KR101778813B1 - 다수의 ｃｃ 케모카인에 결합하는 항카인 항체 - Google Patents

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Abstract

항카인 항체는 2종, 3종, 4종, 5종 이상의 CC 케모카인, 예컨대 RANTES/CCL5, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 또는 MCP-1/CCL2에 결합한다. 순차적 면역화에 의해 항카인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주의 생성뿐만 아니라 항카인 항체의 인간화 및 친화성 성숙 방법도 또한 개시된다.

Description

다수의 ＣＣ 케모카인에 결합하는 항카인 항체{ANTIKINE ANTIBODIES THAT BIND TO MULTIPLE CC CHEMOKINES}
관련 출원(들)과의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2009년 8월 28일에 출원된 미국 가출원 제61/238,015호를 우선권으로 주장하며, 상기 미국 가출원은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 항카인 항체, 또는 2종, 3종, 4종, 5종 이상의 CC 케모카인(CC 케모카인은 β-케모카인으로도 공지됨)에 결합하는 항체, 특히 RANTES/CCL5, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, 및 MCP-1/CCL2로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 케모카인에 결합하는 항체를 포함한다. 단지 단일 CC 케모카인에 결합하는 항체와는 달리, 항카인 항체는 하나 초과의 CC 케모카인에 동시에 결합하고/하거나, 상기 케모카인을 탐지하고/하거나 중화시킴으로써 CC 케모카인 중에서의 기능적 중복의 문제에 실제로 대처한다. 본 발명의 다른 측면은 CC 케모카인에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 질환의 치료를 포함하는 항카인 항체의 진단 및 치료 용도; 항카인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 및 순차적 면역화에 의한 하이브리도마의 생성 방법; 항카인 항체를 인간화하는 방법; 및 친화성 성숙에 의해 항카인 항체를 개선시키는 방법을 포함한다.
케모카인은 염증의 주요 매개자이며 자가면역 질환의 발병에 연루되어 있다(문헌[Viola & Luster, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48: 171-197 (2008)]). 케모카인은 염증 또는 감염 부위에서 생성되며, 백혈구가 순환계로부터 조직 내로 이동하는 것을 유도한다. 케모카인에 의해 매개되는 염증 또는 면역학적 과정을 조정하는 간단하고 효과적인 방법이 오랫동안 탐색되었다. 이러한 노력은 다수의 상이한 케모카인의 기능 및 이의 수용체에 있어서의 중복성 및 중첩성에 의해 복잡해진다. 예를 들어, 케모카인 억제제는 전임상 동물 모델에서 자가면역 질병을 치료하기 위하여 사용되었지만, 그런데도 클리닉에서 자가면역 징후의 치료에 성공하였다. 이러한 효능 결여는 케모카인의 기능의 중복성으로 인한 것일 수 있음이 제안되었다. 50종 초과의 케모카인이 확인되었으며, 각각은 상이한 구조적 및 기능적 특성을 갖는다. 일부 케모카인의 특이성은 중첩되며, 즉, 상기 케모카인은 동일한 유형의 수용체에 결합하거나 유사한 유형의 세포에 작용한다(문헌[Vergunst, et al., Arthritis Rheum. 58: 1931-1939 (2008)]). 특정 케모카인은 하나 초과의 유형의 케모카인 수용체에 결합할 수 있으며, 주어진 케모카인 수용체에는 하나 초과의 유형의 케모카인이 결합할 수 있다. 따라서, 수용체에 결합하여 수용체에의 케모카인 결합을 차단할 수 있거나, 또는 다르게는 하나 초과의 케모카인의 활성을 중화시킬 수 있는 단일 물질의 개발이 고도로 바람직하다.
화학주성 사이토카인에서 이름을 따온 케모카인은 면역 세포의 조직 내로의 이주를 조절하는 작은 분비형 폴리펩티드이다(문헌[Baggiolini, et al., Adv.Immunol. 55:97-179 (1994)]; 문헌[Oppenheim et al., Ann. Rev. Immunol. 9:617-648 (1991)]).
모든 케모카인은 보존된 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합에 의해 안정화된 그리스 열쇠(Greek key) 구조를 공유한다. 그러나, 케모카인은 이들 보존된 시스테인 잔기의 수 및 위치를 기반으로 하여 4종의 상이한 패밀리에 추가로 할당된다. α-케모카인 및 β-케모카인 각각은 4개의 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. α-케모카인의 첫 번째 두 시스테인은 단일 아미노산에 의해 분리되고, 그에 따라 특징적인 CXC 아미노산 모티프를 형성한다. β-케모카인의 첫 번째의 보존된 두 시스테인은 인접하여 있다. 따라서, β-케모카인은 CC 케모카인으로도 공지되어 있다. 이와는 대조적으로, 림포탁틴은 XC 케모카인의 세 번째 부류의 유일한 구성원이며, 단지 두 번째 및 네 번째의 보존된 시스테인 잔기를 함유한다. 프락탈카인이 유일한 구성원인 케모카인의 네 번째 부류는 첫 번째의 보존된 두 시스테인을 분리시키는 3개의 아미노산을 갖는 CXXXC 또는 CX3C 부류이다. 인간에 있어서, α-케모카인은 4번 염색체 상에 클러스터링된 유전자에 의해 주로 코딩되며, β-케모카인은 17번 염색체 상의 유전자에 의해 주로 코딩된다. 림포탁틴은 1번 염색체 상에서 코딩되며, 프락탈카인은 16번 염색체 상에서 코딩된다.
케모카인은 구배를 형성하며, 이는 면역 세포 및 기타, 세포, 예컨대 단구, 대식세포, 호염기구, 호산구, T 림프구 및 섬유아세포에 있어서 잠재적인 증식 신호 및 화학유인물질로서의 역할을 한다. CC 케모카인은 화학주성 세포에 의해 인식되는 농도 구배를 형성함으로써 화학유인물질 특성을 나타내며, CC 케모카인은 또한 섬유아세포 및 면역 세포, 예컨대 단구, 대식세포, T 림프구, 호염기구 및 호산구를 포함하는 특정 세포 유형에 신호를 전달하여 증식하게 한다. CC 케모카인을 포함하는 케모카인의 표적 수용체 및 세포가 문헌[Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48: 171-197 (2008)]에 기술되어 있으며, 예를 들어 도 1을 참조하는데, 상기 문헌은 CC 케모카인 화학유인물질 및 신호 전달 기능에 관한 이의 교시에 대하여 본원에 참고로 포함된다.
케모카인은 특정한 케모카인 기능과 관련된, 예컨대 케모카인 수용체의 결합과 관련된 구조적 특징을 공유한다. 공통 구조는 첫 번째 시스테인 잔기에 선행하는 연장된 N 말단 세그먼트(N 말단 도메인), N 루프, 310 나선, 베타 가닥 β1, β2, 및 β3, 30번대, 40번대 및 50번대 루프; 디술피드 결합의 위치 및 C 말단 α-나선형 세그먼트를 포함한다.
CC 케모카인의 용매 접근 가능한, 부분적으로 용매 접근가능한, 그리고 묻힌 아미노산 잔기뿐만 아니라 상이한 CC 케모카인 중의 보존된 또는 상동성인 아미노산 잔기도 포함하는 이들 및 기타 CC 케모카인 구조가 문헌[Fernandez, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469-99 (2002)]을 참고로 하여 포함되어 있으며, 예를 들어 도 1 및 도 2를 참조한다. 온전한 비변성 케모카인의 묻힌 아미노산 잔기는 케모카인에 대한 항체가 접촉하는 에피토프 또는 항원 결정부위를 형성할 가능성이 없다. 이와는 대조적으로, 용매 또는 표면-노출된 CC 케모카인 잔기는 항체 결합이 더욱 쉽게 얻어질 수 있다.
CCL3/MIP-1α의 케모카인 수용체 결합과 관련된 CC 케모카인 잔기는
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 및 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE)을 포함하며;
CCL4/MIP-1β 케모카인 수용체 결합과 관련된 잔기는 서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE)을 포함하며;
CCL5/RANTES 결합과 관련된 잔기는 서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE)을 포함하며;
CCL23/MPIF-1 결합과 관련된 잔기는 서열 번호 81의 잔기 9-13(CCISY), 잔기 15-22(PRSIPCSL), 잔기 32-33(EC), 또는 잔기 55-65(KQVQVCMRMLK)를 포함하며;
CCL15/HCC-2와 관련된 잔기는 서열 번호 79의 잔기 8-12(CCTSY), 잔기 14-21(SQSIPCSL), 잔기 31-32(EC), 또는 잔기 54-64(PGVQDCMKKLK)
를 포함한다. 다른 CC 케모카인의 상응하는 아미노산 잔기가 예를 들어 문헌[Fernandez, et al., id. (2002)]의 도 1에 도시되어 있다.
CC 케모카인의 보존된 도메인은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/에 개시되어 있다. 이러한 구조 데이터는 2010년 8월 24일에 마지막으로 접근한 상기에 거명된 웹사이트에 당해 단백질 및 보존된 도메인에 대한 데이터베이스 정보를 참고로 하여 포함된다.
CC 케모카인류 내의 케모카인은 CC 케모카인 수용체 또는 CCR로 칭해지는 7개의 막관통 G-단백질 커플링된 수용체와 상호작용한다(문헌[Rossi & Zlotnik, Ann. Rev. Immunol. 18:217-242 (2002)]). 케모카인과 이의 수용체의 상호작용은 부착 분자의 활성화를 조절하며, 면역 세포의 순환계로부터의 조직 내로의 누출 및 삼출에 영향을 준다.
케모카인은 다수의 염증성 및 면역적 질병, 장애 및 질환의 발병 및 유지에 연루되었다. 이는 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥 경화증, 건선, 염증성 장질환(크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병을 포함함), 혈관 재협착, 루푸스 신염, 사구체신염, 이식 거부, 경피증, 섬유성 질환, 천식(및 기타 폐 염증성 질병)을 포함한다. 예를 들어, CC 케모카인의 수준은 류마티스 관절염, 다발성 경화증(MS), 아테롬성 동맥 경화증, 및 기타의 것을 갖는 환자 유래의 영향을 받은 조직에서 상승된다. 이들 질환의 전임상 동물 모델은 개개의 케모카인의 억제가 질환 증상을 적어도 부분적으로 개선시킬 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 문헌[Kasama, et al., J. Clin. Invest. 95: 2868- 2876 (1995)]에서는 MIP-1α/CCL3을 억제하는 항체의 투여가 류마티스 관절염의 설치류 모델에서 관절염 임상 스코어를 대략 50%만큼 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 이와 유사하게, 문헌[Ogata, et al., J. Pathol. 182: 106-114 (1997)]에서는 항-MCP-1/CCL2 항체가 관절 종창을 대략 30%만큼 감소시킬 수 있음을 보여주었다. MIP-1α/CCL3의 수용체(CCR1 및 CCR5) 및 MCP-1/CCL2의 수용체(CCR2)는 백혈구에서 중첩 패턴으로 발현되며, 따라서 MIP-1α/CCL3 및 MCP-1/CCL2 둘 모두의 억제제는 각각의 케모카인 단독의 개개의 억제제보다 효과적일 수 있다는 것이 가능하다. 문헌[Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48: 171-197 (2008)]은 이러한 CC 케모카인과 관련된 또는 이러한 CC 케모카인에 의해 매개되는 질환 및 장애의 특정 부류 또는 유형에 대한 이의 개시내용에 대하여 본원에 참고로 포함되며, 예를 들어 표 1을 참조한다.
케모카인 활성의 천연 억제제는 공지되어 있으며, 특정 물질, 예컨대 특정 케모카인에 결합하거나 특정 케모카인의 활성을 방해하는 소분자형 억제제 또는 항체가 개발되었으며, 이러한 억제제 및 에이전트가 참고로 포함된 문헌[Fernandez, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 469-99 (2002)]을 참조하는데, 예를 들어 제482-488면을 참조한다. 백시니아(Vaccinia) 바이러스 및 관련 폭스(pox) 바이러스는 CC 부류의 케모카인류 내의 다수의 케모카인에 결합하여 이것을 억제하는, vCCI(서열 번호 117)로 칭해지는 용해성 35 kD 단백질을 생성한다. CC 부류의 케모카인은 일반적으로 T 세포 및 단구를 포함하는 백혈구에 작용한다(문헌[Smith et al., Virology 236: 316- 327 (1997)], 문헌[Burns et al., J. Biol. Chem. 277: 2785-2789 (2002)]). 재조합 vCCI는 천식(문헌[Dabbagh, et al., J. Immunol. 165: 3418-3422 (2000)] 및 실험적 자가면역성 뇌염(문헌[Jones et al., Cytokine 43: 220-228 (2008)]을 포함하는 만성 염증성 질환의 몇몇 모델에 있어서 백혈구 침윤을 감소시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 피험체의 면역계에 대한 vCCI 외래물질과 같은 바이러스 단백질과 같은 천연 물질의 사용은 안전성 상의 쟁점을 제기한다. vCCI와 같은 물질의 투여는 요망되지 않는 생리학적 응답 또는 면역 응답을 유도할 수 있으며, 이러한 물질은 숙주의 소거 또는 방어 기작에 의해 외래물질로서 중화되거나, 제거되거나, 파괴될 수 있다.
이를 염두에 두고서, 본 발명자들은 하나 초과의 케모카인에 특이적으로 결합하여 이것을 중화시킬 수 있지만 vCCI와 같은 분자와 관련된 위험을 불러일으키지 않는 항체, 특히 인간화 항체의 제조 방법의 개발에 초점을 맞추었다. 종래 기술의 케모카인 억제제, 예컨대 단일 CC 케모카인에 결합하는 항체는 CC 케모카인 수용체 중복성 문제로 고통을 받고 있다. 예를 들어, CCL3/MIP-1α 및 CCL5/RANTES 각각은 케모카인 수용체 1(CCR1) 및 5(CCR5)에 결합하며, 문헌[Viola, 동일 문헌, (2008)]의 도 1을 참조한다. 이들 케모카인 수용체에의 CCL3 결합만을 억제하는 항체는 다른 CC 케모카인, 예컨대 CCL5의 결합에 의한 수용체 활성화를 방지하지 못한다.
처음에 본 발명자들은 케모카인 수용체 CCR1 및 CCR5의 일차적인 리간드를 구성하는 CC 케모카인 MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 및 RANTES/CCL5를 표적화하였다. CCL2/MCP-1은 또한 CCR2의 리간드로서 표적화되었다. 문헌[Viola, et al., 상기 문헌, (2008)]의 도 1에 의해 예시되는 바와 같이, 이들 수용체는 단구 및 T 세포와, 다른 백혈구 하위세트 상에서 널리 발현된다. 이들은 질환의 전임상 동물 모델에서 그리고 인간 질환에서 다수의 염증성 질환 상태에 연루된다.
본 발명의 일 측면은 적어도 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 7종 이상의 상이한 CC 케모카인에 결합할 수 있는 단리된 항카인 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항카인 항체의 일례로는 케모카인 수용체 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9 또는 CCR1O과 상호작용하는 1종 이상의 CC 케모카인을 포함하여 2종 이상의 CC 케모카인에 결합할 수 있는 것이 있다. 또 다른 실시양태에서, 항카인은 CCR1, CCR2 및 CCR5와 상호작용하는 CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, 및 CCL2/MCP-1 중 적어도 2종 또는 3종에 결합한다. 항카인 항체 또는 항카인 항체의 항원 결합 단편의 다른 예는 CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC, 및 CCL23/MPIF-1로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 상이한 CC 케모카인에 결합하는 것을 포함한다.
결합은 항카인 항체와, CC 케모카인의 1개 이상의 결정부위 사이의 접촉을 통하여 일어난다. 예를 들어, 결합은 CC 케모카인의 CC 잔기와 CC 케모카인의 마지막 C 잔기 사이에 위치하는, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC, 또는 CCL23/MPIF-1의 결정부위와 항체 사이에서 일어날 수 있다. CC 케모카인에 있어서 마지막 시스테인 잔기 및 인접 CC (시스테인-시스테인) 잔기의 위치는 당해 분야에 공지되어 있으며, 서열 목록에 예시된 CC 케모카인의 서열에서 용이하게 확인될 수 있다.
또한 항카인 항체 및 이의 항원 결합 단편은 CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC, 및 CCL23/MPIF-1을 포함하는 CC 케모카인의 1개 이상의 결정부위에 결합할 수 있는데, 이는 상기 CC 케모카인의 N-루프, 30번대 루프 또는 40번대 루프 내에 위치한다.
항카인 항체는 또한 일부 CC 케모카인에는 결합하지만 다른 것에는 결합하지 않는 이의 능력을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 항카인 항체는 CCL3/MIP-1α 및 CCL4/MIP-1β에 결합할 수 있지만, CCL5/RANTES, CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2 또는 CCL7/MCP-3에는 결합할 수 없다. 다른 것은 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MPIF-1, HCC-1, HCC-2, HCC-4, Pare, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신, MDC, ELC, 1-309, IL-8, SDF 또는 프락탈카인을 포함하여 도면에 거명된 다른 생물학적 활성 분자 및 케모카인 중 일부 또는 전부와, 기타 케모카인에 결합하지 않는다. 예를 들어, MCP-1, MCP-2 또는 MCP-3 중 1종 이상에 결합하지 않는 항카인이 본원에 예시되어 있다.
항카인은 또한 하나의 종의 2종 이상의 CC 케모카인에는 결합하지만 또 다른 종의 상응하는 CC 케모카인에는 결합하지 않는 능력을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 항카인은 인간 CCL3에는 결합할 수 있지만 쥐과 CCL3에는 실질적으로 결합할 수 없다. 항카인 항체의 결합 특이성의 구체적인 예가 도 8 내지 도 12에 나타난다.
일부 항카인 항체 및 이의 항원 결합 단편은 CC 케모카인과 상응하는 수용체의 상호작용을 또한 억제할 수 있다. 이러한 억제는 수용체에의 케모카인 결합에 의해 활성화되는 화학주성 또는 기타 효과의 억제와 같은 기능적 효과를 가질 수 있다.
항카인 항체는 CC 케모카인의 CC 수용체 결합 잔기 내의 1개 이상의 결정부위에 결합할 수 있다. CC 케모카인 수용체 결합과 관련된 것으로 공지되거나 생각되는 CC 케모카인의 수용체 결합 아미노산 잔기 및 세그먼트는 당해 분야에 기록되어 있다.
당해 N 말단, N-루프, 30번대 루프, 및 디술피드 다음의 그리고 알파 나선 내의 잔기는 일반적으로 CC 케모카인 패밀리에 있어서의 수용체 결합에 연루된 것으로 생각된다. 케모카인의 다양한 기능과 상관된 케모카인의 특정한 구조적 특징의 설명은 하기 두 간행물을 참고로 하여 포함된다: 문헌[Baysal, et al., Proteins 43(2): 150-60 (2001)] 및 문헌[Kuloglu, et al., Biochemistry, 40(42): 12486-96 (2001)]. CC 케모카인의 제안된 기능성 도메인에 대해서는 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111을 참조한다.
본 발명자들은 특이적 항카인 단클론 항체 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E를 제조 및 확인하였다. 이들 항카인을 사용하여, 당해 분야에 공지된 경쟁적 억제 분석법을 이용하여 이들이 인식한 CC 케모카인 중 하나 이상에의 이들 항카인 단클론 항체의 결합을 경쟁적으로 차단하는 다른 항체 또는 물질을 확인할 수 있다. 경쟁적 억제제, 예컨대 항카인 항체 결합을 억제하는 항체와, 항카인 단클론 항체 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E를 사용한 이러한 경쟁적 억제제의 탐지 방법이 또한 본 발명에 포함된다.
항카인 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과 또는 기타 척추 동물, 조류 또는 포유류 항체, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명의 일 유형의 항카인 항체는 결합 특이성이 단클론 항체 3C12F의 것과 동일하거나 유사하며, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL15/HCC-2, 및 CCL23/MPIF-1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종 또는 5종의 CC 케모카인에 결합할 수 있다. 이들은 HCC-1, PARC, 또는 MCP 1, 2 또는 3과 같은 도 8에 예시된 다른 케모카인을 포함하는 다른 케모카인에 대하여 결합을 전혀 나타낼 수 없거나 실질적으로 전혀 나타낼 수 없다. 이러한 유형의 항체는 케모카인 수용체에의 결합에 중요할 수 있는 도메인에 결합할 수 있으며, 상기 도메인은 하기를 포함한다:
CC 케모카인의 N 루프, 30번대 루프, 또는 40번대 루프 내의 결정부위;
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 81의 잔기 9-13(CCISY), 잔기 15-22(PRSIPCSL), 잔기 32-33(EC), 또는 잔기 55-65(KQVQVCMRMLK) 내에 위치하는 CCL23/MPIF-1의 1개 이상의 항원 결정부위; 또는
서열 번호 79의 잔기 8-12(CCTSY), 잔기 14-21(SQSIPCSL), 잔기 31-32(EC), 또는 잔기 54-64(PGVQDCMKKLK) 내에 위치하는 CCL15/HCC-2의 1개 이상의 항원 결정부위.
이러한 유형의 항체는 서열 번호 3, 4, 5, 8, 9 또는 10, 또는 서열 번호 53, 54, 55, 58, 59 또는 60의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb 3C12F의 하나 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR) 또는 경쟁적으로 MAb 3C12F가 이것이 결합하는 CC 케모카인에 결합하는 것을 억제 또는 차단하는 또는 RANTES가 vCCI에 결합하는 것을 차단하는 항체의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다(도 2 참조). 이러한 유형의 항카인 항체는 서열 번호 3, 4, 5, 8, 9 및/또는 10, 또는 서열 번호 53, 54, 55, 58, 59 및/또는 60의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 결실, 삽입 또는 치환된 CDR 또는 MAb 3C12F의 CDR 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 수 있다. 따라서, CDR 서열은 하이브리도마 세포주 3C12F에 의해 또는 이의 계대배양물에 의해 생성되는 항체의 것과 동일할 수 있거나; 3C12F의 항카인 항체 유사체의 것에 상응하거나 MAb 3C12F가 이것이 결합하는 CC 케모카인 중 2종 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단 또는 억제하는 항카인 단클론 항체의 것에 상응할 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과, 조류 또는 기타 척추 동물 항체; 또는 이의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다.
두 번째 유형의 항체는 결합 특이성이 7D1G와 유사하거나 동일하며, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL23/MPIF-1, 및 CCL18/PARC로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 CC 케모카인에 결합한다. 이러한 유형의 항체는 HCC-2, 에오탁신 또는 MCP 1, 2, 3 또는 4와 같은 도 10에 예시된 기타 케모카인과 같은 다른 케모카인에의 결합을 전혀 나타낼 수 없거나 실질적으로 전혀 나타낼 수 없다.
이러한 두 번째 유형의 항체는 CC 케모카인 또는 케모카인의 구조적 결정부위에 결합할 수 있으며, 이는 하기에 결합하는 것을 포함한다:
MAb 7D1G가 결합하는 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위;
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 81의 잔기 9-13(CCISY), 잔기 15-22(PRSIPCSL), 잔기 32-33(EC), 또는 잔기 55-65(KQVQVCMRMLK) 내에 위치하는 CCL23/MPIF-1의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 78의 CCL14/HCC-1의 잔기 8-12(CCFTY), 잔기 14-21(TYKIPRQR), 잔기 31-32(QC), 또는 잔기 54-64(KWVQDYIKDMK)의 1개 이상의 항원 결정부위; 또는
서열 번호 82의 CCL18/PARC의 잔기 10-14(CCLVY), 잔기 16-23(SWQIPQKF), 잔기 33-34(QC), 또는 잔기 56-66(KWVQKYISDLK)의 1개 이상의 항원 결정부위.
구조적으로, 이들 항체는 서열 번호 23, 24, 25, 28, 29 또는 30의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb 7D1G의 1개 이상의 CDR, 또는 MAb 7D1G가 이것이 결합하는 CC 케모카인에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제 또는 차단하는 항체 유래의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 항카인 항체의 한 종은 서열 번호 23, 24, 25, 28, 29 및/또는 30의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 결실, 삽입 또는 치환된 CDR 또는 MAb 7D1G의 CDR 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함한다. 따라서, CDR 서열은 하이브리도마 세포주 7D1G에 의해 또는 이의 계대배양물에 의해 생성되는 항체의 것과 동일할 수 있거나; 7D1G의 항카인 항체 유사체의 것에 상응하거나 MAb 7D1G가 이것이 결합하는 CC 케모카인 중 2종 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단 또는 억제하는 항카인 단클론 항체의 것에 상응할 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과, 조류 또는 기타 척추 동물 항체; 또는 이의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다.
세 번째 유형의 항카인 항체는 결합 특이성이 7D12A와 유사하거나 동일하며, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, 및 CCL23/MPIF-1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종, 3종 또는 4종의 CC 케모카인에 결합한다. 이들은 CCL2/MCP-1과 같은 도 9에 예시된 기타 케모카인을 포함하는 다른 케모카인에의 결합을 전혀 나타낼 수 없거나 실질적으로 전혀 나타낼 수 없다.
이러한 항체 생성물은 상기 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위에 결합할 수 있으며;
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위; 또는
서열 번호 81의 CCL23/MPIF-1의 잔기 9-13(CCISY), 잔기 15-22(PRSIPCSL), 잔기 32-33(EC), 또는 잔기 55-65(KQVQVCMRMLK)의 1개 이상의 항원 결정부위
에 결합할 수 있다.
구조적으로 이들 세 번째 유형의 항체는 서열 번호 13, 14, 15, 18, 19 또는 20의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb 7D12A의 1개 이상의 CDR, 또는 MAb 7D12A가 이것이 결합하는 CC 케모카인에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체 유래의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 항카인 항체는 서열 번호 13, 14, 15, 18, 19 및/또는 20의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 결실, 삽입 또는 치환된 CDR 또는 MAb 7D12A의 CDR 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 수 있다. 따라서, CDR 서열은 하이브리도마 세포주 7D12A에 의해 또는 이의 계대배양물에 의해 생성되는 항체의 것과 동일할 수 있거나; 7D12A의 항카인 항체 유사체의 것에 상응하거나 MAb 7D12A가 이것이 결합하는 CC 케모카인 중 2종 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단 또는 억제하는 항카인 단클론 항체의 것에 상응할 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과, 조류 또는 기타 척추 동물 항체; 또는 이의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다.
네 번째 유형의 항카인 항체는 결합 특이성이 18V4F와 유사하거나 동일하며, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β 및 CCL5/RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종 또는 3종의 CC 케모카인에 결합한다. 이들은 CCL2/MCP-1과 같은 도 11에 예시된 기타 케모카인을 포함하는 다른 케모카인에의 결합을 전혀 나타낼 수 없거나 실질적으로 전혀 나타낼 수 없다. 이러한 항체 생성물은 상기 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위에 결합할 수 있으며;
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위
에 결합할 수 있다.
구조적으로 이들 네 번째 유형의 항체는 서열 번호 33, 34, 35, 38, 39, 또는 40 또는 서열 번호 63, 64, 65, 68, 69 또는 70의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb 18V4F의 1개 이상의 CDR, 또는 MAb 18V4F가 이것이 결합하는 CC 케모카인에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체 유래의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 항카인 항체는 서열 번호 33, 34, 35, 38, 39 및/또는 40 또는 서열 번호 63, 64, 65, 68, 69 또는 70의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 삽입되거나, 결실된 CDR 또는 MAb 18V4F의 CDR 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 수 있다. 따라서, CDR 서열은 하이브리도마 세포주 18V4F에 의해 또는 이의 계대배양물에 의해 생성되는 항체의 것과 동일할 수 있거나; 18V4F의 항카인 항체 유사체의 것에 상응하거나 MAb 18V4F가 이것이 결합하는 CC 케모카인 중 2종 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단 또는 억제하는 항카인 단클론 항체의 것에 상응할 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과, 조류 또는 기타 척추 동물 항체; 또는 이의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다.
다섯 번째 유형의 항카인 항체는 결합 특이성이 18P7E와 유사하거나 동일하며, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β 및 CCL5/RANTES로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2종 또는 3종의 CC 케모카인에 결합한다. 이들은 CCL2/MCP-1과 같은 도 12에 예시된 기타 케모카인을 포함하는 다른 케모카인에의 결합을 전혀 나타낼 수 없거나 실질적으로 전혀 나타낼 수 없다. 이러한 항체 생성물은 상기에 언급된 3종의 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위에 결합할 수 있다.
이러한 항체 생성물은 상기 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위에 결합할 수 있으며;
서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위;
서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위에 결합할 수 있다.
구조적으로 이들 다섯 번째 유형의 항체는 서열 번호 43, 44, 45, 48, 49, 또는 50의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 MAb 18P7E의 1개 이상의 CDR, 또는 MAb 18P7E가 이것이 결합하는 CC 케모카인에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하는 항체 유래의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 항카인 항체는 서열 번호 43, 44, 45, 48, 49 및/또는 50의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나, 삽입되거나, 결실된 CDR 또는 MAb 18P7E의 CDR 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개를 포함할 수 있다. 따라서, CDR 서열은 하이브리도마 세포주 18P7E에 의해 또는 이의 계대배양물에 의해 생성되는 항체의 것과 동일할 수 있거나; 18P7E의 항카인 항체 유사체의 것에 상응하거나 MAb 18P7E가 이것이 결합하는 CC 케모카인 중 2종, 3종 이상에 결합하는 것을 경쟁적으로 차단 또는 억제하는 항카인 단클론 항체의 것에 상응할 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 쥐과, 조류 또는 기타 척추 동물 항체; 또는 이의 항원 결합 단편의 형태일 수 있다.
3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F, 18P7E 및 이의 유사체, 또는 기타 항카인 항체의 각각의 CDR의 것을 포함하는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열은 항체 모방체의 약물 디자인에 있어서의 코어 구조체로서, CC 케모카인-수용체 결합을 간섭하는 경쟁적 억제제로서, CC 케모카인 항체에 대한 항이디오타입 항체 또는 케모카인을 단리 또는 확인하기 위한 리간드로서, 또는 CC 케모카인에 대한 항체에 대한 항이디오타입 항체를 유도하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다. 이러한 펩티드는 항카인 항체의 CDR을 포함하는 원형 또는 루프형 펩티드와 같은 입체 배좌 제한된 펩티드 또는 변형된 또는 안정화된 펩티드를 포함한다. 항체의 CDR을 이용한 펩티드 디자인 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이는 문헌[Takahashi, et al., Chem. Eur. J. 6(17):3196-3203] 또는 문헌[Feng, et al., Cell. Host. Microb. 98(2): 311-316]을 참고로 하여 포함된다. 이들 CDR은 서열 번호 3-5, 8-10, 13-15, 18-20, 23-25, 28-30, 33-35, 38-40, 43-45, 48-50, 53-55, 58-60, 63-65 및 68-70의 것과, 친화성 성숙에 의해 생성된 이들 펩티드 서열의 유사체를 포함한다. 유니터리(unitary) 펩티드 생성물을 형성하는 2개 이상의 CDR 펩티드 서열의 융합물, 하이브리드, 또는 콘쥬게이트로서, 또는 상이한 CDR을 포함하는 별도의 펩티드들의 조합으로서의 상이한 CDR의 조합을 이용하여 CC 케모카인 결합 또는 활성을 조정 또는 억제하거나, 케모카인 이량체화 또는 다량체화를 억제하거나, 유용한 생리적 또는 면역적 응답을 유도할 수 있다.
본 발명의 항카인 항체는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이 항카인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 담체, 부형제 또는 완충제와 함께 포함하는 조성물로서 제제화될 수 있다.
항카인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주의 제조 방법은 순차적으로 포유류, 예컨대 마우스를 특정 CC 케모카인으로 면역화하는 단계, 1종 이상의 상이한 CC 케모카인으로 면역증강시키는 단계, 그 후 하이브리도마 세포주를 상기 포유류로부터 예를 들어 이의 비장 세포와 골수종 또는 불사화 B 세포주와의 융합에 의해 생성하는 단계, 및 2종 이상의 케모카인 또는 CC 케모카인에 결합하는 항카인 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 단리하는 단계를 포함한다.
1종 이상의 CC 케모카인에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 질병, 특히 항카인 항체에 의해 인식되는 적어도 2종 또는 3종의 CC 케모카인에 의해 매개되는 것의 치료 방법은 이를 필요로 하는 피험체에게 항카인 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함한다. 질환, 장애 또는 질병은 염증 또는 자가면역을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 하기의 도면 및 실시 형태의 상세한 설명으로부터 명백해진다.
도 1에 ELISA에 의한 케모카인에의 정제 3C12F의 결합성이 도시되어 있다.
도 2에 3C12F가 RANTES/CCL5에의 vCCI 결합을 차단함이 도시되어 있다.
도 3에 화학주성 분석에서 정제 3C12F의 억제 활성의 적정이 도시되어 있다.
도 4에 화학주성 분석에서 정제 7D12A의 억제 활성의 적정이 도시되어 있다.
도 5에 화학주성 분석에서 정제 7D1G의 억제 활성의 적정이 도시되어 있다.
도 6에 화학주성 분석에서 정제 18V4F의 억제 활성의 적정이 도시되어 있다.
도 7에 화학주성 분석에서 정제 18P7E의 억제 활성의 적정이 도시되어 있다.
도 8에 MSD 플랫폼을 이용한 3C12F의 케모카인 결합 특이성이 도시되어 있다.
도 9에 MSD 플랫폼을 이용한 7D12A의 케모카인 결합 특이성이 도시되어 있다.
도 10에 MSD 플랫폼을 이용한 7D1G의 케모카인 결합 특이성이 도시되어 있다.
도 11에 MSD 플랫폼을 이용한 18V4F의 케모카인 결합 특이성이 도시되어 있다.
도 12에 MSD 플랫폼을 이용한 18P7E의 케모카인 결합 특이성이 도시되어 있다.
도 13a, 도 13b, 도 13c 및 도 13d에 5종의 항카인 항체에 의해 인식되는 케모카인 서열의 정렬이 도시되어 있다.
"항체"라는 용어는 단일 단클론 항체, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물과, 바람직한 생물학적 활성, 예컨대 특정 항원, 에피토프 또는 항원 결정부위에 결합하는 능력을 나타내는 한 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, scFv 및 Fv)을 기술하는 것으로 널리 파악되어야 한다. 이 용어는 온전한 항체, 전장 또는 비절단형 항체와, 항체 단편, 및 항체 유도체, 변이체 및 유사체를 포함한다.
하기에 기술된 항카인 항체를 포함하는 항체는 상이한 이소형 - 예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 및 IgY - 과, 다양한 이소형 서브클래스, 예컨대 인간 IgG 서브클래스 1, 2, 3 및 4 또는 IgA 서브클래스 1 및 2를 가질 수 있다. 다가 항체는 다가 항원에 대한 이의 친화력을 특징으로 할 수 있다. 친화력은 반복적인 동일 에피토프를 갖는 항원에의 결합을 강화시키며, 일부 케모카인은 이량체 또는 사량체 구조를 특징으로 하였다. 개개의 항체 분자가 더 많은 항원-결합 부위를 가질수록 항원에 대한 이의 친화력은 더욱 커진다. 포유류 및 조류의 것을 포함하는 항체는 다양한 척추 동물로부터 수득되거나 유래될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "단클론 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되는 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 집단에 포함되는 개개의 항체가 동일함을 나타낸다. 단클론 항체는 고도로 특이적이며 단일 항원 부위에 대하여 유도된다. 더욱이, 상이한 결정부위(에피토프들)에 대하여 유도된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 통상적인 (다클론) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대하여 유도된다. 단클론 항체는, 이의 특이성에 더하여, 이것이 다른 면역글로불린으로 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. "단클론"이라는 수식어는 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 항체의 특질을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 파악되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 문헌[Koehler & Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 처음에 기술된 하이브리도마법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호를 참조한다.
"키메라 항체"는 2종의 상이한 공급원 유래의 아미노산 서열을 함유하는 항체, 예를 들어 특정 에피토프 또는 항원에 결합하는 것으로 공지된 쥐과 동물 항체의 가변 세그먼트에 스플라이싱된 보존된 인간 항체 세그먼트를 함유하는 것을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 하나의 부분은 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 클래스에 속하는 항체에서의 서열과 동일하거나 상기 서열에 대하여 상동성인 반면, 상기 사슬들의 나머지 세그먼트는 또 다른 종 유래의 서열에 대하여 상동성이거나 그와 동일하다. 일 실시양태에서, 본 발명은 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역이 포유류의 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면 불변 부분은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열에 대하여 상동성인 키메라 항체 또는 항원 결합 단편을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 키메라 항체는 인간 항체의 프레임워크 영역 상에 마우스 항체 유래의 CDR을 그래프팅함으로써 제조된다. 따라서, 본 발명의 단클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 대하여 상동성인 반면 상기 사슬(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래된 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체와, CC 케모카인에 결합하는 능력을 유지한 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 대하여 상동성인 "키메라" 항체를 포함한다. 키메라 항체의 특징 및 이의 제조 방법은 카빌리 등의 미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851- 6855 (1984)]을 참고로 하여 포함된다.
"상보성 결정 영역(CDR)"은 면역글로불린 분자의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 일부를 형성한다. 항체 사슬의 이들 섹션은 항원 상의 특정 에피토프에 대한 항체의 특이성을 결정하는 영역의 일부분을 형성하며, 에피토프에 직접적으로 결합할 수 있는 항체 분자의 부분을 형성한다. CDR3은 항체를 형성하는 상이한 CDR 중에서 가장 큰 가변성을 나타낸다. CDR은 항체와, 이것이 인식하는 에피토프 사이의 접촉을 매개한다. CDR 서열을 포함하거나 CDR 서열과 유사한 단리된 펩티드는 추가의 기능적 활성을 나타낼 수 있다(문헌[Polonelli, et al., PLoS One 3:e2371 (2008)].
"인간화 항체"는 실질적으로 비인간 항체(예를 들어, 마우스)로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)과, 실질적으로 인간 항체 사슬(수용 면역글로불린 또는 항체로 나타냄)로부터의 가변 영역 프레임워크 잔기를 포함하는 하나 이상의 사슬을 포함하는 항체를 나타낸다. CDR의 그래프팅에 더하여, 전형적으로 인간화 항체는 친화성 개선 및/또는 면역원성 감소를 위하여 추가의 변경을 받는다. "인간화 항체"는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체인, 전적으로는 아닌 인간 항체를 포함한다. 대부분의 부분에 있어서, 인간화 항체는 수령체의 초가변 영역 잔기가 바람직한 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종 유래의 초가변 영역 잔기 (공여 항체)로 대체된 인간 면역글로불린(수령 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수령 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개량하기 위하여 행해진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하며, 여기서, 초가변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하며, FR의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 또한 인간화 항체는, 전형적으로 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가 (즉, 돌연변이)의 도입에 의해 변경된, 2종 이상의 CC 케모카인에 면역특이적으로 결합하는 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분을 임의로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 유도체이다. 이러한 인간화 항체는 하나 이상의 비인간 CDR에 있어서 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 인간화 항체 유도체는 비유도체형 인간화 항체와 비교할 때 실질적으로 동일한 결합성, 더욱 우수한 결합성, 또는 더욱 불량한 결합성을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기는 치환, 결실 또는 부가된다(즉, 돌연변이된다). 인간화 항체의 제조 방법은 유럽 특허 제239,400호, 유럽 특허 제592,106호, 및 유럽 특허 제519,596호; 국제 특허 공개 제WO 91/09967호 및 국제 특허 공개 제WO 93/17105호; 미국 특허 제5,225,539호, 미국 특허 제5,530,101호, 미국 특허 제5,565,332호, 미국 특허 제5,585,089호, 미국 특허 제5,766,886호, 및 미국 특허 제6,407,213호; 문헌[Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)]; 문헌[Studnicka, et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)]; 문헌[Roguska, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969-973 (1994)]; 문헌[Tan, et al.,, J. Immunol. 169: 11 19-25 (2002)]; 문헌[Caldas, et al., Protein Eng. 13:353-60 (2000)]; 문헌[Morea, et al., Methods 20:267-79 (2000)]; 문헌[Baca, et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-84 (1997)]; 문헌[Roguska, et al., Protein Eng. 9:895-904 (1996)]; 문헌[Couto, et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)]; 문헌[Couto, et al., Cancer Res. 55: 1717-22 (1995)]; 문헌[Sandhu, Gene 150:409-10 (1994)]; 문헌[Pedersen, et al., J. Mol. Biol. 235:959-73 (1994)]; 문헌[Jones, et al., Nature 321 :522-525 (1986)]; 문헌[Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참고로 하여 포함된다.
본원에서 "변이체형" 또는 "유사체형" 항체는 모 항체 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 아미노산 서열이 "모" 항체 아미노산 서열과 상이한 분자를 나타낸다. 일 실시양태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들) 내에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 내에 적어도 하나, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개, 바람직하게는 약 2개 내지 약 10개, 바람직하게는 약 2개 내지 약 5개의 치환을 포함할 수 있다. 보통, 변이체는 모 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 서열과 75% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 본원에서 이 서열과 관련된 동일성 또는 상동성은, 서열을 정렬하고, 필요할 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 모 항체 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 항체 서열 내로의 N 말단, C 말단 또는 내부 신장, 결실 또는 삽입 중 어떠한 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주는 것으로 파악되지 않는다. 변이체는 수용체에 결합하는 능력을 유지하며, 바람직하게는 모 항체의 것보다 탁월한 특성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 더욱 강한 결합 친화성, 수용체를 활성화시키는 향상된 능력 등을 가질 수 있다. 이러한 특성을 분석하기 위하여, 예를 들어 Fab 형태의 변이체를 Fab 형태의 모 항체와 비교하거나 전장 형태의 변이체를 전장 형태의 모 항체와 비교하여야 하며, 그 이유는 항체의 포맷이 본원에 개시된 생물학적 활성 분석에서 이의 활성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 본원에서 특히 관심 있는 변이체형 항체는 모 항체와 비교할 때 약 10배 이상, 바람직하게는 약 20배 이상, 가장 바람직하게는 약 50배 이상의 생물학적 활성의 향상을 나타내는 것이다.
본원에서 "모" 항체는 변이체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것이다. 바람직하게는, 모 항체는 인간 프레임워크 영역을 가지며, 인간 항체 불변 영역(들)을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 공여 (쥐과) 항체의 CDR이 내부에 매립된 인간 항체일 수 있다.
"단리된" 항체는 이의 자연적인 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연적인 환경의 오염 성분은 항체에 있어서의 진단 또는 치료 용도를 간섭하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 로리법(Lowry method)에 의해 결정할 때 95 중량% 초과의 항체로, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로 정제되거나, (2) 스피닝 컵 서열 분석기(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나, (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용한 환원 또는 비환원 조건하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연적인 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내의 원위치의 항체를 포함한다. 그러나, 보통 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조된다.
"세포 물질이 실질적으로 없는"이라는 어구는 항체 또는 항체 단편이 이것이 단리되거나 재조합으로 생성되는 세포의 세포 성분으로부터 분리된 항체 또는 항체 단편 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편은 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만(건조 중량 기준)의 비상동성 단백질 (본원에서 "오염 단백질"로도 나타냄)을 갖는 항체 또는 항체 단편의 제제를 포함한다. 항체 또는 항체 단편이 재조합으로 생성될 경우, 배양 배지가 실질적으로 없는 것이 또한 바람직하며, 즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 나타낸다. 항카인 항체 또는 이의 항체 단편이 화학 합성에 의해 생성될 때, 바람직하게는 이것은 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 없이 생성되며, 즉, 이것은 단백질 합성에 연루된 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 분리된다. 따라서 이러한 항체 또는 항체 단편 제제는 관심 있는 항체 또는 항체 단편 이외의 약 30%, 20%, 10%, 5% 미만(건조 중량 기준)의 화학적 전구체 또는 화합물을 갖는다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 단리되거나 정제된다.
"항카인 항체"라는 용어는 2종 이상의 케모카인에 결합하는 상기에 정의된 항체를 나타내며, 바람직하게는 항카인 항체는 3종 이상의 인간 CC 케모카인에 결합한다. 항카인 항체는 단클론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단리되거나 정제된 1특이성 항체 또는 단클론 항체이다. 항카인 항체는 포유류 항체, 예컨대 쥐과 또는 인간 항체, 또는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 전적으로 인간 항체인 항체는 인간으로부터 또는 트랜스제닉 동물 또는 파지 디스플레이 (display) 플랫폼으로부터 수득될 수 있으며, 문헌[Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20(4):450-9 (2008)]을 참조하는데, 상기 문헌은 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 절차를 참고로 하여 포함된다. 항카인 항체는 합성 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 나노바디(VHH) 또는 카멜라이즈드 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디술피드 연결 Fv, 내부체, 및 항이디오타입 (항-Id) 항체 (3C12F 등과 같이 본 발명의 항카인 항체에 대한 항-항 이디오타입 항체 및 항이디오타입 항체를 포함함) - 2특이성 -, 및 CC 케모카인의 결정부위 또는 에피토프에 결합하는 상기 중 임의의 것의 단편일 수 있다. 조작된 항체의 다양한 구조적 형태는 문헌[Antibody Engineering: A Practical Approach, edited by McCafferty, et al., Oxford University Press (1996)]을 참고로 하여 포함된다. "항카인 항체"라는 용어는 1개 이상의 항원 결합 부위 (antigen binding site, ABS)를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편 및 면역글로불린 분자를 포함한다. 이들은 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 및 IgY를 포함하는 임의의 이소형의 것일 수 있으며, 항체를 생성하는 포유류 및 조류와 같은 척추 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항카인 항체는 동물, 예컨대 가축 또는 상업적으로 사육된 동물, 또는 야생 동물 또는 사로잡혀 사육된 동물에게 투여하기에 적합할 수 있지만, 항카인 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 이들은 반려 동물, 예컨대 개 및 고양이; 가축, 예컨대 소, 말, 들소, 물소, 돼지, 염소, 양, 낙타, 라마 등; 및 가금류, 예컨대 닭, 칠면조, 거위, 매 등을 포함한다. 당업자라면 예를 들어 특정한 유형의 동물에 의해 발현되는 CC 케모카인에 대하여 항체를 유도함으로써 및/또는 인간화와 유사한 항체-조작 공정에 의해 비인간 용도를 위하여 항카인 항체를 생성하여 수정하는 방법을 이해할 것이다.
항카인 항체 또는 이의 단편은 특정 CC 케모카인에 결합하며, 다른 케모카인 또는 폴리펩티드에는 비특이적으로 결합하지 않는다. CC 케모카인 또는 CC 케모카인의 단편에 면역특이적으로 결합하는 항카인 항체 또는 이의 단편은 다른 항원과 교차 반응할 수 있다. 그러나, CC 케모카인 또는 이의 단편에 면역특이적으로 결합하는 항카인 항체 또는 단편은 다른 항원과 교차 반응하지 않는 것이 선택될 수 있다. 특정 CC 케모카인에 면역특이적으로 결합하는 항카인 항체 또는 이의 단편은 예를 들어 면역분석법 또는 당업자에게 공지된 다른 기술에 의해 확인될 수 있다.
"단편"은 CC 케모카인 또는 항카인 면역글로불린과 같은 온전한 폴리펩티드 분자의 부분을 기술한다. "단편"은 온전한 성숙 CC 케모카인의 서열 또는 경쇄 또는 중쇄 항체 폴리펩티드의 서열과 같은 아미노산 서열의 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 60개, 70개, 75개, 80개, 90개, 100개, 120개, 130개, 150개, 175개, 200개, 또는 250개의 인접 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. CC 케모카인에 있어서, 단편은 성숙 케모카인의 길이보다 더 짧은 당해 분자의 부분, 예컨대 5개 이상의 인접 아미노산 잔기, 10개 이상의 인접 아미노산 잔기, 15개 이상의 인접 아미노산 잔기, 20개 이상의 인접 아미노산 잔기, 25개 이상의 인접 아미노산 잔기, 40개 이상의 인접 아미노산 잔기, 50개 이상의 인접 아미노산 잔기, 또는 성숙 CC 케모카인의 전 아미노산 서열까지의 그러나 이것을 포함하지는 않는 임의의 중간 값의 아미노산 서열을 포함하는 CC 케모카인 단편이다. 항카인 항체에 있어서, 단편은 CC 케모카인에 특이적으로 결합하며 온전한 항카인 항체가 결합하는 적어도 2종 또는 3종의 CC 케모카인에 결합하는 항체의 VH 및/또는 VL 부분의 전장까지의, 그러나 이것을 포함하지는 않는, 또는 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개의 인접 아미노산 잔기의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 항카인 항체 단편은 단쇄 단편, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄의 일부분일 수 있지만, 또한 다수의 사슬을 포함하는 단편, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함한다.
"친화성 성숙된 항체"는 가변 영역 내의 하나 이상의 잔기의 유형 또는 위치를 변경시킴으로써 이의 결합 친화성 및/또는 생물학적 활성을 증가시킨 항체이다. 변경의 일례로는 CDR 또는 프레임워크 영역 내에 있을 수 있는 돌연변이가 있다. 친화성 성숙된 항체는 전형적으로 단리된 항체 또는 천연 항체 또는 이의 단편의 결합 친화성보다 2 내지 500배만큼 증가된 결합 친화성을 갖는다. 친화성 성숙된 항체는 수용체 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 가질 수 있다. 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해 생성된다. 참고로 포함된 문헌[Marks, J. D. et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기술되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발은 문헌[Barbas, C. F. et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809- 3813 (1994)], 문헌[Schier, R. et al. Gene 169: 147-155 (1995)], 문헌[Yelton, D. E. et al. J. Immunol. 155;1994- 2004 (1995)], 문헌[Jackson, J. R. et al. J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)] 및 문헌[Hawkins, R. E. et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]을 참고로 하여 포함된다.
"항카인 항체 유도체"는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의해 변경된, 적어도 2종, 3종, 4종 이상의 CC 케모카인에 특이적으로 결합하는 CC 케모카인 결합 항체 단편 또는 항카인 항체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 본원에 사용되는 바와 같이 "유도체"라는 용어는 또한 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단, 단백질 분해 절단, 세포 리간드에의 결합 또는 기타 단백질에 의한 유도체화 등에 의해 공유적으로 변형된 항카인 항체의 단편 또는 항카인 항체를 나타낸다. 이러한 항카인 항체 유도체는 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신의 대사적 합성 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 당업자에게 공지된 기술을 이용한 화학적 변형에 의해 생성될 수 있다. 항카인 항체 유도체는 2종 이상의 CC 케모카인에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다.
"항카인 항체 유사체"는 공지된 항카인 항체와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하며 2종 이상의 CC 케모카인에 결합하는 공지된 항카인 항체의 능력을 유지하는 폴리펩티드를 나타낸다. 또한 유사체는 1개, 2개, 3개, 5개 또는 10개 또는 그 초과의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다. 항카인 항체 폴리펩티드와 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 또 다른 단백질에 대한 동일성을 참고로 하여 또는 코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 참고로 하여 기술될 수 있으며, 이는 하기로서 포함된다:
(ⅰ) 공지된 항카인 항체의 1개 이상의 CDR 또는 하나 이상의 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열에 대하여 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;
(ⅱ) 엄격한 조건하에 본원에 기술된 항카인 항체 단편 또는 항카인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드로서, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 50개, 75개, 90개, 100개, 125개, 또는 적어도 150개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드. 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격도"를 결정한다. 55℃의 Tm에 상응하는 낮은 엄격도의 혼성화 조건은 예를 들어 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크를 포함하며, 포름아미드는 포함하지 않거나; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS를 포함한다. 중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건은 더욱 높은 Tm, 예를 들어, 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SSC에 상응하며, 높은 엄격도의 혼성화 조건은 최고 Tm, 예를 들어, 50% 포름아미드, 0.1x SSC에 상응한다; 및
(ⅲ) 공지된 항카인 항체 또는 항카인 항체 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 적어도 99% 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 본원에 기술된 항카인 항체 단편 또는 항카인 항체와 유사한 구조를 갖는 폴리펩티드는 공지된 항카인 항체 또는 이의 단편과 유사한 2차, 3차 또는 4차 구조를 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 폴리펩티드 및 단백질 구조는 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이는 X-선 결정술, 핵자기 공명 및 결정학적 전자 현미경법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
"초가변 영역"이라는 용어는 항원 결합에 책임이 있는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 내의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 내의 "초가변 루프"로부터의 잔기(문헌[Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 항체의 구조적 특징 및 항체 구조의 결정 또는 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 문헌[Kabat, id., Chothia, et al., id.]; 문헌[Deret, et al., Comput. Appl. Biosci. 11(4):435-9 (1995)]; 문헌[Martin, Protein 25(1): 130-3 (1996)] 및 문헌[Abhinandan, et al., Mol. Immunol. 45(14):3832-9 (2008)]; 및 문헌[Abhinandan, et al., J. Mol. Biol. 369(3):852-62 (2007)]을 참고로 하여 포함된다.
"CC 케모카인"은 4개의 보존된 시스테인 잔기를 함유하는 화학주성 사이토카인 패밀리 유래의 폴리펩티드를 나타내는데, 상기 시스테인 잔기의 처음 2개는 예를 들어 문헌[Van Coillie, et al., Cytokine & Growth Factor Rev. 10:61-86 (1999)]에 기술된 바와 같이 인접하여 있다. CC 케모카인은 β-케모카인으로도 공지되어 있다. 이들 인접 시스테인-시스테인(cys-cys, 또는 C-C) 잔기를 기반으로 하여 β-케모카인은 "CC" 케모카인으로 공지되어 있으며, 여기서, "CC"는 인접 시스테인 잔기를 나타낸다. CC 케모카인의 예로는 CCR1 및 CCR5에 결합하는 것이 있으며, 이는 CCL3/MIP-1α, CCL4/ MIP-1β 및 CCL5/RANTES를 포함한다. CC 케모카인은 포유류 및 조류에 존재한다. 특정 케모카인의 인간 또는 쥐과 버전, 예를 들어 인간 CCL3/MIP-1α에 사용되는 용어는 또 다른 종에서의 상응하는 분자, 예를 들어, "쥐과 동물 MIP-1α" 또는 "소과 동물 MIP-1α"를 확인하기 위하여 사용될 수 있으며, 언급되는 종에서의 비슷한, 구조적으로 유사한 분자를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 포유류 및 조류 종 중에서의 유사한 케모카인은 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 동일성 또는 이 범위 내의 임의의 중간 값의 서열 동일성을 가질 수 있으며, 동일하거나 유사한 기능적 면역학적 활성을 나타낸다.
포유류 및 조류의 것을 포함하는 척추 동물 CC 케모카인의 서열은 NCBI 데이터베이스(2010년 8월 9일에 마지막으로 접근됨)에서의 가장 최근에 업데이트된 수탁 번호에 의해 확인되는 서열을 구체적으로 참고로 하는 NCBI 데이터베이스를 참고로 하여 그리고 본원에 참고로 포함된 문헌[Fernandez & Lolis, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469 (2002)]을 참고로 하여 포함된다.
인간 케모카인 CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC, 및 CCL23/MPIF-1와 기타의 것의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 특정 수탁 번호가 표 4에 제공되어 있다. 각각은 표 4에 기술된 카탈로그 번호, 공급처, 또는 NCBI 수탁 번호를 참고로 하여 구체적으로 포함된다. 이들 케모카인은 표 4에 기술된 공급처로부터 구매가능하다.
본원에 사용될 때 "CC 케모카인 결정부위"라는 용어는 항체의 항원 결합 잔기가 접촉하는 CC 케모카인의 부분을 나타낸다. 이 용어는 비선형 에피토프를 포함하는 입체 배좌적 에피토프분만 아니라 CC 케모카인 상의 항카인 항체에 의해 인식되는 통상적인 선형 에피토프도 포함한다. 항카인 항체가 결합하는 또는 이의 항원 결합 아미노산 잔기와 직접적으로 접촉하는 CC 케모카인의 하나 이상의 부분이 이의 결정부위이다. CC 케모카인의 항원 결정부위의 제거, 대체, 파괴 또는 변성은 항카인 항체가 CC 케모카인에 결합하는 능력을 감소시키거나 없앨 수 있다. 항체 결합 에피토프를 결정하는 방법은 참고로 포함된 문헌[Ladner, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 24:1-30 (2007)]에 예시된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다. CC 케모카인 결정부위는 케모카인 수용체(CCR1 또는 CCR5)에의 결합에 연루된 세그먼트 또는 도메인, 예컨대 이의 N-루프, β-1, 2 및 3 가닥, 30번대, 40번대 및 50번대 루프 및 이의 C 말단 나선형 세그먼트를 포함하며, 이들 결정부위는 문헌[Fernandez & Lolis, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42:469 (2002)], 문헌[Viola, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48: 171], 및 문헌[Pakianathan, et al., Biochem. 36(32):9642 (1997)]을 참고로 하여 포함된다.
또한 CC 케모카인 결정부위는 백시니아 바이러스의 vCCI가 결합하는 CC 케모카인 결정부위와 같이 병원체 유래의 단백질의 결합에 의해 규정되며, 이들 결정부위는 문헌[Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 103(38): 13985-13990 (2006)]을 참고로 하여 포함된다.
"결합하다" 또는 "결합하는"이라는 용어는 두 상이한 물질들 사이의 화학적 또는 물리적 접촉 또는 상호작용을 나타낸다. 이것은 항카인 항체와 상응하는 결정부위, 예컨대 CC 케모카인 분자상의 에피토프 사이의 회합을 포함한다. 이러한 접촉 또는 상호작용은 이온, 비이온, 수소 결합, 반데르 발스 결합, 소수성 결합, 또는 기타 공지된 유형의 분자간 결합 중 하나 이상에 의한 것일 수 있다. 결합은 리간드와 이의 상응하는 수용체와 같은 두 분자들 사이의 직접적인 접촉, 또는 링커 또는 2가 또는 다가 모이어티를 통한 공유 또는 비공유 결합과 같은 개재 모이어티를 통한 간접적인 것을 포함할 수 있다.
"결합 친화성"은 항체와 항원의 결합 및 해리의 속도 상수들 사이의 비인 친화도 상수 Ka로 기술된다. IgG 항체에 있어서의 전형적인 친화도는 10-5 내지 10-9 mole/L이다. 항체 친화도는 당해 분야에 공지된 다수의 상이한 기술에 의해 측정되며, 이는 평형 투석, 표면 플라스몬 공명(비아코어(BIAcore)®), 및 운동 배제 분석법 (kinetic exclusion assay)(키넥사(KinExA)®)을 포함한다. 결합 및 자유 항원과 항체 친화도 사이의 관계는 스캐차드(Scatchard) 등식, r/c = Kn - Kr로 표현되며, 여기서, r = [결합 항원] 대 [전체 항체]의 비, c = [자유 항원], K = 친화도, 및 n = 항체 분자당 결합 부위의 수(결합가). 모든 항체가 항원에 대하여 동일한 친화도를 가질 경우(예를 들어, 단클론 항체), r/c 대 r의 그래프는 -K의 기울기 및 n에 가까운 r의 절편을 갖는 직선을 생성한다. 항체가 불균질할 경우(예를 들어, 다클론), r/c 대 r의 그래프는 곡선을 생성하며, 평균 친화도는 결합 부위의 절반이 채워질 때(r = 1) 곡선의 기울기에 의해 결정될 수 있다.
"CC 케모카인에 특이적으로 결합하는"이라는 어구는 항체 또는 항체 단편과 특정 CC 케모카인 또는 CC 케모카인 세트와의 배경보다 큰 상호작용 - 그러나 다른 케모카인과는 아님 - 을 기술한다. CC 케모카인은 CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, 및 CCL5/RANTES를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, CC 케모카인 세그먼트 또는 도메인의 예는 이의 케모카인 수용체 결합 잔기, 이의 N-루프, β-1, 2 및 3 가닥, 30번대, 40번대 및 50번대 루프 및 이의 C 말단 나선형 세그먼트를 포함한다. CC 케모카인 또는 이의 도메인 또는 세그먼트들 중 하나에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어 면역분석법, 표면 플라스몬 공명(비아코어®), 또는 당해 분야에 공지된 기타 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 더욱 낮은 친화성으로 다른 항원에 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 CC 케모카인에 결합하는 능력이 동일한 농도에서 그리고 동일한 조건하에 비교될 때 또 다른 항체 또는 대조 항체와 비교하여 4배 또는 그 초과인 항카인 항체는 CC 케모카인에 특이적으로 결합하는 것으로 간주된다. 그러나, 결합의 양 또는 친화성의 유의한 차이를 확립하는 다른 비교용 결합 기준이 사용될 수 있으며, 이들은 항카인 항체의 경우 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100 또는 1000배 더 많은 양의 결합성 또는 2, 5, 10, 15, 20, 100배 또는 적어도 1,000배 더 큰 결합 친화성을 포함한다.
2종, 3종, 4종, 5종 이상의 CC 케모카인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 단편은 다른 비케모카인 항원 또는 비CC 케모카인과 교차반응할 필요는 없다. CC 케모카인 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항카인 항체 또는 단편은 면역분석법, 비아코어, 또는 당업자에게 공지된 기타 기술에 의해 확인될 수 있다. 항체 또는 이의 단편은 웨스턴 블롯, 방사면역분석법(RIA) 및 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 결정되는 바와 같이 CC 케모카인 항원 또는 이의 단편에 임의의 교차 반응성 항원에 대한 것보다 더 높은 친화도로 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항체 특이성에 관한 논의에 대해서는 문헌[Paul, ed, Fundamental Immunology, Second Edition, Raven Press, New York (1989), pages 332-336]을 참조한다.
용어 "억제 농도"는 대조와 비교할 때 CC 케모카인 활성을 예를 들어 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 최대 100%만큼 감소시키는 항체, 예컨대 항카인 항체 또는 이의 CC 케모카인-결합 단편의 농도를 나타낸다. CC 케모카인 활성은 생체내 또는 시험관내에서 결정되며 CC 케모카인 활성, 예컨대 화학주성의 분석을 포함할 수 있다. 이러한 분석은 칼슘 유동 또는 인테그린 활성화를 포함한다. 항카인 항체 또는 이의 CC 케모카인 결합 단편과, 대조 항체, 예컨대 CC 케모카인에 결합하지 않는 것 또는 단일 케모카인에 결합하는 것의 조정 효과가 또한 생체내 동물 모델에서 결정될 수 있으며, 이는 염증 및 자가면역과 같은 면역 현상의 CC 케모카인 활성화를 측정하는 것을 포함한다. 케모카인 활성의 억제는 억제제의 존재하에 케모카인의 하나 이상의 활성이 억제제의 부재하에서의 활성과 비교하여 상대적으로 감소되게 하는 것을 나타낸다. 억제는 예를 들어 케모카인 상의 활성 부위에의 항체 결합에 의한, 또는 케모카인을 효과적으로 제거하거나 고정하거나 불활성화시키는 결합에 의한 케모카인 활성의 길항작용 또는 중화를 포함할 수 있다. "화학주성 억제"라는 용어는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 부재하에 관찰되는 화학주성 활성과 비교한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 존재하에서의 세포의 화학주성 활성의 상대적인 양의 감소를 나타낸다. 상이한 백혈구 세포 유형을 포함하는 특정 유형의 세포의 주화 억제를 측정하는 공지된 방법을 이용가능하며 이는 문헌[Chemokine Protocols, Meth. in Mol. Biol. 138 (2000), Humana Press, Eds. AEI Proudfoot, TNC Wells, and CA Power]을 참고로 하여 포함된다.
"단리된" 또는 "정제된" 생성물 또는 성분에는 그 생성물 또는 성분이 유래된 세포 또는 조직 공급원 유래의 세포 물질 또는 기타 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 단리된 또는 정제된 성분, 분자 또는 다른 물질(펩티드, 폴리펩티드, 항체, 케모카인, 폴리핵산 또는 세포)은 이의 통상적인 또는 자연적인 또는 고유한 환경으로부터 옮겨진 또는 그로부터 별도로 합성된 것이다. 또한 단리된 또는 정제된 생성물 또는 성분은 이것이 관련된 혼합물 또는 성분 - 요망되지 않는 생물학적 오염물질, 또는 합성될 경우, 이의 합성과 관련된 기재 또는 부산물에 의한 오염물질을 포함함 - 으로부터 물리적으로 또는 화학적으로 옮겨지거나 또는 분리될 수 있다. 정제는 다른 성분의 1, 5, 10, 50, 75, 90, 95 또는 100%의 제거를 포함하는 임의의 정도로 연장될 수 있다. 항체의 경우, 단리는 혈액 또는 혈청으로부터의 옮겨짐, 또는 단클론 항체의 경우 복수 또는 조직 배양액으로부터의 옮겨짐을 구성할 수 있다.
"핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA 분자와 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 항카인 항체 유사체 또는 변이체의 부분을 코딩할 수 있다. 이러한 유사체는 예를 들어 이노신 또는 트리틸화된 염기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 제조될 수 있다. 또한 이러한 유사체는 예를 들어 뉴클레아제 저항성 또는 세포막을 가로지르는 능력 증가와 같이 DNA 또는 RNA 분자에 유익한 속성을 더해주는 변형된 골격을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있으며, 단일 가닥 및 이중 가닥 부분 둘 모두를 포함할 수도 있고, 삼중 가닥 부분을 포함할 수도 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. "단리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자에는 재조합 기술에 의해 제조될 때에는 배양 배지, 또는 다른 세포 물질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때에는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 단리 또는 정제된다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "숙주 세포"라는 용어는 핵산 분자로 트랜스펙션된 특정 대상 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 나타낸다. 이러한 세포의 자손은 다음 세대에서 일어날 수도 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 통합으로 인하여 핵산 분자로 트랜스펙션된 모 세포와 동일하지 않을 수도 있다. 숙주 세포를 이용하여 항카인 항체 또는 이의 구성요소들 중 하나, 예를 들어 이의 경쇄 또는 중쇄 또는 단편을 재조합으로 발현시킬 수 있다.
두 핵산 또는 아미노산 서열의 "동일성 퍼센트"의 결정을 위하여, 서열을 먼저 최적의 비교의 목적을 위하여 정렬시킨다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위하여 제1 아미노산 또는 핵산 서열 내에 갭을 도입할 수 있음). 그 후 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 그 서열이 공유하는 동일한 위치들의 수의 함수이다(즉, 동일성(%) = 동일한 중복 위치의 수/위치의 총수 x 100). 일 실시양태에서, 두 서열은 길이가 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학 알고리즘을 이용하여 또한 달성될 수 있다. 두 서열의 비교에 이용되는 수학 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예로는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264-2268 (1990)]의 알고리즘이 있으며, 이는 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5877 (1993)]에서와 같이 변경된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 탐색은 NBLAST 뉴클레오티드 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12를 이용하여 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 대하여 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 탐색은 XBLAST 프로그램 파라미터 세트, 예를 들어 스코어 = 50, 단어 길이 = 3을 이용하여 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 대하여 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 형성된 정렬을 얻기 위하여 Gapped BLAST를 이용할 수 있으며 이는 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]에 기술된 바와 같다. 대안적으로, 분자들 사이의 먼 관계를 탐지하는 반복된 탐색을 수행하기 위하여 PSI-BLAST를 이용할 수 있다(동일 문헌). BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST의) 디폴트 파라미터가 이용될 수 있다. 서열 비교에 이용되는 수학 알고리즘의 또 다른 바람직한 비제한적 예로는 문헌[Myers and Miller, CABIOS 4: 11-17 (1988)]의 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내에 포함되어 있다. 아미노산 서열 비교를 위한 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM 120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티가 사용될 수 있다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 갭을 허용하거나 허용하지 않고서 상기에 기술된 것과 유사한 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트의 계산에 있어서, 전형적으로 단지 정확한 매치가 카운팅된다.
"보존적 변화"는 입체 배좌적으로 또는 항원과 관련하여 실질적으로 중성이어서, 모 또는 천연 펩티드 또는 폴리펩티드와 비교할 때 펩티드 도는 폴리펩티드 변이체의 3차 구조에서 최소의 변화를 생성하거나, 또는 변이체 또는 유사 펩티드 또는 폴리펩티드의 항원 결정부위에서 최소의 변화를 생성하는 변경을 나타낸다. 케모카인의 맥락에서, 보존적 변화는 예를 들어 화학주성의 유도, 케모카인 네트워크에의 참여와 같은 기능을 포함하는, 또는 다르게는 효소 또는 사이토카인 생성을 유도하는, 또는 모 또는 천연 케모카인의 수용체에 결합하는 모 케모카인의 하나 이상의 기능을 나타내는 기능에 의해 결정할 때 생성된 케모카인 변이체 또는 유사체의 특이성 및/또는 친화성에 실질적으로 영향을 주지 않는 아미노산 치환을 포함한다. CDR 세그먼트를 포함하는 항체 단편, 항체의 변이체 또는 유사체에 적용될 때, 보존적 변화는 상응하는 비변형 항체 생성물과 동일한 에피토프 또는 항원에 결합할 수 있는 항체 생성물을 생성하는 아미노산 치환을 나타낸다. 어느 아미노산 치환이 분자의 입체 배좌적인 항원 중화성을 유지하는가에 대한 예측은 문헌[Berzofsky, Science 229:932-940 (1985)] 및 문헌[Bowie, et al., Science 247: 1306-1310 (1990)]에 기술된 바와 같이 당해 분야의 기술 이내이다. 어느 치환이 입체 배좌적인 항원 중화성을 유지할 가능성이 가장 큰가에 대한 안내는 (a) 소수성 아미노산의 치환이 항원성에 영향을 줄 가능성이 덜하며 그 이유는 소수성 잔기가 단백질 내부에 위치할 가능성이 더 크기 때문이라는 것, (b) 물리화학적으로 유사한 아미노산의 치환이 입체 배좌에 영향을 줄 가능성이 덜하며 그 이유는 치환된 아미노산이 천연 아미노산을 구조적으로 모방하기 때문이라는 것, 및 (c) 진화론적으로 보존된 서열의 변경은 입체 배좌에 악영향을 줄 가능성이 있으며 그 이유는 이러한 보존은 아미노산 서열이 기능적 중요성을 가질 수 있음을 시사하기 때문이라는 것을 포함한다.
"조성물" 또는 "약학 조성물 또는 치료 조성물"은 CC 케모카인에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키거나 또는 이것을 치료하는 항카인 항체 또는 이의 CC 케모카인 결합 단편 또는 이의 다른 단편을 함유하는 용액, 또는 부형제, 담체의 조합물을 나타낸다. "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 본 발명의 분자와 양립가능하고 의약품 투여에 적합한, 임의의 그리고 모든 담체 및 부형제, 예컨대 희석제, 용매, 분산제, 에멀젼, 지질 이중층, 리포좀, 코팅, 항균제 또는 항진균제를 포함하는 보존제, 등장제, pH 완충제, 흡수 조정제 등을 포함한다. 제약적 활성 물질의 투여를 위한 이러한 담체, 붕해제, 부형제 및 에이전트의 사용은 당해 분야에 공지되어 있으며, 참고로 포함된 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, Am. Pharm. Assoc. (2000)]을 참조한다. 본 발명의 약학 조성물은 일반적으로 비경구, 경구 또는 국소 투여와 같은 의도된 투여 경로와의 양립가능성을 위하여 제제화된다.
본 발명의 치료 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 중에 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 항체 단편을 함유한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분, 생물학적 생성물 또는 약물과 통상적으로 혼합되어 이의 투여에 사용되는 하나 이상의 성분이다. 담체는 당해 분야에서 사용되는 임의의 약학 부형제 및 투여용의 임의의 형태의 비히클을 함유할 수 있다. 조성물은 예를 들어 주사가능 용액, 수성 현탁액 또는 용액, 비-수성 현탁액 또는 용액, 스프레이, 고형 및 액상 경구 제형, 고약, 겔, 연고, 피내 패치, 크림, 로션, 정제, 캡슐, 서방성 제형 등일 수 있다. 추가의 부형제는 예를 들어 착색제, 맛 차폐제, 용해 보조제, 현탁제, 압축제, 장용 코팅, 지속 방출 보조제 등일 수 있다. 적합한 투여 형태는 문헌[U.S. FDA CDER Data Standards Manual C-DRG-00201, Version 08]에 기술된 것; 또는 FDA 웹사이트 http://www.fda.gov/Forlndustry/DataStandards/StructuredProductLabeling/ucm 162038.htm(2010년 8월 9일에 마지막으로 접근함)에 열거된 것과 같은 형태로부터 당업자에 의해 선택될 수 있으며, 상기 문헌 및 웹사이트 둘 모두는 본원에 참고로 포함된다.
경구 투여되는 조성물은 고형 담체 또는 부형제를 포함할 수 있거나, 또는 액상 또는 겔 제제로 제제화될 수도 있으며 식용 또는 불활성 담체를 포함할 수도 있으며 캡슐 내에 봉입되거나, 정제로 압착되거나, 트로키제로 제제화될 수도 있다. 경구 투여되는 조성물은 정시 방출형 또는 캡슐화된 형태로 제조되어 위에서의 분해가 방지하고 분자의 흡수를 최적화할 수 있다.
주사용 조성물은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제제화될 수 있으며, 치료분자의 살균 용액 또는 분산액을 포함할 수 있다. 이러한 것은 일반적으로 살균 희석제, 예컨대 물, 보통의 염수, 또는 본 발명의 분자와 양립가능한 기타 완충제를 포함한다. 주사용 조성물은 단위 투여형으로 또는 단위 용량 용기 형태, 예컨대 바이알, 앰풀, 또는 시린지 형태로 제조될 수 있다.
통상적인 완충제 및 등장제가 사용될 수 있으며, pH는 공지된 에이전트, 예컨대 HCl 또는 NaOH 또는 완충제를 사용하여 조정될 수 있다. 항미생물제 또는 정균제, 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 EGTA, 및 항산화제 및 보존제가 존재할 수 있다.
본 발명의 치료 조성물은 점막상에의 국소 투여, 경구 투여 또는 장 투여 또는 비경구 투여를 포함하는 임의의 허용되는 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 이들 경로는 국소, 경점막, 경구(협측, 설하), 점막(결막, 비강, 부비동, 요도, 질, 장, 직장을 포함함), 장, 경피, 피내, 피하(s.c.), 근육내, 복강내, 정맥내(i.v.), 심장내, 관절 또는 뼈 내, 기관(뇌, 척수, 눈, 귀, 간, 비장, 신장, 담낭, 방광) 내, 뼈, 연골 또는 관절 조직 내, 흡입 (예를 들어, 비강내, 기관내, 폐내, 또는 기관지내), 경구, 협측에 의한 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 경로는 본원에 참고로 포함된 문헌[U.S. FDA, CDER, Data Standards Manual "Routes of Administration", CDRG-00301, Version 004]에 열거된 것으로부터; 또는 http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/DrugRegistrationandListing/ucm08403 9.htm(2010년 8월 9일에 마지막으로 접근함)에서 입수가능한 표 2로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다.
"치료 유효량"은 CC 케모카인에 의해 매개되는 질병, 장애 또는 질환의 중증도를 감소시키거나 이것을 치료하기에 충분한, 질병, 장애 또는 질환의 또 다른 요법의 치료학적 효능을 향상시키기에 충분한, 또는 질병, 장애 또는 질환 또는 이의 증상들 중 하나 이상의 중증도 증가 또는 재발을 방지하기에 충분한 치료제의 양을 나타낸다. 치료 유효량은 질환의 발병을 지연시키거나 최소화하기에 충분한 치료제의 양을 나타낼 수 있다. 또한 치료 유효량은 질환의 치료 또는 관리에 있어서 치료학적 이득을 제공하는 치료제의 양을 나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제와 관련된 치료 유효량은 질환의 치료 또는 관리에 있어서 치료학적 이득을 제공하는, 단독의 또는 다른 요법과 조합된 치료제의 양, 예를 들어 질환을 치료 또는 관리하기에 충분한 치료학적 항체의 치료학적 효능을 향상시키기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 항체의 양과 관련되어 사용될 경우, 상기 용어는 전체 요법을 개선시키거나, 원하지 않는 효과를 감소시키거나 회피하거나, 또는 또 다른 치료제의 치료학적 효능을 부가적으로 향상시키거나, 또는 또 다른 치료제와 상승작용을 하는 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "피험체" 또는 "환자"라는 용어는 조류 및 포유류(예를 들어, 소, 말, 돼지, 염소, 양, 개, 또는 고양이) 및 바람직하게는 인간을 포함하여 CC 케모카인을 발현하는 척추 동물을 나타낸다. 피험체 또는 환자는 유효량의 항카인 항체를 이용한 치료를 필요로 하는 것일 수 있으며, 상기 항체는 이것이 인식하는 CC 케모카인의 CC 케모카인 활성을 조정한다.
"염증성 질병, 장애 또는 질환"은 부종, 열, 화학주성 또는 백혈구의 이동, 혈관 증식, 결합 조직 증식, 발적, 국소적 열, 삼출, 및 문헌[Robbins, The Pathological Basis of Disease, 6th edition, Cotran, et al. (eds.), W. B. Saunders, Co. (1999)], 특히 제3장, 제7장 및 제15장에 기술된 다른 징후를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 명백한 또는 정량 가능한 생리학적 현상을 나타낸다. CC 케모카인에 대한 항카인 항체의 맥락에서, 이 용어는 CC 케모카인, 예컨대 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, 또는 기타 케모카인과 관련된 또는 그에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 매개되는 현상을 나타낸다.
"면역친화성 수지"는 하나 이상의 면역학적 리간드 또는 수용체가 결합하는 고형 기재를 나타낸다. 예를 들어, 항카인 항체는 이의 항원 연합 부위 이외의 영역을 통하여 수집에 결합됨으로써 항체가 CC 케모카인 상의 항원 결정부위에 결합하게 할 수 있다. 이와 유사하게, CC 케모카인은 수지에 작동적으로 결합하여 이것이 항카인 항체에 결합하는 것을 가능케 할 수 있다. 면역학적 리간드 또는 수용체의 고정화에 유용한 다수의 수지는 당해 분야에 공지되어 있으며, 면역친화성 수지의 형성에 일상적으로 사용된다. 이러한 수지는 면역학적 분석법에서 또는 정제 절차에서 특정 리간드 또는 수용체가 결합하는 성분의 분석에 유용하다. 임의의 이러한 수지는 본 발명의 면역친화성 수지의 형성에 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CC 케모카인에 대한 다수의 항체의 투여와 관련된 종래 기술의 문제를 해결하는 수단을 추구하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 하나 초과의 유형의 CC 케모카인에 결합할 수 있는 항체인 항카인 항체를 발견하였다. 이러한 항카인 항체는 염증성 질환 세팅에서 단일 케모카인 또는 단일 케모카인 수용체의 억제에 비하여 개선을 나타내며, 그 이유는 단지 단일한 항체가 다수의 케모카인의 기능 차단에 필요하기 때문이다. 또한 본 발명의 항카인 항체는 각각의 항체에 있어서의 불편한 별도의 투약 섭생법의 사용과 같이 상이한 약동학적 특성을 갖는 2종 이상의 항체의 투여의 단점을 회피한다. 항카인은 특정 케모카인 항원에 결합하는 것이 덜 효과적이며 Fc 수용체에 더욱 쉽게 결합하는 복합체를 형성하고 그에 따라 세포에 의해 흡수되고 리소좀에서 분해되는 2특이성 항체의 단점을 회피한다.
본원에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 다수의 케모카인에 의해 매개되는 인간 염증성 및 면역학적 질병, 장애 및 질환의 치료를 단순화할 수 있는 몇몇 항카인 항체를 제공한다. 이들 항카인 항체는 친수성 성숙 및 항체 인간화와 같은 공정에 의해 훨씬 더 효과적이고 안전한 항카인 항체를 생성하는 구조적 및 기능적 원형으로서의 역할을 한다.
항카인 항체는 2종 이상의 CC 케모카인에 결합하여 이의 활성을 억제한다. MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및 MCP-1를 포함하는 CC 케모카인을 표적화함으로써, 본 발명자들은 동일하거나 상이한 케모카인 수용체(CCR1, CCR2, CCR3, 및 CCR5를 포함함)를 활성화시키는 케모카인의 조정에 유용한 항체를 확인하였다. 예를 들어, MIP-1α, MIP-1β, 및 RANTES 각각은 케모카인 수용체 CCR5에 결합하기 때문에, 이들 3종의 CC 케모카인을 인식하는 항카인 항체는 단일 CC 케모카인에의 것보다 더 철저히 조정할 수 있다. CCR5 활성화는 미성숙 골수성 수지상 세포, 단구, Th 1, Treg, NK 및 형질세포양 수지상 세포를 표적화한다. 이와 유사하게, MIP-1α, RANTES, MPIF-1 및 HCC-1 각각은 CCR1에 결합하며, 이 활성화는 단구, 기억 T 세포 및 NK 세포를 표적화한다. 이들 CCR1-결합 케모카인 중 2종 이상에의 항카인 항체 결합은 수용체 활성화를 더욱 철저히 조정한다. 그러면 MIP-1α 및 RANTES 둘 모두에 결합하여 이들을 억제할 수 있는 항체는 CCR1 및 CCR5 둘 모두의 일차적인 리간드 중 2종을 효과적으로 차단한다. 따라서, 본 발명자들은 염증성 질환에 연루된 단구 및 T 세포를 포함하는 백혈구 상에서 발현되는 상이한 케모카인 수용체의 일차적인 리간드를 억제하는 항카인 항체를 확인하였다. 케모카인의 이들 조합물들 중 어느 하나의 억제제는 염증성 질환 세팅에 있어서 단일 케모카인 억제(또는 단일 케모카인 수용체에의 결합을 차단하는 항체)에 비하여 개선을 제공하며 그 이유는 단지 단일 항체가 단일 수용체 상에서의 다수의 케모카인의 기능 또는 다수의 수용체 상에서의 케모카인 활성을 차단하는 데 필요하기 때문이다.
항카인 항체는 이것이 결합하는 케모카인에 따라 상이한 특이성 및 기능적 활성을 갖는다. 본 발명은 다양한 CC 케모카인에, 그리고 유리하게는 RANTES, MIP-1α, MIP-1β 및/또는 MCP-1 중 적어도 2종에 특이적으로 결합하는 항카인 항체를 제공한다. 추가로 본 발명은 RANTES와 MIP-1α 둘 모두; RANTES와 MIP-1β 둘 모두; RANTES와 MCP-1 둘 모두; MIP-1α와 MIP-1β 둘 모두; MIP-1α와 MCP-1 둘 모두; 또는 MIP-1β와 MCP-1 둘 모두에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 이와 유사하게, 본 발명은 RANTES, MIP-1α, MIP-1β 및/또는 MCP-1 중 3종 또는 4종에 결합하는 항카인 항체와, 다른 밀접하게 관련된 CC 케모카인에 결합하는 항카인 항체를 제공한다.
케모카인에의 항체 또는 항원 결합 항체 단편의 결합은 케모카인의 에피토프 또는 항원 결정부위 및 항체의 항원 결합 부위(ABS) 내의 아미노산 잔기 사이의 접촉에 의해 일어난다. 에피토프는 다수의 항원 결정부위, 심지어 선형 인접 아미노산 서열의 부분을 형성하지 않는 단일 아미노산 또는 아미노산 측기를 포함하는 선형 펩티드 서열 또는 입체 배좌 에피토프일 수 있음이 공지되어 있다. 예를 들어, α-나선의 한 면상에 있는 잔기는 항체의 ABS에 의해 접촉될 수 있는 반면, 반대면상의 것은 그렇지 않다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 항체 단편은 신호 펩티드를 함유하지 않는 성숙 CC 케모카인의 N 말단 또는 C 말단 절반에 결합할 수 있다. 예를 들어, 인간 RANTES의 성숙형은 신호 펩티드 잔기 1-23이 결여되어 있다. 따라서, 이의 N 말단 부분은 잔기 1-35의 범위이며, 이의 C 말단은 36-68의 범위이다(서열 번호 73).
본 발명의 항체 및 항원 결합 항체 단편은 케모카인이 이의 수용체에 결합하는 것과 관련된 CC 케모카인 잔기에의 결합에 의한 CC 케모카인 결합을 차단할 수 있다. CC 케모카인의 제안된 기능적 도메인에 대해서는 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111 [uid]; http://www.ncbi. nlm.nih.gov/sites/entrez(2010년 8월 9일에 마지막으로 접근함)를 참조한다. 예상되는 결합 부위 잔기가 하기에 CC 케모카인 각각에 대하여 나타내어져 있다:
서열 번호 71의 CCL3/MIP-1α 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC), 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE);
서열 번호 72의 CCL4/MIP-1β 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC), 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE);
서열 번호 73의 CCL5/RANTES 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC), 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE).
서열 번호 78의 CCL14/HCC-1 잔기 8-12(CCFTY), 잔기 14-21(TYKIPRQR), 잔기 31-32(QC), 잔기 54-64(KWVQD YIKDMK).
서열 번호 79의 CCL15/HCC-2 잔기 8-12(CCTSY), 잔기 14-21(SQSIPCSL), 잔기 31-32(EC), 또는 잔기 54-64(PGVQDCMKKLK).
서열 번호 81의 CCL23/MPIF-1 잔기 9-13(CCISY), 잔기 15-22(PRSIPCSL), 잔기 32-33(EC), 또는 잔기 55-65(KQVQVCMRMLK).
서열 번호 82의 CCL18/PARC 잔기 10-14(CCLVY), 잔기 16-23(SWQIPQKF), 잔기 33-34(QC), 또는 잔기 56-66(KWVQKYISDLK).
이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 다른 관련 CC 케모카인뿐만 아니라 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES 중 적어도 2종의 세그먼트 - 이는 상기 케모카인의 이의 수용체에의 결합에 연루됨 - 에 결합할 수 있다. 항카인, 예컨대 3C12F는 vCCI와 같은 케모카인 결합 바이러스 단백질과 동일한 결정부위에 결합할 수 있거나, 또는 이러한 바이러스 단백질이 케모카인에 결합하는 것을 억제할 수 있다.
CC 케모카인 RANTES, MIP-1α 및/또는 MIP-1β에 결합하는 단클론 항체 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E는 본 발명자들에 의해 생성되고 특성화되었다. 이들 항체는 다수의 CC 케모카인의 활성을 동시에 조정할 수 있는 인간화 항체의 개발을 위한, 그리고 CC 케모카인에 의해 매개되는 염증성 질환의 치료를 위한 초가변 영역 및 경쇄 및 중쇄 CDR로부터의 구조적 정보를 포함하는 필요한 정보를 제공한다.
상기 3종의 MAb의 초가변 및 CDR 서열은 3C12F의 경우 서열 번호 2-5 및 7-10; 인간화 3C12F의 경우 서열 번호 52-55 및 57-60; 7D12A의 경우 서열 번호 12-15 및 17-20; 7D1G의 경우 서열 번호 22-25 및 27-30; 18V4F의 경우 서열 번호 32-35 및 37-40; 인간화 18V4F의 경우 서열 번호 62-65 및 67-70; 및 18P7E의 경우 서열 번호 42-45 및 47-50으로 표현된다.
특정 항카인 항체 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E를 특징으로 하는 5종의 특정 유형의 항카인 항체가 개시된다. 게다가, 3C12F 및 18V4F의 인간화 버전이 개시된다.
제1 유형의 항체는 하이브리도마 세포주 3C12F 또는 이의 계대배양물에 의해 만들어지는 단클론 항체의 결합 특이성에 의해 특성화된다. 단클론 항체(MAb)의 이러한 유형의 전형적인 항체로는 3C12F가 있다. 따라서 이러한 유형은 MAb 3C12F와, 이의 유사체 및 유도체를 포함하며, 이는 친화성 성숙 공정에 의해 또는 인간화에 의해 생성된 항체를 포함한다. 3C12F형의 항체는 서열 번호 2 또는 52로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 3C12F 중쇄의 CDR1(서열 번호 3 또는 53), CDR2(서열 번호 4 또는 54) 및 CDR3(서열 번호 5 또는 55) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 서열 번호 7 또는 57의 서열을 포함하거나, 서열 번호 8 또는 58의 CDR1, 서열 번호 9 또는 59의 CDR2, 및 서열 번호 10 또는 60으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 서열 번호 2-5 및 7-10은 비인간화 3C12F를 기술하는 반면, 서열 번호 52-55 및 57-60은 인간화 3C12F를 기술한다. 인간화 3C12F는 서열 번호 52로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 3C12F 중쇄의 CDR1(서열 번호 53), CDR2(서열 번호 54) 및 CDR3(서열 번호 55) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함한다. 이러한 항체는 서열 번호 57의 서열을 포함하거나 서열 번호 58의 CDR1, 서열 번호 59의 CDR2, 및 서열 번호 60으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
제2 유형의 항체는 하이브리도마 세포주 7D12A 또는 이의 계대배양물에 의해 만들어지는 단클론 항체의 결합 특이성에 의해 특성화된다. 단클론 항체(MAb)의 이러한 유형의 전형적인 항체로는 7D12A가 있다. 따라서 이러한 유형은 MAb 7D12A와, 이의 유사체 및 유도체를 포함하며, 이는 친화성 성숙 공정에 의해 또는 인간화에 의해 생성된 항체를 포함한다. 7D12A 항체 유형의 항체는 서열 번호 12로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 7D12A 중쇄의 CDR1(서열 번호 13), CDR2(서열 번호 14) 및 CDR3(서열 번호 15) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함할 수 있다. 이는 또한 서열 번호 17의 서열을 포함하거나, 서열 번호 18의 CDR1, 서열 번호 19의 CDR2, 및 서열 번호 20으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
제3 유형의 항체는 하이브리도마 세포주 7D1G 또는 이의 계대배양물에 의해 만들어지는 단클론 항체의 결합 특이성에 의해 특성화된다. 단클론 항체(MAb)의 이러한 유형의 전형적인 항체로는 7D1G가 있다. 이러한 유형은 MAb 7D1G와, 이의 유사체 및 유도체를 포함하며, 이는 친화성 성숙 공정에 의해 또는 인간화에 의해 생성된 항체를 포함한다. 7D1G형의 항체는 서열 번호 22로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 7D1G 중쇄의 CDR1(서열 번호 23), CDR2(서열 번호 24) 및 CDR3(서열 번호 25) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함할 수 있다. 이는 또한 서열 번호 27의 서열을 포함하거나, 서열 번호 28의 CDR1, 서열 번호 29의 CDR2, 및 서열 번호 30으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
제4 유형의 항체는 하이브리도마 세포주 18V4F 또는 이의 계대배양물에 의해 만들어지는 단클론 항체의 결합 특이성에 의해 특성화된다. 단클론 항체(MAb)의 이러한 유형의 전형적인 항체로는 18V4F가 있다. 이러한 유형은 MAb 18V4F와, 이의 유사체 및 유도체를 포함하며, 이는 친화성 성숙 공정에 의해 또는 인간화에 의해 생성된 항체를 포함한다. 18V4F형의 항체는 서열 번호 32 또는 62로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 18V4F 중쇄의 CDR1(서열 번호 33 또는 63), CDR2(서열 번호 34 또는 64) 및 CDR3(서열 번호 35 또는 65) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함할 수 있다. 이는 또한 서열 번호 37 또는 67의 서열을 포함하거나, 서열 번호 38 또는 68의 CDR1, 서열 번호 39 또는 69의 CDR2, 및 서열 번호 40 또는 70으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 서열 번호 32-35 및 37-40은 비인간화 18V4F를 기술하는 반면, 서열 번호 62-65 및 67-70은 인간화 18V4F를 기술한다. 인간화 18V4F는 서열 번호 62로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 18V4F 중쇄의 CDR1(서열 번호 63), CDR2(서열 번호 64) 및 CDR3(서열 번호 65) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함한다. 이러한 항체는 서열 번호 67의 서열을 포함하거나 서열 번호 68의 CDR1, 서열 번호 69의 CDR2, 및 서열 번호 70으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
제5 유형의 항체는 하이브리도마 세포주 18P7E 또는 이의 계대배양물에 의해 만들어지는 단클론 항체의 결합 특이성에 의해 특성화된다. 단클론 항체(MAb)의 이러한 유형의 전형적인 항체로는 18P7E가 있다. 이러한 유형은 MAb 18P7E와, 이의 유사체 및 유도체를 포함하며, 이는 친화성 성숙 공정에 의해 또는 인간화에 의해 생성된 항체를 포함한다. 18P7E형의 항체는 서열 번호 42로 표현되는 중쇄 가변 영역 또는 18P7E 중쇄의 CDR1(서열 번호 43), CDR2(서열 번호 44) 및 CDR3(서열 번호 45) 중 적어도 하나를 함유하는 중쇄를 포함할 수 있다. 이는 또한 서열 번호 47의 서열을 포함하거나, 서열 번호 48의 CDR1, 서열 번호 49의 CDR2, 및 서열 번호 50으로 나타낸 CDR3 중 적어도 하나를 함유하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
상기에 기술된 항카인 항체의 특정 유형에 더하여, 본 발명은 3종, 4종, 5종 이상의 CC 케모카인에 결합하는 항카인 항체, 예를 들어 MIP-1α, MIP-1β, RANTES 및/또는 기타 관련 CC 케모카인에 결합하는, MAb 3C12F 및 상기에 기술된 기타의 것과 같은 항카인 항체를 포함한다. 유리하게는, 항카인 항체는 특정 CCR에 결합하는 모든 CC 케모카인에 대하여 생성될 수 있거나, 또는 특정 질병, 장애 또는 질환에 연루된 CC 케모카인에 대하여 표적화될 수 있다.
항카인 항체는 이것이 CC 케모카인에 결합하는 것을 가능케 하기에 충분한 결합 친화성을 갖는다. 예시적인 결합 친화성은 이것이 결합하는 CC 케모카인에 대하여 1,000, 900, 800, 400, 200, 150, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.1 nM 또는 그 미만을 포함한다. 그러나, 이것은 도면에 예시된 바와 같이 상이한 CC 케모카인에 대하여 결합 친화성이 상이할 수 있다.
적절한 결합 친화성을 갖는 항체의 선택은 당해 분야의 기술 이내이다. 다수의 치료학적 목적에 있어서, 높은 친화성을 갖는 항체가 낮은 친화성을 갖는 것보다 더 바람직하며, 예를 들어, 수동적으로 투여되는 높은 친화성의 항체는 생체내에서 낮은 친화성의 항체보다 더 효율적으로 항원을 제거하는 것으로 입증되었으며, 더 높은 친화성의 항체는 더욱 낮은 수준의 순환 면역 복합체를 생성하여 사구체 기능을 덜 손상시켰다(문헌[Steward, Antibodies: Their Structure and Function, Taylor and Francis (1984)], 표 4.5를 참조하는데, 항체 친화성 결정 방법과, 낮은 그리고 높은 친화성의 항체의 특성 및 기능이 이를 참고로 하여 포함됨). 반면에, 항체의 중화력은 이의 친화성뿐만 아니라 이의 농도, 결합가 및 분자 배열과, 이것이 투여되는 부위에도 의존적임을 염두여 두면, 일부 응용에 있어서 더욱 높은 농도의 더욱 낮은 친화성의 항체가 바람직할 수 있다.
항카인 항체의 생성에 사용되는 면역원은 단리된 천연 CC 케모카인, 재조합으로 발현된 CC 케모카인 또는 화학적으로 합성된 CC 케모카인과, 임의로, 아쥬반트 제제를 포함할 수 있다. 면역 응답의 증가에 사용되는 다양한 아쥬반트는 프로인트 아쥬반트(완전 및 불완전), 미네랄 겔(예를 들어, 수산화알루미늄), 표면 활성 물질(예를 들어, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 디니트로페놀 등), 인간 아쥬반트, 예컨대 바실 칼메뜨-게랭(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 또는 유사한 면역촉진제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및 MCP-1 단백질 및 이러한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어 젠뱅크(GenBank)와 같은 공개적으로 이용가능한 서열 데이터베이스에서 또는 표 4의 수탁 번호를 참고로 하여 찾아볼 수 있다. 달리 특정되지 않으면, 이들 서열의 관련 버전은 본 출원의 출원일 직전에 이들 데이터베이스에 입력된 것이다. 게다가, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및 MCP-1을 포함하는 다양한 CC 케모카인의 서열이 공개되었으며, 이는 예를 들어 문헌[Furutani, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:249-255(1989)] (MCP-1), 문헌[Obaru, et al., J. Biochem. 99:885-894 (1986)] (MIP-1α), 문헌[Lipes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9704-9708 (1988)] (MlP-lβ), 문헌[Schall, et al., J. Immunol. 141 :1018-1025 (1988)] (RANTES)에서 찾아볼 수 있는데, 이들 각각의 개시내용은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 대립유전자 변이체가 이들 케모카인 중 일부 또는 전부에 대하여 존재함이 공지되어 있다. 서열 번호 71-74는 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및 MCP-1에 대한 항카인 항체의 스크리닝 및 면역화에 사용되는 인간 서열을 표현한다.
다클론 항체의 제조에 있어서, 다양한 적합한 숙주 동물(예를 들어, 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유류)이 천연 단백질, 또는 이의 합성 변이체, 또는 CC 케모카인의 유도체 또는 하나 초과의 CC 케모카인의 조합물을 이용한 주사에 의해 면역화될 수 있다. 예를 들어, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및 MCP-1의 칵테일을 면역원으로 사용하여 이들 CC 케모카인에 대한 면역 응답을 유도할 수 있다.
요망될 경우, CC 케모카인에 대하여 유도된 다클론 항체 분자를 포유류로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리하고, 공지된 기술, 예컨대 면역글로불린 분획을 수득하기 위한 단백질 A 크로마토그래피 및 2종 이상의 CC 케모카인에 결합하는 항카인 항체를 선발하기 위한 면역친화성 정제에 의해 추가로 정제할 수 있다.
다수의 응용에 있어서, 항클론 항체를 단클론 항체로 생성하는 것이 바람직하다. 연속 세포주 배양에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술은 하이브리도마 기술(문헌[Koehler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975) 참조); 트리오마(trioma) 기술; 인간 B 세포 하이브리도마 기술(문헌[Kozbor, et al., Immunol. Today 4:72 (1983)] 참조) 및 EBV 하이브리도마 기술 - 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 것임 - (문헌[Cole et al., In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 참조)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 단클론 항체는 본 발명의 실행에서 이용될 수 있으며, 문헌[Cote, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030 (1983)]에 기술된 바와 같이 인간 하이브리도마의 사용에 의해 또는 시험관내에서 인간 B 세포를 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus)로 형질전환시킴으로써 생성될 수 있다(문헌[Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)] 참조). 이 단락에서 인용된 모든 문헌은 참고로 포함된다.
단클론 항체를 생성하는 이러한 종래의 방법을 넘어서서, 본 발명자들은 항원 원죄(호스킨스 효과(Hoskins Effect))의 문제를 고려하여 순차적 면역화 방법이 놀랍게도 하나 초과의 CC 케모카인을 인식하는 항카인 항체를 생성함을 발견하였다. 면역화 서열은 생성된 항체의 특이성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 이들 방법은 백시니아 바이러스 vCCI 단백질이 CC 케모카인(RANTES/CCL5)에 결합하는 것을 차단하는 일부 및 특정 CC 케모카인에 결합하는 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌다.
상이한 케모카인을 이용한 척추 동물, 바람직하게는 마우스의 순차적 면역화는 예를 들어 적절한 아쥬반트 중 제1 케모카인으로 동물을 면역화하고, 수주 후 제2 케모카인으로 면역증강시키고, 마지막으로 제3 케모카인으로 두 번째로 면역증강시키는 것에 의해 진행된다. 그러나, 항카인 항체는 다수의 면역화와, 예를 들어 2종, 3종, 4종 이상의 상이한 케모카인을 상이한 조합으로 이용한 면역증강을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 단백질 및 DNA 기반 케모카인 면역화 둘 모두가 수행될 수 있다. DNA 면역화는 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual (Eds. E. Harlow & D. Lane, 1988)]을 참고로 하여 포함된다. 케모카인의 폴리뉴클레오티드 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌[Yoshie, et al., Adv. Immunol. 78: 57-110 (2001)]을 참고로 하여 또한 포함된다. 면역화는 참고로 포함된 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Eds. E. Harlow & D. Lane (1988)]에 기술된 것과 같은 캐리어 단백질 및 케모카인의 콘쥬게이트 또는 아쥬반트를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 체중 1 kg당 약 500 ㎍, 또는 마우스당 케모카인 약 10 ㎍이 투여되며, 바람직한 아쥬반트는 처음 면역화의 경우 완전 프로인트 아쥬반트이고 후속 면역증강의 경우 불완전 프로인트 아쥬반트이다. 면역원으로 사용하기 위한 예시적인 CC 케모카인은 CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β 및 CCL5/RANTES 중 적어도 2종을 포함한다.
순차적 면역화의 일 실시양태에서, 마우스는 먼저 MIP-1α로 면역화되며, 후속적으로 RANTES 및/또는 MCP-1, 또는 CC 케모카인 RANTES, MIP-1α, MIP-1β 및/또는 MCP-1의 임의의 다른 서열로 면역증강된다. 마우스 혈청은 ELISA에 의해 RANTES, MIP-1α, MIP-1β 및 MCP-1과의 반응성에 대하여 시험된다. 그 후 적절한 혈청 응답을 갖는 마우스 유래의 비장을 사용하여 하이브리도마 생성을 계속한다.
하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체는 ELISA에 의해 CC 케모카인을 인식하는 이의 능력에 대하여 그리고 시험관내 주화석 분석에서 또는 vCCI/케모카인 결합 분석에서 차단 활성에 대하여 시험될 수 있다. 이러한 전략을 사용하여 다수의 CC 케모카인에 결합하여 이것을 억제하는 몇몇의 유일무이한 단클론 항체를 확인하였다. 이들 항체는 "항카인"으로 명명되었다. 하이브리도마 생성 항체는 또한 다른 기능 분석에서 시험될 수 있다. 그 후 다수의 CC 케모카인 반응성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주는 클로닝되고, 항체 생성 및 정제를 위하여 확장된다. 항체 결합 특이성을 결정하는 스크리닝 분석법은 공지되어 있으며, 당해 분야에서 일상적으로 실행된다. 이러한 분석법에 대한 폭넓은 논의에 있어서, 문헌[Harlow, et al. (Eds.), Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N. Y., Chapter 6 (1988)]을 참조한다. 항카인 항체는, 이의 처음 확인 후, 예를 들어 친화성 성숙 공정에 의해 또는 이의 CDR 또는 프레임워크 서열의 조작에 의해 친화성 향상을 받을 수 있거나, 또는 이것은 인간화될 수 있다. 인간 요법에서의 사용에 있어서, 바람직하게는 항카인 항체는 전적으로 인간 항체이거나 인간화되며, 2종, 3종, 4종 이상의 CC 케모카인을 인식한다.
일 실시양태에서, 바람직한 특이성을 보유하는 항체의 스크리닝 방법은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 당 기술 분야 내에 공지된 다른 면역학적으로 매개된 기술을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, CC 케모카인의 특정 도메인에 특이적인 항체의 선택은 이러한 도메인을 보유하는 CC 케모카인의 단편에 결합하는 하이브리도마의 생성에 의해 도움을 받는다. CC 케모카인 내의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, CC 케모카인 패밀리의 단백질의 보존된 도메인에 특이적인 항체, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체가 또한 본원에 제공된다.
본 발명의 항카인 항체 및 이의 단편은 경쟁적 및 비-경쟁적 결합 면역분석법에서 CC 케모카인, 특히 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1 및/또는 기타 케모카인에의 특이적 결합에 대하여 분석될 수 있다. 공지된 면역분석 절차는 문헌[Stites and Terr (Eds.) Basic and Clinical Immunology, 7th ed., (1991)]; 문헌[Maggio (Ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FIa. (1980)]; 문헌[Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1985)]; 문헌[Harlow and Lane (Eds.) Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988)]; 문헌[Chan (Ed.), Immunoassay: A Practice Guide, Academic Press, Orlando, FIa. (1987)]; 문헌[Price and Newman (Eds.) Principles and Practice of Immunoassays, Stockton Press, N. Y. (1991)]; 및 문헌[Ngo (Ed.) (1988) Non-isotopic Immunoassays, Plenum Press, N. Y. (1988)]을 참고로 하여 본원에 포함된다.
항체 결합을 측정하는 면역분석법은 경쟁적이거나 비경쟁적일 수 잇다. 일반적으로 항체 맥락에 있어서, 경쟁적 분석법은 두 항체 사이의 리간드의 결합에 있어서의 경쟁을 포함한다. 예를 들어, 표지된 MCP-1은 표지된 MCP-1에의 결합에 대하여 하나의 항체가 또 다른 항체와 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이 분석법은 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 방사선 면역 측정법 (RIA)과 같은 표준 분석법을 기반으로 할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 기질에의 결합에 대하여 비경쟁적 분석법에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 리간드(예를 들어, MCP-1)가 ELISA 플레이트상에 고정된 표준 ELISA가 이용될 수 있다. 시험 항체는 리간드와 함께 인큐베이션하여 결합시킨다. 플레이트는 세척되고, 그 후 효소-콘쥬게이션된 이차 항체(예를 들어, 마우스 항-인간 Fc 항체)는 시험 항체가 리간드에 결합될 경우 시험 항체에 결합한다. 세척 후, 효소의 기질이 첨가되며, 효소와 반응하게 한다. 일반적으로, 색 변화는 리간드와 반응하는 항체의 존재를 나타낸다. ELISA를 상이한 CC 케모카인에 대하여 반복하여 어느 케모카인이 시험 항체에 의해 인식되는지를 결정할 수 있다.
흔히 면역분석법에서는 표지된 분석 성분이 이용된다. 표지체는 다양한 형태로 존재할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 방법에 따라 바람직한 분석 성분에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수도 있다. 분석 성분에 있어서의 일반적인 표지체는 3H, 125I, 35S, 14C, 및 32P를 포함하는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광제 및 효소를 포함한다. 특정 표지체의 선택은 필요한 민감도, 화합물과의 콘쥬게이션의 용이함, 안정성 요건, 및 이용가능한 기계류에 의존적이며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
본 발명의 항체가 CC 케모카인 활성, 특히 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1 및/또는 다른 케모카인을 억제하는지를 평가하는 분석은 화학주성, 세포내 칼슘 증가 등에 대한 공지된 분석법을 이용하여 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 그러나 한정하지 않고서 케모카인 화학주성 분석이 96웰 플라스틱 챔버에서 수행될 수 있다. 웰은 필터에 의해 두 구획으로 분리된다. 필터는 세포가 화학 구배에 응답하여 하나의 구획으로부터 그 다음의 것으로 통과하게 한다. 시험 세포는 배양 배지 중에 챔버의 한 구획 내에 두어지며, CC 케모카인은 예를 들어 다른 구획 내에 배양 배지 중에 두어진다. 필터를 횡단하는 세포가 카운팅된다. 다른 웰에서, CC 케모카인은 항체가 세포 이동을 차단할 수 있는지를 결정하기 위하여 시험 항체와 혼합된다.
상기의 스크리닝 절차에 의해 확인된 항카인 단클론의 추가의 항체 조작에 있어서, 항체의 DNA 서열이 실시예 7에 보고된 바와 같이 결정한다.
본 발명의 항카인 항체의 친화성은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌[Raipal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102:8466-8471 (2005)]; 문헌[Lippow, et al,, Nat. Biotechnol. 25: 1171-1176 (2007)]; 문헌[Wu, et al., J. Mol. Biol. 368: 652-665 (2007)]; 문헌[Yang, et al., J. Mol. Biol. 254: 392-403 (1995)]; 및 문헌[Huse, et al., J. Immunol. 149:3903-3913 (1992)]에 기술된 것을 이용하여 추가로 향상시킬 수 있으며, 상기 문헌 각각은 항체의 친화성 성숙 또는 향상 방법을 교시하는 것으로서 참고로 포함된다. 본 발명의 항카인 항체는 친화도가 200, 100 nM 미만이며(예를 들어, 처음에 단리된 쥐과 동물 항체 3C12F는 MIP-1α에 대하여 친화도가 49 nM임), 친화성 성숙 절차 동안 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5 또는 0.1 nM 미만이 되도록 향상될 수 있다. 단클론 항체의 친화성 성숙에 유용한 절차는 당해 분야에 공지되어 있으며, 문헌[Antibody Engineering (Humana Press, 2004)] 및 문헌[Phage Display, T. Clackson and H. B. Lowman, editors (Oxford University Press, 2004)]을 참고로 하여 포함된다. 이러한 절차는 친화성 성숙과 별도로 또는 그와 동시에 인간화될 수 있는 이러한 항카인 항체의 키메라 형태를 이용하여 시작될 수 있다. 항체의 가변 영역은 섬유상 파지의 표면상에서 Fab 단편으로 발현될 수 있다. 돌연변이 유발 전략을 이용하여 6개의 CDR 내의 각각의 잔기를 변화시켜 파지 상에서 발현되는 Fab 단편의 조합 라이브러리를 제조할 수 있다. 이는 케모카인 항원에의 결합에 대하여 스크리닝되고 친화성 향상에 대하여 분석될 수 있다. 후속적으로, 바람직한 아미노산 치환들이 친화성의 훨씬 더 큰 향상을 위하여 조합될 수 있다. 이와 동시에, 가변 도메인의 프레임워크 영역 내의 돌연변이를 분석하여 개선된 특성을 갖는 서열을 찾을 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이 "변이체형" 또는 "유사체형" 항체는 모 항체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기(들)의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 아미노산 서열이 모 항체 아미노산 서열과 상이해진다. 일 실시양태에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들) 내에 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함한다.
항체 유사체는 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F, 또는 18P7E의 중쇄 또는 경쇄 서열의 CDR, 초가변 또는 프레임워크 영역 내의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 초과의 아미노산 잔기를 대체함으로써 조작될 수 있다. 이와 유사하게, 이러한 항체의 이소형은 당해 분야에 공지된 이소형 스위칭 기술에 의해 또는 유전자 조작 절차, 예컨대 CDR 그래프팅, 키메라 항체 형성 또는 인간화에 의해 변화될 수 있다.
유사체는 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E형 단클론 항체의 친화성 성숙 공정에 의해 제조될 수 있다. 유사체는 일반적으로 더욱 높은 결합 친화성 또는 더욱 넓은 케모카인 결합 프로필에 대하여 선발되며, 이들은 동시에 획득될 수 있다. 유사체는 이것이 모 항체가 결합하는 동일 케모카인에 결합하는지를 예를 들어 ELISA 또는 기타 공지된 분석법에 의해 결정함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 유사체는 중쇄 및 경쇄가 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F, 또는 18P7E의 상응하는 중쇄 및 경쇄 서열과 약 90, 95, 99 또는 100%의 서열 동일성을 공유하는 변이체를 포함한다. 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E 하이브리도마 세포주 또는 이의 계대배양물에 의해 생성된 항체의 친화성 성숙된 변이체는 결합 친화도가 1,000, 800, 400, 200, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 또는 0.1 nM 또는 그 미만이 되도록 선발될 수 있다. 일부 유사체 또는 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 10개 또는 최대 20개의 아미노산 서열 변경, 예컨대 결실, 삽입 또는 치환을 가지며, 유사체는 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E 항체의 하나 이상의 초가변 영역 또는 CDR 내에 약 2 내지 10개의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
유사체는 하기 CDR 조합 중 적어도 하나를 포함하는, MIP-1α, MlP-1β, RANTES, MCP-1 중 적어도 2종 이상에 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 구성할 수 있다: 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR1과 CDR2; CDR1과 CDR3; CDR2와 CDR3; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3.
동물 항원 결합 가변 도메인이 인간 불변 도메인에 커플링된 키메라 항체는 당해 분야에 공지되어 있으며, 이의 제조 방법은 카빌리 등의 미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison, S. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)]; 문헌[Boulianne, G. L. et al., Nature 312:643-646 (1984)]; 및 문헌[Neuberger, M. S. et al., Nature 314:268-270 (1985)]을 참고로 하여 포함된다.
인간 불변 도메인의 이소형은 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 및 보체 의존성 세포독성에 참여하기 위한 키메라 항체의 맞춤을 위하여 선택될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)]; 문헌[Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327 (1988)]; 문헌[Love et al., Methods in Enzymology 178:515-527 (1989)]; 문헌[Bindon, et al., J. Exp. Med. 168: 127-142 (1988)] 참조), 상기 문헌은 참고로 포함된다. 키메라 및 인간화 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 국제 특허 출원 제PCT/US86/02269호; 유럽 특허 출원 제184,187호; 유럽 특허 출원 제171,496호; 유럽 특허 출원 제173,494호; 국제 특허 공개 제WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌[Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988)]에 기술된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 항카인 항체는 참고로 포함된 카터(Carter)의 미국 특허 제6,719,971호, 문헌[Almagro, et al., Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)]; 문헌[Pini, et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 5:503-510 (2002)]; 및 문헌[Wu, et al., J. Mol. Biol. 294: 151-162 (1999)]에 개시된 것을 포함하는 공지된 절차에 의해 인간화될 수 있다. 인간화는 공여 동물(쥐과 동물) 항체의 항체 특이성을 갖지만 인간에 있어서 더욱 우수한 이펙터 기능 및 감소된 면역원성을 갖는 면역글로불린 분자를 생성한다. 이 공정은 공지된 항카인 CDR 서열을 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 내로 매에 매립시키는 것을 포함한다. 일반적으로, 인간화 항체는, 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 발원하는 마우스 가변 프레임워크에 대하여 동일하거나 유사한 입체 배좌를 채용할 경우 CDR의 올바른 공간 배향을 유지할 가능성이 가장 큰 인간 가변 도메인 프레임워크 내로 마우스 CDR을 치환함으로써 생성된다. 이는 CDR이 유래된 쥐과 동물 가변 프레임워크 도메인과 WHV은 정도의 서열 동일성을 프레임워크 서열이 나타내는 인간 항체 유래의 인간 가변 도메인을 수득함으로써 달성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 인간 항체의 서열일 수 있거나 몇몇 인간 항체의 콘센서스 서열일 수 있다. 문헌[Kettleborough, et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991)]; 문헌[Kolbinger, et al., Protein Engineering 6:971-980 (1993)] 및 카터 등의 국제 특허 공개 제WO 92/22653호를 참조한다.
쥐과 동물 공여 면역글로불린 및 적절한 인간 수용 면역글로불린의 상보성 결정 영역을 확인하였으면, 다음 단계는, 만약에 있다면, 이들 성분으로부터의 어느 잔기가 생성된 인간화 항체의 특성을 최적화하도록 치환되어야 하는지를 결정하는 것이다. 일반적으로, 인간 아미노산 잔기를 쥐과로 치환하는 것은 최소화되어야 하며, 그 이유는 쥐과 잔기의 도입이 인간에 있어서 인간-항-마우스-항체(human-anti-mouse-antibody, HAMA) 응답을 야기하는 항체의 위험성을 증가시키기 때문이다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기 유래의 특정 아미노산은 이의 가능한 CDR 입체 배좌에 대한 영향 및/또는 항원에의 결합을 기반으로 하여 치환용으로 선택된다. 쥐과 CDR 영역과 인간 가변 프레임워크 영역의 비자연적 병치는 비자연적 입체 배좌 구속을 생성할 수 있으며, 이는 특정 아미노산 잔기의 치환에 의해 교정되지 않으면 결합 친화성이 손실되게 한다.
치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로는 컴퓨터 모델링에 의해 결정된다. 일반적으로, 분자 모델은 면역글로불린 사슬 또는 이의 도메인에 있어서의 해명된 구조로부터 출발하여 생성된다. 모델링되는 사슬들은 대한 해명된 3차원 구조의 도메인 또는 사슬과의 아미노산 서열 유사성에 대하여 비교되며, 최대 서열 유사성을 나타내는 사슬 또는 도메인이 분자 모델의 제작을 위한 출발점으로 선택된다. 적어도 50%의 사슬 동일성을 공유하는 사슬 또는 도메인이 모델링용으로 선택되며, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%의 서열 동일성 또는 그 초과의 서열 동일성을 공유하는 것이 모델링용으로 선택된다. 해명된 출발 구조는 모델링되는 면역글로불린 사슬 또는 도메인에서의 실제 아미노산들 및 출발 구조에서의 것들 사이의 차이를 허용하도록 변형된다. 그 후 변형된 구조는 복합 면역글로불린으로 조립된다. 마지막으로, 당해 모델은 에너지 최소화에 의해 그리고 모든 원자가 서로로부터 적절한 거리 내에 있으며 결합 길이 및 결합각은 화학적으로 허용되는 한계치 내임을 확증함으로써 개량된다.
또한 치환을 위한 아미노산 잔기의 선택은 부분적으로는 특정 위치의 아미노산의 특성의 조사, 또는 특정 아미노산의 치환 또는 돌연변이 유발의 효과의 경험적 관찰에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 쥐과 동물 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에서 아미노산이 상이할 때, 인간 프레임워크 아미노산은 일반적으로 아미노산이 비공유적으로 항원에 직접적으로 결합하거나, CDR 영역에 인접하거나, 다르게는 CDR 영역과 상호작용하거나(예를 들어, 컴퓨터 모델링에 의해 결정할 때 CDR 영역의 약 3-6Å 이내임), 또는 VL-VH 경계면에 참여하는 것이 합리적으로 예상될 경우 마우스 항체 유래의 등가의 프레임워크 아미노산에 의해 치환되어야 한다.
"비공유적으로 항원에 직접적으로 결합하는" 잔기는 확립된 화학적 힘에 따라, 예를 들어 수소 결합, 반데르 발스힘, 소수성 상호작용 등에 의해 항원상의 아미노산과 직접적으로 상호작용할 확률이 상당한 프레임워크 영역 내의 위치의 아미노산을 포함한다.
"CDR 영역에 인접한" 잔기는 인간화 면역글로불린 사슬의 일차적인 서열 내의 CDR 중 하나 이상에 바로 인접한 위치 내의, 예를 들어 문헌[Kabat-Wu & Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250 (1970)]에 정의된 CDR 또는 문헌[Chothia-Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 정의된 CDR에 바로 인접한 위치 내의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 아미노산은 특히 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 가능성이 있으며, 수용자로부터 선택될 경우, 공여 CDR을 왜곡시켜 친화성을 감소시킬 가능성이 있다. 더욱이, 인접 아미노산은 항원과 직접적으로 상호작용할 수 있으며 (본원에 참고로 포함된 문헌[Amit, et al., Science 233:747-753 (1986)], 공여체로부터의 이들 아미노산의 선택은 모든 항원이 계속하여 접촉하게 하는 것이 바람직할 수 있는데 이는 원래의 항체에 있어서 친화성을 제공한다.
"다르게는 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 CDR 영역에 영향을 주기에 충분한 공간 배향임이 이차 구조 분석에 의해 결정된 것을 포함한다. "다르게는 CDR 영역과 상호작용하는" 잔기는 공여 면역글로불린의 3차원 모델을 분석함으로써 확인될 수 있다(예를 들어, 컴퓨터-생성된 모델). 전형적으로 원래 공여 항체의 3차원 모델은 CDR 바깥의 특정 아미노산이 CDR에 가까우며 수소 결합, 반데르 발스 힘, 소수성 상호작용 등에 의해 CDR 내의 아미노산과 상호작용할 확률이 상당함을 보여준다. 이러한 아미노산 위치에서, 수용 면역글로불린 아미노산보다는 오히려 공여 면역글로불린 아미노산이 선택될 수 있다. 이 기준에 따른 아미노산은 일반적으로 CDR 내의 일부 원자의 약 3Å 내에 측쇄 원자를 가지며, 확립된 화학적 힘, 예컨대 상기에 열거된 것에 따라 CDR과 상호작용할 수 있는 원자를 포함하여야 한다.
CDR 내의 아미노산과 상호작용할 수 있는 아미노산은 또 다른 방법으로 확인될 수 있다. 각각의 프레임워크 아미노산의 용매 접근가능한 표면적은 하기 2가지 방법으로, (1) 온전한 항체에서, 그리고 (2) CDR이 제거된 항체로 이루어진 가설적 분자에서 계산된다. 약 10Å2 이상의 이들 수 사이의 유의한 차이는 용매에 프레임워크 아미노산이 접근하는 것이 적어도 부분적으로 CDR에 의해 차단되며, 따라서 아미노산이 CDR과 접촉하고 있음을 보여준다. 아미노산의 용매 접근가능한 표면적은 당해 분야에 공지된 알고리즘을 사용하여 항체의 3차원 모델을 기반으로 하여 계산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Connolly, J. Appl. Cryst. 16:548 (1983)] 및 문헌[Lee & Richards, J. Mol. Biol. 55:379 (1971)], 이들 둘 모두 본원에 참고로 포함됨). 또한 프레임워크 아미노산은 가끔 또 다른 프레임워크 아미노산 - 이는 다시 CDR과 접촉함 - 의 입체 배좌에 영향을 줌으로써 CDR과 간접적으로 상호작용할 수 있다.
"VL-VH" 경계면에 참여하는" 잔기 또는 "패킹" 잔기는 예를 들어 문헌[Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4592-66 (1985)] 또는 문헌[Chothia & Lesk, 상기 문헌]에 의해 정의된 바와 같이 VL과 VH 사이의 경계면의 잔기를 포함한다. 일반적으로, 특이한 패킹 잔기는 이 잔기가 인간 프레임워크 내의 것과 상이할 경우 인간화 항체에서 유지되어야 한다.
일반적으로, 상기 기준을 충족시키는 아미노산들 중 하나 이상이 치환된다. 일부 실시양태에서, 상기 기준을 충족시키는 아미노산들 전부 또는 대부분이 치환된다. 가끔, 특정 아미노산이 상기 기준을 충족시키는지에 관하여 약간의 모호함이 있으며, 대안적인 변이체형 면역글로불린이 생성되는데 그 중 하나는 그 특정한 치환을 가지며, 다른 하나는 그렇지 않다. 그렇게 생성된 대안적인 변이체형 면역글로불린은 바람직한 활성 및 선택된 바람직한 면역글로불린에 대하여 본원에 기술된 분석법들 중 임의의 것으로 시험될 수 있다.
일반적으로 인간화 항체 내의 CDR 영역은 실질적으로 동일하며, 더 일반적으로는 공여 항체의 상응하는 CDR 영역과 동일하다. 일반적으로 바람직한 것은 아니지만, 때로 생성된 인간화 면역글로불린의 결합 친화성에 눈에 띄게 영향을 주지 않고서 CDR 잔기의 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 만드는 것이 가능하다. 보존적 치환은 gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; 및 phe, tyr과 같은 조합을 의도한다.
치환에 있어서의 추가의 후보로는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 있어서 특이한 또는 "희귀한" 수용 인간 프레임워크 아미노산이 있다. 이들 아미노산은 마우스 공여 항체의 등가의 위치로부터의 아미노산 또는 더욱 전형적인 인간 면역글로불린의 등가의 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 치환은 수용 면역글로불린의 인간 프레임워크 영역 내의 아미노산이 그 위치에 있어서 희귀하고 공여 면역글로불린 내의 상응하는 아미노산이 인간 면역글로불린 서열에서의 그 위치에 대하여 일반적일 때; 또는 수용 면역글로불린에서의 아미노산이 그 위치에 있어서 희귀하며 공여 면역글로불린에서의 상응하는 아미노산이 또한 희귀할 때 - 다른 인간 서열에 비하여 - 바람직할 수 있다. 이들 기준은 인간 프레임워크에서의 이례적인 아미노산이 항체 구조를 파괴하지 않는 것을 보장하는 것을 돕는다. 게다가, 인간 항체에 있어서 전형적이도록 일어나는 공여 항체로부터의 아미노산에 의한 특이한 인간 수용 아미노산의 대체에 의해 인간화 항체가 면역원성이 덜해지도록 만들어질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "희귀한"이라는 용어는 서열의 대표적인 샘플에서 약 20% 미만의 그러나 일반적으로 약 10% 미만의 서열에서 그 위치에 나타나는 아미노산을 나타내며, 본원에 사용되는 바와 같이 "일반적"이라는 용어는 대표적인 샘플에서 약 25% 초과의 그러나 일반적으로는 약 50% 초과의 서열에서 나타나는 아미노산을 나타낸다. 예를 들어 모든 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 특정한 결정적인 위치에서 동일한 아미노산을 가지며 서로에게 특히 상동성인 서열의 "하위군"으로 각각 분류된다(우(Wu) 및 카바트(Kabat)의 상기 문헌). 인간 수용 서열 내의 아미노산이 인간 서열 사이에서 "희귀한지" 또는 "일반적인지"를 결정할 때, 흔히 수용 서열과 동일한 하위군 내의 인간 서열만을 고려하는 것이 바람직하다. 치환에 있어서의 추가의 후보로는 초티아 및 레스크의 상기 문헌에 제안된 대안적인 정의하에 CDR 영역의 부분으로서 확인되는 수용 인간 프레임워크 아미노산이 있다.
치환에 있어서의 다른 후보로는 희귀한 또는 특이한 공여 프레임워크 잔기에 상응하는 수용 프레임워크 잔기가 잇다. 희귀한 또는 특이한 공여 프레임워크 잔기는 그 위치에서 쥐과 동물 항체에 있어서 희귀하거나 특이적인 것이다(본원에 정의된 바와 같음). 쥐과 동물 항체에 있어서, 하위군은 콘센서스와 상이한 확인된 잔기 위치 및 카바트 위치에 따라 결정될 수 있다. 이들 공여체 특이적 차이는 활성을 향상시키는 쥐과 서열에서의 체세포 돌연변이를 가리킬 수 있다. 결합에 영향을 주는 것으로 예측되는 특이적인 잔기는 유지되며, 반면에 결합에 중요하지 않을 것으로 예측되는 잔기는 치환될 수 있다.
치환에 있어서의 추가적인 후보로는 수용 프레임워크 영역에서 나타나는 비-생식세포계 잔기가 있다. 예를 들어, 수용 항체 사슬(즉, 공여 항체 사슬과 상당한 서열 동일성을 공유하는 인간 항체 사슬)이 생식세포계 항체 사슬 (마찬가지로 공여 사슬과 상당한 서열 동일성을 공유함)과 정렬될 때, 수용 사슬 프레임워크와 생식세포계 사슬 프레임워크 사이에 매칭되지 않는 잔기는 생식세포계 서열 유래의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다.
상기에 논의된 특정 아미노산 치환 이외에, 인간화 면역글로불린의 프레임워크 영역은 일반적으로 실질적으로 동일하며, 더욱 일반적으로는 이것이 유래된 인간 항체의 프레임워크 영역과 동일하다. 물론, 프레임워크 영역 내의 아미노산들 중 다수는 항체의 특이성 또는 친화성에 직접적인 기여를 거의 하지 않거나 전혀 하지 않는다. 따라서, 프레임워크 잔기의 많은 개개의 보존적 치환은 생성된 인간화 면역글로불린의 특이성 또는 친화성의 눈에 띄는 변화 없이 견디어질 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 인간화 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 인간 가변 프레임워크 영역 서열 또는 이러한 서열의 콘센서스에 대하여 적어도 85%의 서열 동일성을 공유한다. 또 다른 실시양태에서, 인간화 면역글로불린의 가변 프레임워크 영역은 인간 가변 프레임워크 영역 서열 또는 이러한 서열의 콘센서스에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 95%, 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다. 그러나, 일반적으로 이러한 치환은 바람직하지 못하다.
일부 실시양태에서, 인간화 항체는 바람직하게는 이것이 작제된 마우스 항체의 것과 유사한 또는 그보다 더 높은 항원에 대한 특이적 결합 친화성을 나타낸다. 일반적으로, 항원에 대한 인간화 항체의 결합 친화성의 상한치는 공여 면역글로불린의 것의 3배, 4배 또는 5배 이내이다. 흔히, 결합 친화성의 하한치도 공여 면역글로불린의 것의 3배, 4배 또는 5배 이내이다. 대안적으로, 결합 친화성은 치환이 없는 인간화 항체(예를 들어, 공여 CDR 및 수용 프레임워크 영역을 갖는 항체 - 그러나 프레임워크 영역 치환은 없음)의 것과 비교될 수 있다. 이러한 예에서, (치환을 갖는) 항체의 결합성은 바람직하게는 비치환 항체의 적어도 2배 내지 3배 더 크거나 또는 3배 내지 4배 더 크다. 비교를 위하여, 다양한 항체의 활성은 예를 들어 비아코어®(즉, 미표지 시약을 이용한 표면 플라스몬 공명) 또는 경쟁적 결합 분석법에 의해 측정될 수 있다.
조작된 항체는 염증성 질환에 또한 연루될 수 있는 다른 CC 케모카인에 대한 케모카인 선택성을 넓히고/넓히거나 처음에 확인된 케모카인에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위하여 문헌[Wu, et al., J. Mol. Biol. 350: 126-144 (2005)](참고로 포함됨)에 기술된 것과 같은 표준 친화성 성숙 기술을 이용하여 본원에 개시된 단클론 항체의 서열을 기반으로 하여 디자인될 수 있다.
클래스 또는 이소형 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)가 특히 선택된 클래스 또는 서브클래스에 있어서 공지된 특정 기능에 대하여 항체를 표적화하거나 채용하기 위하여 키메라, 인간화 또는 조작 항체에 대하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG2를 선택하여 이 항체 생성물이 태반을 가로질러 통과하는 것을 최소화하거나 피험체의 면역계의 다른 성분과의 Fc-수용체 상호작용을 최소화할 수 있고, 서브클래스 IgG4를 선택하여 이 항체 생성물이 보체를 활성화시키는 능력을 최소화할 수 있다. IgA 이소형을 선택하여 분비형 항체 및 오량체형 IgM 항체 생성물을 생성하여 단량체형 항체와 비교하여 항체의 결합성을 향상시킬 수 있다. 항체 분자의 다양한 클래스 및 서브클래스의 기능이 문헌[Kuby, Immunology, WH Freeman (1997)]을 참고로 하여 포함된다.
단쇄 "Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항카인 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 참고로 포함된 문헌[Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. CC 케모카인에 특이적인 단쇄 항체는 참고로 포함된 미국 특허 제4,946,778호에 개시된 것과 같은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
"다이아바디(diabody)"는 두 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 상기 단편은 동일 폴리펩티드 사슬(VH 및 VL) 내에서 중쇄 가변 도메인(VH)이 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 것을 포함한다. 너무 짧아서 동일 사슬상에서의 두 도메인의 쌍형성이 허용될 수 없는 링커를 사용함으로써 상기 도메인들은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍이 형성되게 되어 두 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 본 발명의 항카인 항체는 다이아바디로서 제제화될 수 있으며, 상기 다이아바디는 유럽 특허 제404,097호; 국제 특허 공개 제WO 93/11161호; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]을 참고로 하여 포함된 절차에 의해 제조될 수 있다.
"선형 항체"는 문헌[Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)]에 기술된 항체를 나타낸다. 간략하게는, 이들 항체는 탠덤(tandem) 세그먼트 쌍(VH-CH 1-VH-CH 1)을 포함하는데, 이는 항원 결합 영역의 쌍을 형성한다. 선형 항체는 2특이성 또는 1특이성일 수 있다. 본 발명의 항카인 항체는 본원에 참고로 포함된 자파타 (Zapata) 등에 의해 기술된 절차에 따라 제조될 수 있다.
Fab 발현 라이브러리는, CC 케모카인 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대하여 바람직한 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 허용하기 위하여 문헌[Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]에 개시된 그리고 상기 문헌을 참고로 하여 포함된 것과 같은 다른 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있다.
하기에 예시된 유일무이한 항체 부분, 예컨대 이의 CDR 서열 및 CDR의 일부분을 포함하는 서열을 사용하여 항이디오타입 항체를 생성할 수 있다. 이들 항체는 항카인 항체의 가변 세그먼트상의 하나 이상의 이디오타입을 인식하며, 이를 사용하여 항카인 항체를 확인 또는 정제하거나 이의 활성을 조정할 수 있다. 이러한 항이디오타입 항체는 당해 분야에 공지된 절차에 의해, 예컨대 면역원성 담체에 대한 항체의 가변 펩티드 서열의 콘쥬게이션 및 반복된 면역화에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Cavenaugh, et al., Pharm. Res. 21 : 1480-1488 (2004)]을 참고로 하여 또한 포함된다.
항이디오타입 항체는 또 다른 항체(표적 항체)의 결정부위를 인식하는 항체이다. 일반적으로, 항이디오타입 항체는 표적 항체의 항원-결합 부위의 결정부위를 인식한다. 전형적으로, 표적 항체는 단클론 항체이다. 항이디오타입 항체는 일반적으로 표적 단클론 항체원과 동일한 종 및 유전자형의 동물(특히, 마우스)을 표적 단클론 항체로 면역화함으로써 제조된다. 면역화된 동물에는 표적 단클론 항체의 이디오타입 결정부위에 대한 면역 응답이 탑재되며, 상기 동물은 표적 단클론 항체의 이디오타입 결정부위에 대한 항체를 생성한다. 면역화된 동물의 항체-생성 세포, 예컨대 비장 세포를 이용하여 항이디오타입 단클론 항체를 생성할 수 있다. 더욱이, 항이디오타입 항체를 또한 이용하여 동물을 면역화하여 항-항 이디오타입 항체를 생성할 수 있다. 이들 면역화된 동물을 이용하여 항-항 이디오타입 단클론 항체를 표준 기술을 이용하여 생성할 수 있다. 항-항 이디오타입 항체는 항이디오타입 항체를 제조하기 위하여 사용된 원래의 표적 단클론 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 항-항 이디오타입 항체는 원래의 표적 단클론 항체와 동일한 항원 특이성을 갖는 다른 단클론 항체를 나타낸다.
항이디오타입 항체와 표적 항체의 결합은 표적 항체의 관련 항원에 의해 억제되며, 항이디오타입 항체가 표적 항체와 동일한 특이성으로 항체 응답을 유도할 경우, 이것은 표적 항체의 항원을 모방한다. 이러한 항이디오타입 항체는 "내부 이미지 항이디오타입"이며, 마치 이것이 원래의 항원인 것처럼 항체 응답을 유도할 수 있는데, 문헌[Bona and Kohler, Anti-idiotypic Antibodies and Internal Image in Monoclonal and Anti-idiotypic Antibodies: Probes for Receptor Structure and Function, Venter J. C, Frasser, C. M., Lindstrom, J. (Eds.), Alan R. Liss, N. Y., pp 141-149 (1984)]을 참조한다. 내부 이미지 항이디오타입 항체를 포함하는 백신은 바이러스, 세균 및 기생충에 대하여 보호 응답을 유도하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Kennedy, et al. Science 232:220-223 (1986)]; 문헌[McNamara, et al., Science 226: 1325-1326 (1985)]. 내부 이미지 항이디오타입 항체는 또한 종양 관련 항원에 대하여 면역성을 유도하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Raychauhuri, et al., J. Immunol. 137: 1743-1749 (1986)]; 문헌[Raychauhuri et al., J. Immunol. 139:3902-3910 (1987)]; 문헌[Bhattacharya-Chatterjee et al., J. Immunol. 139: 1354-1360 (1987)]; 문헌[Bhattacharya-Chatterjee, et al., J. Immunol. 141 : 1398-1403 (1988)]. 이 단락에서 인용된 문헌의 교시내용은 참고로 포함된다.
CC 케모카인에 대한 항이디오타입 항체는 예를 들어 동물, 예컨대 마우스를 CC 케모카인의 하나 이상의 항원 에피토프를 포함하는 CC 케모카인 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 조성물의 면역유발적 양으로 면역화함으로써 제조될 수 있다. 본 조성물은 또한 적합한 아쥬반트, 및 면역원성 제공에 필요한 임의의 담체를 함유할 수 있다. CC 케모카인을 인식하는 단클론 항체는 상기에 기술된 바와 같이 면역화 동물의 세포로부터 제조될 수 있다. 그 후 CC 케모카인의 일반적인 에피토프를 인식하는 단클론 항체가 선발되며, 이를 이용하여 항CC 케모카인 단클론 항체의 면역유발적 양을 포함하는 조성물을 제조한다. 전형적으로, 25 내지 200 ㎍ 용량의 정제 CC 케모카인 단클론이 적합한 아쥬반트에서 충분하다. 동물은 용량들 사이에서 14일 내지 30일 간격으로 2-6회 면역화될 수 있다. 전형적으로, 동물은 임의의 적합한 투여 경로, 예컨대 복강내, 피하, 정맥내 또는 이들의 조합에 의해 면역화된다. 항이디오타입 항체 생성은 표준 면역분석법을 이용하여 면역화 기간 동안 모니터링될 수 있다. 표적 단클론 항체와 반응성인 항체의 적합한 역치를 갖는 동물은 항체 생성 세포를 수확하기 3일 전에 면역원으로서 사용되는 단클론 항체를 이용하여 재면역화될 수 있다. 바람직하게는, 다른 항체 생성 세포가 선택될 수 있지만 비장 세포가 사용된다. 항체 생성 세포가 수확되며, 이는 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 생성하고(이는 상기에 기술된 바와 같음), 적합한 항이디오타입 항체 생성 세포가 선택된다. 항-항 이디오타입 항체는 면역원으로서 항이디오타입 단클론 항체의 사용에 의해 도 다른 라운드의 면역화 및 하이브리도마 생성에 의해 생성된다.
상기에 기술된 바와 같이 항카인 항체의 가변 세그먼트, 예컨대 CDR 세그먼트, 또는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 그 초과의 인접 아미노산 잔기를 갖는 단편을 포함하는 가변 세그먼트의 펩티드 단편, 특히 케모카인에 대하여 결합 활성을 갖는 것이 자가변역 질환의 치료학적 치료에 더하여 다수의 응용에 사용될 수 있으며, 이는 펩티드 기반 약제, 백신, 항이디오타입 항체의 생성으로서 또는 면역원으로서의 응용을 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면은 면역 응답을 유도하기에 충분한 양의 폴리펩티드 제제를 포유류에게 투여하는 단계에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 포유류에서 면역 응답을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 양은 동물 종, 동물의 크기 등에 의존적이지만, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
또한 본 발명은 친화성 성숙 공정을 통하여 키메라 또는 인간화 항카인 항체로부터 유래된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. CDR 내에서의 아미노산 치환이 확인될 수 있으며, 이는 CC 케모카인에 대한 항체의 친화성을 유의하게 향상시키고 따라서 본 발명에 포함된다. 친화성 성숙 방법은 예를 들어 문헌[Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6037-6042 (1998)] 및 문헌[Clackson and Loman, Phage Display, Oxford University Press (2004)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 또한 참고로 포함된다.
항CC 케모카인 항카인 항체는 CC 케모카인의 위치화 및/또는 정량화에 관련된 기술분야 내에 공지된 방법에서 사용될 수 있다(예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내의 CC 케모카인의 수준 측정에서의 사용, 진단 방법에서의 사용, 단백질의 이미징에서의 사용 등). 주어진 실시양태에서, CC 케모카인에 대한 항체, 또는 항체 유래된 결합 도메인을 포함하는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체가 약리학적 활성 화합물, 약물 또는 치료 화합물로서 이용된다.
항CC 케모카인 항카인 항체(예를 들어, 단클론 항체)는 표준 기술, 예컨대 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전에 의한 CC 케모카인 단리에 사용될 수 있다. 항CC 케모카인 항체는 세포로부터의 천연 CC 케모카인의 정제 및 숙주 세포에서 발현된 재조합으로 생성된 CC 케모카인의 정제를 도울 수 있다. 더욱이, 항CC 케모카인 범용(pan) 항체가 CC 케모카인의 발현의 패턴 및 풍부성을 평가하기 위하여 CC 케모카인(예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상청액 중)을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항CC 케모카인 항카인 항체는 예를 들어 주어진 치료 섭생법의 효능을 결정하기 위하여 임상 시험 절차의 부분으로서 조직 중 단백질 수준을 진단학적으로 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능 물질에 커플링시킴으로써(즉, 물리적으로 연결시킴으로써) 촉진될 수 있다. 검출가능 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며, 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 스트렙티비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하며, 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하며, 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하며, 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 및 3H를 포함한다.
게다가, 본 발명의 항체는 항체에 콘쥬게이션될 수 있는 방사성 동위원소, 단백질 독소 및 화학적 독소와 같은 독소에 콘쥬게이션될 수 있다. 이러한 독소는 납-212, 비스무스-212, 아스타틴-211, 요오드-131, 스칸듐-47, 레늄-186, 레늄-188, 이트륨-90, 요오드-123, 요오드-125, 브롬-77, 인듐-111, 붕소-10, 악티니드(Actinide), 리신, 아드리아마이신, 칼리케아미신, 5-플루오로우라실, 아우리스타틴 및 마이탄시노이드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
키메라, 인간화 및 인간 항체와, 이의 항원 결합 단편은 전형적으로 재조합적 발현에 의해 생성된다. 인간 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 임의로 불변 영역에 연결된 것을 코딩하는 핵산이 발현 벡터 내로 삽입된다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 코딩하는 DNA 세그먼트는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 발현 조절 서열은 프로모터(예를 들어, 자연적으로 관련된 또는 비상동성 프로모터), 신호 서열, 인핸서 요소, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템이다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 포함되었으면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현과, 교차반응 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건하에 유지된다.
이들 발현 벡터는 전형적으로 에피좀으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 일체화된 부분으로서 숙주 유기체 내에서 복제 가능하다. 일반적으로 발현 벡터는 바람직한 DNA 서열로 형질전환되는 세포의 검출을 가능케 하기 위하여 선발 마커(예를 들어, 암피실린 내성, 하이그로마이신 내성, 테트라사이클린 내성 또는 네오마이신 내성)를 포함하며, 예를 들어 참고로 포함된 이타쿠라(Itakura) 등의 미국 특허 제4,704,362호를 참조한다. 이. 콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 서열0의 클로닝에 특히 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 간균, 예컨대 바실루스 서틸루스(Bacillus subtilus), 및 기타 장내세균(enterobacteriaceae), 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 양립가능한 발현 조절 서열(예를 들어, 복제 원점)을 포함하는 발현 벡터를 또한 만들 수 있다. 게다가, 다수의 다양한 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다 유래의 프로모터 시스템이 존재한다. 프로모터는 전형적으로 발현을, 임의로 오퍼레이터 서열에 의해 조절하며, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위하여 리보좀 결합 부위 서열 등을 갖는다.
다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스가 바람직한 효모 숙주이며, 이때 적합한 벡터는 요망될 경우 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제 원점, 종결 서열 등을 갖는다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는 특히 알콜 데히드로게나제, 이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 책임이 있는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
미생물 이외에, 포유류 조직 세포 배양물이 또한 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 발현 및 생성에 사용될 수 있다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987)]을 참조한다. 진핵 세포가 실제로 바람직하며, 그 이유는 비상동성 단백질(예를 들어, 온전한 면역글로불린)을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었기 때문이며, 이는 CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주, 또는 형질전환된 B 세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비인간 세포이다. 이들 세포에 있어서의 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제 원점, 프로모터 및 인핸서(문헌[Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68 (1986)], 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 프로모터이다. 문헌[Co, et al., J. Immunol. 148: 1149-1154 (1982)]을 참조하며, 상기 문헌 각각은 참고로 포함된다.
대안적으로, 항체 코딩 서열은 각각이 참고로 포함된 데보에르(Deboer) 등의 미국 특허 제5,741,957호, 로젠(Rosen)의 미국 특허 제5,304,489호, 및 메드 (Meade) 등의 미국 특허 제5,849,992호에 기술된 바와 같이 트랜스제닉 동물의 게놈 내로의 도입 및 트랜스제닉 동물의 밀크에서의 후속적인 발현을 위하여 트랜스진 내에 포함될 수 있다. 적합한 트랜스진은 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자 유래의 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄의 코딩 서열을 포함한다.
관심 있는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 또는 이의 단편 및 발현 조절 서열)을 포함하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 이전될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 트랜스펙션이 원핵 세포에 일반적으로 이용되며, 반면에 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱스(biolistics) 또는 바이러스 기반 트랜스펙션이 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유류 세포의 형질전환에 사용되는 다른 방법은 폴리브렌, 원형질체 융합, 리포좀, 전기천공 및 미세주입의 사용을 포함한다(일반적으로 샘브룩(Sambrook) 등의 상기 문헌 참조). 트랜스제닉 동물의 생성에 있어서, 트랜스진을 수정된 난모세포 내로 미세주입할 수 있거나, 배아 줄기 세포의 게놈 내로 포함시킬 수 있으며, 이러한 세포의 핵을 핵제거 난모세포 내로 이전시킬 수 있다. 이들 방법 모두는 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd ed. (1989)]을 참고로 하여 포함된다.
중쇄 및 경쇄를 별도의 발현 벡터 상에 클로닝할 때, 벡터들을 동시 트랜스펙션시켜 온전한 면역글로불린의 발현 및 조립을 수득한다. 일단 발현되면, 전 항체, 이의 이량체, 개개의 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태는 황산암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 겔 전기영동 및 참고로 포함된 문헌[Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982)]에 개시된 것을 포함하는 기타 유사 절차의 사용을 포함하는 당해 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 의약품 용도에 있어서, 적어도 90 내지 95%, 또는 심지어 98 내지 99%의 균질성 및/또는 순도 또는 정도를 갖는 실질적으로 순수한 면역글로불린을 이용하는 것이 바람직하다.
케모카인 결합에 연루된 개개의 경쇄 및/또는 중쇄 CDR을 포함하는 단쇄 항체뿐만 아니라 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 및 Fv 단편과 같은 항카인 항체의 단편 또는 절단형 항카인 항체도 1종 이상의 CC 케모카인에의 결합 또는 이의 중화에 사용될 수 있다.
항카인 항체를 화학적으로 변형시키거나 유도체화하여 바람직한 효과를 제공할 수 있다.
항체 콘쥬게이트 또는 콘쥬게이션된 항체는 비상동성 단백질에의 펩티드 결합을 통하여 연결된 항카인 항체 또는 이의 단편을 이용하여 만들어질 수 잇다. 이러한 실시양태에서, 항체의 항원 결합 부분은 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1, 및/또는 다른 관련 CC 케모카인에 결합한다. 또한 항카인 항체는 효소, 독소 또는 사이토카인에 이펙터 모이어티로서 콘쥬게이션될 수 있다. 이는 또한 액세서리 모이어티, 예컨대 화학적 또는 방사성 태그, 독소, 생물학적 활성 또는 표적화 모이어티, 또는 이의 생물학적 반감기 또는 생물학적 이용가능성을 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 알부민에의 콘쥬게이션에 의해 증가시키는 다른 물질을 포함하거나, 도는 그에 추가로 콘쥬게이션되거나 공유 결합될 수 있다. 본 발명의 항카인 항체는 참고로 포함된 문헌[Carter and Senter, Cancer J. 14: 154-169 (2008)]에 개시된 것과 같은 액세서리 모이어티를 포함하거나 그에 콘쥬게이션될 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 생성물은 고형 기재 또는 면역친화성 수지, 예컨대 본원에 참고로 포함된 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual; Eds. E. Harlow & D. Lane, (1988)]에 기술된 것에 고정될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 단편의 페길화는 예를 들어 하기 참고 문헌[Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992)]; 유럽 특허 제0 154 316호; 및 유럽 특허 제0 401 384호에 기술된 바와 같이 당해 분야에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 실시될 수 있는데, 상기 문헌 및 유럽 특허 각각은 이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 바람직하게는, 페길화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 이용한 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 실시된다. 본 발명의 항체 및 항체 단편의 페길화에 바람직한 수용성 중합체는 PEG이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "폴리에틸렌 글리콜"은 모노 (C1--C1O) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콘과 같이 다른 단백질의 유도체화에 사용되었던 임의의 형태의 PEG를 포함하는 것으로 의미된다.
본 발명의 페길화 항체 및 항체 단편의 제조 방법은 일반적으로 (a) 항체 또는 항체 단편이 하나 이상의 PEG기에 부착되게 하는 조건하에 항체 또는 항체 단편을 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물을 수득하는 단계를 포함한다. 공지된 파라미터 및 바람직한 결과를 기반으로 하여 최적 반응 조건 또는 아실화 반응을 선택하는 것은 당업자에게 명백하다.
페길화 항체 및 항체 단편은 일반적으로 본원에 기술된 항체 및 항체 단편의 투여에 의해 완화되거나 조정될 수 있는 질병의 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 페길화 항체 및 항체 단편은 페길화되지 않은 항체 및 항체 단편과 비교하여 증가된 반감기를 갖는다. 페길화 항체 및 항체 단편은 단독으로, 다른 약학 조성물과 함께 또는 그와 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 당해 분야에서 인식되는 기술을 이용하여 알부민에 콘쥬게이션된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 잠재적인 글리코실화 부위를 감소시키거나 제거하도록 변형된다. 이러한 변형된 항체는 흔히 "글리코실화 제거된" 항체로 칭해진다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 친화성을 향상시키기 위하여, 항체의 글리코실화 부위는 예를 들어 돌연변이 유발 (예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발)에 의해 변경될 수 있다. "글리코실화 부위"는 당 잔기의 부착을 위한 장소로서 진핵 세포에 의해 인식되는 아미노산 잔기를 나타낸다. 탄수화물, 예컨대 올리고당이 부착되는 아미노산은 전형적으로 아스파라긴 (N-결합), 세린 (O-결합), 및 트레오닌 (O-결합) 잔기이다. 항체 또는 항원 결합 단편 내의 잠재적인 글리코실화 부위를 확인하기 위하여, 예를 들어 미국 생물 서열 분석 센터 (Center for Biological Sequence Analysis)에 의해 제공되는 웹사이트 (N-결합 글리코실화 부위의 예측의 경우 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/, 그리고 O-결합 글리코실화 부위의 예측의 경우 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ 참조)와 같은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 사용함으로써 항체의 서열을 조사한다. 항체의 글리코실화 부위를 변경시키는 추가의 방법이 참고로 포함된 미국 특허 제6,350,861호 및 미국 특허 제5,714,350호에 기술되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편을 항체의 불변 영역의 변형에 의해 변경시켜 비변형 항체에 비하여 하나 이상의 불변 영역-매개된 생물학적 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 항체를 변형시켜서 이것이 Fc 수용체에 대하여 감소된 결합성을 나타내도록 하기 위하여, 항체의 면역글로불린 불변 영역 세그먼트를 Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이시킬 수 있다 (예를 들어, 모두 참고로 포함된 문헌[Canfield, S. M. and S. L. Morrison, J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991)]; 및 문헌[Lund, J. et al., J. Immunol. 147:2657-266 (1991)] 참조). 항체의 FcR 결합 능력의 감소는 또한 FcR 상호작용에 의존적인 다른 이펙터 기능, 예컨대 옵소닌화 및 식균작용과 항원 의존성 세포 독성을 감소시킬 수 있다. 항체 이펙터 기능을 향상 또는 감소시키고 혈청 중 지속성을 감소 또는 연장시키기 위한 불변 영역 유도체가 참고로 포함된 문헌[Carter, P. J., Nat. Rev. Immunol. 6:343-357 (2006)]에 기술되어 있다.
본 발명의 항카인 항체는 상기에 기술된 것과 같은 약학 조성물 내로 또는 치료를 필요로 하는 피험체에게 항체를 투여하거나, 이것을 보관, 보존하기 위하여 사용되는 조성물 내에 포함시킬 수 있다.
상기의 치료학적 또는 진단학적 응용에서 사용하기 위한 키트는 하나 이상의 항카인 항체, 양성 또는 음성 대조 항체, 항카인 항체가 결합하는 CC 케모카인, 항카인 항체가 결합하지 않는 대조 케모카인과, 기타 약리학적 또는 진단학적 성분 및 키트 사용에 관한 서면으로 된 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 예를 들어 치료학적 목적(CC 케모카인의 활성의 조정에 의해), CC 케모카인을 검출하거나 정량화하기 위한 진단 목적, 및 CC 케모카인의 정제에 유용하다. 따라서, 본원에 기술된 목적들 중 임의의 것을 위한 본 발명의 항체를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범주 이내이다.
CC 케모카인, 특히 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및/또는 MCP-1은 염증과 관련된 병리학적 상태에서 그 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및/또는 MCP-1 모두는 백혈구, 특히 단구 및 T 림프구에 대하여 강한 화학주성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 병리학적 상태은 본원에 참고로 포함된 문헌[Johnson et al., Trends Immunol. 26:268-274 (2005)]에 기술된 것을 포함한다.
MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및/또는 MCP-1은 단구 및 T 림프구에 대하여 강한 화학주성 활성을 갖는 분자이다. 인간 질환에 있어서, 모든 4종의 이들 케모카인의 증가된 발현 및 이의 중첩된 활성이 주어질 경우, 2종, 3종 또는 4종의 CC 케모카인 분자의 차단은 단지 단일 CC 케모카인 단독의 억제보다 더 큰 유익한 효과를 가질 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 이들 케모카인의 활성을 조정하고 이들 케모카인과 관련된 장애의 병인에 영향을 주는 데 유용하다. 그와 같이, 이들 항체 및 단편은 CC 케모카인 분자의 발현과 관련된 병리학적 상태 및 염증성 질병의 치료를 위한 치료 조성물에서 유용하다. 이들 실시양태에서, 환자는 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타냄에 의한 것과 같이 치료될 질환들 중 하나를 갖는 것으로 확인된다. 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 조성물은 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화시키기에 충분한 양으로 또는 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, 및/또는 MCP-1 중 하나 이상의 활성을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.
예방 또는 치료에 따르는 장애. 본원에 사용되는 바와 같이, "CC 케모카인 활성이 해로운 장애" 및 "CC 케모카인-관련된 장애"라는 용어는 장애를 앓고 있는 피험체에 있어서 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, MCP-1 및 기타 CC 케모카인을 포함하는 CC 케모카인의 존재가 그 장애에 기여하는 인자 또는 그 장애의 병리생리학적 특성에 책임이 있을 것으로 의심되거나 이러한 것으로 밝혀진 질환 또는 기타 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, CC 케모카인 활성이 해로운 장애는 CC 케모카인 활성의 억제가 그 장애의 증상 및/또는 진행을 방지하거나 완화시키는 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는 예를 들어 그 장애를 앓고 있는 피험체의 생물학적 유체 중의 CC 케모카인의 농도의 증가, 예를 들어 피험체의 혈청, 혈장, 활액, 소변 등 중의 RANTES의 농도의 증가에 의해 입증될 수 있는데, 상기 RNATES 농도 증가는 예를 들어 항-RANTES 항체를 사용하여 탐지될 수 있다. CC 케모카인 활성이 해로운 장애의 다수의 예가 있다. 특정 장애의 예방 또는 치료에 있어서의 본 발명의 항체 및 항체 부분의 사용이 하기에 추가로 논의된다.
류마티스 관절염(RA)은 T 및 B 림프구, 대식세포, 및 호중구를 비롯한 백혈구가 관절의 활액막 내로 유입되는 것을 특징으로 하며, 문헌[Koch, Arthritis Rheum. 52: 710-721 (2005)]의 개관을 참조한다. MIP-1α는 RA 환자의 활액에서 높은 수준으로 발견되며 증가된 수준은 질환의 중증도와 상관된다. 이와 유사하게 RA의 설치류 쥐과 모델에서 MIP-1α가 관절염에 걸린 관절에서 발견된다. 중화 항체는 콜라겐-유도 관절염 모델에서 관절염 스코어를 대략 50%만큼 감소시킨다 (문헌[Kasama, et al., J. Clin. Invest. 95: 2868-2876 (1995)]).
RANTES의 수준이 또한 관절염의 설치류 아쥬반트-유도 모델에서 관절에서 증가된다. RANTES에 대한 항체는 이 모델에서 증상을 감소킨다(문헌[Barnes et al., J. Clin. Invest. 101 : 2910-2919 (1998)]).
MCP-1은 또한 RA 환자에서 활막 세포 및 침윤성 백혈구에 의해 생성되는 것으로 나타났다. MCP-1에 대한 중화 항체가 또한 관절염의 설치류 모델에서 임상 스코어를 감소시킨다(문헌[Ogata, et al., J. Pathol. 182: 106-114 (1997)]).
다발성 경화증(MS)은 신경 주위의 마이엘린초의 분해 및 신경 조직 내로의 백혈구의 유입을 특징으로 한다. MIP-1α, RANTES, 및 MCP-1을 비롯한 높은 수준의 케모카인이 MS 환자의 뇌 병변에서 발견된다(문헌[Sorensen, et al., J. Clin. Invest. 103: 807-815 (1999)]).
실험적 자가면역성 뇌염(EAE)은 인간 MS를 밀접하게 모방하는 질환 모델이다. MIP-1α와 MCP-1은 중화 항체에서 나타난 바와 같이, 둘 모두 질환 증상의 유도와 재발 발생에 연루되었다(문헌[Kennedy, et al., J.Neuroimmunol. 92: 98-108 (1998)]).
섬유성 질환은 간질 섬유 조직의 증가에 의해 표시되는 임의의 질병을 포함한다. CC 케모카인은 섬유성 질병과 관련된 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β의 수준은 전신성 경화증을 가진 환자에서 모두 상승되며 높은 수준의 CC 케모카인은 이들 환자에서 폐 섬유증의 발병과 상관된다(문헌[Hesegawa et al., Clin. Exp. Immunol. 117: 159-165 (1999)]).
아테롬성 동맥 경화증은 대식세포의 높은 침윤을 가진 혈관 지질 침착을 특징으로 한다. MCP-1 넉아웃(knockout) 마우스는 아테롬성 동맥 경화증의 쥐과 모델에서 대식세포와 지질 침착의 주목할만한 감소를 보여준다(문헌[Gu, et al., MoI. Cell 2: 275-281 (1998)]).
천식 환자는 폐에서 주목할만한 백혈구 침윤과 CC 케모카인의 수준 증가를 가져 기도 과민 반응성을 야기하였다. 천식의 설치류 모델에서, MIP-1α, MCP-1 또는 RANTES에 대한 중화 항체는 이 질환에 전형적인 염증 및/또는 기도 과민 반응성을 감소시킨다(문헌[Lukacs, et al., J. Immunol. 158: 4398-4404 (1997)]).
상기 문헌에 기술된 동물 모델은 관련된 질병, 장애 또는 질환의 치료에서 항카인 항체의 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있으며 이들 모델 및 이것의 사용 방법은 상기 문헌을 참고로 하여 포함된다.
상기에 강조된 질환 이외에, 다수의 다른 질병, 장애 및 질환이 하나 이상의 케모카인의 활성과 관련되었으며, 이는 발암성 질환, 염증성 장질환, 아토피성 피부염, 건선, 뇌졸중, 기관 이식, COPD, 사구체신염, 루푸스 신염, 경피증, 간경변, 알츠하이머병, CHF 허혈, 관동맥 재협착, 당뇨성 신장병증/신경장애/망막증, 골관절염, 치주염, 효모 및 바이러스 감염, 및 임신의 이상조절을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. CC 케모카인이 이들 병인에서 그 역할을 할 경우, 항카인 항체를 투여하여 이들 질병의 중증도를 감소시킬 수 있다.
이러한 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 동물 또는 인간과 같은 피험체에게 일반적으로 약학적으로 허용되는 담체 중의 소정량의 항카인 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 항카인 항체 또는 이의 절단 버전 또는 단편의 양은 피험체에서 하나 이상의 케모카인의 활성을 억제하도록 선택된다. 피험체로부터 제거된 생물학적 물질(예를 들어, 혈액, 골수, 유기 조직) 또는 시험관내에서 유지된 생물학적 물질에서 생체외에서 유사한 방법을 수행할 수 있다.
항카인 항체를 이용하여 화학주성을 차단할 수 있다. 이러한 방법은 항카인 항체를 항카인 항체가 결합하는 CC 케모카인을 포함하는 배지 또는 이들 CC 케모카인을 생성하는 세포를 포함하는 배지와 혼합하거나 접촉시키는 단계를 포함한다.
진단학적 분석법에서 본 발명의 항카인 항체가 유용하게 이용될 수 있다. 이러한 분석법은 CC 케모카인에 대하여 공지된 특이성을 갖는 항카인 항체를 항카인 항체가 결합하는 하나 이상의 케모카인을 함유할 것으로 의심되는 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계 및 예를 들어 복합체 형성의 측정에 의해 결합의 양을 결정하는 단계를 포함한다. 항카인 항체는 유리 형태로 또는 기질 결합된 형태로 사용될 수 있다. 본 발명은 샘플 중 CC 케모카인을 검출하는 시험관내 면역분석법을 추가로 제공한다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 다양한 공지된 면역학적 분석법을 이용하여 샘플 중 CC 케모카인을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 방사성면역분석법, 면역침전법, 면역친화성 크로마토그래피, 조직 섹션의 면역염색, 전자 현미경을 이용한 조직 샘플에서의 면역금 검출 등에서 사용될 수 있다. 이들 및 기타 분석법의 프로토콜은 당해 분야에 공지되어 있으며, 당업자의 이해범위 이내이다.
본 발명의 항체 및 항체 단편을 이용한 면역분석법을 이용하여 샘플 중 CC 케모카인의 존재 및 상대적인 양을 탐지할 수 있다. 샘플은 균질화된 조직 또는 세포, 광학 현미경법 또는 전자 현미경법을 위한 조직학적 조직 섹션, 조직 또는 세포의 단백질 추출물, csf, 관절액, 혈액, 혈장, 혈청, 점막 분비물, 정액, 질 분비액, 눈물, 타액, 땀, 소변, 대변 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 정상 샘플에 비하여 증가된 양의 CC 케모카인의 존재는 질환 상태의 존재를 나타낼 수 있으며, 본 발명의 치료제를 이용한 치료가 지시될 수 있다. 일부 예에서, 정상 샘플에 비하여 감소된 양의 CC 케모카인(들)이 있을 수 있으며, 적절한 CC 케모카인(들) 또는 CC 케모카인(들)을 모방하는 내부 이미지 항체를 이용한 치료를 이용하여 면역 기능을 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역분석법을 이용하여 CC 케모카인의 정제를 도울 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편이 기재상에 고정된 면역친화성 수지가 사용될 수 있다. CC 케모카인(들)을 함유하는 샘플이 면역친화성 수지에 첨가되고, 항체는 수지에 결합하게 되며, 한편 샘플의 다른 성분은 용액중에 남아있다. 수지는 세척되며, CC 케모카인은 후속적으로 수지로부터 용출되고, 실질적으로 정제 및 단리된다. 바람직하게는, 면역분석법에 사용되는 항체는 결합 친화성이 높으며, 이는 본원에 정의된 바와 같다.
[실시예]
본 발명을 하기 실시예로 추가로 예시하는데, 하기 실시예는 한정하는 것으로 파악되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고 문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용과, 도면 및 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1 - 항카인 항체를 생성하는 하이브리도마의 제조
랜덤한 순서로 처음에 MIP-1α, RANTES 및 MCP-1 (페프로테크 (PeproTech))를 포함하는 세트로부터의 3종의 CC 케모카인을 이용하여 마우스를 순차적으로 면역화하였다. MAb 3C12F를 생성하는 하이브리도마 융합체 3에 있어서, 마우스를 처음에 MIP-1α로 면역화하고, 이어서 RANTES, 그 후 MCP-1, 그 후 MCP-1로 다시 면역증강시켰다. MAb 7D12A 및 7D1G를 생성하는 하이브리도마 융합체 7에 있어서, 마우스를 처음에 MIP-1α로 면역화하고, 이어서 MCP-1, 그 후 RANTES, 그 후 MIP-1α와 RANTES의 조합물로 면역증강시켰다. MAb 18V4F 및 18P7E를 생성하는 하이브리도마 융합체 18에 있어서, 마우스를 청음에 MIP-1β로 면역화하고, 이어서 MIP-1α, 그 후 RANTES로 면역증강시키고, 그 후 RANTES로 한번 더 면역증강시켰다.
각각의 면역화에 있어서, 표준 면역화 프로토콜에 따라 10 ㎍의 단백질을 사용하였으며, 문헌[Current Protocols in Immunology, Eds. JE Coligan, et al. (2006), section 2.1]을 참조한다. 처음 면역화는 완전 프로인트 아쥬반트에서 행하였으며, 이어서 불완전 프로인트 아쥬반트 중 2종의 상이한 케모카인의 3주 간격의 면역증강을 행하였다.
최종 면역증강 10일 후, 혈청을 수집하고, 참고로 포함된 문헌[Current Protocols in Immunology, 2006, Eds. JE Coligan et al., section 2.4]에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 CC 케모카인 MIP-1α, RANTES, MCP-1 및 MIP-1β와의 반응성에 대하여 시험하였다. MIP-1α에 있어서, 상기 케모카인을 96웰 ELISA 플레이트상에 코팅하고 (1 ㎍/㎖로), 1:50 내지 1:6400의 희석 범위로 혈청과 함께 인큐베이션하였다. RANTES, MCP-1 및 MIP-1β에 있어서, 바이오티닐화 케모카인 (0.5 ㎍/㎖)을 스트렙타비딘-코팅된 플레이트(피어스(Pierce))에 첨가하고, 그 후 희석 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 코팅된 케모카인에 결합된 항체를 HRP에 콘쥬게이션된 항-마우스 Fc 이차 항체를 이용하여 검출하였다.
ELISA 분석을 위한 케모카인의 바이오티닐화는 술포-NHS-LC-비오틴(피어스)을 이용하여 수행하였다. PBS 중 케모카인을 대략 2배 몰 과량의 술포-NHS-LC-비오틴과 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 자유 비오틴 시약은, 컷오프(cutoff)가 3,500 MW인 슬라이드-a-라이저(Slide-a-lyzer) 미니 투석 유닛을 사용하여 PBS 중에서 하룻밤 투석시킴으로써 제거하였다.
MIP-1α, RANTES 및 MCP-1을 이용한 면역화의 청음 세트로부터의 혈청에서의 ELISA의 결과는, 비록 MIP-1β가 직접적인 면역원으로서 사용되지 않는다 해도 MIP-1β에 대하여 약간 응답하는 것을 포함하여 다양한 응답을 보여주었다(표 1 참조). 몇몇 마우스는 3종, 심지어 4종의 케모카인에 대하여 응답하였다. 이들은 다수의 케모카인과 반응하는 단일 항체를 찾기 위한 하이브리도마 융합체의 후보였다. 하기 표 1에 예시된 바와 같이, 면역화된 마우스는 다수의 CC 케모카인과 반응하는 다클론 혈청을 생성하였다.
Figure 112012024453421-pct00001
3종 이상의 표적 케모카인과의 유의한 혈청 반응성을 나타내는 마우스를 하이브리도마 융합을 위하여 선택하였으며, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Eds. E. Harlow & D. Lane (1988), chapter 6]을 참조한다.
하이브리도마를 생성하기 위하여 NS1 세포와의 융합을 위하여 비장을 수확하기 전 -4일 및 -3일에 PBS 중 케모카인(각각 20 ㎍)의 혼합물로 선택한 마우스를 면역증강시켰다. 냉동된 두 슬라이드 말단 사이를 누르고 10 ㎖ RPMI 중에 세포를 수집함으로써 단일 세포 현탁물을 비장으로부터 만들었다. 세포를 70 ㎛ 나일론 여과기(strainer)에 통과시키고, 10 ㎖의 추가의 RPMI로 헹구고, 300 x g에서 5분 동안 펠렛화하였다. 세포를 2회 더 세척 및 원심분리하고, 그 후 카운팅하였다. 비장 세포를 5:1의 비장:NS1의 비로 NS1 세포(ATCC)와 합하고, 그 후 펠렛화하였다. 1 ㎖의 50% PEG를 펠렛화 세포에 스월링시키면서 1분에 걸쳐 적가하고, 그 후 혼합물을 추가로 1분간 스월링시켰다. 추가의 1 ㎖의 RPMI를 스월링시키면서 1분에 걸쳐 첨가하고, 그 후 추가의 3 ㎖의 RPMI를 스월링시키면서 1분에 걸쳐 첨가하고, 그 후 추가의 16 ㎖의 RPMI를 스월링시키면서 2분에 걸쳐 첨가하였다. 세포를 300 x g에서 10분 동안 펠렛화하고, 800 ㎖의 하이브리도마 선발 배지에 재현탁시켰다. 세포를 2시간 동안 휴지시키고, 그 후 40개의 96웰 플레이트 위에 200 ㎕/웰로 분배하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 넣고, 배지의 부피의 절반을 제거하고 대체함으로써 다음 8-10일에 걸쳐 매 2-3일마다 공급하였다. 대안적으로, 융합된 세포를 4 ㎍/㎖의, 알렉사488(Alexa488)-태깅된 MIP-1α + 클론디텍트(CloneDetect)(제네틱스(Genetix))를 함유하는 메틸셀룰로스 기반의 반고형 배지 클론매트릭스 (CloneMatrix)(제네틱스)에 현탁시키고, 단일 웰 10 cm 플레이트(제네틱스)에 도말하였다.
실시예 2 - 항카인 항체의 확인
실시예 1에서 수득한 하이브리도마 상청액 중 항체를 MIP-1α, RANTES, MCP-1 및 MIP-1β를 인식하는 이의 능력에 대하여 ELISA로 시험하였다(상기에 기술한 혈청 시험과 유사). 처음의 하이브리도마 상청액에 있어서의 ELISA 결과가 하기 표 2에 예시되어 있다. 배경에 비하여 적어도 4배의 하나 초과의 케모카인과의 반응성을 나타낸 융합물 웰로부터의 세포를 추가의 시험을 위하여 24웰 플레이트로 확장시켰다. 3개 이상의 케모카인과 반응하는 웰로부터의 세포를 제한 희석에 의해 또는 적어도 2회의 연속 희석에 의해 클로닝하였다. 클론 플레이트 상청액을 ELISA로 다시 시험하여 다수의 케모카인에 대하여 반응성인 항체를 생성한 개개의 클론을 확인하였다. 양성 웰을 시각적 검사에 의해 클론인 것으로 인증하였다.
대안적으로, 반고형 배지에서 콜로니로 성장한 하이브리도마를 16일 후에 성장 및 형광 케모카인 결합 - 클론픽스FL(ClonePixFL)(제네틱스)을 이용함 - 에 대하여 분석하고, 최상의 콜로니를 96웰 플레이트 내로 골라냈다. 하이브리도마 클론으로부터의 항체-함유 상청액을 4일 후에 ELISA에 의해 MIP-1α(직접적으로 코팅된 것 및 바이오티닐화된 것 둘 모두), RANTES 및 MIP-1β와의 반응성에 대하여 분석하였으며, 이는 혈청 분석에 대하여 상기에 기술한 바와 같았다. 클론 18V4F 및 18P7E는 모든 3종의 CC 케모카인과의 유의한 반응성을 나타냈다. 이들을 연속 희석에 의해 재클로닝하여 클론성을 인증하고 ELISA에 의해 다시 시험하여 다중-케모카인 반응성을 나타내는 항카인 항체의 생성을 인증하였다.
Figure 112012024453421-pct00002
실시예 3 - 항카인 항체의 케모카인 결합 특이성의 특성화
단리된 항카인 항체에 대한 케모카인 결합 특이성의 더욱 완전한 분석을 MSD(중간 규모 발견(Meso Scale Discovery)) 분석을 이용하여 수행하였다. 이는 항체 스크리닝 동안 행한 ELISA 분석과 매우 유사하였지만, 이것은 술포-태그 (SULFO-TAG) 시약의 전기화학발광 검출을 사용하였다. 이 경우, 선택된 케모카인을 MSD 96웰 멀티어레이(multiarray) 플레이트(MA2400) 상에 1 ㎍/㎖로 코팅하였다. 항카인 항체를 3 ㎍/㎖(정제 항체 3C12F, 7D12A, 7D1G, 18V4F)로 또는 비정량화 하이브리도마 항체-함유 상청액(18P7E)으로서 첨가하고, 1 ㎍/㎖로 사용한 세포-태그 항-쥐과 동물 항체를 이용하여 검출하였다. 플레이트를 MSD 섹터 이미저(imager) 2400에서 판독하였다. 도면에서 점선으로 나타낸 배경 수준은 비-반응성 단백질, 소 혈청 알부민(BSA)에의 결합을 기반으로 하였다.
실시예 4 - 항카인 항체의 기능적 활성의 조사
실시예 2에서 수득한 확장된 융합물 웰로부터의 상청액을 표적 케모카인에 의해 매개되는 화학주성을 차단하는 능력에 대하여 시험하였다. 이는 96웰 트랜스웰 플레이트(밀리포어(Millipore))에서 CCR2 형질전환체(MCP-1의 수용체) 또는 CCR5 형질전환체(MIP-1α, RANTES 및 MIP-1β의 수용체)를 사용하여 시험관내에서 시험하였다. 각각의 트랜스웰 챔버의 하부 웰에서, 75 ㎕의 케모카인 용액(2% FBS를 포함하는 RPMI 중 10 ng/㎖)을 75 ㎕의 하이브리도마 상청액과 혼합하였다. 각각의 챔버의 상부 웰에서 2% FBS를 포함하는 75 ㎕의 RPMI 중 4×105개의 세포를 첨가하였다. 세포 이동이 37℃에서 2시간 동안 일어나게 하고, 그 후 하부 챔버 내의 세포의 수를 팩스칼리버(FACScalibur)를 사용하여 세포 카운팅에 의해 정량화하였다. 그 후 적어도 2종의 케모카인의 억제를 나타낸 하이브리도마 웰로부터의 세포를 연속 희석에 의해 또한 클로닝하였다. 정제된 항체를 일련의 농도에서 화학주성 억제에 대하여 유사하게 시험하였다.
화학주성 분석에서 사용한 케모카인 수용체 형질전환체를 Ba/F3 세포(저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐스 - DSMZ로부터 획득)를 이용하여 생성하였다. 인간 CCR2 및 CCR5의 개방 판독 프레임을 오리진(Origene)으로부터 구매한 cDNA 클론으로부터 PCR에 의해 증폭시켰다(문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eds. Sambrook et al.]). PCR 프라이머를 공개된 서열로부터 디자인하였다. 5' 프라이머는 개시 Met 코돈과 중첩되었으며, XhoI 클로닝 부위를 포함하였다. 3' 프라이머는 종결 코돈과 중첩되었으며, XbaI 클로닝 부위를 포함하였다. 증폭시킨 단편을 XhoI 및 XbaI로 절단하고, 발현 플라스미드 pNEF38 내의 등가의 부위 내로 삽입하였다(문헌[Running Deer & Allison, Biotechnol Prog 20, 880-889, 2004]). Ba/F3 세포를 전기천공(아막사(Amaxa))에 의해 발현 플라스미드로 트랜스펙션시키고 G418에서 선발하였다. 기능적 수용체를 발현하는 세포를 동계 케모카인 리간드에 대한 화학주성을 통하여 선발하고, 이동 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하여 안정한 세포 클론을 수득하였다.
실시예 5 - 항카인 항체의 확인 및 특성화
다수의 CC 케모카인을 인식한 5종의 유일무이한 단클론 항체를 확인하고, 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E로 명명하였다. 이 항체의 이소형을 이소스트립스(IsoStrips)(로슈(Roche))를 사용하여 결정하였다. 3C12F 중쇄는 쥐과 동물 하위군 IgG1의 구성원인 것으로 결정된 반면 3C12F 경쇄는 쥐과 동물 κ 군의 구성원인 것으로 결정되었다. 7D1G 중쇄는 쥐과 동물 하위군 IgG1의 구성원인 것으로 결정된 반면 7D1G 경쇄는 쥐과 동물 κ 군의 구성원인 것으로 결정되었다. 7D12A 중쇄는 쥐과 동물 하위군 IgG1의 구성원인 것으로 결정된 반면 7D12A 경쇄는 쥐과 동물 κ 군의 구성원인 것으로 결정되었다. 18V4F 중쇄는 쥐과 동물 하위군 IgG2a의 구성원인 것으로 결정된 반면 18V4F 경쇄는 쥐과 동물 λ의 구성원인 것으로 결정되었다. 18P7E 중쇄는 IgG1인 것으로 결정되었으며, 이의 경쇄는 쥐과 동물 λ인 것으로 또한 밝혀졌다.
MAb 3C12F는 도 1에서 정제 항체를 사용하여 예시된 바와 같이 그리고 ELISA에 의해 원래 분석된 바와 같이 MIP-1α, RANTES 및 MIP-1β를 인식하였으며(표 2a 참조) 바이러스 vCCI 분자가 RANTES에 결합하는 것을 차단하였다(도 2). 화학주성 분석에서 3C12F는, 5 ng/㎖의 케모카인을 사용하여 화학주성을 유도할 때 3-5 ㎍/㎖의 IC50 값으로 MIP-1α 및 RANTES의 기능을 억제하였다(도 3). 비아코어®에 의하면, MIP-1α에 대한 3C12F의 친화성은 49 nM이다.
항체 7D1G 및 7D12A 둘 모두는 하이브리도마 상청액을 ELISA에 의해 분석할 때 MIP-1α 및 MIP-1β를 인식하였다(표 2a). 이러한 상기 항체는 또한 도 4 및 도 5에 의해 예시되는 바와 같이 화학주성 분석에서 둘 모두의 케모카인의 기능을 차단하였다.
항체 18V4F 및 18P7E 둘 모두는, 하이브리도마 상청액을 ELISA에 의해 분석할 때 MIP-1α, MIP-1β, 및 RANTES를 인식하였다(표 2b). 상기 항체는 도 6 및 도 7에 의해 예시되는 바와 같이 화학주성 분석에서 케모카인 MIP-1α, RANTES, 및 MIP-1β의 기능을 (적어도 부분적으로) 또한 차단하였다.
케모카인의 어레이를 이용하여 정제 항카인 항체(또는 18P7E의 경우 클론성 하이브리도마로부터의 항체 상청액)의 반응성을 분석하기 위하여 MSD 플랫폼을 사용하면, 항카인 항체 3C12F가 배경에 비하여 적어도 4배로 MIP-1α, RANTES, MIP-1β, MPIF-1 및 HCC-2에 결합함이 밝혀졌다(도 8). 이와 유사하게, 항카인 항체 7D12A는 MIP-1α, RANTES, MIP-1β 및 MPIF-1에 결합하며(도 9), 항카인 항체 7D1G는 MIP-1α, RANTES, MlP-1β, HCC-1, MPIF-1 및 PARC에 결합하였다(도 10). 항카인 항체 18V4F 및 18P7E 둘 모두는 MIP-1α, RANTES, 및 MIP-1β에 결합하였다(도 11 및 도 12).
하기 표 3에는 이들 5종의 항카인 단클론 항체의 결합 특이성이 요약되어 있다.
Figure 112012024453421-pct00003
실시예 6 - 항카인 항체가 결합하는 CC 케모카인에 공통적인 구조의 분석
단클론 항체 7D1G, 7D12A, 3C12F, 18V4F 및 18P7E가 결합하는 CC 케모카인의 아미노산 서열을 정렬하였다. 도 13에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항카인 단클론 항체가 결합하는 몇몇 상동성 영역 또는 높은 정도의 구조적 유사성을 갖는 몇몇 영역을 확인하였다. CC 케모카인의 이들 공통 또는 보존 세그먼트의 확인은 항체 결합을 특성화하며, 이는 새로운 항카인 항체의 생성 또는 스크리닝을 위한 코어 구조로서의 역할을 한다.
도 13a 내지 도 13d는 각각의 항카인 항체 3C12F(도 13a), 7D12A(도 13b), 7D1G(도 13c), 18V4F(도 13d) 및 18P7E(도 13d)가 결합하는 CC 케모카인의 정렬을 예시한다. 특정 항카인 항체가 결합하는 CC 케모카인에 의해 공유되는 동일한 아미노산 잔기는 음영으로 처리하였다. 유사한 아미노산 잔기를 표 5에 따라 표기하였으며, 예를 들어 아미노산 잔기 알라닌 (A)은 글리신, 세린 또는 트레오닌과 유사하다.
공유된 동일한 또는 유사한 잔기를 페르난데스(Fernandez)의 상기 문헌의 도 1 및 도 2와 문헌[Czaplewski et al., J. Biol. Chem. 274: 16077-84 (1999)]을 기반으로 하여 용매 노출되지 않은 것으로서, 부분적으로 용매 노출된 것으로서 또는 완전히 용매 노출된 것으로서 추가로 특성화하였으며, 상기 둘 모두의 문헌은 참고로 포함되었다.
추가의 분석은 정렬된 동일하거나 동일 + 유사한 잔기의 공유된 용매 노출된 잔기들을 CC 케모카인 수용체의 결합과 관련된 CC 케모카인 잔기와 상관시켰다. 케모카인 수용체 결합 부위에 관한 구조적 정보 및 기타 구조적, 화학적 또는 기능적 정보는 2010년 8월 9일에 각각이 마지막으로 접근된 하기에 예시된 웹 주소 및 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD29111(uid)에의 본원에 기술된 케모카인 또는 기타 생물학적 분자의 입력을 참고로 하여 포함된다.
MIP-1α/CCL3(서열 번호 71)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=NP_002 974.1에 기술되어 있다.
MIP-1β/CCL4(서열 번호 72)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=AAH70310.1에 기술되어 있다.
RANTES/CCL5(서열 번호 73)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P13501.3에 기술되어 있다.
MPIF-1/CCL23(서열 번호 81)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P55773.2에 기술되어 있다.
HCC-1/CCL14(서열 번호 78)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=NP_004 157.1에 기술되어 있다.
HCC-2/CCL15(서열 번호 79)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=Q16663.2에 기술되어 있다.
PARC/CCL18(서열 번호 82)의 추정 수용체 결합 부위 잔기 및 기타 구조적 특징이 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?INPUT_TYPE=live&SEQUENCE=P55774.1에 기술되어 있다.
MAb 3C12F는 도 13a에서 상대적인 위치 11, 12, 15, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 51, 52, 54, 59 및 66에서 동일한 아미노산 잔기 C, C, Y, P, Y, T, C, S, P, V, F, T, C, A, P, V 및 L을 공유하는 CC 케모카인을 인식한다. 이들 잔기 중, 잔기 11, 12, 15, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 54 및 66은 짜플레브스키(Czaplewki)의 상기 문헌 및 페르난데스의 상기 문헌의 도 1 및 도 2를 기반으로 하면 부분적으로 또는 완전히 용매 노출된다.
게다가, MAb 3C12F에 의해 인식되는 CC 케모카인은 도 13a에서 위치 9, 14, 20, 25, 29, 33, 39, 41, 45, 46, 48 및 63에서 화학적으로 유사한 아미노산 잔기를 공유한다. 이들 잔기 중, 14, 20, 29, 33, 39, 45, 46, 및 48의 것은 부분적으로 또는 완전히 용매에 노출된다(도 13a와 페르난데스 등의 도 1 및 도 2를 비교).
이러한 구조 분석을 기반으로 하면, 동일한 그리고 유사한 잔기 11, 12, 14, 15, 20, 21, 28, 29, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 45, 46, 48, 54 및 66은 MAb 3C12F 항체와 이것이 인식하는 CC 케모카인 사이의 결합에 있어서의 결정부위로서 이용가능한, MAb 3C12F가 결합하는 CC 케모카인 분자의 공유된 부분을 형성한다.
이들 공유된, 용매 노출 잔기 중, 잔기 14, 15, 20, 21 및 66은 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111에 따라 케모카인 수용체 접촉 잔기로서 특성화되었다. CC 케모카인 수용체에 있어서의 접촉 잔기에의 항카인 항체의 결합의 차단은 CC 케모카인이 이의 수용체에 결합하는 능력에 영향을 주거나 상기 능력을 조정한다.
MAb 3C12F가 결합하는 CC 케모카인의 공유된, 용매 접근 가능한 잔기는 추가로 CC 케모카인 구조와 상관되었으며, CC 케모카인의 처음 CC 잔기와 β1 가닥 사이의 N-루프와, β1 가닥과 β2 가닥 사이의 CC 케모카인의 30번대 루프에서 나타난다.
MAb 7D12A는 도 13b에서 상대적인 위치 11, 12, 15, 18, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 51, 52, 54, 59 및 66에서 아미노산 잔기 C, C, Y, R, P, Y, T, C, S, P, V, F, T, C, A, P, V 및 L을 갖는 CC 케모카인을 인식한다. 이들 잔기 중, 잔기 11, 12, 15, 18, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 54 및 66은 짜플레브스키의 상기 문헌 및 페르난데스의 상기 문헌의 도 1 및 도 2를 기반으로 하면 부분적으로 또는 완전히 용매 노출된다.
게다가, MAb 7D12A에 의해 인식되는 CC 케모카인은 도 13b에서 위치 9, 14, 20, 25, 29, 33, 39, 41, 45, 46, 48 및 63에서 유사한 아미노산 잔기를 공유한다. 이들 잔기 중, 14, 20, 29, 33, 39, 45, 46, 및 48의 것은 부분적으로 또는 완전히 용매에 노출된다(도 13b와 페르난데스 등의 도 1 및 도 2를 비교).
이러한 구조 분석을 기반으로 하면, 동일한 그리고 유사한 잔기 14, 15, 18, 20, 21, 28, 29, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 45, 46, 48, 54 및 66은 MAb 7D12A 항체와 이것이 인식하는 CC 케모카인 사이의 결합에 있어서의 결정부위로서 이용가능한, MAb 7D12A가 결합하는 CC 케모카인 분자의 공유된 부분을 형성한다.
이들 잔기 중, 잔기 14, 15, 18, 20, 21 및 66은 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111에 따라 케모카인 수용체 접촉 잔기로서 특성화되었다. 이들 잔기를 포함하는 경쟁적 항체 분석은 CC 케모카인이 이의 수용체에 결합하는 능력에 영향을 준다. MAb 7D12A가 인식하는 CC 케모카인에 있어서, 몇몇의 공유된 용매 접근가능 잔기는 CC 케모카인의 처음 CC 잔기와 β1 가닥 사이의 N-루프, β1 가닥과 β2 가닥 사이의 CC 케모카인의 30번대 루프와, β2 가닥과 β3 가닥 사이의 40번대 루프에서 나타난다.
MAb 7D1G는 도 13c에서 상대적인 위치 11, 12, 15, 21, 28, 31, 35, 38, 44, 51, 54 및 59에서 동일 아미노산 잔기 C, C, Y, P, Y, T, C, P, T, C, P, 및 V를 갖는 CC 케모카인을 인식한다. 이들 잔기 중, 잔기 11, 12, 15, 21, 28, 31, 35, 38 및 54는 짜플레브스키의 상기 문헌 및 페르난데스의 상기 문헌의 도 1 및 도 2를 기반으로 하면 부분적으로 또는 완전히 용매 노출된다.
게다가, MAb 7D1G에 의해 인식되는 CC 케모카인은 도 13c에서 위치 20, 25, 39-41, 45, 46, 63 및 66에서 유사한 아미노산 잔기를 공유한다. 이들 잔기 중, 20, 39, 45, 46 및 66의 것은 부분적으로 또는 완전히 용매에 노출된다(도 13c와 페르난데스 등의 도 1 및 도 2를 비교).
이러한 구조 분석을 기반으로 하면, 동일한 그리고 유사한 잔기 11, 12, 15, 20, 21, 28, 31, 35, 38, 39, 45, 46, 54 및 66은 MAb 7D1G 항체와 이것이 인식하는 CC 케모카인 사이의 결합에 있어서의 결정부위로서 이용가능한, MAb 7D1G가 결합하는 CC 케모카인 분자의 공유된 부분을 형성한다.
이들 공유된 잔기 중, 잔기 15, 20, 21, 24 및 66은 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111에 따라 케모카인 수용체 접촉 잔기로서 특성화되었다. 이들 잔기를 포함하는 경쟁적 항체 분석은 CC 케모카인이 이의 수용체에 결합하는 능력에 영향을 준다. MAb 7D1G가 인식하는 CC 케모카인에 있어서, 몇몇의 공유된 용매 접근가능 잔기는 CC 케모카인의 처음 CC 잔기와 β1 가닥 사이의 N-루프와, β2 가닥과 β3 가닥 사이의 40번대 루프에서 나타난다.
MAb 18V4F 및 MAb 18P7E는 도 13d에서 상대적인 위치 11, 12, 15, 18, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 51, 52, 54, 59 및 66에서 아미노산 잔기 C, C, Y, R, P, Y, T, C, S, P, V, F, T, C, A, P, V 및 L을 갖는 CC 케모카인을 인식한다. 이들 잔기 중, 잔기 11, 12, 15, 18, 21, 28, 31, 35, 36, 38, 54 및 66은 짜플레브스키의 상기 문헌 및 페르난데스의 상기 문헌의 도 1 및 도 2를 기반으로 하면 부분적으로 또는 완전히 용매 노출된다.
게다가, MAb 18V4F 및 18P7E에 의해 인식되는 CC 케모카인은 도 13d에서 위치 9, 14, 20, 25, 29, 33, 39, 41, 45, 46, 48 및 63에서 유사한 아미노산 잔기를 공유한다. 이들 잔기 중, 14, 20, 29, 33, 39, 45, 46 및 48의 것은 부분적으로 또는 완전히 용매에 노출된다(도 13d와 페르난데스 등의 도 1 및 도 2를 비교).
이러한 구조 분석을 기반으로 하면, 동일한 그리고 유사한 잔기 14, 15, 18, 20, 21, 28, 29, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 45, 46, 48, 54 및 66은 MAb 18V4F 및 18P7E 항체와 이것이 인식하는 CC 케모카인 사이의 결합에 있어서의 결정부위로서 이용가능한, MAb 18V4F 및 18P7E가 결합하는 CC 케모카인 분자의 공유된 부분을 형성한다.
이들 공유된 잔기 중, 잔기 14, 15, 18, 20, 21 및 66은 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 CDD 29111에 따라 케모카인 수용체 접촉 잔기로서 특성화되었다. 이들 잔기를 포함하는 경쟁적 항체 분석은 CC 케모카인이 이의 수용체에 결합하는 능력에 영향을 준다. MAb 18V4F 및 18P7E가 인식하는 CC 케모카인에 있어서, 몇몇의 공유된 용매 접근가능 잔기는 CC 케모카인의 처음 CC 잔기와 β1 가닥 사이의 N-루프, β1 가닥과 β2 가닥 사이의 CC 케모카인의 30번대 루프와, β2 가닥과 β3 가닥 사이의 40번대 루프에서 나타난다.
실시예 7 - 항카인 항체의 폴리뉴클레오티드 서열
항체의 가변 도메인의 서열을 불변 영역 내의 프라이머를 사용하여 이들 영역의 PCR 증폭 후 결정하였다. RNA를 RNeasy(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 107개의 하이브리도마 세포로부터 추출하고, 그 후 인비트로겐(Invitrogen)으로부터의 수퍼스크립트(SuperScript) III 역전사 키트를 사용하여 역전사시켰다. CDR 영역을 경쇄 또는 중쇄에 대한 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다 (문헌[Jones & Bendig, Biotechnology 9, 88-89, 1991]). 생성된 단편은 제로 블런트 토포(Zero Blunt TOPO) PCR 클로닝 키트를 사용하여 pCRII 플라스미드 내로 삽입하고, M13 및 M13rev 프라이머를 이용하여 서열결정하였다. 단클론 항체 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 및 18P7E의 CDR과 같은 경쇄 및 중쇄 세그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 하기에 기술되어 있다. 3C12F 중쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 1로 나타나며, 3C12F 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 2로 나타난다. 3C12F 경쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 6으로 나타나며, 3C12F 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 7로 나타난다. 더욱이 항체 3C12F의 CDR이 서열 번호 3-5(중쇄 가변 영역) 및 서열 번호 8-10(경쇄 가변 영역)으로 기술된다.
7D12A 중쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 11로 나타나며, 7D12A 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 12로 나타난다. 7D12A 경쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 16으로 나타나며, 7D12A 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 17로 나타난다. 더욱이 항체 7D12A의 CDR이 서열 번호 13-15(중쇄 가변 영역) 및 서열 번호 18-20(경쇄 가변 영역)으로 기술된다.
7D1G 중쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 21로 나타나며, 7D1G 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 22로 나타난다. 7D1G 경쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 26으로 나타나며, 7D1G 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 27로 나타난다. 더욱이, 항체 7D1G의 CDR이 서열 번호 23-25(중쇄 가변 영역) 및 서열 번호 28-30(경쇄 가변 영역)으로 기술된다.
18V4F 중쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 31로 나타나며, 18V4F 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 32로 나타난다. 18V4F 경쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열이 서열 번호 36으로 나타나며, 18V4F 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 서열 번호 37로 나타난다. 더욱이, 항체 18V4F의, 초티아(Chothia) 및 레스크(Lesk)에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 서열 번호 33-35(중쇄 가변 영역) 및 서열 번호 38-40(경쇄 가변 영역)으로 기술된다.
18P7E 중쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열은 서열 번호 41로 나타나며, 18P7E 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 42로 나타난다. 18P7E 경쇄 가변 영역의 DNA 코딩 서열은 서열 번호 46으로 나타나며, 18P7E 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 47로 나타난다. 더욱이, 항체 18P7E의, 초티아 및 레스크에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 서열 번호 43-45(중쇄 가변 영역) 및 서열 번호 48-50(경쇄 가변 영역)으로 기술된다.
실시예 8 - 단클론 항체 3 C12F 의 인간화
항체 인간화 방법을 디자인하여 인간 면역원성이 감소된 분자를 생성하였다. 항체 인간화 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 문헌[Almagro and Frannson, Frontiers Bioscience 13:1619-1633 (2008)]에 기술된 것을 포함한다. CDR 그래프팅 방법 (문헌[Jones et al., Nature 321 :522-525, 1986]; 문헌[Riechmann, et al., Nature 332:323-327, 1988])을 이용하여 3C12F의 CDR 서열을 유사한 인간 생식 세포계 유전자 유래의 중쇄 및 경쇄 IgG 가변 영역 프레임워크 서열 내에 매립시켰다. 이 경우, 각각의 설치류 중쇄 및 경쇄 가변 서열에 대하여 최고의 동일성을 갖는 선택된 인간 생식 세포계 유전자 유래의 중쇄 및 경쇄 IgG 가변 영역 프레임워크 서열 내로 설치류 CDR 서열을 매립시켰다. 적합한 방법에 대해서는 본원에 이의 전체 내용이 포함된 문헌[Jones et al., Nature 321 :522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann, et al., Nature 332:323-327 (1988)]을 참조한다.
3C12F의 인간화에 있어서, 쥐과 동물 3C12F 서열과 최대의 유사성을 공유한 가변 중쇄 및 경쇄의 인간 생식 세포계 서열을 인간 프레임워크 서열로 사용하였다. 선택된 생식 세포계 서열은, 쥐과 동물 항체와 높은 서열 유사성을 공유하는 것 외에, 재배열된 항체 서열의 샘플링이 풍부한 것으로 또한 밝혀졌다. 카바트에 의해 정의된 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있는 쥐과 잔기는 인간 프레임워크 서열 내로 그래프팅시켰으며, 이때 추가의 잔기는, 이것이 결합에 필수적일 수 있음을 증거가 나타낼 때 쥐과 아미노산으로 되돌아가게 하였다. 인간화 3C12F MAb의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 51 및 56에 의해 주어진다. 상응하는 아미노산 서열 및 CDR은 서열 번호 52-55 및 57-60으로 확인된다.
실시예 9 - 단클론 항체 18 V4F 의 인간화
18V4F의 인간화에 있어서, 3C12F의 인간화에서 사용한 것과 상이한 전략을 이용하였다. 쥐과 동물 18V4F 항체의 CDR을 가장 유사한 인간 생식 세포계 서열 내로 그래프팅하는 대신, 상기 CDR을 가장 많은 가변 중쇄 패밀리, VIII, 및 가장 많은 가변 람다 경쇄 패밀리, VLλIII로부터 모은 콘센서스 서열 내로 그래프팅하였다. 다음, 결합에 있어서 구조적으로 관련된, 초티아 및 레스크에 의해 정의된 CDR 내의 잔기만을 콘센서스 프레임워크 내로 처음에 그래프팅시켰다. 카바트에 의해 더욱 널리 정의된 추가의 CDR 위치와, 프레임워크 잔기는, 증거가 이것이 결합성 유지에 중요할 수 있다고 나타낼 때 쥐과 아미노산으로 다시 되돌아가게 하였다. 인간화 18V4F MAb의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 61 및 66으로 주어진다. 상응하는 아미노산 서열 및 CDR은 서열 번호 62-65 및 67-70으로 확인된다.
실시예 10 - 인간화 MAb 3 C12F 및 Mab 18 V4F 의 친화성 성숙
본 발명의 항카인 단클론 항체의 결합 친화성은, 요망될 경우 예를 들어 본원에 참고로 포함된 문헌[Wu et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6037-6042]에 기술된 바와 같이 친화성 성숙에 의해 추가로 향상시킬 수 있다.
다양한 케모카인(예를 들어, RANTES/CCL5, MIP-1α/CCL3 및 MIP-1β/CCL4)에 대한 인간화 MAb 3C12F 및 인간화 MAb 18V4F의 결합 특성을 향상시키기 위하여 그리고 더욱 강한 에이전트를 생성하기 위하여, 부위-특이적 돌연변이 유발 전략을 파지 디스플레이와 함께 이용하였다. 인간화 3C12F 또는 인간화 18V4F의 Fab 단편을 먼저 섬유상 파지 M13의 표면 상에서, 각각 인간화 3C12F 또는 인간화 18V4F 경쇄의 동시 발현에 의해 M13 유전자 III 단백질과의 중쇄 융합물로서 디스플레이하였다. 다음, 인간화 Mab 3C12F 또는 인간화 18V4F의 모든 6개의 CDR의 모든 위치를 문헌[Sidhu and Weiss, Phage Display, A Practical Approach, Clackson, T. and Lowman, H. B., ed., Oxford University Press, 2004, Chapter 4]의 프로토콜을 이용하여 조직적으로 돌연변이시킨 4-6개의 인접 CDR 잔기였다. 일부의 경우, 정의된 CDR 주변의 아미노산을, 이것이 항원 결합에 연루된 경우 또한 돌연변이시켰다. 총 15개의 라이브러리를 각각의 항체에 대하여 제작하였다.
파지 디스플레이 돌연변이체 인간화 3C12F 또는 인간화 18V4F의 Fab 단편을 결합 선택을 위하여 각각의 라이브러리용으로 제조하였다. 인간화 3C12F 또는 인간화 18V4F의 더욱 높은 친화성의 변이체에 대한 최대 6라운드의 파지 선발을 닐센(Nielsen) 및 막스(Marks)의 친화성 성숙 프로토콜을 이용하여 행하였다(클락슨 (Clackson) 및 로우맨(Lowman)의 상기 문헌, 제14장). 간략하게는, 바이오티닐화 케모카인을 이용하여 결합 선택을 기획하고, 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 이용하여 포획하여 인간화 3C12F Fab 또는 인간화 18V4F Fab의 더욱 고도한 변이체를 확인하였다. 더욱 큰 친화성의 변이체는 먼저 당업게에 공지된 방법을 이용하여 확인하고(클락손 및 로우맨의 문헌 및 그 안에 인용된 참고 문헌 참조), 그 후 더욱 큰 친화성 개선이 달성되도록 조합하였다.
항체의 이의 표적에 대한 친화성은 당해 분야에 공지된 다른 다양한 방법을 이용하여 또한 증가시킬 수 있다. 친화성은 직접적인 돌연변이, 파지 디스플레이, 또는 항체 분자를 코딩하는 핵산 내에서의 사슬 셔플링에 의해 증가시킬 수 있다. 개개의 또는 다수의 잔기를 랜덤화하여서 동일한 항원 항체 부위의 집단에서 모든 20개의 아미노산 또는 이들의 하위세트가 CDR 내의 또는 CDR에 인접한 특정 위치에서 발견되게 할 수 있다. 이 목적에 있어서 유용한 방법은 문헌[Yang et al., J. Mol. Biol. 254, 392- 403(1995)]; 문헌[Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992)]; 또는 문헌[Low et al., J. Mol. Biol. 250, 359-368 (1996)]을 참고로 하여 포함된다. 문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙이 기술되어 있으며, CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이 유발이 문헌[Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 91 :3809-3813 (1994)]; 문헌[Schier et al., Gene, 169: 147-155, 1995], 문헌[Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995)]; 문헌[Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310- 3319 (1995)]; 및 문헌[Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있으며, 이들 각각은 참고로 또한 포함된다.
친화성 성숙은 때로 랜덤 돌연변이 유발을 이용하여 실시한다. 특정 위치에서 만들어진 아미노산 치환은 랜덤하거나, 극단적으로 간소한 규칙을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 모든 잔기는 알라닌으로 돌연변이될 수 있으며, 이는 알라닌 스캐닝으로 칭해지는데, 예를 들어 국제 특허 공개 제WO 9523813호를 참조한다. 또한 서열을 기반으로 한 친화성 성숙 방법을 사용하여 항체의 결합 친화성을 증가시킬 수 있는데, 둘 모두가 참고로 포함된 미국 특허 공개 제2003/022240 A1호 및 미국 특허 공개 제2002/177170 A1호를 참조한다. 다른 방법은 일부 또는 모든 CDR을 이용한 일부 또는 모든 위치 내에서의 아미노산의 올리고뉴클레오티드 기반 돌연변이 유발, 이어서 문헌[Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 6037-6042 (1998)]에 기술된 바와 같이 더욱 높은 친화성에 대한 스크리닝, 또는 문헌[Rajpal, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102:8466-8471 (1996)]에 기술된 바와 같이 파지 디스플레이를 이용한 더욱 높은 친화성에 대한 선발을 포함한다. 친화성 성숙 항체의 선발은 문헌[Siegal, Methods Mol. Biol., 504:351-83 (2009)]에 기술된 바와 같이 효모 세포의 표면상에서의, 또는 문헌[Ho, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:9637-9642 (2006)]에 기술된 바와 같이 포유류 세포의 표면상에서의 항체 또는 이의 단편의 디스플레이에 의해 또한 행해질 수 있다. 친화성 성숙 공정에 사용될 수 있는 상기 문서에 기술된 방법은 본 실시예에서 인용된 문서를 참고로 하여 각각 포함된다.
CC 케모카인 및 콕스폭스 바이러스 서열의 확인
본원에 개시된 케모카인 및 기타 생성물의 신원을 표 4에서 수탁 번호를 참고로 하여 포함시켰다.
Figure 112012024453421-pct00004
Figure 112012024453421-pct00005
Figure 112012024453421-pct00006
Figure 112012024453421-pct00007
Figure 112012024453421-pct00008
Figure 112012024453421-pct00009
하이브리도마 기탁
하이브리도마 세포주 3C12F, 7D12A, 7D1G, 18V4F, 및 18P7E를 2010년 8월 12일에 하기 수탁 번호로 미국 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 불러바드 10801의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁하였다:
Figure 112012024453421-pct00010
변형 및 기타 실시양태
본 발명의 개념뿐만 아니라 기술된 항카인 항체 및 조성물과 이의 제조 및 사용 방법의 변형 및 변화도 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명을 특정 실시양태와 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명을 이러한 특정 실시양태에 한정하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다.
참고로 포함시킴
본 개시내용에 의해 인용되거나 본 개시내용에 참고된 각각의 문서, 특허, 특허 출원 또는 특허 공개는 특히 텍스트에서의 참고 문헌의 인용을 둘러싼 특정 주제와 관련하여 이의 전체 내용이 참고로 포함된다. 그러나, 임의의 이러한 참고 문헌이 배경 기술을 구성하고 인용된 문서의 정확성 및 적절성을 의심할 권리가 확보된다는 어떠한 승인도 이루어지지 않는다. 용어의 정의들 사이에서의 상충의 경우, 본 명세서에 주어진 용어의 정의가 좌우한다.
아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-11257 20100812 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-11258 20100812 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-11259 20100812 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-11260 20100812 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-11261 20100812
SEQUENCE LISTING <110> VLST CORPORATION Allison, Dan Raport, Carol <120> Multikine Antibodies that Bind to Multiple CC Chemokines <130> 366369WO <150> US 61/238,015 <151> 2009-08-28 <160> 117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Coding sequence for 3C12F VH <400> 1 gag gtt cag ctg cag cag tct ggg gca gag ctt gtg aag cca ggg gcc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtc aag ttg tcc tgc aca gct tct ggc ttc aac att aaa gac acc 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg aag cag agg cct gaa cag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga agg att gat cct gcg aat ggt aat act caa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc act ata aca gca gac aca tcc tcc aac aca gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr 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Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 tat aat gca aaa acc tta gca gat ggt gtg cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tca gga aca caa tat tct ctc aag atc aac agc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt ggg agt tat tac tgt caa cat ttt tgg agt act ccg tac 288 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 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25 30 tac tgg aac tgg atc cgg aaa ttc cca ggg aat aaa ctt gac tac atg 144 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Asp Tyr Met 35 40 45 gga tac ata agc tac gat ggt aac act tac tac aat cca tct ctc aaa 192 Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga ttc tcc atc act cga gac aca tcc aag aac cag tac tac ctg 240 Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 cag ttg aat tct gtg act act gaa gac aca gcc aca tat tac tgt tca 288 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser 85 90 95 aga gga gac tac gga acc tat gtt atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336 Arg Gly Asp Tyr Gly Thr Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 tca gtc acc gtc tcc tca 354 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Glu Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Asn Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg 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16 aac att gtg ctg acc caa tct cca gtt tct ttg gct gtg tct cta ggg 48 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 cag agg gcc acc att tcc tgc aga gcc agt gaa agt gtt gat agt cat 96 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser His 20 25 30 ggc aat agt ttt atg cac tgg tac cag cag aaa ccg gga cag cca ccc 144 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 aaa ctc ctc atc tat ctt gca tcc aac cta gag tct ggg gtc cct gcc 192 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 agg ttc act ggc ggt ggg tct ggg tca gac ttc acc ctg acc att gac 240 Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 cct gtg gag gct gat gat gtt gga aca tat tac tgt cag caa aat aat 288 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 gag gat ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 333 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser His 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> VL CDR1 of 7D12A <400> 18 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser His Gly Asn Ser Phe Met His 1 5 10 15 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> VL CDR2 of 7D12A <400> 19 Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 of 7D12A <400> 20 Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 21 <211> 345 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <223> Coding sequence for 7D1G VH <400> 21 cag gtg cag ctg cag cag cct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat ata cac tgg gta aag cag aca cct gga cag ggc ctg gaa tgg att 144 Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct gtt tct cca cga aat ggt gat act tcc tac aat cag agg ttc 192 Gly Ala Val Ser Pro Arg Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac att tcc tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg tat ggt tac gac tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca 336 Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 gtc tcc tca 345 Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Val Ser Pro Arg Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> VH CDR1 of 7D1G <400> 23 Ser Tyr Asn Ile His 1 5 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(17) <223> VH CDR2 of 7D1G <400> 24 Ala Val Ser Pro Arg Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> VH CDR3 of 7D1G <400> 25 Gly Tyr Gly Tyr Asp Tyr 1 5 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> Coding sequence for 7D1G VL <400> 26 gat gtt gtg cta act cag tct cca gcc acc ctg tct gtg act cca gga 48 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gat aga gtc agt ctt tcc tgc agg gcc agt caa agt gtt agc aag tac 96 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Lys Tyr 20 25 30 cta cac tgg tat caa caa aaa tca cat gag tct cca agg ctt ctc atc 144 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 aag tat gtt tcc cag tcc atc tct ggg atc ccc tcc agg ttc agt ggc 192 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tca ggg aca gat ttc act ctc agt atc aac agt gtg gag act 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 gaa gat ttg gga atg tat ttc tgt caa cag agt aac agc tgg cct cac 288 Glu Asp Leu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His 85 90 95 acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 321 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Leu Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> VL CDR1 of 7D1G <400> 28 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Lys Tyr Leu His 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> VL CDR2 of 7D1G <400> 29 Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> VL CDR3 of 7D1G <400> 30 Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr 1 5 <210> 31 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> Coding sequence for MAb 18V4F VH <400> 31 cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc act tgc act gtc tct ggg ttt tca tta acc ggc tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 ggt ata cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg cct ggt gga ggc aca aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga ctg agc atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc atg tac tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga ggt ccc ctt att act acg gaa gtt tct atg gac tac tgg ggt caa 336 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc tcg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> MAb 18V4F VH CDR1 <400> 33 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 1 5 <210> 34 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> MAb 18V4F VH CDR 2 <400> 34 Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> MAb 18V4F VH CDR 3 <400> 35 Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 330 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(330) <223> Coding sequence for 18V4F VL <400> 36 cag gct gtt gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aca ctc act tgt cgc tca aat act ggg gct gtt aca act agt 96 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc act ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 cta ata ggt ggt acc aac aac cga gct cca ggt gtt cct gcc aga ttc 192 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt gct cta tgg tac agc aac 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 cat tgg gtg ttc ggt gga gga acc aaa ctg act gtc cta ggc 330 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 37 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MAb 18V4F VL CDR 1 <400> 38 Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> MAb 18V4F VL CDR 2 <220> <221> MISC_FEATURE <400> 39 Gly Thr Asn 1 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> MAb 18V4F VL CDR3 <400> 40 Trp Tyr Ser Asn His Trp 1 5 <210> 41 <211> 360 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> MAb 18P7E VH coding region <400> 41 cag gtg cag ctg aag gag tca gga cct ggc ctg gtg gcg ccc tca cag 48 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 agc ctg tcc atc act tgc act gtc tct ggg ttt tca tta acc ggc tat 96 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 ggt ata cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg 144 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gta ata tgg cct ggt gga ggc aca aat tat aat tcg gct ctc atg 192 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 tcc aga ctg aac atc agc aaa gac aac tcc aag agc caa gtt ttc tta 240 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 aaa atg aac agt ctg caa act gat gac aca gcc atg tac tac tgt gcc 288 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga ggt ccc ctt att act acg gaa gtt tct atg gac tac tgg ggt caa 336 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc tcg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Asn Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> MAb 18P7E VH CDR1 <400> 43 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 1 5 <210> 44 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(14) <223> MAb 18P7E VH CDR2 <400> 44 Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> MAb 18P7E VH CDR3 <400> 45 Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 330 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> MAb 18P7E VL coding sequence <400> 46 cag gct gtt gtg act cag gaa tct gca ctc acc aca tca cct ggt gaa 48 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 aca gtc aca ctc act tgt cgc tca aat act ggg gct gtt aca act agt 96 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 aac tat gcc aac tgg gtc caa gaa aaa cca gat cat tta ttc act ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 cta ata ggt ggt acc aac aac cga gct cca ggt gtt cct gcc aga ttc 192 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 tca ggc tcc ctg att gga gac aag gct gcc ctc acc atc aca ggg gca 240 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 cag act gag gat gag gca ata tat ttc tgt gct cta tgg tac agc aac 288 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 cat tgg gtg ttc ggt gga gga acc aaa ctg act gtc cta ggc 330 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 47 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(11) <223> MAb 18P7E VL CDR1 <400> 48 Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(3) <223> MAb 18P7E VL CDR2 <220> <400> 49 Gly Thr Asn 1 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> MAb 18P7E VL CDR3 <400> 50 Trp Tyr Ser Asn His Trp 1 5 <210> 51 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized version of MAb 3C12F <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <223> Humanized MAb 3C12F VH coding sequence <400> 51 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag ccc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga ttc aac att aaa gac acc 96 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 tat ata cac tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 ggg agg att gat cct gcg aat ggt aat act caa tat gac ccg aag ttc 192 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 cag ggc aag gcc acc atc tca gcc gac aca tcc atc agc acc gcc tac 240 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg agc agc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg aga agg tgg gat tac gac tat gct atg gac tac tgg ggg caa ggg 336 Ala Arg Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc acg gtc acc gtc tcc tca 357 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VH CDR1 <400> 53 Asp Thr Tyr Ile His 1 5 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VH CDR2 <400> 54 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VH CDR3 <400> 55 Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VL coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 56 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cga gga agt ggg aat att cac aat tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 tta gca tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg gtc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 tat aat gca aaa acc tta gca gat ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat tac act ctc acc atc agc agt ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cat ttt tgg agt act ccg tac 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 acg ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Gly Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VL CDR1 <400> 58 Arg Gly Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VL CDR2 <400> 59 Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp 1 5 <210> 60 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 3C12F VL CDR3 <400> 60 Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 61 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VH coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 61 gaa gtt cag ctg gtg gaa tct ggt ggt ggt ctg gtt caa cct ggc ggc 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg cgt ctg tcc tgc gct gcc tcc ggt ttc tct ctg acc ggc tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 gca atg cac tgg gtt cgc cag gcc ccg ggt aaa ggc ctg gaa tgg gtt 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 ggt gtt atc tgg ccg ggt ggc ggt act aat tac aac tcc gcg ctg atg 192 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 agc cgt ttt acc atc tcc aag gac aat tcc aaa aac acc gtt tac ctg 240 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 cag atg aac tcc ctg cgt gct gaa gat act gct gtg tac tac tgt gct 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 cgt ggt cca ctg atc acc acc gaa gtg agc atg gac tat tgg ggc caa 336 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 ggt acg ctg gtc acc gtt agc tct 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VH CDR1 <400> 63 Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr 1 5 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VH CDR2 <400> 64 Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VH CDR3 <400> 65 Gly Pro Leu Ile Thr Thr Glu Val Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VL coding sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> Humanized MAb 18V4F VL coding sequence <400> 66 tct gcg gaa gtt acc cag cct ccg tct gtg agc gta tct ccg ggt cag 48 Ser Ala Glu Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 acc gcg cgc atc acg tgt tcc tct aac acg ggc gca gtt acg act agc 96 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 aac tat gct aac tgg gtt caa cag aag ccg ggc cag gct ccg gtg ggt 144 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Gly 35 40 45 ctg att ggt ggc acg aac gag cgt ccg agc ggc att cca gaa cgt ttt 192 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 50 55 60 tct ggc agc tct tct ggt aac act gcg acc ctg acc atc tct ggc gct 240 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 cag gct gaa gac gaa gcg gat tac tac tgc gcg ctg tgg tac agc aac 288 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 cac tgg gta ttc ggc ggt ggt acc aaa ctg act gtg ctg ggc 330 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 67 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 67 Ser Ala Glu Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VL CDR1 <400> 68 Ser Asn Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr 1 5 10 <210> 69 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VL CDR2 <400> 69 Gly Thr Asn 1 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized MAb 18V4F VL CDR3 <400> 70 Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp 1 5 <210> 71 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(70) <223> Human MIP1-alpha, CCL3 <400> 71 Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Ser Ala 65 70 <210> 72 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(69) <223> Human MIP1-beta, CCL4 <400> 72 Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Arg Lys Leu Pro His Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Gly Lys 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Asn 65 <210> 73 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(68) <223> Human RANTES, CCL5 <400> 73 Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala 1 5 10 15 Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser 50 55 60 Leu Glu Met Ser 65 <210> 74 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(76) <223> Human MCP-1, CCL2 <400> 74 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 75 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(76) <223> Human MCP-2, CCL8 <400> 75 Gln Pro Asp Ser Val Ser Ile Pro Ile Thr Cys Cys Phe Asn Val Ile 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Pro Ile Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg Ile Thr 20 25 30 Asn Ile Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Arg Gly 35 40 45 Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Gln Ile Phe Gln Asn Leu Lys Pro 65 70 75 <210> 76 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(76) <223> Human MCP-3, CCL7 <400> 76 Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile 1 5 10 15 Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr 20 25 30 Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met 50 55 60 Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu 65 70 75 <210> 77 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(75) <223> Human MCP-4, CCL13 <400> 77 Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr 20 25 30 Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys 35 40 45 Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys 50 55 60 His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu Lys Thr 65 70 75 <210> 78 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(66) <223> Human HCC-1/CCL14a <400> 78 Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys 1 5 10 15 Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys 20 25 30 Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys 35 40 45 Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys 50 55 60 Glu Asn 65 <210> 79 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(68) <223> Human HCC-2/MIP1-delta/CCL15 <400> 79 Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys 20 25 30 Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys 50 55 60 Pro Tyr Ser Ile 65 <210> 80 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(97) <223> Human HCC-4, CCL16 <400> 80 Gln Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu 1 5 10 15 Lys Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg 20 25 30 Lys Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala Ile Ile Phe Val Thr Lys Arg 35 40 45 Asn Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gln Glu Tyr 50 55 60 Ile Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr 65 70 75 80 Val Lys Ile Ile Thr Ala Lys Asn Gly Gln Pro Gln Leu Leu Asn Ser 85 90 95 Gln <210> 81 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(75) <223> Human MPIF-1, CCL23 <400> 81 Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu 20 25 30 Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe 35 40 45 Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu 50 55 60 Lys Leu Asp Thr Arg Ile Lys Thr Arg Lys Asn 65 70 75 <210> 82 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(69) <223> Human PARC, CCL18 <400> 82 Ala Gln Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe Ile Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro 20 25 30 Gln Cys Pro Lys Pro Gly Val Ile Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gln 35 40 45 Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Asp 50 55 60 Leu Lys Leu Asn Ala 65 <210> 83 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg 1 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Arg Ile Leu His 1 5 10 15 Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys 20 25 30 Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys 35 40 45 Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser 50 55 60 Lys Lys Val Lys Asn Met 65 70 <210> 89 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro 1 5 10 15 Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp 20 25 30 Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln 35 40 45 Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg 50 55 60 Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser 65 70 75 <210> 90 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys 1 5 10 15 Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu 20 25 30 Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln 35 40 45 Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu Leu Trp Val Gln Gln Leu Met 50 55 60 Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys 65 70 75 80 Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser 85 90 95 Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser Gln Thr Pro Lys Gly Pro 100 105 110 <210> 91 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu 1 5 10 15 Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu 35 40 45 Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met 50 55 60 Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys 65 70 <210> 92 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gln Gly Val Phe Glu Asp Cys Cys Leu Ala Tyr His Tyr Pro Ile Gly 1 5 10 15 Trp Ala Val Leu Arg Arg Ala Trp Thr Tyr Arg Ile Gln Glu Val Ser 20 25 30 Gly Ser Cys Asn Leu Pro Ala Ala Ile Phe Tyr Leu Pro Lys Arg His 35 40 45 Arg Lys Val Cys Gly Asn Pro Lys Ser Arg Glu Val Gln Arg Ala Met 50 55 60 Lys Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Val Phe Ala Lys Leu His His Asn 65 70 75 80 Met Gln Thr Phe Gln Ala Gly Pro His Ala Val Lys Lys Leu Ser Ser 85 90 95 Gly Asn Ser Lys Leu Ser Ser Ser Lys Phe Ser Asn Pro Ile Ser Ser 100 105 110 Ser Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Ile Ser Ala Asn Ser Gly Leu 115 120 125 <210> 93 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln 20 25 30 Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala 35 40 45 Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp 50 55 60 Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn 65 70 75 80 Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly 85 <210> 94 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr Glu Val Ser His His Ile 1 5 10 15 Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met Cys Arg Ile Gln Arg Ala 20 25 30 Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile Leu His Val Lys Arg Arg 35 40 45 Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr Val Lys Gln Trp Met Lys 50 55 60 Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly Asn Val Cys His Arg Lys 65 70 75 80 Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg Ala His Gln Gly Lys His 85 90 95 Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr 100 105 <210> 95 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Met Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr 1 5 10 15 Thr Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val 35 40 45 Cys Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met 50 55 60 Asp Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr 65 70 75 80 Gly Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly 85 90 <210> 96 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Met Ala Pro Ile Ser Leu Ser Trp Leu Leu Arg Leu Ala Thr Phe Cys 1 5 10 15 His Leu Thr Val Leu Leu Ala Gly Gln His His Gly Val Thr Lys Cys 20 25 30 Asn Ile Thr Cys Ser Lys Met Thr Ser Lys Ile Pro Val Ala Leu Leu 35 40 45 Ile His Tyr Gln Gln Asn Gln Ala Ser Cys Gly Lys Arg Ala Ile Ile 50 55 60 Leu Glu Thr Arg Gln His Arg Leu Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln 65 70 75 80 Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu 85 90 95 Thr Arg Asn Gly Gly Thr Phe Glu Lys Gln Ile Gly Glu Val Lys Pro 100 105 110 Arg Thr Thr Pro Ala Ala Gly Gly Met Asp Glu Ser Val Val Leu Glu 115 120 125 Pro Glu Ala Thr Gly Glu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Thr Pro Ser Ser 130 135 140 Gln Glu Ala Gln Arg Ala Leu Gly Thr Ser Pro Glu Leu Pro Thr Gly 145 150 155 160 Val Thr Gly Ser Ser Gly Thr Arg Leu Pro Pro Thr Pro Lys Ala Gln 165 170 175 Asp Gly Gly Pro Val Gly Thr Glu Leu Phe Arg Val Pro Pro Val Ser 180 185 190 Thr Ala Ala Thr Trp Gln Ser Ser Ala Pro His Gln Pro Gly Pro Ser 195 200 205 Leu Trp Ala Glu Ala Lys Thr Ser Glu Ala Pro Ser Thr Gln Asp Pro 210 215 220 Ser Thr Gln Ala Ser Thr Ala Ser Ser Pro Ala Pro Glu Glu Asn Ala 225 230 235 240 Pro Ser Glu Gly Gln Arg Val Trp Gly Gln Gly Gln Ser Pro Arg Pro 245 250 255 Glu Asn Ser Leu Glu Arg Glu Glu Met Gly Pro Val Pro Ala His Thr 260 265 270 Asp Ala Phe Gln Asp Trp Gly Pro Gly Ser Met Ala His Val Ser Val 275 280 285 Val Pro Val Ser Ser Glu Gly Thr Pro Ser Arg Glu Pro Val Ala Ser 290 295 300 Gly Ser Trp Thr Pro Lys Ala Glu Glu Pro Ile His Ala Thr Met Asp 305 310 315 320 Pro Gln Arg Leu Gly Val Leu Ile Thr Pro Val Pro Asp Ala Gln Ala 325 330 335 Ala Thr Arg <210> 97 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro 1 5 10 15 Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro 20 25 30 His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys 50 55 60 Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 65 70 <210> 98 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 65 70 <210> 99 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn 65 70 <210> 100 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn 65 70 <210> 101 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ala Gly Pro Ala Ala Ala Val Leu Arg Glu Leu Arg Cys Val Cys Leu 1 5 10 15 Gln Thr Thr Gln Gly Val His Pro Lys Met Ile Ser Asn Leu Gln Val 20 25 30 Phe Ala Ile Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu 35 40 45 Lys Asn Gly Lys Glu Ile Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys 50 55 60 Lys Val Ile Gln Lys Ile Leu Asp Gly Gly Asn Lys Glu Asn 65 70 75 <210> 102 <211> 75 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Val Ser Ala Val Leu Thr Glu Leu Arg Cys Thr Cys Leu Arg Val Thr 1 5 10 15 Leu Arg Val Asn Pro Lys Thr Ile Gly Lys Leu Gln Val Phe Pro Ala 20 25 30 Gly Pro Gln Cys Ser Lys Val Glu Val Val Ala Ser Leu Lys Asn Gly 35 40 45 Lys Gln Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Phe Leu Lys Lys Val Ile 50 55 60 Gln Lys Ile Leu Asp Ser Gly Asn Lys Lys Asn 65 70 75 <210> 103 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ile His Pro 1 5 10 15 Lys Asn Ile Gln Ser Leu Glu Val Ile Gly Lys Gly Thr His Cys Asn 20 25 30 Gln Val Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys Ile Cys Leu 35 40 45 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Ile Lys Lys Ile Val Gln Lys Lys Leu Ala 50 55 60 Gly Asp Glu Ser Ala Asp 65 70 <210> 104 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Glu Ala Glu Glu Asp Gly Asp Leu Gln Cys Leu Cys Val Lys Thr Thr 1 5 10 15 Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala 20 25 30 Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile 50 55 60 Lys Lys Leu Leu Glu Ser 65 70 <210> 105 <211> 78 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Met Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser 1 5 10 15 Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro 20 25 30 Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys 35 40 45 Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro 65 70 75 <210> 106 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln 1 5 10 15 Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro 20 25 30 Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly 35 40 45 Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile 50 55 60 Lys Lys Thr Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly 65 70 75 80 Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg 85 90 95 Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr 100 <210> 107 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly Val 1 5 10 15 Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro 20 25 30 Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile Thr Leu Lys Glu Asn 35 40 45 Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gln Ala Arg Leu Ile 50 55 60 Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe 65 70 <210> 108 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65 <210> 109 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr Ser Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Leu 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Ile Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Met Met Glu Val Leu Arg Lys Arg Ser Ser Ser Thr Leu Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe Lys Arg Lys Ile Pro 85 <210> 110 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Asn Glu Gly Ser Val Thr Gly Ser Cys Tyr Cys Gly Lys Arg Ile Ser 1 5 10 15 Ser Asp Ser Pro Pro Ser Val Gln Phe Met Asn Arg Leu Arg Lys His 20 25 30 Leu Arg Ala Tyr His Arg Cys Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Gln Leu Leu 35 40 45 Ser Trp Ser Val Cys Gly Gly Asn Lys Asp Pro Trp Val Gln Glu Leu 50 55 60 Met Ser Cys Leu Asp Leu Lys Glu Cys Gly His Ala Tyr Ser Gly Ile 65 70 75 80 Val Ala His Gln Lys His Leu Leu Pro 85 <210> 111 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Ser Lys Cys Lys Cys Ser Arg Lys Gly Pro Lys Ile Arg Tyr Ser Asp 1 5 10 15 Val Lys Lys Leu Glu Met Lys Pro Lys Tyr Pro His Cys Glu Glu Lys 20 25 30 Met Val Ile Ile Thr Thr Lys Ser Val Ser Arg Tyr Arg Gly Gln Glu 35 40 45 His Cys Leu His Pro Lys Leu Gln Ser Thr Lys Arg Phe Ile Lys Trp 50 55 60 Tyr Asn Ala Trp Asn Glu Lys Arg Arg Val Tyr Glu Glu 65 70 75 <210> 112 <211> 69 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(69) <223> Murine MIP-1alpha, CCL3 <400> 112 Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Ser 1 5 10 15 Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser 20 25 30 Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Asn Arg Gln 35 40 45 Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr Trp Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp 50 55 60 Leu Glu Leu Asn Ala 65 <210> 113 <211> 69 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(69) <223> Murine MIP-1beta, CCL4 <400> 113 Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ser Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Arg Gln Leu His Arg Ser Phe Val Met Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Leu Cys Ser Lys Pro Ala Val Val Phe Leu Thr Lys Arg Gly Arg 35 40 45 Gln Ile Cys Ala Asn Pro Ser Glu Pro Trp Val Thr Glu Tyr Met Ser 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Asn 65 <210> 114 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(68) <223> Murine RANTES, CCL5 <400> 114 Ser Pro Tyr Gly Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Leu Pro Arg Ala His Val Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Ser 20 25 30 Lys Cys Ser Asn Leu Ala Val Val Phe Val Thr Arg Arg Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Gln Glu Tyr Ile Asn Tyr 50 55 60 Leu Glu Met Ser 65 <210> 115 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> Murine MCP-1, CCL2 <400> 115 Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr 1 5 10 15 Ser Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe Val Thr Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Lys Glu Trp Val Gln Thr Tyr Ile 50 55 60 Lys Asn Leu Asp Arg Asn Gln Met Arg Ser Glu Pro Thr Thr Leu Phe 65 70 75 80 Lys Thr Ala Ser Ala Leu Arg Ser Ser Ala Pro Leu Asn Val Lys Leu 85 90 95 Thr Arg Lys Ser Glu Ala Asn Ala Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Thr 100 105 110 Ser Ser Thr Ser Val Gly Val Thr Ser Val Thr Val Asn 115 120 125 <210> 116 <211> 82 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(82) <223> Murine MCP-5, CCL12 <400> 116 Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Val Val 1 5 10 15 Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Arg Thr Ile Leu Asp 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Lys Asn Ser Ile 50 55 60 Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe Ile Leu Glu Pro Ser Cys 65 70 75 80 Leu Gly <210> 117 <211> 246 <212> PRT <213> Cowpox virus <400> 117 Met Lys Gln Ile Val Leu Ala Cys Ile Cys Leu Ala Ala Val Ala Ile 1 5 10 15 Pro Thr Ser Leu Gln Gln Ser Phe Ser Ser Ser Ser Ser Cys Thr Glu 20 25 30 Glu Glu Asn Lys His His Met Gly Ile Asp Val Ile Ile Lys Val Thr 35 40 45 Lys Gln Asp Gln Thr Pro Thr Asn Asp Lys Ile Cys Gln Ser Val Thr 50 55 60 Glu Val Thr Glu Ser Glu Asp Glu Ser Glu Glu Val Val Lys Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Thr Tyr Tyr Thr Val Val Gly Gly Gly Leu Thr Met Asp Phe 85 90 95 Gly Phe Thr Lys Cys Pro Lys Ile Ser Ser Ile Ser Glu Tyr Ser Asp 100 105 110 Gly Asn Thr Val Asn Ala Arg Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Gln Gly 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Ala Ile Thr Arg Glu Glu Ala Leu Ser Met Ile Lys 130 135 140 Asp Cys Glu Met Ser Ile Asn Ile Lys Cys Ser Glu Glu Glu Lys Asp 145 150 155 160 Ser Asn Ile Lys Thr His Pro Val Leu Gly Ser Asn Ile Ser His Lys 165 170 175 Lys Val Ser Tyr Glu Asp Ile Ile Gly Ser Thr Ile Val Asp Thr Lys 180 185 190 Cys Val Lys Asn Leu Glu Ile Ser Val Arg Ile Gly Asp Met Cys Lys 195 200 205 Glu Ser Ser Glu Leu Glu Val Lys Asp Gly Phe Lys Tyr Val Asp Gly 210 215 220 Ser Ala Ser Glu Asp Ala Ala Asp Asp Thr Ser Leu Ile Asn Ser Ala 225 230 235 240 Lys Leu Ile Ala Cys Val 245

Claims (48)

  1. CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β 및 CCL5/RANTES 케모카인에 결합하는 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 내에 포함된 3개의 중쇄 CDR(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열 내에 포함된 3개의 경쇄 CDR(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)을 포함하고, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍이 서열 번호 2/7, 서열 번호 12/17, 서열 번호 22/27, 서열 번호 32/37, 서열 번호 42/47, 서열 번호 52/57 및 서열 번호 62/67로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β 또는 CCL5/RANTES에 대해 적어도 20 nM의 결합 친화도를 갖는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 4종 이상의 상이한 CC 케모카인에 결합하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, MCP-1, MCP-2 또는 MCP-3에 결합하지 않는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC 및 CCL23/MPIF-1의 1개 이상의 결정부위에 결합하며, 상기 결정부위는 상기 CC 케모카인의 CC 잔기와 상기 케모카인의 마지막 C 잔기 사이에 위치하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL18/PARC 및 CCL23/MPIF-1의 1개 이상의 결정부위에 결합하고, 상기 결정부위는 상기 CC 케모카인의 N-루프, 30번대 루프 또는 40번대 루프 내에 위치하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, CC 케모카인의 CC 수용체 결합 잔기 내의 1개 이상의 결정부위에 결합하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 결합하는 CC 케모카인의 화학주성 활성을 중화시키는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 하이브리도마 세포주 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E에 의해 생성되거나 하이브리도마 세포주 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E에 의해 생성되는 항체의 결합을 경쟁적으로 차단하고,
    상기 하이브리도마 세포주 3C12F는 수탁 번호 PTA-11261로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 7D1G은 수탁 번호 PTA-11257로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 7D12A는 수탁 번호 PTA-11259로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 18V4F는 수탁 번호 PTA-11260으로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 18P7E는 수탁 번호 PTA-11258로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서,인간화 항체 또는 키메라 인간-쥐과 동물 항체, 또는 이의 항원 결합 단편인 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL15/HCC-2 및 CCL23/MPIF-1로 이루어진 군으로부터 선택된 5종 이상의 CC 케모카인에 결합하며, CCL2/MCP-1에는 결합하지 않는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CC 케모카인 중 1개 이상의 N 루프, 30번대 루프 또는 40번대 루프 내의 결정부위에 결합하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제11항에 있어서,
    서열 번호 71의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(SRQIPQNF), 잔기 34-35(QC) 또는 잔기 57-67(EWVQKYVSDLE) 내에 위치하는 CCL3/MIP-1α의 1개 이상의 항원 결정부위에 결합하며;
    서열 번호 72의 잔기 11-15(CCFSY), 잔기 17-24(ARKLPHNF), 잔기 34-35(LC) 또는 잔기 57-67(SWVQEYVYDLE) 내에 위치하는 CCL4/MIP-1β의 1개 이상의 항원 결정부위에 결합하며;
    서열 번호 73의 잔기 10-14(CCFAY), 잔기 16-23(ARPLPRAH), 잔기 33-34(KC) 또는 잔기 56-66(KWVREYINSLE) 내에 위치하는 CCL5/RANTES의 1개 이상의 항원 결정부위에 결합하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 서열 번호 53의 HCDR1 서열, 서열 번호 54의 HCDR2 서열 및 서열 번호 55의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 58의 LCDR1 서열, 서열 번호 59의 LCDR2 서열 및 서열 번호 60의 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제1항에 있어서, 서열 번호 23의 HCDR1 서열, 서열 번호 24의 HCDR2 서열 및 서열 번호 25의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 28의 LCDR1 서열, 서열 번호 29의 LCDR2 서열 및 서열 번호 30의 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항에 있어서, 서열 번호 13의 HCDR1 서열, 서열 번호 14의 HCDR2 서열 및 서열 번호 15의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 18의 LCDR1 서열, 서열 번호 19의 LCDR2 서열 및 서열 번호 20의 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제1항에 있어서, 서열 번호 63의 HCDR1 서열, 서열 번호 64의 HCDR2 서열 및 서열 번호 65의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 68의 LCDR1 서열, 서열 번호 69의 LCDR2 서열 및 서열 번호 70의 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서, 서열 번호 43의 HCDR1 서열, 서열 번호 44의 HCDR2 서열 및 서열 번호 45의 HCDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 48의 LCDR1 서열, 서열 번호 49의 LCDR2 서열 및 서열 번호 50의 LCDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항에 있어서, 이펙터 모이어티, 표적화 모이어티, 이종성 단백질, 독소, 효소, 사이토카인, 화학적 태그, 방사성 태그, 이의 생물학적 반감기를 증가시키는 물질, 또는 이의 생물학적 이용가능성을 증가시키는 물질에 콘쥬게이션된 것인 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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  21. 하이브리도마 세포주로서, 상기 하이브리도마 세포주는 3C12F, 7D1G, 7D12A, 18V4F 또는 18P7E이고,
    상기 하이브리도마 세포주 3C12F는 수탁 번호 PTA-11261로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 7D1G은 수탁 번호 PTA-11257로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 7D12A는 수탁 번호 PTA-11259로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 18V4F는 수탁 번호 PTA-11260으로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것이고,
    상기 하이브리도마 세포주 18P7E는 수탁 번호 PTA-11258로 ATCC에 2010년 8월 12일 수탁된 것인 하이브리도마 세포주.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 담체, 부형제 또는 완충제와 함께 포함하는, 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 단클론 항체를 1종 초과로 포함하는 것인 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 아테롬성 동맥 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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