KR101801700B1 - 히드록시새플로르 옐로우 a 나트륨염, 그의 제조방법 및 그의 용도 - Google Patents

히드록시새플로르 옐로우 a 나트륨염, 그의 제조방법 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염과 이 화합물의 제조방법 및 의학적 용도를 제공한다. 본 발명은 천연 한약재 홍화를 원료로 하며, 이를 추출하여 신규 단량체 약물 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 얻는다. 98.5%이상의 순도를 보증할 수 있다. 항혈소판응집, 관상동맥질환, 협심증, 급성뇌빈혈 등 열 가지 혈액순환장애 질환의 치료에서 히드록시새플로르 옐로우 A보다 더 안전하고 효과적인 안전성과 제어가능성을 구비한 단량체 화합물이다. 또 양호한 수용성과 인체 내성도 구비하고 있다.
Figure 112016123047862-pct00013

(I)

Description

히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염, 그의 제조방법 및 그의 용도 {HYDROXYSAFFLOR YELLOW A SODIUM AND PREPARATION AS WELL AS APPLICATION THEREOF}
본 발명은 신규 화합물, 더 상세히는 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염(HYDROXYSAFFLOR YELLOW A SODIUM, HSYA SODIUM), 그의 제조방법 및 그의 의학적 용도에 관한 것이, 또한 본 발명은 천연 약물화학 분야에 관한 것이다.
홍화 한약재는 국화과 식물 카르타무스 틴크토리우스[Carthamus　tinctouius L.]의 꽃의 건조품으로서, 어혈을 제거하여 혈맥의 소통을 원활하게 하는 일반 한약재이다. 관상동맥질환, 협심증 등 각종 혈액순환장애 질환의 치료에 사용된다. 히드록시새플로르 옐로우 A(hydroxysafflor yellow A)는 모노-칼콘 글리코시드 구조를 가진 화합물로서 홍화 약리효과 중의 가장 유효한 수용성 부위에 속한다. 혈소판 활성화 요인으로 발생한 혈소판응집을 억제하고, 혈소판 활성화 요인과 혈소판 수용체의 결합을 경쟁력 있게 억제할 수 있다. 혈의 운행을 활발히 하여 어혈을 없애는 히드록시새플로르 옐로우 A의 효과적인 성분에 속한다. 연구에 따르면 항응고, 섬유소용해 촉진, 항혈전, 미순환 개선 등 여러 방면의 심혈관 약리효과를 가지고 있다.
종래 기술에서는 이미 히드록시새플로르 옐로우 A 및 히드록시새플로르 옐로우 A의 각종 추출, 분리 및 정제 방법, 그리고 히드록시새플로르 옐로우 A 주사액을 공개하였다(냉동건조 분말주사제 포함). 그러나 종래의 히드록시새플로르 옐로우 A 제품의 순도 및 안정성은 여전히 문제가 존재한다. 종래 히드록시새플로르 옐로우 A의 순도를 보면, 일반적으로 10%이상의 불순물을 함유하고 있으며, 이런 불순물의 구조와 특성에 대해서도 밝히지 않았고, 그의 품질은 완전히 제어할 수 없었다. 홍화 약재에서 추출한 히드록시새플로르 옐로우 A 불순물의 스펙트럼도 일치하지 않았다.
CN102675379A에는 홍화로부터 정제 히드록시새플로르 옐로우 A를 추출하는 방법을 개시하였다. 홍화 한약재를 추출한 후, 추출물을 약염기성 이온교환수지에 의한 정제, 중극성 대공극 흡착수지에 의한 정제, 비극성 대공극 흡착수지에 의한 정제, 냉동건조 등 5개 단계를 거쳐서 함유량이 80％이상이며 이전율이 20%이상인 히드록시새플로르 옐로우 A를 제조하는 방법을 구체적으로 개시되어 있다.
CN101195647A, CN101215307A, CN1475272A에서는 홍화로부터 정제된 히드록시새플로르 옐로우 A를 추출하는 방법을 개시하고 있으며, 여기서 히드록시새플로르 옐로우 A의 함유량이 90%이상인 것을 개시하였다.
그러나 히드록시새플로르 옐로우 A의 안정성이 충분하지 못하여, 장기간 보존 후, 그의 순도가 떨어지고, 이것은 약물 치료효과에 악영향을 끼친다. 특히 히드록시새플로르 옐로우 A 주사 제제의 안전성 문제로 이어진다.
약물 연구의 주요 내용에는 약물의 안전성, 효능, 안정성, 제어 가능성이 포함되는바 어느 한가지도 빠지면 안 된다.
이미 생산하여 임상에 사용하고 있는 히드록시새플로르 옐로우 A 주사제에 대해서는 약리학적시험과 임상평가를 통하여 히드록시새플로르 옐로우 A 화합물의 안전성과 효능을 이미 증명하였다. 그러나 히드록시새플로르 옐로우 A 추출기술과 화합물의 안정성으로 인하여 현재 시장에 나온 히드록시새플로르 옐로우 A 원료의 순도는 대부분 10%이상의 불순물이 함유되어 있다. 또 이런 불순물의 구조와 특성에 대해서도 아직 밝히지 않았으므로 품질 제어가 불가능하다. 홍화 약재에서 추출한 히드록시새플로르 옐로우 A 불순물의 스펙트럼도 일치하지 않는다. 그 때문에 종래 히드록시새플로르 옐로우 A 약품, 특히 주사액 약품 유효성분의 안정성과 순도는 여전히 약품 안전성 및 품질 제어 가능성 개선에 관한 주요 문제를 제약하고 영향을 주고 있다.
종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 새로운 히드록시새플로르 옐로우 A 화합물을 제공한다. 더 구체적으로는 신규 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이다. 이 신규 화합물은 천연 홍화 한약재를 원료로 하고, 이를 추출, 분리 및 정제 등의 단계를 거쳐서 제조한다. 시험 및 연구 결과에 의하면 이 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 히드록시새플로르 옐로우 A보다 더 안전하고, 더 제어 가능하다. 관상동맥 질환, 협심증 등 각종 혈액순환 장애 질환의 치료에 적용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하기 식(I)로 표시되는 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제공한다.
Figure 112014084150951-pct00001
(I)
분자식: C27H31O16Na
본 발명의 다른 목적은 상기 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 제조방법을 제공하는 것이며, 그 특징은 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A로 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조하는 단계를 포함한다.
Figure 112014084150951-pct00002
(II)
우선, 상기 제조방법 중에서 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A로부터 다음과 같은 방법으로 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조한다. 즉, 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A를 나트륨 이온교환수지 컬럼에 통과하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조하거나, 또는 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A와 나트륨염을 반응시켜 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조한다. 상기 나트륨염은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨 중의 한가지 또는 2종 이상을 선택한다.
바람직하기로는 상기 제조방법 중에서 사용되는 나트륨 이온교환수지는 001*7 나트륨 이온교환수지 또는 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지를 사용한다. 이 2종 수지는 모두 시판되는 제품이다. 예컨대, 상하이화진과기유한공사(Shanghai Huazhen Sci. & Tech. Co., Ltd.)의 제품을 구입할 수 있다.
본 발명에 따르면, 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 히드록시새플로르 옐로우 A에 비해 더 안전하고, 안정성이 있고, 제어 가능한 단량체 화합물에 속한다. 따라서 관상동맥질환, 협심증 등 각종 혈액 순환 장애 질환의 치료에 w적용될 수 있다.
도 1은 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 수소 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 탄소 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 COSY스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 DEPT135 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 HSQC 스펙트럼을 나타낸다.
하나의 구체적인 실시방안으로서 상기 제조방법의 특징은 홍화 약재를 원료로 하며 다음과 같은 추출, 나트륨염 전환, 분리 및 정제 등 단계를 거쳐서 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조하는데 있다.
(1) 추출: 물로 홍화 약재를 추출한다.
(2) 나트륨염으로의 전환: 상기 단계 (1)에서 얻은 홍화 추출액을 나트륨 이온교환수지 컬럼에 통과시켜 히드록시새플로르 옐로우 A로부터 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염으로 전환한다.
(3) 분리: 상기 단계 (2)에서 얻은 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 함유하는 용출액을 대공극 흡착수지 컬럼에 통과시켜 분리하면 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품(粗品)을 얻는다.
(4) 정제: 상기 단계 (3)에서 얻은 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품을 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 초여과막으로 초여과를 행하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻는다.
상기 제조방법의 단계 (1)에서는 10~30중량부의 물로 50~100℃에서 홍화를 2~3회, 매회 0.5~24시간 추출한 후, 추출액을 수집하여 냉각한다.
상기 제조방법의 단계 (2)에서는 단계 (1)에서 얻은 추출액을 나트륨 이온교환수지 컬럼에 통과시킨다. 상기 나트륨 이온교환수지는 001*7 나트륨 이온교환수지나 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지를 사용하며, 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 함유하는 용출액을 수집한다.
상기 제조방법의 단계 (3)에서는 단계 (2)에서 얻은 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 함유하는 용출액을 대공극 흡착수지 HZ801컬럼으로 분리하고, 물로 세척하고, 그 세척액을 수집하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품을 얻는다.
상기 제조방법 중의 단계 (4)에서는 단계 (3)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품을 Sephadex LH-20 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 순수로 세척한 후, 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 함유된 세척액을 수집한다. 감압 농축하여 농축액을 얻은 후, 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 초여과하여 초여과액을 얻고, 냉동건조시켜 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻는다.
또 다른 구체적인 실시예로서는, 홍화 약재를 원료로 하여, 다음과 같은 추출, 분리, 정제, 산성화 및 나트륨염 전환 등 단계를 거쳐서 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조하는 것이다.
(1) 추출: 물로 홍화 약재를 추출하여 홍화 추출액을 얻는다.
(2) 분리: 상기 단계 (1)에서 얻은 홍화 추출액을 대공극 흡착수지 컬럼에 통과, 분리하여 히드록시새플로르 옐로우 A 조품을 얻는다.
(3) 정제: 상기 단계 (2)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 조품을 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 초여과막에 의해 초여과한 후, 냉동건조하여 히드록시새플로르 옐로우 A 정제품을 얻는다.
(4) 산성화: 상기 단계 (3)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 정제품에 물을 넣고 산(바람직하기로는 염산)을 첨가하여 pH를 1.5∼2.5로 조정한 후, 석출된 담황색 고체를 수집하면 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A를 얻는다.
(5) 나트륨염 전환: 상기 단계 (4)에서 얻은 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A에 물을 넣은 후, 0.1mol/L~10mol/L 수산화나트륨 또는 탄산나트륨 또는 탄산수소나트륨(바람직하기로는 수산화나트륨) 용액으로 pH를 6으로 조절하면, 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A가 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 생성된다. 초여과막으로 반응생성물을 초여과하고, 여과액을 냉동건조하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻는다.
상기 제조방법에서 서술한 대공극 흡착수지는 HZ801형 대공극 흡착수지를 사용하였다. 우선적으로, 상기 제조방법에서 서술한 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피는 Sephadex LH-20 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하였고, 순수를 세척액으로 사용하였다. 초여과는 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 행하였다.
홍화 한약재의 수추출액에는 주로 히드록시새플로르 옐로우 A의 화학성분이 포함되어 있다. 본 발명을 통하여 의외로 다음과 같은 사실을 발견하였다. 즉 홍화 한약재 수추출액을 나트륨 이온교환수지 컬럼(예컨대 001*7 나트륨 이온교환수지나 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지)에 통과시키면 홍화 수추출액 중의 히드록시새플로르 옐로우 A가 모두 전기 식(I)의 신규 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염으로 변환된다. 발명자의 추측에 의하면 나트륨 이온교환수지에 의한 분리과정에서 히드록시새플로르 옐로우 A가 식(II)의 유리된 히드록시새플로르 옐로우 A 음이온이 교환된 나트륨 이온과 결합하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 생성한다고 본다. 이는 다음과 같은 실험을 통하여 검증하였다. 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A 샘플을 001*7 나트륨 이온교환수지로 본 발명의 실시예 1 방법에 따라 나트륨 이온교환수지에 의한 분리를 행한 후, 수집한 세척액에 대해 측정한 결과, 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 함유되어 있었다.
마찬가지로 본 발명을 통하여 다음과 같은 사실을 발견하였다. 즉 히드록시새플로르 옐로우 A 정제품에 대해 산성화를 행하면 히드록시새플로르 옐로우 A를 얻을 수 있다. 그다음 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 탄산수소나트륨 등 나트륨염으로 처리하여도 고수율, 고순도의 식(I)의 새로운 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 목적으로 이 밖에도 한가지 약물 제제를 제공하였는바, 상기에서 서술한 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 약물 확성화 성분과 약학적으로 가능한 담체로 사용하고 있다. 상기 약물 제제는 냉동건조 분말주사제를 우선적으로 사용하며 상기 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 또는 상기 방법으로 제조한 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 주사용 물에 용해한 후, 0.22㎛ 미세다공성 여과막이나 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 여과하여 병에 나누어 넣는다. 그다음 냉동건조하여 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말주사제를 얻는다.
단위당 제제 중의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 함유량은 50mg-200mg이다. 예컨대 다음과 같이 제조할 수 있다.
(1) 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말주사제, 함유량: 50mg-200mg/병.
(2) 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염-염화나트륨 주사액, 함유량: 100ml 염화나트륨 주사액에 50mg-200mg의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 함유되어 있다.
(3) 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 포도당주사액, 100ml 포도당주사액에 50mg-200mg의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 함유되어 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
즉 본 발명의 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 및 그의 냉동건조 분말주사제를 홍화 한약재의 추출, 나트륨 이온교환수지에 의한 전환, 대공극수지에 의한 분리, 글루칸 겔 크로마토그래피에 의한 분리 및 초여과 등 단계를 거쳐서 제조한다. 구체적인 내용은 다음과 같다.
(1) 홍화 약재를 원료로 하며 적당한 양의 50~100℃ 물로 추출한다. 추출 회수는 2~3회, 매회 0.5~24시간씩 추출하며 추출에 사용하는 물의 양은 홍화 생약의 10~30배이다. 추출 후 여과하여 찌꺼기를 제거하고 추출액을 5~30℃까지 냉각한 후 2~24시간 동안 방치한다.
(2) 추출액을 1~30ml/min의 유속으로 나트륨 이온교환수지에 통과시킨 다음 컬럼체적의 1배에 해당하는 물로 컬럼 내의 추출액을 배출한다.
(3) 대공극 흡착수지에 의한 분리: 상기 단계 (2)에서 얻은 홍화 추출액을 대공극 흡착수지 HZ801컬럼으로 분리한다. 대공극 흡착수지 컬럼의 내경과 컬럼 높이의 비례는 1:8~15이며, 정제수를 세척액으로 하며, 세척 유속은 10~30ml/min이다. 세척액을 수집한 후 감압 농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 농축액 조품을 얻는다.
(4) 글루칸 겔 크로마토그래피에 의한 분리: 상기 단계 (3)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 농축액 조품에 대해 여과 또는 원심분리를 행한 후, Sephadex LH-20 글루칸 겔 크로마토그래피로 분리한다. 크로마토그래피 컬럼의 내경과 높이의 비례는 1:5~20이다. 정제수를 세척액으로 하며, 세척의 선형 유속은 1~10cm/h로 제어한다. 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 세척액을 수집한 후, 감압 농축하여 농축액을 얻는다.
(5) 초여과: 상기 단계 (4)에서 얻은 농축액에 대해 여과 또는 원심분리를 행한 후, 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 초여과를 행하여 초여과액을 얻는다.
(6) 냉동건조: 상기 단계 (5)에서 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 얻는다.
(7) 상기 단계 (6)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 주사용 물에 용해하고, 0.22㎛ 미세다공성 여과막이나 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 여과하여 병에 나누어 넣는다. 그 다음 냉동건조하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말주사제를 얻는다.
상기 나트륨 이온교환수지는 001*7 나트륨 이온교환수지 또는 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지를 사용한다. 상기 대공극수지에 의한 분리는 대공극 흡착수지HZ801를 사용한다. 상기 글루칸 겔 크로마토그래피에 의한 분리는 글루칸 겔 LH-20를 사용한다. 상기 초여과는 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막을 사용한다.
본 발명에서는 상기 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제공하여 약물제조에 응용한다. 상기 약물은 항PAF 또는 ADP에 유도되는 혈소판응집작용, 심근빈혈, 뇌빈혈, 혈전으로 형성된 손상과 질병을 예방하고 치료하는데 사용된다. 임상 사용량은 50∼200mg/일이다.
본 발명은 천연 한약재 홍화를 원료로 하며 우수한 추출방식을 통하여 신규 단량체 약물 화합물인 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제공한다. 순도는 98.5%이상으로 보증하며 불순물 수량은 5개이하로 제어할 수 있다. 더 중요한 점은 히드록시새플로르 옐로우 A에 비하여 본 발명의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 더 안정하고 약물 안전성과 제어가능성에 더욱 유리하므로 관상동맥질환, 협심증 등 각종 혈액순환장애 질환의 치료에 응용될 전망이다. 히드록시새플로르 옐로우 A보다 더 안전하고 효과적인 안정하고 제어가능한 단량체 화합물이다.
약리학적 실험 1:
시험목적: 개의 급성 심근경색에 대한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염과 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A(50mg/병) 정맥주사에 의한 개선작용을 관찰한다.
시험 약물
주사용 히드록시새플로르 옐로우 A(50mg/병). 출처: 저장융닝약업주식유한공사. 함유량: 50mg/병, 히드록시새플로르 옐로우 A 42.5mg 함유.
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말(실시예 1에 따라 제조)
동물
건강한 잡종개 18마리, 암수 각각 절반, 임의로 세 그룹으로 나눈다.
Figure 112014084150951-pct00003
상기 약물은 전부 정맥주사를 통하여 주입하며, 임상 사용경로(정맥주사)와 일치한다. 약물 주입 회수는 1회이다.
실험방법
동물의 체중을 칭량한 후, 3% 펜토바르비탈 나트륨 30mg/kg 정맥주사로 마취를 행한다. 기관지에 호스를 연결하고, 마취호흡기를 연결하고, 흉벽을 절개한 후 기계적으로 호흡을 돕는다. 호흡빈도는 16~18회/분, 날숨과 들숨의 비례는 1:2, 호흡량은 350~550㎖이고 기혈 분석결과에 근거하여 환기 지수를 조절한다. 침상전극을 사지와 가슴의 피하조직에 꼽고 표준사지유도 및 V1, V3, V5 심전도를 관측한다. 흉골 왼쪽 가장자리의 제3 늑간에 따라 흉벽을 절개하고 제4늑골을 절단하여 심장을 충분히 노출시킨다. 심낭을 자르고 심낭 해먹을 설치한다. 리도카인 정맥주사 2mg/kg으로 부정맥을 예방한다. 왼쪽 관상동맥 앞쪽 내림차순 동맥 부위를 분리하고 앞쪽 내림차순 동맥 아래 부분을 2개의 1호실크로 느슨하게 매듭을 짓는다. 직경이 1mm인 와이어를 제1매듭에 삽입한 후 제1매듭을 짓는다. 와이어와 관상동맥을 함께 묶은 후 와이어를 꺼낸다. 30분 후 제2매듭을 짓는다(그와 동시에 시험약물을 정맥주사한다). 제2매듭을 지은 후 5분, 10분, 30분 및 1, 2, 3, 4시간 간격으로 심전도의 변화를 관찰한다. 4시간 후 심장을 꺼내어 심장무게를 달고 대동맥 근부 좌우에 따라 관상동맥 입구에 압력을 가하면서 10% 탄소잉크를 10㎖ 주입하여 비심근빈혈구역(검은색으로 물든 심근)과 빈혈구역(검은색으로 물들지 않은 심근)을 구분한 후 빈혈구역을 잘라 무게를 단다. 그 다음 빈혈구역을 두께 0.5~1cm의 심근으로 절단하고 생리식염수로 씻은 후 37℃ 0.025% 니트로블루테트라졸리움(NBT) 용액에 넣어 염색한다. 염색 중 자주 염색용액을 흔들어 심근과 충분히 접촉시킨다. 30분 후, 즉시 물로 여분의 염료를 씻어낸다. 심근경색이 발생한 심근은 염색되지 않으나 정상적인 심근은 검은색으로 염색된다. 염색된 부분을 제거한 후 염색되지 않은 심근경색 부분의 무게를 단다.
관찰지수
약을 투입한 후 주요 관찰지수는 흉부유도 심전도 ST단계의 받침 정도 및 심근경색 범위 등 정량지수이다. 구체적으로는 다음과 같다.
1. ST단계 받침정도: ΔST, 매듭짓기 전의 ST를 0점으로 한다.
관찰주기는 약물 투입 후의 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간이다.
2. 심근경색 정도
빈혈구역 심근무게(g): 관상동맥을 묶은 혈액공급구역의 심근무게.
경색구역 심근무게(g): 염색 후 염색되지 않은 심근.
심근경색률(%): (경색구역 /빈혈구역 )*100%
시험대조
음성 대조그룹 생리식염수 1mg/kg
통계분석
시험결과는 X?S로 표시하며 비매칭t검사법으로 통계한다. P<0.05는 현저한 통계학 차이가 있음을 설명한다.
시험결과
1. 개 심근경색을 마취한 후의 ST단계 받침정도에 대한 약물의 영향
생리식염수와 비교할때 약물을 투입하여 5분부터 4시간 사이에 정맥주사주사용 히드록시새플로르 옐로우 A와 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 마취하여 흉벽을 절개한 개 관상동맥 매듭에 의한 ST단계 받침정도를 현저히 감소시킨다. 결과는 표 1을 참조하기 바란다.
[표 1] 마취하여 흉벽을 절개한 개 심근경색의 ST단계 받침정도에 대한 영향
Figure 112014084150951-pct00004
2. 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A와 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 모두 마취하여 흉벽을 절개한 개 급성심근경색의 심근경색 범위를 현저히 축소시킨다. 그중 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 주사 그룹의 효과가 가장 좋다. 결과는 표 2를 참조하기 바란다.
[표 2] 개 급성심근경색 범위에 대한 영향
Figure 112014084150951-pct00005
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs생리식염수 그룹
시험 결론
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염과 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A를 비교한 결과, 빈혈구역 심근괴사 방지에 더 좋은 효과가 있었다.
약리학적적 연구시험 2:
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 항혈소판응집 작용, 급성뇌빈혈에 대한 예방치료 작용.
시험약물
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조분말(실시예 1에 따라 제조)
실험내용
1. 개 신체를 이탈한 심장 및 뇌혈관의 선택: 이 실험에서는 비글(Beagle) 견 뇌기저 동맥링과 관상동맥링을 체외 혈관 측정장치에 고정하고 장력센서를 조정하고 컵내 용액에 10-6 mol /L의 페닐에프린을 첨가하여 혈관의 적당한 장력을 유지한다. 그 다음 혈관링 반응이 아주 약해지거나 더이상 반응이 행되지 않을때까지(약물 첨가회수는 보통 4∼5회이다) 5분 간격으로 컵내 용액에 10mg/㎖의 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 첨가한다. 혈관수축이나 이완변화값을 계산한다. 실험결과, 심장혈관링에 대한 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 이완작용은 30.9%이고 뇌혈관링에 대한 이완작용은 72.8%이다. 이는 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 뇌혈관에 대해 아주 훌륭한 선택성과 이완작용이 있음을 설명한다.
2. 급성뇌빈혈에 대한 영향: 실험용 SD쥐에게 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 정맥주사한 후, 일반 중간대뇌동맥폐색(MCAO) 봉합법으로 급성뇌빈혈 모형을 만든다. 24시간 사육한 후, 신경행위학에 대해 평가를 행하고 머리를 잘라 쥐를 죽이고 대뇌를 채취하여 금형에 넣어 7개 부분으로 자른다. 그다음 TTC 염색을 행하면 살아있는 뇌조직은 붉은 색으로 염색되고 괴사한 뇌조직은 염색되지 않는다. 그래픽분석 소프트웨어로 대뇌반구에서 차지하는 괴사뇌조직의 비례를 계산한다. 그 결과, 뇌경색면적 용제 대조그룹은 38%이고 니모디핀 양성 대조그룹은 15.4%이고, 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 저,중,고 3개 용량 그룹은 각각 38.0%, 27.2% 및 21.5%이다. 용제 대조그룹과 비교할 때. 중,고 용량은 급성뇌빈혈에 의한 뇌조직괴사를 현저히 감소시킨다.
3. 쥐 뇌혈관 투과성에 대한 영향: 쥐에게 정맥주사를 매일 1회, 연속 7일 동안 주입한다. 마지막으로 주입한 후 쥐를 마취시키고 에반스블루 50mg/kg을 정맥주사한다. 5분 후, 양측의 경동맥을 묶고 3시간 후 동물의 머리를 잘리 죽이고 대뇌를 취출한다. 그다음 무게를 달아 포름아미드 용액에 침지하고, 45℃ 인큐베이터에 72시간 방치한다. 이때 뇌혈관 중의 에반스블루가 포름아미드용액속에 침출되므로 분광광도계로 포름아미드 용액 중에 석출된 에반스블루의 양으로 뇌혈관 투과성을 표시한다. 실험결과가 설명하다시피 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 중,고 용량 그룹은 뇌혈관에서 에반스블루가 넘치는 것을 현저히 감소시킨다. 이는 해당 약물이 혈관 투과성을 감소시키는데 좋은 효과가 있음을 설명한다.
4. 개 뇌혈 유량에 대한 영향: 실험동물은 비글(Beagle) 견이며, 펜토바르비탈 나트륨으로 개를 마취한 후, 수술하여 한 측의 외부 경정맥, 내부 경정맥 및 척추동맥을 분리하고 외부 경정맥을 묶은 후 유량센서를 내부 경정맥과 척추동맥에 설치하여 두개 센서에서 기록한 혈액유량의 합계에 2를 곱하여 뇌 전체 혈액공급량을 표시한다. 실험이 끝나면 대뇌를 채취하여 뇌조직 100g의 혈액유량을 계산한다. 시험결과, 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 정맥주사한 후 중. 고 용량 그룹의 혈액유량은 현저히 증가하였으나 혈액유량의 증가 유지시간은 비교적 짧았다(약 15분). 이 실험에서 나타난 바와 같이, 향후 임상에서 급성뇌빈혈을 치료할 경우에는 정맥 적주법으로 약물을 투입하는 것이 바람직하다.
5. 급성대뇌저산소증에 대한 영향: 실험용 쿤밍쥐와 SD쥐를 사용한다. 동물을 저산소 환경에 방치하여 생존시간을 기록하여 약물 사용 후 동물의 급성저산소환경에 대한 내성을 관찰한다. 실험결과, 밀폐된 용기속에서 용제 대조그룹의 생존시간은 32분이고 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 저, 중, 고 3개 용량 그룹의 생존시간은 각각 37, 37, 37분이었다. 통계학적으로 용제 대조 그룹과 비교한 결과, 현저한 차이가 존재한다(P<0.05~0.01). 쥐 실험은 97%의 질소와 3%의 산소가 함유된 환경에서 행하였다. 동물을 용기에 넣은 후, 호흡이 정지될 때까지 각 그룹의 생존시간은 용제 대조그룹은 평균 3분43초이고 양성 대조그룹(니모디핀)은 5분45초이다. 두 그룹의 차이는 아주 현저하다. 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 저,중,고 3개 용량 그룹은 각각 3분30초, 4분35초 및 4분12초이다. 용제 대조그룹과 비교할때 중,고 용량 그룹의 생존시간은 현저한 차이가 난다.
6. 항혈소판응집: 실험은 측정기검측과 생체실험 두 부분으로 나뉜다.
1) 측정기 검측법: 집토끼에게 매일 1회씩 연속 5일 동안 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 정맥주사한다. 마지막 약물투입이 결속된 후 2시간 내에 심장에서 혈액 4㎖을 채취하여 혈액을 저속 원심분리하여 혈소판을 충분히 함유한 혈청을 얻는다. 고속 원심분리하여 혈소판을 적게 함유된 혈청을 얻는다. 혈소판응집 유도제는 아데노신이인산염(adenosine diphosphate；ADP)과 혈소판응집 활성화 요인(Platelet-Activating Factor PAF)을 사용하며 혈소판응집장치로 측정한다. 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염주사액의 항ADP와 PAF로 유도하는 혈소판응집 실험에서 뛰어난 항혈소판응집 작용을 보여주었다. 3가지 용량은 양호한 양적-효능적 관계가 나타났다.
2) 생체방법: 라텍스관으로 쥐 동정맥 사이에 단락을 형성하고 라텍스관 내에 수술용 실을 고정하며 혈소판의 접착특성을 이용하여 단락을 오픈하여 혈액이 라텍스관으로부터 동정맥에 15분 동안 흐르게 한 후 실을 제거하고 무게를 단다. 그 무게에서 실의 건조무게를 감하면 실에 접착된 혈소판 무게가 된다. 실험결과, 실에 접착된 혈소판 무게는 용제 대조그룹은 14.8±1.57mg이고, 양성 대조그룹은 8.62±2.79mg이고, 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 저,중,고 3개 용량 그룹의 혈소판 무게는 각각 13.8±1.95mg, 9.87±1.50mg 및 9.02±1.29mg이다. 중,고 용량그룹과 용제 대조그룹의 차이가 비교적 현저한 바 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 쥐에 대해 뛰어난 항혈소판응집작용이 있음을 설명한다.
7. 혈액 접착도에 대한 영향: 집토끼에게 매일 1회씩 연속 5일 동안 정맥주사를 행한다. 마지막 약물 투입이 결속된 후 2시간내에 심장에서 혈액을 채취하여 응고방지처리를 행한 후 혈액레오미터로 검측한다. 실험결과가 보여주다시피 용제 대조그룹과 비교할때 약물 사용량의 증가에 따라 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 치료그룹의 혈액접착도의 로우컷, 중간컷, 하이컷 3개 지수가 감소한다. 감소정도는 약물 투입량의 증가에 따라 증가한다. 고용량 그룹의 효과는 양성 대조약물 니모디핀 주사용 약물그룹보다 높다. 이는 주사용 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염이 혈액접착도 감소에 현저한 효과가 있음을 설명한다.
나. 안정성시험
시험목적: 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염과 히드록시새플로르 옐로우 A안정성 및 물리화학 데이터를 관찰한다.
시험 약물
히드록시새플로르 옐로우 A CN102675379A방법에 따라 자체로 제조하였으며, 그의 순도는 89.9%이었다.
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 자체 제조(실시예 1에 따라 제조한다) 순도 98.6%
결과는 표 3을 참조한다.
[표 3] 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 안정성의 시험결과
Figure 112014084150951-pct00006
히드록시새플로르 옐로우 A 실시예 2의 방법에 따라 자체로 제조하였다. 히드록시새플로르 옐로우 A를 산성화한 후, 제조하였다. 순도99.2%.
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 자체제조(실시예 2에 따라 제조한다) 순도99.2%
결과는 표 4를 참조한다.
[표 4] 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 안정성의 시험결과
Figure 112014084150951-pct00007
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 물리화학 데이터는 표 5를 참조한다.
[표 5] 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 물리화학 데이터 결과
Figure 112014084150951-pct00008
시험결과로부터 나타난 바와 같이, 본 발명의 식(I)의 새로운 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염과 히드록시새플로르 옐로우 A의 안정성 비교실험에서 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 안정성이 더 뛰어나며 품질도 더 안전하고 신뢰성이 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A는 산성이 비교적 강하여 인체가 접수할 수 있는 pH를 초과하므로 주사시 통증 등 불편한 느낌을 동반하며 용해성도 약하다. 본 발명의 식(I)의 새로운 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염은 뛰어난 내성과 용해성을 구비하고 있다.
실시예 1에서 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 적외선 스펙트럼(IR), 질량 스펙트럼(MS), 핵자기 공명 스펙트럼(1H-NMR), 탄소 스펙트럼(13C-NMR), COSY스펙트럼, DEPT135스펙트럼 및 HSQC 스펙트럼으로 확인한 결과, 그 구조는 다음과 같다.
Figure 112014084150951-pct00009
1. 적외 흡수 스펙트럼
측정기 모델: Bruker VECTOR-22형 적외 흡수 스펙트럼 측정기
IR(브롬화칼륨 태블릿)
IR스펙트럼의 주요 특성피크는 표 6을 관찰한다.
[표 6] 적외선스펙트럼 특성피크
Figure 112014084150951-pct00010
2. 질량 스펙트럼
측정기 모델: 미국FINNIGAN회사 LC-MS 다단계 이온트랩 질량 스펙트럼 시리즈(LCQ-DECAXP)
측정조건: ESI
질량스펙트럼MS
+c ESI 635.14 (M)+
-c ESI 611.25(M-Na)-
3. 핵자기공명스펙트럼과 탄소스펙트럼
측정기 모델: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500초전도 핵자기공명장치
측정조건: 용제: DMSO, 내부표준: TMS
식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 핵자기공명 1H-NMR(도1), 13C-NMR(도 2), COSY스펙트럼(도 3), DEPT135스펙트럼(도 4) 및 HSQC 스펙트럼(도 5)는 설명서의 첨부도와 같다.
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 1H-NMR 데이터의 귀속은 다음과 같다.
화학 시프트 δ(ppm) 2.84~4.14(14H)는 당 부분 수소 G1~G6와 G'1~G'6에 속하고, 4.39~4.77(8H)는 당 부분 히드록실기 수소에 속하고, 7.26(1H)7.39(1H)는 8과 9에 속하며, 6.75~7.42(4H)는 11~15에 속하고, 18.65(1H)는 3-OH에 속하며, 4.70(1H)는 4-OH에 속하고, 9.72(1H)는 13-OH에 속한다.
히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 13C-NMR 데이터의 귀속은 다음과 같다.
DEPT135에서 나타난 바와 같이 화학 시프트 δ(ppm) 61.05(1C), 61.46(1C)(2차 탄소)는 당 부분의 탄소 G6, G'6에 속하며, 68.60, 69.62, 69.83, 70.86, 73.80, 78.25, 79.15, 80.19, 80.62, 85.57(10C)(3차 탄소)는 당 부분의 탄소 G1~G5와 G'1~G'5에 속하고, 115.52(2C)(3차 탄소)는 12와 14에 속하며, 129.26(2C)(3차 탄소)는 11과 15에 속하고, 123.22(1C)135.63(1C)(3차 탄소)는 8과 9에 속한다. 화학 시프트 δ(ppm) 189.37, 105. 96, 195.29, 85.24, 182.69, 99.24(6C)는 1~6에 속하고, 179.06(1C), 127.27(1C), 158.34(1C)는 각각 7, 10, 13에 속한다.
실시예 1: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후, 100 ℃에서 20∼25분 동안 추출하고, 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후, 상기 조건하에서 추출을 1회 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합하고, 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후, 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 처리를 거쳐 평형을 잡은 001*7 나트륨 이온교환수지에 천천히 주입한다. 컬럼의 내경과 높이의 비례는 1:10이고 컬럼체적은 500㎖이며, 유속은 3㎖/min이다. 마지막으로 컬럼체적의 1배에 달하는 물로 컬럼내 추출액을 배출하고, 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 용출액을 수집하여 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입 유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 홍화 농축액 100㎖를 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼체적의 10%이다. 정제수를 세척액으로 하며 세척 유속은 5㎖/분이고 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 함유한 부분을 수집한다. 수집한 액체를 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 35~50㎖를 제조할 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품 분말을 얻는데 순도는 98.6%이고 수율은 홍화로 계산하면 약 0.45% 이다.
상기 방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 주사용 물에 용해하고 0.22㎛ 미세다공성 여과막으로 여과한 후 병에 나누어 넣어 냉동건조하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말주사제를 얻는다.
실시예 2: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후 100 ℃에서 20∼25분 동안 추출하고 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후 상기 조건하에서 추출을 1회 더 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합병하여 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 홍화 농축액 100㎖를 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼체적의 10%이다. 정제수를 세척액으로 하며 세척 유속은 5㎖/분이고 히드록시새플로르 옐로우 A 부분을 수집한다. 수집한 액체를 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 35~50㎖를 제조할 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색 히드록시새플로르 옐로우 A 분말을 얻는데 그 순도는 약 90%이다. 히드록시새플로르 옐로우 A 분말에 물을 넣어 용해한후 HCl로 산성화하고 차거운 곳에 2~24시간 동안 방치하여 고체를 석출시킨다. 고체를 여과한 후 0.1mol/L~10mol/L 수산화나트륨용액으로 pH를 6.0정도로 조절하고 냉동건조하여 담황색의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻는데 그 순도는 99.2%이고 수율은 홍화로 계산하면 약 0.70% 이다.
검증 결과, 상기방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨의 구조는 식(I)과 같다.
상기 방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 주사용 물에 용해하고 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 여과하여 병에 나누어 넣는다. 그 다음 냉동건조하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말주사제를 얻는다.
실시예 3: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후, 100℃에서 20∼25분 동안 추출하고 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후 상기 조건하에서 추출을 1회 더 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합병하여 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 처리를 거쳐 평형을 잡은 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지에 주입한다. 컬럼의 내경과 높이의 비례는 1:10이고 컬럼체적은 500㎖이며 유속은 3㎖/min이다. 유출액을 수집하여 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 100㎖을 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼체적의 10%이다. 세척 유속은 5㎖/분이고, 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 함유한 부분을 수집한다. 수집한 액체를 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 35~50㎖를 제조할 수 있다. 그다음 냉동건조하여 담황색 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품 분말을 얻는데 그 순도는 98.7%이고 수율은 홍화로 계산하면 약 0.50%이다.
검증 결과, 상기방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨의 구조는 식(I)과 같다.
실시예 4: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후, 100℃에서 20∼25분 동안 추출하고 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후 상기 조건하에서 추출을 1회 더 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합병하여 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후, 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 조품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 홍화 농축액 100㎖를 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼체적의 10%이다. 정제수를 세척액으로 하며, 세척 유속은 5㎖/분이고 히드록시새플로르 옐로우 A 부분을 수집한다. 수집한 액체를 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 35~50㎖를 제조할 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색 히드록시새플로르 옐로우 A 분말을 얻는데 그 순도는 약 90%이다. 히드록시새플로르 옐로우 A 분말에 물을 넣어 용해한후 HCl로 산성화하고, 차거운 곳에 2~24시간 동안 방치하여 고체를 석출시킨다. 고체를 여과한 후, 물을 첨가하고 0.1mol/L~10mol/L 탄산나트륨용액으로 pH를 6.0정도로 조절한다. 그다음 냉동건조하여 담황색의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻었다. 순도는 99.1%이고 수율은 홍화로 계산하면 약 0.75%이다.
검증 결과, 상기방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨의 구조는 식(I)과 같다.
실시예 5: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후, 100℃에서 20∼25분 동안 추출하고 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후, 상기 조건하에서 추출을 1회 더 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합병하여 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 조품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 홍화 농축액 100㎖를 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼체적의 10%이다. 정제수를 세척액으로 하며 세척 유속은 5㎖/분이고 히드록시새플로르 옐로우 A 부분을 수집한다. 수집한 액체를 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 농축액 35~50㎖를 제조할 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색 히드록시새플로르 옐로우 A 분말을 얻었다. 그의 순도는 약 90%이다. 히드록시새플로르 옐로우 A 분말에 물을 넣어 용해한후 HCl로 산성화하고 차거운 곳에 2~24시간 동안 방치하여 고체를 석출시킨다. 고체를 여과한 후 물을 첨가하고 0.1mol/L~10mol/L 탄산수소나트륨용액으로 pH를 6.0정도로 조절한다. 그다음 냉동건조하여 담황색의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻는데 순도는 99.3%이고, 수율은 홍화로 계산하면 약 0.69%이다.
검증 결과, 상기방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨의 구조는 식(I)과 같다.
실시예 6: 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염
홍화의 무게를 달아 약재 무게의 12.5배에 달하는 탈이온수를 첨가한 후, 100℃에서 20∼25분 동안 추출하고 여과하여 여과액에 약재 무게의 10배에 달하는 탈이온수를 넣은 후 상기 조건하에서 추출을 1회 더 중복하여 여과한다. 두 차례의 추출액을 합병하여 실온까지 냉각하고 원심분리기로 원심분리를 행한 후 원심분리액을 취하여 예비용으로 준비한다. 상기 원심분리액을 대공극 흡착수지(모델: HZ801) 분리 컬럼에 천천히 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:12이고 샘플 투입유속은 10㎖/분이다. 샘플투입이 끝나면 상온의 탈이온수로 20㎖/분의 유속으로 세척한다. 60℃에서 세척액을 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 조품의 농축액을 얻는다. 홍화로 계산하면 홍화 1킬로그램으로 홍화 농축액 100㎖를 제조할 수 있다. 히드록시새플로르 옐로우 A 조품 농축액을 글루칸 겔 LH-20 컬럼에 주입한다. 컬럼 내경과 높이의 비례는 1:5이고 샘플투입량은 컬럼 체적의 10%이다. 정제수를 세척액으로 하며 세척 유속은 5㎖/분이고 히드록시새플로르 옐로우 A 부분을 수집한다. 수집한 액체를 평형을 잡은 강산성 H형 양이온교환수지에 주입하여 유출액을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압농축하여 히드록시새플로르 옐로우 A 농축액을 얻는다. 차거운 곳에 2~24시간 동안 방치하여 고체를 석출시킨다. 고체를 여과한 후 0.1mol/L~10mol/L 수산화나트륨용액으로 pH를 6.0정도로 조절하고, 냉동건조하여 담황색의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 정제품을 얻었다. 그의 순도는 99.8%이고 수율은 홍화로 계산하면 약 0.68%이다.
검증 결과, 상기방법으로 제조한 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨의 구조는 식(I)과 같다.

Claims (10)

  1. 하기 식(I)로 표시되는 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염:
    Figure 112016123047862-pct00011
    (I)
  2. 하기 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A를 나트륨 이온교환수지 컬럼을 통과시키거나, 또는 수산화나트륨, 탄산나트륨 및 중탄산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 나트륨염과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 청구항 1 기재의 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 제조 방법.
    Figure 112016123047862-pct00012
    (II)
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 나트륨 이온교환수지는 001*7 나트륨 이온교환수지 또는 대공극 HD-8 나트륨 이온교환수지인 것이 특징인 방법.
  5. 제2항에 있어서, 홍화를 원료 물질로 사용하고, 추출, 나트륨염으로의 전환, 분리 및 정제에 의해 얻어지는 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 얻는 방법으로, 그의 방법이 하기 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
    (1) 추출: 물로 홍화 원료를 물로 추출하여 그의 추출액을 얻는 단계;
    (2) 나트륨염으로의 전환: 단계(1)에서 얻은 청구항 2 기재의 식(II)를 주성분으로 함유하는 홍화 추출액을 나트륨 이온교환수지 컬럼에 통과시켜 히드록시새플로르 옐로우 A를 상기 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염으로 전환시키는 단계;
    (3) 분리: 단계 (2)에서 수집한 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 대공극 흡착수지 컬럼에 통과시켜 분리하여 상기 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품을 얻는 단계; 및
    (4) 정제: 단계 (3)에서 얻은 상기 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 조품을 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리한 후, 초여과막(ultrafiltration membrane)으로 초여과를 행하는 단계.
  6. 제2항에 있어서, 하기 단계로 이루어진 단계에 따라 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염의 정제품을 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
    (1) 추출: 물로 홍화 약재를 추출하여 홍화 추출액을 얻는 단계,
    (2) 분리: 단계 (1)에서 얻은 홍화 추출액을 대공극 흡착수지 컬럼에 통과시켜 분리하여 히드록시새플로르 옐로우 A 조품을 얻는 단계,
    (3) 정제: 단계 (2)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 조품을 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고 초여과막으로 초여과를 행한 후 냉동건조를 행하여 히드록시새플로르 옐로우 A 정제품을 얻는 단계,
    (4) 산성화: 단계 (3)에서 얻은 히드록시새플로르 옐로우 A 정제품에 물을 넣고 산을 첨가하여 pH를 1.5-2.5로 조절한 후, 석출된 담황색 고체를 수집하여 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A를 얻는 단계,
    (5) 나트륨염 전환: 단계 (4)에서 얻은 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A에 물을 넣은 후, 0.1mol/L~10mol/L의 수산화나트륨 또는 탄산나트륨 또는 탄산수소나트륨 수용액으로 pH를 6으로 조절하여 식(II)의 히드록시새플로르 옐로우 A를 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염으로 전환시킨 후, 초여과막으로 반응생성물을 초여과하고, 여과액을 냉동 건조하는 단계.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 대공극 흡착수지는 HZ801형 대공극 흡착수지인 것이 특징인 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피 단계는 Sephadex LH-20 글루칸 겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리하고 순수를 세척액으로 사용하며, 초여과는 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤의 초여과막인 것이 특징인 방법.
  9. 제1항 기재의 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 주사용수에 용해한 후, 0.22㎛ 미세다공성 여과막 또는 여과능력이 분자량 8000∼10000달톤에 달하는 초여과막으로 여과한 후, 냉동건조하여 얻어진 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염 냉동건조 분말을 유효성분으로 함유하는 심근빈혈, 뇌빈혈, 혈전으로 인한 질환의 예방, 치료제.
  10. 제1항 기재의 식(I)의 히드록시새플로르 옐로우 A 나트륨염을 유효성분으로 함유하는 심근빈혈, 뇌빈혈, 혈전으로 인한 질환의 예방, 치료제.
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