한 교반에 의해 oil상은 연속상인 water상에 droplet의 형태로 평형을 이루고, 안정화제는 새로 생성된 계면의 droplet에 흡착한다.
그 후 충분한 양의 물을 첨가하면 열역학적 불안정에 의해 유기 용매가 수상으로 확산되면서 마이크로 입자를 생성한다.
아울러 유기 용매가 자발적으로 물에 유화하지 않기 때문에 nanoprecipitaion법과는 달리 교반이 필수적이다.
3) 분석방법
가. FT-IR 분석
PLLA 마이크로 입자의 화학적 변화 차이를 보기 위하여 FT-IR（Cary 630 FT-IR, Agilent Technology)분석기를 사용하였다.
나. HR FE-SEM
PLLA 마이크로 입자의 형상, 크기를 보기 위하여 HR FE-SEM (High resolution field emission scanning microscope, TESCAN)을 사용하였다.
다. 광학현미경 분석
PLLA 마이크로 입자의 형상 및 크기를 관찰하기 위해 광학현미경(Quantax 2000, Bruker)을 사용하였다.
2. 제조과정 및 분석결과
<실험예1> 유기용매에 의한 입자의 형상 및 크기 변화
도 4는 본 발명에 따른 PLLA 마이크로 입자의 제조 공정도이다.
도 4에 도시된 바와 같이 PLLA에 0.1g, 0.3g, 0.5g으로 각기 양이 조절된 마이크로 입자 PLLA를 유기 용매인 dichloromethane(DCM) 또는 chloroform 10 mL에 각각 용해하여 oil상을 제조하였다.
그 후 1 wt%의 PVA 용액 50 mL에 앞서 제조된 oil상 전량을 첨가한 후 1시간 동안 교반하여 균질한 O/W emulsion을 제조하였다.
또한, PLLA 용액 중에 포함된 유기 용매인 DCM 혹은 chloroform을 제거하기 위하여 증류수 200 mL을 O/W emulsion에 첨가하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시켰다.
그 후 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 물을 제거하여 최종의 PLLA 마이크로 입자를 제조하였다.
도 5는 본 발명에 따른 PLLA를 chloroform 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
따라서 도 5에 도시된 바와 같이 유기 용매인 chloroform 10 mL에 PLLA 양을 각각 0.1g, 0.3g, 0.5g으로 양을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경을 통해 확인한 것이다.
도 5의 a와 b는 각각 PLLA 0.1g을 사용하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대한 상태를 나타낸 것으로써, a에서 평균 67㎛ 크기의 구형이 아닌 불규칙한 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서도 입자의 형상이 구형이 아님을 알 수 있다.
도 5의 c와 d는 PLLA 0.3g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대한 상태를 나타낸 것으로써, c에서 평균 76㎛ 크기의 불규칙한 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d에서는 입자의 내부가 비어 있음을 알 수 있다.
도 5의 e와 f는 PLLA 0.5g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대한 상태를 나타낸 것으로써, e에서 평균 95㎛ 크기의 불규칙한 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, f에서는 입자 내부가 비어 있는 것을 알 수 있다.
이와 같은 결과로부터 유기 용매로 chloroform을 사용 시에는 전반적으로 얻어진 입자의 형상이 구형이 아닌 불규칙한 모양을 보이며, 첨가한 PLLA의 양이 많아질수록 입자의 크기가 커지고 얻어진 입자는 내부가 비어 있음을 알 수 있다.
도 6은 본 발명에 따른 PLLA를 DCM 유기 용매 10 mL에 용해시켜 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
그리고 도 6에 도시된 바와 같이 유기 용매인 dichloromethane(DCM) 10 mL에 PLLA 양을 각각 0.1g, 0.3g, 0.5g으로 양을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경을 통해 확인한 것이다.
도 6의 a와 b는 각각 PLLA 0.1g을 사용하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태를 나타낸 것으로써, a에서 평균 19㎛ 크기의 규칙적인 구형 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서도 입자의 형상이 구형임을 알 수 있었고 입자의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 제조되었음을 알 수 있다.
도 6의 c와 d는 PLLA 0.3g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태를 나타낸 것으로써, c에서 평균 40㎛ 크기의 구형 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d에서는 입자의 내부가 비어 있음을 알 수 있다.
도 6의 e와 f는 PLLA 0.5g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태를 나타낸 것으로써, e에서 평균 104㎛ 크기의 구형 형상의 입자가 제조된 것을 알 수 있으며 f에서는 입자 내부가 비어 있는 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 유기 용매로 DCM을 사용 시에는 전반적으로 구형 형상의 입자가 얻어지며, 첨가한 PLLA의 양이 많아질수록 입자의 크기가 커지고 얻어진 입자는 내부가 빈 구조를 보임을 알 수 있다.
따라서 유기용매는 불규칙한 형상을 가지며 입자크기가 상대적으로 큰게 나오는 chloroform보다 구형 형상의 입자를 가지며 입자크기가 상대적으로 작은 DCM( dichloromethane)을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, DCM( dichloromethane)을 사용할 경우 입자가 구형으로 균일하게 나와 주사 주입이 가능한 30~150㎛의 입자로 선별하는데 용이하다.
또한, DCM( dichloromethane)을 사용할 경우 입자가 구형으로 균일하게 나와 주사 주입이 가능한 30~150㎛의 입자로 선별하는데 용이하다.
<실험예2> Homogenizer를 이용한 교반 속도 및 시간에 따른 입자의 형상 및 크기 변화
여기서는 도 4에 나타난 바와 같이 DCM의 유기용매를 사용하였으며, 나머지 조건은 <실험예1>과 동일하게 진행하였으며, Homogenizer의 속도를 1,000 rpm, 3,000 rpm, 5,000 rpm, 7,000 rpm으로 조절하고 시간은 15분 및 30분 동안 교반하여 제조된 상태를 비교하였다.
도 7은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 15분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 7에 나타난 바와 같이 교반속도를 달리하여 15분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경을 통해 확인하였다.
도 7의 a와 b는 교반속도를 1,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, a에서 평균 96㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 7의 c와 d는 교반속도를 3,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, c에서 평균 55㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 7의 e와 f는 교반속도를 5,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, e에서 평균 28㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, f에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 7의 g와 h는 교반속도를 7,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, g에서 평균 18㎛ 크기의 많은 수의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, h에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 homogenizer의 교반속도가 커질수록 PLLA 마이크로 입자의 평균 크기가 96㎛에서 18㎛로 작아지며, 얻어진 PLLA 입자는 내부가 비어 있는 마이크로 입자 형상을 보임을 알 수 있다.
도 8은 본 발명에 따른 Homogenizer 교반속도를 달리하여 30분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 8은 교반속도를 달리하여 30분 동안 교반하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경을 통해 확인하였다.
도 8의 a와 b는 교반속도를 1,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, a에서 평균 44㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 8의 c와 d는 교반속도를 3,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, c에서 평균 26㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 8의 e와 f는 교반속도를 5,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, e에서 평균 16㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, f에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
도 8의 g와 h는 교반속도를 7,000 rpm으로 고정하여 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, g에서 평균 12㎛ 크기의 많은 수의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, h의 1,000배 확대 사진에서는 구의 내부가 비어 있는 마이크로 입자가 생성된 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 homogenizer의 교반속도가 커질수록 PLLA 마이크로 입자의 평균 크기가 44 ㎛에서 12 ㎛로 크게 작아지며, 또한 교반시간을 15분에서 30분으로 길게 함으로서 같은 rpm에서 더 입자 크기가 작아지며, 얻어진 PLLA 입자는 내부가 비어 있는 마이크로 입자 형상을 보임을 알 수 있다.
<실험예3> 혼합 비율에 의한 입자의 형상 및 크기 변화
<실험예1>과 동일한 조성과 <실시예1>의 조성에서 PLLA, DCMD을 각각 2배, 3배, 6배, 10배씩 증가하고, PVC용액 및 증류수는 정적량을 증가시킨 실시예 2 내지 5에 대한 입자의 형상 및 크기에 미치는 영향을 살펴보았다.
| PLLA(g) | DCM(mL) | PVC용액(mL) | 증류수(mL) | |
| 실시예1 | 0.5 | 10 | 50 | 200 |
| 실시예2(2배) | 1.0 | 15 | 100 | 300 |
| 실시예3(3배) | 1.5 | 20 | 100 | 300 |
| 실시예4(5배) | 3.0 | 30 | 150 | 500 |
| 실시예5(10배) | 5.0 | 55 | 300 | 500 |
도 4에 도시된 바와 같이 <실험예1>의 방법과 동일한 방법으로 실시예 1 내지 5에 따른 최종의 PLLA 마이크로 입자를 제조하였다.
도 9는 본 발명에 따른 혼합 비율의 변경에 의한 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 9는 <표 1>에서 나타난 바와 같이 실시예 1 내지 5를 통해 얻어진 PLLA 마이크로 입자의 100배 확대한 광학현미경을 통해 나타낸 것이다.
도 9의 a의 <실시예1>은 평균 106 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 <실시예2>는 평균 94 ㎛ 크기의 구형입자가 형성된 것을 알 수 있고, c의 <실시예3>은 평균 95 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d의 <실시예4>는 평균 96 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, d의 <실시예5>는 평균 94 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 실시예1 내지 5에 따라 기본조성을 10배까지 조절하여 제조하여도 입자의 크기는 94 - 106㎛ 크기로 크게 변하지 않으며, 동일한 구형 형상을 나타냄을 알 수 있다.
<실험예4> 연골세포 및 진피세포 첨가량에 따른 형상 및 크기의 변화
<실험예4>는 <실험예1>의 조성과 동일한 방법으로 이루어지되, <실험예1>을 통해 제조된 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 연골세포와 진피세포의 콜라겐을 0.1g, 0.3g, 0.5g으로 변화를 주어 혼합하여 제조하였다.
여기서 진피세포 및 연골세포로 부터의 유전자 오염을 방지하기 위해 진피세 포 및 연골세포의 유전자를 사멸시킨 후 세포 내의 콜라겐만을 이용하였으며, 연골세포 및 진피세포 첨가량 변화가 마이크로 입자의 크기 및 형상에 미치는 영향을 살펴보았다.
여기서 진피세포 및 연골세포로 부터의 유전자 오염을 방지하기 위해 진피세 포 및 연골세포의 유전자를 사멸시킨 후 세포 내의 콜라겐만을 이용하였으며, 연골세포 및 진피세포 첨가량 변화가 마이크로 입자의 크기 및 형상에 미치는 영향을 살펴보았다.
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도 10은 본 발명에 따른 진피세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경 사진이다.
도 10는 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 진피세포의 콜라겐을 각각 0g, 0.1g, 0.3g, 0.5g씩 첨가하여 제조된 진피세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 100배와 1,000배 확대한 광학현미경을 통해 상태를 나타낸 것이다.
도 10의 a와 b는 각각 진피세포를 첨가하지 않고 PLLA만을 사용하여 얻어진 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, a에서 평균 109 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서는 속이 비어 있는 마이크로 입자 형태임을 알 수 있다.
도 10의 c와 d는 진피세포 0.1g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, c에서 평균 143 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, a와는 달리 PLLA 내부에 진피세포가 부분적으로 함침 되어 있는 구조를 보여주고 있으며, 또한 d에서는 PLLA 입자 내부에 진피세포가 부분적으로 함침된 마이크로 입자의 구조를 재확인 하고 있다.
도 10의 e와 f는 진피세포 0.3g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, e에서 평균 155 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있고 PLLA 입자 내부가 진피세포에 의해 완전히 채워져 있으며, 과량의 진피세포의 첨가로 인해 섬유 모양의 진피세포가 PLLA 입자 내에 함침 되지 못하고 존재함을 알 수 으며, f는 입자 내부에 진피세포가 완전히 함침된 구조를 재확인 하고 있다.
도 10의 g와 h는 진피세포 0.5g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, g에서 평균 175 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있고 과량의 진피세포의 첨가로 인해 PLLA에 함침 되지 못한 섬유 모양의 진피세포가 많이 존재함을 알 수 있으며, h에서는 PLLA 입자 내부에 진피세포가 함침 되어 내부가 꽉 차 있음을 재확인시키고 있다.
이상의 결과로부터 진피세포의 첨가량이 많아질수록 PLLA 마이크로 입자가 더 많은 진피세포로 함침되어 크기가 109 ㎛에서 175 ㎛로 커지나, 과량의 진피세포가 첨가된 경우(0.3g 이상)에서는 PLLA에 함침 되지 못한 진피세포의 양이 많아지는 것을 알 수 있다.
도 11은 본 발명에 따른 연골세포의 첨가량을 달리하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 광학현미경
도 11은 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 연골세포 콜라겐을 각각 0g, 0.1g, 0.3g, 0.5g씩 첨가하여 제조된 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 100배와 1,000배 확대한 광학현미경을 통해 상태를 나타낸 것이다.
도 11의 a와 b는 각각 연골세포를 첨가하지 않고 PLLA만을 사용하여 얻어진 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, a에서 평균 109 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b에서는 속이 비어 있는 마이크로 입자 형태임을 알 수 있다.
도 11의 c와 d는 연피세포 0.1g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, c에서 평균 121㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, a와는 달리 PLLA 내부에 연골세포가 함침 되어 있는 구조를 보여주고 있으며, 또한 d에서는 PLLA 입자 내부에 연골세포가 부분적으로 함침된 마이크로 입자의 구조를 재확인하고 있다.
도 11의 e와 f는 연골세포 0.3g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, e에서 평균 131 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, PLLA 입자 내부가 연골세포에 의해 완전히 채워져 있음을 알 수 있고, f는 입자 내부에 연골세포가 완전히 함침 되어 있는 구조를 재확인하고 있다.
도 11의 g와 h는 연골세포 0.5g을 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 100배와 1,000배 확대상태로써, g에서 평균 141 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, 과량의 연골세포의 첨가로 인해 PLLA에 함침 되지 못한 많은 양의 연골세포가 존재함을 알 수 있고, h에서는 PLLA 입자 내부에 연골세포가 함침 되어 내부가 꽉 차 있음을 재확인시키고 있다.
이상의 결과로부터 연골세포의 첨가량이 많아질수록 PLLA 마이크로 입자 내에 더 많은 연골세포로 함침 되어 크기가 109 ㎛에서 141 ㎛로 커지며, 연골세포의 첨가량이 과량인 경우(0.5g)에는 PLLA에 함침 되지 못한 연골세포가 존재하는 것을 알 수 있다.
도 12는 본 발명에 따른 진피세포가 담지된 PLLA 마이크로 입자의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 12의 a는 PLLA 스펙트럼에서는 1758 cm-1에서의 -COO- 그룹의 stretching vibration에 기인된 PLLA의 특성 피크가 나타나고 있으며, b는 진피세포의 스펙트럼에서는 3400 cm-1에서의 진골세포의 OH 그룹의 stretching vibration에 기인된 진골세포의 특성 피크가 나타나고 있고 c는 진피세포가 담지된 PLLA 마이크로 입자에서는 1758 cm-1에서의 PLLA 특성 피크와 1036 cm-1와 3400 cm-1에서의 진피세포의 특성 피크가 동시에 나타나고 있다.
따라서 진피세포가 PLLA 마이크로 입자 중에 성공적으로 담지 되었다는 것을 알 수 있다.
<실험예 5> PVA 용액의 농도에 따른 형상 및 크기의 변화
도 4에 도시된 바와 같이 <실험예1>과 동일한 방법으로 이루어지되, <실험예1>을 통해 제조된 마이크로 입자 PLLA를 사용하였으며, PAV용액의 농도가 진피세포 또는 연골세포가 함유된 PLLA 마이크로 입자의 크기 및 형상에 미치는 영향을 살펴보았다.
이를 위해 PVA용액의 농도를 농도를 1 wt%, 3 wt%, 5 wt%로 각각 변화시킨 PVA 용액 50 mL을 사용하였다.
도 13은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 <실험예1>을 통해 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 13의 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 DCM 용매 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경을 통해 확인한 것이다.
도 13의 a의 1 wt% PVA용액을 사용한 경우에서는 평균 135 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 3 wt% PVA용액을 사용한 경우에서는 평균 116 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 102 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되어 크기가 크게 작아졌음을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 PVA 용액의 농도를 증가시키면 입자의 평균 크기가 135 ㎛에서 102 ㎛로 감소함을 알 수 있다. 또한, 입자 내부가 비어 있으므로 입자가 투명하게 보임을 알 수 있다.
도 14는 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 14의 PLLA 0.5g에 진피세포 0.5g을 첨가하여 DCM 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 첨가하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 14의 a의 1 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 173 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 3 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 164 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 115 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되어 크기가 크게 작아짐을 알 수 있다.
또한, 진피세포가 PLLA 마이크로 입자 내에 함침 되므로 입자의 색깔이 검게 보임을 알 수 있다.
도 15는 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가한 후 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 15은 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 연골세포 0.5g을 첨가하여 DCM 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 광학현미경 사진이다.
도 15의 a의 1 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 174 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 3 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 146 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 127 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되어 크기가 작아짐을 알 수 있다.
또한, 연골세포가 PLLA 마이크로 입자 내에 함침 되므로 입자의 색깔이 검게 보임을 알 수 있다.
도 16은 본 발명에 따른 진피세포 또는 연골세포를 첨가하지 않고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진이다.
도 16의 PLLA 0.5g에 진피세포나 연골세포를 첨가하지 않고 DCM 용매 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 16의 a의 1 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 140 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 3 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 120 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 100 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었음을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 PVA 용액의 농도를 증가시키면 입자의 평균 크기가 140 ㎛에서 120 ㎛로 감소함을 알 수 있으며, 광학현미경으로 관찰한 결과와 비슷한 크기를 보이며, 매끈한 입자 표면을 보임을 알 수 있다.
도 17은 본 발명에 따른 진피세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진이다.
도 17은 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 진피세포 0.5g을 첨가하여 DCM 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 첨가하여 제조된 진피세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 주사전자현미경 사진이다.
도 17의 a의 1 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 170 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, b의 3 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 140 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 120 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었음을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 PVA 용액의 농도를 증가함에 따라 입자의 평균 크기가 170 ㎛에서 120 ㎛로 감소함을 알 수 있으며, 광학현미경으로 관찰한 결과와 비슷한 크기를 보였다. 그러나 제조된 입자의 표면은 진피세포의 첨가로 인해 표면이 매끄럽지 못하며, 진피세포를 첨가하지 않은 경우 보다 크기가 커짐을 알 수 있다.
도 18은 본 발명에 따른 연골세포 0.5g을 첨가하고 여러 농도의 PVA 용액을 사용하여 제조된 PLLA 마이크로 입자의 주사전자현미경 사진이다.
도 18은 마이크로 입자 PLLA 0.5g에 연골세포 0.5g을 첨가하여 DCM 10 mL에 용해시킨 후 여러 농도의 PVA 용액 50 mL를 첨가하여 제조된 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 주사전자현미경 사진이다.
도 18의 a의 1 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 160 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조된 것을 알 수 있으며, 22b의 3 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 140 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었으며, c의 5 wt% PVA 용액을 사용한 경우에서는 평균 110 ㎛ 크기의 구형 입자가 제조되었음을 알 수 있다.
이상의 결과로부터 PVA 용액의 농도를 증가함에 따라 입자의 평균 크기가 160 ㎛에서 110 ㎛로 감소함을 알 수 있으며, 광학현미경으로 관찰한 결과와 비슷한 크기를 보였다. 제조된 입자는 연골세포를 첨가하지 않은 경우 보다 크기는 커지나, 입자 표면은 진피세포 첨가 시와는 달리 매끈한 구조를 보임을 알 수 있다.
<실험예 6> 주사형 PLLA 필러 제조
여러 조건에 의해 제조된 PLLA 마이크로 입자 중 최적 조건을 나타낸 조성인 마이크로 입자 PLLA 0.5g과 연골세포 0.3g을 유기 용매인 DCM 10 mL에 용해한 후 1 wt%의 PVA 용액 50 mL에 PLLA 용액을 혼합하여 제조된 PLLA 마이크로 입자를 CMC(carboxylic methyl cellulose) 용액과 혼합하여 현탁액을 만든 후 이 현탁액을 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조하였으며, 아래 절차는 주사형 PLLA 필러를 제조한다.
시료의 입자평균 크기가 131 ㎛이므로 실험용 체를 사용하여 100-150 ㎛ 크기의 입자만을 선별하였다.
그리고 선별된 100-150 ㎛ 크기의 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA를 3 wt% CMC(carboxylic methyl cellulose) 용액과 혼합하여 현탁액을 만들었다. 이때 3 wt% CMC 용액의 점도가 높으므로 3 wt% CMC 용액 3g과 3 wt% PVA 용액 3g 및 PLLA 마이크로 입자 1g을 혼합하여 10분 동안 교반하여 PLLA 마이크로 입자가 균일하게 분산된 현탁액을 제조하였다.
이렇게 제조된 PLLA 마이크로 입자가 균일하게 분산된 현탁액을 1 mL 용량의 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조하였다.
이상에서와 같이 본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
Claims (5)
- 생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid)를 마이크로 입자로 만드는 생성단계(S10);
상기 생성단계(S10)를 통해 마이크로 입자로 생성된 PLLA에 연골세포의 콜라겐을 첨가/혼합하는 혼합단계(S20);
상기 혼합단계(S20)에서 생성된 연골세포가 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러의 주사주입이 가능한 적합성을 분석하는 분석단계(S30);
상기 분석단계(S30)를 통해 주사주입에 적합하다고 분석된 연골세포 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA 필러를 현탁액으로 변환한 후 주사기에 주입하여 주사형 PLLA 필러를 제조하는 제조단계(S40);로 이루어지되,
상기 혼합단계(S20)는,
마이크로 입자로 이루어진 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 연골세포 콜라겐 0.1g 내지 0.5g을 혼합한 후 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조하는 단계(S21);
제조된 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA가 혼합된 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 제조하는 단계(S22);
상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시키는 단계(S23);
상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA 마이크로 입자를 제조하는 단계(S24);로 이루어지는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 생성단계(S10)는,
생분해성 고분자인 PLLA(poly-L-lactic acid) 0.1g 내지 0.5g에 유기용매 10mL를 용해하여 오일을 제조하는 단계(S11);
제조된 상기 오일 전량에 1wt%의 PVA(poly vinyl alcohol)용액 50mL를 첨가하여 1시간 동한 교반하여 균질한 PLLA가 혼합된 수중 유형 에멀션(oil-in-water emulsion)을 제조하는 단계(S12);
상기 수중 유형 에멀션에 증류수 200mL를 혼합하여 2시간 동안 교반하여 유기용매를 증발시키는 단계(S13);
상기 유기용매가 증발된 수중 유형 에멀션을 동결건조기를 사용하여 -50℃에서 24시간 동안 건조시켜 PLLA 마이크로 입자를 제조하는 단계(S14);로 이루어지는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 분석단계(S30)는,
연골세포의 콜라겐이 혼합된 마이크로 입자 PLLA의 입자크기는 주사주입이 가능한 30~150㎛ 크기 및 구형입자인 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 제조단계(S40)는,
연골세포의 콜라겐이 혼합된 PLLA 입자에 3wt% CMC(carboxylic methyl cellulose)용액과 혼합하여 현탁액을 만든 후 주사기에 주입하는 것을 특징으로 하는 지속성이 우수한 안면성형용 PLLA 필러의 제조방법.
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