KR101788658B1

KR101788658B1 - 신규 히드록시 홍화황색소 a의 의약용 정제염

Info

Publication number: KR101788658B1
Application number: KR1020157001552A
Authority: KR
Inventors: 펭퀴 예; 벤 카이; 민 루; 용링 첸
Original assignee: 체지앙 용닝 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2013-06-08
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2017-10-20
Also published as: JP6193368B2; EP2899186A4; EP2899186A1; CN104540811B; EP2899186B1; CN104230864A; KR20150102925A; JP2015526398A; CN104540811A

Abstract

본 발명은 하기 식(I)의 히드록시 홍화황색소 A 의약용 정제염，특히 히드록시 홍화황색소 A의 칼륨농축액, 암모늄, 칼슘, 염화마그네슘의 신형 단량체화합물 및 생산방법과 의약용도를 제공한다. 히드록시 홍화황색소 A와 비교할 때，본 발명의 수산기 홍화황색소 A 의약용 정제염의 순도는 98%이상으로 더 안전하고 더 효과적이며 신뢰도가 더 높다. PAF 혹은 ADP 유도로 인한 혈소판응집을 억제하는 작용이 있다. 혈소판응집억제, 관상동맥경화증, 협심증, 급성뇌허혈 등 각종 혈액순환 장애 질병의 치료 측면에서 수산기 홍화황색소 A보다 효능이 탁월하다.

[식중，n은 1 또는 2를 나타내고，
M은 Ca, Mg, K, NH₄ 및

(식중, R1, R2, R3, R4는 서로 같거나 다르며, 각각 수소 또는 알킬기를 나타낸다. )
으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 의미한다.]

Description

신규 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 {NEW HYDROXYSAFFLOR YELLOW A SALT FOR PHARMACEUTICAL FORMULATION}

본 발명은 일종의 신규 히드록시 홍화황색소 의약용 정제염에 관한 것이다. 더 상세히는 일종의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 및 제조방법, 냉동분말 주사제, 의약용도에 관한 것이다.

홍화 한약재는 국화과 식물인 Carthamus　tinctouius L.의 말린 꽃으로, 어혈을 제거하고, 혈맥의 소통을 원활하게 하는 일반 한약재로 알려져 있다. 관상동맥질환, 협심증 등 각종 혈액순환장애 질환의 치료에 사용된다. 히드록시 홍화황색소 A (hydroxysafflor yellow A)는 단일 카르콘글리코시드 구조를 가진 화합물로서 홍화 약리효과 중의 가장 유효한 수용성 부위에 속한다. 혈소판 활성화 요인으로 발생한 혈소판응집과 릴리스를 억제하고, 혈소판 활성화 요인과 혈소판 수용체의 결합을 효과 있게 억제할 수 있다. 혈의 운행을 활발히 하여 어혈을 없애는 홍화황색소의 효과적인 성분에 속한다. 당해 분야의 보고에 의하면, 항응고, 섬유소용해 촉진, 항혈전, 순환부전 개선 등 여러 방면의 심혈관 약리효과가 있다고 알려져 있다.

히드록시 홍화황색소 A는 홍화황색소 중 함량이 가장 높은 성분으로서 약용가치는 심혈관 응용에서 증명된 만큼 그 메커니즘은 매우 명확하다. 지금까지 대량의 히드록시 홍화황색소 A 제조방법이 개시되었다. 예를 들면, 홍화를 원재료로 하여 수용추출, 대공극 흡착수지 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과 등 단계를 통해 주사용 히드록시 홍화황색소 A를 얻는 방법도 포함한다. 그러나 기존 제조방법으로 얻은 히드록시 홍화황색소 A제품의 순도가 높지 않고, 기본적으로 10% 이상의 불순물이 포함한다. 그리고 이런 불순물의 구조성질은 정성적으로 분석되지 않아 품질의 일관성 및 제품에 영향을 준다. 특히 주사제의 안정성과 안전성에 영향을 준다. CN102675379A는 홍화로부터 정제된 히드록시 홍화황색소 A를 추출하는 방법을 개시되어있다. 구체적으로 홍화액 추출, 약알칼리성 이온교환수지 정제, 중극성 대공극 흡착수지 정제, 비극성 대공극 흡착수지 정제, 냉동건조 등 5단계의 공정을 통해 순도 80％ 이상에 불과한 히드록시 홍화황색소 A를 얻음을 개시하고 있다.

기존 기술의 결함을 극복하기 위해 본 발명은 일종의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염이란 새로운 화합물을 제공한다. 순도는 98% 이상, 불순물 개수는 5개 이하이다. 이는 관상동맥질환, 협심증, 뇌졸중 등 각종 혈액순환장애 질병의 치료에서 히드록시 홍화황색소 A보다 더 안전하고 유효하고, 더 안정적인 새로운 단량체 화합물이다.

본 발명의 과제를 해결하기 위한 수단은 다음과 같다.

본 발명의 1 목적은 식(I)로 표시되는 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 제공하는 것이다.

(식 I)

[식중，n은 1 또는 2를 나타내고，

M은 Ca, Mg, K, NH₄ 및

(식중, R1, R2, R3, R4는 서로 같거나 다르며, 각각 수소 또는 알킬기를 나타낸다. )

으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 의미한다.]

우선, 전술한 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염은, 식(II)의 염화칼륨, 식(III)의 염화암모늄，식(IV)의 염화칼슘 또는 식(V)의 염화마그네슘으로부터 얻을 수 있다.

식(II)

식(III)

식(IV)

식(V)

본 발명의 또 다른 목적은 상기 히드록시 홍화황색소A의 의약용 정제염의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 식(IV)의 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 핵자기공명 ¹H-NMR을 나타낸다.
도 2는 식(IV)의 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 핵자기공명 ¹³C-NMR을 나타낸다.
도 3은 식(V)의 히드록시 홍화황색소 A마그네슘 핵자기공명 ¹H-NMR을 나타낸다.
도 4는 식(V)의 히드록시 홍화황색소 A마그네슘 핵자기공명 ¹³C-NMR을 나타낸다.

본원 발명의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염은, 홍화의 추출, 강산성 H형 양이온 교환수지로 전환, 대공극 흡착수지로 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과 등 단계로 이루어진 방법에 의해 얻어진 화합물이며, 그 방법의 특징은 다음과 같다.

(1) 홍화액 추출: 홍화약제 원료를 수용액으로 추출하여 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 추출액을 얻는다.

(2) 강산성 H형 양이온 교환수지로 전환: 단계(1)에서 얻은 추출액을 강산성 H형 양이온교환수지 칼럼을 통과시켜 세탈액(spent regenerant)을 수집한다. 세탈액에 수산화칼륨, 수산화암모늄, 알킬아민 또는 알킬암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘을 가하여，히드록시 홍화황색소 A로부터 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 얻는다. 그리고 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 의약용 정제염의 세탈액을 수집한다.

(3) 대공극 흡착수지 분리: 단계(2)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 의약용 정제염의 세탈액을 대공극 흡착수지 칼럼을 이용하여 분리한다. 물을 세탈제로 하여 세탈액을 수집한다. 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 조품(crude product)을 얻는다.

(4) 글루칸젤 분리: 단계(3)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 조품을 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 물을 세탈제로 하여 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 의약용 정제염 세탈액을 수집한다.

(5) 초여과막 여과: 단계(4)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A함유 의약용 정제염 세탈액을 농축한 후, 여과 또는 원심분리한다. 그런 다음, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과를 행하여 초여과액을 얻는다. 이를 건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 얻는다.

상기 단계(2)에서 기술한 양이온교환수지는 강산성 H형 양이온 교환수지를 001*7 이온교환수지 또는 대공극 HB-8 교환수지를 이용한다.

본 발명에서 강산성 H형 양이온 교환수지로서, 시판되고 있는 상하이화전과기유한공사(上海震科技有限公司)의 001*7 이온교환수지 또는 대공극 HB-8교환수지를 이용하여도 좋다. 이는 염산(HCl) 수용액을 통과시켜 재생 사용하는 것이 가능하다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 제조방법을 제공하는 것이다. 이는 홍화액 추출, 대공극 흡착수지 분리, 글루칸젤 분리, 초여과, 산성화, 정제염의 단계로 이루어진다. 그의 상세는 아래와 같다.

(1) 홍화액 추출: 홍화약제 원료를 수용액으로 추출하여 홍화황색소를 함유한 추출액을 얻는다.

(2) 대공극 흡착수지 분리: 단계(1)에서 얻은 홍화황색소를 함유한 추출액을 대공극 흡착수지 칼럼을 이용하여 분리한다. 물을 세탈제로 하여 세탈액을 수집한다. 감압, 농축하여 홍화황색소의 조품을 얻는다.

(3) 글루칸젤 분리: 단계(2)에서 얻은 홍화황색소 조품을 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 물을 세탈제로 하여 홍화황색소를 함유한 세탈액을 수집한다.

(4) 초여과: 단계(3)에서 얻은 홍화황색소를 함유한 세탈액을 농축한 후, 여과 또는 원심분리한다. 그런 다음, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과를 행하여 초여과액을 얻는다. 이를 건조하여 홍화황색소 분말을 얻는다.

(5) 산성화: 단계(4)에서 얻은 홍화황색소 분말에 물을 붓고, 산성화한 후 냉소에서 2~24시간 보관한다. 생성된 담황색 고체 히드록시 홍화황색소 A를 분리한 후, 상층의 액체를 여과한다.

(6) 정제염: 단계(5)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A에 물을 부은 후, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 알킬아민 또는 알킬암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘을 첨가한다. 히드록시 홍화황색소 A가 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 생성한 후, 다시 초여과막법으로 초여과를 행한다. 그런 다음, 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 얻는다.

본 발명의 또 다른 목적은 일종의 의약조성물을 제공하는 것이다. 이는 치료유효량의 전술한 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 유효성분이며, 여기에 의학적으로 허용되는 담체를 부형제로 함유하여도 좋다.

히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 함유하는 냉동 건조분말 주사제, 수액제 등을 제조할 수 있다. (1) 주사용 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 냉동건조 주사제, 한 병에 50mg~200mg 함량, 부형제 첨가하지 않거나, 또는 1:0.5~1.5의 만니톨을 첨가한다. (2) 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 염화나트륨 주사액, 염화나트륨 주사액 100㎖당 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 50mg~200mg 함유한다. (3) 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 함유하는 포도당 주사액은 포도당 주사액 100㎖당 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 50mg~200mg을 함유한다.

그 중, 전술한 의약조성물에 냉동건조분말인 주사제를 우선 선택한다. 이는 다음과 같은 단계로 얻는다.

(1) 홍화 약재의 원재료에 온도 50~100℃의 물을 부어 추출한다. 수용추출방식으로 매회 0.5~24시간씩 2~3회 추출한다. 추출용수의 양은 홍화 생약 중량의 10~30배이다. 추출한 후 잔사를 여과하고, 추출액을 5~30℃까지 냉각한 다음 2~24시간 보관한다.

(2) 단계(1)을 통해 얻은 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시킨다. 수산화칼륨, 수산화암모늄, 알킬기 아민 또는 알킬기 암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A에서 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 생성한다. 그리고 청구항 1 또는 2에서 기술한 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 포함한 세탈액을 수집한다.

(3) 단계(2)를 통해 얻은 세탈액을 대공극 흡착수지 칼럼으로 분리한다. 순수(Purified Water)를 세탈액으로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈한다. 그리고 세탈액을 수집하여 감압, 농축과정을 통해 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 농축액 조품을 얻는다.

(4) 단계(3)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후, 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형 유속으로 세탈한다. 그리고 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 포함한 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는다.

(5) 단계(4)를 통해 얻은 농축액을 여과 또는 원심분리한 후, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과를 진행하여 초여과액을 얻는다.

(6) 단계(5)를 통해 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 정품을 얻는다.

(7) 단계(6)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 정품을 주사용수에 용해한다. 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 여과한 후, 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 냉동분말 주사제를 얻는다.

그 중, 전술한 양이온교환수지로 001*7 이온교환수지 또는 대공극 HB-8교환수지를, 전술한 대공극 흡착수지로 대공극 흡착수지 HZ801을, 전술한 글루칸젤 크로마토그래피로 세파덱스LH-20을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 전술한 방법에서 약용소다는 히드록시 홍화황색소 A를 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염으로 정제하는데 바람직하게 사용될 수 있다. 약용소다를 바람직하기로는 히드록시 홍화황색소 A의 몰비로 0.5~1배 첨가한다.

본 발명의 한가지 구체예로, 식(II)에서 기술한 일종의 히드록시 홍화황색소 A칼륨 및 그 냉동건조분말 주사제의 제조방법을 예시한다. 이는 홍화액 추출, 강산성 H형 양이온 교환수지로 전환, 대공극수지 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과 등 단계를 포함하며, 그의 구체적 방법으로 다음을 들 수 있다. (1) 홍화 약재 원재료에 50~100℃의 물을 적정량으로 추출한다. 수용 추출방식으로 매회 0.5~24시간씩 2~3회 추출한다. 추출용수의 양은 홍화 생약 중량의 10~30배이다. 추출한 후 잔사를 제거하고, 추출액을 5~30℃까지 냉각하고, 2~24시간 보관한다. (2) 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시켜 세탈액을 수집한다. 히드록시 홍화황색소 A와 같은 몰 중량의 수산화칼륨을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A칼륨을 함유한 세탈액을 얻는다. (3) 대공극 흡착수지 분리: 단계(2)에서 얻은 세탈액을 대공극 흡착수지 HZ801칼럼으로 분리한다. 대공극 흡착수지 칼럼의 내경과 높이의 비는 18~15이다. 순수를 세탈제로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 얻는다. (4) 글루칸젤 크로마토그래피 분리: 단계(3)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후, 세파덱스 LH-20 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 글루칸젤 칼럼의 내경과 높이의 비는 15~20이다. 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형유속으로 히드록시 홍화황색소 A칼륨을 함유한 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는다. (5) 초여과: 단계(4)를 통해 얻은 농축액을 여과 또는 원심분리한 후, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 초여과액을 얻는다. (6) 냉동건조: 단계(5)를 통해 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A칼륨을 얻는다. 필요할 경우 단계(6)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 칼륨 정품을 주사용수에 용해하여 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 여과한 후, 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨 농축분말 주사제를 얻는다.

본 발명의 또 다른 구체예로서 일종의 식(III)에서 기술한 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 및 그 냉동건조분말 주사제의 제조방법을 제공한다. 이는 홍화액 추출, 강산성 양이온 교환수지로 전환, 대공극수지 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과의 단계로 이루어지며, 그의 특징은 다음과 같다.

(1) 홍화 약재의 원재료에 50~100℃의 물을 적정량 부어 추출한다. 수용추출방식으로 매회 0.5~24시간씩 2~3회 추출한다. 추출용수의 양은 홍화 생약 중량의 10~30배이다. 추출한 후 잔사를 제거하고, 추출액을 5~30℃까지 냉각하여 2~24시간 보관한다. (2) 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시켜 세탈액을 수집한다. 히드록시 홍화황색소 A와 등몰중량의 수산화암모늄(즉, 암모니아수)을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염을 함유한 세탈액을 얻는다. (3) 대공극 흡착수지 분리: 단계(2)에서 얻은 세탈액을 대공극 흡착수지 HZ801 칼럼으로 분리한다. 대공극 흡착수지 칼럼의 칼럼 내경과 칼럼 높이의 비는 18~15이다. 순수를 세탈제로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A암모늄 농축액 조품을 얻는다. (4) 글루칸젤 크로마토그래피 분리: 단계 (3)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후 세파덱스 LH-20 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 글루칸젤 칼럼의 내경과 높이의 비는 15~20이다. 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형유속으로 히드록시 홍화황색소 A암모늄을 함유한 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는다. (5) 초여과: 단계(4)를 통해 얻은 농축액을 여과 또는 원심분리한 후 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 초여과액을 얻는다. (6) 냉동건조: 단계(5)를 통해 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염을 얻는다. 필요할 경우 단계(6)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A암모늄 정품을 주사용수에 용해하여 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 여과한 후, 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축분말 주사제를 얻는다.

본 발명의 또 다른 구체예로서 일종의 식(IV)에서 기술한 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 및 그 냉동건조분말 주사제의 제조방법을 제공한다. 이는 홍화액 추출, 강산성H양이온 교환수지로 전환, 대공극수지 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과의 단계를 포함한다. 그 특징은 다음과 같다.

(1) 홍화 약재의 원재료에 50~100℃의 물을 적정량 부어 추출한다. 수용추출방식으로 매회 0.5~24시간씩 2~3회 추출한다. 추출용수의 양은 홍화 생약 중량의 10~30배이다. 추출한 후 잔사를 제거하여 추출액을 5~30℃까지 냉각하여 2~24시간 보관한다. (2) 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시켜 세탈액을 수집한다. 히드록시 홍화황색소 A와 등몰중량의 Ca(OH)₂를 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A칼슘을 함유한 세탈액을 얻는다. (3) 대공극 흡착수지 분리: 단계(2)에서 얻은 세탈액을 대공극 흡착수지 HZ801칼럼으로 분리한다. 대공극 흡착수지 칼럼의 칼럼 내경과 칼럼 높이의 비는 18~15이다. 순수를 세탈제로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 얻는다. (4) 글루칸젤 크로마토그래피 분리: 단계 (3)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후 세파덱스 LH-20 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 글루칸젤 칼럼의 내경과 높이의 비는 15~20이다. 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형유속으로 히드록시 홍화황색소 A칼슘을 함유한 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는다. (5) 초여과: 단계(4)를 통해 얻은 농축액을 여과 또는 원심분리한 후 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 초여과액을 얻는다. (6) 냉동건조: 단계(5)를 통해 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 얻는다. 필요할 경우 단계(6)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 정품을 주사용수에 용해하여 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 여과한 후 용기에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축분말 주사제를 얻는다.

본 발명의 또 다른 구체예로서 일종의 식(V)에서 기술한 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 및 그 냉동건조분말 주사제의 제조방법을 제공한다. 이는 홍화액 추출, 강산성 양이온 교환수지로 전환, 대공극수지 분리, 글루칸젤 크로마토그래피 분리, 초여과의 단계를 포함한다. 그 특징은 아래에 있다.

(1) 홍화 약재의 원재료에 50~100℃의 물을 적정량 부어 추출한다. 수용추출방식으로 매회 0.5~24시간씩 2~3회 추출한다. 추출용수의 량은 홍화 생약 중량의 10~30배이다. 추출한 후 잔사를 제거하고, 추출액을 5~30℃까지 냉각하여 2~24시간 보관한다. (2) 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시켜 세탈액을 수집한다. 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 약 1/2의 몰중량의 수산화마그네슘을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염을 함유한 세탈액을 얻는다. (3) 대공극 흡착수지 분리: 단계(2)에서 얻은 세탈액을 대공극 흡착수지 HZ801칼럼으로 분리한다. 대공극 흡착수지 칼럼의 칼럼 내경과 칼럼 높이의 비는 18~15이다. 순수를 세탈제로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 농축액 조품을 얻는다. (4) 글루칸젤 크로마토그래피 분리: 단계(3)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후, 세파덱스 LH-20 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리한다. 글루칸젤 칼럼의 내경과 높이의 비는 15~20이다. 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형유속으로 히드록시 홍화황색소 A마그네슘염을 함유한 세탈액을 수집한다. 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는다. (5) 초여과: 단계(4)를 통해 얻은 농축액을 여과 또는 원심분리한 후, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 초여과액을 얻는다. (6) 냉동건조: 단계(5)를 통해 얻은 초여과액을 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A마그네슘염을 얻는다. 필요할 경우 단계(6)을 통해 얻은 히드록시 홍화황색소 A마그네슘염 정품을 주사용수에 용해하여 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 통해 여과한 후 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 농축분말 주사제를 얻는다.

상기에서 양이온교환수지로서 001*7 이온교환수지 또는 대공극 HB-8교환수지를, 대공극 흡착수지로서 대공극 흡착수지 HZ801을, 글루칸젤 크로마토그래피로서 세파덱스LH-20을, 초여과에 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막을 이용하여도 좋다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 의약제조에서의 용도를 제공하는 것이다. 그 중에서 전술한 의약은 PAF 또는 ADP유도의 혈소판응집을 억제하는 효능을 가지고 있다. 이는 심근허혈, 뇌졸중, 혈전형성으로 인한 손상질병을 예방, 치료하는데 사용된다. 본 발명의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 임상투여량은 50-200mg/일이다.

본 발명은 홍화 약재를 원재료로 신규 단량체 의약인 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 제조하는 것이다. 그의 순도는 98% 이상, 불순물 개수는 5개 이하이다. 이는 관상동맥질환, 협심증, 뇌졸중 등 각종 혈액순환장애 질병의 치료에서 히드록시 홍화황색소 A보다 더 안전유효하고 더 안정적인 신규 단량체 화합물이다.

본 발명의 연구과정에서 반복적인 시험연구를 통해 홍화 추출액 중의 히드록시 홍화황색소 A는 산의 형태가 아닌 다른 형태로 존재한다는 것을 발견했다. 종래의 기술(예를 들면, CN101168539A, CN1895317A, CN101195647A)은 홍화황색소 추출액에 수산화나트륨 등 pH 조절제를 직접 첨가하여 pH값을 조절했기 때문에 히드록시 홍화황색소 A는 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염으로 전환, 생성할 수 없었다. 따라서 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 단량체 화합물을 얻을 수 없다. 본 발명과정에서, 홍화황색소 추출액을 먼저 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시키면 확실한 히드록시 홍화황색소 A를 얻을 수 있다는 것을 의외로 발견했다. 즉, 산 형태로 서로 다른 알칼리를 통과하면서 pH를 조절하고 전환하여 히드록시 홍화황색소 A 정제염을 얻는다. 이는 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 단량체 화합물이다. 또한, 본 발명은 다음 현상을 발견한다. 홍화황색소 정제품의 산성화작업을 통해 먼저 히드록시 홍화황색소 A를 얻고, 히드록시 홍화황색소 A에 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘 등 염을 첨가하여 본 발명의 고수율, 고순도의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 단량체 화합물을 얻을 수 있다. 히드록시 홍화황색소 A과 비교할 때, 본 발명의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염은 순도가 98% 이상일뿐 아니라 불순물 수가 5개 이하이며 안정성이 더욱 뛰어나다.

I. 약력학 연구시험

약력학 연구시험 1: (홍화황색소 A염의 흰쥐 급성 심근경색에 대한 보호작용)

시험 의약

주사용 홍화황색소(50mg/병)，제공원: 저장융닝약업지분유한공사(浙江永股有限公司), 함량: 50mg/병에 히드록시 홍화황색소 A 42.5mg 함유.

히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 (구체예 1에 따라 제조함)；

히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 (구체예 5에 따라 제조함)

동물: 수컷 SD흰쥐 32마리, 체중 250~350g.

시험그룹 및 투여량 설정:

그룹 동물 수 및 투여량

1.생리식염수그룹 8 1㎖/kg

2. 주사용 홍화황색소그룹 8 40mg/kg

3. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 8 40mg/kg

4. 히드록시 홍화황색소 A칼슘 8 40mg/kg

시험방법

1. 급성 심근경색 흰쥐모델의 준비: 3% 펜토바르비탈나트륨 45mg/kg으로 복강을 마취한다. 넓적다리 동맥, 정맥에 삽관하여 혈압측정 및 약 투여용으로 한다. 기관지에 삽관하여 인공기계로 호흡하며 빈도는 60회/분, 통기량은 약 10㎖/kg이다. 사지 피하에 침전극을 삽입하여 심전도를 기록한다. 흉골 좌연 바깥 측에 0.5cm크기로 피부를 세로로 절개한다. 피하조직을 순서대로 둔적박리(blunt dissection) 하여 큰가슴근, 작은 가슴근, 늑간근을 결찰, 절개한다. 흉골 좌연 네번째 늑간 심첨박동이 가장 강한 부위에서 개흉하여 심포를 절개한다. 지혈감자로 심포를 흉벽양측에 고정하여 심포 해먹을 형성하여 좌심실 표면 혈관을 노출시킨다. 6-0실을 좌심이 밑 2mm의 전방성 강하 심장동맥을 관통한다. 실을 관통한 후 15분 안정을 취한다. 이 기간에 부정맥 또는 동맥 수축압이 70mmHg(9.31KPa)이하인 상황이 5분을 초과할 경우, 해당 흰쥐를 폐기한다. 실을 관통하여 15분 후에 약을 정맥 투여한다. 투여 10분 후, 관상동맥을 결찰한다. 결찰시간 4시간 지속한다.

2. 부정맥 평점: 관상동맥을 결찰한 후 30분 내에 나타난 부정맥 심각 정도에 대하여 평점한다.

3. 심근효소 검사: 시험종료 후 정맥혈 약 2㎖ 채취한다. 온도 4℃에서 4000/분의 원심분리를 5분 진행한다. 상층 액을 채취하여 심근효소검사를 진행한다. 측정항목: LDH, AKP, CK.

4. 심근괴사면적 측정: 관상동맥을 결찰하여 4시간 후 좌심실 전벽을 뚫어 탄소잉크를 주사해 흰쥐를 죽인다. 심장을 꺼내 생리식염수로 깨끗이 씻고 혈관, 지방 등 비 심장조직을 제거한다. 그리고 흡수지로 수분을 흡수하고 무게를 칭량한다. 심첨에서 심장 밑부분까지 심실을 약 2mm 좌우의 박편으로 절개한다. 주입부분(잉크주입부분)과 허혈위험부분(잉크가 없는 부분)을 분리하고, 허혈위험부분의 무게를 달고 0.05%의 NBT용액에 담그고, 37℃ 항온 수욕 상에서 15분 동안 염색한다. NBT는 활조직 내의 기질, 보조효소, 탈산소효소 등을 짙은 남색으로 염색한다. 괴사조직에는 이런 대사기질, 효소가 없기 때문에 착색되지 않는다. 비괴사부분은 NBT에 의해 짙은 남색으로 변하고 괴사구역에는 염색되지 않은 것을 볼 수 있다. 심근 중 염색된 비 괴사 심근을 잘라내어 염색되지 않은 괴사심근의 무게를 칭량하여 괴사심근이 위험구역 심근에서 차지하는 중량백분비(괴사부분 중량/위험부분 중량*100%)를 계산한다.

통계학적 처리:

시험데이터는 평균수치±표준 차로 표시한다. 분산분석법을 통해 통계학 검험을 진행한다. P<0.05는 차이가 뚜렷하다는 것을 표시한다.

1. 흰쥐 급성 심근 허혈 후 부정맥에 대한 영향

흰쥐의 관상동맥을 결찰하여 5분 후부터 부정맥현상이 나타나 30분, 10분 지속하다가 최고조에 오른다. 본 시험결과는, 홍화황색소，히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 정맥에 투여하면 부정맥의 심각성을 완화할 수 있는데 그 중에서 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액, 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 효과가 더욱 탁월하다는 것을 표시한다.

그룹	n	부정맥평점
생리식염수그룹	8	3.25±0.7
주사용 홍화황색소 그룹	8	1.63±0.7*
히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액	8	1.38±0.5*
히드록시 홍화황색소 A 칼슘염	8	1.46±0.3*

<각 실험그룹 부정맥 평점>

*P<0.05 vs 그룹 1

2. 홍화황색소, 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 흰쥐 심근괴사범위에 대한 영향을 비교한다.

그룹별	n	전체 중량(g)	괴사부분(g)	괴사율(%)
생리식염수 그룹	8	0.38±0.06	0.20±0.04	52±7
주사용 홍화황색소 그룹	8	0.35±0.04	0.11±0.03*	31±8*
히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액	8	0.39±0.07	0.10±0.02*	26±9*
히드록시 홍화황색소 A 칼슘염	8	0.38±0.05	0.11±0.04*	29±6*

<심근괴사 범위에 대한 각 실험그룹의 영향>

*P<0.05vs그룹 1

3. 주사용 홍화황색소의 흰쥐 심근괴사 후 혈청 LDH, AKP, CK에 대한 영향:

본 시험결과는, 주사용 홍화황색소, 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A칼슘을 정맥에 투여하면 흰쥐 혈청 LDH, CK의 상승을 억제할 수 있는데 그 중에서 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액, 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 효과가 더 탁월하다는 것을 표시한다.

그룹별	n	LDH(IU/L)	AKP(IU/L)	CK(IU/L)
생리식염수 그룹	8	897±134	159±22	5218±1203
주사용 홍화황색소그룹	8	496±88*	149±27	2543±678*
히드록시 홍화황색소 A칼륨염 농축액	8	451±78*	144±19	2203±530*
히드록시 홍화황색소 A칼슘염	8	463±65*	152±24	2139±594*

<각 실험그룹 혈청 LDH, AKP, CK값>

*p<0.05 vs 그룹 1

시험결론

1. 홍화황색소，히드록시 홍화황색소 A칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 정맥에 투여하면 부정맥의 증상을 완화할 수 있는데, 그 중에서 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액, 히드록시 홍화황색소 A칼슘의 효능이 더욱 탁월하다.

2. 주사용 홍화황색소와 비교할 때 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액, 히드록시 홍화황색소 A칼슘은 흰쥐 심근괴사범위를 줄이는데 더욱 좋은 효능을 보이고 있다.

3. 주사용 홍화황색소와 비교할 때, 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액, 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염은 흰쥐 혈청LDH, CK를 억제하는 효능이 더욱 뚜렷하다.

4. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 효능 차이는 거의 없다.

약력학 연구시험 2:

히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 정맥주사로 투여하면 급성 뇌허혈을 예방할 수 있다.

시험 약물:

주사용 홍화황색소(50mg/병)，공급원: 저장융닝약업지분유한공사, 함량:50mg/병, 히드록시 홍화황색소 A 42.5mg 함유.

히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액(구체예 1의 방법으로 제조);

히드록시 홍화황색소 A 칼슘염(구체예 5의 방법으로 제조함).

시험내용은 다음과 같다.

1. 개의 생체외 심, 뇌혈관에 대한 선택성: Beagle견의 뇌저동맥환과 관상동맥환을 생체외 혈관측량장치에 고정한다. 장력센서를 조절하여 컵에 10^-6mol/L의 페닐에프린(Phenylephrine)을 주입하여 혈관이 적절한 장력을 유지하도록 한다. 그리고 5분마다 컵에 mg당 10mg의 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 또는 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 혈관환 반응이 매우 약하거나 없을 때(일반적으로 약 주입횟수는 4~5회)까지 주입한다. 혈관 이완수축 변화치를 계산한다. 실험결과, 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액의 심장혈관환에 대한 이완수축작용은 31.6%，뇌혈관환에 대한 이완수축작용은 73.1%로 나타났다. 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 심장혈관에 대한 이완수축작용은 37.1%，뇌혈관환에 대한 이완수축작용은 69.7%로 나타났다. 이는 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염은 뇌혈관에 대하여 매우 탁월한 선택성과 이완수축작용을 가지고 있으며 두 가지 의약 사이에 뚜렷한 차이가 없다는 것을 표시한다.

2. 급성뇌허혈에 대한 영향: 실험용SD흰쥐에 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 또는 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 정맥 투여한 후 일반적인 중대뇌동맥폐색(MCAO)법으로 급성 뇌허혈모델을 제조한다. 24시간 사육한 후, 흰쥐에 대하여 신경학평점을 진행한다. 그리고 흰쥐의 머리를 잘라내어 대뇌를 채취한다. 모형에 넣어서 7개로 절편하여 TTC염색한다. 활조직은 적색으로 염색되고 괴사조직은 착색되지 않는다. 도형분석소프트웨어를 이용해 대뇌반구에서 괴사조직이 차지하는 비례를 계산한다. 시험결과, 뇌괴사 면적에서 용제 대조그룹은 38%，니모디핀(Nimodipine) 양성 대조그룹은 15.7%， 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 저, 중, 고 3개 투여량 그룹은 각각 38.2%, 27.6%, 21.9%，주사용 히드록시 홍화황색소A 칼슘염 저, 중, 고 3개 투여량 그룹은 각각 41.3%, 25.7%, 21.6%로 나타났다. 용제 대조그룹과 비교할 때, 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염은 중,고 투여량에서 급성 뇌허혈으로 인한 뇌조직괴사를 현저하게 경감할 수 있다. 상기 2종 의약은 서로 뚜렷한 차이가 없다.

3. 흰쥐 뇌혈관 투과성(permeability)에 대한 영향:

흰쥐에 1일 1회씩 연속 7일간 의약을 정맥 투여한다. 마지막 투여한 후 흰쥐를 마취하여 에반스 블루(Evans Blue) 50mg/kg을 정맥 주사한다. 5분 후, 양측 총경동맥을 결찰하고, 3시간 후에 단두한다. 대뇌를 채취하여 중량을 달은 후 포름아미드 용액에 담근다. 72시간 동안 45℃ 항온조에 보관한다. 이때 뇌혈관 중의 에반스 블루가 포름아미드 용액으로 침출한다. 분광기로 포름아미드 용액 중의 에반스 블루의 침출량을 검측한다. 침출량은 뇌혈관의 투과성을 표시한다. 시험결과, 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 중, 고 투여량 그룹은 에반스 블루가 뇌혈관에서 침출되는 양을 감소하는데 매우 탁월한 작용을 하고 있다. 이는 해당 의약이 혈관 투과성을 낮추는데 좋은 효능이 있다는 것을 설명한다. 2종 의약 사이 뚜렷한 효능차이가 없다.

4. 개의 뇌혈류량에 대한 영향:

실험용으로 Beagle견을 선택했다. 개를 펜토바비탈 나트륨으로 마취한 후, 한 측의 외부 경정맥, 내부 경정맥과 추골동맥을 수술하여 분리한다. 경외정맥을 결찰하고, 유량센서를 경내정맥과 추골동맥에 설치한다. 두 센서가 기록한 혈류량을 더한 후 2를 곱한 결과가 전체 뇌의 혈액공급량을 대표한다. 실험종료 후 뇌를 꺼내고, 무게를 측정한 후 100그램당 뇌조직의 혈류량을 산출한다. 실험결과, 중, 고 조제량의 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염을 정맥으로 투여한 후 혈류량이 뚜렷이 증가한다. 그러나 혈류량 증가유지시간이 비교적 짧다(약 15분). 이 시험이 제시하는 것은, 향후 급성 뇌허혈을 치료하는 임상응용에서 정맥 링거의 방법으로 의약을 투여해야 한다는 것이다. 상기 두가지 의약 사이에 현저한 차별이 없다.

5. 급성 뇌 산소부족에 대한 영향:

실험용으로 Kunming mice와 SD 흰쥐를 채택한다. 동물을 저산소환경에 넣은 후 생존시간을 기록하고 의약을 투여한다. 급성 산소부족에 대한 내성이 향상되었는지 확인한다. 실험결과, 밀폐된 용기에서 용제대조그룹의 생존시간은 32분인데 비해 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액의 저, 중, 고 3가지 투여량 그룹의 생존시간은 각 36, 37, 36분으로 나타났다. 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 저, 중, 고 3가지 투여량 그룹의 작은 쥐 생존시간은 각 35, 38, 37분으로 나타났다. 통계학적으로 용제 대조그룹과 비교할 때 비교적 현저한 차이(P<0.05~0.01)가 있음을 발견할 수 있다. 흰쥐실험은 97%의 질소와 3% 산소를 함유한 환경에서 진행했다. 용기에 넣는 시점을 기준으로 각 그룹 흰쥐의 생존시간을 기록한 결과, 용제 대조그룹은 평균 3분43초인데 비해 양성 대조그룹(니모디핀)은 5분38초로 매우 현저한 차별을 나타냈다. 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액의 저, 중, 고 3가지 투여량 그룹의 생존시간은 각 3분20초, 4분30초와 4분9초이다. 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 저, 중, 고 투여량 그룹의 생존시간은 각 3분31초, 4분35초와 4분21초이다. 용제 대조그룹과 비교할 때 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 고투여량 그룹의 생존시간은 현저히 길다. 2종 의약 사이 현저한 차별이 없다.

6. 혈소판응집억제:

실험은 기기검사와 생체실험 두 부분으로 구성한다.

1) 기기검사방법:

집토끼에 1일1회, 연속 5일 동안 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액을 정맥 주사한다. 마지막 투여 후 2시간 내에 심장에서 4㎖ 혈액을 채취한다. 혈액에서 저속 원심분리방법으로 혈소판이 풍부한 혈청을 얻고 고속원심분리방법으로 혈소판이 적은 혈청을 얻었다. 혈소판 응집유도제로 아데노신2인산(adenosine diphosphate; ADP)과 혈소판 응집활성화인자(Platelet-Activating Factor PAF)를 이용하여 혈소판응집기로 측정한다. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축주사액 ADP 및 PAF유도로 인한 혈소판응집을 억제하는 실험에서 매우 탁월한 혈소판응집 억제작용을 나타냈다. 3가지 투여량 사이에 양호한 양적-효능관계가 존재한다.

2) 생체방법:

라텍스 관으로 흰쥐의 동맥과 정맥 사이에 단락을 형성한다. 라텍스관 내에 수술용 실을 고정하고 단락을 개방한다. 혈액이 고무관을 통해 동맥과 정맥 사이를 15분 동안 흐르게 한 후 실을 꺼내어 무게를 칭량한다. 건조시 실의 무게를 빼면 실에 붙어 있는 혈소판의 중량을 얻을 수 있다. 실험결과, 그룹별 혈소판 중량에서 용제대조그룹은 14.8±1.57mg, 양성대조그룹은 8.62±2.79mg, 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 저, 중, 고투여량 그룹은 각각 13.6±1.89mg，9.90±1.53mg과 8.91±1.34mg, 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 저, 중, 고 투여량 그룹은 각 13.9±1.54mg，10.26±1.15mg과 8.73±1.79mg으로 나타났다. 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 및 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 중, 고 투여량 그룹과 용제 대조그룹을 비교할 때 뚜렷한 차이가 있다. 이는 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 또는 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 흰쥐 혈소판응집에 대한 억제작용이 매우 탁월하다는 것을 설명한다. 두가지 의약 사이에 현저한 차별이 없다.

7. 혈액 점조도에 대한 영향:

집토끼에 1일1회, 연속 5일 동안 의약을 정맥 투여한다. 마지막 투여 2시간 만에 응고 방지한 후 직접 혈액유동계(rheometer)로 측정한다. 실험결과, 용제 대조그룹과 비교해 볼 때, 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 및 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 그룹은 투여량의 증가에 따라 혈액점조도의 저전단, 중전단, 고전단 지표가 떨어진다. 떨어지는 폭은 투여량 증가에 따라 증가한다. 상기 두가지 의약의 고투여량 그룹의 효과는 양성대조 니모디핀 그룹보다 탁월하게 나타났다. 이는 주사용 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액과 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 혈액 점조도를 낮추는데 현저하게 작용한다는 것을 설명한다. 두가지 의약 사이에 현저한 차별은 없다.

II . 안정성 시험과 물리화학 데이터

1. 히드록시 홍화황색소 A염과 히드록시 홍화황색소 A의 안정성을 관찰한다.

시험 약물

검체 1: 히드록시 홍화황색소 A: CN102675379A의 방법에 의해 제조

(순도 89.9%)

검체 2: 히드록시 홍화황색소 A: 본 발명의 산성화를 통해 제조

(순도 99.2%)

검체 3: 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염: 구체예 3에 따라 제조

(순도 99.3%)

검체 4: 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액: 구체에 1에 따라 제조

(순도 98.5%)

검체 5: 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염: 구체예 5에 따라 제조(순도 98.8%)

검체 6: 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염: 구체예 8에 따라 제조

(순도 99.0%)

검체 7: 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염: 구체예 10에 따라 제조

(순도 99.0%)

검체 8: 히드록시 홍화황색소 A 메테나민염: 구체예 1에 따라 제조

(순도 99.0%)

	항목	가속 0개월	가속 1개월	가속 2개월	가속 3개월
검체 1	총불순물	10.1%	13.9%	19.8%	28.6%
검체 1	함량	89.8%	84.0%	81.4%	70.1%
검체 2	총불순물	0.8%	5.9%	10.7%	18.6%
검체 2	함량	99.1%	94.1%	89.2%	81.3%
검체 3	총불순물	0.7%	1.1%	1.8%	2.7%
검체 3	함량	96.8%	96.2%	95.5%	94.6%
검체 4	총불순물	1.5%	1.8%	2.2%	2.8%
검체 4	함량	92.5%	92.2%	91.8%	91.3%
검체 5	총불순물	1.2%	1.4%	1.9%	2.6%
검체 5	함량	96.2%	95.6%	95.1%	94.5%
검체 6	총불순물	1.0%	1.3%	1.8%	2.4%
검체 6	함량	97.4%	97.0%	96.4%	95.8%
검체 7	총불순물	1.0%	1.6%	2.4%	3.2%
검체 7	함량	84.9%	84.4%	83.7%	82.8%
검체 8	총불순물	1.0%	1.5%	2.3%	3.1%
검체 8	함량	88.3%	87.8%	87.2%	86.3%

주: 함량은 히드록시 홍화황색소 A로 계산한다.

시험결과. 본 발명의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 단량체 화합물과 히드록시 홍화황색소 A의 안정성 비교시험에서 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 안정성이 더 탁월한 것으로 나타났다.

2. 히드록시 홍화생색소 A염과 수산기 홍화황색소 A의 물리화학데이터 비교

수산기 홍화황색소 A 의약용 정제염 물리화학데이터 결과

시료	pH	용해도
수산기 홍화황색소 A	1.9	약간 용해
수산기 홍화황색소 A암모늄	4.5	잘 용해된다
수산기 홍화황색소 A칼륨농축액	5.8	잘 용해된다
수산기 홍화황색소 A칼슘	5.5	잘 용해된다
수산기 홍화황색소 A마그네슘	5.2	잘 용해된다
수산기 홍화황색소 A트리에틸아민	4.5	잘 용해된다
수산기 홍화황색소 A메테나민	4.7	잘 용해된다

시험결과. 본 발명의 수산기 홍화황색소 A 의약용 정제염 단량체화합물과 수산기 홍화황색소 A의 물리화학데이터를 비교할 때 수산기 홍화황색소 A 의약용 정제염의 내성이 더 좋은 것으로 나타났다.

[실시예]

실시예 1: 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액(본 발명 식(II) 화합물)

일정 무게의 홍화를 칭량하고, 이 홍화 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20~25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 수산화칼륨을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 112이고, 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 15, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동 건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축분말을 얻었다. 순도는 98.5%이고, 수율은 홍화를 기준으로 0.55% 정도이다.

히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액의 적외선스펙트럼(IR), 질량분석(MS), 핵자기공명¹H-NMR, ¹³C-NMR의 데이터는 다음과 같다.

1. 적외선흡수 스펙트럼

기기: Bruker VECTOR-22형 적외선흡수 스펙트럼

흡수피크cm^-1	진동유형	라디칼	강도
3361	υ_- _OH	-OH	brs
1650	υ_C=O	-C=O	s
1624	υ_C=C	-C=C-	s
1604 1515	υ_C=C	C₆H₆	s
1440	δ_- _CH2	-CH₂	m
1171 1077 1005	υ_C-O	-C-OH	s

<IR(브롬화물 칼륨농축액 압편)>

2. 질량분석

기기: 미국 FINNIGAN사 다단계 이온트랩 질량분석기(LCQ-DECAXP)

테스트조건: ESI

질량분석(MS)

+c ESI 651.06 (M)⁺

-c ESI 611.24(M-K)^-

3. 핵자기공명 수소스펙트럼과 탄소스펙트럼

기기: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500형 초전도체 자기공명기

테스트 조건: 용제: DMSO，내부표준: TMS

양성자번호(H귀속)	화학 쉬프트δ(ppm)	양성자수량
8	7.27	1
9	7.39	1
11，15	7.41	2
12，14	6.75	2
3-OH	18.65	1
4-OH	4.71	1
5-OH	소실	대체됨
13-OH	9.75	1
당부분
G1	3.61	1
G2	2.84	1
G3	3.06	1
G4	3.27	1
G5	3.01	1
G6	3.36~3.25	2
G'1	4.14	1
G'2	4.03	1
G'3	3.08	1
G'4	3.04	1
G'5	2.92	1
G'6	3.58	2
당부분 히드록시	4.41~4.79	8

<히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액의 ¹H一NMR 데이터>

탄소번호	화학 쉬프트ppm)
1	189.6
2	106.7
3	195.9
4	86.1
5	183.2
6	99.7
7	179.3
8	123.9
9	135.9
10	127.9
11(15)	129.7
12(14)	116.0
13	158.8
G1	85.9
G2	70.4
G3	78.8
G4	70.3
G5	81.2
G6	61.7
G'1	74.4
G'2	69.2
G'3	79.7
G'4	71.6
G'5	80.8
G'6	62.2

<히드록시 홍화황색소 A염화칼륨의 ¹³C一NMR 데이터>

상기에서 얻어진 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 정품을 주사용수에 용해한다. 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 여과한 후 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축분말을 얻었다.

실시예 2: 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액(본 발명의 식(II) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20~25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배의 탈이온수를 붓고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 HB-8 대공 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 수산화칼륨을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 112이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 15, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 칼륨염 농축분말을 얻었다. 순도는 98.6%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.50% 정도이다.

실시예 3: 식III의 히드록시 홍화황색소 A암모늄(본 발명 식(III) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20~25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 암모니아수를 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 112이고, 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 15, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축분말을 얻었다. 순도는 99.3%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.45% 정도이다.

히드록시 홍화황색소 A 암모늄염의 적외선스펙트럼(IR), 질량분석(MS), 핵자기공명¹H-NMR, ¹³C-NMR의 데이터는 다음과 같다.

1. 적외선흡수 스펙트럼 기기

기기형: Bruker VECTOR-22형 적외선흡수 스펙트럼 기기

흡수피크cm^-1	진동유형	라디칼	강도
3361	┲_- _OH	-OH	br s
1651	┲_C=O	-C=O	s
1624	┲_C=C	-C=C-	s
1604 1515	┲_C=C	C₆H₆	s
1441	┙_- _CH2	-CH₂	m
1171 1077 1005	┲_C-O	-C-OH	s

<IR(브롬화물 칼륨농축액 압편)>

2. 질량분석

기기형: 미국FINNIGAN사 다단계 이온트랩질량분석기(LCQ-DECAXP)

테스트조건: ESI

질량분석(MS)

+c ESI 613.17 (M)⁺

-c ESI 611.22(M-H)^-

3. 핵자기공명 수소스펙트럼과 탄소스펙트럼

기기형: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500형 초전도체 자기공명기기

테스트조건: 용제: DMSO，내부표준: TMS

양성자번호(H귀속)	화학 쉬프트δ(ppm)	양성자수량
8	7.26	1
9	7.39	1
11，15	7.40	2
12，14	6.76	2
3-OH	18.65	1
4-OH	4.76	1
5-ONH4	6.99-7.23	4
13-OH	9.74	1
당부분
G1	3.61	1
G2	2.81	1
G3	3.06	1
G4	3.27	1
G5	3.00	1
G6	3.35-3.24	2
G'1	4.15	1
G'2	4.04	1
G'3	3.06	1
G'4	3.04	1
G'5	2.91	1
G'6	3.60	2
당부분 히드록시	4.41~4.77	8

<히드록시 홍화황색소 A 암모늄염의 ¹H一NMR 데이터>

탄소 번호	화학 쉬프트(ppm)
1	189.3
2	107.0
3	196.0
4	86.1
5	183.7
6	189.2
7	179.0
8	123.8
9	135.9
10	127.9
11(15)	129.7
12(14)	116.0
13	158.8
G1	85.8
G2	70.5
G3	78.9
G4	70.4
G5	81.2
G6	61.9
G'1	74.4
G'2	69.2
G'3	79.7
G'4	71.7
G'5	80.9
G'6	62.3

<히드록시 홍화황색소 A 암모늄염의 ¹³C一NMR 데이터>

실시예 4: 히드록시 홍화황색소 A암모늄(본 발명 식(III) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20~25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 HB-8 대공 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 암모니아수를 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 112이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 15, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 암모늄염 농축분말을 얻었다. 순도는 99.4%이고, 수율은 홍화를 기준으로 0.50% 정도이다.

실시예 5: 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염(식(IV) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가하였다. 100℃에서 20~25분 동안 추출하여 여과하였다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 부어 상기 조건에서 1회 추출하여 여과하고, 추출액을 실온까지 냉각하였다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 1/2몰 중량비의 Ca(OH)₂를 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 112이고, 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 15, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동 건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축분말을 얻었다. 순도는 98.8%이고 수율은 홍화를 기준으로 약 0.50%이다.

히드록시 홍화황색소 A 칼슘염의 질량분석(MS), 핵자기공명¹H-NMR, ¹³C-NMR 데이터는 다음과 같다.

1. 질량분석

기기형: 미국 FINNIGAN사 다단계 이온트랩 질량분석기(LCQ-DECAXP)

테스트조건: ESI

질량분석(MS)

+c ESI 1263.08 (M)⁺

-c ESI 611.29 (M)^-

2. 핵자기공명 수소스펙트럼과 탄소스펙트럼

기기형: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500형 초전도체 핵자기공명기기

테스트조건: 용제: DMSO，내부표준: TMS

결과 도 1, 2 참조.

히드록시 홍화황색소 A칼슘의 ¹H一NMR 데이터 귀속(구조가 대칭되고 번호가 일치하기 때문에)

화학 쉬프트δ(ppm) 3.01~4.15은 당부분 수소 G1~G6과 G'1~G'6에 해당한다. 4.29~4.88은 당부분 히드록시수소에 해당한다. 7.33(1H), 7.38(1H)는 8과 9에 해당한다. 6.77~7.47(4H)는 11~15에 해당한다. 18.74(1H)는 3-OH에 해당한다. 4.72(1H)는 4-OH에 해당한다. 9.82(1H)는 13-OH에 해당한다.

히드록시 홍화황색소 A칼슘의 ¹³C一NMR 데이터 귀속

화학 쉬프트δ(ppm): 60.32(1C), 61.83(1C)(제2급 탄소)는 당부분 탄소 G6, G'6에 해당한다. 68.92, 69.28, 69.38, 71.04, 73.71, 78.33, 79.36, 79.81, 80.95, 85.67(10C)(제3급 탄소)는 당부분 탄소 G1~G5와 G'1~G'5에 해당한다. 115.71(2C)(제3급 탄소)는 12와 14에 해당한다. 129.58(2C)(제3급 탄소)는 11과 15에 해당한다. 122.81(1C)136.56(1C)(제3급 탄소)는 8과 9에 해당한다.

화학 쉬프트δ(ppm): 189.21, 105.74, 85.59, 183.92, 99.72(5C)는 1~2, 4~6에 해당한다.

179.88(1C), 127.17(1C), 158.66(1C)는 각각 7, 10, 13에 해당한다.

상기에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 정품을 주사용수에 용해한다. 이를 0.22㎛의 미세다공 여과막 혹은 분획분자량 8000-10000달톤의 초여과막으로 여과한 후, 병에 포장한다. 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 분말주사제를 얻었다.

실시예 6: 히드록시 홍화황색소 A칼슘(식(IV) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 HB-8 대공 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 1/2 몰중량의 Ca(OH)₂를 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼에 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고, 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후, 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg으로부터 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동 건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 농축분말을 얻었다. 순도는 98.6%이고, 수율은 홍화를 기준으로 0.50% 정도이다.

실시예 7: 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염(본 발명 식(IV) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 대공극 흡착수지 분리칼럼에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 홍화황색소 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg으로부터 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 농축분말을 얻었다. 순도는 90%이다. 홍화황색소 분말을 용해한 후, HCl로 산성화한다. 냉소에 2~24시간 보관하면 히드록시 홍화황색소 A 고체가 석출된다. 고체를 여과한 후 용해한다. 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 1/2 몰중량의 수산화칼슘을 첨가한다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 칼슘염 정품을 얻었다. 순도는 99.2%，수율은 홍화를 기준으로 0.7% 정도이다.

실시예 8: 식(III)의 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염(본 발명 식(V) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 1/2 몰중량의 수산화마그네슘을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻었다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염농축분말을 얻었다. 순도는 99.0%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.5% 정도이다.

히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염의 질량분석(MS), 핵자기공명¹H-NMR, ¹³C-NMR 데이터는 다음과 같다.

1. 질량분석

테스트조건: ESI

질량분석(MS)

+c ESI 1247.01 (M)⁺

-c ESI 611.35(M-H)^-

2. 핵자기공명 수소스펙트럼과 탄소스펙트럼

기기형: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500형 초전도체 핵자기공명기기

테스트조건: 용제: DMSO，내부표준: TMS

결과는 도 3, 4 참조.

히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염의 ¹H一NMR과¹³C一NMR，케이스(에소메프라졸나트륨[esomeprazole sodium]와 에소메프라졸마그네슘)와 유사하다. 마그네슘의 존재는 시료의 테스트에 영향을 주기 때문에 일부 탄소스펙트럼과 수소스펙트럼밖에 얻지 못한다. 제조공법 및 주요 구조가 수산화 홍화황색소A칼슘과 일치하기 때문에 참고할 수 있다.

히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염의 ¹H一NMR 데이터 귀속(구조가 대칭되고 번호가 일치하기 때문에)

화학 쉬프트δ(ppm): 2.85~4.11은 당부분 수소 G1~G6과 G'1~G'6에 해당한다. 4.38~4.81는 당부분 히드록시 수소에 해당한다. 7.30(1H), 7.38(1H)는 8과 9에 해당한다. 6.74~7.41(4H)는 11~15에 해당한다. 18.68(1H)는 3-OH에 해당한다. 4.72(1H)는 4-OH에 해당한다. 9.80(1H)는 13-OH에 해당한다.

히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염의 ¹³C一NMR 데이터 귀속

화학 쉬프트δ(ppm): 61.26(1C), 62.26(1C)(제2급 탄소)는 당부분 탄소 G6, G'6에 해당한다. 69.24, 70.03, 71.51, 74.13, 79.70, 80.54, 81.33, 85.91(8C)(제3급 탄소)는 당부분 탄소 G1~G5과 G'1~G'5부분에 해당한다. 116.09(2C)(제3급 탄소)는 12와 14에 해당한다. 129.90(2C)(제3급 탄소)는 11과 15에 해당한다. 122.81(1C)136.56(1C)(제3급 탄소)는 8과 9에 해당한다.

화학 쉬프트δ(ppm): 195.38(1C)는 3에 해당한다. 179.83(1C), 127.62(1C), 159.01(1C)는 각각 7, 10, 13에 해당한다.

실시예 9: 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염(본 발명 식(V) 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 홍화황색소 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 홍화황색소 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％이다. 순수를 세탈제로 하여 5㎖/분의 유속으로 세탈한다. 홍화황색소를 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 홍화황색소 농축액을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻을 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색의 홍화황색소 분말을 얻었다. 순도는 90%이다. 홍화황색소 분말을 용해한 후 HCl로 산성화한다. 냉소에 2~24시간 보관하면 히드록시 홍화황색소 A 고체가 석출된다. 고체를 여과한 후, 용해한다. 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 1/2 몰중량의 수산화마그네슘을 첨가한다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 마그네슘염 정품을 얻었다. 순도는 99.2%，수율은 홍화를 기준으로 0.7% 정도이다.

실시예 10: 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염(식 I에서，n은 1，R1은 수소, R2, R3, R4는 에틸기인 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 트리에틸아민을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 트릴에틸아민염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻을 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A트리에틸아민염 농축분말을 얻었다. 순도는 99.0%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.45% 정도이다.

실시예 11: 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염(식 I에서，n은 1，R1은 수소，R2, R3, R4은 에틸기인 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 HB-8 대공 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 트리에틸아민을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻을 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 트리에틸아민염 농축분말을 얻었다. 순도는 99.0%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.47% 정도이다.

실시예 12: 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염(식 I에서，n은 1，R1, R2, R3, R4는 메틸기인 화합물)

칭량한 홍화의 중량에 대해 12.5배의 탈이온수를 가한다. 100℃에서 20-25분 동안 추출하여 여과한다. 찌꺼기에 10배량의 탈이온수를 가하고, 상기 조건에서 1회 추출하여 여과한다. 추출액을 실온까지 냉각한다. 원심분리기로 원심분리하여 상등액을 수집한다. 상기 상등액을 평형상태의 001*7 강산성 H형 양이온 교환수지에 천천히 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:10, 칼럼 체적은 500㎖，유속은 3㎖/분이다. 유출액을 수집하고 히드록시 홍화황색소 A를 기준으로 등몰량의 메테나민 수산화암모늄을 첨가한다. 그리고 천천히 대공극 흡착수지 분리칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:12이고, 주입유속은 10㎖/분이다. 주입완료 후 상온의 탈이온수로 세탈한다. 유속은 20㎖/분이다. 세탈액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염 농축액 조품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg에 농축액 100㎖를 얻었다. 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염 농축액 조품을 세파덱스 LH-20 칼럼으로 주입한다. 칼럼의 직경 대 높이의 비는 1:5, 주입량은 칼럼 체적의 10％，세탈유속은 5㎖/분이다. 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염 농축액을 함유한 부분을 수집한다. 수집액을 60℃에서 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염 농축액 정품을 얻었다. 홍화를 기준으로 홍화 1kg당 35~50㎖의 농축액을 얻을 수 있다. 이를 냉동건조하여 담황색의 히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염 농축분말을 얻었다. 순도는 99.0%이고 수율은 홍화를 기준으로 0.45% 정도이다.

히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염의 질량분석(MS), 핵자기공명¹H-NMR, 데이터는 다음과 같다.

1. 질량분석

테스트조건: ESI

질량분석(MS)

-c ESI 611.22(M-H)^-

2. 핵자기공명 수소스펙트럼과 탄소스펙트럼

기기형: BRUCKER AVANCE Ⅲ 500형 초전도체 핵자기공명기기

테스트조건: 용제: DMSO，내부표준: TMS

양성자번호(H귀속)	화학 쉬프트δ(ppm)	양성자수량
8	7.25	1
9	7.39	1
11，15	7.41	2
12，14	6.76	2
3-OH	18.66	1
4-OH	4.73	1
5-ON(CH₃₎ ₄	6.90-7.33	12
13-OH	9.74	1
당부분
G1	3.60	1
G2	2.82	1
G3	3.06	1
G4	3.27	1
G5	3.01	1
G6	3.36-3.22	2
G'1	4.15	1
G'2	4.03	1
G'3	3.07	1
G'4	3.04	1
G'5	2.91	1
G'6	3.59	2
당부분 히드록시	4.40~4.78	8

<히드록시 홍화황색소 A 메테나민 암모늄염의 ¹H一NMR 데이터>

Claims

식(I)의 신규 히드록시 홍화황색소 A(hydroxysafflor yellow A) 의약용 정제염，

식(I)
[식중，n은 1 또는 2를 나타내고，M은 Ca, Mg, K, NH₄및

(식중, R1, R2, R3, R4는 서로 같거나 다르며, 각각 수소 또는 알킬기를 나타낸다. 다만, R1, R2, R3 및 R4의 모두가 수소원자인 경우는 제외한다.)으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 의미한다.]
하기 식(II)의 염화칼륨, 식(III)의 염화암모늄，식(IV)의 염화칼슘 또는 식(V)의 염화마그네슘으로부터 제조된 제1항 기재의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염.

식(II)

식(III)

식(IV)

식(V)
하기 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항 기재의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 제조방법.
(1) 홍화를 수용액으로 추출하여 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 추출액을 얻는 단계;
(2) 단계(1)에서 얻은 추출액을 강산성 H형 양이온 교환수지 칼럼을 통과시켜 세탈액(spent regenerant)을 수집하고, 얻어진 세탈액에 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄, 알킬아민 또는 알킬암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 및 탄산칼슘으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 생성하고, 이를 함유하는 세탈액을 수집하는 단계;
(3) 단계(2)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 의약용 정제염의 세탈액을 대공극 흡착수지 칼럼을 이용해 분리하고, 이어서 물을 세탈제로 하여 세탈액을 수집한 후, 감압, 농축하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 조품을 얻는 단계;
(4) 단계(3)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 조품을 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리하고, 물을 세탈제로 하여 히드록시 홍화황색소 A를 함유한 의약용 정제염 세탈액을 수집하는 단계;
(5) 단계(4)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A함유 의약용 정제염 세탈액을 농축한 후 여과 또는 원심분리한 후, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과하여 초여과액을 얻고, 이를 건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 얻는 단계.
제3항에 있어서, 전기 단계(2)의 강산성 H형 양이온 교환수지가 001*7 이온교환수지 또는 대공극 HB-8 교환수지인 제조방법.
하기 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 제1항 또는 제2항 기재의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염의 제조방법.
(1) 홍화를 수용액으로 추출하여 홍화황색소를 함유한 추출액을 얻는 단계;
(2) 단계(1)에서 얻은 홍화황색소를 함유한 추출액을 대공극 흡착수지 칼럼을 이용하여 분리한 후, 물을 세탈제로 하여 세탈액을 수집하고, 감압, 농축하여 홍화황색소의 조품을 얻는 단계;
(3) 단계(2)에서 얻은 홍화황색소 조품을 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리하고, 물을 세탈제로 하여 홍화황색소를 함유한 세탈액을 수집하는 단계;
(4) 단계(3)에서 얻은 홍화황색소를 함유한 세탈액을 농축한 후 여과 또는 원심분리하고, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과하여 초여과액을 얻고, 이를 건조하여 홍화황색소 분말을 얻는 단계;
(5) 단계(4)에서 얻은 홍화황색소 분말에 물을 가하여 산성화한 후, 냉소에서 2~24시간 보관하여 담황색 고체 히드록시 홍화황색소 A를 석출시키고, 상층의 액체를 여과하는 단계;
(6) 단계(5)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A에 물을 가한 후, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 알킬아민 또는 알킬암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘을 가하여, 히드록시 홍화황색소 A가 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 생성한 후, 다시 초여과막법으로 초여과하고, 냉동건조하여 목적물인 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 얻는 단계.
제1항 또는 제2항 기재의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 유효성분으로 하는 심근허혈, 뇌허혈, 혈전의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제6항에 있어서, 의약조성물이 냉동건조분말 주사제 또는 수액제인 조성물.
다음 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 심근허혈, 뇌허혈, 혈전의 예방 또는 치료용 냉동건조 분말 주사제의 제조방법.
(1) 홍화 중량에 대해 10~30배의 50~100℃의 물을 가하여 0.5~24시간씩 2~3회 추출하고, 얻어진 잔사를 여과하고 추출액을 5~30℃까지 냉각한 다음 2~24시간 보관하는 단계;
(2) 단계(1)에서 얻은 추출액을 1~30㎖/분의 유속으로 강산성 H형 양이온 교환수지를 통과시키고, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 알킬아민 또는 알킬암모늄, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 탄산마그네슘 또는 탄산칼슘을 첨가하여 히드록시 홍화황색소 A에서 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 생성하고, 청구항 1 또는 2 기재의 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 포함한 세탈액을 수집하는 단계;
(3) 단계(2)에서 얻어진 세탈액을 대공극 흡착수지 칼럼으로 분리하고, 순수를 세탈액으로 하여 10~30㎖/분의 유속으로 세탈하고, 세탈액을 수집하여 감압, 농축과정을 통해 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 농축액 조품을 얻는 단계;
(4) 단계(3)에서 얻어진 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 농축액 조품을 여과 또는 원심분리한 후, 글루칸젤 칼럼 크로마토그래피로 분리하고, 순수를 세탈제로 하여 1~10cm/h의 선형 유속으로 세탈하고, 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염을 포함한 세탈액을 수집하고, 이를 감압, 농축하여 농축액을 얻는 단계;
(5) 단계(4)에서 얻어진 농축액을 여과 또는 원심분리한 후, 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 초여과하여 초여과액을 얻는 단계;
(6) 단계(5)에서 얻어진 초여과액을 냉동 건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 정품을 얻는 단계; 및
(7) 단계(6)에서 얻은 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 정품을 주사용수에 용해하고, 0.22㎛의 미세다공 여과막 또는 분획분자량 8000~10000달톤의 초여과막으로 여과한 후 병에 포장한 후, 이를 냉동건조하여 히드록시 홍화황색소 A의 의약용 정제염 냉동분말 주사제를 얻는 단계.
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