KR101831932B1 - 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나, 산초, 배, 다시마 또는 다시마 추출액, 및 버섯 또는 버섯 추출액을 포함하여 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치를 제공하며, 본 발명에 따른 김치를 섭취할 경우 헬리코박터의 돌연변이 성향을 줄이며, 장시간 투입시, 헬리코박터에 의한 위축성 위염의 진행을 개선 시킬 수 있으며, 헬리코박터 관련 위암을 예방 및 치료할 수 있는 것으로 나타났다.
Description
본 발명은 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 발효 식품인 김치에 관한 것이다.
1983년 호주의 미생물학자인 마샬(Marchall)과 와렌(Warren)은 최초로 B 형 위염환자의 위점막 생검조직에서 만곡성 세균을 발견하고, 상기 세균을 배양하여 캠필로박터 종(campylobacter genus)과 연관된 새로운 종임을 규명한 이래, 헬리코박터 파이로리와 위염 및 소화성 궤양 등의 상부위장관 질환 간의 연관성에 대한 활발한 연구가 이루어져 왔다. 헬리코박터 파이로리는 그람음성의 간균으로서 얇은 막으로 둘러싸인 편모가 있으며, 다량의 유레아제(urease)를 방출하고 대변-구강 경로를 통하여 전파되는 것으로 알려져 있으며, 1994년에는 세계보건기구(WHO)가 확실한 발암인자라고 밝혀 세계적으로 주목을 받고 있는 병원균이다.
현재 헬리코박터 파이로리에 의한 질병의 발병기전은 음식물과 함께 위 내강에 들어온 세균이 강한 운동성을 가진 편모를 이용하여 위 점액층을 뚫고 들어가서 위 점액층 내 위 상피세포층 상부와 세포 간 접합부에 서식하면서 다량의 유레아제를 분비하여 점액층을 알칼리성으로 변화시킴으로써 가스트린에 의한 위산분비 촉진을 비정상적으로 과다하게 유도하여 결국 염증 및 궤양을 초래하는 것으로 밝혀져 있다.
또한 헬리코박터 파이로리가 위 선암(gastric adenocarcinoma) 발명의 중요한 위험요소임을 규명한 최근의 연구보도에 따라 국제보건기구에서는 헬리코박터 파이로리를 제 1 군 발암물질로 지정하였다.
헬리코박터 파이로리에 의한 감염은 한국을 비롯한 개발도상국에서 특히 자주 발생하는 것으로 보고되어 있으며, 백 등의 보고에 의하면 한국인 정상인의 약 80% 이상이 헬리코박터 파이로리에 감염되어 있는 것으로 추정된다(백승철 등, 대한미생물학회지, 25:45-52, 1990). 따라서 헬리코박터 파이로리 감염에 대한 치료 및 예방방법의 개발이 매우 시급한 실정이다.
상기와 같은 미생물 감염에 의한 질병을 치료하기 위한 방법으로 현재 항생제를 이용한 화학요법이 주로 실시되고 있으며, 이 방법의 광범위한 사용은 단기적인 측면에서는 효과적일 수 있으나 항생제의 지속적인 사용으로 인한 항생제 내성균주의 출현 등의 위험이 있다는 문제점이 있다.
또한 헬리코박터 파이로리에 대한 항균요법으로 Rauws 등은 비스무트(bismuth) 제제와 아모시실린(amoxicillin), 메트로니다졸(metronidazole)의 세 가지 항균제를 투여하여 치료성과를 발표하였고(Rauws EAJ, Langenberg W, Houthoff JH, Zanen HC and Tytgat GHJ, Gastroenterol, 94:33~40, 1988), Borody 등은 비스무트 제제와 테트라싸이클린(tetracycline), 메트로니다졸을 소화성 궤양 환자에게 투여하여 80% 내외의 치료성과를 발표하였으며 (Borody T, Lynne j anew Moore-Jones D, Gastroenterol, 98: A24, 1990), 이로부터 헬리코박터 파이로리 감염증의 치료에 이 세 가지 항균제의 병용투여가 가장 일반적으로 사용되고 있다.
하지만, 항균요법의 지속적인 사용으로 인해 설사, 역류성 식도염 발생, 장내 정상적인 균총 억제, 내성균주 출현 등의 다양한 부작용이 발생하는 것으로 보고되고 있다.
최근 위·장관 질환의 예방과 치료에 있어 유산균 발효물질의 기능에 대해 관심이 증대되고 있고, 특히 사람 병원균의 생육을 저해할 수 있는 프로바이오틱 락토바실러스(probiotic Lactobacillus)에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 이들 유산균들은 발효 산물로서 유산, 초산, 및 과산화수소뿐만 아니라 박테리오신과 관련된 항균물질을 생산한다.
Marie-Helen Coconier 등은 생체 밖에서 헬리코박터 파이로리에 대한 항균물질을 생산하는 사람의 락토바실러스 에시도필러스 LB(Lactobacillus acidophilus strain LB)를 배양하여 이 배양액의 상등액이 생체 밖에서 사람의 장관세포에 대한 헬리코박터 파이로리의 부착을 저해하고 유레이즈(urease)의 활성을 억제할 뿐만 아니라 헬리코박터 펠리스(H. felis)가 생쥐에 감염되는 것을 저해하는 성질을 확인하였다(Marie-Helen Coconier et al., Environ. Microbiol, Nov.4573~4580, 1998).
또한 Yuji Aida M.T. 등은 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius)의 구강투여를 통해 무균의 뮤린(murine)에 대한 헬리코박터 파이로리의 감염이 저해되는 것을 확인하였고, 미국특허 제5,578,392호에는 락토바실러스 존슨니(L. johnsonii)가 장관세포에 대한 헬리코박터 파이로리의 부착을 저해하는 기능에 대하여 기재하고 있다.
또한 Canducci 등은 라베프라졸(rabeprazol), 클라리트로마이신(clarithromycin), 아목시실린(amoxycillin)을 사용한 항균요법과 병행하여 사람의 락토바실러스 에시도필러스 배양액의 불활성제제를 처방함으로써 헬리코박터 파이로리의 박멸률을 증대시키는 결과를 얻었다(Canducci F. et al., Aliment Pharmacol. Ther, 14:1625~1629, 2000).
또한 대한민국 특허 출원 제 10-1999-0040387호에는 헬리코박터 파이로리에 대한 항체와 함께 헬리코박터 파이로리에 대해 억제능을 나타내는 유산균인 락토코커스 sp. HY 49, 락토바실러스 카제이 HY 2782 및 비피도박테리아 롱검 HY 8001 등을 함유한 식품에 대하여 기재하고 있다.
그러나 자주 섭취하는 식품을 통하여 헬리코박터 파이로리 감염에 의해 발병되는 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 방법에 대한 연구는 완전하지 못하며, 여전히 진행 중에 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 소금, 향신료 그리고 다른 양념을 사용하여 젖산 발효과정을 거친 한국의 전통 발효 음식으로 안전성이 확보되어 있으며, 한국의 프로바이오틱스 음식이라고 정의할 수 있는 김치의 조성을 개선하여 헬리코박터 파이로리 원인성 질환에 대한 예방 및 치료 활성을 나타내도록 하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은
갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나, 산초, 배, 다시마 또는 다시마 추출액, 및 버섯 또는 버섯 추출액을 포함하여 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치를 제공한다.
본 발명에 따른 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치는 김치 전체 중량에 대하여 상기 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 1.0 내지 10.0중량%, 상기 산초를 0.05 내지 0.5중량%, 상기 배를 1.0 내지 5.0중량%, 상기 다시마 또는 다시마 추출액을 1.0 내지 5.0중량%, 상기 버섯 또는 버섯 추출액이을 1.0 내지 5.0중량% 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치에 있어서, 상기 버섯이 표고버섯, 상기 다시마 추출액 및 버섯 추출액의 추출 용매가 물인 것이 바람직하다.
또한 본 발명에 따른 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대한 예방 및 치료 활성을 보이는 김치를 제조하기 위하여 스타터(starter)로 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 김치가 특별히 예방 및 치료 활성을 보이는 질병은 헬리코박터 파이로리 원인성 질병 중에서 위염, 위궤양, 위암이다.
본 발명에 따른 항암 김치는 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나, 산초, 배, 다시마 또는 다시마 추출액, 및 버섯 또는 버섯 추출액을 본래 김치 조리법에 더하여 헬리코박터의 돌연변이 성향을 줄이며, 장시간 투입시, 헬리코박터에 의한 위축성 위염의 진행을 개선 시킬 수 있으며, 헬리코박터 관련 위암을 예방 및 치료할 수 있는 것으로 나타났다.
도 1은 체외 세포와 체내 동물 모델에 사용되기 위한 김치의 가공처리 과정을 도시한 것이다.
도 2는 일반 김치와 항암 김치의 in vitro 헬리코박터 감염 세포 모델에서의 생물학적 반응을 도시한 것이다.
도 3은 헬리코박터 감염으로 인한 만성 위축성 위염에서 개선 효과(헬리코박터 감염 24주 후)를 도시한 것이다.
도 4는 항암 김치의 항 염증 작용 및 재생에 대한 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것이다.
도 5는 항암 김치의 장기간 섭취로 헬리코박터로 유도된 위 종양 형성 예방에 대하여 도시한 것이다.
도 6은 항암 김치의 암 예방 효과를 설명하는 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것이다.
도 2는 일반 김치와 항암 김치의 in vitro 헬리코박터 감염 세포 모델에서의 생물학적 반응을 도시한 것이다.
도 3은 헬리코박터 감염으로 인한 만성 위축성 위염에서 개선 효과(헬리코박터 감염 24주 후)를 도시한 것이다.
도 4는 항암 김치의 항 염증 작용 및 재생에 대한 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것이다.
도 5는 항암 김치의 장기간 섭취로 헬리코박터로 유도된 위 종양 형성 예방에 대하여 도시한 것이다.
도 6은 항암 김치의 암 예방 효과를 설명하는 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것이다.
이하 본 발명을 내용을 구체적으로 설명하기로 한다.
헬리코박터 파이로리 감염에 대한 식이 조정으로서, 항암 김치(cpKimchi)의 조리법을 새롭게 연구하였으며, 쥐 모델을 이용하여 항암 김치의 식이 조정은 대표적으로 위염, 위궤양, 위암 등과 같은 헬리코박터 파이로리 원인성 질병을 예방 및 치료할 수 있다는 가설을 세우고, 항암 김치를 일반화된 김치에서 다음의 다섯 가지 추가하여 제조하였다.
추가되는 다섯 가지는
첫째, 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나,
둘째, 산초,
셋째, 배,
넷째, 다시마 또는 다시마 추출액,
다섯째, 버섯 또는 버섯 추출액
이다.
상술한 바와 같이 추가되는 다섯 가지의 함량은 특별한 제한을 받지 않으나 김치의 약리학적 효과 부분뿐만 아니라 식품으로서의 맛을 고려하여야 하기 때문에 이 전체적인 부분을 고려하여 본 발명에서는 김치 전체 중량에 대하여 상기 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 1.0 내지 10.0중량%, 상기 산초 0.05 내지 0.5중량%, 상기 배 1.0 내지 5.0중량%, 상기 다시마 또는 다시마 추출액 1.0 내지 5.0중량%, 상기 버섯 또는 버섯 추출액이 1.0 내지 5.0중량% 포함하도록 김치를 제조한다.
또한, 상기 버섯은 식용으로 사용할 수 있는 버섯이라면 특별한 제한 없이 사용 가능하나 본 발명자들의 다양한 시험 결과 표고버섯을 이용하여 김치를 제조하는 것이 김치의 맛 그리고 헬리코박터 파이로리 원인성 질병 예방 및 치료에 효과적이다.
그리고 상기 버섯과 다시마는 그 자체로 사용할 수 있으며, 유효 성분을 물로 추출하여 유효성분이 녹아 있는 추출 용액을 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 김치를 제조할 때 별도의 김치 유산균의 접종 없이 자연 발효에 의한 제조에도 충분히 효과가 발휘되나 다양한 김치 유산균 중에서도 위 장관 내 소화효소와 위산 및 담즙산 등에 대한 내성을 가진 김치 유산균을 많이 포함하는 경우에 그 효과가 배가될 수 있어, 다양한 시험 결과 내성이 우수한 것으로 확인된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 스타터(starter)로 더 포함시켜 김치를 제조할 수도 있다.
본 발명에 따른 김치는 헬리코박터 파이로리 원인성 질병에 대하여 우수한 예방 및 치료효과를 보이지만, 특이 위염, 위궤양, 위암에서 우수한 효과를 보인다.
이하, 본 발명을 실시할 수 있도록 그 구체적인 내용을 설명하기로 하며, 먼저, 본 발명을 설명의 도입으로서 김치 제조 과정, 시험 방법 및 통계 등에 대하여 설명하기로 한다.
<김치 준비: 항암 김치(cpKimchi) 생산>
김치의 준비는 부산대학교 김치연구소의 일반화된 김치 조리법(sKimchi)에 기초하였다. 대조군이 되는 일반 김치(sKimchi)와 본 발명에 따른 항암 김치(cpKimchi)의 성분 및 함량은 아래 표 1과 같다.
아래 표 1에서 제시되었듯이, 일반 김치는 소금에 절인 배추, 고춧가루, 마늘, 생강, 멸치액젓, 무채, 파, 약간의 설탕으로 만들어졌으며, L.plantarum과 같은 김치 유산균이 생성되도록 한동안 발효시켜 제조하였다.
또한, 일반 김치(sKimchi) 생산을 위한 이러한 필수적인 구성 재료들에 더하여 갓잎, 산초, 배, 표고 버섯 추출액, 다시마 추출액을 추가하여 본 발명에 따른 항암 김치(cpKimchi)에 제조하였다. 일반 김치와 항암 김치 사이에서 맛과 외형은 구별할 수 없었다.
상기 표고 버섯 추출액은 5장의 표고 버섯을 물 1ℓ에 넣고 밤새 방치한 다음 약 5초 동안 가열하고 여과하여 표고 버섯은 제거하고 여과된 추출액을 사용한 것이며, 또한 다시마 추출액은 2 X 3 cm2 크기의 다시마 5장을 물 1ℓ에 넣고 밤새 방치한 다음 약 5초 동안 가열한 후 다시마가 제거될 수 있도록 여과하여 제조하였다.
성분 | 일반 김치 | 항암 김치 |
배추 | 100.0 | 100.0 |
고추 가루 | 3.5 | 2.5 |
마늘 | 1.4 | 2.8 |
생강 | 0.6 | 0.6 |
멸치 액젓 | 2.2 | - |
무 | 13.0 | 11.0 |
파 | 2.0 | 2.0 |
설탕 | 1.0 | 1.0 |
갓잎 | - | 7.5 |
산초 | - | 0.1 |
배 | - | 2.8 |
표고버섯 및 다시마 추출액 | - | 5.0 |
최종 염도(%) | 2.5 | 2.2 |
상기 표 1에서 각 성분들의 함량은 배추의 중량을 100으로 하였을 때 상대적인 중량 비율이며, 표고 버섯과 다시마는 함께 물에 넣고 추출하여 사용한 것이어서 중량 비율을 나눈다면 본 발명에 따른 항암 김치에는 5:5로 함유된 것으로 볼 수 있다.
또한 상기 표 1을 보면 겨자잎은 사용하지 않고 갓잎 만을 사용하였는데, 갓은 쌍떡잎식물 양귀비목 겨자과의 한해살이풀로서 겨자의 변종이며, 겨자와 갓의 씨를 개자(芥子)라 하여 씨를 가루로 만들어 향신료로 쓰는 등 실질적으로 갓과 겨자는 어는 것을 사용하나 동등한 효과를 보인다.
<체외 세포와 체내 동물 모델에 사용되기 위한 김치의 가공처리>
상기 제조한 2가지의 김치를 동결 건조한 후 고운 김치 가루로 만든 다음에 하룻밤 동안 저어 가며 메탄올(methanol)로 20번의 추출하여 김치 메탄올 추출액을 제조하였으며, 이들을 증발 농축(BRE 111 rotavapor, Switzerland)하여 4℃에서 저장하여 시험에 사용하였다.
보통 김치의 먹는 양은 개인의 취향에 따라 약 30g-100g/day이고, 일반적인 김치의 약 90%는 수분으로 구성되어 있기 때문에 본 시험에서는 동결건조와 증발을 통해 김치의 부피를 줄였으며, 추출된 일반 김치 및 항암 김치는 동물을 위해 보통 일반적인 김치 섭취량과 동등한 1.7g/kg/day와 5.0g/kg/day의 두 가지 양을 마시는 물병에 섞어줬으며 매일 갈아주었다. 또한 항암 김치와 일반 김치 추출액은 체외 실험을 수행하기 위해 2.5mg/ml, 5mg/ml, 7.5mg/ml로 용해하여 사용하였다.
상술한 바와 같은 가공 처리 과정은 도 1에 나타냈다.
<세균 배양>
헬리코박터 파이로리 균주 ATCC 43504(American Type Culture Collection, cagA+와 vacA s1-m1 유형의 균주)는 체외 모델에 사용되었으며, Sydney 균주(SS1, cagA+,vacAs2-m2쥐 감염에 알맞은 균주)는 체내 모델을 위해 사용되었다.
헬리코박터 파이로리는 5%의 양 혈액과 함께 BBL의 Trypticase soy(TS) 한천 배지(TSAII; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에서 미호기성 조건(BD GasPaK EZ Gas Generating Systems, BD Biosciences)으로 37℃에서 3일 동안 배양되었다. 세균을 깨끗한 TS 배지에서 채취하여 3000 X g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 마지막 농도가 109 colony-forming units(CFUs)/ml가 되도록 배지에 재 부유시켰다. 모든 실험은 TS 한천 배지에서 72시간 동안 성장된 배양균을 사용하였다.
<헬리코박터 파이로리에 감염된 쥐 모델>
동물: 5주 된 암컷 C57BL/6 쥐(Charles River Japan)는 시판되는 멸균 알갱이 사료(Biogenomics, South Korea) 를 먹이로 주었으며, 멸균된 물은 자유롭게 마시게 하였고, 24℃의 온도에서 공기 조절 장치를 갖춘 생물학적 위험 공간에서 살게 하였다. 적응 일주일 후, 위산을 낮춰 헬리코박터 파이로리 군체를 형성하기 위해 20mg/kg의 판토프라졸(pantoprazole)을 3번 주입하였다. 그 후 각 쥐는 109 CFUs/ml을 포함하는 헬리코박터 파이로리 부유액을 동등한 부피(0.1ml)로 위 삽관 바늘을 사용하면서 위 내로 접종되었다.
모든 그룹에 한 주에 4번 헬리코박터 파이로리를 주입하였다. 10마리 쥐에는 깨끗한 TS 배지를 주입하여 감염되지 않은 그룹을 먼들었다. 더 악화된 자료를 모으기 위해 4주 동안 쥐들에게 7.5% NaCl를 포함하는 AIN76을 기초로 한 특별한 알갱이 사료를 먹이로 주었다. 그 후, 헬리코박터 파이로리에 양성 반응하는 쥐를 임의적으로 4그룹(n=20)으로 나눴다. 모든 감염된 쥐들에서 헬리코박터 파이로리로 유도된 발암과정을 촉진하기 위해 7.5% NaCl를 포함하는 알갱이 사료 AIN76을 24주와 36주 동안 줬다. 모든 동물 연구는 IRB승인 후에 차대학 차 암 연구소의 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)에서 승인된 계획서에 따라 실행되었다. 위를 떼어내고, 추가적으로 조직검사, ELISA, 웨스턴 블럿(Western blotting), RT-PCR를 수행하였다.
총 수치: 쥐를 죽인 후, 떼어낸 위를 큰 만곡을 따라 절개하고, 염분이 든 차가운 얼음으로 씻었다. 총 점막 손상의 정도를 조사하기 위해 위의 점막층을 디지털 카메라를 이용하여 사진 찍었으며, 점막의 일부분을 즉시 10%의 포르말린(formalin) 용액에 고정하였다. 위 점막의 총 손상량은 총 궤양 지수(gross ulcer index)를 사용하여 어떠한 처리를 했는지 알지 못하는 세 명의 위장병 전문의에 의해 평가되었다.
이들의 병변 유형은 다음으로 정의되었다;
유형Ⅰ, 부종, 충혈, 또는 점막 밑에서 하나의 점모양 출혈의 존재;
유형Ⅱ, 가벼운 위염과 함께 점막 밑의 출혈성 병변의 존재;
유형Ⅲ, 위염과 함께 깊은 궤양과 침습성 병변의 존재.
조직병리학: 병리조직 분석을 위해 위를 10%의 중화된 포르말린에 고정하였으며, 표준 방법을 사용하여 가공 처리하였고, 파라핀에 넣었다. 그 후 박편을 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)(H&E)으로 염색하였다. 위 조직의 선 점막과 위강에 대해 조직 검사를 하였다. 염증성 세포의 침입, 짓무름 병변, 궤양, 형성이상, 선종 형성(암발병전의 병변)과 같은 헬리코박터 파이로리 감염의 병적인 변화들은 조직학적 손상 지수(index of histologic injury)를 사용하여 어떠한 처리를 했는지 알지 못하는 세 명의 위장병전문의에 의해 분류되었다.
본 연구에서, 염증은 염증성 세포의 침입을 점수로서 규정하였다.
0: 아무것도 없음,
1: 점막고유층 아래,
2: 점막의 반,
3: 상피 분비선 층까지(모든 점막). 짓
무름은 짓무름 병변의 비율로서 규정하였다.
0: 아무것도 없음,
1: 상피 분비선의 손실(1/3 부분),
2: 점막의 2/3 부분(2/3 부분),
3: 모든 점막(3/3 부분)
웨스턴 블럿(Western blot) 분석: 추출된 위 조직을 PBS로 두 번 세척한 다음, 1mM의 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Aldrich, St Louis, MO)를 포함하는 차가운 세포 용해 용액(Cell Signaling Technology, Denver, MA)에서 용해하였다. 20분 동안 반응시킨 후, 샘플들을 10,000 X g에서 10분 동안 원심분리하였다.
그 후 상층액을 모았으며, 용해물에 있는 단백질은 도데실황산나트륨폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 장치(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)(SDS-PAGE)에 의해 분리하였고, 폴리비닐이딘 플루오라이드 (polyvinylidene fluoride)(PVDF) 막으로 옮겨졌으며, 이것을 일차 항체와 반응시킨 후, 수세하고, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 이차 항체를 반응시키고, 재수세하였다. 그 후 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence) (ECL) 시스템(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용해 눈으로 확인하였다.
면역조직화학 염색(Immunohistochemical staining): 파라핀 블록을 제거하고, 알코올(alcohol)로 재수화한 후, 조직면에는 10mM/L의 구연산(citrate) 용액으로 채워진 압력 병에서 마이크로파로 10분 동안 열을 가하였다. 슬라이드(slide)는 15분 동안 물에서 식히고, PBS로 씻었다. 슬라이드는 하룻밤 동안 일차 항체와 반응시켰다. 반응 후, 차후 반응은 VECTOR kit (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)를 사용하였다. 마지막으로, 슬라이드는 3,3′-다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)(Invitrogen Life Technologies)과 함께 반응시켰고, 해마톡실린(hematoxylin)(Sigma-Aldrich)으로 대비-염색하였다. 항체에 양성 반응하는 세포의 수는 각 쥐에서 임의로 선택된 중피의 5군데에서 결정하였고, 100배 확대하여 관찰하였다. 값은 평균ㅁ평균오차로 주어졌다.
PAS 염색: 과요오드산(Periodic acid)과 쉬프(Schiff)의 염색을 위해 당결합체(glycoconjugate)의 조직화학 염색은 어두운 곳에서 2%의 Periodic acid와 Schiff(PAS)의 시약을 사용하여 20분 동안 Pandurangan의 방법으로 수행하였다.
이것은 10(훌륭한 보호)과 0(낮은 보호) 사이의 PAS 염색 점수로 결론을 내렸다.
TUNEL 분석: 아포토시스(Apoptosis) 검출을 위해 위 조직은 DeadEnd™ Fluorometric TUNEL 시스템 (G3250#, Promega, USA)을 사용하여 terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) 방법으로 염색하였다.
<헬리코박터 파이로리에 감염된 체외 세포 모델>
세포 배양과 세포독성(cytotoxicity) 분석: 쥐의 위 상피 세포주(RGM-1)는 H. Matsui (Tsukuba Univ., Japan) 교수님으로부터 받았고, AGS 세포들은 적절한 관리 능력과 진품임을 입증할 수 있는(DNA 검사 포함) 공인 기기관인 ATCC (Manassas, VA)로부터 구매하였다. 실험실에서 소생한 후, 모든 세포들은 6개월 이상 사용하지 않았다. AGS 세포들은 RPMI-1640 배지 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양되었으며, RGM-1 세포들은 DMEM 배지에서 배양되었다.
모든 배지들은 37℃, 5%의 CO2에서 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum)(Gibco BRL)을 추가하였다. 세포 생존도는 MTT 비색(colorimetric) 분석을 사용하면서 평가하였다.
MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]는 Sigma 화학 회사(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 여과액(50g)은 1L의 물과 섞은 후 동결건조하였다. 세포들은 96-well의 판(plate)에 104cells/ml의 농도로 넣고, 24시간 동안 부착되게 하였다. 김치 추출액은 24시간 동안 다양한 농도로 실험 well에 넣어 사용하였다.
살아 있는 세포의 이미지로 세포 이동 관찰: 일반 김치와 항암 김치 추출액의 농도에 따라 처리된 AGS 세포들을 파이펫(pipette) 팁으로 긁고, ScopeTek MDC200 (CHA University, Seoul, Korea) 하에서 세포 이동을 18시간까지 관찰하였다. 아무 처리도 하지 않은 그룹과 일반 김치 추출액의 농도에 따른 처리, 항암 김치 추출액의 농도에 따른 처리를 한 세 개의 그룹으로 관찰을 하였다. 18시간 후의 사진과 함께 세포 이동의 평균 속도는 그룹에 따라 계산되었고, 세포 이동의 평균 수치를 보여주었다.
ELISA 분석: 위의 세포를 채취한 후에 pH 7.4(1ml)의 10mM 인산나트륨(sodium phosphate) 용액에서 균질화 하였다. 9000 X g에서 원심분리한 후에 상층액의 PGE2수치는 ELISA에 의해 측정하였고, 농도는 pg/mg단백질로 표현하였다. 처리과정은 Prostaglandin E2 express EIA kit 원본(Cayman, Ann Arbor, MI)에 따라서 수행하였다.
HO-1, Bax, PARP, cleaved capspase-3를 위한 웨스턴 블롯(Western blot): 추출된 세포를 PBS로 두 번 씻은 후, 1mM의 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma Aldrich, St Louis, MO)를 포함하는 차가운 세포 용해 용액(Cell Signaling Technology, Denver, MA)에서 용해하였다. 20분 동안 반응시킨 후에, 샘플들은 10분 동안 10,000 X g에서 원심분리한 후 상층액을 모았다.
용해물에 있는 단백질은 도데실황산나트륨폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 장치(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)(SDS-PAGE)에 의해 분리하였고, 폴리비닐이딘 플루오라이드 (polyvinylidene fluoride)(PVDF) 막으로 옮겨졌으며, 이것을 일차 항체와 반응시킨 후, 수세하고, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 이차 항체를 반응시키고, 재수세하였다. 그 후 증강된 화학발광(enhanced chemiluminescence) (ECL) 시스템(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)을 사용해 눈으로 관찰하였다.
<통계 분석>
결과값은 평균ㅁ표준편차(SD)로 표현되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)과 SPSS software (version 12.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용해 수행하였다. 그룹들 사이의 통계적 유의성은 맨-휘트니 유 검정(Mann-Whitney Utest)에 의해 결정하였으며, 통계적 유의성은 p < 0.05에서 인정되었다.
이어서 시험에 대한 결과를 통하여 본 발명에 따른 항암 김치의 예방 및 치료 효과에 대하여 설명하기로 한다.
<결과>
<헬리코박터에 감염된 세포모델에서 일반 김치와 항암 김치의 생물학적 기능의 차이>
도 2는 일반 김치와 항암 김치의 in vitro 헬리코박터 감염 세포 모델에서의 생물학적 반응을 도시한 것으로 이를 참조하여 설명한다.
위암 세포인 AGS 세포(도 2A 왼쪽)와 변형되지 않은 위 상피 세포인 RGM-1 세포(도 2A 오른쪽)의 두 가지 세포 주에 일반 김치와 항암 김치의 추출물을 각각 1, 2.5, 5, 7.5mg/ml의 네 가지 농도로 투여했으며, 농도에 따른 세포의 생존도를 확인하였다.
위암 세포(p<0.05)에서 5mg/ml 이상의 김치 추출물 농도는 상당한 세포사멸을 보였지만, 위 정상 세포 모두에서는 세포사멸을 보이지 않았다. 위암 세포에서 항암 김치 추출물은 일반 김치 추출물(p<0.01)과 비교하여 더 우월한 효과를 나타냈다. 또한 비슷한 결과가 다른 위암 세포주인 MKN28과 SNU-719 세포에서도 얻어졌다.
항암 김치 추출물이 위암 세포에만 선택적으로 세포사멸이 초래되고, 위 정상 세포에서는 세포사멸이 발생되지 않는지에 대한 의문이 발생하여 오직 암 세포에서만 위 항암 김치 추출물이 우월하고 선택적인 세포사멸효과가 있음을 증명하기 위해 각각 6시간, 18시간 처리 후 세포 보호 효과를 나타내는 HO-1의 발현을 확인하였다(도 2B).
항암 김치 추출물로 처리된 위 정상 세포와 위암세포에서 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현은 상당히 증가하였으며, HO-1의 발현은 위 정상 세포에서 더 두드러지게 나타났다. HO-1의 발현은 또한 일반 김치 추출물 처리 후에도 나타났으나, 항암 김치 추출물과 비교해서는 적게 나타났다. 항암 김치 추출물의 세포사멸은 암이 없는 세포에서는 세포보호 유전자의 왕성한 유도 때문에 약화된 것이라 추측하였다. 항암 김치 추출물 처리 후 암 세포에서만 증가된 세포사멸은 항암 김치의 선택적인 세포사멸 작용과 관계 있음을 가설하였고, 이것을 위해 Bax와 cleaved capspase-3의 발현을 확인하였다(도 2C).
그 결과는 도 2C에서 보듯이, 위암 세포에서 일반 김치 추출물과 비교하여 항암 김치 추출물은 Bax와 cleaved capspase-3의 발현이 증가함을 보여주었다. 예상대로, 위 정상 세포에서 항암 김치 추출물은 Bax의 발현이 증가 되지 않음을 보여주었다.
항암 김치 추출물이 암 세포에서만 선택적으로 세포사멸을 유도한다는 상기 실험 결과에 더 나아가 항암 김치 추출물에 부과된 능력인 항종양 발생과 관련된 세포 이동 제한을 알아내기 위해 세포 이동 분석(wound healing assay)으로 증명하였다(도 2D).
도 2D에서 보듯이, 18시간 후에 통제된(control) 위암 세포에서 활발한 세포 이동으로 상처(wound)가 없어졌으나, 일반 김치 추출물 5mg/ml의 농도에서는 50%, 7.5mg/ml의 농도에서는 35%만 세포가 이동 되었으며(p<0.005), 이것은 대조군과 비교하여 뛰어난 세포 이동 억제를 보여주었다(p<0.01).
그러나, 항암 김치 추출물 5mg/ml의 농도에서는 30%, 7.5mg/ml의 농도에서 오직 10%만 세포가 이동 되었으며(p<0.005), 항암 김치 추출물 처리는 더 지연된 세포 이동을 보임으로서 항암 김치는 더 뛰어난 세포 이동 억제를 나타냈다. 흥미롭게, 상기의 세포사멸 분석처럼 항암 김치는 위 정상 세포에서는 지연된 세포 이동을 보이지 않았다.
항암 김치는 헬리코박터로 유도된 COX2, TNF-α 같은 염증 관련 인자들의 발현을 줄어들었음을(도 2E) 함께 알아내었다. 항암 김치의 오랜 투여는 종양 발생을 포함하여 헬리코박터로 유도된 위 손상에 상당한 구조 조치가 될 수 있을 것이다.
<헬리코박터 감염으로 인한 만성 위축성 위염에서 항암 김치의 재생 효과와 메커니즘 (24주 모델)>
<가벼운 만성 위염에서 24주 동안 항암 김치 섭취>
도 3은 헬리코박터 감염으로 인한 만성 위축성 위염에서 개선 효과(헬리코박터 감염 24주 후)를 도시한 것으로서, 이를 참조하면, 헬리코박터를 감염시킨 C57BL/6 쥐에 고염도 식이를 공급하여 만성 위축성 위염을 유도하였다(도 3A). 그로 인해 헬리코박터 감염 그룹에서는 위염 병변, 위 점막의 홍반, 결절성 점막의 변화, 부문동-위샘 부분에서 위 점막 돌기가 나타났다(도 3B).
총 병변 점수(Gross lesion score)는 항암 김치 추출물 투여로 상당히 감소되었다(p<0.01, 도 3C). 도 3B와 도 3D에서 보듯이, 위 점막 세포와 위샘과 위염 점막 변화를 대체하는 단핵백혈구, 림프구, 대식세포와 같은 염증 세포가 감소됨을 보이면서 만성 위축성 위염의 변화는 24주의 헬리코박터균 감염에서 두드러졌다.
그러나, 상기의 변화는 항암 김치 추출물이 5mg/kg 처리된 그룹에서 감소되었다(p<0.05). 상기 우수한 결과는 항암 김치의 재생 효과에 기초한 것이다.
<항암 김치의 항염증 및 재생 효과>
도 4는 항암 김치의 항 염증 작용 및 재생에 대한 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것으로서 이를 바탕으로 설명한다.
헬리코박터의 감염 이후 증가된 COX-2의 발현은 중요 염증 메커니즘 중의 하나로서 도 4A에서 보듯이, COX-2의 발현은 대조군 그룹에서 상당히 증가하였다(p<0.01). 또한 헬리코박터 감염에서 F4/80 항체의 면역 염색으로 대식세포와 단핵백혈구가 집중적으로 증가하였다. 그러나, 항암 김치 추출물을 처리한 그룹에서는 COX-2의 발현이 감소되었다(p<0.01).
대식세포 침입 후에 염증 조절 인자는 산화-환원반응 전사 활성화 관련되어 있기 때문에 NF-kB p65의 면역염색을 수행하였고, 헬리코박터에 감염된 위 점막에서 대조군 그룹은 상당히 NF-kB의 발현이 증가한 것을 확인한 반면에, 항암 김치 추출물이 처리된 그룹에서는 발현이 유의미하게 감소되었다(p<0.01).
위 점막 COX-2 발현의 웨스턴 블럿(Western blot) 분석에서, 헬리코박터 감염 후에 COX-2는 상당히 증가되었으나(p<0.01), 항암 김치 추출물이 처리된 그룹에서는 COX-2의 발현이 유의미하게 감소하였다(p<0.05).
대조군 그룹에서는 IL-6와 STAT3 활성이 상당히 증가하였으나, 항암 김치가 처리된 그룹에서는 IL-6와 STAT3활성이 유미의하게 감소되는 것을 알 수 있었다(p<0.05).
ELISA를 통해 Cox-2의 산물인 PGE2의 측정하였으며, 위 점막 PGE2 농도는 5mg/ml 농도의 항암 김치 추출물이 처리된 그룹에서 상당히 감소되었다(p<0.01).
NF-kB 활성화와 관련된 산화 스트레스는 과산화 지방질인 MDA의 농도를 통해 알 수 있는데, 헬리코박터의 감염에 의해 MDA의 농도가 상당히 증가하였으나, 항암 김치 추출물 투여로 MDA의 농도가 유의미하게 감소할 수 있었다(p<0.05).
대표적 항산화 단백질인 HO-1과 세포 보호 단백질인 HSP70의 발현을 각각 측정하였고, 확인한 결과 항암 김치를 처리한 그룹에서 HO-1과 HSP70의 발현이 상당히 증가하였다(p<0.05).
마지막으로, 위 축성 위염의 변화나 만성 헬리코박터 감염에 의해 위 중성 뮤신이 감소되는데, PAS staining으로 위 중성 뮤신을 측정한 결과 헬리코박터 감염 후 상당히 감소했으나, 항암 김치 추출물 투여 그룹에서는 뮤신의 수치가 감소되지 않고 유지되었다(p<0.01).
<항암 김치의 장기간 섭취로 인한 헬리코박터로 유도된 위종양 형성 예방(36주 모델)>
<36주 동안 항암 김치의 섭취로 인한 항암>
도 5는 항암 김치의 장기간 섭취로 헬리코박터로 유도된 위 종양 형성 예방에 대하여 도시한 것으로, 이를 참조하여 설명한다.
종양 형성에 항암 김치가 미치는 영향을 연구하기 위해 36주에 걸친 동물 모델 실험을 수행하였다.
헬리코박터와 관련된 위 병리로 인해 비록 헬리코박터 감염 후 약 7주 이후로 상당히 쥐의 체중이 줄어들었지만, 시작 2주로부터 그리고 29주 후에(p<0.001), 통계적으로 체중 감소의 정도가 줄어드는 것이 5mg/kg 농도의 항암 김치 추출물이 투여된 그룹에서 확인되었다(p<0.05).
헬리코박터균에 감염되고, 고염도 식이를 한 모델은 도 5C와 5D에서 보이듯이, 36주에서 상당한 위 종양뿐만 아니라 심각한 정도의 만성 위축성 위염이 만들어졌으며, 결절성 점막의 변화, 얇아진 위 점막, 선종 폴립, 중심의 궤양 형성과 함께 종양 병변이 발견되었다. 병리학적 확인에서, 상기 병변은 심각한 만성 위축성 위염, 위 궤양, 심낭종성 위염, 선종, 선암에서 보여지는 것들이다.
대조군 그룹에서 전체 총 병변 점수(gross lesion index)는 상당히 증가하였으나, 항암 김치 추출물이 투여된 그룹에서는 유의미한 감소를 보였다(p<0.05). 또한, 병리학 점수(Pathological score) 분석으로부터 얻어진 전체 모습(gross appearance)에서 비슷한 결과가 확인할 수 있었다(p<0.05).
헬리코박터 감염 모델은 대조군 그룹의 전체 확인에서 상당한 종양이 형성되었고, 이것은 위 선종과 위 선암으로 증명되었으나, 항암 김치 추출물이 투여된 그룹에서는 위 종양 형성이 상당히 감소하였다(p<0.01).
<항암 김치의 암예방 효과에 대한 메커니즘>
도 6은 항암 김치의 암 예방 효과를 설명하는 분자 생물학적 메커니즘을 도시한 것으로서, 이를 참조하여 설명한다.
헬리코박터 파이로리로 감염된 대조군 그룹은 24주 후에 COX-2 및 F/80의 발현에서 상당한 증가를 보인 보였다. COX-2를 중점으로 하여 보면, COX-2뿐만 아니리 COX-2 mRNA 발현이 헬리코박터 파이로리로 감염된 그룹 Ⅱ에서는 상당한 증가를 보였으나, 항암 김치를 섭취한 그룹 Ⅲ 및 Ⅳ에서는 상당한 감소를 보였다(p<0.01).
또한 각 그룹에 따른 macrophage 침입의 경우 헬리코박터 감염 그룹에서는 상당히 증가되었으나(p<0.01), 항암 김치를 섭취한 그룹에서 감소하였다(p<0.05).
musocal COX-2 발현에 대한 웨스턴 블롯 및 RT-PCR 분석 결과에서도 헬리코 감염 그룹과는 달리 항암 김치를 섭취한 그룹에서는 상당한 감소를 보였다.
결과적으로, 4주에 확인한 분자적인 변화와 같이, RNA와 protein 발현 수치에서 헬리코박터 감염 그룹에서 COX-2가 증가하였지만, 항암 김치를 섭취한 그룹에서는 감소하였으며, 또 IL-1β, VEGF, IL-6, MMP-2 같은 염증 및 암전이 인자 역시 감소함을 확인할 수 있었다.
Cox-2 IHC 분석에서도 같은 결과를 확인할 수 있었으며, macrophage 침입도 호전됨을 확인할 수 있었다. STAT3, IkB-a 같이 염증 조절 전사인자 및 전사인자 조절 단백질의 발현도 같은 경향을 보였으며, 헬리코 박터에 의한 apoptosis가 김치에 의해 감소됨을 TUNEL assay 와 Bax 단백진 분석을 통해 확인할 수 있었다. 그리고 김치에 의해 대표적 항산화 단백질인 HO-1, HSP70, NQO-1이 증가함을 확인할 수 있었다.
상술한 바와 같은 설명에 의하면, 본 발명에 따른 항암 김치는 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나, 산초, 배, 다시마 또는 다시마 추출액, 및 버섯 또는 버섯 추출액을 본래 김치 조리법에 더하여 헬리코박터의 돌연변이 성향을 줄이며, 장시간 항암 김치 투입시, 헬리코박터에 의한 위축성 위염의 진행을 개선 시킬 수 있으며, 헬리코박터 관련 위암을 예방할 수 있는 것으로 나타났다.
Claims (6)
- 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나,
산초,
배,
다시마 또는 다시마 추출액,
및
버섯 또는 버섯 추출액을 포함하는 김치를 유효성분으로 포함하여 헬리코박터 파이로리 원인성 위염 개선 및 헬리코박터 파이로리 원인성 위암 예방용 식품 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 김치 전체 중량에 대하여
상기 갓잎, 겨자잎 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 1.0 내지 10.0중량%,
상기 산초 0.05 내지 0.5중량%,
상기 배 1.0 내지 5.0중량%,
상기 다시마 또는 다시마 추출액 1.0 내지 5.0중량%, 및
상기 버섯 또는 버섯 추출액이 1.0 내지 5.0중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 원인성 위염 개선 및 헬리코박터 파이로리 원인성 위암 예방용 식품 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 버섯이 표고버섯인 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 원인성 위염 개선 및 헬리코박터 파이로리 원인성 위암 예방용 식품 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 다시마 추출액 및 버섯 추출액의 추출 용매가 물인 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 원인성 위염 개선 및 헬리코박터 파이로리 원인성 위암 예방용 식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 스타터(starter)로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 헬리코박터 파이로리 원인성 위염 개선 및 헬리코박터 파이로리 원인성 위암 예방용 식품 조성물.
- 삭제
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KR102060720B1 (ko) | 2018-05-30 | 2019-12-30 | 농업회사법인 (주)다모 | 면역 증진 활성을 가지는 김치용 소스의 제조방법 |
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KR20170058509A (ko) | 2017-05-29 |
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