WO2020114495A1 - 二核苷酸化合物及其前体药物 - Google Patents

二核苷酸化合物及其前体药物 Download PDF

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刘保民
朱炎
盖阔
黄雨
尧超
童顺禹
张洋
王晓金
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Abstract

公开了二核苷酸化合物及其前体药物。具体而言，公开了通式(I)所示的二核苷酸化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、其制备方法、其药物组合物及其在治疗乙型肝炎病毒感染，尤其是乙型肝炎病毒感染引起的肝脏疾病中的医药用途。

Description

二核苷酸化合物及其前体药物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月06日向中国国家知识产权局提交的第201811487263.4号中国专利申请的优先权和权益，所述申请公开的全部内容通过引用整体并入本文中。
技术领域
本申请涉及二核苷酸化合物及其前体药物、其制备方法、含有该化合物的药物组合物、以及其在治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染和与HBV有关的肝脏疾病方面的用途。
背景技术
慢性乙型病毒性肝炎目前不可治愈只能控制，临床中已经认可的两种抗HBV药物包括α干扰素和核苷类似物，但是通常存在耐药性的快速出现和与治疗有关的剂量限制的毒性问题。另外很多当前的药物受到吸收、分布、代谢和/或排泄(ADME)特性差的困扰，妨碍了其更广泛的应用。ADME特性差也是候选药物在临床试验中失败的一大原因。
已有的低聚核苷酸药物如SB9000及其前体药SB9200，在未经治疗无肝硬化的慢性乙肝患者中兼具安全性和抗病毒效用，但是仍需要开发具有更优的抗HBV活性、安全性、前药释放活性化合物速度及生物利用率，较高的稳定性及一定的肝靶向性的化合物。
发明概述
本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2019123704-appb-000001
其中，R 1选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000002
R选自C 1-12烷基、C 1-12烷氧基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，所述R基团任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素、-OH、C 1-6烷基、-(OCH 2CH 2) m-OC 1-6烷基、-NO 2、-CN、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(O)C 1-6烷基、-C(O)OC 1-6烷基、-CONHC 1-6烷基、-SH、-SC 1-6烷基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，其中m选自0、1、2、3、4或5；
R 2选自H、-OH、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 3-10环烷基、3-10元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基；
R 3选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000003
R 4选自H、C 1-6烷基、C 3-6环烷基或3-6元杂环烷基。
另一方面，本申请涉及药物组合物，其包含本申请的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐。
另一方面，本申请涉及治疗或抑制哺乳动物的HBV感染的方法，包括对有需要的哺乳动物给予治疗有效量的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐或上述药物组合物。
另一方面，本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐或上述药物组合物在制备用于预防或治疗哺乳动物的HBV感染的药物中的用途。
另一方面，本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐或上述药物组合物在预防或治疗哺乳动物的HBV感染中的用途。
另一方面，本申请涉及用于预防或治疗哺乳动物的HBV感染的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐或上述药物组合物。
发明详述
本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2019123704-appb-000004
其中，R 1选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000005
R选自C 1-12烷基、C 1-12烷氧基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，所述R基团任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素、-OH、C 1-6烷基、-(OCH 2CH 2) m-OC 1-6烷基、-NO 2、-CN、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(O)C 1-6烷基、-C(O)OC 1-6烷基、-CONHC 1-6烷基、-SH、-SC 1-6烷基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，其中m选自0、1、2、3、4或5；
R 2选自H、-OH、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 3-10环烷基、3-10元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基；
R 3选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000006
R 4选自H、C 1-6烷基、C 3-6环烷基或3-6元杂环烷基。
本申请涉及通式I化合物或其药学上可接受的盐，
Figure PCTCN2019123704-appb-000007
其中，R 1选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000008
R选自C 1-12烷基、C 1-12烷氧基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，所述R任选地被以下基团取代：卤素、-OH、C 1-6烷基、-(OCH 2CH 2) m-OC 1-6烷基、-NO 2、-CN、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(O)C 1-6烷基、-C(O)OC 1-6烷基、-CONHC 1-6烷基、-SH、-SC 1-6烷基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，其中m选自0、1、2、3、4或5；
R 2选自H、-OH、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 3-10环烷基、3-10元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基；
R 3选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000009
R 4选自H、C 1-6烷基、C 3-6环烷基或3-6元杂环烷基。
在一些实施方案中，
Figure PCTCN2019123704-appb-000010
与
Figure PCTCN2019123704-appb-000011
结合，形成
Figure PCTCN2019123704-appb-000012
其中
Figure PCTCN2019123704-appb-000013
为一价阳离子。在一些实施方案中，
Figure PCTCN2019123704-appb-000014
可以为碱金属阳离子或铵阳离子，例如，Na +、K +、Li +或NH 4 +。在一些实施方案中，
Figure PCTCN2019123704-appb-000015
可以为Na +或NH 4 +；在一些实施方案中，
Figure PCTCN2019123704-appb-000016
可以为NH 4 +。在一些实施方案中，所述通式I化合物的药学上可接受的盐选自钠盐或铵盐。在一些实施方案中，所述通式I化合物的药学上可接受的盐选自铵盐。
在一些实施方案中，R 1选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000017
在一些实施方案中，m选自0、1、2或3；在一些实施方案中，m选自0、1或2；在一些实施方案中，m为0。
在一些实施方案中，R选自C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯基或C 2-6炔基，所述R任选地被一个或多个选自以下的基团取代：-(OCH 2CH 2) m-OCH 3、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基；在一些实施方案中，R选自C 1-6烷基或C 1-6烷氧基，所述R任选地被一个或多个C 3-6环烷基取代；在一些实施方案中，R选自(CH 3) 2CHO-、(CH 3CH 2) 2CHO-、(CH 3) 2CHCH 2O-、(CH 3CH 2) 2CHCH 2O-、(CH 3) 3CCH 2O-、环丙基-CH 2O-、(CH 3) 2CH-或(CH 3) 3C-。
在一些实施方案中，R 2选自H、-OH或卤素；在一些实施方案中，R 2选自H或卤素；在 一些实施方案中，R 2选自H或氟。在一些实施方案中，R 2选自H。
在一些实施方案中，R 3选自
Figure PCTCN2019123704-appb-000018
在一些实施方案中，R 4选自C 1-6烷基；在一些实施方案中，R 4选自C 1-3烷基；在一些实施方案中，R 4为甲基。
在一些实施方案中，通式I化合物的药学上可接受的盐选自通式I化合物的钠盐或通式I化合物的铵盐。
在一些实施方案中，本申请的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐选自以下化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2019123704-appb-000019
Figure PCTCN2019123704-appb-000020
在一些实施方案中，本申请的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐选自：
Figure PCTCN2019123704-appb-000021
Figure PCTCN2019123704-appb-000022
Figure PCTCN2019123704-appb-000023
另一方面，本申请涉及药物组合物，其包含本申请的通式I化合物、其互变异构体、立体 异构体或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本申请的药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
另一方面，本申请涉及治疗或抑制哺乳动物的HBV感染方法，包括对有需要的哺乳动物，优选人类，给予治疗有效量的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或上述药物组合物。
另一方面，本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或上述药物组合物在制备用于预防或治疗哺乳动物的HBV感染的药物中的用途。
另一方面，本申请涉及通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或上述药物组合物在预防或治疗哺乳动物的HBV感染的用途。
另一方面，本申请涉及预防或治疗哺乳动物的HBV感染的通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或上述药物组合物。
在本申请的部分实施方案中，所述治疗HBV感染指控制、降低或清除HBV以缓解或治愈受感染的哺乳动物或患者的肝脏疾病。
定义
除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
术语“被取代”是指特定原子或基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子或基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。
术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选地”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH 2CH 3)、单取代的(如CH 2CH 2F)、多取代的(如CHFCH 2F、CH 2CHF 2等)或完全被取代的(CF 2CF 3)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。
本文中的C m-n是指该部分具有给定范围中的整数个碳原子。例如“C 1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基”是指通式为C nH 2n+1的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“C 1- 12烷基”指含有1至12个碳原子的烷基；术语“C 1- 6烷基”指含有1至6个碳原子的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、己基、2-甲基戊基等)。类似地，烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷酰基、烷基磺酰基和烷硫基的烷基部分(即烷基)具有上述相同定义。
术语“烷氧基”指-O-烷基。
术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。
术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个叁键的不饱和脂肪族烃基。炔基的非限制性实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、1-丙炔基(-C≡C-CH 3)、2-丙炔基(-CH 2-C≡CH)、1,3-丁二炔基(-C≡C-C≡CH)等。
术语“环烷基”指完全饱和的并且可以以呈单环、稠环、桥环或螺环形式存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环或3-6元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等。
术语“杂环烷基”是指完全饱和的并且可以以单环、稠环、桥环或螺环形式存在的环状基团，其可以具有1至4个选自氮、氧和/或硫的杂原子。除非另有指示，该杂环烷基通常为含有1至3个独立地选自硫、氧和/或氮的杂原子(优选1或2个杂原子)的3至6元环、3至7元环或3至10元环。3元杂环烷基的实例包括但不限于环氧乙烷基、环硫乙烷基、环氮乙烷基，4元杂环烷基的非限制性实例包括但不限于吖丁啶基、噁丁环基、噻丁环基，5元杂环烷基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、异噁唑烷基、噁唑烷基、异噻唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、四氢吡唑基，6元杂环烷基的实例包括但不限于哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、哌嗪基、1,4-噻噁烷基、1,4-二氧六环基、硫代吗啉基、1,3-二噻烷基、1,4-二噻烷基，7元杂环烷基的实例包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基。优选为具有5或6个环原子的单环杂环烷基。
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子、6-12个碳原子或6-10个碳原子。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和1,2,3,4-四氢化萘等。
术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个(例如1个、2个、3个、4个、5个或1至3个)选自N、O和S的杂原子作为环原子，其余环原子为C，并且具有至少一个芳香环。杂芳基可以为含有1至3个或1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的5至10元芳香环。优选的杂芳基具有单个5至8元环，或包含6至14个，尤其是6至10个环原子的多个稠合环。杂芳基的非限制性实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。
术语“预防”意为防止疾病、病症或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病、病症或疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病、病症或疾病状态时，或者当这类哺乳动物易处于患有该疾病、病症或疾病状态的风险中时。
术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
(i)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
(ii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、疾病状态或病症，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、疾病状态或病症的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、疾病状态或病症的一种或多种症状发作的本申请化合物的用量。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量取决于该化合物、疾病、疾病状态或病症及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
作为药学上可接受的盐，例如，可以为金属盐(例如，碱金属盐、碱土金属盐、铝盐、铁盐等)、铵盐、与有机碱(例如有机胺)形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。
术语“药物组合物”是指包含一种或多种本申请的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的辅料的混合物。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。
术语“药学上可接受的辅料”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害活性化合物的生物活性及性能的那些辅料。合适的辅料是本领域技术人员熟知的，例如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等。
词语“包括(comprise)”或“包含(comprise)”及其英文变体例如comprises或comprising应理解 为开放的、非排他性的意义，即“包括但不限于”。
本申请的化合物和中间体还可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含于本申请的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指可经由低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移的互变，如酮-烯醇及亚胺-烯胺异构化。质子互变异构体的具体实例是咪唑部分，其中质子可在两个环氮间迁移。价互变异构体包括通过一些成键电子的重组的互变。
本申请化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体，如对映异构体和非对映异构体都包括在本申请的范围内。本申请的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
本申请的化合物可以存在特定的几何异构体或立体异构体形式。本申请设想所有的这类化合物，包括互变异构体、顺式和反式异构体、(-)-和(+)-对映体、(R)-和(S)-对映体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体，及其外消旋混合物和其他混合物，例如对映异构体或非对映体富集的混合物，所有这些都属于本申请的范围之内。烷基等取代基中可以存在另外的不对称碳原子。所有这些异构体以及它们的混合物均包括在本申请的范围之内。
本申请的药物组合物可通过将本申请的化合物与适宜的药学上可接受的辅料组合而制备，例如可配制成固态、半固态、液态或气态制剂，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、膏剂、乳剂、悬浮剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球及气溶胶等。
给予本申请化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物的典型途径包括但不限于口服、直肠、局部、吸入、肠胃外、舌下、阴道内、鼻内、眼内、腹膜内、肌内、皮下、静脉内给药。
本申请的药物组合物可以采用本领域众所周知的方法制造，如常规的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣药丸法、磨细法、乳化法、冷冻干燥法等。
在一些实施方案中，药物组合物是口服形式的剂型。对于口服给药，可以通过将活性化合物与本领域熟知的药学上可接受的辅料混合，来配制该药物组合物。这些辅料能使本申请的化合物被配制成片剂、丸剂、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、液体、凝胶剂、浆剂、悬浮剂等，用于对患者的口服给药。
可以通过常规的混合、填充或压片方法来制备固体口服组合物。例如，可通过下述方法获得：将所述的活性化合物与固体辅料混合，任选地碾磨所得的混合物，如果需要则加入其它合适的辅料，然后将该混合物加工成颗粒，得到了片剂或糖衣剂的核心。适合的辅料包括但不限于：粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、甜味剂或矫味剂等。
药物组合物还可适用于肠胃外给药，如合适的单位剂型的无菌溶液剂、混悬剂或冻干产品。
本文所述的通式Ⅰ化合物的所有给药方法中，每天给药的剂量为0.01mg/kg体重到200mg/kg体重，以单独剂量或分开剂量的形式。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。
本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
本领域合成路线规划中的一个重要考量因素是为反应性官能团(如本申请中的羟基)选择合适的保护基，例如，可参考Greene's Protective Groups in Organic Synthesis(4th Ed).Hoboken,New Jersey:John Wiley&Sons,Inc.本申请引用的所有参考文献整体上并入本申请。
在一些实施方案中，本申请通式I的化合物可以由有机合成领域技术人员通过以下路线来制备：
路线1：
Figure PCTCN2019123704-appb-000024
路线2：
Figure PCTCN2019123704-appb-000025
其中，R 1、R、R 2、R 4定义同上述通式I化合物。
本申请采用下述缩略词：
Me代表甲基；TBDPS代表叔丁基二苯基硅烷基；DMSO代表二甲基亚砜。
为清楚起见，进一步用实施例来阐述本发明，但是实施例并非限制本申请的范围。本申请所使用的所有试剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。
具体实施方案
实施例1：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(R)-硫代磷酸铵
步骤1：(2R,3R,3aS,9aR)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基-2,3,3a,9a-四氢-6H-呋喃并[2',3':4,5]噁唑并[3,2-a]嘧啶-6-酮
Figure PCTCN2019123704-appb-000026
向反应瓶中依次加入(2R,3R,3aS,9aR)-3-羟基-2-羟甲基-2,3,3a,9a-四氢-6H-呋喃并[2',3':4,5]噁唑并[3,2-a]嘧啶-6-酮(30g)，4,4'-(氯(苯基)亚甲基)双(甲氧基苯)(49.4g)，N,N-二甲基吡啶-4-胺(0.12g)，N,N-二甲基甲酰胺(120ml)及吡啶(360ml)，室温搅拌22小时。浓缩反应液，残余物以二氯甲烷溶解，5％碳酸氢钠溶液洗涤。有机相以无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩得粗品，经甲基叔丁基醚打浆纯化得到标题化合物(45.74g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ7.94(d,J＝7.5Hz,1H),7.31-7.26(m,4H),7.21-7.14(m,5H),6.86-6.83(m,4H),6.34(d,J＝6.0Hz,1H),5.95(d,J＝4.5Hz,1H),5.89(d,J＝7.0Hz,1H),5.22(d,J＝5.5Hz,1H),4.34-4.31(m,1H),4.25-4.20(m,1H),3.74(s,6H),2.98-2.95(m,1H),2.86-2.82(m,1H).
步骤2：1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2019123704-appb-000027
向反应瓶中依次加入镁条(7.28g)及2-甲氧基乙-1-醇(236ml)，110℃反应10分钟。将反应液冷却至室温，加入(2R,3R,3aS,9aR)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-3-羟基-2,3,3a,9a-四氢-6H-呋喃并[2',3':4,5]噁唑并[3,2-a]嘧啶-6-酮(35g)，加热至80℃并反应9h。冰浴下向反应液中加入600ml水和600ml二氯甲烷，用冰醋酸调反应液pH至7左右，有机相分别用水和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩得粗品，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝50:1)纯化，得到标题化合物(32g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.37(s,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.33(t,J＝7.5Hz,2H),7.26-7.27(m,5H),6.91(d,J＝8.5Hz,4H),5.81-5.82(m,1H),5.31(d,J＝8.0Hz,1H),5.10(d,J＝6.5Hz,1H),4.20(q,J＝6.0Hz,1H),3.97-4.02(m,2H),3.75(s,6H),3.73-3.74(m,2H),3.49(t,J＝5.0Hz,2H),3.29-3.32(m,1H),3.25(s,4H).
步骤3：(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺
Figure PCTCN2019123704-appb-000028
将1-((2R,3R,4R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(32g)溶于二氯甲烷(150ml)，依次缓慢滴加3-((二(二异丙基氨基)膦酰基)氧基)丙腈(20.15g)和吡啶-1-鎓2,2,2-三氟乙酸盐(12.26g)的二氯甲烷(50ml)溶液，室温搅拌反应液2h。将反应液浓缩得粗品，经柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到标题化合物(15.11g)。MS(ESI)m/z 827.5[M+Na] +。
步骤4：((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基((2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(2-氰基乙基)亚磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000029
将(2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基(2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(13g)溶于无水乙腈(240ml)，依次缓慢滴加N-(9-((2R,4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(8.73g)的N,N-二甲基甲酰胺(60ml)溶液和1H-四唑(2.615g)的乙腈溶液(83ml)，室温搅拌反应液3h。将反应液浓缩得粗品，经柱层析(二氯加烷:甲醇＝20:1)纯化，得到标题化合物(3.86 g)。MS(ESI)m/z 1081.3[M+Na] +。
步骤5：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-(2-氰基乙基)硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000030
将((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基((2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(2-氰基乙基)亚磷酸酯(3.58g)溶于乙腈(40ml)，滴加3H-苯并[c][1,2]二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(0.691g)的乙腈(10ml)溶液，室温搅拌反应液2小时。将反应液浓缩得粗品，经柱层析(二氯加烷:甲醇＝20:1)纯化，得到标题化合物(1.37g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.42(s,1H),11.16(s,1H),8.73(d,J＝9.0Hz,1H),8.60(d,J＝8.5Hz,1H),8.05(d,J＝7.0Hz,2H),7.69-7.65(m,2H),7.57-7.54(m,2H),7.39-7.22(m,9H),6.89(t,J＝7.5Hz,4H),6.51(d,J＝5.5Hz,1H),5.84(s,1H),5.38(t,J＝9.5Hz,1H),5.10(s,1H),4.54-4.07(m,9H),3.74(s,3H),3.72(s,3H),3.64(s,1H),3.44-3.12(m,8H),2.92-2.84(m,3H),2.42(s,1H).
步骤6：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000031
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-(2-氰基乙基)硫代磷酸酯(1.37g)溶于二氯甲烷(13ml)，滴加2,2-二氯乙酸(0.248g)，室温搅拌反应液1小时。以三乙胺调反应液pH至7，浓缩得粗品，经柱层析(二氯加烷:甲醇＝10:1)纯化，得到标题化合物(0.51g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.40(s,1H),11.16(s,1H),8.76(s,1H),8.63(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.56(t,J＝7.5Hz,2H),6.53(t,J＝6.5Hz,1H),5.91(d,J＝6.0Hz,1H),5.72(d,J＝8.0Hz,1H),5.59(d,J＝4.5Hz,1H),5.33(t,J＝5.0Hz,1H),5.04-5.01(m,1H),4.57-4.54(m,1H),4.38-4.11(m,7H),3.72-3.58(m,4H),3.43-3.39(m,2H),3.18(s,3H),2.96-2.91(m,3H),2.47-2.42(m,1H).
步骤7：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(R)-硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000032
O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)硫代磷酸酯(410mg)通过YMC高压制备色谱仪进行拆分(色谱柱：YMC Triart C18高压动态轴向压缩柱，10μm，50×235mm；流动相：水和乙腈(25％乙腈等度洗脱50分钟)；检测器：UV 260nm)，将洗脱剂浓缩后得到标题化合物(146mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.39(s,1H),11.17(s,1H),8.76(s,1H),8.63(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.56(t,J＝7.5Hz,2H),6.54(t,J＝6.5Hz,1H),5.92(d,J＝6.0Hz,1H),5.71(d,J＝8.0Hz,1H),5.57(d,J＝4.0Hz,1H),5.32(t,J＝5.0Hz,1H),5.03-4.99(m,1H),4.57-4.55(m,1H),4.42-4.13(m,7H),3.67-3.53(m,4H),3.33-3.32(m,2H),3.11(s,3H),2.96-2.91(m,3H),2.46-2.42(m,1H).
步骤8：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(R)-硫代磷酸铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000033
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(R)-硫代磷酸酯(13mg)溶于氨水(1ml)，室温搅拌反应液17h。冰浴下，将反应液用50％醋酸水溶液调节pH至8，乙酸乙酯萃取。分取水相，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，得到标题化合物(70mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.34(s,1H),8.49(s,1H),8.15(s,1H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(s,2H),7.16(brs,4H),6.39-6.36(m,1H),5.86(d,J＝6.0Hz,1H),5.68(d,J＝8.0Hz,1H),5.37(s,1H),5.19(s,1H),4.76-4.72(m,1H),4.48(s,1H),4.18-4.16(m,1H),4.04-3.88(m,4H),3.77-3.73(m,1H),3.65-3.59(m,2H),3.54-3.50(m,1H),3.38-3.34(m,2H),3.14(s,3H),2.77-2.72(m,1H),2.30-2.25(m,1H).HRMS(ESI)m/z:632.1540[M+H] +.
实施例2：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸铵
步骤1：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000034
参照实施例1中步骤7操作，得到标题化合物(158mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.40(s,1H),11.16(s,1H),8.76(s,1H),8.63(s,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),7.87(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(t,J＝7.5Hz,1H),7.56(t,J＝7.5Hz,2H),6.53(t,J＝6.5Hz,1H),5.91(d,J＝6.0Hz,1H),5.72(d,J＝8.0Hz,1H),5.59(d,J＝4.5Hz,1H),5.33(t,J＝5.0Hz,1H),5.04-5.01(m,1H),4.57-4.54(m,1H),4.38-4.11(m,7H),3.72-3.58(m,4H),3.43-3.39(m,2H),3.18(s,3H),2.96-2.91(m,3H),2.47-2.42(m,1H).
步骤2：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000035
以O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸酯为原料，参照实施例1中步骤8的操作，得到标题化合物。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.34(s,1H),8.46(s,1H),8.15(s,1H),7.90(d,J＝8.0Hz,1H),7.24(s,2H),7.13(brs,4H),6.39-6.36(m,1H),5.85(d,J＝6.0Hz,1H),5.67(d,J＝6.0Hz,1H),5.36(s,1H),5.22(s,1H),4.76-4.72(m,1H),4.47(s,1H),4.15-4.14(m,1H),4.04-3.87(m,4H),3.84-3.80(m,1H),3.64-3.61(m,2H),3.58-3.54(m,1H),3.40(t,J＝5.0Hz,2H),3.18(s,3H),2.75-2.70(m,1H),2.29-2.25(m,1H).HRMS(ESI)m/z:632.1539[M+H] +.
实施例3：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
步骤1：(2S,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷2-硫化物
Figure PCTCN2019123704-appb-000036
向反应瓶中依次将三乙胺双(全氟苯基)二硫代磷酸酯(126g)，(1R,4R,6S)-1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)-7-氧杂二环[4.1.0]庚烷(48.3g)和磷酸氢二丁酯(48.9g)加至氯仿(1200ml)中，然后将2,2-二氯乙酸(60.0g)缓慢滴加至上述溶液中，室温反应1h。将反应液浓缩至500ml后，向反应液 中加入1000ml正己烷稀释，然后分别用10％的磷酸二氢钾溶液、饱和食盐水洗涤。将有机相浓缩至200ml，加入200ml甲醇，继续浓缩至50ml后加入200ml甲醇，再浓缩至50ml，析出固体。冰浴降温至0℃后过滤，得粗品93.48g。将粗品(93.48g)溶于225ml二氯甲烷中，然后加入正庚烷374ml，粗品完全溶解。将溶液浓缩至200ml，再加入正庚烷374ml，此操作重复3次。将溶液浓缩至200ml后析出大量固体，室温搅拌2h。过滤，将滤饼干燥得到标题化合物(62.58g)。
1H NMR(500MHz,CDCl 3):δ5.04(s,1H),4.87(s,1H),4.31-4.27(m,1H),2.64-2.62(m,1H),2.37-2.35(m,1H),2.11-1.85(m,5H),1.83(s,3H),1.68(s,3H).
步骤2：1-((2R,3R,4R,5R)-5-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(((2R,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-磺酰基六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮
Figure PCTCN2019123704-appb-000037
将1-((2R,3R,4R,5R)-5-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(35g)和(2S,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-2-((全氟苯基)硫代)-6-(丙-1-烯-2-基)六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷2-硫化物(37.6g)溶于乙腈(645ml)，冰浴降温。缓慢滴加2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂卓(12.81g)至上述反应液。冰浴条件下继续反应2h。将反应液依次以纯化水和10％磷酸二氢钾溶液洗涤。有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，经柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)纯化，得到标题化合物(49.23g)。
1H NMR(500MHz,CDCl 3):δ8.92(s,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,1H),7.70-7.63(m,4H),7.48-7.38(m,6H),6.12(d,J＝5.5Hz,1H),5.45-5.41(m,1H),5.38(dd,J＝8.3,1.9Hz,1H),5.05(s,1H),4.92(s,1H),4.55-4.59(m,1H),4.32-4.22(m,2H),3.98(dd,J＝11.9,2.0Hz,1H),3.90-3.79(m,3H),3.54(t,J＝4.5Hz,2H),3.30(s,3H),2.59(s,1H),2.33-2.24(m,1H),2.14(td,J＝13.4,4.2Hz,1H),2.00-1.88(m,3H),1.79(s,3H),1.71(d,J＝4.9Hz,3H),1.11(s,9H),0.91-0.82(m,1H).
步骤3：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000038
1-((2R,3R,4R,5R)-5-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(((2R,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-磺酰基六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(25g)、N-(9-((2R,4S,5R)-4-((叔丁基二苯基甲硅 烷基)氧基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(37.7g)溶于乙腈(235ml)，室温下加入2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂卓(14.51g)，搅拌反应液1h。反应液以乙酸乙酯稀释，依次以饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到粗品，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化，得到标题化合物(33.01g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.43(s,1H),11.17(s,1H),8.93(s,1H),8.73(s,1H),8.05(d,J＝7.5Hz,2H),7.67-7.53(m,13H),7.47-7.35(m,13H),6.64-6.61(m,1H),5.89(d,J＝6.0Hz,1H),5.24(d,J＝8.0Hz,1H),5.01-4.97(m,1H),4.72-4.57(m,1H),4.15(d,J＝4.0Hz,1H),4.08-4.02(m,2H),3.92-3.61(m,6H),3.55-3.51(m,1H),3.13(s,3H),2.68-2.64(m,1H),2.30-2.26(m,1H),1.06(s,9H),0.99(s,9H).
步骤4：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000039
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯(25g)、四丁基氟化铵三水合物(19.52g)和四氢呋喃(17ml)，室温搅拌反应液17小时。反应液用水稀释，乙醚洗涤。将水相浓缩得到标题化合物36g，未经处理直接投入下一步。
步骤5：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000040
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(36g)和氨水(260ml)，将混合物室温搅拌反应16h。冰浴下向反应液中滴加50％醋酸水溶液，调节pH至8左右。将反应液用乙酸乙酯萃取两次，分取水相，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(20.27g)。MS(ESI)m/z:630.5[M-H] -.
步骤6：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
Figure PCTCN2019123704-appb-000041
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(0.30g)、钠离子交换树脂(6.0g)和去离子水(5ml)，并室温搅拌1h。过滤，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.16g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.36(br,1H),8.46(s,1H),8.15(s,1H),7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(s,2H),6.37(t,J＝7.0Hz,1H),5.85(d,J＝5.5Hz,1H),5.60(d,J＝8.0Hz,1H),5.40(s,1H),5.26(s,1H),4.81-4.61(m,1H),4.47(d,J＝6.0Hz,1H),4.13(t,J＝3.0Hz,1H),4.01-3.82(m,5H),3.61(s,2H),3.59-3.54(m,1H),3.39(t,J＝5.0Hz,2H),3.18(s,3H),2.74-2.71(m,1H),2.29-2.26(m,1H).MS(ESI)m/z:630.5[M-H] -.
实施例4：O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
步骤1：O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000042
1-((2R,3R,4R,5R)-5-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(((2R,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-磺酰基六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(1.50g)和N-(9-((2R,3R,4R,5R)-4-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-3-氟-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(2.33g)溶于乙腈(30ml)，室温下加入2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂卓(0.87g)，搅拌并反应1h。反应液以乙酸乙酯稀释，依次以饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化，得到标题化合物(2.00g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.42(d,J＝2.0Hz,1H),11.21(s,1H),8.90(s,1H),8.69(s,1H),8.05(d,J＝7.5Hz,2H),7.69-7.47(m,13H),7.47-7.34(m,12H),6.47(dd,J＝14.5,5.0Hz,1H),5.88(d,J＝6.0Hz,1H),5.40(m,1H),5.22(d,J＝8.0Hz,1H),4.97(dt,J＝10.0,4.0Hz,1H),4.74(dt,J＝8.0,4.0Hz,1H),4.20(s,1H),4.11-4.02(m,2H),3.96(t,J＝9.5Hz,1H),3.86-3.77(m, 3H),3.69-3.67(m,1H),3.55-3.53(m,1H),3.37(t,J＝5.0Hz,2H),3.14(s,3H),1.09(s,9H),1.00(s,9H).
步骤2：O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000043
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-4-氟四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯(1.80g)、三水合四丁基氟化铵(1.15g)和四氢呋喃(15ml)，室温搅拌反应液过夜。反应液用水稀释，乙醚洗涤。将水相浓缩得到标题化合物2.10g，未经纯化直接投入下一步。
步骤3：O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000044
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(2.10g)和氨水(15ml)，将混合物室温搅拌并反应过夜。冰浴下，反应液以50％醋酸水溶液调节pH至8。反应液以乙酸乙酯洗涤，分取水相，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.90g)。MS(ESI)m/z:648.7[M-H] -.
步骤4：O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
Figure PCTCN2019123704-appb-000045
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3R,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(0.30g)、钠离子树脂(6.0g)和去离子水(5ml)，室温搅拌1h。过滤，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.15g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.33(s,1H),8.48(s,1H),8.16(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H),7.33(s,2H),6.24(dd,J＝16.5,3.0Hz,1H),5.85(d,J＝5.5Hz,2H),5.65(d,J＝8.0Hz,1H),5.50-5.40(m,1H),5.24(d,J＝5.5Hz,1H),4.74(dd,J＝10.0,5.0Hz,1H),4.53(d,J＝16.0Hz,1H),4.17-4.09(m,2H),4.09-3.96(m,3H),3.84-3.81(m,1H),3.62-3.54(m,3H),3.40-3.38(m,2H),3.18(s,3H).MS(ESI)m/z:648.7[M-H] -.
实施例5：O-(((2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
步骤1：O-(((2R,3S,5R)-3-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000046
1-((2R,3R,4R,5R)-5-(((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)甲基)-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(((2R,3aS,6R,7aS)-3a-甲基-6-(丙-1-烯-2-基)-2-磺酰基六氢苯并[d][1,3,2]氧硫杂磷杂环戊烷-2-基)氧基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4-(1H,3H)-二酮(1.50g)和N-(9-((2R,4S,5R)-4-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-6-氧代-6,9-二氢-1H-嘌呤-2-基)异丁酰胺(2.20g)溶于乙腈(20ml)，室温下加入2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂卓(0.87g)，搅拌并反应1h。反应液以乙酸乙酯稀释，依次以饱和碳酸氢钠水溶液及饱和食盐水洗涤，有机相以无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩得粗品，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化，得到标题化合物(2.10g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ12.12(s,1H),12.04(s,1H),11.41(s,1H),8.29(s,1H),7.66(d,J＝7.0Hz,2H),7.63-7.57(m,7H),7.48-7.38(m,12H),6.35-6.32(m,1H),5.84(d,J＝6.0Hz,1H),5.25(d,J＝8.0Hz,1H),4.96-4.92(m,1H),4.71(d,J＝4.0Hz,1H),4.09-4.01(m,3H),3.86-3.70(m,5H),3.53-3.49(m,1H),3.37-3.36(m,2H),3.13(s,3H),2.95-2.90(m,1H),2.85-2.80(m,1H),2.14-2.10(m,1H),1.11(d,J＝7.5Hz,3H),1.07(d,J＝7.5Hz,3H),1.05(s,9H),1.01(s,9H).
步骤2：O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-(((2R,3S,5R)-3-羟基-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000047
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3S,5R)-3-((叔丁基二苯基硅烷基)氧基)-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-2-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-氢(S)-硫代磷酸酯(1.80g)、四丁基氟化铵三水合物(1.43g)和四氢呋喃(20ml)，将反应液室温搅拌过夜。将反应液用水稀释，乙醚洗涤，水相浓缩后得到标题化合物2.20g，未经纯化直接投入下一步。
步骤3：O-(((2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000048
将O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)O-(((2R,3S,5R)-3-羟基-5-(2-异丁酰氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)四氢呋喃-2-基)甲基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(2.20g)溶于氨水(15ml)，40℃搅拌并反应36h。冰浴下，反应液用50％醋酸水溶液调节pH至8，反应液以乙酸乙酯洗涤。分取水相，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，得到标题化合物(0.17g)。
MS(ESI)m/z:646.6[M-H] -.
步骤4：O-(((2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸钠
Figure PCTCN2019123704-appb-000049
向反应瓶中依次加入O-(((2R,3S,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1,6-二氢-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(0.30g)、钠离子交换树脂(6.0g)和去离子水(5ml)，室温搅拌1h。过滤，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.16g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d 6):δ11.11(brs,2H),7.97(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H),6.55(s,2H),6.16-6.13(m,1H),5.85(d,J＝5.5Hz,1H),5.67(d,J＝8.5Hz,1H),5.31(s,1H),5.24(s,1H),4.73-4.71(m,1H),4.42(s,1H),4.15(s,1H),4.02(t,J＝5.0Hz,1H),3.96-3.92(m,3H),3.83-3.81(m,1H),3.62(s,2H),3.56-3.54(m,1H),3.39-3.38(m,2H),3.18(s,3H),2.63-2.58(m,1H),2.19-2.15(m,1H).MS(ESI)m/z:646.6[M-H] -.
实施例6：(((R)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丙基碳酸酯
步骤1：O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)硫代磷酸铵
Figure PCTCN2019123704-appb-000050
以O-(((2R,3S,5R)-5-(6-苯甲酰氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-(2-氰基乙基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)硫代磷酸酯为原料，参照实施例1中步骤8的操作，得到标题化合物。HRMS(ESI)m/z:632.1539[M+H] +.
步骤2：(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丙基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000051
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R))-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)硫代磷酸铵(1.56g)溶于水(150ml)和异丙醇(39ml)的混合溶液，滴加碘代甲基异丙基碳酸酯(1.761g)，室温反应24h，浓缩以除去异丙醇，残余物用正己烷萃取三次。分取水相，水相用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，得到标题化合物(1.39g)。MS(ESI)m/z 748.2[M+H] +.
步骤3：(((R)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丙基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000052
(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丙基碳酸酯(1.39g)通过YMC高压制备色谱仪进行拆分(色谱柱：CHIRAL ART Amylose-SA，5μm，30×250mm；流动相：无水乙醇和正己烷(50％正己烷等度洗脱45分钟)；检测器：UV 254nm)，得到标题化合物(0.527g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.32(s,1H),8.24(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.49(t,J＝6.5Hz,1H),6.03(d,J＝6.0Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.53-5.46(m,2H),5.10-5.05(m,1H),4.90-4.87(m,1H),4.74-4.70(m,1H),4.52-4.46(m,1H),4.44-4.40(m,1H),4.38-4.35(m,1H),4.31-4.24(m,2H),3.82-3.76(m,3H),3.75-3.71(m,1H),3.53-3.48(m,2H),3.29(s,3H),2.99-2.91(m,1H),2.56-2.50(m,1H),1.27-1.24(m,6H).HRMS(ESI)m/z:748.2002[M+H] +.
实施例7：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丙基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000053
参照实施例6步骤3的操作，另外得到标题化合物(0.456g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.35(s,1H),8.24(s,1H),8.01(d,J＝8Hz,1H),6.50(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6Hz,1H),5.74(d,J＝8Hz,1H),5.50-5.42(m,2H),5.13-5.08(m,1H),4.90-4.88(m,1H),4.74-4.70(m,1H),4.54-4.46(m,2H),4.36(t,J＝5.5Hz,1H),4.31-4.28(m,1H),4.26-4.23(m,1H),3.86-3.77(m,3H),3.73-3.68(m,1H),3.50-3.44(m,2H),3.25(s,3H),2.96-2.89(m,1H),2.56-2.50(m,1H),1.28(s,3H),1.27(d,J＝6.5Hz,6H).
HRMS(ESI)m/z:748.2034[M+H] +.
实施例8：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基戊-3-基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000054
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(120ml)和异丙醇(30ml)的混合溶液，滴加碘甲基戊-3-基碳酸酯(0.935g)，室温反应24h，浓缩以除去异丙醇。水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.400g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.35(s,1H),8.24(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.5Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.55-5.43(m,2H),5.17-5.09(m,1H),4.74-4.69(m,1H),4.63-4.57(m,1H),4.55-4.46(m,2H),4.39-4.35(m,1H),4.32-4.29(m,1H),4.27-4.22(m,1H),3.87-3.74(m,3H),3.73-3.66(m,1H),3.51-3.41(m,2H),3.25(s,3H),2.95-2.87(m,1H),2.58-2.50(m,1H),1.69-1.53(m,4H),0.89(t,J＝7.0Hz,6H).MS(ESI)m/z:776.5[M+H] +.
实施例9：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基异丁基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000055
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(100ml)和异丙醇(26ml)的混合溶液，滴加碘甲基异丁基碳酸酯(0.887g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.419g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.35(s,1H),8.24(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.0Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.50-5.46(m,2H),5.13-5.10(m,1H),4.74-4.70(m,1H),4.59-4.45(m,2H),4.36(t,J＝5.5Hz,1H),4.31-4.29(m,1H),4.25-4.24(m,1H),3.94(d,J＝6.5Hz,2H),3.85-3.68(m,4H),3.52-3.45(m,2H),3.25(s,3H),2.95-2.89(m,1H),2.56-2.51(m,1H),1.94-1.88(m,1H),0.91(d,J＝6.5Hz,6H).MS(ESI)m/z:760.6[M+H] +.
实施例10：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基(2-乙基丁基)碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000056
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(120ml)和异丙醇(30ml)的混合溶液，滴加2-乙基丁基(碘甲基)碳酸酯(0.983g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.440g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.35(s,1H),8.24(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝ 6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.5Hz,1H),5.74(d,J＝8.5Hz,1H),5.54-5.45(m,2H),5.14-5.08(m,1H),4.74-4.69(m,1H),4.56-4.45(m,2H),4.39-4.34(m,1H),4.32-4.29(m,1H),4.26-4.22(m,1H),4.12-4.07(m,2H),3.86-3.81(m,1H),3.80-3.75(m,2H),3.74-3.68(m,1H),3.51-3.42(m,2H),3.25(s,3H),2.95-2.87(m,1H),2.57-2.50(m,1H),1.53-1.44(m,1H),1.37-1.26(m,4H),0.88(t,J＝7.5Hz,6H).MS(ESI)m/z:790.6[M+H] +.
实施例11：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基新戊基碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000057
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(120ml)和异丙醇(30ml)的混合溶液，滴加碘甲基新戊基碳酸酯(0.935g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.250g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.35(s,1H),8.25(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.0Hz,1H),6.06(d,J＝6.0Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.54-5.44(m,2H),5.16-5.08(m,1H),4.75-4.69(m,1H),4.56-4.45(m,2H),4.40-4.35(m,1H),4.33-4.29(m,1H),4.26-4.22(m,1H),3.90-3.86(m,2H),3.84-3.76(m,3H),3.74-3.69(m,1H),3.52-3.42(m,2H),3.26(s,3H),2.97-2.88(m,1H),2.59-2.49(m,1H),0.92(s,9H).HRMS(ESI)m/z:776.2350[M+H] +.
实施例12：(((S)-((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)甲基(环丙基甲基)碳酸酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000058
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(100ml)和异丙醇(26ml)的混合溶液，滴加环丙基甲基(碘甲基)碳酸酯(0.880g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.400g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD)δ8.35(s,1H),8.24(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.0Hz,1H),5.75(d,J＝8.0Hz,1H),5.49-5.45(m,2H),5.16-5.06(m,1H),4.74-4.71(m,1H),4.54-4.46(m,2H),4.36(t,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.29(m,1H),4.26-4.23(m,1H),4.03-3.96(m,2H),3.86-3.67(m,4H),3.50-3.43(m,2H),3.25(s,3H),2.93-2.91(m,1H),2.56-2.52(m,1H),1.18-1.10(m,1H),0.58-0.51(m,2H),0.31-0.29(m,2H).
MS(ESI)m/z:760.6[M+H] +.
实施例13：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)异丁酸甲酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000059
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(120ml)和异丙醇(30ml)的混合溶液，滴加碘甲基异丁酸酯(0.784g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.330g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.34(s,1H),8.24(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.50(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.0Hz,1H),5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.42-5.38(m,2H),5.10(s,1H),4.72(s,1H),4.49-4.47(m,2H),4.37(s,1H),4.28(s,1H),4.24(s,1H),3.82-3.80(m,2H),3.76-3.69(m,2H),3.51-3.44(m,2H),3.26(s,3H),2.97-2.92(m,1H),2.59-2.51(m,2H),1.14-1.12(m,6H).MS(ESI)m/z:732.5[M+H] +.
实施例14：(((S)-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)氧基)磷酰基)硫代)新戊酸甲酯
Figure PCTCN2019123704-appb-000060
将O-(((2R,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基)O-((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-2-羟甲基-4-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-3-基)(S)-硫代磷酸四丁基铵(1.0g)溶于水(120ml)和异丙醇(30ml)的混合溶液，滴加新戊酸碘甲酯(0.832g)，室温反应24h。浓缩除去异丙醇，水相用正己烷萃取三次后，用Biotage C18 120g反相色谱柱进行分离纯化(水:乙腈＝3:1)，浓缩后得到标题化合物(0.550g)。
1H NMR(500MHz,CD 3OD):δ8.34(s,1H),8.24(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.49(t,J＝6.5Hz,1H),6.06(d,J＝6.0Hz,1H),5.74(d,J＝8.5Hz,1H),5.43(s,1H),5.39(s,1H),5.11-5.09(m,1H),4.72-4.71(m,1H),4.50-4.47(m,2H),4.36(t,J＝5.5Hz,1H),4.28-4.27(m,1H),4.24-4.23(m,1H),3.84-3.80(m,2H),3.76-3.69(m,2H),3.51-3.44(m,2H),3.26(s,3H),2.98-2.93(m,1H),2.56-2.51(m,1H),1.18(s,9H).MS(ESI)m/z:746.6[M+H] +.
体外抗乙肝病毒活性筛选
1.实验材料
1.1细胞
HepG2.2.15细胞
1.2化合物
受试化合物：实施例制备得到的化合物，用二甲基亚砜(DMSO)配制成20mM母液。
1.3试剂
本实验使用的试剂包括QIAamp 96 DNA Blood Kit(12)(货号Qiagen-51162)，FastStart Universal Probe Master(货号Roche-04914058001)，CellTiter-Blue检测试剂(货号Promega-G808B)。
2.实验方法
2.1化合物稀释：受试化合物起始终浓度为100μM，3倍稀释，8个浓度。
3.2.体外抗HBV活性实验和细胞毒性实验：第一天，种HepG2.2.15细胞(4×10 4细胞/孔)到96孔板，在37℃，5％CO 2培养过夜。第二天，加入含不同浓度的化合物的新鲜培养液到培养孔中。第三至十天，每天吸除培养孔中旧的培养液，加入含不同浓度的化合物的新鲜培养液。第十一天，收集培养孔中的上清液，用于提取上清液中的HBV DNA。qPCR实验检测HepG2.2.15上清液中的HBV DNA含量。收集细胞上清液后，加入CellTiter-Blue试剂，孵育后酶标仪检测每孔荧光值。
抑制百分比：
抑制率％＝(1-样品中的HBV DNA含量/DMSO对照组中的HBV DNA含量)×100％。
细胞活力百分比：
细胞活力％＝(样品孔的荧光值-培养基对照的荧光值)/(DMSO对照组的荧光值-培养基对照的荧光值)×100％。
实验结果如表1所示。
表1.
实施例化合物 EC 50(nM) CC 50(μM)
实施例1 5239 >100
实施例2 6355 >100

Claims (12)

  1. 通式I化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐，
    Figure PCTCN2019123704-appb-100001
    其中，R 1选自
    Figure PCTCN2019123704-appb-100002
    并且R选自C 1-12烷基、C 1-12烷氧基、C 2-6烯基、C 2-6炔基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，所述R任选地被一个或多个选自以下的基团取代：卤素、-OH、C 1-6烷基、-(OCH 2CH 2) m-OC 1-6烷基、-NO 2、-CN、-NH 2、-NH(C 1-6烷基)、-N(C 1-6烷基) 2、-C(O)C 1-6烷基、-C(O)OC 1-6烷基、-CONHC 1-6烷基、-SH、-SC 1-6烷基、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基，其中m选自0、1、2、3、4或5；
    R 2选自H、-OH、卤素、C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 3-10环烷基、3-10元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基；
    R 3选自
    Figure PCTCN2019123704-appb-100003
    以及
    R 4选自H、C 1-6烷基、C 3-6环烷基或3-6元杂环烷基。
  2. 如权利要求1所述的化合物，其中
    Figure PCTCN2019123704-appb-100004
    与
    Figure PCTCN2019123704-appb-100005
    结合，形成
    Figure PCTCN2019123704-appb-100006
    其中
    Figure PCTCN2019123704-appb-100007
    为一价阳离子；或者
    Figure PCTCN2019123704-appb-100008
    为碱金属阳离子或铵阳离子；或者
    Figure PCTCN2019123704-appb-100009
    为Na +、K +、Li +或NH4 +；或者
    Figure PCTCN2019123704-appb-100010
    为Na +或NH4 +；或者
    Figure PCTCN2019123704-appb-100011
    为NH4 +。
  3. 如权利要求1-2中任一项所述的化合物，其中m选自0、1、2或3；或者m选自0、1或2；或者m为0。
  4. 如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中R选自C 1-6烷基、C 1-6烷氧基、C 2-6烯基或C 2-6炔基，所述R任选地被一个或多个选自-(OCH 2CH 2) m-OCH 3、C 3-6环烷基、3-6元杂环烷基、C 6-10芳基或5-10元杂芳基的基团取代；或者R选自C 1-6烷基或C 1-6烷氧基，以及所述R任选地被一个或多个C 3-6环烷基取代；或者R选自(CH 3) 2CHO-、(CH 3CH 2) 2CHO-、(CH 3) 2CHCH 2O-、(CH 3CH 2) 2CHCH 2O-、(CH 3) 3CCH 2O-、环丙基-CH 2O-、(CH 3) 2CH-或(CH 3) 3C-。
  5. 如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R 2选自H、-OH或卤素；或者R 2选自H或卤素；或者R 2选自H或氟；或者R 2为H。
  6. 如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中R 4选自C 1-6烷基；或者R 4选自C 1-3烷基；或者R 4为甲基。
  7. 如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其选自以下化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2019123704-appb-100012
  8. 如权利要求1-6任一项所述的化合物，其选自：
    Figure PCTCN2019123704-appb-100013
    Figure PCTCN2019123704-appb-100014
    Figure PCTCN2019123704-appb-100015
  9. 药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料。
  10. 治疗或抑制哺乳动物的HBV感染的方法，其包括对有需要的所述哺乳动物给予治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或权利要求9所述的药物组合物。
  11. 权利要求1-8中任一项所述的化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗哺乳动物的HBV感染的药物中的用途；任选地，所述预防或治疗哺乳动物的HBV感染是指控制、降低或清除HBV以预防、缓解或治愈受感染的哺乳动物的肝脏疾病。
  12. 用于预防或治疗哺乳动物的HBV感染的权利要求1-8中任一项所述的化合物、其互变异构体、立体异构体或其药学上可接受的盐、或权利要求9所述药物组合物；任选地，所述预防或者治疗哺乳动物HBV感染是指控制、降低或清除HBV以预防、缓解或治愈受感染的哺乳动物的肝脏疾病。
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