KR101806314B1 - 바이러스 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

바이러스 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감수성 바이러스 감염증, 특히 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염증, 뿐만 아니라 HBV 및/또는 HIV와 같은 다른 바이러스와의 HCV의 동시 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 화학식 (I), 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 입체이성질체, 토토머, 용매화물, 전구약물, 또는 이들의 조합을 갖는 조성물, 및 바이러스 감염증을 치료함에 있어서 이들의 용도를 제공한다:

Description

바이러스 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING VIRAL INFECTIONS}
본 출원은 2008년 4월 3일에 출원된 미국가출원번호 61/072,794호; 2008년 4월 3일에 출원된 미국가출원번호 61/072,799호; 및 2008년 6월 20일에 출원된 미국가출원번호 61/074,421호를 우선권으로 주장한다. 상기 출원의 전체 교시는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
전세계적으로 1억 7천만명 이상이 C형 간염 바이러스에 감염되고 있다. 현재의 치료법은 용량-제한 독성을 가지며, 상당히 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다. HCV 폴리머라제, HCV 프로테아제 및 HCV NS5A를 타겟으로 하는 여러 화합물들이 개발되고 있다. 그러나, 바이러스 복제 사이클은 상당히 오류가 발생하기 쉬워서 특히 항바이러스 치료의 선택적 압력 하에서 내성 돌연변이체(resistant mutant)를 출현시킨다. 이는 항바이러스 치료 요법을 개발하는데 상당한 어려움을 야기시킨다.
현재까지, 개발된 대부분의 항-HCV 제제는 HCV 폴리머라제 억제제이다. NS3 프로테아제 억제제 BILN-2061은 환자에게서 상당한 바이러스 양의 감소를 형성시키기 위해 인간에게 시험된 최초의 화합물이다. 뉴클레오시드 유사체 NM 283은 HCV-감염된 환자들에게서 항바이러스 효과를 나타내었다. 그러나, 임상에서 수개의 화합물들이 이미 상당한 약물 내성 및 독성을 나타내었다. 몇몇 항바이러스 화합물들은 임상 개발 단계에 있다. 예를 들어, 비-뉴클레오시드 벤조티아디아진, 아실 피롤리딘, 벤조푸란, 페닐 알라닌, 치환된 티오펜, 디히드로피라논, 피라노인돌, 벤즈이미다졸, 및 인돌은 NS5B 폴리머라제 도메인의 억제제인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 시험관내 레플리콘 검정에서 상이한 약물들이 상당한 교차 내성을 나타내었다.
항바이러스 약물에 대한 내성 발달이 실제로 확실하기 때문에, 이를 공략하기 위한 하나의 방법은 교차 내성 돌연변이체를 촉진시키지 않을 수 있는 약물을 포함하는 치료들을 조합하는 것이다. 일반적으로, 상이한 바이러스 효소를 초래하는 약물들은 교차 내성을 나타내지 않고 성공적으로 조합하여 사용될 수 있다. 이에 따라, 교차 내성을 나타내지 않는 상이한 작용 메카니즘을 갖는 상이한 약물들의 조합은 성공적인 항바이러스 치료법에 대한 열쇠일 것이다.
20-mer 올리고뉴클레오티드와 비교하여 보다 적은 숫자의 전하 및 적은 분자량을 갖는 보다 짧은 사슬 올리고뉴클레오티드 (8-mer 미만)는 항바이러스로서 잠재적인 치료학적 성질들을 갖는 유망한 새로운 분자들의 부류를 나타낸다. 또한, 최근의 보고서에서는 모노-, 디-, 트리-, 및 짧은 사슬 올리고뉴클레오티드가 다양한 치료학적 적용을 위해 이용될 수 있는 상당한 생물학적 활성을 가지고 있다는 것이 제시되어 있다. 그러나, 경구, 경피 또는 환자에 대한 다른 비-침습적 전달 모드에 대한 개선된 성질을 갖는 개선된 짧은 올리고뉴클레오티드는 여전히 단독 치료제로서 또는 조합 치료에서 사용하기 위해 요구되고 있다.
본 발명은 감수성 바이러스 감염증, 특히 C형 간염 바이러스(HCV) 감염증 뿐만 아니라 HBV 및/또는 HIV와 같은 다른 바이러스와 HCV의 동시 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 (I), 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 입체이성질체, 토토머, 용매화물, 전구약물, 또는 이들의 조합을 갖는 조성물, 및 바이러스 감염증을 치료함에 있어서의 이들의 용도를 제공한다:
Figure 112016016769190-pat00001
상기 식에서,
N1 및 N2는 독립적으로 천연 뉴클레오시드 또는 개질된 뉴클레오시드로부터 선택되며;
W, X, Y 및 Z는 각각 독립적으로 O, S 및 NR1으로부터 선택되며, 여기서 R1은 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며;
R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
A는 부재이거나, 치환되거나 비치환된 방향족기이며;
J는 부재이거나, CR6R7, O, S 또는 NR1이며, 여기서 R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며, R1은 상기에서 정의된 바와 같으며;
M은 부재이거나, CR8R9, O, S 또는 NR1이며, 여기서 R8 및 R9는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며, R1은 상기에서 정의된 바와 같으며;
V는 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기이며;
Q는 부재이거나, 개질되거나 비개질된 뉴클레오티드이며;
m은 1, 2, 3 또는 4이다.
본 발명은 감수성 바이러스 감염증, 특히 C형 간염 바이러스 감염증을 치료하기 위한 짧은 뉴클레오티드 조성물 및 방법을 제공한다. 용어 "짧은 뉴클레오티드(들)"는 1개 내지 약 6개의 연결된 뉴클레오시드 단위로 형성된 모노뉴클레오티드, 디뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 칭한다. 본 발명은 또한 모노뉴클레오시드 화합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "감수성 바이러스 감염증"은 속 플라비바이러스를 포함하는 플라비바이러스, 쿤진 바이러스(Kunjin virus)가 이의 일부인 페스티바이러스, 및 C형 간염 바이러스가 이의 일부인 헤파바이러스, 및 웨스트 나일 바이러스가 이의 일부인 아르보바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 아레나바이러스, 부니아바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 및 레트로바이러스와 같은 바이러스의 패밀리를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 광범위한 RNA 바이러스 및 DNA 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염증을 의미한다. 통상적인 적합한 "감수성 바이러스 감염증"은 인플루엔자 A 감염증 및 B 바이러스 감염증; 파라인플루엔자 바이러스 감염증, 호흡기 세포융합 바이러스("RSV") 감염증, 예를 들어 RSV 세기관지염 및, RSV 폐렴, 특히, 아동 및 유아의 RSV 감염증 뿐만 아니라 이미 존재하는 심폐 질환을 지닌 환자의 RSV 폐렴, 홍역 바이러스 감염증, 라사열 바이러스 감염증, 한국형 출혈열 감염증, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염증, 크리미안 콩고 출혈성 및 HCV 감염증 및 HIV-1 감염증, 웨스트 나일 바이러스 또는 쿤진 바이러스에 의해 야기되는 뇌염 감염증, 또는 세인트 루이스 뇌염 감염증, 뿐만 아니라 면역저하된 환자에게서 발견된 바이러스 감염증을 포함한다. 다른 감수성 바이러스 감염증은 미국특허번호 제4,211,771호, 컬럼 2, 21줄에서 컬럼 3, 37줄에 기재되어 있으며; 복용량 및 투여 요법 및 제형은 컬럼 3, 4줄에서 컬럼 9, 5줄에 기재되어 있다. 일 구체예에서, 바이러스 감염증은 단지 HBV 감염증만이 아니며, 바이러스 감염증은 HCV와 같은 다른 바이러스와의 HBV 동시 감염증일 수 있다.
감수성 바이러스 감염증 및 특히 HCV 감염증 뿐만 아니라 HBV 및/또는 HIV와 같은 다른 바이러스와의 HCV의 동시 감염증을 치료하기 위해 적합한 본 발명의 조성물은 화학식 (I) 내지 화학식 (IV)의 화합물로 표시된다. 하기 화학식들 중 일부에서, 뉴클레오시드 단위는 선 그림(line drawing)의 국제적으로 허용되는 협약에 의해 표시된다. 하기 예에서, 2'-치환된 리보뉴클레오시드는 통상적인 구조 및 상응하는 선 그림 포맷 둘 모두로 표시된다:
Figure 112016016769190-pat00002
α 또는 β N- 또는 C-뉴클레오시드를 발생시키는 B1 및 B2에 결합된 당 단위는 푸라노즈, 데옥시리보푸라노즈, 리보즈, 및 아라비노즈를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
제 1 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 도시된 화학식 (I)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 토토머이다.
화학식 (I)의 바람직한 아속(subgenera)은 하기에 도시된 화학식 (II)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 토토머이다.
Figure 112016016769190-pat00003
상기 식에서, V, M, J, A, R2, R3, R4, R5, N1, N2, Q, m 및 n은 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다.
본 발명에 따른 대표적인 화합물은 하기 화학식 (A1)의 화합물 (1) 내지 화합물 (8)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다:
Figure 112016016769190-pat00004
상기 식에서, V, M, R10 및 R11은 하기 표 1에서 각 예에 대해 기술되어 있다:
Figure 112016016769190-pat00005
본 발명에 따른 대표적인 화합물은 하기 화학식 (B1)의 화합물 (9) 내지 화합물 (16)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다:
Figure 112016016769190-pat00006
상기 식에서, V, M, R10 및 R11은 하기 표 2에서 각 예에 대해 기술되어 있다:
Figure 112016016769190-pat00007
화학식 (I)의 화합물의 예는 하기의 화합물들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure 112016016769190-pat00008
Figure 112016016769190-pat00009
Figure 112016016769190-pat00010
Figure 112016016769190-pat00011
화학식 (I)의 화합물들의 다른 예는 하기의 화합물들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure 112016016769190-pat00012
상기 식에서, B1 및 B2는 자연 발생 핵염기 또는 개질된 염기이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르, 입체이성질체, 토토머, 용매화물, 전구약물, 또는 이들의 조합, 및 바이러스 감염증을 치료함에 있어 이들의 용도를 제공한다:
Figure 112016016769190-pat00013
상기 식에서, M' 및 M"는 각각 독립적으로 CH2, NH, NR", O, 및 S로부터 선택되며; R"는 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기이며;
X'는 O, NH, NR", 또는 S이며; 여기서 R"는 상기에서 정의된 바와 같으며;
Y'는 OR12, NHR12, 및 SR12이며; 여기서 각 R12는 독립적으로 H, 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며;
Z' 및 Z"는 각각 독립적으로 O, NR13, 및 S이며; 여기서 R13은 H, 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기이며;
R 및 R'는 각각 독립적으로 H, OH, O-알킬, O-아릴, O-헤테로아릴, O-아르알킬, O-알킬 헤테로아릴, -NH2, -NHR14, -NR15NR16, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 시클로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 아르알킬, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로시클릭이며, 여기서 R14, R15 및 R16은 각각 독립적으로 H, 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되며;
B1 및 B2는 각각 독립적으로 부재이거나, H, 자연 발생 핵염기 및 개질된 염기로부터 선택되며;
Q'는 부재이거나,
Figure 112016016769190-pat00014
이며;
여기서 X' 및 Y'는 상기에서 정의된 바와 같으며, A는 OH, O-알킬, O-아릴, O-헤테로아릴, O-아르알킬, 또는 O-알킬 헤테로아릴이다.
바람직한 구체예에서, B1 및 B2 중 적어도 하나는 독립적으로 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112016016769190-pat00015
화학식 (III)의 화합물들의 특정 예는 하기 화합물들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure 112016016769190-pat00016
Figure 112016016769190-pat00017
상기 화학식에서, R은 10개 이하의 원자의 골격을 갖는 치환되거나 비치환된 지방족기이며, 바람직하게 R은 장쇄 지방산이다.
화학식 (III)의 추가적인 화합물들은 하기 화합물들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
Figure 112016016769190-pat00018
상기 화학식에서, B1 및 B2는 독립적으로 자연 발생 핵염기 또는 개질된 염기이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 화학식 (IV)를 갖는 화합물, 및 바이러스 감염증을 치료함에 있어서 이들의 용도를 제공한다:
Figure 112016016769190-pat00019
상기 식에서, M'는 CH2, NH, NR", O, 및 S로부터 선택되며; 여기서 R"는 치환되거나 비치환된 지방족기 또는 치환되거나 비치환된 방향족기이며;
X는 O, NH, NR", 또는 S이며, 여기서 R"는 상기에서 정의된 바와 같으며;
Z'는 H, OH, OR", OR17, COOH, COOR", NH2, NHR", NHR17이며, 여기서 R"는 상기에서 정의된 바와 같으며, R17은 아로일 (CO-Ph), 설포닐 (SO2-R), 우레이딜 (CO-NH-R), 티오우레이딜 (CS-NH-R)이며, 여기서 R은 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되지만, M'가 O인 경우, Z'는 OH가 아니며;
R'는 H, OH, O-알킬, O-아릴, O-헤테로아릴, O-아르알킬, O-알킬 헤테로아릴, O-아로일, -NH2, -NHR1, -NR1NR2 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로시클릭이며, 여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나 비치환된 지방족기 및 치환되거나 비치환된 방향족기로부터 선택되지만, M'가 O인 경우, R'는 OH가 아니며;
B1은 H, 자연 발생 핵염기 또는 개질된 염기이다.
바람직한 구체예에서, 화학식 (IV)의 R, R1 및 R2는 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 시클로알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 아르알킬, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로시클릭이다.
화학식 (IV)의 화합물의 비제한적인 예는 하기 화합물을 포함한다:
Figure 112016016769190-pat00020
하기에는 본 발명을 기술하기 위해 사용되는 여러 용어들의 정의가 나열되어 있다. 이러한 정의들은 특정 예에서 개별적으로 또는 보다 큰 그룹의 일부로서 제한되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에서 사용되는 용어에 적용된다.
"지방족"은 탄소 원자, 수소 원자, 할로겐 원자, 산소, 질소, 황 또는 다른 원자들의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 임의적으로 하나 이상의 불포화 단위, 예를 들어 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 함유하는 비-방향족 부분이다. 지방족기는 직쇄형, 분지형 또는 환형일 수 있고, 바람직하게 약 1개 내지 약 24개의 탄소 원자, 보다 통상적으로 약 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 함유한다. 지방족 탄화수소 기 이외에, 지방족기는 예를 들어 폴리알콕시알킬, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 폴리아민, 및 폴리이민을 포함한다. 본원에 기술되는 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐 및 시클로알킬 부분이 또한 지방족기, 지환족기 또는 헤테로시클릭기일 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 지방족기는 추가로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 인데닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모노- 또는 폴리시클릭 카르보시클릭 고리 시스템을 칭한다. 용어 아릴은 2개의 고리로 이루어진 고리 시스템을 갖는 비시클릭 아릴 또는 비시클릭 헤테로아릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 적어도 하나의 고리는 방향족이다. 용어 아릴은 3개의 고리로 이루어진 고리 시스템을 갖는 트리시클릭 아릴 또는 트리시클릭 헤테로아릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 적어도 하나의 고리는 방향족이다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 고리 원자가 S, O 및 N으로부터 선택되고, 나머지 고리 원자가 탄소인 모노- 또는 폴리시클릭 방향족 라디칼을 칭하는 것으로서, 여기서 고리내에 포함된 임의의 N 또는 S는 임의적으로 산화될 수 있다. 헤테로아릴은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 본원에 기술되어 있는 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴 중 임의의 것은 또한 임의의 방향족기일 수 있다. 이에 따라, 본원에서 사용되는 용어 "방향족기"는 모든 이러한 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 치환된 헤테로아릴을 포함한다. 방향족기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 포화된, 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 칭하는 것으로서, 바람직하게 1개 내지 24개의 탄소 원자를 포함한다. 알킬 라디칼의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 3차-부틸, 네오펜틸, n-헥실, 헵틸 및 옥틸 라디칼, 데실, 도데실 라디칼을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 단일 탄소 원자의 제거에 의해 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 적어도 2개, 및 바람직하게 2개 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 칭한다. 알케닐기는 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일, 헵테닐, 옥테닐, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "알키닐"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 적어도 2개의 탄소 원자 및 바람직하게 2개 내지 8개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 칭한다. 대표적인 알키닐기는 예를 들어 에티닐, 1-프로피닐, 1-부티닐, 헵티닐, 옥티닐, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "시클로알킬"은 모노시클릭 또는 폴리시클릭 포화된 카르보시클릭 고리 화합물을 칭한다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸; 비시클로 [2.2.1] 헵틸, 및 비시클로 [2.2.2] 옥틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "시클로알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 카르보시클릭 고리 화합물을 칭한다. 시클로알케닐의 예는 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐, 시클로옥테닐, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술되는 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐 및 시클로알킬 부분은 또한 상기 기술된 지방족기, 지환족기, 또는 헤테로시클릭기일 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "지환족"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 모노시클릭 또는 비시클릭 포화된 카르보시클릭 고리 화합물로부터 유도된 일가 기를 의미한다. 이의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 비시클로 [2.2.1] 헵틸, 및 비시클로 [2.2.2] 옥틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 지환족기들은 추가로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클로알킬"은 교호적으로 사용될 수 있는 것으로서, 비-방향족 고리 또는 비- 또는 트리-시클릭 기 융합 시스템을 칭하는 것이며, 여기서 (i) 각 고리 시스템은 독립적으로 산소, 황 및 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하며, (ii) 각 고리 시스템은 포화되거나 불포화될 수 있으며, (iii) 질소 및 황 헤테로원자는 임의적으로 산화될 수 있으며, (iv) 질소 헤테로원자는 임의적으로 4차화될 수 있으며, (v) 상기 고리들 중 임의의 것은 방향족 고리에 융합될 수 있으며, (vi) 나머지 고리 원자들은 임의적으로 옥소-치환될 수 있는 탄소 원자이다. 대표적인 헤테로시클릭 기는 1,3-디옥솔란, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 및 테트라히드로푸릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 헤테로시클릭 기들은 추가로 치환될 수 있다.
용어 "치환된"은 방향족기 또는 지방족기와 같은 부분 상에서 1개, 2개 또는 3개 또는 그 이상의 수소 원자의, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, 보호된 히드록시, -NO2, -CN, -NH2, 보호된 아미노, 옥소, 티옥소, 스테로이달,(steroidal), -NH-C1-C12-알킬, -NH-C2-C8-알케닐, -NH-C2-C8-알키닐, -NH-C3-C12-시클로알킬, -NH-아릴, -NH-헤테로아릴, -NH-헤테로시클로알킬, -디알킬아미노, -디알릴아미노, -디헤테로아릴아미노, -O-C1-C12-알킬, -O-C2-C8-알케닐, -O-C2-C8-알키닐, -O-C3-C12-시클로알킬, -O-아릴, -O-헤테로아릴, -O-헤테로시클로알킬, -C(O)-C1-C12-알킬, -C(O)-C2-C8-알케닐, -C(O)-C2-C8-알키닐, -C(O)-C3-C12-시클로알킬, -C(O)-아릴, -C(O)-헤테로아릴, -C(O)-헤테로시클로알킬, -CONH2, -CONH-C1-C12-알킬, -CONH-C2-C8-알케닐, -CONH-C2-C8-알키닐, -CONH-C3-C12-시클로알킬, -CONH-아릴, -CONH-헤테로아릴, -CONH-헤테로시클로알킬, -OCO2-C1-C12-알킬, -OCO2-C2-C8-알케닐, -OCO2-C2-C8-알키닐, -OCO2-C3-C12-시클로알킬, -OCO2-아릴, -OCO2-헤테로아릴, -OCO2-헤테로시클로알킬, -OCONH2, -OCONH-C1-C12-알킬, -OCONH-C2-C8-알케닐, -OCONH-C2-C8-알키닐, -OCONH-C3-C12-시클로알킬, -OCONH-아릴, -OCONH-헤테로아릴, -OCONH-헤테로시클로알킬, -NHC(O)-C1-C12-알킬, -NHC(O)-C2-C8-알케닐, -NHC(O)-C2-C8-알키닐, -NHC(O)-C3-C12-시클로알킬, -NHC(O)-아릴, -NHC(O)-헤테로아릴, -NHC(O)-헤테로시클로알킬, -NHCO2-C1-C12-알킬, -NHCO2-C2-C8-알케닐, -NHCO2-C2-C8-알키닐, -NHCO2-C3-C12-시클로알킬, -NHCO2-아릴, -NHCO2-헤테로아릴, -NHCO2-헤테로시클로알킬, -NHC(O)NH2, -NHC(O)NH-C1-C12-알킬, -NHC(O)NH-C2-C8-알케닐, -NHC(O)NH-C2-C8-알키닐, -NHC(O)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(O)NH-아릴, -NHC(O)NH-헤테로아릴, -NHC(O)NH-헤테로시클로알킬, NHC(S)NH2, -NHC(S)NH-C1-C12-알킬, -NHC(S)NH-C2-C8-알케닐, -NHC(S)NH-C2-C8-알키닐, -NHC(S)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(S)NH-아릴, -NHC(S)NH-헤테로아릴, -NHC(S)NH-헤테로시클로알킬, -NHC(NH)NH2, -NHC(NH)NH-C1-C12-알킬, -NHC(NH)NH-C2-C8-알케닐, -NHC(NH)NH-C2-C8-알키닐, -NHC(NH)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(NH)NH-아릴, -NHC(NH)NH-헤테로아릴, -NHC(NH)NH-헤테로시클로알킬, -NHC(NH)-C1-C12-알킬, -NHC(NH)-C2-C8-알케닐, -NHC(NH)-C2-C8-알키닐, -NHC(NH)-C3-C12-시클로알킬, -NHC(NH)-아릴, -NHC(NH)-헤테로아릴, -NHC(NH)-헤테로시클로알킬, -C(NH)NH-C1-C12-알킬, -C(NH)NH-C2-C8-알케닐, -C(NH)NH-C2-C8-알키닐, -C(NH)NH-C3-C12-시클로알킬, -C(NH)NH-아릴, -C(NH)NH-헤테로아릴, -C(NH)NH-헤테로시클로알킬, -S(O)-C1-C12-알킬, -S(O)-C2-C8-알케닐, -S(O)-C2-C8-알키닐, -S(O)-C3-C12-시클로알킬, -S(O)-아릴, -S(O)-헤테로아릴, -S(O)-헤테로시클로알킬 -SO2NH2, -SO2NH-C1-C12-알킬, -SO2NH-C2-C8-알케닐, -SO2NH-C2-C8-알키닐, -SO2NH-C3-C12-시클로알킬, -SO2NH-아릴, -SO2NH-헤테로아릴, -SO2NH-헤테로시클로알킬, -NHSO2-C1-C12-알킬, -NHSO2-C2-C8-알케닐, -NHSO2-C2-C8-알키닐, -NHSO2-C3-C12-시클로알킬, -NHSO2-아릴, -NHSO2-헤테로아릴, -NHSO2-헤테로시클로알킬, -CH2NH2, -CH2SO2CH3, -아릴, -아릴알킬, -헤테로아릴, -헤테로아릴알킬, -헤테로시클로알킬, -C3-C12-시클로알킬, 폴리알콕시알킬, 폴리알콕시, -메톡시메톡시, -메톡시에톡시, -SH, -S-C1-C12-알킬, -S-C2-C8-알케닐, -S-C2-C8-알키닐, -S-C3-C12-시클로알킬, -S-아릴, -S-헤테로아릴, -S-헤테로시클로알킬, 또는 메틸티오메틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 치환기로의 독립적인 대체에 의한 치환을 칭한다. 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 스테로이달 등은 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로부터 선택된 원자를 칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "스테로이달"은 4개의 고리에 배열된 기본적으로 17개의 탄소 원자를 가지고 스테롤 및 담즙산, 아드레날 호르몬 및 성 호르몬, 특정의 천연 약물, 예를 들어 디기탈리스(digitalis) 화합물, 및 특정 비타민의 전구체를 포함하는 임의의 여러 자연 발생 또는 합성 지방-가용성 유기 화합물을 칭한다. 스테로이달 구조물의 예는 콜레스테롤, 콜레스타놀, 3α-시클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포르미에이트, 콜레스타닐 포르미에이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적을 위하여, 용어 "짧은 뉴클레오티드(들)"는 1개 내지 약 6개의 연결된 뉴클레오시드 단위로 형성된 모노, 디 또는 폴리뉴클레오시드를 칭한다. 이러한 짧은 뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는, 존재하는 핵산 공급원으로부터 획득될 수 있지만, 바람직하게 합성 방법에 의해 생산된다. 뉴클레오시드 잔기는 임의의 다수의 공지된 뉴클레오시드간 연결에 의해 서로 결합될 수 있다. 이러한 뉴클레오시드간 연결은 개질되거나 비개질될 수 있고, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿징된 포스포라미데이트, 브릿징된 메틸렌 포스포네이트, 브릿징된 포스포로티오에이트, 및 설폰 뉴클레오시드간 연결을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "짧은 뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체특이적 뉴클레오시드간 연결 (예를 들어, (RP)- 또는 (SP)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 갖는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명의 짧은 뉴클레오티드는, 연결이 포스페이트기를 포함하든지 하지 않던지 간에, 임의의 이러한 뉴클레오시드내 연결을 포함한다. 특정의 바람직한 구체예에서, 이러한 뉴클레오시드간 연결은 개질되거나 비개질될 수 있고, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 연결, 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "짧은 뉴클레오티드(들)"는 또한 단백질기, 친유성기, 삽입성 물질(intercalating agent), 디아민, 폴산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 추가적인 치환기들을 포함한다.
용어 "짧은 뉴클레오티드(들)"는 또한 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트기를 지닌 펩티드 핵산 (PHONA), 로킹된(locked) 핵산 (LNA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다른 핵염기 함유 폴리머를 포함한다. PNA 및 LNA의 예는 하기에 도시되어 있다:
Figure 112016016769190-pat00021
"뉴클레오티드"는 뉴클레오티드간 연결, 당 기 및 헤테로시클릭 염기를 포함하는 핵산의 서브-단위 (DNA 또는 RNA 또는 이들의 유사체이든지 간에), 뿐만 아니라 이러한 서브-단위들의 유사체를 칭한다. "뉴클레오시드"는 당 기 및 헤테로시클릭 염기를 포함하는 핵산 서브 단위를 참조한다. 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오시드" 및 뉴클레오티드"는 자연 발생 뉴클레오티드간 연결("뉴클레오티드"와 관련하여), 예를 들어 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결; 자연 발생 당 부분, 예를 들어 리보스 및 데옥시리보스 부분; 및 자연 발생 핵염기, 예를 들어 푸린 및 피리미딘 염기, 예를 들어 아데닌 (A), 티민 (T), 시토신 (C), 구아닌 (G), 또는 우라실 (U), 뿐만 아니라 개질된 뉴클레오티드간 연결, 개질된 당 부분 및 개질된 푸린 및 피리미딘 염기, 또는 이들의 유사체, 또는 개질된 뉴클레오티드간 연결 및 비개질된 뉴클레오티드간 연결, 당 부분 및 푸린 및 피리미딘 염기의 임의의 조합을 포함하는 이러한 것들의 부분들을 포함할 것으로 인식될 것이다. 개질된 뉴클레오시드의 다른 예는 비시클로뉴클레오시드(acyclonucleoside)를 포함하며, 이는 리보스 및 데옥시리보스 부분의 개환된 형태로 이루어진다. 대응하게, 이러한 개환된 뉴클레오시드는 개질된 뉴클레오티드를 형성시키는데 사용될 수 있다. 개질된 뉴클레오시드의 다른 예는 C-뉴클레오시드, 예를 들어 유사이소시티딘, 및 펩티드 핵산 모노머와 같은 뉴클레오시드 이소스테르(isosteres)를 포함하는 뉴클레오시드 유사체(mimics)을 포함한다.
자연 발생 푸린 및 피리미딘 핵염기의 개질은 메틸화된 푸린 또는 피리미딘, 아실화된 푸린 또는 피리미딘 등, 또는 아세틸, 디플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 이소부티릴, 벤조일 등과 같은 보호기의 첨가를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 푸린 또는 피리미딘 염기는 또한 상술된 것의 유사체일 수 있으며; 적합한 유사체는 당업자에게 알려질 것이고 적절한 텍스트 및 문헌에 기술될 것이다. 통상적인 유사체는 1-메틸아데닌, 2-메틸아데닌, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜틸아데닌, N,N-디메틸아데닌, 8-브로모아데닌, 2-티오시토신, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, 5-에틸시토신, 4-아세틸시토신, 1-메틸구아닌, 2-메틸구아닌, 7-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 8-브로모구아닌, 8-클로로구아닌, 8-아미노구아닌, 8-메틸구아닌, 8-티오구아닌, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 5-에틸우라실, 5-프로필우라실, 5-메톡시우라실, 5-히드록시메틸우라실, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-(메틸아미노메틸)우라실, 5-(카르복시메틸아미노메틸)-우라실, 2-티오우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-(2-브로모비닐) 우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 유사우라실, 1-메틸유사우라실, 퀘오신, 이노신, 1-메틸이노신, 히폭산틴, 크산틴, 2-아미노푸린, 6-히드록시아미노푸린, 6-티오푸린, 2,6-디알미노푸린 5-트리플루오로메틸 티민, 6-클로로-아데닌, 7-데아자-아데닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"개질된 염기"는 또한 "개질된 핵염기"로서 칭하여지는데, 이는 헤테로시클릭일 수 있거나 헤테로시클릭이지 않을 수 있는 질소 함유 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 바람직한 질소 함유 화합물은 -NHR18을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 여기서 R18은 수소, 부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐, 알릴, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 시클로알킬, 치환되거나 비치환된 아르알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 또는 헤테로시클릭이다.
용어 "개질된 염기"는 대부분의 전통적인 측면에서 뉴클레오시드 염기가 아니라 뉴클레오시드 염기로서 제공될 수 있는 헤테로시클릭 화합물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 화합물은 당해 분야에서 공지된 바와 같이, "유니버설 염기(universal base)"를 포함한다. 유니버설 염기는 방향족 고리 부분을 포함할 수 있으며, 이는 질소 원자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 일부 구체예에서, 유니버설 염기는 뉴클레오시드의 펜토즈 당의 C-1' 탄소에 공유 결합될 수 있다. 유니버설 염기의 예는 3-메틸-프로피닐카르보스티릴 (PIM), 3-메틸이소카르보스티릴 (MICS), 및 5-메틸 이소카르보스티릴 부분을 포함한다. 추가적인 예는 이노신 유도체, 아졸 카르복사미드 유사체, 니트로졸, 및 니트로이미다졸을 포함한다.
개질된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 당 부분의 예는 트레할로즈, 아라비노즈, 2'-데옥시-2'-치환된 펜토즈 부분, 2'-O-치환된 펜토즈 부분, 릭소스, 및 크실로즈, 또는 헥소즈 당 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, "2'-치환된 리보뉴클레오시드" 또는 "2'-치환된 아라비노시드"와 같은 임의의 명명된 당 기들에서의 용어 "2-치환된"은 펜토즈 부분의 2' 위치의 히드록실 기가 치환되어 2'-치환된 또는 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드 또는 아라비노뉴클레오시드를 형성시키는 리보뉴클레오시드 또는 아라비노뉴클레오시드를 포함한다. 바람직하게, 치환은 1개 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 함유한 저급 알킬기, 또는 6개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 아릴기로의 치환 (여기서, 알킬 또는 아릴 기는 비치환될 수 있거나, 예를 들어 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시, 또는 아미노기로 치환될 수 있음)이다. 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드 또는 2'-O-치환된-아라비노시드의 예는 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 (본원에서 또한 2'-OMe로서 명시됨) 또는 2'-O-메틸아라비노시드 및 2'-O-메톡시에틸리보뉴클레오시드 또는 2'-O-메톡시에틸아라비노시드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드" 또는 "2'-치환된 아라비노시드"는 또한 2'-히드록실기가 1개 내지 6개의 포화되거나 불포화된 탄소 원자를 포함하는 저급 알킬기, 또는 아미노 또는 할로기로 대체되는 리보뉴클레오시드 또는 아라비노뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 2'-치환된 리보뉴클레오시드 또는 2'-치환된 아라비노시드의 예는 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 및 2'-프로파르길 리보뉴클레오시드 또는 아라비노시드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
개질된 뉴클레오티드간 연결의 예는 치환되거나 비치환된 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 브릿징된 포스포라미데이트, 브릿징된 메틸렌 포스포네이트, 브릿징된 포스포로티오에이트, 및 설폰 뉴클레오시드간 연결을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 개질된 뉴클레오티드간 연결 및 비개질된 뉴클레오티드간 연결의 치환은 하기 부분을 포함한다:
Figure 112016016769190-pat00022
상기 식에서, V, M, J, R2, R3, R4, R5 및 n은 모두 화학식 (I)에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 이에 따라 라세미체 및 라세미체 혼합물, 단일 거울상이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 개개의 부분입체이성질체로서 발생할 수 있다. 본 발명은 5원 푸라노즈 고리에 대해 ß-D 입체화학 배열을 갖는 짧은 뉴클레오티드 화합물, 즉 5원 푸라노즈 고리의 C-1 및 C-4에서의 치환기가 ß-입체화학 배열 (통상적으로 본원에 도시된 일부 화학식에서 굵은 선으로 표시되는 "업(up)" 배향)을 갖는 짧은 뉴클레오티드 화합물을 포함한다.
약어
반응식 및 실시예의 설명에서 사용될 수 있는 약어들은 하기와 같다:
Ac: 아세틸;
AcOH: 아세트산;
Boc2O: 디-3차-부틸-디카르보네이트;
Boc: t-부톡시카르보닐;
Bpoc: 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸 카르보닐;
Bz: 벤조일;
Bn: 벤질;
BocNHOH: 3차-부틸 N-히드록시카르바메이트;
t-BuOK: 칼륨 3차-부톡사이드;
Bu3SnH: 트리부틸주석 히드라이드;
CDI: 카르보닐디이미다졸;
CH2Cl2: 디클로로메탄;
CH3: 메틸;
CH3CN: 아세토니트릴;
DMSO: 디메틸 설폭사이드;
EtOAc: 에틸 아세테이트;
EtOH: 에탄올;
Et2O: 디에틸 에테르;
HCl: 염화수소;
MeOH: 메탄올;
MOM: 메톡시메틸;
Ms: 메실 또는 -SO2-CH3;
Ms2O: 메탄설폰산 무수물 또는 메실-무수물;
NaCl: 소듐 클로라이드;
NaH: 소듐 히드라이드;
NaHCO3: 소듐 비카르보네이트 또는 소듐 하이드로겐 카르보네이트;
Na2CO3: 소듐 카르보네이트;
NaOH: 소듐 히드록사이드;
Na2SO4: 소듐 설페이트;
NaHSO3: 소듐 비설피트 또는 소듐 하이드로겐 설피트;
Na2S2O3: 소듐 티오설페이트;
NH2NH2: 히드라진;
NH4HCO3: 암모늄 비카르보네이트;
NH4Cl: 암모늄 클로라이드;
OH: 히드록실;
OMe: 메톡시;
OEt: 에톡시;
TEA 또는 Et3N: 트리에틸아민;
TFA: 트리플루오로아세트산;
THF: 테트라히드로푸란;
TPP 또는 PPh3: 트리페닐포스핀;
Ts: 토실 또는 -SO2-C6H4CH3;
Ts2O: 토실설폰산 무수물 또는 토실-무수물;
TsOH: p-토실설폰산;
Ph: 페닐;
TBS: 3차-부틸 디메틸실릴; 또는
TMS: 트리메틸실릴;
TMSCl: 트리메틸실릴 클로라이드.
또한, 본 발명에는 본 발명의 짧은 올리고뉴클레오티드 화합물 및 본 발명의 이의 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제 조성물이 포함된다. 본 발명의 다른 예는 상기 기술된 임의의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 조합함으로써 제조된 약제 조성물이다. 본 발명의 다른 예시는 상기 기술된 임의의 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체를 조합함을 포함하여 약제 조성물을 제조하는 방법이다.
본 발명의 다른 양태는 감수성 바이러스 감염증, 특히 HCV 복제의 억제, 및/또는 하나 이상의 감수성 바이러스 감염증, 특히 HCV 감염증, 및/또는 HBV 또는 HIV와 같은 다른 바이러스 감염증과 조합한 HCV 감염증의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 짧은 뉴클레오티드 화합물 및 이의 유도체, 및 이들의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명의 또다른 양태는 RNA-의존 RNA 바이러스 복제, 특히 HCV 복제의 억제, 및/또는 RNA-의존 RNA 바이러스 감염증, 특히 HCV 감염증의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한, 짧은 올리고뉴클레오티드 화합물 및 이의 유도체, 및 이들이 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제 조성물은 활성성분으로서 적어도 하나의 본 발명의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고, 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제 및 임의적으로 다른 치료학적 성분들을 함유할 수 있다. "약제학적으로 허용되는"은 담체, 희석제, 또는 부형제가 제형의 다른 성분들과 양립가능해야 하고, 이의 수용체에 유해하지 않아야 함을 의미한다. 이러한 조성물은 경구, 직장, 국소, 비경구(피하, 근육내, 및 정맥내), 안구(눈), 폐(비강 또는 협측 흡입), 또는 비강 투여를 위해 적합한 조성물을 포함하지만, 임의의 제공된 경우에서 가장 적합한 경로는 치료할 질환의 특성 및 중증도, 및 활성성분의 특성에 의존할 것이다. 이러한 것들은 편리하게 단위 투약 형태로 존재할 수 있고 제약 분야에서 널리 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
실제 사용에서, 본 발명의 화합물은 활성성분으로서 통상적인 약제학적 배합 기술에 따라 약제학적 담체와 친밀하게 배합하여 조합될 수 있다. 담체는 투여, 예를 들어 경구 또는 비경구 투여 (정맥내 투여 포함)를 위해 요망되는 제조 형태에 따라 매우 다양한 형태를 가질 수 있다. 경구 투여형을 위한 조성물을 제조함에 있어서, 임의의 통상적인 약제학적 매질, 예를 들어 현탁액, 엘릭시르 및 용액과 같은 경구 액체 제형의 경우에 물, 글리콜, 오일, 알코올, 착향제, 보존제, 착색제 등,; 또는 분말, 경질 및 연질 캡슐 및 정제와 같은 고체 경구 제조물의 경우에 전분, 당, 미정질 셀룰로즈, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 분해제 등과 같은 담체가 사용될 수 있으며, 고체 경구 제조물이 액체 제조물에 비해 바람직하다.
이들의 투여 용이성으로 인하여, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 경구 투약 단위형으로 나타나는데, 이러한 경우에, 고체 약제학적 담체가 분명히 사용된다. 요망되는 경우에, 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 코팅될 수 있다. 이러한 조성물 및 제조물은 적어도 0.1%의 활성 화합물을 함유하여야 한다. 이러한 조성물 중의 활성 화합물의 백분율은 물론 변경될 수 있고, 통상적으로 단위의 약 2 중량% 내지 약 60 중량%일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물 중에서의 활성 화합물의 양은 효과적인 복용량이 얻어지기 위한 양이다. 활성 화합물은 또한 예를 들어, 액체 방울 또는 분말로서 비강내로 투여될 수 있다.
정제, 환제, 캡슐, 등은 또한 검 트래거캔스, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로즈, 락토즈 도는 사카린과 같은 감미제를 함유할 수 있다. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 타입의 물질 이외에, 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 여러 다른 물질들이 코팅으로서 또는 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제는 셀락, 당 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성성분 이외에, 감미제로서 수크로즈, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 착향제, 예를 들어 체리 또는 오렌지 착향제를 함유할 수 있다. 분해에 대해 약제학적 활성 성분을 안정화시키는 여러 안정화제, 예를 들어 아미노산 또는 폴리아민이 첨가될 수 있다. 다른 부형제는 PEG 400, 글리신, 비타민 E 유도체, 소르비탄 모노-올레이트, 키토산, 콜린 시트레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 트윈 80, Igepal CA 630, Brij 35, NP-40 및 이들의 유사한 유도체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물은 또한 비경구적으로 투여될 수 있다. 이러한 활성 화합물의 용액 또는 현탁액은 수중에서 히드록시-프로필 셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합되어 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 오일 중 이들의 혼합물 중에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건 하에서, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 방해하기 위해 보존제를 함유한다. 주사가능한 사용을 위해 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위해 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 이러한 형태는 바람직하게 멸균된 형태이고, 바람직하게 용이한 주사능력(syringability)이 나타나는 정도로 유동성을 나타낸다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 균주와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
치료학적으로 유효한 용량의 본 발명의 화합물을 포유동물, 특히 인간에게 제공하기 위해 임의의 적합한 투여 경로가 이용될 수 있다. 용어 화합물"의 투여" 및 화합물을 "투여하는"은 필요로 하는 개체에 본 발명의 화합물을 제공함을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 치료 방법에 따르면, 바이러스 감염증은 피검체에 치료학적 유효량 또는 억제량의 본 발명의 화합물을 소정의 결과를 달성하기 위해 필요로 하는 양 및 시간 동안에 투여함으로써 인간 또는 하급 포유동물과 같은 피검체에서 치료되거나 예방된다. 본 발명의 또다른 방법은 억제량의 본 발명의 조성물로 화합물을 소정의 결과를 달성하기 위해 필수적인 양 및 시간 동안에 생물학적 샘플을 처리하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 본 발명의 화합물의 "치료학적 유효량"은 생물학적 샘플 또는 피검체에서 바이러스의 양(viral load)을 감소시키기 위한 화합물의 충분한 양을 의미한다. 의학 분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량은 임의의 의학적 치료에 대해 적용될 수 있는 적절한 이익/위험 비를 나타낼 것이다.
용어 본 발명의 화합물의 "억제량"은 생물학적 샘플 또는 피검체에서 C형 간염 바이러스의 양을 감소시키기 위한 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 화합물의 억제양 또는 투여량은 약 0.1 mg/Kg 내지 약 500 mg/Kg, 또한 약 1 mg/Kg 내지 약 50 mg/Kg의 범위일 수 있다. 억제량 또는 투여량은 또한 투여 경로, 뿐만 아니라 다른 제제의 동시 사용 가능성에 따라 변경될 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플(들)"은 피검체에 투여하기 위해 의도되는 생물학적 기원의 물질을 의미한다. 생물학적 샘플의 예는 혈액 및 이의 구성성분, 예를 들어 혈장, 혈소판, 혈액 세포의 소집단(subpopulation) 등; 기관, 예를 들어 신장, 간, 심장, 폐 등; 정자 및 난자; 골수 및 이의 구성성분들; 또는 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이에 따라, 본 발명의 다른 구체예는 생물학적 샘플을 억제량의 본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물과 접촉시킴으로써 생물학적 샘플을 치료하는 방법이다.
피검체의 상태의 개선시에, 필요한 경우에, 유지 용량의 본 발명의 화합물, 조성물 또는 조합물이 투여될 수 있다. 이후에, 투여량 또는 투여 횟수, 또는 둘 모두는 증상의 작용에 따라, 증상이 소정의 수준으로 완화되고 치료가 중지되어야 할 때 개선된 상태를 유지시키는 수준으로 감소될 수 있다. 그러나, 피검체는 질환 증상의 임의의 재발시에 장기간에 간헐적 치료를 필요로 할 수 있다.
그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 용량은 건전한 의학적 판단의 범위내에서 주치의에 의해 결정되는 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특이적 억제 용량은 치료될 질환 및 질환의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성; 환자의 나이, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용되는 특정 화합물의 배출율; 치료 기간; 사용되는 특정 화합물과 조합 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사한 인자들을 포함하는 여러 인자들에 따를 것이다.
피검체에, 단일, 다중, 또는 분할된 용량으로 투여되는 본 발명의 화합물의 총 일일 억제량은 예를 들어 0.01 내지 50 mg/kg 체중, 또는 더욱 일반적으로 0.1 내지 25 mg/kg 체중의 양일 수 있다. 단일 용량 조성물은 일일 용량을 채우기 위해 이러한 양 또는 이의 약수의 양을 함유할 수 있다. 다중 용량은 상이한 시간 간격으로 제공되는 단일 용량일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 치료 요법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 단일 또는 다중 용량으로 일일 당 약 10 mg 내지 약 1000 mg의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 HCV 감염증을 HCV 감염증을 치료하기 위해 유용한 하나 이상의 제제와 조합하여 본 발명의 화합물로 억제하거나 치료함을 포함한다. HCV에 대해 활성인 이러한 제제들은 리바비린, 레보비린, 비라미딘, 티모신 알파-1, 인터페론-ß, 인터페론-α, 페그화된 인터페론-α (페그인터페론-α), 인터페론-α와 리바비린의 조합, 페그인터페론-α와 리바비린의 조합, 인터페론-α와 레보비린의 조합, 및 페그인터페론-α와 레보비린의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인터페론-α는 재조합 인터페론-α2a (예를 들어, Hoffmann-LaRoche(Nutley, N.J.)로부터 입수가능한 로페론(Roferon) 인터페론), 페그화된 인터페론-α2a (Pegasys™), 인터페론-α2b (예를 들어, Schering Corp.(Kenilworth, N.J.)로부터 입수가능한 인트론-A 인터페론), 페그화된 인터페론-α2b (PegIntron™), 재조합 콘센서스 인터페론 (예를 들어, 인터페론 알파콘-1), 및 정제된 인터페론-α 제품을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 암겐(Amgen)의 재조합 콘센서스 인터페론은 상표명 Infergen®을 갖는다. 레보비린은 리바비린과 유사한 면역조절 활성을 나타내는 리바비린의 L-거울상이성질체이다. 비라미딘은 WO 01/60379 (ICN Pharmaceuticals으로 양도됨)에 기술된 리바비린의 유사체를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따르면, 조합물의 개개의 성분들은 치료 과정 동안에 상이한 시간에 별도로 또는 분할되거나 단일 조합 형태로 동시에 투여될 수 있다. 이에 따라 본 발명은 동시 치료 또는 교차 치료의 모든 요법들을 포함하는 것으로 이해될 것이며, 용어 "투여하는"은 이에 따라 해석될 것이다. HCV 감염증을 치료하기 위해 유용한 다른 제제들과 본 발명의 화합물의 조합 범위는 원칙적으로 HCV 감염증, 또는 HBV 또는 HIV와 같은 다른 바이러스와의 HCV 동시 감염증을 치료하기 위한 임의의 약제학적 조성물과의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 HCV에 대해 활성인 제 2 치료제와 조합하여 사용되는 경우에, 각 화합물의 용량은 화합물이 단독으로 사용되는 경우의 용량과 동일하거나 상이할 수 있다.
HCV 감염증의 치료를 위하여, 본 발명의 화합물은 또한 HCV NS3 세린 프로테아제의 억제제인 제제와 조합하여 투여될 수 있다. HCV NS3 세린 프로테아제는 필수 바이러스 효소이고, HCV 복제의 억제를 위한 우수한 타겟인 것으로 기술되어 있다. HCV 복제의 억제제를 개발하고 HCV 감염증을 치료하기 위한 타겟으로서의 HCV NS3 프로테아제는 문헌[B. W. Dymock, "Emerging therapies for hepatitis C virus infection," Emerging Drugs, 6: 13-42 (2001)]에서 논의되어 있다.
리바비린, 레보비린, 및 비라미딘은 세포간 효소 이노신 모노포스페이트 디히드로게나제 (intracellular enzyme inosine monophosphate dehydrogenase; IMPDH)의 억제제 의해 구아닌 뉴클레오티드의 세포간 풀(pool)을 조절함으로써 이들의 항-HCV 효과를 나타낼 수 있다. IMPDH는 데 노보(de novo) 구아닌 뉴클레오티드 생합성에서 생합성 경로에 대한 속도-제한 효소이다. 리바비린은 세포간에 용이하게 포스포릴화되며, 모노포스페이트 유도체는 IMPDH의 억제제이다. 이에 따라, IMPDH의 억제는 HCV 복제의 억제제의 발견을 위한 다른 유용한 타겟을 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 화합물은 또한 IMPDH의 억제제와 조합하여 투여될 수 있다 [참조, A. C. Allison and E. M. Eugui, Agents Action, 44 (Suppl.): 165 (1993)].
HCV 감염증의 치료를 위해, 본 발명의 화합물은 또한 항바이러스제 아만타딘 (1-아미노아다만탄)과 조합하여 투여될 수 있다 [이러한 제제에 대한 포괄적 설명, 참조 J. Kirschbaum, Anal. Profiles Drug Subs. 12: 1-36 (1983)]. 본 발명의 화합물은 또한 HCV 감염증의 치료를 위해 문헌[R. E. Harry-O'kuru, et al., J. Org. Chem., 62: 1754-1759 (1997); M. S. Wolfe, et al., Tetrahedron Lett., 36: 7611-7614 (1995)]에 기술된 항바이러스 2'-C-분지된 리보뉴클레오시드와 조합될 수 있다. 이러한 2'-C-분지된 리보뉴클레오시드는 2'-C-메틸-시티딘, 2'-C-메틸-우리딘, 2'-C-메틸-아데노신, 2'-C-메틸-구아노신, 및 9-(2-C-메틸-ß-D-리보푸라노실)-2,6-디알미노푸린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물은 또한 HCV 감염증의 치료를 위해 항-HCV 성질들을 갖는 뉴클로오시드와 조합될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 HCV 감염증의 치료를 위해 HCV 폴리머라제의 비-뉴클레오시드 억제제와 조합될 수 있다.
본 발명의 화합물과 조합하여 사용될 수 있는 항바이러스 화합물들은 라미부딘, 아데포비르, 테노포비르, FTC, 엔타카비르, 아시클로비르, 펜시클로비르, 간시클로비르, 인터페론, 페그화된 인터페론, 리바비린, 및 바이러스 감염증 및 HIV 및/또는 HBV와 조합한 HCV와 같은 바이러스 동시 감염증의 치료를 위한 다른 공지된 치료학적 조성물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예 1: 3'-dApsU 2'-OMe 의 합성
본 연구에서, 실시예 2에 도시된 바와 같이, 포스포로티오에이트 유사체 3'-dApsU2'-OMe의 Rp,Sp 혼합물을 특별히 제작된 LOTUS 반응기®와 함께, 고체상 포스포라미디트 화학(Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. Tetrahedron 1993, 49, 1925)을 이용하여 대용량(1 밀리몰의 뉴클레오시드-로딩된 조절된-공극 유리 (CPG) 지지체)으로 합성하였다[Padmanabhan, S.; Coughlin, J. E.; Iyer, R. P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 343; Iyer, R. P.; Coughlin, J. E.; Padmanabhan, S. Org. Prep. Proc. Intl. 2005, 37, 205]. dA-연결된 CPG 지지체를 초고속 작용화(ultrafast functionalization) 및 고체 지지체에 대한 로딩 공정을 이용하여 제조하였다. 뉴클레오티드간 디뉴클레오시드 포스피트 결합된 생성물의 황화(sulfurization)를 위하여, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1,-디옥사이드의 용액 (건조 CH3CN 중 0.4 M)을 사용하였다 [Iyer, R. P.; Regan, J. B.; Egan, W.; Beaucage, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253]. 5'-트리틸 기의 제거를 디클로로메탄 중의 디클로로아세트산의 2.5% 용액으로 수행하였다. 염기에서 보호기, 및 포스페이트의 제거, 및 지지체로부터 뉴클레오티드의 분리를, 지지체-결합 생성물을 28% 암모늄 히드록사이드로 실온에서 수시간 동안 처리하여 수행하였다. 가공, 크로마토그래프 정제, 및 동결건조 후에, Rp,Sp 3'-dApsU2 '- OMe의 소듐 염 (~60:40 혼합물)을 >96% 순도로 수득하였으며, 이를 31P 및 1H NMR로 특징분석하였다. 31P NMR, (D2O), 57.0, 및 57.7 ppm.
대안적으로, 표제 화합물을 또한 용액상 방법으로 제조할 수 있다. 통상적으로, 3'-보호된 5'-히드록시 Nbz-dA를 불활성 대기 중에서 용매로서 무수 디클로메탄 또는 아세토니트릴 중에서 테트라졸 또는 티오에틸 테트라졸과 같은 활성제의 존재하에 5'-DMT-2'-OMe-3'-우리딘 포스포라미디트와 접촉시켰다. 3'-보호된 뉴클레오시드의 예는 레불리닐, t-부틸디메틸실릴, 벤조일, 4-t-부틸벤조일 등을 포함한다. 디뉴클레오시드 모노포스피트를 함유한 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1,-디옥사이드의 용액 (건조 CH3CN 중 0.4 M)으로 처리하였다 [Iyer, R. P.; Regan, J. B.; Egan, W.; Beaucage, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253]. 반응 혼합물을 DCA/DCM을 이용하여 탈트리틸화시키고, 용액을 물로 희석시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 NaHCO3, 물, 및 염수로 세척하였다. 유기층을 농축시켜 전부 보호된 디뉴클레오시드 포스포트리에스테르를 수득하였다. 보호기의 탈트리틸화 및 제거를 상기와 같이 수행하였다. 가공, 크로마토그래피 정제, 및 동결건조 이후에, Rp,Sp 5의 소듐 염(~60:40 혼합물)을 역상 HPLC로 확인하여 >96% 순도로 수득하였다.
본 발명에서 청구되고 있는 다른 디뉴클레오티드를 또한 상기와 유사한 절차를 이용하여 제조할 수 있다. 당업자는 전통적인 포스포트리에스테르 방법 또는 H-포스포네이트 방법을 이용하여 유사한 화합물들을 합성할 수 있다고 언급하는 것과 관련이 있다 [Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. Tetrahedron 1993, 49, 1925].
실시예 2: 3'dApsU 2'OMe 의 S-이소프로필카르보닐옥시메틸 티오포스페이트 (6k)
Figure 112016016769190-pat00023
타겟 화합물 6k (또한 표 1에서 화합물 2로 명시됨)를 2 단계로 제조하였다.
단계 1. 요오도메틸이소프로필 카르보네이트의 제조: 무수 아세토니트릴 (20 mL) 중 무수 소듐 요오다이드 (6 g, 40 mmol)의 용액에 무수 아세토니트릴 (10 mL)의 클로로메틸 이소프로필 카르보네이트 (2.9g, 19 mmol)를 20 분에 걸쳐 적가하였다. 알루미늄 호일(빛으로부터 보호)로 덮혀진 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 분리된 고체를 여과하고, 아세토니트릴로 세척하고, 여액을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 물 (10 mL) 중에 용해시키고, 유기물을 에테르 (25 mL)에서 추출하였다. 에테르 추출물을 소듐 비설피트 (5%, 10 mL)로 세척한 후에, 염수 (10 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 여과하고, 농축하고, 높은 건조된 진공하에서 건조시켰다. 수율 2.72 g (58%); 1H-NMR δ 1.3 (d, 6H), 4.95 (m, 1H), 5.95 (s, 2H) ppm.
단계 2. 디뉴클레오티드, 3'- ApsU2'OMe의 알킬화: 교반 하에서 물 (HPLC, 400 mL) 중 실시예 1의 디뉴클레오티드 (60 mg, 0. 098mmol)의 용액에, 아세톤 (1 mL) 중 요오도메틸 이소프로필 카르보네이트 (80 mg, 0.0166 mmol, 3.33 당량)의 용액을 첨가하였다. 알킬화제의 오일 방울의 임의의 분리를 방지하기 위해 추가 아세톤 (1 mL)을 첨가하여 맑은 용액을 수득하였다. 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하고, 로타뱁(rotavap) 조건하에서 농축하고, 이후에 고진공하에서 농축하여 반응 혼합물을 백색 고체로 수득하였다. 이를 초기에 클로로포름을 이용하여 서서히 2%에서 마지막으로 8% 메탄올을 함유하는 클로로포름을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 주성분을 함유한 분획물을 합하고, 농축하고, 고진공하에서 하룻밤 동안 건조시켰다. 요망되는 순수한 생성물 6k를 거의 정량 수율 (64 mg)로 분리하였다. 31P-NMR (MeOH-d4) δ 27.7, 28.6.
Figure 112016016769190-pat00024
실시예 3: 3'dApsU 2'OMe 의 S-메틸 콜산 에스테르 6l의 제조
단계 1. 클로로메틸 데옥시콜레이트의 합성: 에탄올 (4 mL) 중의 데옥시콜산 (120 mg, 0.306 mmol)에, 물 (3 mL) 중의 세슘 카르보네이트 (53 mg, 0.160 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 교반하고, 에탄올을 초기에 로타뱁 하에서 제거하고, 이후에 고진공하에서 제거하였다. 잔류물을 동결건조시켜 세슘 염을 백색 분말로 수득하였다. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 3 mL) 중 세슘 염의 용액에, 브로모클로로메탄 (10 mL)을 첨가하고, 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (20 mL)에서 추출하고, 물 (5 mL), 염수 (5 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조한 후에 용매를 제거하여 클로로메틸 화합물 (100 mg, 74%)을 수득하였다. 이를 상응하는 요오도메틸 유도체로의 전환을 위해 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2. 요오도메틸 데옥시콜레이트의 제조: 무수 아세토니트릴 (3mL) 중 소듐 요오다이드 (304 mg, 2.03 mmol)의 용액에, 아세토니트릴 (6 mL) 및 디클로로메탄 (2 mL)이 혼합물 중 클로로메틸 에스테르 (438 mg, 0.99 mmol)를 서서히 첨가하였다. 빛으로부터 보호된 반응 혼합물을 실온에서 48 시간에 걸쳐 교반하였다. 농축 후에, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (15 mL)에서 추출하고, 유기층을 물 (5 mL), 소듐 비설피트 (5%, 5 mL) 및 마지막으로 염수 (5 mL)로 세척하였다. 무수 소듐 설페이트로 건조시키고, 용매를 제거한 후에 얻어진 미정제 생성물을 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요오도 화합물 (110 mg, 21%)을 수득하였다.
단계 3. 요오도메틸 데옥시콜레이트의 커플링: 실시예 1의 물 (400 mL) 중 3'dApsU2'OMe (50 mg, 0.082 mmol)의 용액에, 아세톤 (3 mL) 중 요오도메틸 데옥시콜레이트 (110 mg, 2.066 mmol)의 용액을 첨가하였다. 분리된 고체를, 추가 아세톤 (~ 6 mL)를 첨가하여 용해시키고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 진공하에서 농축하고, 클로로포름 내지 메탄올(2 내지 10%)을 함유한 클로로포름을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 합하고, 농축하고, 고진공하에서 건조시켜 요망되느 생성물 6l (40 mg, 49%)을 수득하였다. 31P-NMR (MeOH) δ 28.2, 29.1 ppm.
실시예 4: N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트 (6m)의 제조
Figure 112016016769190-pat00025
요오도메틸 N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트. 에탄올 (3 mL) 중 N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐글리신 (663 mg, 2.49 mmol)에, 물 (2 mL) 중 세슘 카르보네이트 (427 mg, 1.31 mmol)의 용액을 첨가하였다. 가스 방출이 중지된 후에, 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 동결건조시켜 세슘 염을 수득하였다. N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 2 mL) 중 세슘 염 (270 mg, 0.82 mmol)의 용액에 브로모클로로메탄 (5 mL)을 첨가하고, 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물과 함께 하룻밤 동안 교반하였다. 분리된 고체를 여과하고, DMF (2 mL)로 고체를 세척하고, 여액을 고진공하에서 농축하였다. 생성물 (206 mg, 80%)이 TLC (Hex: EtOAc 4:1)로 순수한 것임을 확인하였다. 이러한 중간체를 요오도 화합물로의 전환을 위해 추가 정제 없이 사용하였다. 무수 아세토니트릴 (3 mL) 중 소듐 요오다이드 (196 mg, 1.31 mmol)의 용액에, 무수 아세토니트릴 (1 mL) 중 클로로메틸 페닐알라니에이트 유도체 (206 mg, 0.656 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하면서 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, DMF (3 mL)로 세척하고, 여액을 진공하에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (10 mL) 및 물 (5 mL)에서 추출하고, 유기층을 NaHSO3 (5%, 5 mL) 및 염수 (포화, 5 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조하고, 농축시켜 요망되는 요오도 화합물 (199 mg, 75%)을 수득하였다.
3'dApsU2'OMe의 알킬화. 실시예 1의 물 (400 ㎕) 중 3'dApsU2'OMe (44 mg, 0.072 mmol)의 용액에, 아세톤 (800 ㎕) 중 요오다이드 (100 mg, 0.25 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에서 농축하고, 동결건조하고, 클로로포름, 및 클로로포름과 메탄올(2% 내지 10%)을 함유한 혼합물을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 수집하고, 합하고, 농축하고, 고진공하에 건조하여 t-Boc 보호된 페닐알라닌 커플링된 생성물 6m (40 mg, 65%)을 수득하였다. 31P-NMR (MeOH-d4) δ 28.7, 27.9 ppm.
실시예 5: 3'dApsU 2'OMe 의 4-아세트아미도벤질 유도체 6n의 제조
Figure 112016016769190-pat00026
4-아세트아미도벤질 알코올의 제조. 메탄올 (100 mL) 중의 4-아세트아미도벤즈알데히드 (10 g, 61.3 mmol)의 용액에, 소듐 보로히드라이드 (800 mg)를 실온에서 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하고, 반응 과정을 용리액으로서 4:1 헥산:EtOAc을 이용하여 TLC로 체크하였다. 출발 물질의 부재로 환원의 완료를 나타내었으며, 반응 혼합물을 로타뱁에서 농축하였다. 잔류물을 물 (25 mL)와 에틸 아세테이트 (4 X 50 mL)로 분별하고, 유기층을 염수 (25 mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트층을 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 용매를 제거하여 알코올을 엷은 황색 고체로 수득하고, 이를 고진공하에서 건조하였다. 8.6 g (85%); 1H NMR (DMSO-d6): δ 2.0 (s, 3H), 4.5 (d, 2H), 5.2 (t, 1H), 7.25 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 9.95 (s, 1H) ppm.
4-아세트아미도벤질 요오다이드의 제조. 무수 DMF (5 mL)의 냉각된 용액에, 티오닐 클로라이드 (0.2 mL, 2.8 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 무수 DMF (12 mL) 중 KI (2.49g, 15 mmol)의 용액을 첨가한 후에 상기 제조된 알코올 (0.165 g, 1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음욕에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물 (25 mL)에 붓고, 에테르 (3X 25 mL)로 추출하였다. 에테르층을 염수로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 농축시켜 용매를 제거하였다. 생성물을 맑은 황색 고체로 수득하였다 (138 mg, 50%) (TLC Hex: EtOAc (1:1). 1H NMR (CDCl3): δ 2.17 (s, 3H), 4.45 (s, 2H), 7.17(br.s, 1H), 7.33 (d, 2H), 7.43 (d, 2H) ppm. 이러한 화합물을 또한 아세토니트릴 중 세슘 요오다이드 및 보론 트리플루오라이드 에테레이트를 이용하여 개선된 수율(~75 %)로 제조하였다. 4-아세트아미도벤질 요오다이드와 3'dApsU2'OMe의 커플링을 콜산 유사체에 대해 상기에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 6: 3'dApsU 2'OMe 의 4-벤즈아미도부틸 유사체 6o의 합성
Figure 112016016769190-pat00027
4-벤즈아미도부틸 요오다이드의 제조. 0-5℃에서 차가운 무수 DMF (5 mL)에, 티오닐 클로라이드 (0.2 mL)를 첨가하고, 혼합물을 15 분 동안 교반하였다. 무수 DMF (8 mL) 중 칼륨 요오다이드 (2.4 g, 5 mmol)의 용액을 첨가한 후에 무수 DMF (2 mL) 중 4-벤즈아미도부탄올 (193 mg, 1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 색을 갖는 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 냉각수 (~10 mL)에 부어서 처리하고, 에테르 (3 X 15 mL)로 추출하였다. 마지막으로, 에테르층을 물, 염수로 세척하고, 무수 소듐 설페이트로 건조하였다. 여과 및 용매의 제거 후 얻어진 미정제 생성물을 헥산과 에틸 아세테이트의 혼합물(4:1)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요오도 화합물을 오일로서 수득하였다. 45%; 1H NMR (CDCl3): δ 1.77 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 3.23 (t, 2H), 3.55 (q, 2H), 6.26 (br.s, 1H), 7.48 (m, 3H), 7.75 (m, 2H) ppm.
4-벤즈아미도부틸 요오다이드와 3'dApsU2'OMe의 커플링을 상기와 같이 수행하여 표제 화합물 6o를 수득하였다.
실시예 7: 3'dApsU 2'OMe 의 5-벤조일옥시펜틸 유사체의 합성
Figure 112016016769190-pat00028
5-벤조일옥시펜탄-1-올의 제조. 벤조산 (1 g), 1,5-펜탄디올 (5 mL) 및 p-톨루엔설폰산 (110 mg)의 혼합물을 오일욕에서 100℃로 하룻밤 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (50mL)에 붓고, EtOAc (2 X 25 mL)로 추출하고, 소듐 카르보네이트 (5%, 20mL)로 세척한 후에 염수 (15 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고, 농축시켜 거의 순수한 생성물 (1.15g, 67%)을 수득하였다.
5-벤조일옥시-1-요오도펜탄의 제조. 36% 수율. 1H NMR (CDCl3): δ 1.57 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 3.22 (t, 2H), 4.33 (t, 2H), 7.44 (m, 2H), 7.57 (m, 1H), 8.04 (m, 2H) ppm.
5-벤조일옥시-1-요오도펜탄과 3'dApsU2'OMe의 커플링을 상기와 같이 수행하였다.
5-벤조일옥시부탄-1-올의 제조. 이를 5-벤조일펜탄-1-올에 대한 절차에서 1,4-부탄디올을 이용하여 73% 수율로 제조하였다.
실시예 8: 3'dApsU 2'OMe 의 4-아세톡시벤질 유사체 6q의 합성
Figure 112016016769190-pat00029
단계 1. 4-아세톡시벤질 알코올의 제조. 얼음욕에서, 에틸 아세테이트 (25 mL) 중 4-히드록시벤질 알코올 (1.95g, 14 mmol)의 냉각된 현탁액에, 교반하에 트리에틸아민 (2.1 mL, 14.9 mmol)을 한번에 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (12 mL) 중의 아세틸 클로라이드 (1.1 mL, 15.5 mmol)의 용액을 첨가 깔대기로부터 적가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 고체를 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 농축 후에, 잔류물을 초기에 헥산을 사용하고 이후에 점차적으로 40% 에틸 아세테르를 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 수율 40%. 1H-NMR (CDCl3) δ 2.02 (br.s, 1H), 2.29 (s, 3H), 4.65 (s, 2H), 7.07 (d, 2H), 7.36 (d, 2H) ppm.
단계 2. 4-아세톡시벤질 요오다이드의 제조. 질소하, 무수 아세토니트릴 (10 mL) 중 4-아세톡시벤질 알코올 (0.332 g, 2 mmol), 및 세슘 요오다이드 (0.571 g, 2.2 mmol)의 용액에, 아세토니트릴 (5 mL) 중 보론 트리플루오라이드 에테레이트 (0.28 mL, 2.2 mmol)를 첨가하였다. 하룻밤 동안 교반한 후에, 반응 혼합물을 얼음 냉각된 물 (20 mL)에 붓고, 분리된 고체를 여과하고, 물로 세척한 후에 헥산으로 세척하였다. 고진공하에 생성물을 건조시켰다. 수율, 0.39g, 71%; TLC, 헥산:EtOAC (4:1). 1H NMR (CDCl3): δ 2.3 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 7.05 (d, 2H), 7.5 (d, 2H) ppm.
단계 3. 3'dApsU2'OMe의 4-아세톡시벤질 유사체의 합성. 3'dApsU2'OMe와 4-아세톡시벤질 요오다이드의 알킬화를 상기와 같이 수행하였다.
실시예 9: 1차 항-HCV 검정 및 2차 항-HCV 검정
1차 항- HCV 검정 - HCV에 대한 항바이러스 활성을 96-웰 플레이트 상에서 서브-컨플루언트 배양물로서 유지된 안정하게 발현하는 HCV 레플리콘 세포주, AVA5 [서브-게놈 (CON1), 유전자형 1b] (Blight, et al., 2000, Science 290:1972)를 이용하여 3일 검정으로 평가하였다 [Okuse, et al., 2005; Antiviral. Res. 65:23; Korba, et al., 2008, Antiviral Res. 77:56]. 항바이러스 활성을 세포간 HCV RNA의 블롯 혼성화 분석(blot hybridization analysis)으로 결정하였다 [각 배양 샘플에서 세포 B-액틴 RNA의 수준으로 일반화됨]. 세포독성을 병렬의 플레이트들에 유지된 배양물에서 중성 적색 염료 섭취로 평가하였다.
EC50, EC90, 및 CC50 값을 모든 처리된 배양물로부터 합쳐진 데이타[Korba & Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55; Okuse, et al., 2005, Antivir. Res. 65:23]를 이용하여 선형 회귀 분석(MS EXCEL®, QuattroPro®)으로 계산하였다. E50 및 E90 값에 대한 표준편차를 회귀 분석에 의해 발생된 표준 오차로부터 계산하였다. EC50 및 EC90을 세포간 HCV RNA의 2배, 또는 10배 저하(처리되지 않은 배양물에서의 평균 수준과 비교)가 각각 관찰되는 약물 농도이다. CC50은 중성 적색 염료 섭취의 2배 낮은 수준(처리되지 않은 배양물에서의 평균 수준과 비교)이 관찰되는 약물 농도이다. 선택도 지수(S.I.)를 CC50/EC50으로서 계산하였다. 재조합 인간 인터페론 2b (PBL laboratories, Inc.)를 검정 대조군으로서 사용하였다.
2차 항- HCV 검정 - 이러한 검정은 1차 검정에 대해 기술된 포맷을 이용하여 상이한 HCV 유전자형에 대한 활성을 평가하는 것이다. 유전자형 1b HCV에 대한 활성은 비교를 위해 포함되었다. H/FL-Neo (유전자형 1a (H77), 전장 작제물)를 함유한 레플리콘 세포주는 현재 입수가능하다 (Blight, et al., 2003, J. Virol. 77:3181). 레플리콘 세포주 AVA5 (서브-게놈 (CON1), 유전자형 1b; (Blight, et al., 2000, Science 290:1972).
1차 및 2차 검정의 결과는 표 3에 나타내었다.
Figure 112016016769190-pat00030
실시예 10: 세포독성 검정
본 화합물들의 세포독성 프로필을 세포주의 패널에 대해 수행하였다. 표준 MTT 검정을 96-웰 플레이트 판독기(ThermoMax,Molecular devices)가 결합된 프로메가 CellTiter96 비-방사활성 세포 증식 검정 키트를 사용하고, MDBK, Vero, 및 HFF 세포주 (ATCC로부터 입수)를 이용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 뉴클레오시드 유사체 3TC, AZT, 및 ddC, 및 약물이 존재하지 않는 배지를 포함한 여러 대조군을 사용하였다. SDS를 양성 세포독성 대조군으로서 사용하였다. 모든 프로뉴클레오티드를 100, 300 및 1000 μM의 농도에서 세 번씩 시험하였다. 세포를 시험 물질과 함께 24 시간 인큐베이션한 후에, MTT 검정을 수행하였다. 데이타는 하기 표 4에 나타내었다.
Figure 112016016769190-pat00031
실시예 11: 억제 검정
HCV NS5B RNA-의존 RNA 폴리머라제 (RdRp)의 억제제로서 본 발명의 화합물의 유효성을 하기 검정에서 측정할 수 있다.
HCV NS5B 폴리머라제의 억제에 대한 검정
이형 RNA 주형 상에서 C형 간염 바이러스 (HCV)의 RNA-의존 RNA 폴리머라제의 효소 활성을 억제하기 위한 본 발명의 화합물의 능력을 측정하기 위해 본 검정을 사용하였다.
절차:
검정 완충액 조건: (50 ㎕-전체/반응) 20 mM 트리스, pH 7.5, 50 μ M EDTA 5 mM DTT 2 mM MgCl2 80 mM KCl 0.4 U/㎕ RNAsin (Promega, 모액은 40 유닛/㎕임) 0.75 μg t500 (500-nt RNA는 C형 간염 게놈의 NS2/3 영역으로부터의 시퀀스로 T7 런오프(runoff) 전사를 이용하여 제조됨) 1.6 μg 정제된 C형 간염 NS5B (C-말단이 절단된 21개의 아미노산으로 형성) 1 μ M A,C,U,GTP (뉴클레오시드 트리포스페이트 혼합물) [알파-33P]-GTP 또는 [알파-32P]-GTP.
화합물을 100 μM 최종 농도 이하의 다양한 농도에서 시험하였다.
효소 및 주형 t500을 포함하는 적절한 부피의 반응 완충액을 제조하였다. 본 발명의 티오뉴클레오시드 유도체를 96-웰 플레이트의 웰에 피펫팅하였다. 방사선표지된 GTP를 포함하는, 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP)의 혼합물을 제조하고, 96-웰 플레이트의 웰에 피펫팅하였다. 효소-주형 반응 용액을 첨가하여 반응을 개시하고, 실온에서 1 시간 내지 2 시간 동안 처리하였다.
20 ㎕ 0.5M EDTA, pH 8.0을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 반응 완충액의 첨가 전에 NTP에 켄칭 용액을 첨가하는 블랭크 반응을 포함시켰다.
50 ㎕의 켄칭된 반응을 DE81 필터 디스크(Whatman) 상에 스폿팅하고, 30분 동안 건조시켰다. 필터를 0.3 M 암모늄 포르메이트, pH 8로 세척하였다 (1 mL 세척에서의 cpm이 100 미만이 될때까지, 150 mL/세척, 대개 6 세척). 필터를 섬광 계수기에서 5-mL 섬광 유체 중에서 계수하였다.
억제율을 하기 방정식에 따라 계산하였다: %억제 = [1-(시험 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)/(대조 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)] x 100
카운터스크린(Counterscreen)
인간 DNA 폴리머라제를 억제하기 위한 본 발명의 화합물들의 능력을 하기 검정으로 측정하였다.
a. 인간 DNA 폴리머라제 알파 및 베타의 억제:
반응 조건:
50 ㎕ 반응 부피 반응 완충액 성분들: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 200 μg/mL 소혈청 알부민 100 mM KCl 2 mM ß-메르캅토에탄올 10 mM MgCl2 1.6 μM dA, dG, dC, dTTP α33P-dATp 효소 및 주형: 0.05 mg/mL 갭핑된 물고기 정자 DNA 주형 0.01 U/㎕ DNA 폴리머라제 α 또는 ß 갭핑된 물고기 정자 DNA 주형의 제조: 5 ㎕ 1M MgCl2를 500 ㎕ 활성화된 물고기 정자 DNA (USB 70076)에 첨가; 37℃로 가온시키고 30 ㎕의 65 U/㎕ 엑소뉴클레아제 III (GibcoBRL 18013-011)를 첨가; 5 분 동안 37℃에서 인큐베이션; 65℃에서 10분 동안 가열하여 반응 종결; 50-100 ㎕ 분취액을 20 mM Tris-HCl, pH 7.5로 평형이 유지된 바이오-스핀(Bio-spin) 6 크로마토그래피 컬럼 (Bio-Rad 732-6002) 상에 로딩; 1,000 g으로 4분 동안 원심분리하여 용리; 용리액을 풀링(pool)하고, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정.
DNA 주형을 적절한 부피의 20 mM Tris-HCl, pH 7.5로 희석시키고, 효소를 2 mM ß-메르캅토에탄올 및 100 mM KCl을 함유한 적절한 부피의 20 mM Tris-HCl로 희석시켰다. 주형 및 효소를 마이크로원심분리기 튜브 또는 96 웰 플레이트에 피펫팅하였다. 효소를 배제한 블랭크 반응물 및 시험 화합물을 배제한 대조 반응물을 또한 효소 희석 완충액 및 시험 화합물 용매를 각각 이용하여 제조하였다. 상술된 성분들과 함께 반응 완충액으로 반응을 개시하였다. 반응을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 20 ㎕ 0.5M EDTA를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 50 ㎕의 켄칭된 반응물을 Whatman DE81 필터 디스크 상에 스폿팅하고, 공기로 건조시켰다. 필터 디스크를, 1 mL의 세척으로 < 100 cpm이 될 때까지 150 mL 0.3M 암모늄 포르메이트, pH 8로 세척하였다. 디스크를 150 mL 무수 에탄올로 2회 세척하고 150 mL 무수 에테르로 1회 세척하고, 건조하고, 5 mL 섬광 유체 중에서 계수하였다.
억제율을 하기 방정식에 따라 계산하였다: %억제 = [1-(시험 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)/(대조 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)] x 100
인간 DNA 폴리머라제 감마의 억제:
인간 DNA 폴리머라제 감마의 억제에 대한 가능성을 20 mM 트리스 pH 8, 2 mM ß-메르캅토에탄올, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 및 0.1 μg/㎕ BSA를 함유한 완충액 중 .5 ng/㎕ 효소; 10 μM DATP, dGTP, dCTP, 및 TTP; 2 μCi/반응 [α33P]-dATP, 및 0.4 μg/㎕ 활성화된 물고기 정자 DNA(US Biochemical로부터 시판)를 포함하는 반응물에서 측정하였다. 반응을 37℃에서 1 시간 동안 처리하고, 0.5 M EDTA를 142 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 생성물 포메이션을 음이온 교환 필터 결합 및 섬광 계수로 정량화하였다. 화합물들을 50 μM 이하에서 시험하였다.
억제율을 하기 방정식에 따라 계산하였다: %억제 = [1-(시험 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)/(대조 반응에서의 cpm - 블랭크에서의 cpm)] x 100
HIV 감염성 및 HIV 확산(spread)을 억제하기 위한 본 발명의 화합물들의 능력을 하기 검정으로 측정하였다.
HIV 감염성 검정:
낮은 백그라운드 ß-갈락토시다제 (ß-gal) 발현에 대해 선택된 CXCR4 및 CCR5 둘 모두를 발현시키는 HeLa Magi의 변형체로 검정을 실시하였다. 세포를 48 시간 동안 감염시키고, 통합된 HIV-1 LTR 촉진제로부터의 ß-gal 생산을 화학발광 기질 (Galactolight Plus, Tropix, Bedford, Mass.)로 정량화하였다. 억제제를 100 μM에서 출발하여 2배 계단 희석으로 적정하였다 (두배(in duplicate)); 각 농도에서의 억제율을 대조 감염과 비교하여 계산하였다.
HIV 확산의 억제:
인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 확산을 억제하기 위한 본 발명의 화합물들의 능력을 미국특허번호 5,413,999 (May 9, 1995), 및 문헌[J. P. Vacca, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 4096-4100 (1994)]에 기술된 방법으로 측정하였으며, 이러한 특허 및 문헌은 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
다른 RNA-의존 RNA 바이러스에 대한 본 발명의 화합물의 활성을 측정하기 위해 하기 검정을 이용하였다. 리노바이러스에 대한 화합물의 시험관내 항바이러스 활성의 결정 (세포변성 효과 억제 검정); 검정 조건은 문헌에 기술된 바와 같다[Sidewall and Huffman, "Use of disposable microtissue culture plates for antiviral and interferon induction studies," Appl. Microbiol. 22: 797-801 (1971)].
바이러스:
리노바이러스 타입 2 (RV-2), 균주 HGP를 KB 세포 및 상기 시드웰(Sidwell) 및 호프만(Huffman)의 문헌에 기술된 배지 (0.1% NaHCO3, 항생제가 존재하지 않음)와 함께 사용하였다. ATCC로부터 얻어진 바이러스는 가벼운 급성 열병 상부 호흡기 질환에 걸린 성인 남성의 목 스윕(throat swab)으로부터 얻어진 것이다.
리노바이러스 타입 9 (RV-9), 균주 211, 및 리노바이러스 타입 14 (RV-14), 균주 토우(Tow)를 또한 미국미생물보존센터(American Type Culture Collection; ATCC (Rockville, Md. 소재))로부터 획득하였다. RV-9는 인간 목 세척으로부터 얻어지며, RV-14는 상부 호흡기 질환에 걸린 청년의 목 스윕으로부터 얻어진다. 이러한 바이러스 모두를, 인간 자궁 경부암 상피 세포인 HeLa Ohio-1 세포 (Dr. Fred Hayden, Univ. (VA))와 함께 사용하였다. 5% 우태아 혈청(FBS) 및 0.1% NaHCO3를 지닌 MEM (이글의 최소 필수 배지)를 성장 배지로서 사용하였다.
3가지 바이러스 타입 모두에 대한 항바이러스 시험 배지는 5% FBS, 0.1% NaHCO3, 50 μg 겐타마이신/mL, 및 10 mM MgCl2를 함유한 MEM이다.
2000 μg/mL는 본 발명이 화합물을 검정하기 위해 사용되는 가장 높은 농도이다. 바이러스를 시험 화합물을 첨가하고 대략 5분 후에 검정 플레이트에 첨가하였다. 또한 적절한 대조군을 진행시켰다. 검정 플레이트를 37℃에서 가습된 공기 및 5% CO2와 함께 인큐베이션하였다. 세포독성을 대조군 세포에서 구조적 변화에 대해 현미경으로 모니터링하였다. 바이러스 CPE 데이타 및 독성 대조군 데이타의 회귀 분석은 ED50 (50% 유효 용량) 및 CC50 (50% 세포독성 농도)을 제공하였다. 선택도 지수(SI)를 하기 식으로 계산하였다: SI=CC50/ED50.
뎅기열, 반지(Banzi), 및 황열병에 대한 화합물들의 시험관내 항바이러스 활성의 측정 (CPE 억제 검정).
검정 내용은 상기 시드웰 및 호프만의 참조문헌에 제공되어 있다.
바이러스:
뎅기열 바이러스 타입 2, 뉴기니아 균주(New Guinea strain)를 질병 통제 센터로부터 획득하였다. 아프리카 그린 몽키 신장 세포의 2개의 세포주를 사용하여 바이러스(Vero)를 배양하고, 항바이러스 시험(MA-104)을 실행하였다. 감염된 마우스 뇌로부터 제조된 황열병 바이러스, 17D 균주, 및 남아프리카의 열병에 걸린 소년의 혈청으로부터 분리된 반지 바이러스, H 336 균주 둘 모두를 ATCC로부터 획득하였다. Vero 세포를 검정을 위해 이러한 둘 모두의 바이러스와 함께 사용하였다.
세포 및 배지:
MA-104 세포 (BioWhittaker, Inc., Walkersville, Md.) 및 Vero 세포 (ATCC)를 항생제 없이 5% FBS 및 0.1% NaHCO3를 함유한 배지 중에서 사용하였다. 뎅기열, 황열병, 및 반지 바이러스를 위한 검정 배지는 MEM, 2% FBS, 0.18% NaHCO3 및 50 μg 겐타마이신/mL이다. 본 발명의 화합물들의 항바이러스 시험을 시드웰 및 호프만의 참조문헌에 따라 그리고 상기 리노바이러스 항바이러스 시험과 유사하게 실행하였다. 적절한 세포변성 효과 (CPE)를 이러한 바이러스 각각에 대해 5일 내지 6일 후에 기록하였다.
웨스트 나일 바이러스에 대한 화합물들의 시험관내 항바이러스 활성의 측정 (CPE 억제 검정).
검정 내용은 상기에서 인용된 시드웰 및 호프만의 참고문헌에 제공되어 있다. 수닭 뇌로부터 유래된 뉴욕 분리물(New York isolate)인 웨스트 나일 바이러스를 질병 통제 센터로부터 획득하였다. Vero 세포를 상기에서 기술된 바와 같이 성장시키고 사용하였다. 시험 배지는 MEM, 1% FBS, 0.1% NaHCO3 및 50 μg 겐타마이신/mL이다.
본 발명의 화합물들의 항바이러스 시험을 시드웰 및 호프만의 방법을 따라 실행하였으며, 이러한 방법은 리노바이러스 활성에 대한 검정을 위해 사용된 방법과 유사한 것이다. 적절한 세포변성 효과 (CPE)를 5일 내지 6일 후에 기록하였다.
리노, 황열병, 뎅기열, 반지 및 웨스트 나일 바이러스에 대한 화합물들의 시험관내 항바이러스 활성의 측정 (중성 적색 염료 섭취 검정(Neutral Red Uptake Assay))
상기 CPE 억제 검정을 수행한 후에, 문헌[Microtiter Assay for Interferon: Microspectrophotometric Quantitation of Cytopathic Effect," Appl. Environ. Microbiol. 31: 35-38 (1976)]에 기술된 추가의 세포변성 검색 방법을 이용하였다. 모델 EL309 마이크로플레이트 판독기 (Bio-Tek Instruments Inc.)를 이용하여 검정 플레이트를 판독하였다. ED50 및 CD50을 상기와 같이 계산하였다.
실시예 12: 항- HCV 화합물, 리바비린, 인터페론, 뉴클레오시드 유사체 2'CmeC 및 프로테아제 억제제 VX-950와 조합한 화합물 2의 상승적 항바이러스 활성
인터페론, 리바비린, VX-950 (프로테아제 억제제), 및 2'CmeCyt (폴리머라제 억제제)와 표 1의 화합물 2 (또한 반응식에서 6k로 언급됨)의 조합 치료를 실시예 9에 기술된 1차 레프리콘 검정을 이용하여 수행하였다. 간단하게, 2개의 제제를 각 화합물의 EC90 값(HCV RNA의 10배의 감소가 관찰되는 약물 농도)을 기초로 하여 개개의 제제의 사전결정된 상대적 비율로 함께 혼합하였다. 제제들의 각 조합을 위하여, 대등한 항바이러스 농도에서 화합물들의 사용을 중심으로, 농도 비율을 사용하였다. 이후에 희석 계단 (dilution series) (대략 EC90에서 시작하는, 6개의 3배 농도 단계)을 각 희석 단계에서 동일하게 잔류하는 2개의 제제의 농도 비율로 생성시켰다. 독성 분석을 단일치료에 대해 상술된 바와 같이 수행하였다. 조합 연구에서 약물 상호작용의 분석을 CALCUSYN 프로그램 (Biosoft, Inc., Cambridge, United Kingdom)을 이용하여 측정하였다. 이러한 프로그램은 신뢰 한계를 제공하기 위한 몬테 카를로 기술을 이용하는 통계학적 분석을 갖는 초유(Chou) 및 탈랄레이(Talalay)의 방법, 분율-영향-신뢰 구간 (FA-CI) 플롯, 이소볼로그램(isobologram), 및 중간-효과 플롯을 포함하는 여러 방법을 이용하여 상승효과, 부가성(additivity) 또는 길항성(antagonism)을 평가한다 (Belenkii, M. S. Schinazi, R. A method for the analysis of combination therapies with statistical analysis. Antiviral Res. 25, 11, 2005). 데이타는 하기 표 5에 나타내었다.
Figure 112016016769190-pat00032
Figure 112016016769190-pat00033
실시예 13: 화합물 2의 시험관내 박테리아 변이원성 검정
절차: 화합물 2를 건조된 디메틸설폭사이드(DMSO)에서 포뮬레이션시키고, 박테리아 돌연변이 시험의 사전-인큐베이션 버젼을 이용하여 1/2 log10 희석의 적절한 수와 함께 5000 ㎍/플레이트의 최대 농도 (이러한 검정을 이한 표준 한계 용량)에서 시험하였다. 멸균성 체크 플레이트 상에 콜로니의 부재는 미생물 오염의 부재를 확인시키는 것이다. 비히클 대조군에 대한 중간 복귀돌연변이체(revertant) 콜로니 계수는 실험실 과거 대조군 범위에 또는 이러한 범위내에 가깝다.
100 마이크로미터 분취액의 적절한 박테리아 배양물을 얼음에 저장된 샘플 튜브에 분산시켰다. 비히클의 분취액, 양성 대조군 또는 투약 포뮬레이션을 적절한 샘플 튜브에 분산시켰다. 2 mL 상부 아가 및 HBT 캡을 샘플 튜브에 첨가하고, 3회 뒤집고, MG 플레이트에 부었다. 뚜껑을 플레이트 상에 배치시키고, 아가 경화를 위해 등위면(level surface)상에 방치하였다. 플레이트를 48 시간 내지 72 시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 백그라운드 론천(lawn) 및 복귀돌연변이체의 갯수를 각 플레이트에 대해 체크하였다.
대조군: 적절한 양성 대조군 화합물 (요구되는 경우 S9 혼합물을 함유)은 적절한 박테리아 균주를 갖는 동시발생 비히클 대조군 수준의 적어도 2배로 (균주 TA100에 대해 1.5 ×) 복귀돌연변이체 콜로니 갯수의 증가를 유도하였는데, 이는 시험 시스템의 민감도 및 S9 혼합물의 활성을 확인하는 것이다.
결과: 비-복귀돌연변이체 박테리아의 백그라운드 론천의 어떠한 보여지는 박막화가 화합물 2에 대한 노출 후에 얻어지지 않았는데, 이는 시험 물품이 시험된 수준에서 박테리아에 비독성적인 것을 명시하는 것이다. 어떠한 침전도 관찰되지 않았다. 복귀돌연변이체의 실질적인 증가가 S9 혼합물의 부재 또는 존재하에 시험 물품 화합물 2에 노출 후에 임의의 균주에서 얻어지지 않았다. 이에 따라, 화합물 2는 이러한 시험관 변이원성 검정에서 유전자독성 활성의 어떠한 증거도 나타내지 않는다고 단정된다. 데이타는 하기 표 6, 표 7, 표 8, 표 9 및 표 10에 나타내었다.
Figure 112016016769190-pat00034
Figure 112016016769190-pat00035
Figure 112016016769190-pat00036
Figure 112016016769190-pat00037
Figure 112016016769190-pat00038
모든 양성 대조군들은 공지된 돌연변이원이다.
실시예 14: uPA SCID (KMT) 마우스에서 화합물 2의 내약성 연구
본 연구의 목적은 KMT 마우스에서 14일 투약 기간에 걸쳐 화합물 2의 내약성을 평가하고, 연구 동물에서 약물의 약물동력학적 성질들을 평가하기 위한 것이다. 2개의 개별적인 동물의 그룹들을 비히클 대조군 또는 300 mg/kg의 일일 약물 용량으로 14일 동안 처리하였다. 연구 동물의 혈청에서 약물의 농도를 측정하기 위하여, 혈액 샘플을 1일(첫번째 투약), 7일, 및 14일(마지막 투약)에 약물 투약 후 15분에 획득하였다. 체중 및 건강 지수 스코어를 투약 절차 및 약물에 대한 연구 동물의 내약성을 평가하기 위해 매일 모니터링하였다. 연구 중 매일 아침에, 1병의 화합물 2를 0.05M 시트르산, pH 3.0, 비히클에 40 mg/mL의 요망되는 농도로 용해시켰다. 용액을 동물에 7.5 ml/kg의 부피로 투약하기 위해 사용하였다. 시트르산 완충액을 또한 비히클 대조군 동물의 투약을 위해 사용하였다.
낮은 생착의 인간 간 세포를 갖는 10 마리의 KMT 형질 전환 동물 (6주에 20 미만의 hAAT 값)을 본 연구를 위해 할당하였다. 동물들의 개개의 체중을 치료 전에 기록하고, 본 연구 동안 매일 기록하였다. 동물들을 또한 임상 징후를 위해 하루에 한번씩 (오전 투약시에) 평가하고, 이환률 및 사망률에 대해 모니터링하였다. 연구 동물을 5마리 동물의 2 그룹으로 할당하였다. 화합물 2 또는 시트르산 비히클 대조군을 각 동물에 대해 멸균 시린지 및 공급 니들을 이용하여 경구 영양 급식으로 하루에 한번 투여하였다. 투약 부피는 모든 그룹에 대해 7.5 mL/kg (150 ㎕/20 그램 체중)이었다. 각 개개 동물의 일일 체중을 기초로 하여 부피를 조절하였다. 그룹 1 동물은 시트르산 대조군을 수용하였고, 그룹 2 동물은 화합물 2를 300 mg/kg으로 수용하였다. 본 연구는 1일째에 제 1 약물 용량을 아침에 투여하면서 시작하고, 약물 처리의 마지막 날인 14일까지 지속하였다. 혈액을 1일째에 제 1 약물 투약 후 15분에, 7일 째에 약물 투약 후 15분에, 및 14일 째에 약물 투약 후 15분에 그룹의 모든 동물로부터 종앙 꼬리 동맥에서 수집하였다. 혈액 샘플을 응고시키고, 상기 응고된 혈소판으로부터 혈청을 제거하였다. 혈청 샘플을 연구 의뢰자에게 운송하기 전에 -80℃에서 저장하였다. 최종 실험 스케쥴은 하기 표 11에 요약되어 있다.
Figure 112016016769190-pat00039
동물들의 개개 체중을 치료 전에 기록하고, 연구 과정 동안에 매일 기록하였다. 동물들을 또한 임상 징후에 대해 매일 평가하고 이환률 및 사망률에 대해 모니터링하였다. 연구 동물들의 이환률(건강 지수)을 모니터링하기 위해 사용되는 표준화된 스케일을 하기 표 12에 요약하였다.
Figure 112016016769190-pat00040
화합물 2는 일반적으로 연구 동물들에 의해 내약성을 나타내었다. 비히클 대조군에서의 1마리의 동물은 본 연구의 11일에서 14일에 중간정도 상승된 건강 지수를 나타내었다. 약물 치료 그룹에서의 2마리의 동물은 또한 중간정도 상승된 건강 지수 값을 나타내었다. 다른 모든 연구 동물들은 연구를 완료하였으며, 이들의 건강 수치는 이들의 초기 값 보다 매우 큰 스코어와 동일하거나 절반 정도 크다.
건강 지수 값은 하기 표 13에 나타내었다.
Figure 112016016769190-pat00041
비히클 대조군에서의 2마리 동물 (F139 및 F170)은 본 연구의 1일에서 14일까지 체중의 순한계 손실(marginal net loss)을 갖는다. 약물 그룹에서의 1마리 동물(F187)은 또한 체중의 작은 감소를 나타내었다.
연구 절차, 약물 및 약물 비히클은 연구 동물의 건강에 다양한 영향을 미친다. 본 연구에서, 10마리 중 단 3마리의 동물이 임의 정도의 악영향을 나타내었으며, 결국, 이는 대조군과 약물 그룹 간에 동일하게 분포되었다. 이에 따라, 본 투약법 및 300 mg/kg의 약물 용량은 동물에 의해 내약성을 잘 나타내었다.
당업자에게 입수될 수 있는 본원에서 언급되는 특허 및 과학적 문헌은 지식을 확립시킨다. 본원에 인용된 모든 미국특허 및 공개되거나 비공개된 미국특허출원은 참고문헌에 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허출원은 참고문헌으로 포함된다. 본원에 인용된 다른 모든 공개된 참고문헌, 문서, 원고, 및 과학적 문헌은 참고문헌으로 포함된다.
본 발명이 특히 이의 바람직한 구체예들을 참조로 하여 도시되고 기술되었지만, 형태 및 설명의 다양한 변형예가 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 본원에서 이루어질 수 있는 것으로 당업자에게 이해될 것이다. 또한, 본원에 기술된 구체예들은 서로 배타적이지 않으며 다양한 구체예들로부터의 특징들은 본 발명에 따라 전체적으로 또는 부분적으로 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 (III)을 갖는 화합물을 포함하는, HCV(hepatitis C viral) 감염증의 예방 또는 치료용 약제 조성물:
    Figure 712017002812911-pat00054

    상기 식에서,
    M' 및 M"는 각각 독립적으로 O 및 S로부터 선택되며;
    X'는 O 또는 S이며;
    Y'는 OR12 또는 SR12이며; 여기서 각 R12는
    Figure 712017002812911-pat00060
    또는
    Figure 712017002812911-pat00061
    로 치환된 C1-12알킬이며;
    Z' 및 Z"는 O이며;
    R 및 R'는 각각 독립적으로 H, OH, 또는 O-C1-4알킬이며;
    B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌 또는 우라실로부터 선택되며;
    Q'는 부재이거나,
    Figure 712017002812911-pat00055
    이며, 여기서 X' 및 Y'는 상기에서 정의된 바와 같으며, A는 OH이다.
  2. 제1항에 있어서, M' 및 M"이 각각 독립적으로 O인 약제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, X'가 O인 약제 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, HCV 감염증이 2차 바이러스와의 HCV 동시 감염증(co-infection)인 약제 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 2차 바이러스가 HBV(hepatitis B viral), HIV(human immunedeficiency virus), 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 웨스트 나일 바이러스(West Nile Virus), 뎅기열 바이러스(Dengue Virus), RSV(respiratory syncytial virus), 또는 리노바이러스(Rhinovirus)인 약제 조성물.
  10. 삭제
KR1020167004420A 2008-04-03 2009-04-03 바이러스 감염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 KR101806314B1 (ko)

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