CN101151035A - 用于治疗炎性肠病的治疗性反义寡核苷酸组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了持续改善和/或治疗溃疡性结肠炎的方法，包括经直肠给予包括具有序列5’－GCCCAAGCTGGCATCCGTCA－3’的反义寡核苷酸(ISIS2302)的化合物。该方法导致组合物给药结束后长期(多于90天)持续减少溃疡性结肠炎征候。该组合物被很好地耐受且全身暴露最小化。

Description

用于治疗炎性肠病的治疗性反义寡核苷酸组合物

相关申请

本申请涉及两个美国临时专利申请：2004年12月2日提交的60/632,826和2005年9月12日提交的60/716,355，并要求这两个申请的优先权。所述两个申请均以其整体在此引入作为参考。

序列表

与本申请一起按37 CFR 1.821提交了序列表，在此将其引入作为参考。

发明领域

本发明涉及反义寡核苷酸治疗性化合物调节细胞内粘附分子1(ICAM-1)的表达以改善和/或治疗包括克罗恩病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎和贮袋炎(pouchitis)的炎性肠病。

发明背景

ICAM-1为免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，它是低水平组成型表达在血管内皮细胞和白细胞亚型上的可诱导的跨膜糖蛋白(Dustin et al.，J.Immunol.，137：245-54，1986；Rothlein et al，J.Immunol.，137：1270-4，1986；Simmons et al，Nature，331：624-7，1988)。ICAM-1结合的主要配体为β₂整合蛋白-LFA-1和Mac-1，两者都在白细胞上表达(Marlin andSpringer，Cell，51：813-9，1987；Diamond et al，J.Cell Biol.，111：3129-39，1990)。ICAM-1在炎性过程蔓延中具有多种功能，最具有特征的是在炎症位点促进白细胞从血管内腔迁移到血管外空间(Butcher，Cell，67：1033-6，1991；Furie et al，Blood，78：2089-97，1991；Oppenheimer-Markset al.，J.Immunol.，147：2913-21，1991)。此外，在抗原呈递中ICAM-1似乎也提供了对T淋巴细胞的重要的二级信号(Altmann et al.，Nature，338：512-4，1989；Van Seventer et al.，J.Immunol.144：4579-86，1990；Kuhlman et al.，J.Immunol.，146：1773-82，1991)。它也在促进细胞毒性T细胞(Makgoba et al.，Eur.J.Immunol.，18：637-40，1988)、自然杀伤细胞(Allavena et al.，Blood，84：2261-8，1994)和嗜中性白细胞(Ding et al.，J.Immunol.，163：5029-38，1999)介导的损伤靶细胞中起着重要的作用。

应答包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)(To et al.，Arthritis Rheum.，39：467-77，1996；Beutler，Arthritis Rheum.，26：16-21，1999)在内的促炎刺激素，许多细胞类型调节ICAM-1在它们表面的表达。包括ICAM-1在内的细胞粘附分子是白细胞和内皮细胞迁移所必需的。大量研究已证实在患有包括炎性肠病(IBD)(Jones et al.，Gut，36：724-30，1995)、类风湿性关节炎(To et al.，Arthritis Rheum.，39：467-77，1996)、乳糜泻综合征(Sturgess et al.，Clin，Exp.Immuinol.82：489-92，1990)、IgA神经病(Nguyen et al.，Am.J Nephrol.19：495-9，1999)、全身性狼疮(Papa et al.，Lupus，8：423-9，1999；Egerer et al.，Lupus，9：614-21，2000)、炎性皮肤病(Ackermann et al.，Arch Dermatol Res.，290：353-9，1998)和多发性硬化(Bo et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55：1060-72，1996)在内的广泛炎性疾病患者的受累组织中ICAM-1的表达增加。

抗ICAM-1单克隆抗体已证实在包括如下疾病的多种动物模型中有有益作用：肺炎和哮喘(Barton et al.，J.Immunol.143：1278-82，1989；Wegener et al.，Science，247：456-9，1990)、同种异体移植物排斥(Cosimiet al.，J.Immunol.，144：4604-12，1990；Isobe et al.，Science，255：1125-7，1993)、肾炎(Haming et al.，Clin Immunol.Immunopath.，64：129-34，1992；Kawasaki et al.，J.Immunol.，150：1074-83，1993)、局部缺血损伤(Ma etal.，Circulation，86：937-46，1992；Kelly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.91：812-6，1994)、炎性关节炎(Iigo et al.，J.Immunol.，147：4167-71，1991)、接触性皮炎(Scheynius et al.，J.Immunol.150：655-63，1993)和结肠炎(Hamamoto et al.，Clin.Exp.Immunol.，117：462-8，1999)。这些动物模型支持ICAM-1功能或表达的抑制剂在人疾病中的试验。

已证实在炎性肠病(IBD)期间ICAM-1表达。在硫酸葡聚糖诱导的结肠炎小鼠模型中，在结肠粘膜下层和肌层血管的内皮上ICAM-1的表达增加(Bennett，J.Pharm.Exp.Ther，280：988-1000，1997)。克罗恩病中，在鼓膜中层(lamina propria)微脉管系统(结肠和空肠)(Sousa et al.，Gut，45：856-63，1999)、肠单核细胞(Bernstein et al.，Clin.Immunopathol.，86：147-60，1998)和结肠上皮的顶端部分(Vanier et al.，Am.J.Surg.Pathol.，24：1115-24，2000)中人ICAM-1表达增加。ICAM-1的组织表达与疾病活性相关(Vanier et al.，Clin.Exp.Immunol.，121：242-7，2000)

炎性肠病(IBD)指包括克罗恩病和溃疡性结肠炎在内的一组疾病。由于这两种疾病相似的发病机理和临床症状，它们常分在一类。在缺乏侵入性成像研究时，不可能辨别这两种疾病，在许多出版物和研究中它们常被认为是一种疾病。确诊性诊断属于哪种疾病需要诸如内窥镜检查(乙状结肠镜检查或结肠镜检查)、双对照钡灌肠和计算机断层摄影术(CT)扫描的成像研究；与包括用以检测升高的白细胞水平的全血细胞计数、红细胞沉降率和血清白蛋白浓度的实验室试验联合。

所述两种疾病是慢性的、复发/缓解型胃肠(GI)道炎性疾病。最常被克罗恩病侵袭的GI道区域是小肠和大肠(也称作结肠)，包括直肠，然而，克罗恩病可侵袭从口部到肛门的整个GI道。可能会是单处或多处炎症。溃疡性结肠炎仅侵袭大肠。溃疡性结肠炎中的炎症和溃疡限于粘膜层和粘膜下层-大肠四层中的两个最内层。克罗恩病中的炎症和溃疡可延伸到小肠和大肠肠壁的所有层。这些疾病的共同症状包括腹泻、腹痛、直肠出血和体重减轻。克罗恩病的并发症包括肠脓肿、瘘管-导致从肠的一部分到另一部分并允许液体通过或分泌的异常通道、以及肠梗阻。典型地，两种疾病的过程是间歇的，疾病加重后是一段时间的缓解。然而，溃疡性结肠炎可能是单一事件，或是连续的持续不断的症状。

基于克罗恩病和溃疡性结肠炎在病理和临床症状上重叠，因此针对这两种病的可采用的疗法大体上重叠就不意外了。显著的差异是当疾病接近直肠时可能采用灌肠剂治疗溃疡性结肠炎。这使得可以局部施用治疗剂。由于克罗恩病通常包括涉及小肠，通常就需要全身性治疗。尽管在治疗性干预IBD中有很多选择，但是其中许多有不期望的副作用，这使得它们治疗慢性疾病不够理想。

对轻微的溃疡性结肠炎，口服或局部(例如灌肠剂)给予氨基水杨酸盐通常是一线疗法。氨基水杨酸盐类由包含5-氨基水杨酸(5-ASA)的药剂组成，它是用于IBD的最古老的抗炎化合物之一。例如，在二十世纪三十年代开发了5-ASA柳氮磺胺吡啶用于治疗类风湿性关节炎，在二十世纪七十年代确定了它治疗IBD的用途(Anthonisen et al.，Scan.J Gastroenterol.，9：549-554，1974)。高剂量使用5-ASA可引起急性发作的缓解。尽管5-ASAs通常被用于维持治疗，但还没有证实它在维持缓解中是有效的。

通常采用的5-ASA制剂包括柳氮磺胺吡啶、口服和局部美沙拉嗪、奥撒拉嗪以及巴沙拉嗪。多种制剂被修饰以提供针对所关注部位(例如小肠或大肠)的可用的活性药剂。5-ASA的副作用是常见的。柳氮磺胺吡啶具有与磺胺基团有关的很高的毒性(约三分之一的患者)，包括头痛、恶心、消化不良和缺乏食欲。不常见的副作用包括发烧、皮疹、关节痛、溶血、中性粒细胞减少、结肠炎恶化、过敏性反应和肾中毒。不包含磺胺基团的美沙拉嗪、奥撒拉嗪和巴沙拉嗪引起副作用大大减少，但仍会引起皮疹、头痛和发烧。还报道了其他更严重的副作用。

美沙拉嗪灌肠剂已涉及产生急性不耐性综合症，其以痉挛、急性腹痛和血性腹泻、有时有头痛、发烧和皮疹为特征。当采用美沙拉嗪灌肠剂时，一些患者已发展为全结肠炎，然而频率比安慰剂治疗组的低。从灌肠剂中吸收美沙拉嗪的程度主要取决于停留时间，因而是不同的。与口服给药相比，通过灌肠剂给药显著减少了全身性暴露，然而，10-30％的日剂量可在24小时尿液收集中被回收，这暗示了全身性暴露是实在的。在临床条件下，给药后10至12小时患者显示了2μg/ml的血浆水平，其中约三分之二为N-乙酰基代谢物。(PhysiciansDesk Reference(医生案头参考)，53^rd Edition.1999.Medical EconomicsData，Montvale，NJ，pp 3126-7)

皮质类甾醇是引起IBD发作缓解的最有效的药剂之一，通常它在5-ASAs治疗失败时的第二治疗选择。首先在有或没有5-ASA伴随给药时将该化合物以口服或直肠给药。口服给药失败时，将该化合物静脉内给药。理想地，皮质类甾醇仅用作短程治疗以及在缓解疾病时是逐级减少的。

常用于治疗IBD的皮质类甾醇包括泼尼松、布地奈德和氢化可的松。许多严重的和显著的与皮质类甾醇相关的副作用限制了它的应用。短期使用常见的副作用包括失眠、夜汗、情绪变化和改变的葡萄糖代谢。长时期的维持治疗通常仅用于严重的、难控制的情况。长时期的治疗会导致肾上腺萎缩，然而突然停止可引起肾上腺机能不全、低血压，以及甚至死亡。其他的副作用包括痤疮、异常的脂肪沉积、过度的头发生长和骨质疏松症。在克罗恩病中，皮质类甾醇可阻挠瘘管康复，使疾病状态恶化。

应答口服或直肠皮质类甾醇的个体，常给予维持剂量的5-ASA。然而，许多医生在缓解期间不提供药理学干涉。需要用静脉内皮质类甾醇治疗的个体通常以诸如6-巯基嘌呤和/或咪唑硫嘌呤的免疫抑制剂与5-ASA联合来维持。胃肠外营养通常与这些严重的疾病有关。当患者对上述疗法没有反应时，给予免疫抑制剂环孢霉素以试图避免手术移除部分患病肠。

免疫抑制剂干预并不是没有不期望的副作用。6-巯基嘌呤和咪唑硫嘌呤可引起发烧、皮疹、恶心和头痛，更严重的副作用包括白细胞减少、胰腺炎、严重的感染和骨髓抑制。环孢霉素具有更严重的副作用，包括感觉异常(如同燃烧或刺痛的异常感觉)、过度的头发生长、高血压、震颤、肾机能不全、头痛和机会感染。

典型地如环丙沙星或甲硝哒唑的抗生素被用作5-ASA或皮质类甾醇治疗的补充，尤其是治疗具有瘘管或结肠病的患者。和所有其他疗法一样，用抗生素的长期治疗具有副作用。

英夫利昔单抗(infliximab)是目前在IBD中药物疗法的最后手段。它是由75％人蛋白和25％小鼠蛋白组成的嵌合单克隆抗体。英夫利昔单抗是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)-有效炎性细胞因子的抑制剂。该药物通过结合可溶的和膜结合的TNF-α作为接受体起作用。通过抑制炎性级联中上游的活化剂来抑制许多炎性通路。首先静脉内给予该药治疗，随后以每隔8周的维持药物给药，如产品标签上所说明的。然而，和生物学药剂一样，免疫反应限制了该药物的应用。因此，通常免疫抑制剂与英夫利昔单抗维持疗法联合给药。如同所有其他对IBD的治疗一样，英夫利昔单抗具有很多副作用。TNF-α在消除肿瘤细胞中起重要作用，因此它的抑制可导致机会感染、恶性肿瘤和其他并发症，尤其是对作为长期策略而言(Brown et al.，Arthritis Rheum.，46：3151-5，2002；Lee et al.，Arthritis Rheum.，46：2565-70，2002；Nahar et al.，Ann.Pharmacotherapy，37：1256-65，2003)。

外科手术是治疗IBD的方法，而不是治愈。由于IBD的慢性特点和发作年龄较早，在对药理学干预没有反应的患者一生中需要多次外科手术。切除小部分肠且没有很大副作用是可能的。然而，切除大量的或许多段肠会导致个体不能吸收营养素的短肠综合征。切除部分大肠会导致需要结肠造口术或其他进一步的外科方法。因此，外科手术不是治疗IBD的优选方法。

治疗IBD的外科手术可导致其它疾病。在完全切除结肠时，外科医生从小肠处构建回肠陷凹以使得通过肛门排除粪便，而不需要永久的造口术。贮袋炎是通常在重构建后第一个两年内发生的回肠陷凹的非特异性炎症。症状包括不断增加的排便次数，并伴随失禁、出血、发烧和/或急迫感。具有溃疡性结肠炎的患者约20-30％经受至少一种症状。抗生素足以治疗贮袋炎，然而需要类似于用在IBD中的其他更多的侵入性疗法。

反义寡核苷酸提供了理想的解决现有技术方法中碰到的问题。可将它们设计为选择性抑制给定核酸或蛋白的表达，以及基于核苷酸序列通过与核酸目标相互作用避免非特异性作用机制，使得能抑制一族类似蛋白结构或活性的特定异型(isoform)。设计特异性抑制剂不需要完全理解目标机制或大分子相互作用。

由3.3-kb mRNA(SEQ ID NO 1)编码人ICAM-1，最终合成55,219道尔顿的蛋白。ICAM-1通过N连接的糖基化位点高度糖基化。成熟蛋白具有如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量90kDa(Staunton et al.，Cell，52：925-933，1988)。ICAM-1是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。在氨基端它包含五个免疫球蛋白样结构域，随后为跨膜结构域和胞质结构域。在第一个免疫球蛋白样结构域中发现对LFA-1和鼻病毒的主要结合位点。然而结合位点似乎是不同的(Staunton et al.，Cell，61：243-354，1990)。

ICAM-1显示了广泛的组织和细胞分布，可能存在于白细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞和其他上皮细胞上。通过用细菌脂多糖和诸如白细胞间介素-1、肿瘤坏死因子、γ-干扰素和淋巴细胞毒素的细胞因子处理可调控ICAM-1在血管内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、星形细胞和一些细胞系中的表达(见，例如Frohman et al.，J.Neuroimmunol.，23：117-124，1989).。

采用体外和体内试验测试了一系列寡核苷酸抑制人ICAM-1(SEQID NO 1)表达的能力(见，例如第5,514,788号美国专利)。选择靶向于人ICAM-1的核苷2114-2133的寡核苷酸ISIS 2302(SEQ ID NO 2)用于进一步的研究。

ISIS 2302是20个碱基的硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸，它被设计用于特异性杂交人ICAM-1mRNA的3’-未翻译区域的序列。研究强烈地暗示了ISIS 2302起作用是通过特异性结合ICAM-1mRNA导致通过酶RNaseH1(RNaseH核酸酶中普遍存在的家族的一种)切割mRNA(Crooke，Biochim.Biophys.Acta.，1489：31-44，1999)。然而，本发明的方法不限于ISIS 2302的作用机制。

相对于未修饰的DNA，硫代磷酸酯通过将每个磷酸二酯键中的非桥接氧分子置换为硫分子修饰寡聚脱氧核苷酸显著地增强了核酸外切酶抗性并延长了药物的半衰期(Geary et al.，Anti-Cancer Drug Design，12：383-94，1997)。硫代磷酸酯寡核苷酸仅具有最小抗原性的、不具有细胞毒性并能很好耐受，它们的药代动力学和药效学特性已被充分表征(见，例如Butler et al.，Lab.Invest.，77：379-88，1997；Mirabelli et al.，Anti-Cancer Drug Des.，6：647-61，1991)。

除了硫代磷酸酯主链修饰，许多其他可能的主链、糖和其他修饰为本领域技术人员所熟知并在本申请所基于的母案申请中有论述。

已证实当皮下或腹膜内全身给药时，靶向ICAM的反义寡核苷酸在炎性肠病的小鼠和大鼠模型中是有效的(分别见例如Bennett美国专利5,514,788实施例20和美国专利6,096,722实施例29)。这些数据是开展针对治疗人克罗恩病、贮袋炎和溃疡性结肠炎的临床试验的基础。在克罗恩试验中，将ISIS 2302(Alicaforsen)全身给药于以安慰剂为对照的研究中的个体。II期研究暗示了静脉内给药ISIS 2302在一些患者组中的功效(Yacshyn et al.，Gut，51：30-36.2002；Yacyshyn et al.，Aliment.Pharmacol.Ther.，16：1761-70.2002)。在两个随后的III期试验中，基于临床缓解和疾病活性指数得分发现静脉内给予ISIS 2302在治疗中等至严重克罗恩病患者中是无效的(Chey et al.，Gastroenterology，128：A-112，abst724.2002)。

ISIS 2302的灌肠剂制剂被用在临床试验中治疗囊贮袋炎(见公开号20040162259的美国专利实施例17，Miner et al.，Alimnet.Pharmacol.Ther，19：281-6.2004)。12名患有慢性持续贮袋炎且贮袋炎疾病活性指数(PDAI)至少为7的患者参与了这项研究。PDAI是基于一系列因素的临床得分，这些因素包括排便次数、直肠出血、粪便紧急、腹部痉挛、发烧高于100、内窥镜检查和组织学得分。传统上将活性贮袋炎定义为PDAI得分至少为7。患者接受6周疗程，每夜给予含有240mgISIS 2302的羟丙基甲基纤维素灌肠剂。在初始时和第3、6和10周进行评价。在第6周达到主要终点(primary endpoint)降低(p＝0.001)，早在第3周时就观察到内窥镜检查和症状得分显著减少，在第6周持续，在第10周时所观察到每个内窥镜检查组件都有所改善。从初始时到第6周临床症状得分也降低。在研究中灌肠剂良好耐受且没有严重的不良现象。没有进行超过10周的长期随访。

直肠递送ISIS 2302的小的随机的、可控的、双盲逐步增加剂量研究用于治疗轻微至中等的溃疡性结肠炎(SJH van Deventer et al.，Gut，53：1646-51)。用四个日剂量ISIS 2302(6、30、120和240mg)中的一个治疗患者持续28天，1、3和6个月后就疾病活性指数(DAI)的改善监测治疗的安全性和效力。DAI是基于排便次数、直肠出血、内窥镜检查外观和研究者总体评估的临床得分。在6个月的研究期间，在240mg/天一组的患者中或与安慰剂组中50％患者相比，没有人越过基线而需要另外的外科或内科干预。结果显示了有希望的急性和长期效果然而，该结果仍需要大量的结论性临床试验来确认。

尽管有许多可能的IBD治疗性干预，由于有限的疗效、不希望的副作用或两者使得它们中没有一个是完全令人满意的。很明显，仍存在未满足的对有效治疗IBD的需要，由于该疾病的慢性特点，优选治疗可产生持续作用。

发明概述

本发明公开了持续改善或治疗溃疡性结肠炎的方法，包括对个体经直肠给予治疗剂量的组合物并监测所述个体疾病的改善，所述组合物包含8至80核苷酸碱基(nucleobase)长度的反义寡核苷酸化合物，优选配制在羟丙基甲基纤维素中，其中所述寡核苷酸包括与SEQ ID 1中核苷酸2114至2133特异杂交的至少8核苷酸碱基部分。还公开了促进黏膜粘膜康复和持续反应的方法，其包括给予所述组合物。还公开了产生改变疾病修饰结果的方法，其包括给予所述组合物。这些方法在对组合物活性成分的最小全身暴露和没有显著副作用的情况下实现了它们的治疗目的。在优选的实施方案中，将该方法用于具有中等至严重溃疡性结肠炎的个体。

本发明公开了持续改善或治疗溃疡性结肠炎的方法，包括经直肠给予个体治疗剂量的组合物并监测所述个体疾病的改善，所述组合物包含在羟丙基甲基纤维素中具有序列(SEQ ID 2)：

5’-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3’

的反义寡核苷酸化合物，其中所述寡核苷酸抑制ICAM-1蛋白的表达。还公开了促进粘膜康复和持续反应的方法，其包括给予所述组合物。还公开了产生疾病修饰结果(disease modifying results)的方法，其包括给予所述组合物。这些方法在对组合物活性成分的最小全身暴露和没有显著副作用的情况下实现了它们的治疗目的。在优选的实施方案中，将该方法用于治疗具有中等至严重溃疡性结肠炎的个体。

本发明公开了包含8至80核苷酸碱基长度的反义寡核苷酸化合物的组合物在制备药物中的用途，所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1中核苷酸2114至2133特异杂交的至少8核苷酸碱基部分，所述药物用于对个体给药以促使患有溃疡性结肠炎的个体粘膜康复和持续反应。所述药物的另一个用途为产生疾病修饰结果。可在对组合物活性成分的最小全身暴露和没有显著副作用的情况下实现这些用途。还公开了所述寡核苷酸可具有序列SEQ ID NO：2，以及可用羟丙基甲基纤维素制备直肠给药的药物。在优选的实施方案中，所述组合物用于制备治疗患有中等至严重溃疡性结肠炎的个体的药物。

发明的详细说明和优选的实施方案

反义寡核苷酸有很大希望成为治疗许多人类疾病的治疗剂。按Watson-Crick碱基配对所确定，寡核苷酸特异地结合前mRNA或成熟mRNA互补序列，抑制了基因信息从DNA向蛋白质的流动。使反义寡核苷酸特异于它们的靶序列的特性也使得它们有很多用途。由于反义寡核苷酸是四个单体单位的长链，可容易地合成针对任意靶RNA序列的反义寡核苷酸。

诸如本发明中那些药物组合物(例如寡核苷酸)的递送方法是公知的。在本发明中，以在羟丙基甲基纤维素中包含寡核苷酸的灌肠制剂通过直肠给药递送寡核苷酸。在随后的实施例以及母案专利申请(在此引入作为参考)中提供了关于给药方法的详述。

递送药物组合物的制剂对本领域技术人员是熟知的。选择特定的制剂是基于本领域技术人员熟知的因素，这些因素包括但不限于给药途径、待给药化合物的溶解性和待给药化合物的量。在实施例以及第6,096,722和6,747,014号美国专利(在此引入作为参考)中提供了详细的制剂。

以下在实施例中讨论的研究证实了ISIS 2302在改善和治疗溃疡性结肠炎中的功效和安全性。ISIS 2302产生持续反应，它比美沙拉嗪的标准治疗更持久。这种反应的持久性在一些疾病中是关键的，例如溃疡性结肠炎，其对患有该病的个体生活质量具有深远的影响。通过减少发作的频率来改善患者的生活质量。而且，已证实ISIS 2302具有疾病修饰活性(disease modifying activity)，这在治疗溃疡性结肠炎的任何先前的疗法中都没有观察到。

本发明公开的试验中测试的寡核苷酸具有完全硫代磷酸酯修饰的主链。其他可能的主链、修饰的糖或其他形式的同样的核苷酸序列可用在本发明中。

定义

本发明上下文中术语“寡核苷酸”指核糖核酸或脱氧核糖核酸的低聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键构成的低聚物以及功能类似的具有非天然存在部分的低聚物。由于诸如增强的细胞吸收、存在核酸酶时增加的稳定性和增加的杂交亲和力的特性，相对于天然形式，这种修饰的或置换的寡核苷酸常是优选的。关于寡核苷酸主链和糖的可能的修饰(包括混和的或嵌合的低聚物)的详述在专利和非专利出版物中有详尽的论述并且对本领域技术人员是熟知的。使用诸如肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)和锁核酸(lockednucleic acid，LNA)的模拟低聚物以增加寡核苷酸对其目标的亲和力和提供与靶序列错配的耐受性为本领域技术人员所公知。还提供了合成未修饰的和修饰的寡核苷酸的方法。在本发明优选的方法中，寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，其中硫代磷酸酯键是最优选的。

本发明的寡核苷酸优选包含约8至约80核酸碱基单位。这类寡核苷酸更优选包括约12至50核酸碱基单位，还更优选具有约15至30核酸碱基单位，最优选具有约18至22核酸碱基单位。应理解的是，核酸碱基单位是通过磷酸二酯键或其他键适合地连接到临近的核酸碱基单位的碱基-糖组合。本领域技术人员知道约8至约80个核酸碱基单位包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核酸碱基单位。

本发明的寡核苷酸化合物优选包括与SEQ ID NO 1中核苷酸2114至2133特异杂交的至少8核苷酸碱基部分，更优选至少12核苷酸碱基部分，还更优选至少15核苷酸碱基部分，还更优选18核苷酸碱基部分，最优选20个核苷酸碱基部分。

“炎性肠病”(IBD)，在本发明上下文中指在肠道内引起刺激和溃疡的疾病，IBD最常见的形式为克罗恩病和溃疡性结肠炎。其他炎性肠病包括但不限于贮袋炎、过敏性肠综合征、节段性肠炎和节段性回肠炎。

“信使RNA”由本领域技术人员理解为DNA(从其转录而得到该信使RNA)的开放阅读框(ORF)，它不仅包括来自DNA的ORF的信息，还包括技术人员公知的形成5’-未翻译区域和3’-未翻译区域的相关核糖核苷酸以及间插序列(intervening sequence)核糖核苷酸。因此，可以根据本发明制备寡核苷酸，使其全部或部分靶向这些相关核糖核苷酸以及靶向信息核糖核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸与3’-未翻译区域的序列特异杂交，特别是与SEQ ID NO 1中核苷酸2114至2133杂交。

在本发明上下文中“杂交”指氢键键合，其可以是通常在相对的核酸链或核酸链的两个区域的互补碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen或反向的Hoogsteen氢键键合。鸟嘌呤和胞嘧啶是之间形成三个氢键的互补碱基的实例。腺嘌呤和胸腺嘧啶是之间形成两个氢键的互补碱基的实例。

“可特异性杂交的”和“互补的”是用于表明互补性的充足程度的术语，以致于在DNA或RNA靶与寡核苷酸之间发生稳定的和特异的结合。当寡核苷酸对靶的结合干扰了靶分子的正常功能而引起活性丧失，且互补性的充足程度避免了在特异性结合所需条件下(例如，在体内分析或治疗剂治疗情况下的生理条件，或在体外分析情况下进行该分析的条件)该寡核苷酸非特异地结合到非靶核酸序列上时，该寡核苷酸是特异性杂交。

“药物组合物”为包括药理学活性药剂，任选地还包括递送药剂的载体的组合物，其中该组合物适合对动物、优选人类给药。载体可以是惰性的，如生理盐水或在口服给药组合物情况下使组合物更可口的试剂。作为选择，载体可以是增加或改变药理学活性药剂生物利用度的活性剂。这些活性载体包括渗透增强剂或在胃部保护药理学活性以使得药理学活性药剂能被吸收到肠内的化合物。这些活性载体对本领域技术人员是公知的。

“治疗剂量”是提供改善或治疗待用所述组合物治疗的疾病所需的组合物的量。监测疾病的方法对本领域技术人员是公知的。关于治疗剂量和检测疾病特别是IBD的严重程度的方法，在实施例中提供了指导。

“持续的”指终止给予本发明公开的组合物后，较长期状态的溃疡性结肠炎临床表现的充分减少和/或维持的粘膜康复水平，与标准治疗或安慰剂相比不需要采用其他药理学或外科手术干预的额外治疗。“持续的”定义为给予最后一剂本发明公开的组合物后疾病征候(indication)减少或维持粘膜康复水平至少约60天，优选至少约90天，还更优选至少约120天，最优选至少约180天。临床表现持续减少表明对干预的更持久的反应。

用于本文时，具有“疾病修饰活性”的药物指具有减缓按标准的疾病检测方法(例如DAI)所确定的疾病进展速率和/或清除药物后具有长期作用的能力的组合物。

“溃疡性结肠炎征候”指与存在溃疡性结肠炎疾病相关的症状或状况。征候可以是客观的(例如排便次数、直肠出血、粘膜脆性)、主观的(例如内科医生的评估)或众多观察的组合(例如DAI或临床活性指数)。

溃疡性结肠炎的“疾病活性指数(DAI)”由Schroeder等人(1987.N.Engl.J.Med.317：1625-9)所定义，它是基于排便次数、直肠出血、内窥镜检查外观和研究者总体评价的总体得分，其中研究者总体评价纳入患者症状、乙状结肠镜检查和体格检查的结果、试验室研究和患者整体状态。指数的四种状况各自鉴定为等级0-3，0为最轻程度，3为最重程度。

用在本文时，“治疗期”指相对频繁地(至少每周一次)给予所述组合物的时间。治疗期优选至少每周两次，更优选每隔一天，最优选每天，持续至少约两周，优选至少约三周，更优选至少约四周。

用在本文时，“最小全身暴露”指可达到全身的剂量少于约5％，优选少于约4％，更优选少于约3％，还更优选少于约2％，最优选少于约1％的给药剂量。

实施例1

空肠内和直肠给予制剂后分析ISIS 2302的生物利用度。空肠内滴注几种制剂后评估ISIS 2302的绝对生物利用度。根据下式从所得的数据计算生物利用度百分比：

％生物利用度＝(AUC_po/D_o)/(AUC_iv/D_o)×100％

其中AUC_po为配制的寡核苷酸片剂口服给药时的血浆浓度曲线下面积，AUC_iv为寡核苷酸以i.v.溶液(对照)给药时的血浆浓度曲线下面积，以及D_o为这两种方案的各自剂量。

研究了两种不同方式给予寡核苷酸，以确定药物制剂的生物利用度。在如下制备油包水型乳剂中配制寡核苷酸。首先，制备两相。通过将2ml的ISIS 2302溶液(100mg/ml)和2ml的水混和制备水相。通过稍稍加热1g Grill 3(山梨糖醇酐单硬脂酸酯)(Croda，US)、3mlCaptex 355(Abitec Corp.，Janesville，Wis.)和3ml Labrasol(Gattefosse，France)到约70℃制备油相。在剧烈搅拌情况下将水溶液缓慢倒入油相中。

对于空肠内滴注，采用重量为250-300g的Sprague-Dawley大鼠。大鼠通宵禁食后，通过腹膜内注射5％戊巴比妥(50mg/kg)将其麻醉。腹部中线切口后，将小肠拉出，定位注射位点(Treitz韧带后2cm)。随后通过27号针头注射等份的1.0mL药物制剂。随后外科手术缝合肌肉，注射后夹紧皮毛。

对于直肠给药，在通宵禁食后首先给予试验大鼠清洁灌肠剂，随后给予试验制剂的样品，通过导管应用灌肠制剂，并保持1小时。

为了评估寡核苷酸的生物利用度，对样品进行处理，通过毛细管凝胶电泳(CGE)和HPLC分析来评估存在的寡核苷酸的量。

在五只Sprague-Dawley大鼠中空肠内滴注之后和在七只大鼠中直肠给药之后测定ISIS 2302的绝对生物利用度。对空肠内给药的ISIS2302，绝对生物利用度为20.3％(n＝5)。对直肠给药的ISIS 2302，绝对生物利用度为24.5％(n＝7)。

实施例2

制备灌肠制剂用于分析寡核苷酸的组织吸收。为了评价在直肠给药之后寡核苷酸的递送和穿透粘膜进入结肠，制备以下制剂(表1)。制备ISIS 2302的溶液和乳液制剂。用在制剂中的添加剂包括盐水、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、角叉藻聚糖、维生素E a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)、Tween 80和山梨醇。

制剂1a：无菌盐水中以期望的浓度制备ISIS 2302溶液，用于体内评估。

制剂1b：制备ISIS 2302和羟丙基甲基纤维素(HPMC)的溶液，使得ISIS 2302的终浓度与制剂2a中的相同，并且HPMC的浓度为1.5％。

制剂1c：制备ISIS 2302的溶液，如同制剂2a，包含1.0％角叉藻聚糖、2.5％维生素E TPGS。

制剂1d：根据上述实施例的一般方法制备ISIS 2302的油包水型乳剂。

制剂1e：通过以适当量混和ISIS 2302、Tween 80和HPMC使得提供的混合物具有期望的ISIS 2302浓度、0.5％Tween 80和0.75％HPMC来制备这种制剂。

制剂1f：通过以适当量混和ISIS 2302、山梨醇和HPMC使得提供的混合物具有期望的ISIS 2302浓度、5％Tween 80和0.75％HPMC来来制备这种制剂。

表1

用于局部/灌肠给药的ISIS 2302制剂

制剂	组成
		1a	盐水中的ISIS 2302
1b	ISIS 2302+1.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)
		1c	ISIS 2302+1.0％角叉藻聚糖+2.5％维生素E a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)
1d	油包水型乳剂中的ISIS 2302
		1e	ISIS 2302+0.5％Tween 80+0.75％HPMC
1f	ISIS 2302+5％山梨醇+0.75％HPMC

通过以灌肠剂对实验室毕尔格狗(beagle dog)直肠给药评估寡核苷酸制剂。通宵禁食之后，首先给予试验狗清洁灌肠剂，随后给予试验制剂的样品。通过Foley导管应用灌肠制剂，保持1小时。为了评估结肠组织递送和吸收寡核苷酸，在给药后3h和24h在试验动物中进行结肠组织活检。处理组织样品，通过毛细管凝胶电泳(CGE)和免疫组织化学(IHC)分析评估存在于组织中的寡核苷酸的量。

将前述实施例制备的六种ISIS 2302制剂(制剂2a-2f)通过直肠灌肠剂给予狗，在给药后3h和24h通过CGE和IHC测定ISIS 2302在结肠组织中局部分布。结果显示在表2中。值得注意的是，羟丙基甲基纤维素(1b)导致了比依据上述实施例1中的方法制备的油包水型乳剂(1d)更高的组织吸收。

表2

对狗给予直肠灌肠剂后ISIS 3202的局部结肠组织分布

制剂	免疫组织化学		CGE(mg/g)±SD
						3h	24h	3h	24h
1a	++++	-	782.2±664.2	NA
					1b	++++	-	660.4±439.6	6.8±5.0
1c	++++	-	557.8±212.2	2.5±1.4
					1d	++++	-	224.1±78.3	1.2±0.7
1e	++++	-	620.7±368.1	6.0±5.9
					1f	++++	-

“++++”表示采用针对ISIS 3202的初级抗体有强免疫组织化学染色；

“-”表示相对于背景水平没有显著的染色。

实施例3

在I期临床试验中分析人静脉内给予ISIS 2302的毒性和药代动力 学。在对目标疾病状态开始试验性治疗试验之前，ISIS 2302的第一临床试验评估了健康个体静脉内给予抗ICAM-1反义寡核苷酸的安全性和药代动力学。这是双盲的、安慰剂对照的、随机的(3∶1，药物∶安慰剂)研究。在七个单剂量(0.06、0.12、0.24、0.5、1.0、1.5和2.0mg/kg)组和多剂量组(0.2、0.5、1.0和2.0mg/kg，每隔一天给予，四剂)的每组中有四位健康男性志愿者参加。以剂量增加的方式研究各组，在起初的五个单剂量组完成试验后开始多剂量。通过在两小时静脉输注80ml体积给予ISIS 2302(或无菌生理盐水作为安慰剂)。受试者保持斜躺状态，在开始各个输注后持续ECG检测四小时。在各个输注之前以及输注之后间隔地测量仰卧血压和脉搏、包括aPTT、凝血酶时间、凝血酶原时间、血清补体裂解产物C3a和C5a的凝固筛选(clotting screen)、嗜中性粒细胞计数、尿微量蛋白(microprotein)和标准实验室安全筛选(血液学、血液生物化学和尿分析)。最后输注后14和21天从多剂量组中收集血清样品以分析针对ISIS 2302的抗体的存在。开始输注之前和之后直到24小时测定血液样品中ISIS 2302的血浆浓度。

通过商业上可购得的C3a和C5a测定试剂盒(Amersham)测定补体裂解产物。通过采用之前描述的ELISA方法(Lacy and Voss，J Immunol.Methods，116：87-98，1989)的改良方法检测血浆中抗ISIS 2302抗体的存在。将产生识别ISIS 2302的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的培养基作为阳性对照。由于ISIS 2302似乎在小鼠中没有免疫原性，通过偶联到钥孔血兰素的ISIS 2302免疫小鼠来产生所述细胞系。

通过如Leeds等人(Anal.Biochem.，235：36-43，1996)所述的毛细管凝胶电泳(CGE)进行药物分析。由27个胸腺嘧啶核苷(T27)组成的硫代磷酸酯标准核苷酸作为内标物加入血浆和尿中。采用这种方法在血浆中可检测到的寡核苷酸浓度的线形范围为10nM至20μM(约0.07至140μg/ml)。

在两小时单一输注ISIS 2302过程中，与合成的n-1、n-2和n-3链缩短形式的完整药物共迁移的代谢物很快出现在血浆中，构成输注30分钟后总核苷酸的20％。有趣的是，由全长药物、n-1、n-2和n-3形式构成的总寡核苷酸的相对比例在两小时输注过程中以及在输注后至少另外可测量代谢物的四小时保持相对稳定。因此完整药物构成了可检测到药物或代谢物的全部时间的主要寡核苷酸。

分析来自1.0和2.0mg/kg多剂量组的尿样品中完整药物和代谢物的浓度。尽管有极低浓度的药物或代谢物(在起初6小时分泌了少于给药总量的0.5％)被分泌到尿中，但可以检测到完整药物和n-1、n-2和n-3形式，可从电泳图谱中估计较短形式的量。在开始输注后6小时分泌的完整药物的量平均约为给药总量的0.05％，估计在这个时间段内母体药物和代谢物的总的分泌少于总剂量的0.5％。

实施例4

在I期临床试验中分析人皮下给予ISIS 2302的毒性和药代动力 学。在正常的志愿者中进行皮下给予ISIS 2302的I期研究。在研究的第一阶段，研究了以双盲的、安慰剂对照的、随机的(3∶1，研究药物∶安慰剂)方式对四个受试者组以浓度范围为50-200mg/ml的单一的1ml皮下注射ISIS 2302给药的耐受性和药代动力学。所有的浓度产生持续几天的轻微的注射部位红斑、水肿和硬块。这是临床观察而不是患者的陈诉，似乎足以耐受所有的剂量。初步分析表明血浆生物利用度似乎为约50％，1-3小时达到最大浓度。对每隔一天1mg/kg的4剂量或每周一次持续4周的方案勉强可以耐受，具有非常低级的补体活化(只有C3a，没有C5a)和低级的淋巴结病以及上述的轻微的注射部位反应的迹象。不能很好地耐受2mg/kg的推注方案。

实施例5

在公开标签研究中，分析ISIS 2302灌肠剂在治疗轻微至中等溃疡 性结肠炎中的相对吸收和药理学活性。(CS-28)在公开标签研究中评估了ISIS 2302灌肠剂的相对吸收(局部和全身药代动力学)和药理学活性。

研究了具有粘膜脆性(mucosal friability)的轻微至中等活性的左侧溃疡性结肠炎(DIA 3-10)的一群15患者。

每晚给予患者240mg的ISIS 2302，持续6周。在治疗初始和结束取得内窥镜检查粘膜活检样品。在最初和最后的灌肠剂量之后的所有患者中进行密集的24小时血浆药代动力学(PK)取样，用于定量药物分析。治疗结束时，从降结肠收集结肠活检样品进行局部定量PK评估。采用敏感和选择性杂交ELISA生物分析方法测定结肠组织活检和血浆样品的药物浓度。

分析了最初12个患者的PK和临床数据。最大血浆浓度(C_max)从2.2ng/mL至38ng/mL，达到最大血浆浓度的平均时间为第一次灌肠剂之后1.8hr。平均AUC为0.124μg*hr/mL，表明了小于1％的给药剂量是可到达全身的。与研究结束的稳态剂量相比，单一剂量之后的血浆PK没有差别。相反，母体寡核苷酸的结肠粘膜组织浓度平均为4300ng/g湿组织。局部组织暴露比血浆中观察到的最大药物浓度高100倍。在具有肠炎、脆性和潜在自发性出血的群体中这种低的全身暴露是令人意外的。将药物限定到待治疗的特定部位可增加化合物的安全性和效力。

12个患者中有9人从初始时到第6周疾病活性指数(DAI)显著改善。进行研究的所有患者在初始时具有中等至严重的粘膜疾病(初始时，改良的Mayo得分-DAI的内窥镜外观组分为2或更多)。在研究完成时，12个患者中有7人显示粘膜康复和脆性消退(改良的Mayo得分为0或1)。这远好于预期。不能证实粘膜药物浓度和临床反应之间的相关性，但临床反应与盲法试验的效力类似。

在患有活性结肠炎的患者中ISIS 2302灌肠剂的稳定状态和单一剂量全身可得性(systemic availability)最小。可实现alicaforsen的有效组织浓度。在这一小群患者中不能建立alicaforsen的粘膜组织浓度和临床反应之间的关系。

实施例6

分析ISIS 2302灌肠剂在治疗轻微至中等溃疡性结肠炎中的安全 性和效力。在安慰剂对照的双盲2期研究中评估了ISIS 2302的四种不同剂量方案治疗溃疡性结肠炎的安全性和效力。

鉴定了具有轻微至中等活性末梢溃疡性结肠炎(DIA 4-10)的在最初就诊前以稳定的本底剂量口服美沙拉嗪30天，和/或在最初就诊前以稳定的本底6-巯基嘌呤60天，最初就诊90天内没有TNF-α抑制剂、氨甲喋呤、环孢霉素或沙利度胺的一群112患者。患者初始特征如下：平均年龄47.1岁，性别M/F：67/45，平均的疾病持续时间7.5年，平均初始DAI 6.9。在试验组之间初始特征是类似的。患者被随机等分到五个试验组中。

1.每晚240mg ISIS 2302，持续6周。

2.10个连续的晚上240mg ISIS 2302，随后每隔一晚240mg ISIS2302，持续32个晚上。

3.每隔一晚240mg of ISIS 2302持续6周。

4.10个连续的晚上120mg of ISIS 2302，随后每隔一晚120mg ofISIS 2302，持续32个晚上。

5.每晚安慰剂灌肠剂，持续6周。

所有患者每晚接受安慰剂灌肠剂或ISIS 2302灌肠剂持续6周。当隔天给予ISIS 2302时，第2和4组中的患者每隔一晚接受安慰剂灌肠剂。

主要反应终点为在第6周时DAI减少，次要反应(secondaryresponse)为急性反应、好转/粘膜康复、缓解和复发。

对患者安全性和效力跟踪30周，除非复发，进行新的内科或外科干预或停止药物治疗研究，在这种情况下，从最后的药物治疗起检测患者的安全性30天。

在第18和30周时，每晚给予ISIS 2302(Alicaforsen)显示了比安慰剂显著更好的反应率(p＝0.04和p＝0.03)。3个较低剂量Alicaforsen的组没有显示比安慰剂有统计学上的改进。当对仅包括中等疾病组(DAI 8-10)或具有“纯粹的”左侧疾病(15-40cm)的个体的亚组进行分析时，统计上的差别更加显著，甚至在其他时间点更显著(参见实施例8)。

还分析了DAI的各个因素。作为对ISIS 2302治疗的反应，观察到排便次数和直肠出血的持续减少。

对治疗的反应的持续性是重要的。治疗6周后最初疾病缓解的个体中，在ISIS 2302 240mg组的13个受试者中10个在第30周(试验结束)时保持了疾病缓解，与安慰剂组9个中的4个形成对比(p＝0.12)。因此，ISIS 2302 240mg组反应的中值持续时间被显著延长(治疗组≥6个月而安慰剂组＜3个月)。

每晚给予ISIS 2302 240mg持续6周显示了统计上显著的反应活性和持续时间、疾病修饰活性，并且普遍被很好地耐受。

实施例7

分析ISIS 2302灌肠剂在治疗轻微至中等溃疡性结肠炎中的安全 性和效力。在多中心、随机的、双盲的、安慰剂对照的、剂量范围2期研究中评估了以羟丙基甲基纤维素制剂形式的ISIS 2302在治疗具有轻微至中等活性溃疡性结肠炎、左侧结肠炎或具有左侧疾病发作的全结肠炎中的安全性和效力。

鉴定了具有活性远端溃疡性结肠炎或具有左侧疾病发作的全结肠炎并且DAI得分4-10，在最初就诊前以稳定的本底剂量口服美沙拉嗪30天，和/或在最初就诊前以稳定的本底6-巯基嘌呤60天，最初就诊90天内没有TNF-α抑制剂、氨甲喋呤、环孢霉素或沙利度胺的一群191患者。患者初始特征如下：平均年龄45.3岁，性别M/F：86/73，平均的疾病持续时间9.3年，平均初始DAI 7.3。在试验组之间的初始特征是相似的。患者被随机等分到用120mg ISIS 2302、240mg ISIS2302或4.0g美沙拉嗪(常用于治疗轻微至中等溃疡性结肠炎)灌肠剂制剂治疗的三个组中。每晚给予制剂，持续6周。

选择这样的ISIS 2302剂量是因为在初始2期剂量范围研究中它们显示了统计学上显著的效力。根据动物试验预测获得在动物药理学模型中对炎性肠病有效的局部组织浓度的剂量。主要反应终点为在第6周时DAI减少，次要反应为急性反应、好转/粘膜康复、缓解和复发。

对患者的安全性和效力跟踪30周，除非复发，进行新的内科或外科干预或停止药物治疗研究，在这种情况下，从最后的药物治疗起监测患者安全性30天。对30周之前不需要另外的或备选的内科或外科干预的那些患者跟踪其安全性和效力24周。采集血液样品进行血浆药物浓度测量，在每个治疗组的10患者亚群中，在第一次灌肠剂给药后的以特定间隔在24小时内取样以及在第3和6周取样。

在整个研究中ISIS 2302 240mg和美沙拉嗪之间的临床反应率是类似的，两者都优于ISIS 2302 120mg灌肠剂。如表3所示，对ISIS 2302和美沙拉嗪的急性反应是相似的；然而，当通过DAI百分比减少、医生评估、临床症状缓解和粘膜康复的维持进行测定时，对ISIS 2302的反应明显上更加持久和有持续性。

表3

比较对ISIS 2302和美沙拉嗪治疗的反应

从初始起DAI的平均％Δ	Wk6	Wk12	Wk18	Wk30	Wk54
						美沙拉嗪(4g)	-49.6	-40.0	-39.3	-33.1	-75.0
ISIS 2302(240mg)	-47.1	-56.3	-61.5	-46.9	-85.7

给药6周后有初始反应的个体中，对ISIS 2302 240mg的反应中值持续时间接近6个月，然而美沙拉嗪灌肠剂＜3个月(p＝0.20)。第18周在ISIS 2302 240mg组的临床症状缓解率为20％，而在美沙拉嗪治疗组为5.6％(p＝0.03)。这种趋势在整个研究的所有其他时间点都是明显的。在任何研究组中都没有治疗相关的严重不良事件。在研究组间SAE和AE是类似的。

在急性左侧UC中，ISIS 2302 240mg灌肠剂显示了与美沙拉嗪灌肠剂类似的活性。然而，用ISIS 2302 240mg治疗的个体比用美沙拉嗪治疗的趋向于更高的缓解率和更长的缓解持续时间。ISIS 2302普遍地被很好地耐受。

实施例8

分析ISIS 2302灌肠剂在治疗中等至严重溃疡性结肠炎中的安全 性和效力。对具有中等至严重疾病的亚群(n＝26)进行了分析。中等至严重疾病定义为采用DAI标准具有下述得分的患者：基线排便次数≥2、直肠出血≥2、内窥镜检查≥2和研究者的评估≥1。与一些治疗组中的基线水平和安慰剂相比，这亚群显示了明显的DAI降低。每晚接受ISIS 2302的个体经过18周的研究具有显著的(p≤0.05)DAI降低，在研究的剩余时间具有强的(p≤0.09)DAI降低倾向。类似地，每隔一晚接受ISIS 2302的个体经过6周显示了显著的(p≤0.05)DAI降低，在第18周和30周显示强的(p≤0.11)DAI降低倾向。该亚组的分析证实了ISIS 2302在治疗中等至严重溃疡性结肠炎中的效力。该分析还证实了ISIS 2302在患有更严重疾病的个体中通过促进持续的临床缓解的疾病修饰活性。

序列表

<110>马克·K·韦德尔

<120>细胞粘附的寡核苷酸调节

<130>BIOL0051WO

<150>60/632,826

<151>2004-12-02

<150>60/716,355

<151>2005-09-12

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>3025

<212>DNA

<213>H.sapien

<220>

<400>1

gctataaagg atcacgcgcc ccagtcgacg ctgagctcct ctgctactca gagttgcaac 60

ctcagcctcg ctatggctcc cagcagcccc cggcccgcgc tgcccgcact cctggtcctg 120

ctcggggctc tgttcccagg acctggcaat gcccagacat ctgtgtcccc ctcaaaagtc 180

atcctgcccc ggggaggctc cgtgctggtg acatgcagca cctcctgtga ccagcccaag 240

ttgttgggca tagagacccc gttgcctaaa aaggagttgc tcctgcctgg gaacaaccgg 300

aaggtgtatg aactgagcaa tgtgcaagaa gatagccaac caatgtgcta ttcaaactgc 360

cctgatgggc agtcaacagc taaaaccttc ctcaccgtgt actggactcc agaacgggtg 420

gaactggcac ccctcccctc ttggcagcca gtgggcaaga accttaccct acgctgccag 480

gtggagggtg gggcaccccg ggccaacctc accgtggtgc tgctccgtgg ggagaaggag 540

ctgaaacggg agccagctgt gggggagccc gctgaggtca cgaccacggt gctggtgagg 600

agagatcacc atggagccaa tttctcgtgc cgcactgaac tggacctgcg gccccaaggg 660

ctggagctgt ttgagaacac ctcggccccc taccagctcc agacctttgt cctgccagcg 720

actcccccac aacttgtcag cccccgggtc ctagaggtgg acacgcaggg gaccgtggtc 780

tgttccctgg acgggctgtt cccagtctcg gaggcccagg tccacctggc actgggggac 840

cagaggttga accccacagt cacctatggc aacgactcct tctcggccaa ggcctcagtc 900

agtgtgaccg cagaggacga gggcacccag cggctgacgt gtgcagtaat actggggaac 960

cagagccagg agacactgca gacagtgacc atctacagct ttccggcgcc caacgtgatt 1020

ctgacgaagc cagaggtctc agaagggacc gaggtgacag tgaagtgtga ggcccaccct 1080

agagccaagg tgacgctgaa tggggttcca gcccagccac tgggcccgag ggcccagctc 1140

ctgctgaagg ccaccccaga ggacaacggg cgcagcttct cctgctctgc aaccctggag 1200

gtggccggcc agcttataca caagaaccag acccgggagc ttcgtgtcct gtatggcccc 1260

cgactggacg agagggattg tccgggaaac tggacgtggc cagaaaattc ccagcagact 1320

ccaatgtgcc aggcttgggg gaacccattg cccgagctca agtgtctaaa ggatggcact 1380

ttcccactgc ccatcgggga atcagtgact gtcactcgag atcttgaggg cacctacctc 1440

tgtcgggcca ggagcactca aggggaggtc acccgcaagg tgaccgtgaa tgtgctctcc 1500

ccccggtatg agattgtcat catcactgtg gtagcagccg cagtcataat gggcactgca 1560

ggcctcagca cgtacctcta taaccgccag cggaagatca agaaatacag actacaacag 1620

gcccaaaaag ggacccccat gaaaccgaac acacaagcca cgcctccctg aacctatccc 1680

gggacagggc ctcttcctcg gccttcccat attggtggca gtggtgccac actgaacaga 1740

gtggaagaca tatgccatgc agctacacct accggccctg ggacgccgga ggacagggca 1800

ttgtcctcag tcagatacaa cagcatttgg ggccatggta cctgcacacc taaaacacta 1860

ggccacgcat ctgatctgta gtcacatgac taagccaaga ggaaggagca agactcaaga 1920

catgattgat ggatgttaaa gtctagcctg atgagagggg aagtggtggg ggagacatag 1980

ccccaccatg aggacataca actgggaaat actgaaactt gctgcctatt gggtatgctg 2040

aggccccaca gacttacaga agaagtggcc ctccatagac atgtgtagca tcaaaacaca 2100

aaggcccaca cttcctgacg gatgccagct tgggcactgc tgtctactga ccccaaccct 2160

tgatgatatg tatttattca tttgttattt taccagctat ttattgagtg tcttttatgt 2220

aggctaaatg aacataggtc tctggcctca cggagctccc agtcctaatc acattcaagg 2280

tcaccaggta cagttgtaca ggttgtacac tgcaggagag tgcctggcaa aaagatcaaa 2340

tggggctggg acttctcatt ggccaacctg cctttcccca gaaggagtga tttttctatc 2400

ggcacaaaag cactatatgg actggtaatg gttacaggtt cagagattac ccagtgaggc 2460

cttattcctc ccttcccccc aaaactgaca cctttgttag ccacctcccc acccacatac 2520

atttctgcca gtgttcacaa tgacactcag cggtcatgtc tggacatgag tgcccaggga 2580

atatgcccaa gctatgcctt gtcctcttgt cctgtttgca tttcactggg agcttgcact 2640

atgcagctcc agtttcctgc agtgatcagg gtcctgcaag cagtggggaa gggggccaag 2700

gtattggagg actccctccc agctttggaa gcctcatccg cgtgtgtgtg tgtgtgtatg 2760

tgtagacaag ctctcgctct gtcacccagg ctggagtgca gtggtgcaat catggttcac 2820

tgcagtcttg accttttgag ctcaagtgat cctcccacct cagcctcctg agtagctggg 2880

accataggct cacaacacca cacctggcaa atttgatttt tttttttttt ccagagacgg 2940

ggtcttgcaa cattgcccag acttcctttg tgttagttaa taaagctttc tcaactgcca 3000

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                       3025

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反义化合物

<400>2

gcccaagctg gcatccgtca                                             20

Claims (37)

1.包含寡核苷酸和羟丙基甲基纤维素的组合物在制备直肠给药的药物中的用途，所述寡核苷酸具有包含SEQ ID NO 2的序列，其中所述组合物导致对所述寡核苷酸的最小全身暴露。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述最小全身暴露包括全身可得性小于直肠给药剂量的约5％。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述药物导致溃疡性结肠炎的至少一种征候的改善。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述药物导致粘膜脆性、排便次数、直肠出血或疾病活性指数中至少一种被改善。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯键。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述药物导致持续的粘膜康复。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述持续的粘膜康复维持至少约90天。

8.如权利要求6所述的用途，其中所述持续的粘膜康复维持至少约120天。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述药物具有疾病修饰活性。

10.如权利要求2所述的用途，其中溃疡性结肠炎为中等至严重的溃疡性结肠炎。

11.持续改善个体中溃疡性结肠炎的至少一种征候的方法，包括：

对个体经直肠给予治疗剂量的包含长度约15至30核酸碱基单位的反义寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸与SEQ ID 1中的核苷酸2114至2133特异杂交，以及

监测所述个体溃疡性结肠炎的至少一种征候的改善。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括粘膜脆性。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括排便次数。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括直肠出血。

15.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括疾病活性指数。

16.如权利要求11所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是被修饰的。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯核苷键。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述反义寡核苷酸仅包括硫代磷酸酯核苷键。

19.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的持续改善包括在对所述个体给予所述组合物的治疗期终止后改善溃疡性结肠炎的至少一种征候至少60天。

20.如权利要求11所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的持续改善包括在对所述个体给予所述组合物的治疗期终止后改善溃疡性结肠炎的至少一种征候至少90天。

21.如权利要求11所述的方法，其中所述直肠给予的组合物为灌肠剂。

22.如权利要求11所述的方法，其中所述治疗剂量包括至少每天约240mg的所述反义寡核苷酸。

23.如权利要求11所述的方法，其中对所述组合物的全身暴露小于所给予剂量的5％。

24.如权利要求11所述的方法，其中所述寡核苷酸长度为约18至22核酸碱基单位。

25.持续改善个体中溃疡性结肠炎的至少一种征候的方法，包括：

经直肠给予治疗剂量的包含含有SEQ ID 2的反义寡核苷酸的组合物，以及

监测所述个体溃疡性结肠炎的至少一种征候的改善。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括粘膜脆性。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括排便次数。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括直肠出血。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的征候包括疾病活性指数。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是被修饰的。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯核苷键。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述反义寡核苷酸仅包括硫代磷酸酯核苷键。

33.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的持续改善包括在对所述个体给予所述组合物的治疗期终止后改善溃疡性结肠炎的至少一种征候至少60天。

34.如权利要求25所述的方法，其中所述溃疡性结肠炎的持续改善包括在对所述个体给予所述组合物的治疗期终止后改善溃疡性结肠炎的至少一种征候至少90天。

35.如权利要求25所述的方法，其中所述直肠给予的组合物为灌肠剂。

36.如权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂量包括至少每天约240mg的所述反义寡核苷酸。

37.如权利要求25所述的方法，其中对所述组合物的全身暴露小于所给予剂量的5％。