KR101767145B1 - 안티센스 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여용의 제약 제형을 제공한다. 본 제약 제형은 크론병, 궤양성 대장염 및 만성 염증성 장질환의 치료에 사용될 수 있다.

Description

안티센스 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법{ANTISENSE COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING AND USING SAME}

<관련 출원>

본 출원은 2008년 11월 12일자로 출원된 유럽 특허 출원 제08425727.8호 및 2009년 2월 1일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/152,297호를 우선권 주장하며, 상기 특허 출원 둘 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

<발명의 배경>

궤양성 대장염 및 크론병 (Crohn's disease)은 인간에서의 만성 염증성 장질환 (inflammatory bowel disease, IBD)의 주요 형태이다. 장관 장질환은 환경적 요인, 미생물적 요인 및 장 면역계 사이의 복합적인 상호작용의 결과로서 유전적으로 민감한 개체에서 일어나는 부적절한 면역 반응이다. 정상적인 역조절 기작에 의해 부적절하게 제어되는, 점막 항원에 대한 과도한 면역 반응에 의해 만성 장 염증이 생기는 것으로 증명되었다.

크론병은 위장관의 만성 재발성 염증성 질환으로서, 분절성 전층성 염증 및 육아종성 변화를 특징으로 한다. 전형적인 제시는 위장관의 다양한 부분의 불연속적 연루와 합병증의 발병을 포함하는데, 상기 합병증은 협착, 농양 또는 누공을 포함한다. 크론병의 의학적 관리는, 그의 원인이 공지되어 있지 않기 때문에 대부분 경험적이며, 염증을 감소시키도록 설계된다. 약물 요법은 코르티코스테로이드, 항생제, 면역억제약, 및 항-TNFα 작용제를 포함한다. 현재의 요법들의 심각한 부작용 및 치료 실패로 인하여 대안이 필요하다.

면역 세포 및 비-면역 세포의 성장, 분화 및 기능을 조절할 수 있는 다기능성 시토카인인 TGF-β1이 IBD의 병인에서 중요한 역할을 한다. 염증 자극에 대한 효율적인 역조절 TGF-β1 반응을 시작하는 능력의 감소는 IBD와 같은 질환의 병인에서 관련성이 있다. TGF-β1은 점막 염증의 강력한 음성 조절자로서 작용하며, 그의 활성의 저해에 의해 대장염이 발병되는데, 상기 대장염은 크론병 또는 궤양성 대장염과 면역형태학적 유사성을 보인다.

IBD에 걸린 환자의 염증이 일어난 장에서, TGF-β1 매개 신호 전달에서의 결정적인 단계인 Smad 3 인산화의 감소 및 Smad7 (TGF-β1 수용체의 기질로서의 역할을 하는 단백질)의 두드러진 과발현이 있다. 따라서, IBD에서 고수준의 Smad7은 TGF-β1 시그널링에 결함이 생기게 하여 전염증성 분자 유전자가 과발현되게 할 수 있으며 TGF-β1은 그의 항염증 역할을 발휘하지 못하게 된다.

안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 약물은 질환-야기 단백질의 생성을 유도하는 데 책임이 있는 메신저 RNA (mRNA)의 작은 절편에 특이적으로 결합함으로써 단백질 번역을 저해하는 DNA 뉴클레오티드의 짧은 사슬이다. 안티센스 약물의 서열은 그의 mRNA 표적에 상보적이도록 설계되어서, 생성된 이중 가닥 절편은 혼성화시에 세포에 의해 비정상적인 것으로 인식되어 파괴되고 그에 의해 단백질 생성물로의 메시지의 번역이 방지되게 한다.

그러나, 안티센스 치료제는 전형적으로 비경구 투여되고, 이는 전신적 효과로 인하여 유해 반응에 이르게 될 수 있다. 그러한 투여는 또한 필요한 치료 부위에 국소화되는 것이 불가능할 수 있다. 따라서, 정제 기반의 제형을 이용하여 IBD 및 관련 질환을 치료하기 위한 안티센스 치료제의 국소-유사 투여가 필요하다.

본 발명은 적어도 부분적으로는 SMAD7에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여용의 제약 제형에 관한 것이다.

일 실시양태에서, 서열 1로 표시되는 것과 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예컨대 나트륨 염), 및 제약상 허용되는 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함하며, 또한 붕해제와 같은 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있는 과립외 상을 포함할 수 있는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여용의 제약 정제 제형이 제공된다. 고려되는 올리고뉴클레오티드는 서열 1로 표시되는 것을 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 실시양태 또는 특정 실시양태들 모두에서 뉴클레오티드간 결합은 O,O-결합 포스포로티오에이트이다.

본 발명은 개시된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며 장용 코팅을 포함하는 정제를 제공한다. 그러한 정제는 예를 들어 충전제, 붕해제 및/또는 윤활제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약 35 내지 약 500 mg의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 서열 1로 표시되는 40 mg의 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는 정제와 같은 경구 투약형이 본원에서 제공된다.

일 실시양태에서, 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 약 0.5 내지 약 10 중량%; 만니톨 약 30 내지 약 50 중량%; 및 미정질 셀룰로오스 약 10 내지 약 30 중량%를 포함하는 경구용 정제가 본원에서 제공된다.

예를 들어, 본 발명은 과립내 상 및 과립외 상을 포함하는 경구용의 제약상 허용되는 정제를 제공하며, 여기서, 예를 들어 과립내 상은 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 약 5 내지 약 10 중량% (예를 들어, 약 8 중량%), 만니톨 약 40 중량%, 미정질 셀룰로오스 약 8 중량%, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 약 5 중량%, 및 소듐 전분 글리콜레이트 약 2 중량%를 포함하고, 예를 들어 과립외 상은 미정질 셀룰로오스 약 17 중량%, 소듐 전분 글리콜레이트 약 2 중량%, 및 스테아르산마그네슘 약 0.4 중량%를 포함하며, 정제는 장용 코팅을 추가로 포함할 수 있다.

크론병, 궤양성 대장염, 및 만성 염증성 장질환의 치료 방법이 또한 본원에서 제공되며, 이는 그를 필요로 하는 환자에게 본원에 개시된 정제, 경구 투약형 또는 제약 제형을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제약 제형, 정제 또는 경구 투여 형태를 환자에게 경구 투여할시에, 제약 제형, 정제 또는 경구 투여 형태는 실질적으로 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 전달될 수 있다.

도 1은 AS1로서 본원에 개시된 안티센스 화합물의 분자 구조를 도시한다.
도 2는 AS1의 제조 공정의 개략도이다.
도 3은 3.5 mg 용량 강도의 AS1에 있어서의 입자 크기 분포를 도시한 막대 그래프이다.
도 4는 35 mg 용량 강도의 AS1에 있어서의 입자 크기 분포를 도시한 막대 그래프이다.
도 5는 250 mg 용량 강도의 AS1에 있어서의 입자 크기 분포를 도시한 막대 그래프이다.
도 6은 3가지의 상이한 매질 (pH 1.0, pH 6.6, 및 pH 7.2)에서 상이한 용량 강도의 AS1을 포함하는 3개의 정제에 있어서의 용해 프로파일 (용해된 정제의 백분율로서)을 나타낸 선 그래프이다.
도 7은 본원에 개시된 배치 (batch)의 용해 프로파일을 도시한다.

본 발명은 일반적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예컨대 도 1에 도시된 것을 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 고려되는 조성물은 Smad7에 대하여 작용하는 올리고뉴클레오티드를 함유하며, 경구 투여될 수 있다. 개시된 조성물은 경구 투여될 때 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 장 시스템에 전달할 수 있으며, 예를 들어 유효량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 회장 말단부 또는 우측 결장에 전달할 수 있다.

고려되는 안티센스 올리고뉴클레오티드는

를 포함하는 것을 포함하며, 여기서, C*는 5-메틸-2'-데옥시시티딘을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 고려되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드간 결합 중 적어도 하나는 O,O-결합 포스포로티오에이트이며, 예를 들어, 서열 1의 20개의 뉴클레오티드간 결합 각각은 O,O-결합 포스포로티오에이트일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 고려되는 조성물은 1 내지 20개의 O,O-결합 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 선택적으로 포함할 수 있는 서열 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 제약상 허용되는 염, 예를 들어 나트륨 염을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 고려되는 염은 완전히 중화된 것을 포함하며, 예를 들어 각각의 포스포로티오에이트 결합은 이온, 예컨대 Na⁺와 연관되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 천연 핵염기, 당 및 뉴클레오티드간 (골격) 공유 결합뿐만 아니라 비-천연 부분도 포함할 수 있다. 본원에서 AS1로서 칭해지는 예시적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 도 1에 예시되어 있다.

일부 실시양태에서, 조성물이 안티센스 화합물을 예를 들어 환자의 회장 말단부 및 우측 결장에 전달할 수 있도록 장용 코팅, 예를 들어 위장-내성 코팅을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 전달에 적합한 조성물, 예를 들어 정제가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 그러한 투여는 국소적 효과로 이어질 수 있으며, 이는 실질적으로 국소적으로 안티센스 화합물을 환자의 장의 영향을 받은 부분에 직접적으로 적용하게 된다. 일부 실시양태에서, 그러한 투여는 실질적으로 안티센스 화합물의 원하지 않는 전신적 흡수를 회피할 수 있다.

예를 들어, 개시된 안티센스 화합물, 예를 들어 AS1 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 과립을 포함하는 (즉, 과립으로부터 적어도 부분적으로 형성된) 구강 투여용 정제가 제공된다. 그러한 정제는 장용 코팅으로 코팅될 수 있다. 고려되는 정제는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 충전제, 결합제, 붕해제 및/또는 윤활제뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 착향제, 예컨대 윈터그린향, 오렌지향, 자일리톨, 소르비톨, 프룩토스 및 말토덱스트린과 방향제, 보존제 및 항산화제도 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 고려되는 제약 제형은 고려되는 안티센스 화합물, 예를 들어 서열 1에 나타낸 것 또는 제약상 허용되는 염, 예를 들어 AS1, 및 제약상 허용되는 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함한다. 예를 들어, AS1 및 충전제는 함께 블렌딩될 수 있으며, 선택적으로 다른 부형제와 함께 블렌딩될 수 있고 과립으로 성형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 과립내 상은 습식 과립화를 이용하여 형성될 수 있으며, 예를 들어 안티센스 화합물 및 충전제가 블렌딩된 것에 액체 (예를 들어, 물)가 첨가되고, 이어서 조합물이 건조되고/되거나, 밀링되고/되거나 체질되어 과립을 생성한다. 당업계의 숙련자라면 다른 공정들이 과립내 상의 달성에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

일부 실시양태에서, 고려되는 제형은 과립외 상을 포함하며, 상기 과립외 상은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함할 수 있고, 과립내 상과 블렌딩되어 개시된 제형을 형성할 수 있다.

개시된 제형은 충전제를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다. 예시적인 충전제는 셀룰로오스, 젤라틴, 인산칼슘, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 미정질 셀룰로오스, 펙틴, 폴리아크릴레이트, 덱스트로스, 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 부분적으로 사전 젤라틴화된 전분, 탄산칼슘, 및 그의 조합을 포함하는 기타의 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, 개시된 제형은 결합제를 포함하는 과립외상 및/또는 과립내 상을 포함할 수 있는데, 상기 결합제는 일반적으로 제약 제형의 성분들을 결합시키는 기능을 할 수 있다. 본 발명에 포함되는 예시적인 결합제는 하기를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다: 전분, 당, 셀룰로오스 또는 개질 셀룰로오스, 예컨대 히드록시프로필 셀룰로오스, 락토스, 사전 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 저 치환 히드록시프로필 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 당 알콜, 및 그의 조합을 포함하는 기타의 것.

고려되는 제형, 예를 들어 과립내 상 및/또는 과립외 상을 포함하는 것은 전분, 셀룰로오스, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 전분 글리콜레이트, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 알기네이트, 콘 전분, 크로스멜로스 나트륨, 가교결합된 카르복시메틸 셀룰로오스, 저 치환 히드록시프로필 셀룰로오스, 아라비아 고무, 및 그의 조합을 포함하는 기타의 것과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 붕해제를 포함할 수 있다. 에를 들어, 과립내 상 및/또는 과립외 상은 붕해제를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 고려되는 제형은 개시된 안티센스 화합물과, 만니톨, 미정질 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 소듐 전분 글리콜레이트 또는 그의 조합으로부터 선택된 부형제를 포함하는 과립내 상, 및 미정질 셀룰로오스, 소듐 전분 글리콜레이트 및 스테아르산마그네슘 또는 그의 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 과립외 상을 포함한다.

일부 실시양태에서, 고려되는 제형은 윤활제를 포함할 수 잇으며, 예를 들어 과립외 상은 윤활제를 포함할 수 있다. 윤활제는 활석, 실리카, 지방, 스테아린, 스테아르산마그네슘, 인산칼슘, 이산화규소, 규산칼슘, 인산칼슘, 콜로이드성 이산화규소, 금속 스테아르산염, 수소화 식물유, 콘 전분, 벤조산나트륨, 폴리에틸렌 글리콜, 아세트산나트륨, 스테아르산칼슘, 나트륨 라우릴 술페이트, 염화나트륨, 마그네슘 라우릴 술페이트, 활석 및 스테아르산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

일부 실시양태에서, 제약 제형은 장용 코팅을 포함한다. 일반적으로, 장용 코팅은 약물이 소화관을 따라서 흡수되는 위치를 제어하는 경구 의약용 장벽을 생성한다. 장용 코팅은 pH에 따라 상이한 속도로 붕해되는 중합체를 포함할 수 있다. 장용 코팅은 예를 들어 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 셀룰로오스 아세테이트 숙시네이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트, 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체, 메타크릴산 공중합체 타입 C, 폴리비닐 아세테이트-프탈레이트, 및 셀룰로오스 아세프테이트 프탈레이트를 포함할 수 있다.

예시적인 장용 코팅은 오파드라이 (Opadry)^® AMB, 아크릴 (Acryl)-EZE^®, 유드라기트 (Eudragit)^® 등급품을 포함한다. 일부 실시양태에서, 장용 코팅은 고려되는 정제의 약 5 내지 약 10 중량%, 약 5 내지 약 20 중량%, 8 내지 약 15 중량%, 약 8 내지 약 18 중량%, 약 10 내지 약 12 중량%, 또는 약 12 내지 약 16 중량%로 포함될 수 있다. 예를 들어, 장용 코팅은 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함할 수 있다.

예를 들어, 약 0.5 내지 약 70 중량%, 예를 들어 약 0.5 내지 약 10 중량%, 또는 약 1 내지 약 20 중량%의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 (예를 들어, AS1)을 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어진 정제가 제공된다. 그러한 정제는 예를 들어 약 0.5 내지 약 60 중량%의 만니톨, 예를 들어 약 30 내지 약 50 중량%의 만니톨, 예를 들어 약 40 중량%의 만니톨 및/또는 약 20 내지 약 40 중량%의 미정질 셀룰로오스 또는 약 10 내지 약 30 중량%의 미정질 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개시된 정제는 약 30 내지 약 60 중량%, 예를 들어 약 45 내지 약 65 중량%, 또는 대안적으로는 약 5 내지 약 10 중량%의 AS1, 약 30 내지 약 50 중량%, 또는 대안적으로는 약 5 내지 약 15 중량%의 만니톨, 약 5 내지 약 15 중량%의 미정질 셀룰로오스, 약 0 내지 약 4 중량%, 또는 약 1 내지 약 7 중량%의 히드록시프로필메틸셀룰로오스 및 약 0 내지 약 4 중량%, 예를 들어 약 2 내지 약 4 중량%의 소듐 전분 글리콜레이트를 포함하는 과립내 상을 포함할 수 있다.

예시적인 제형은 약 35 내지 약 500 mg의 AS1을 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어진 투여 형태를 포함하며, 예를 들어 약 35 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 또는 250 mg의 AS1을 포함하는 정제가 본원에서 고려된다.

예시적 실시양태에서, 약 50 중량%의 AS1 (또는 그의 염), 약 11.5 중량%의 만니톨, 약 10 중량%의 미정질 셀룰로오스, 약 3 중량%의 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 약 2.5 중량%의 소듐 전분 글리콜레이트를 포함할 수 있는 과립내 상; 및 약 20 중량%의 미정질 셀룰로오스, 약 2.5 중량%의 소듐 전분 글리콜레이트, 및 약 0.5 중량%의 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있는 과립외 상을 포함하는, 경구 투여용의 제약상 허용되는 정제가 제공된다. 정제는 장용 코팅을 또한 포함할 수 있다.

또 다른 예시적 실시양태에서, 약 5 내지 약 10 중량%, 예를 들어 약 8 중량%의 AS1 (및/또는 그의 염, 예를 들어 나트륨 염, 여기서, 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-결합 포스포로티오에이트임), 약 40 중량%의 만니톨, 약 8 중량%의 미정질 셀룰로오스, 약 5 중량%의 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 약 2. 중량%의 소듐 전분 글리콜레이트를 포함하거나 본질적으로 그것으로 이루어질 수 있는 과립내 상; 및 약 17 중량%의 미정질 셀룰로오스, 약 2 중량%의 소듐 전분 글리콜레이트, 및 약 0.4 중량%의 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있는 과립외 상을 포함하거나 그로 본질적으로 이루어진, 경구 투여용의 제약상 허용되는 정제가 제공된다.

개시된 정제는 장용 코팅을 또한 포함할 수 있으며, 예를 들어, 개시된 정제는 약 13 중량%, 약 15 중량%, 16 중량%, 17 중량%의 장용 코팅, 예를 들어 아크릴EZE^®를 포함할 수 있다.

코팅이 용해되고 활성 성분이 방출되는 시점에서의 속도가 그의 용해 속도이다. 일 실시양태에서, 고려되는 정제는 7.2의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 예를 들어 USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 시험할 때, 약 120분 내지 약 240분 후, 예를 들어 180분 후 올리고뉴클레오티드 방출율이 약 50 내지 약 100%인 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 고려되는 정제는 1.0의 pH를 갖는 묽은 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 예를 들어 USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 시험할 때, 실질적으로 어떠한 올리고뉴클레오티드도 120분 후에 방출되지 않는 용해 프로파일을 가질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 고려되는 정제는 6.6의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 예를 들어 USP/EP 타입 2 장치 (패들)에서 시험할 때, 30분 후 올리고뉴클레오티드 방출율이 약 10 내지 약 30%, 또는 약 50% 이하인 용해 프로파일을 가질 수 있다.

개시된 제형, 예를 들어 일부 실시양태에서 정제는 환자에게 경구 투여될 때 환자에서 올리고뉴클레오티드의 혈장 농도가 최소가 되게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 제형은 환자에게 경구 투여될 때 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 국소적으로 전달되며, 예를 들어 환자의 영향을 받은 또는 질환에 걸린 장 부위에 전달된다.

개시된 제형을 투여하여 크론병, 궤양성 대장염, 및/또는 만성 염증성 장질환의 치료가 필요한 환자에서 크론병, 궤양성 대장염 및/또는 만성 염증성 장질환을 치료하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.

실시예

하기 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 방법을 예시하기 위하여 제공한다. 본 발명의 많은 다른 실시양태가 당업계의 숙련자에게 명백할 것이다.

실시예 1 - 정제

각각의 과립내 성분을 적절한 용기 내에 분배함으로써 습윤 과립을 제조하였다. 과립내 재료 모두를 710 μm 체를 통하여 스크리닝하고, 푸드 프로세서 보울 (food processor bowl)에서 대략 5분 동안 블렌딩하였다. 수 과립화액을 시린지를 사용하여 서서히 첨가하였다. 습윤 물질을 2.00 mm 핸드 스크린에 통과시키고, 최대 90분 동안 40℃에서 오븐에서 건조시켰다. 건조 후, 과립을 1.00 mm 핸드 스크린을 통하여 스크리닝하였다. 막자사발과 막자를 이용하여 조악한 과립의 크기를 감소시켰다. 과립을 터뷸러 블렌더 (Turbula blender)를 이용하여 42 rpm에서 10분 동안 스테아르산마그네슘을 제외한 과립외 부형제와 블렌딩하였다. 스테아르산마그네슘을 상기 블렌더에 첨가하고, 42 rpm에서 2분 동안 추가로 혼합하였다. 제형을 매네스티 (Manesty) F3 단일 펀치 압축기에서 압축하였다. AS1 정제에 있어서의 전체 제조 공정 흐름도를 도 2에서 볼 수 있다.

50 g 배치 크기로 제조한 만니톨 기반 250 mg 용량 강도 제형은 건조 믹스의 수분 함량이 5.21%이고 건조 과립의 수분 함량이 6.42%였다. 만니톨 기반의 250 mg 용량 강도 제형은 5.0 g의 첨가수, 4분의 과립화 시간, 및 60분의 건조 시간을 가졌다.

100 g 배치 크기로 제조한 만니톨 기반의 35 mg 용량 강도는 건조 과립의 경우 수분 함량이 2.35%였고, 28g의 물을 첨가하였으며, 과립화 시간이 6분이었고, 건조 시간이 65분이었다.

만니톨 기반의 250 mg 용량 강도 제형에 있어서의 압축 IPC 결과는 하기와 같다: 453.0 mg의 평균 중량, 18.0 Kp의 경도, 3.82 mm의 두께, 0.23%의 취약도 및 17분의 붕해.

표 1A는 3가지의 용량 강도: 3.5 mg, 35 mg, 및 250 mg의 정제 조성물을 포함한다. 정제 중량은 모든 제형에 있어서 500 mg이었다.

<표 1A>

표 1B는 이들 3가지 용량 강도의 코어 배치의 조성을 나타낸다:

실시예 2 - 분말 특성화

제형을 입자 크기 분포, 밀도, 카 지수 (Carr's index) 및 안식각에 대하여 평가하였다. 분말 입자 분석에 의하면, 입자가 3.5 mg 용량 강도 제형의 경우 크기가 더욱 크고 (335 μm), 반면, 35 mg 및 250 mg 용량 강도 제형은 일반적인 입자 크기 분포를 나타낸다는 것이 나타났다. 도 3은 표 1에 나타낸 조성물에서 3.5 mg 용량 강도에 있어서의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 4는 표 1에 나타낸 조성물에서 35 mg 용량 강도의 입자 크기 분포를 도시한다. 마지막으로, 도 5는 표 1에 나타낸 조성물에서 250 mg 용량 강도에 있어서의 입자 크기 분포를 도시한다. 표 2는 3가지 용량 강도의 분말 특성화 결과를 제시한다.

<표 2>

실시예 3 - 장용 코팅

20% 코팅 용액을 아크릴-EZE^® 코팅에 대하여 제조하였다. 필요량의 물 및 아크릴-EZE^®를 적절한 용기 내에 분배하였다. 혼합하면서 아크릴-EZE^®를 서서히 첨가하여 와동시켰다. 이 분산물을 45분 동안 교반시키고, 500 μm 체에 통과시켰다. 10% 또는 16%의 중량 증가가 얻어질 때까지 분무를 계속하였다.

실시예 4 - 40 mg 정제

AS1의 40 mg 정제를 위한 배치 제형을 하기에 나타낸다:

실시예 5 - 200 mg 정제 제형

표 4에 예시된 바와 같이, 일반적으로 실시예 1의 절차에 따라 200 mg 용량 강도의 AS1 정제를 제조하였다. 모든 제형에 있어서의 정제 중량은 500 mg이었다.

<표 4>

실시예 6 - HPLC 용해법

이 분석적 시험 절차는 HPLC에 의한 AS1 장용 코팅 정제의 용해 분석을 설명한다. 서방형 고체 투여 형태에 대한 유럽 약전의 절차에 따라, 방법 A를 이용하여 용해를 수행한다. 사용한 장치는 유럽 약전/미국 약전 장치 2 (패들)이었다.

HPLC에 있어서의 용해 조건은 하기와 같았다: 매체는 pH 1.0 HCl (120 min), pH 6.6 (30 min), pH 7.2 (60 min); 37℃의 온도; 100 rpm의 속도; 재순환 샘플: 7.5 ml, 샘플 크기: 0.8 ml; 샘플 시간: pH 1.0 HCl에서 120 min, pH 6.6에서 15 min, 30 min, pH 7.2에서 15 min, 30 min, 45 min, 60 min; 및 45 μm의 디스테크 인라인 필터로 이루어진다.

용해 동안 각각의 용기에서 하기와 같이 각각의 상태로 매질을 조정하였다: 초기 부피: 750 ml의 pH 1.0 HCl, 120 min에서는 200 ml의 0.2 M Na₃PO₄ 및 30 ml의 1.0 M pH 6.7 Na₂HPO₄를 첨가하고 이어서 2.0 M NaOH를 이용하여 pH를 pH 6.60±0.05로 조정하고, 이어서 150 min에서 2.0 M NaOH를 이용하여 pH를 7.20±0.05로 조정하였다.

크로마토그래피 조건은 하기와 같다: 디오넥스 (Dionex) HPLC 분석용 컬럼, DNAPac-100, 4 x 250 mm; 2.0 ml/min의 유속; 80℃의 컬럼 온도; 260 nm에서의 UV의 검출; 100 μl의 주입 부피; 물에 의한 니들 세척; 이동상: A) 100 mM 트리스 (pH 8.0) 중 10% (v/v) 아세토니트릴 및 B) 100 mM 트리스 및 2M LiCl (pH 8.0) 중 10% (v/v) 아세토니트릴; 15분의 HPLC 실행 시간; 및 대략 6 min의 AS1의 용출 기간. 구배를 표 6에 제시한다.

<표 6>

35 mg 정제의 작업 표준 용액의 제조: 12.5 mg의 AS1 기준 표준물을 50 ml 메스 플라스크 내에 넣고 물로 용해시켜 50 ml 용액을 만들었다. 이 용액 7 ml을 물로 희석시켜 50 ml 용액을 만들어서 0.035 mg/ml의 AS1 최종 농도를 생성하였다.

250 mg 정제의 작업 표준 용액의 제조: 12.5 mg의 AS1을 50 ml 메스 플라스크 내에 넣고 50 ml 부피가 되도록 물로 용해시켜 0.25 mg/ml의 AS1 최종 농도를 생성하였다.

표 5는 35 mg, 250 mg, 및 200 mg 배치에 있어서의 용해 결과를 제시하며, 이때 아크릴-EZE^® 코팅의 12% 중량 증가가 있었다. 도 6은 3가지 상이한 매질 중의 AS1 제형의 3가지 용량 크기를 갖는 제형에 있어서의 용해 프로파일의 그래프이다.

<표 5>

16%의 아크릴-EZE^® 코팅을 포함하는 정제를 배치 1에서 상기에 기술한 바와 같이 정제를 사용하여 제조하고, 최종 코팅은 코팅 팬 내로의 정제의 중량 증가가 출발 값의 16%가 될 때까지 행한다. 도 7은 용해 프로파일을 도시한다.

실시예 7 - AS1 의 생체 내 경구 투약

본 연구의 목적은 경구 투여 또는 정맥내 투여에 의해 단회 용량을 투여할 때 의식이 있는, 구속되지 않은 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey)의 심혈관계, 호흡기계, 및 중추 신경계에 대한 AS1의 잠재적인 영향을 확인하는 것이었다. 이 연구에서 정맥내 투여는 전신적 노출과 연관된 잠재적인 영향을 조사하는 것을 포함하였다. 정맥내 투약 제형을 벌크 분말로서 투여하며, 경구 투여의 경우 젤라틴 캡슐 내에 포함된 장용 코팅 정제로서 투여하였다. 3.6 내지 3.8년령의, 그리고 체중이 3.4 내지 3.9 kg인 4마리의 실험적 비-나이브 (naive) 수컷 시노몰구스 원숭이를 단일 군에 할당하였다.

<표 7>

모든 투약 수준은 순도에 대하여 보정한 AS1의 양을 나타낸다. 대조 경구 투약형은 위약 정제를 포함하는 2개의 캡슐이었다. 대략적인 투약 수준은 4일에 3.5 내지 3.9 kg 범위의 체중을 기반으로 하고, 각각이 정제 당 26.1 mg의 AS1 (순도에 대하여 보정함)을 포함하는 정제를 포함하는 2개의 캡슐의 투여에 의해 달성하였다. 대략적인 투약 수준은 4일에 3.5 내지 3.9 kg 범위의 체중을 기반으로 하고, 각각이 정제 당 169.9 mg의 AS1 (순도에 대하여 보정함)을 포함하는 정제를 포함하는 2개의 캡슐의 투여에 의해 달성하였다.

독성동역학적 분석을 위한 혈액 샘플을 연구 전, 및 경구 투약의 경우 투약한지 1시간 및 6시간 후에, 그리고 정맥내 투약의 경우 투약한지 5분, 1시간 및 6시간후에 수집하였다. 샘플을 냉장 조건 하에 혈장으로 가공하고, 혈장을 분석할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 샘플을 AS1 특이적 혼성화 분석을 이용하여 분석하였다.

1일에, 모든 동물은 경구용 대조 물품 투약형을 받았으며, 이어서 경구 가바주 (gavage)를 통하여 4일 및 7일에 AS1의 투약형을 받았다. 경구 투약형의 경우, 위약 및 AS1 함유 정제를 적절한 크기의 젤라틴 캡슐 내에 포함시켜 경구 경로를 통한 투여를 용이하게 하였다. 12일에, 모든 동물은 느린 푸시 (push) 주사에 의해 정맥내 대조 투약형 (인산염 완충 염수)을 받았으며, 이어서 14일 및 19일에 AS1의 정맥내 투약형을 받았다.

심혈관 데이터 및 체온 데이터를 각각의 투약형의 투여 이전에 그리고 상기 투여 이후 24시간 동안 빈번한 간격으로 텔레미터법을 통하여 기록하였다. 호흡기 기능은 투약 이전에, 그리고 각각을 투약한지 1시간, 6시간 및 24시간에 수집한 동맥 샘플에서 혈액 가스를 측정함으로써 평가하고, 그 외에도 상기 동일 시점에서 호흡 속도를 (시각적으로) 측정함으로써 평가하였다. 신경 기능은 시험 물품의 최종 경구 투약 이후 텔레미터법에 의한 기록 기간의 마지막 후 대략 24시간 이내에 그리고 또 최종 정맥내 투여 이후 텔레미터법에 의한 기록 기간의 마지막 후 대략 24시간 이내에 연구하는 것 이전에 모든 동물의 신경학적 검진을 수행함으로써 평가하였다. 또한 동물은 임상 징후 (사망률/이환율, 케이지 측면 관찰, 먹이 소비 및 체중)에 대하여 관찰하였다.

본 분석에 있어서 매우 낮은 LLOQ (0.5 ng/ml)에도 불구하고, 거의 100 mg/kg까지의 경구 투약 이후 어떠한 혈장 샘플에서도 AS1이 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, IV 주사 이후 평균 최대 혈장 농도는 각각 3 및 10 mg/kg 용량의 경우 28,309 및 180,352 ng/ml이었다. IC 투약 이후 혈장으로부터의 AS1의 제거는 구조적으로 관련된 올리고뉴클레오티드에 대하여 보고된 것과 유사한 동력학적 특성을 나타내었다 (즉, 대략 0.5시간의 반감기).

실시예 8 - 경구 투여한 AS1 의 28일에서의 생체 내 연구

이 연구의 목적은 28일 동안 마우스에게 일일 1회 경구 투여하고 이어서 28일간의 회복 기간이 있을 때 AS1의 잠재적인 독성 및 독성동역학적 특성을 평가하는 것이었다. AS1 제형을, AS1을 불활성 비드 상에 층화시킨 작은 코팅된 비드의 형태로 위장-보호 코팅을 포함하는 제형으로서 제조하였으며, 그 후 이것을 유드라기트^® S 100으로 코팅하여 인간 용도에 적합한 경구 제형을 모방하였다. 상이한 용량 수준을 사용하여 세 군에 투여한였다 (30 mg/kg/일 (저); 100 mg/kg/일; 300 mg/kg/일).

혈장중 또는 조직중 수준에 있어서 성별에 관련된 상이함은 없었다. 본 분석에 있어서 매우 낮은 LLOQ에도 불구하고, 1일에 수집한 매우 낮은 용량 (30 mg/kg/일)의 동물 유래의 두 혈장 샘플에서만 AS1이 검출되었으며 28일에 수집한 임의의 샘플에서는 그러하지 않았다. 100 및 300 mg/kg/일의 더욱 높은 투약 수준에서, AS1은 대부분의 혈장 샘플에서 정량화가능하였으며, 이 수준은 일반적으로 용량에 관련된다. 그러나, 심지어 최고 투약 수준에서도, 혈장중 수준은 임의의 동물에서 (투약 후 0.5 내지 24시간의 다양한 시점에 수집한 샘플에서) 21 ng/ml을 초과하지 않았다. AS1 농도는 위장 (GI) 조직에서 매우 높았으며, 이때 최고 투약 수준 (제1 투약 이후)에서의 평균 최대 농도는 각각 대장, 소장, 전위, 선위, 식도 및 직장의 경우 조직 1 g 당 대략 536, 857, 825, 538, 137 및 127 μg이었다.

GI관 조직으로부터의 광범위한 제거가 제1 투약 후 24시간까지 명백하였다. 매일 투약에서 AS1의 명백한 축적은 전혀 없었다.

300 mg/kg의 제1 투약 이후 전신 흡수의 두 주요 기관인 신장 및 간에서의 최대 평균 농도는 단지 4.0 및 2.3 μg/g이었으며, 이는 GI 조직에서 측정된 농도 범위보다 100배 초과로 더 낮다.

30 mg/kg의 최저 용량 이후, 신장 및 간에서의 최고 평균 농도는 단지 0.4 및 0.3 μg/g이었다. 28일간의 투약 기간에 걸쳐 내부 기관에 AS1이 축적된다는 증거는 전혀 없었다.

마우스에서 AS1에의 전신적 노출은 위장-보호 제형으로 전달되는 고용량 (최대 300 mg/kg/일)의 AS1의 경구 투여 이후 매우 낮았으며, 28 연속일 동안 매일 투여될 때 GI 조직 또는 내부 조직에서 축적이 전혀 없었다.

실시예 9 - 대장염에 대한 AS1 의 치료 효과

TNBS-유도성 대장염 모델에서 장 염증의 코스에 대한 AS1의 치료 효과를 조사하기 위하여, TNBS를 직장내 투여한지 1일 후에 단회 용량의 AS1 또는 Smad7 센스 올리고뉴클레오티드로 마우스를 처리하였다. 생쥐 당 125 또는 250 μg의 단회 용량은 체중 손실을 개선하고, 대장염의 중증의 조직학적 발현을 두드러지게 감소시켰다.

AS1 (TNBS로 대장염을 유도한지 1일 후에 125 μg의 단회 용량으로 제공함)은 IL-12 및 IL-23 시토카인의 구성요소인 단량체형 p40 서브유닛의 결장에서의 생성을 유의하게 감소시켰으며, 이는 이들 전염증성 시토카인의 결장에서의 생성의 저해를 증명하는 것이다.

하기에 열거된 항목들을 포함하여 본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 마치 각각의 개개의 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것처럼 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 상충될 경우, 본원에서의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 좌우할 것이다.

등가물

본 발명의 구체적인 실시양태를 논의하였지만, 상기 명세서는 예시적인 것으로서 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변이가 이 명세서의 개관시에 당업계의 숙련자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 전체 범주는 특허청구범위를 그의 등가물의 전체 범주와 함께 참조함으로써 그리고 본 명세서를 그러한 변이와 함께 참조함으로써 결정되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Giuliani International Limited BARONI, Sergio BELLINVIA, Salvatore VITI, Francesca <120> Antisense compositions and methods of making and using same <130> P46432WO/JCH <150> EP08425727.8 <151> 2008-11-13 <150> US61/152,297 <151> 2009-02-01 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> 5-methyl-2'-deoxycytidine <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> 5-methyl-2'-deoxycytidine <400> 1 gtcgcccctt ctccccgcag c 21

Claims (37)

1. 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 및 제약상 허용되는 충전제를 포함하는 과립내 상;
   붕해제를 포함하는 과립외 상; 및
   에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅
   을 포함하며,
   6.6의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 30분 동안 50% 이하의 양의 올리고뉴클레오티드가 방출되고, 1.0의 pH를 갖는 묽은 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 120분 동안 올리고뉴클레오티드가 방출되지 않으며,
   안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 전달하는데 사용되는 것인,
   안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여용의 제약 정제 제형.
2. 제1항에 있어서, 서열 1의 뉴클레오티드간 결합이 O,O-결합 포스포로티오에이트인 제약 정제 제형.
3. 제1항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 서열 1의 나트륨 염인 제약 정제 제형.
4. 제1항에 있어서, 과립내 상이 붕해제를 추가로 포함하는 제약 정제 제형.
5. 제1항에 있어서, 과립외 상이 윤활제를 추가로 포함하는 제약 정제 제형.
6. 제1항에 있어서, 충전제가 만니톨인 제약 정제 제형.
7. 제1항에 있어서, 붕해제가 소듐 전분 글리콜레이트인 제약 정제 제형.
8. 제5항에 있어서, 윤활제가 소듐 전분 글리콜레이트인 제약 정제 제형.
9. 제1항에 있어서, 과립내 상이 미정질 셀룰로오스, 소듐 전분 글리콜레이트, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 그의 혼합물로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 제약 정제 제형.
10. 제1항에 있어서, 과립외 상이 미정질 셀룰로오스 및 스테아르산마그네슘, 및 그의 혼합물로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 제약 정제 제형.
11. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 8 내지 18 중량%인 제약 정제 제형.
12. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 12 내지 16 중량%인 제약 정제 제형.
13. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 8 내지 15 중량%인 제약 정제 제형.
14. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 10 내지 12 중량%인 제약 정제 제형.
15. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 5 내지 20 중량%인 제약 정제 제형.
16. 제1항에 있어서, 상기 장용 코팅이 정제의 13 내지 15 중량%인 제약 정제 제형.
17. 삭제
18. 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 0.5 내지 10 중량%;
    만니톨 30 내지 50 중량%;
    미정질 셀룰로오스 10 내지 30 중량%; 및
    에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅
    을 포함하며,
    6.6의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 30분 동안 50% 이하의 양의 올리고뉴클레오티드가 방출되고, 1.0의 pH를 갖는 묽은 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 120분 동안 올리고뉴클레오티드가 방출되지 않으며,
    안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 전달하는데 사용되는 것인,
    경구용의 제약상 허용되는 정제.
19. 에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는 장용 코팅, 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 35 내지 500 mg을 포함하며,
    6.6의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 30분 동안 50% 이하의 양의 올리고뉴클레오티드가 방출되고, 1.0의 pH를 갖는 묽은 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 120분 동안 올리고뉴클레오티드가 방출되지 않으며,
    안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 전달하는데 사용되는 것인,
    경구 투여 조성물.
20. 서열 1로 표시되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 제약상 허용되는 염 5 내지 10 중량%,
    만니톨 40 중량%,
    미정질 셀룰로오스 8 중량%,
    히드록시프로필메틸 셀룰로오스 5 중량%, 및
    소듐 전분 글리콜레이트 2 중량%
    를 포함하는 과립내 상; 및
    미정질 셀룰로오스 17 중량%,
    소듐 전분 글리콜레이트 2 중량%, 및
    스테아르산마그네슘 0.4 중량%
    를 포함하는 과립외 상; 및
    에틸아크릴레이트-메타크릴산 공중합체를 포함하는, 정제 상의 장용 코팅
    을 포함하며,
    6.6의 pH를 가진 인산염 완충액에서 100 rpm 및 37 ℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 30분 동안 50% 이하의 양의 올리고뉴클레오티드가 방출되고, 1.0의 pH를 갖는 묽은 HCl에서 100 rpm 및 37℃에서 USP/EP 타입 2 장치(패들)에서 시험할 때, 120분 동안 올리고뉴클레오티드가 방출되지 않으며,
    안티센스 올리고뉴클레오티드를 환자의 회장 말단부 및/또는 우측 결장에 전달하는데 사용되며,
    여기서 백분율은 정제의 총 중량에 대한 성분의 중량을 나타내는 것인, 경구용 제약상 허용되는 정제.
21. 제20항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 40 mg을 갖는 제약상 허용되는 정제.
22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 염증성 장질환의 치료를 위한 제약 정제 제형.
23. 제18항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 만성 염증성 장질환의 치료를 위한 제약상 허용되는 정제.
24. 제19항에 있어서, 만성 염증성 장질환의 치료를 위한 경구 투여 조성물.
25. 제22항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 크론병인 제약 정제 제형.
26. 제22항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 궤양성 대장염인 제약 정제 제형.
27. 제23항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 크론병인 제약상 허용되는 정제.
28. 제23항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 궤양성 대장염인 제약상 허용되는 정제.
29. 제24항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 크론병인 경구 투여 조성물.
30. 제24항에 있어서, 만성 염증성 장질환이 궤양성 대장염인 경구 투여 조성물.
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