KR101762798B1 - 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물 - Google Patents
아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살모넬라균에 대해 우수한 항균활성효과를 가질 뿐만 아니라 살모넬라균의 장조직 침투 억제 효과를 나타내는 아교 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물, 기능성 식품 또는 가축용 사료의 활성성분 에 관한 것이다.
Description
본 발명은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물, 살모넬라 감염증의 예방 및 개선에 대한 기능성 식품, 살모넬라 감염증의 예방 및 개선에 대한 가축용 사료에 관한 것이다.
아교는 동물의 가죽이나 뼈를 원료로 하여 짐승에서 얻은 것이며 보통 황갈색 고체이고, 물을 가하면 수용액은 콜로이드가 되고, 가열하면 졸상태, 냉각하면 겔상태가 된다. 주성분으로는 콜라겐과 젤라틴이 대부분이며 일부 단백질을 함유하고 있다. 한의학계에서 허리나 배의 통증 완화, 관절염 및 혈액순환에 도움을 준다고 알려져 있다. 하지만 아교의 효능에 관한 연구가 미비하며 특히 아교 추출물의 항균활성 관련 연구는 보고된 것이 없다.
살모넬라균은 장내세균과(Enterobacteriaceae)로서 그람 음성의 보통 혐기성 세균 1속이고 아포를 형성하지 않는 간균이며 인간을 포함한 동물의 장내에 감염되어 다양한 질병들을 일으키는 병원성 미생물이다.
살모넬라균은 크게 분류학적으로는 살모넬라 본고리아(Salmonella bongoria) 와 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 의 2종이 있을 뿐이지만 혈청형에 의해 타이피무리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 타이피(Typhi), 파라타이피(Paratyphi), 더블린(Dublin), 아고나(Agona), 콜레라수이스(Choleraesuis) 등으로 분류한다.
살모넬라균에 의해 일어나는 살모넬라증(salmonellosis)은 사람을 포함한 동물에서 나타나는 급성 또는 만성의 소화기 질병으로, 사람에서의 살모넬라증은 타이피와 파라타이피 등에 의해 일어나는 티푸스증과 그 외의 혈청형을 가진 살모넬라균으로부터 일어나는 급성위장염으로 구분할 수 있다. 동물에서는 더블린에 의한 소의 티푸스증, 콜레라수이스에 의한 돼지의 티푸스증 등이 있다. 살모넬라균이 혼입,증식된 음식물을 먹으면 균은 다시 장내에서 증식하고, 장에서 생긴 균의 독소에 의하여 중독이 일어난다.
엔테리티디스 및 타이피로 인하여 가금, 양돈, 소에서 살모넬라증이 발병하면 약물로는 완치시키기가 매우 어렵다고 알려져 있다. 이는 살모넬라균이 다양한 약물에 강한 내성을 가지며, 임상증상을 보이는 동안 일반적인 항생제가 침투할 수 없는 세포내에서 기생하기 때문이다. 그로 인해 현재까지 항생제를 포함하여 엔테리티디스와 타이피로 인하여 발병되는 살모넬라증을 억제하기 위한 효과적인 방법이 없다. 이렇게 항생제에 강한 내성을 가지는 살모넬라균은 최근 세계 각지에서 보고되고 있으며 해마다 많은 사람들이 항생제 내성 균주에 의해 피해를 입고 있어 그 문제가 심각한 상황이다. 때문에 세계적으로 신규 항생제를 개발하기 위한 많은 노력들이 이루어지고 있다. 하지만 현재 신약 개발은 큰 진전이 없는 상황이다. 따라서 신약 개발과 동시에 기존의 항생제를 적절히 처방하며 균주의 내성을 최소화 하는 방법이 필요할 뿐만 아니라 천연물 유래 항균활성 신소재를 발굴하는 것 또한 반드시 진행해야 할 연구라고 볼 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 살모넬라에 항균활성을 가지는 천연물 유래 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 아교 추출물의 항균활성 및 세균의 조직 침투 억제 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 위한 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아교 추출물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서의 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물을 구체적으로 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “아교”란 동물의 가죽이나 뼈를 원료로 하여 짐승에서 얻은 것이며 보통 황갈색 고체이고, 물을 가하면 수용액은 콜로이드가 되고, 가열하면 졸상태, 냉각하면 겔상태가 되는 물질을 의미한다. 주성분으로는 콜라겐과 젤라틴이 대부분이며 일부 단백질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 동물은 당나귀 또는 소일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 “추출물”이란 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온상태에서 일정시간동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 상기 용매는 물, C1내지 C10의 알코올 및 헥산(Hexane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 “살모넬라균” 또는 “살모넬라”는 예를 들어, 타이피무리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 타이피(Typhi), 파라타이피(Paratyphi), 더블린(Dublin), 아고나(Agona) 및 콜레라수이스(Choleraesuis)이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 “항균”이란 균의 성장을 억제하거나 사멸을 촉진하는 것으로, 본 명세서에서는 멸균, 살균, 제균, 정균과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 조성물은 살모넬라균의 성장억제 또는 사멸, 또는 살모넬라균의 침투단백질의 발현 감소를 유발할 수 있다. 상기 침투단백질은 SipA, SipB 또는 SipC일 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 “살모넬라균 감염증”은 살모넬라균 감염에 의하여 나타나는 질병으로, 예를 들어 위장질환일 수 있으며, 구체적으로 티푸스증, 급성위장염, 식중독, 설사 및 탈수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 아교 추출물을 개체에 투여하여 살모넬라균 감염증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료" 또는 "개선"이란, 본 발명의 상기 조성물을 살모넬라균 감염증 발병 의심 개체에 투여하여 살모넬라균 감염증의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 살모넬라균 감염증 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 아교 추출물을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 아교 추출물을 포함하는, 살모넬라균 감염증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 살모넬라균 감염증은 상기한 바와 같다. 상기 아교 추출물은 천연 물질로서 오랫동안 사용되어 안정성이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.
건강기능식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 아교 추출물을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 위한 사료용 조성물을 제공한다.
상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 아교 추출물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 살모넬라균 감염증이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 살모넬라균 감염증이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 아교 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물은 살모넬라균에 우수한 항균활성을 가지며 살모넬라균의 장조직 침투 억제 효과를 나타내므로 항균용 약학적 조성물, 기능성 식품 또는 가축용 사료의 활성성분으로 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 아교 에탄올 추출물의 세포독성 실험 결과를 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군.
도 2는 디스크확산법 (Agar well diffusion assay)를 이용한 아교 추출물의 항균성 실험 결과를 나타낸다. Ampicillin: 암피실린 처리, E 91: 아교 에탄올 추출물(실시예 1) 처리, W 91: 아교 물 추출물(실시예 2) 처리.
도 3은 아교 추출물의 농도 별 배양 시간에 따른 박테리아 생장곡선을 나타낸 것이다. a는 대조군(무처리), b는 아교 추출물을 처리한 경우, c는 암피실린을 처리한 경우를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE를 통한 아교 추출물의 농도별 침투단백질 발현 분석 결과를 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, SipA: 침투단백질 A, SipB: 침투단백질 B, SipC: 침투단백질 C.
도 5는 정량적 Real-Time PCR을 통한 아교 추출물의 농도별 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, * p < 0.05 로 나타내었다.
도 6은 아교 추출물의 농도에 따른 살모넬라균의 세포침투율을 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, * p < 0.05 로 나타내었다.
도 7은 마우스 회장 절편 조직 염색 실험 결과를 보여준다. DAPI: 장조직의 염색결과, Anti-LPS: 살모넬라균의 염색결과, Merged: DAPI와 Anti-LPS 사진을 병합한 결과 Control: 살모넬라균 처리 및 아교 추출물 처리를 하지 않은 대조군, Salmonella typhimurium: 살모넬라균을 처리한 장조직, Salmonella typhimurium + E91 100mg/kg: 아교 에탄올 추출물을 100mg/kg으로 처리 후 살모넬라균을 처리한 장조직 Salmonella typhimurium + E91 200mg/kg: 아교 에탄올 추출물을 200mg/kg으로 처리 후 살모넬라균을 처리한 장조직.
도 2는 디스크확산법 (Agar well diffusion assay)를 이용한 아교 추출물의 항균성 실험 결과를 나타낸다. Ampicillin: 암피실린 처리, E 91: 아교 에탄올 추출물(실시예 1) 처리, W 91: 아교 물 추출물(실시예 2) 처리.
도 3은 아교 추출물의 농도 별 배양 시간에 따른 박테리아 생장곡선을 나타낸 것이다. a는 대조군(무처리), b는 아교 추출물을 처리한 경우, c는 암피실린을 처리한 경우를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE를 통한 아교 추출물의 농도별 침투단백질 발현 분석 결과를 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, SipA: 침투단백질 A, SipB: 침투단백질 B, SipC: 침투단백질 C.
도 5는 정량적 Real-Time PCR을 통한 아교 추출물의 농도별 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, * p < 0.05 로 나타내었다.
도 6은 아교 추출물의 농도에 따른 살모넬라균의 세포침투율을 나타낸다. CON: 아교 추출물을 처리하지 않은 대조군, * p < 0.05 로 나타내었다.
도 7은 마우스 회장 절편 조직 염색 실험 결과를 보여준다. DAPI: 장조직의 염색결과, Anti-LPS: 살모넬라균의 염색결과, Merged: DAPI와 Anti-LPS 사진을 병합한 결과 Control: 살모넬라균 처리 및 아교 추출물 처리를 하지 않은 대조군, Salmonella typhimurium: 살모넬라균을 처리한 장조직, Salmonella typhimurium + E91 100mg/kg: 아교 에탄올 추출물을 100mg/kg으로 처리 후 살모넬라균을 처리한 장조직 Salmonella typhimurium + E91 200mg/kg: 아교 에탄올 추출물을 200mg/kg으로 처리 후 살모넬라균을 처리한 장조직.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 아교 에탄올 추출물의 제조
한약재인 아교 50g을 정밀하게 달아 70% 에탄올 300mL을 넣고 진탕배양기를 이용하여 24시간 추출 (40℃, 100rpm)한 다음 여과 (일반 여과지)하였다. 잔류물에 다시 70% 에탄올 90mL를 넣고 1분간 흔들어 씻은 다음 여과하였다. 여과한 용액은 농축기로 유기용매를 날린 후 deep freezer (-80℃) 에서 냉각한다. 그 후 동결상태로 동결건조기에 넣고 약 1주일간 건조를 진행한 후 파우더 상태의 시료를 회수하였다 (yield : 1.66%).
실시예 2: 아교 물 추출물의 제조
한약재인 아교 50g을 정밀하게 달아 물 300ml을 넣고 진탕배양기를 이용하여 24시간 추출 (40℃, 100rpm)한 다음 여과 (일반 여과지)하였다. 잔류물에 다시 물 90ml를 넣고 1분간 흔들어 씻은 다음 여과하였다. 여과한 용액은 농축기로 유기용매를 날린 후 deep freezer (-80℃) 에서 냉각한다. 그 후 동결상태로 동결건조기에 넣고 약 1주일간 건조를 진행한 후 파우더 상태의 시료를 회수하였다.
실험예 1: 아교 추출물의 세포 독성 확인
아교 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, 대장 상피세포주인 Caco-2에 아교 추출물을 처리하였다. 세포의 생존율은 키트를 이용하여 측정하였다. 먼저, Caco-2 세포를 96 웰 플레이트에 1 x 105 cells/well의 세포수로 분주하여 24시간 배양한 후, 아교 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후, CCK-8 용액을 10㎕씩 넣고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이를 통해 발색된 플레이트는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 도 1에 나타난 바와 같이 아교 추출물은 높은 농도에서도 대장암 세포인 caco-2세포에서 독성을 나타내지 않았다.
실험예 2: 아교 추출물의 살모넬라균에 대한 항균성 실험
2-1: 균주의 출처 및 배양 조건
사용한 박테리아는 그람 네거티브 균인 살모넬라 엔테리카 혈청형 변이주 타이피무리움 (Salmonella enterica serovar typhimurium, KCTC 1926)이며, 박테리아의 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하여 진탕배양기에서 37℃, 150 rpm으로 배양하여, 600 nm에서 배양액의 흡광도가 0.5 ~ 0.6이 되도록 배양하였다..
2-2: 디스크확산법 (Agar well diffusion assay)을 이용한 아교 추출물의 항균성 실험
낮은 녹는점을 가진 아가로스를 넣은 LB 배지에 1%의 박테리아 배양액을 페트리 접시에 넣어 고형배지를 만들고, 7 mm 직경이 되도록 고형배지에 웰을 만든 후, 단계별로 희석한 실시예 1 또는 실시예 2의 아교 추출물 (50 ㎕)을 웰 안에 투여하였다. 페트리 접시를 37℃에서 18시간 동안 배양한 후, 웰 주변에 형성된 클리어 존의 지름을 측정하였다. 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이 아교 에탄올 추출물(E91, 실시예 1)이 열수 추출물(W91, 실시예 2)에 비해 박테리아 사멸 효과가 더 뛰어난 것으로 확인되었다.
2-3: 아교 추출물의 최소 억제 농도 (MIC) 및 최소 살균 농도 (MBC) 확인 실험
MIC(Minimal Inhibitory Concentration) 검정법은 박테리아의 가시적 성장을 억제하는데 필요한 특정 항생제의 최저 농도를 측정하는데 사용되는 방법이다. 실시예 1의 아교 에탄올 추출물을 LB 배지에 2배 연속으로 희석하여 준비하였다. 박테리아 배양액은 박테리아 균수가 1×106 cfu/mL이 되도록 LB 배지로 희석하여 아교 추출물과 동량으로 플레이트에 접종하여 37℃에서 150rpm으로 진탕하여 배양하였다. 박테리아의 성장을 알아보기 위하여 배양 시간별로 600nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 3의 a)는 대조군(무처리)을 나타내었고 도 3의 b)는 아교 추출물을, 도 3의 c)는 암피실린을 처리한 결과이다. 도 3의 b)의 생장곡선을 토대로 실시예 1의 아교 에탄올 추출물의 MIC값은 0.78mg/ml으로 확인되었다.
MBC(Minimal Bactericidal Concentration)는 유기체를 사멸시키는데 필요한 시약의 최저 농도로, 최초 접종원의 생존력을 99.9% 이상 감소시키는 시약의 최소농도로 정의된다. MBC 측정을 위하여, MIC 검정으로부터 가시적 성장이 없는 농도의 박테리아 배양액을 단계적으로 희석하여 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 고체배지에 형성된 콜로니를 계수하였다. 그 결과, 하기 표 2와 같이, 최초 접종원의 생존력을 99.9% 이상 감소시키는 농도인 MBC값은 1.56mg/ml로 나타났다.
한편, 표 3에 나타난 바와 같이 아교 에탄올 추출물(#91)을 0.195mg/ml의 농도로 처리 하였을 때 살모넬라 타이피무리움의 성장에 영향을 주지 않았다. 따라서, 실험예 3에서는 이 농도를 이용하여 실험을 진행 하였다.
실험예 3: 아교 추출물에 의한 살모넬라균 장내 침투 억제 효과 확인 실험
3-1: 단백질 발현 분석
살모넬라 배양액 (1×106 cfu/mL)에 실시예 1의 아교 에탄올 추출물을 처리하고 24시간 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상층액을 시린지 필터(0.45-μm)로 여과하였다. 여과한 배양액에 100% 트리클로로아세트산을 처리하여 얻어진 단백질을 아세톤으로 세척한 후, 단백질 펠렛을 PBS에 녹여 SDS 샘플 버퍼와 혼합한 후, SDS-PAGE (10%)를 실시하였다. 겔은 쿠마시 블루로 염색하여 단백질의 발현량을 분석하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 박테리아의 침투단백질의 발현을 SDS-PAGE로 확인 한 결과 아교 추출물을 처리 하였을 때 박테리아의 성장에 영향을 주지 않는 농도인 0.195mg/ml에서도 침투단백질인 SipA, SipB 그리고 SipC의 발현량이 감소하는 것을 확인 하였다.
3-2: mRNA 발현 분석
살모넬라 배양액 (1×106 cfu/ml) 1ml과 농도별로 희석한 아교 추출물 1ml을 혼합하여, 37℃에서 150rpm으로 24시간 배양하였다. 살모넬라 배양액을 5,000rpm에서 10분간 원심분리하여 살모넬라 균을 침전시켜 상등액을 제거한 후, TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 분리하였다. AccuPower Cycle Script RT premix를 사용하여 cDNA를 합성하였고, Quantitative Real-Time PCR 방법을 이용하여 살모넬라 침투 단백질인 SipA, SipB 그리고 SipC의 mRNA의 발현량을 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이 박테리아에 아교추출물을 처리하고 mRNA을 취한다음 real-time PCR로 확인한 결과 박테리아의 성장에 영향을 주지 않는 농도인 0.195mg/ml에서도 침투단백질의 mRNA발현량 역시 감소 한 것을 확인 하였다.
3-3: 세포침투율 분석
대장암 세포주인 caco-2세포에 (1 x 106 cells/well, 6 well plate) 박테리아를 감염 시키기 1시간 전에 아교 추출물을 처리하고, 살모넬라 타이피무리움을 감염시킨 후 (1×108 cfu/ml) 항생제를 포함하지 않는 배지에서 1시간동안 배양하였다. 그 후, PBS와 겐타마이신(100ug/ml)을 이용하여 부착하지 않거나 세포내로 침투하지 못한 박테리아를 제거하고, 1% TritonX-100을 이용하여 세포를 파괴하고 세포내로 침투한 박테리아를 취했다. 고형배지에 플레이팅 하고 24시간후에 콜로니의 수를 확인 하였다 도 6에 나타난 바와 같이 아교 추출물이 박테리아 성장에 영향을 주지 않는 0.195mg/ml의 농도에서도 mRNA발현과 같이 세포내로 침투한 박테리아의 수가 유의적으로 감소한 것을 확인 하였다.
3-4: 마우스 조직 염색
본 실험은 박테리아 시험감염 3일 전에 아교 추출물을 100mg/kg, 200mg/kg 농도로 1일 1회 경구투여하여 진행하였다. 실험동물은 6 내지 8주령의 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 아교 추출물의 잠재적 독성을 조사하기 위해 박테리아로 감염시키지 않은 약물 투여군을 대조군으로 사용하였다. 살모넬라 타이피무리움 (5 × 107 bacteria / 100ul)을 경구투여하여 감염시킨 2일 후에, 각 그룹의 마우스를 희생시킨 후, 회장 부분을 표본제작하여 조직면역법(anti-LPS salmonella typhirium)을 이용하여 작은 창자에 침투한 박테리아를 확인하였다. 도 7에 나타난 바와 같이 아교 추출물은 박테리아의 장내로의 침투를 유의적으로 감소 시키는 것을 확인 할 수 있었다.
이는 아교추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 약학적 조성물의 살모넬라균에 대한 항균효과 및 장조직 침투 억제 효과를 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서 상기 아교 추출물은 물, C1내지 C10의 알코올 및 헥산(Hexane)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서 상기 살모넬라균은 타이피무리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 타이피(Typhi), 파라타이피(Paratyphi), 더블린(Dublin), 아고나(Agona), 콜레라수이스(Choleraesuis) 인 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 살모넬라균의 성장억제 또는 사멸, 또는 침투단백질의 발현 감소를 유발하는 것인 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서 상기 침투단백질은 SipA, SipB 또는 SipC인 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서 상기 아교 추출물의 농도는 살모넬라균의 항균 용도에 0.78mg/ml 이상 1.56mg/ml미만의 농도를 사용하는 것인 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물.
- 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서 살모넬라균 감염증은 티푸스증, 급성위장염, 식중독, 설사 및 탈수인 약학적 조성물.
- 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품용 조성물.
- 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 개선을 위한 사료용 조성물.
- 아교 추출물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 살모넬라균 감염증의 예방 또는 치료 방법.
Priority Applications (1)
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| KR1020160130088A KR101762798B1 (ko) | 2016-10-07 | 2016-10-07 | 아교 추출물을 포함하는 살모넬라균에 대한 항균용 약학적 조성물 |
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| KR (1) | KR101762798B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102172571B1 (ko) | 2020-06-18 | 2020-11-02 | 원광대학교산학협력단 | 미세먼지 유발 호흡기 염증 및 민감성 개선용 복합제제 |
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2016
- 2016-10-07 KR KR1020160130088A patent/KR101762798B1/ko active IP Right Grant
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