CN117795077A - 包含修饰的rt-let7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的组合物 - Google Patents
包含修饰的rt-let7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包含修饰的RT‑LET7或与肝细胞靶向部分(Moiety)结合的修饰的RT‑LET7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，与现有的作为抑制Let‑7i‑5p的翻译微小核糖核酸(microRNA)(AS‑miRNA)的RT‑LET7相比，本发明的修饰的RT‑LET7具有增加Let‑7i‑5p的表达抑制、增加肝癌细胞生长抑制、增加血小板反应蛋白1(TSP1)的表达及增加巨噬细胞的吞噬活性的效果。并且，通过在上述修饰的RT‑LET7结合肝细胞靶向部分提高向肝癌细胞的递送力来显著提高治疗肝癌的效果，从而可以有效用作用于预防或治疗肝癌的药物组合物或用于预防或治疗CD47‑阳性肝癌的免疫抗癌剂。
Description
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗肝癌的药物组合物，具体地，涉及包含作为Let-7i-5p的表达抑制剂的修饰的RT-LET7或搭载递送系统的修饰的RT-LET7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
背景技术
肝癌在全世界范围内是第五位频发的癌症，但却是死亡率排在第三位的攻击性的癌症(Ahn J,Flamm SL Hepatocellular carcinoma Dis Mon 2004；50:556-573)。治疗目的的手术只能在15％至25％左右的患者中进行，大部分肝癌患者因局部的进展或转移的疾病而在相对较短的时间内死亡(Roberts LR,Gores GJ Hepatocellular carcinoma:molecular pathways and new therapeutic targets Semin Liver Dis 2005；25:212-225)。已知肝癌的主要病因为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus)及黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1)等。然而，过去20年间，肝癌患者的整体存活率没有明显增加，肝癌的发展(development)及进程(progression)机制尚处于未完全明了的状态(Bruix J,et al Focus on hepatocellular carcinoma Cancer Cell2004；5:215-219)。迄今，虽然分子靶向治疗(molecular targeted therapy)已表现出成熟且有效的肝癌治疗(Shen YC,Hsu C,Cheng AL Molecular targeted therapy foradvanced hepatocellular carcinoma:current status and future perspectivesJGastroenterol；45:794-807)，但尚不明了的是，这些遗传性的变化是否在每个肝癌患者中引起能够观察到的临床特征。
组蛋白去乙酰化酶(HDACs，Histone deacetylases)通常可以通过辅助抑制因子(corepressors)或多蛋白转录复合体(multi-protein transcriptional complexes)来附着于基因启动子，在那里，不直接与脱氧核糖核酸(DNA)结合，而通过染色质(chromatin)修饰来调节转录(Thiagalingam S,Cheng KH,Lee HJ,Mineva N,Thiagalingam A,Ponte JFHistone deacetylases:unique players in shaping the epigenetic histone codeAnn N Y Acad Sci2003；983:84-100)。编码的人组蛋白去乙酰化酶(HDACs)有18个，它们分类为I类(HDAC 1、2、3及8)、II类(HDAC 4、5、6、7、9及10)、III类(SIRT 1-7)以及IV类(HDAC11)酶(Yang XJ,Seto E The Rpd3/Hda1 family of lysine deacetylases:frombacteria and yeast to mice and men Nat Rev Mol Cell Biol 2008；9:206-218)。抑制乙酰转移酶(acetyltransferases)及组蛋白去乙酰化酶都与细胞增殖、分化及细胞周期调节相关(Witt O,Deubzer HE,Milde T,Oehme I HDAC family:What are the cancerrelevant targets Cancer Lett 2009；277:8-21)。并且，据报告，组蛋白去乙酰化酶的病理活性及调节减少(deregulation)会引起癌症、免疫疾病及肌营养不良症(musculardystrophy)等多种疾病(Yang XJ,Seto E HATs and HDACs:from structure,functionand regulation to novel strategies for therapy and prevention Oncogene 2007；26:5310-5318)。HDAC6为组蛋白去乙酰化酶的IIb类家族的成员，以与微管(MTs)[0004]相关的细胞质去乙酰化酶(cytoplasmic deacetylase)来起作用，使α-微管蛋白(α-tubulin)去乙酰化(Hubbert C,Guardiola A,Shao R,Kawaguchi Y,Ito A,Nixon A,et al HDAC6is a microtubule-associated Mis18α.Nature 2002；417:455-458)。
另一方面，微小核糖核酸(miRNA)为存在于细胞内的具有20-25个核酸(nucleotide)长度的小的核糖核酸(内源性小核糖核酸(endogenous small RNA))的一种，源自不合成蛋白质的脱氧核糖核酸，从发夹结构转录体(hairpin-shaped transcript)中生成。微小核糖核酸通过与靶向信使核糖核酸(mRNA)的3'-UTR的互补序列结合来抑制该信使核糖核酸的翻译或诱导其不稳定化，起到从根本上抑制该靶向信使核糖核酸的蛋白质合成的抑制物(repressor)作用。已知一种微小核糖核酸可以靶向多种信使核糖核酸，信使核糖核酸也可以被多种微小核糖核酸调节。
另一方面，巨噬细胞通过噬菌作用吞噬疾病细胞(癌细胞)，这通过抗体的Fc片段介导与巨噬细胞膜表面的Fc受体的结合来发生。然而，肿瘤可以通过颠覆正常的免疫调节机制来免受包括巨噬细胞在内的免疫细胞的攻击。这样的机制之一就是在正常细胞中表达的一种蛋白质CD47。CD47通过与称为信号调节蛋白α(SIRPα，signal-regulatory proteinα)的巨噬细胞的受体相互作用向巨噬细胞传递“不要吃我(阻止吞噬)”的信号来使正常细胞离开。同样，癌细胞的CD47表达也通过该方式在癌细胞与抗体结合时具有对巨噬细胞的抗性。因此，尽管大量巨噬细胞接近癌细胞，但只要不关闭“阻止吞噬”的信号，就无法对癌细胞起作用。对此的治疗战略之一就是利用对CD47的单克隆抗体来阻断“阻止吞噬”的信号。
因此，本发明确认到可以通过使作为Let-7i-5p的表达抑制剂的RT-LET7修饰来具有比现有的RT-LET7提升的效果以用作用于预防或治疗肝癌的药物组合物，并且，修饰的RT-LET7在肝癌细胞中通过抑制Let-7i-5p来增加血小板反应蛋白1(TSP1)，增加的血小板反应蛋白1与CD47结合来阻止与巨噬细胞的信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用，由此，抑制肝癌细胞的CD47与巨噬细胞的信号调节蛋白α结合来提高巨噬细胞对癌细胞的免疫活性以示出抗癌效果，确认到可以通过这种机制显著增加巨噬细胞的吞噬活性来用作用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种靶向Let-7i-5p的核酸分子。
并且，本发明的再一目的在于，提供一种核酸分子，其特征在于，上述核酸分子与肝细胞靶向部分(Moiety)结合。
并且，本发明的另一目的在于，提供包含上述核酸分子作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
并且，本发明的还一目的在于，提供包含上述核酸分子作为有效成分的用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂。
并且，本发明的又一目的在于，提供一种预防或治疗肝癌的方法，包括向个体给药上述药物组合物的步骤。
并且，本发明的又一目的在于，提供一种靶向Let-7i-5p的核酸分子，其特征在于，由序列1表示，上述核酸分子通过核苷酸序列被2'-O-甲氧基乙基(2'-O-Methoxyethyl)化来修饰，一部分骨架(backbone)通过硫代磷酸酯(phosphorothioate)改性，与肝细胞靶向部分结合。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供一种核酸分子，靶向Let-7i-5p，其特征在于，上述核酸分子由序列1的碱基序列表示，为核苷酸序列被甲氧基乙基化而被修饰的核酸，部分或全部骨架由硫代磷酸酯改性。
并且，本发明提供一种核酸分子，靶向Let-7i-5p，其特征在于，上述核酸分子由序列1的碱基序列表示，为核苷酸序列被2'-O-甲氧基乙基化而被修饰的核酸，部分或全部骨架由硫代磷酸酯改性，与肝细胞靶向部分结合。
本发明提供包含修饰的RT-LET7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
并且，本发明提供包含与肝细胞靶向部分结合的修饰的RT-LET7作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
并且，本发明提供包含修饰的RT-LET7作为有效成分的用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂药物组合物。
并且，本发明提供包含与肝细胞靶向部分结合的修饰的RT-LET7作为有效成分的用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂。
并且，本发明提供预防或治疗肝癌的方法，包括向个体给药上述药物组合物的步骤。
发明的效果
与现有的抑制Let-7i-5p的作为反义微小核糖核酸(AS-miRNA)的RT-LET7相比，本发明的修饰的RT-LET7或与肝细胞靶向部分结合的修饰的RT-LET7具有增加对Let-7i-5p的表达抑制、增加肝癌细胞生长抑制、增加血小板反应蛋白1表达以及增加巨噬细胞的吞噬活性的效果。并且，在上述修饰的RT-LET7结合肝细胞靶向部分提高向肝癌细胞的递送力来显著提高肝癌治疗效果，从而可以有效用作用于预防或治疗肝癌的药物组合物或用于预防或治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂。
附图说明
图1a及图1b为示出在本发明的一实施例中作为Let-7i-5p的表达抑制剂的RT-LET7的多种修饰结构(图1a)及抑制效率(图1b)的图(基本型：RT-LET7，修饰：RT-LET7-2、RT-LET7-4、RT-LET7-6及RT-LET7-8)。
图2a至图2c为确认在本发明的一实施例中作为本发明的修饰的RT-LET7的RT-LET7-8在HCC细胞株中显著地持续抑制Let-7i-5p的效果的图(图2a：SNU-387，图2b：SNU-368，图2c：SNU-423)。
图3a至图3c为确认在本发明的一实施例中通过作为本发明的修饰的RT-LET7的RT-LET7-8抑制HCC细胞株的生长及增加巨噬细胞活性的图(图3a：通过MTT及细胞存活分析的Let-7i-5p对肿瘤形成的特性，图3b：处理基本型RT-LET7及修饰RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认血小板反应蛋白1表达变化，图3c：处理基本型RT-LET7及修饰RT-LET7-8的HCC细胞的巨噬细胞的吞噬活性)。
图4a及图4b为确认在HCC细胞中结合有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的RT-LET7-8的Let-7i-5p表达抑制效率及持续抑制Let-7i-5p的效果的图。
图5a及图5b为在本发明的一实施例中，确认在HCC细胞中结合有半乳糖基类半乳糖基脂质纳米颗粒(Gal-LNP)的RT-LET7-8的Let-7i-5p表达抑制效率及持续抑制Let-7i-5p的效果的图。
图6a至图6c为确认在本发明的一实施例中通过结合有GalNAc的RT-LET7-8抑制HCC细胞株的生长及增加巨噬细胞的活性的图(图6a：通过MTT及细胞存活分析确认Let-7i-5p对肿瘤形成的特性，图6b：处理结合有GalNAc的RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认血小板反应蛋白1表达变化，图6c：处理结合有GalNAc的RT-LET7-8的HCC细胞的巨噬细胞的吞噬活性)。
图7a至图7c为确认在本发明的一实施例中通过结合有Gal-LNP的RT-LET7-8抑制HCC细胞株的生长及增加巨噬细胞的活性的图(图7a：通过MTT及细胞存活分析确认Let-7i-5p对肿瘤形成的特性，图7b：处理结合有Gal-LNP的RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认血小板反应蛋白1表达变化，图7c：处理结合有Gal-LNP的RT-LET7-8的HCC细胞的巨噬细胞的吞噬活性
图8a至图8c为简要示出在本发明的一实施例中有关肝细胞靶向递送系统(GalNAc及Gal-LNP)结合的示意图(图8a：Gal-LNP结合，图8b：Old-GalNAc结合，图8c：D-GalNAc结合)。
图9a至图9c为确认在本发明的一实施例中结合有结构不同的GalNAc(D-GalNAc)的RT-LET7-8在HCC细胞中的Let-7i-5p表达抑制效率及持续抑制Let-7i-5p的效果的图。
图10a及图10b为确认在本发明的一实施例中通过结合有结构不同的GalNAc(D-GalNAc)的RT-LET7-8的对HCC细胞株的生长抑制的图。
图11a及图11b为确认在本发明的一实施例中通过结合有结构不同的GalNAc(D-GalNAc)的RT-LET7-8的对HCC细胞株的血小板反应蛋白1表达变化及增加巨噬细胞的活性的图。
具体实施方式
以下，参照附图通过本发明的实例来详细说明本发明。但下述实例仅为例示本发明而提出，若对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是众所周知的技术或结构的具体说明有可能不必要地混淆本发明的要旨，则将省略其详细说明，但不因此而受限。本发明可以在随附的发明要求保护范围及由此解释的同等范畴内有多重修饰及应用。
并且，本说明书中使用的术语(terminology)是为适当表达本发明的优选实施例而使用的术语，可以根据使用人员、运用人员的意图或本发明所属技术领域的惯例等的不同而不同。因此，这些术语应基于本说明书全文的内容来定义。在说明书全文中，当提及某部分“包含”某结构要素时，若无特别反对的记载，则可以表示还可以包含其他结构要素，而不是排除其他结构要素。
在一实施方式中，本发明涉及作为由序列1表示的核酸分子的靶向Let-7i-5p的核酸分子。
在一实例中，本发明的“核酸分子”可以为核苷酸序列被2'-O-甲氧基乙基化而被修饰的核酸。
在一实例中，本发明的“核酸分子”的部分或全部骨架可以由硫代磷酸酯改性，优选地，可以从序列1的核苷酸中5’末端起第一至第四个核苷酸的骨架由硫代磷酸酯改性，但不限定于此。
在一实例中，本发明的“核酸分子”可以为与肝细胞靶向部分结合的核酸分子。
并且，上述肝细胞靶向部分只要是已知为肝组织靶向药物递送系统的就可以不受限制地使用，例如，有N-乙酰半乳糖胺(N-Acetylgalactosamine，GalNAc)、半乳糖基脂质纳米颗粒(Gal-LNP，Galactosyl lipidoid nanoparticle)、脂质-小干扰核糖核酸(Lipid-siRNA)、抗体-小干扰核糖核酸(Antibody-siRNA)、肽-抗链球菌溶血素(Peptide-ASO)、稳定核酸脂质颗粒(Stable nucleic acid lipid particle)、外泌体(Exosome)、球形核酸(Spherical nucleic acid)、脱氧核糖核酸笼(DNA cage)等(Nat Rev DrugDiscov.2020Oct；19(10):673-694.)。
并且，上述半乳糖基脂质纳米颗粒可以由胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、C16-PET2000-神经酰胺(C16-PET2000-ceramide)及α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide)构成。
并且，上述N-乙酰半乳糖胺可以由化学式1或化学式2表示，优选地，可以由化学式2表示，但不限定于此。
化学式1
化学式2
在一实施方式中，本发明涉及包含上述核酸分子作为有效成分的用于预防或治疗肝癌的药物组合物。
在一实例中，本发明的“组合物”可以抑制Let-7i-5p的表达。
在一实例中，本发明的“组合物”可以抑制肝癌细胞的生长。
在一实例中，本发明的“组合物”可以增加血小板反应蛋白1(TSP1，thrombospondin-1)的表达。
在一实例中，本发明的“组合物”可以增加巨噬细胞的吞噬活性。
在一实施方式中，本发明涉及包含上述核酸分子作为有效成分的用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂。
在一实例中，本发明的“血小板反应蛋白1”可以通过占有CD47受体来抑制CD47-信号调节蛋白α的相互作用。
在一实例中，本发明的“核酸分子”可以调节let-7i-p-TSP1信号传导轴，可以通过将巨噬细胞与HCC之间的CD47-信号调节蛋白α的相互作用转换为CD47-血小板反应蛋白1的相互作用来再激活巨噬细胞对HCC细胞的吞噬作用。
在一实例中，本发明的“肝癌”可以为Let-7i-5p高表达的肝癌，可以为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)，可以为I期(stageⅠ)、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期A阶段或Ⅳ期B阶段(phase)的肝细胞癌，更优选地，为比初期更难治疗的Ⅲ期至Ⅳ期的肝细胞癌。
在一实例中，本发明的“肝癌”可以为血小板反应蛋白1低表达的肝癌，可以为肝细胞癌，可以为I期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期A阶段或Ⅳ期B阶段的肝细胞癌，更优选地，为比初期更难治疗的Ⅲ期至Ⅳ期的肝细胞癌。
发明中使用的术语“表达抑制”是指引起靶向基因的(向信使核糖核酸(mRNA)的)表达或(向蛋白质的)翻译降低，优选地，是指通过此使靶向基因表达检测不到或以不显著的水平来存在。
本发明中使用的术语“预防”是指通过给药本发明的组合物来抑制或延迟肝癌的发病、发展及复发的所有行为。
本发明中使用的术语“治疗”是指通过给药本发明的组合物来使肝癌及由其引起的并发症的症状变更为好转或治愈的所有行为。本发明所属技术领域的普通技术人员可以通过韩国医学协会等颁布的资料来获知本申请的组合物有效的疾病的准确的标准并判断改善、提高及治疗的程度。
在一实例中，上述药物组合物可以为选自包括口服剂型、外用剂、栓剂、灭菌注射溶液及喷雾剂在内的组中的一种以上剂型。
并且，本发明的组合物可以包含生物制剂中通常使用的载体、稀释剂、赋形剂或它们两种以上的组合。药学上可接受的载体只要是适合将组合物递送到生物体内的就不受特别限制，例如，可以利用Merck Index,13th ed.,Merck&Co.Inc.中记载的化合物、生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及混合这些成分中的一种以上来使用，还可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、静菌剂等其他通常的添加剂。并且，还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬混液、乳浊液等注射用剂型以及丸药、胶囊、颗粒或片剂等。进而，可以利用本发明所属技术领域的适当方法或Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中公开的方法根据不同疾病或成分优选地配制。
本发明的组合物还可以包含示出相同或相似功能的一种以上有效成分。相对于组合物的总重量，本发明的组合物包含0.0001重量百分比至10重量百分比的上述蛋白质，优选地，包含0.001重量百分比至1重量百分比的上述蛋白质。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的添加剂，在此情况下，药学上可接受的添加剂可以使用淀粉、明胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、糖稀、阿拉伯胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉末纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、羟基乙酸淀粉钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石粉等。优选地，相对于上述组合物，可以包含0.1重量份至90重量份的本发明的药学上可接受的添加剂，但不限定于此。
本发明的组合物可以根据所目标的方法来胃肠外给药(例如，静脉内、皮下、腹腔内或局部)或者口服给药，以口服给药为最优选。给药量的范围根据个体的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、代谢率及疾病的严重程度等的不同而多种多样。
用于口服给药本发明的组合物的液体制剂有悬混剂、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除通常用作单纯稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包含多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于胃肠外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬混剂、油剂、冷冻干燥机、栓剂等。
在一实施方式中，本发明涉及治疗肝癌的方法，包括向个体给药上述药物组合物或免疫抗癌剂的步骤。
在本发明中，术语“个体”是指需要预防、调节或治疗疾病的方法的对象，可以不受限制地使用人、狗、猴、猫、例如小鼠、基因编辑的小鼠等啮齿类等。更具体地，是指人类或非人类的灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马、牛等哺乳动物。
本发明的药物组合物能够以治疗上有效的量或药学上有效的量来给药。
在本发明中，术语“治疗上有效的量”是指在预防或治疗对象疾病方面有效的药学上可接受的盐的量，本发明的组合物的治疗上有效的量可以根据例如给药方法、目标部位、患者的状态等诸多因素的不同而不同。因此，在向人体使用时应综合考虑安全性及有效性来确定适当的量。也可以从通过动物实验确定的有效量来推断在人体使用的量。确定有效量时需要考虑的诸多事项在例如Hardman and Limbird,eds.,Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.(2001),Pergamon Press；及E.W.Martin ed.,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.(1990),MackPublishing Co.中记述。
本发明的药物组合物以药学上有效的量来给药。本发明中使用的术语“药学上有效的量”是指以能够适用于医学治疗的合理的收益/风险比例治疗疾病的充分且不因其副作用的量，有效剂量水平可以根据包括个体的健康状态、感染症的种类、疾病严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药方法、给药时间、给药途径及代谢比例、治疗期间、配合或同时使用的药物在内的因素以及其他医学领域中广为人知的因素来确定。本发明的组合物能够以单独的治疗机来给药或者与其他治疗剂联合来给药，可以与现有的治疗剂依次或同时给药，可以单次或多次给药。重点在于，在考虑上述所有因素后能够以无副作用的最少的量获得最大效果的方式来给药，这可以通过本发明所属技术领域的普通技术人员轻松确定。
本发明的实施方式
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明的范围不限定于这些实施例。
实施例1.制备现有RT-LET7的修饰的RT-LET7
对于作为Let-7i-5p的抑制剂的RT-LET7(对序列1：AACAGCACAAACUACUACCUCA)以四个步骤过程为一个循环(cycle)来进行，每1mer的核糖核酸片段(RNA oligo 1mer)从3'末端到5'末端以解链(Deblocking)→配对(Coupling)→氧化(Oxidation)→盖帽(Capping)的过程依次进行。在此情况下，使用修饰的碱基，根据Nat Rev DrugDiscov.2020Oct；19(10):673-694.，与未修饰的核糖核酸相比，2'-核糖(2'-Ribose)的修饰(2'-O-methyl，2'-MOE)有助于增加对于核酸酶的抗性，有助于增加在细胞质内的稳定性。并且，还起到在生物体内增加半衰期的作用，结果为起到增大药物效果的作用。进而，强力地附着于互补性的核糖核酸，从而有助于通过核糖核酸酶(RNase)更为有效地分解靶向基因。而且，当使用硫代磷酸酯在核糖核酸碱基之间取代时，不给核糖核酸酶的活性带来影响，仍有效与靶向核糖核酸结合。而且，在细胞和体内通过与白蛋白等蛋白结合来从核酸酶中得到保护，由此，起到防止药物通过尿液排出的作用，从而延长药物在体内的持续时间来起到增大药物效果的作用，因此，进行核糖(Ribose)与硫代磷酸酯修饰。合成修饰的核糖核酸碱基2'-OMe rA亚磷酰胺(2'-OMe rA Phosphoramidite)(Glen Research公司，斯特林(Sterling)，弗吉尼亚州(VA)，cat.10-3100)、2'-OMe rC亚磷酰胺(2'-OMe rCPhosphoramidite)(Glen Research公司，cat.10-3115)、2'-OMe rG亚磷酰胺(2'-OMe rGPhosphoramidite)(Glen Research公司，cat.10-3120)、2'-OMe rU亚磷酰胺(2'-OMe rUPhosphoramidite)(Glen Research公司，cat.10-3130)、2'-MOErA亚磷酰胺(2'-MOErAPhosphoramidite)(Glen Research公司，cat.10-3200)、2'-MOErC亚磷酰胺(2'-MOErCPhosphoramidite)(Glen Research公司，cat.10-3211)、2'-MOErG亚磷酰胺(2'-MOErGPhosphoramidite)(Glen Research,cat.10-3220)、2'-MOErU亚磷酰胺(2'-MOErUPhosphoramidite)(Glen Research,cat.10-3231)。在合成过程中，需要由硫代磷酸酯取代的部分使用硫化剂II(Sulfurizing Reagent II)(Glen Research公司，cat.40-4037-10)来合成(生物合成)。在此情况下，将未进行任何修饰的核糖核酸片段(RNA oligo)命名为RT-LET7，将由2'-O-methyl使所有碱基修饰并使用硫代磷酸酯修饰的核糖核酸片段命名为RT-LET7-2，将使5'末端和3'末端的4处碱基修饰的命名为RT-LET7-6。而且，将由2'-MOE修饰所有碱基并使用硫代磷酸酯修饰的核糖核酸片段命名为RT-LET7-4，将使5'末端和3'末端的4处碱基修饰的命名为RT-LET7-8(图1a)。
实施例2.确认通过处理修饰的RT-LET7的Let-7i-5p的表达抑制
利用TRIzol试剂(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州(CA))将在转染如图1a所示制备的修饰的RT-LET7的HCC细胞株(SNU-387、SNU-368及SNU-423)中分离总核糖核酸后，利用上述micscipt II RT试剂盒(Qiagen公司，曼彻斯特(Manchester)，英国(UK))合成对两种上述微小核糖核酸具有特异性的互补脱氧核糖核酸(cDNA)。使用SensiFASTTM SYBR NoROX试剂盒(Kit)(Bioline公司，伦敦(London)，英国)进行实时定量聚合酶链式反应。在HCC细胞株(SNU-387、SNU-368及SNU-423)中进行Let-7i-5p的实时定量聚合酶链式反应的结果，确认到与由2'-O-methyl取代时(RT-LET7-2及RT-LET7-6)相比，由2'-MOE取代所有碱基时(RT-LET7-4及RT-LET7-8)抑制Let-7i-5p的表达的效果更好(图1b)。
并且，当由2'-MOE修饰RT-LET7时，在转染到HCC细胞株(SNU-387、SNU-368及SNU-423)后最多培养至7天后比较Let-7i-5p的表达抑制程度时，确认到与未进行任何修饰的RT-LET7相比，由2'-MOE修饰后由硫代磷酸酯取代时，显著增大Let-7i-5p的表达抑制的效率(图2a至图2c)。
实施例3.通过MTT及细胞存活分析确认Let-7i-5p对肿瘤形成的特性
为了在肝癌中确认处理RT-LET7时的生物体外肿瘤形成(in vitrotumorigenesis)抑制能力，利用RT-LET7进行MTT分析。具体地，为了进行MTT分析，将SNU-387细胞接种到12孔培养板并分别转染RT-LET7、RT-LET7-4、RT-LET7-8后，与0.5mg/ml的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide))溶液(西格玛公司(Sigma))一同培养1小时后，利用SYNERGY H1多标签(Multilabel)酶标仪(Bio-Tek公司，威努斯基(Winooski)，佛蒙特州(VT))测定吸光度。结果，可以在处理RT-LET7的修饰的RT-LET7-8的实验组中确认到最为优秀地抑制肿瘤细胞生长(图3a)。
实施例4.确认通过修饰的RT-LET7调节巨噬细胞吞噬作用
为了确认Let-7i-5p是否调节与巨噬细胞吞噬作用(macrophage phagocytosis)的调节有关的血小板反应蛋白1的表达，分别处理RT-LET7和修饰的RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认表达变化。结果，可以确认分别处理RT-LET7和RT-LET7-8时，增加血小板反应蛋白1的表达(图3b)。
基于上述结果，为了确认在Let-7i-5p-TSP1网络的CD47与信号调节蛋白α(signalregulatory proteinα)的相互作用中，是否能够通过血小板反应蛋白1占有CD47受体抑制CD47-信号调节蛋白α的相互作用来使巨噬细胞吞噬HCC，在生物体外进行吞噬作用分析。具体地，将作为HCC细胞株的SNU-387分别制备为单一细胞的悬浮液后，使用CFSE(abcam公司，剑桥(Cambridge)，英国)标记。然后，从C57BL/6小鼠获得腹膜巨噬细胞并与SNU-387共培养2小时后，分别处理RT-LET7及修饰的RT-LET7-8后，与作为阳性对照组的直接处理TSP1重组蛋白的HCC细胞进行比较。通过将捕获肿瘤细胞的巨噬细胞的数量除以巨噬细胞的总数来计算吞噬作用指数。结果，确认到处理RT-LET7及修饰的RT-LET7-8的HCC细胞都显著增加巨噬细胞的吞噬活性，确认到相对于RT-LET7，修饰的RT-LET7-8中巨噬细胞的吞噬活性更为增加(图3c)。
通过上述结果可知，修饰RT-LET7的RT-LET7-8可以调节let-7i-p-TSP1信号传导轴，通过将巨噬细胞与HCC之间的CD47-信号调节蛋白α的相互作用转换为CD47-血小板反应蛋白1的相互作用来再激活巨噬细胞对HCC细胞的吞噬作用。
实施例5.检验与肝细胞靶向部分结合的RT-LET7-8的效率
5-1.确认利用递送系统的RT-LET7-8对Let-7i-5p的表达抑制
为了确认利用递送系统的修饰的RT-LET7-8对Let-7i-5p的表达抑制效果，将已知为药物递送系统(drug delivery system)的N乙酰半乳糖胺或半乳糖基脂质纳米颗粒结合有RT-LET7-8的核酸分子递送到去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR，asialoglycoproteinreceptor)表达阳性(positive)的细胞(cell)(Hep3B)和阴性(negative)的细胞(SNU-449)。
具体地，Gal-LNP-RT-LET7-8通过如下方法制备：分别将通过结合烷基环氧化物(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))与多胺(西格玛奥德里奇公司)来合成的C12-SPM、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，Distearoylphosphatidylcholine)(西格玛奥德里奇公司)、胆固醇(西格玛奥德里奇公司)、C16-PEG2000-神经酰胺(ceramide)(Avanti极性脂质(PolarLipids))以及α-半乳糖神经酰胺(Avanti极性脂质)分别以50∶10∶38.5∶0.75∶0.75的比例混合来制备半乳糖基脂质纳米颗粒。然后，混合RT-LET7-8溶液(10mg/mL)与10mM的柠檬酸缓冲溶液(citrate buffer)(pH3)，以7∶1的比例混合Gal-LNP与RT-LET7-8后，在37℃的温度下培养30分钟来使RT-LET7-8搭载Gal-LNP。然后，通过在磷酸盐缓冲溶液(PBS)(西格玛奥德里奇公司，cat.P5368)中透析75分钟来去除乙醇和未搭载Gal-LNP的RT-LET7-8(参照图8a)。接着，在修饰的(modified)RT-LET7-8的5'末端连接特雷布勒亚磷酰胺(Treblerphosphoramidite)(GLEN Research公司)来修饰RT-LET7-8后，连接N-乙酰半乳糖胺(GLENResearch公司)来合成GalNAc-RT-LET7-8(参照图8b)。然后，以与实施例2相同的方法在各细胞中确认Let-7i-5p表达量。
结果，在结合有GalNAc的RT-LET7-8的情况下，在作为唾液酸糖蛋白受体阳性细胞(ASGPR positive cell)的Hep3B细胞中，与现有的RT-LET7-8相比，显著增加Let-7i-5p的表达抑制效果，但在作为唾液酸糖蛋白受体隐形细胞(ASGPR negative cell)的SNU-449细胞中，不增加Let-7i-5p的表达抑制效果(图4a)。相反，在结合有Gal-LNP的RT-LET7-8的情况下，与唾液酸糖蛋白受体无关地，都显著增加Let-7i-5p的表达抑制效果(图5a)。通过这样的结果预测，GalNAc为具有与肝细胞表面的唾液酸糖蛋白受体结合的性质的递送系统，因此只对唾液酸糖蛋白受体阳性细胞具有效果，但Gal-LNP具有与细胞膜相似的结构，因此，与唾液酸糖蛋白受体无关地显出效果。
并且，与结合有脂质转染胺(lipofectamine)的RT-LET7-8(Lipo-RT-LET7-8)相比，结合有Gal-LNP的RT-LET7-8(Gal-LNP-RT-LET7-8)示出显著减少Let-7i-5p的表达。这表示脂质转染胺仅由磷脂构成，与由胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、C16-PET2000-神经酰胺、α-半乳糖神经酰胺构成的Gal-LNP相比，无论是向肝的递送效率还是在生物体内的稳定性都显著降低。
接着，在Hep3B细胞中检验与肝细胞靶向部分(GalNAc或Gal-LNP)结合的RT-LET7-8在7天里的效率保持情况。结果，示出在7天里保持Let-7i-5p的表达抑制效果，即使与Lipo-RT-LET7-8相比，也稳定地抑制Let-7i-5p的表达(图4b及图5b)。
5-2.确认利用递送系统RT-LET7-8在肝癌中的肿瘤形成抑制
为了在肝癌中处理与肝细胞靶向部分结合的RT-LET7-8时的生物体外肿瘤形成抑制能力，以实施例3的方法进行MTT分析。
结果，与对照组相比，与肝细胞靶向部分结合的GalNAc-RT-LET7-8及Gal-LNP-RT-LET7-8有效抑制肝癌细胞的肿瘤形成，即使与Lipo-RT-LET7-8相比，经过72小时时，仍示出高的肿瘤形成抑制能力(图6a及图7a)。
5-3.确认利用递送系统的RT-LET7-8对巨噬细胞吞噬作用的调节
为了确认作为let-7i-5p的靶向蛋白的血小板反应蛋白1在作为RT-LET7的靶向微小核糖核酸(microRNA)的let-7i-5p的表达降低时的表达变化，处理修饰的RT-LET7-8和与肝细胞靶向部分结合的RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认表达变化。
结果，确认到与未与肝细胞靶向部分结合的修饰的RT-LET7-8相比，与肝细胞靶向部分结合的RT-LET7-8增加血小板反应蛋白1的表达(图6b及图7b)。
接着，为了确认巨噬细胞能否吞噬HCC进行，以实施例4的方法在生物体外进行吞噬作用分析。
结果，确认到与修饰的RT-LET7-8相比，GalNAc-RT-LET7-8及Gal-LNP-RT-LET7-8中的巨噬细胞的吞噬活性更为增加(图6c及图7c)。
实施例6.检验结合有D-GalNAc的RT-LET7-8的效率
通过实施例5确认到与Gal-LNP相比，GalNAc与修饰的RT-LET7-8结合时，向肝的递送效率及生物体内的稳定性更高。
因此，为了探索能够通过与修饰的RT-LET7-8结合来显著提高RT-LET7-8的功效的最佳的GalNAc，制备了在5'末端结合结构互不相同的GalNAc(D-GalNAc)的RT-LET7-8，通过下述实验比较结合有GalNAc的修饰的RT-LET7-8的效率。
6-1.确认D-GalNAc-RT-LET7-8对Let-7i-5p的表达抑制
制备结合有在实施例5中使用的GalNAc(Old-GalNAc)和作为新的GalNAc的D-GalNAc的RT-LET7-8，分别将上述两种Old-GalNAc-RT-LET7-8(参照图8b)及D-GalNAc-RT-LET7-8(参照图8c)向Hep3B细胞递送并以与实施例2相同的方法在各细胞中确认Let-7i-5p的表达量。
结果，确认到与现有的Old-GalNAc-RT-LET7-8相比，结合有D-GalNAc的RT-LET7-8在作为唾液酸糖蛋白受体阳性细胞的Hep3B细胞中显著增加Let-7i-5p的表达抑制效果(图9a)。
接着，在Hep3B细胞中检验Old-GalNAc-RT-LET7-8及D-GalNAc-RT-LET7-8在14天里的效率保持情况，效率保持检验测试在不同的温度条件(4℃/室温)下进行。
结果，Old-GalNAc-RT-LET7-8到第七天保持Let-7i-5p的表达抑制效果，但在经过7天的情况下，Let-7i-5p的表达恢复到与对照组相似的水平。然而，GalNAc-RT-LET7-8示出直到第十四天仍稳定地抑制Let-7i-5p的表达(图9b、图9c)。
6-2.确认GalNAc-RT-LET7-8在肝癌中的肿瘤形成抑制
为了确认在肝癌中处理结合有GalNAc(Old-GalNAc)和作为新的GalNAc的D-GalNAc的RT-LET7-8时生物体外肿瘤形成抑制能力，分别向Hep3B细胞递送Old-GalNAc-RT-LET7-8及D-GalNAc-RT-LET7-8后，进行MTT分析(MTT assay)及BrdU分析(BrdU assay)。
MTT分析以实施例3中记载的方法进行，BrdU分析根据生产公司的说明书使用BrdU细胞增殖检测试剂盒(cell proliferation assay kit)(Millipore)来进行。
MTT分析的结果，与Old-GalNAc-RT-LET7-8相比，D-GalNAc-RT-LET7-8示出有效抑制肝癌细胞的肿瘤形成(图10a)。接着，与MTT分析结果相同，BrdU分析结果也确认到与Old-GalNAc-RT-LET7-8相比，处理D-GalNAc-RT-LET7-8的Hep3B细胞的增殖(Proliferation)抑制能力得到显著提高(图10b)。
6-3.确认GalNAc-RT-LET7-8对巨噬细胞吞噬作用的调节
为了确认作为let-7i-5p的靶向蛋白的血小板反应蛋白1在作为RT-LET7的靶向微小核糖核酸的let-7i-5p的表达降低时的表达变化，分别向Hep3B细胞处理Old-GalNAc-RT-LET7-8及D-GalNAc-RT-LET7-8后通过蛋白印迹分析确认表达变化。
结果，确认到与Old-GalNAc-RT-LET7-8相比，D-GalNAc-RT-LET7-8增加血小板反应蛋白1的表达(图11a)。
接着，为了确认巨噬细胞能否吞噬HCC，以实施例4的方法在生物体外进行吞噬作用分析。
结果，确认到与Old-GalNAc-RT-LET7-8相比，D-GalNAc-RT-LET7-8更为增加巨噬细胞的吞噬活性(图11b)。
通过上述结果确认到，当在修饰的RT-LET7-8中搭载肝细胞靶向递送系统时，通过提高向作为靶向器官的肝的递送性来显著增加肝细胞中的Let-7i-5p表达抑制功效、肝癌中的肿瘤形成抑制功效以及巨噬细胞的吞噬活性功效。尤其，可知在结合有肝细胞靶向递送系统中由化学式2表示的D-GalNAc的修饰的RT-LET7-8的情况下，显著提高RT-LET7-8的上述提及的预防或治疗肝癌的效果。
Claims (12)
1.一种核酸分子，靶向Let-7i-5p，其特征在于，
上述核酸分子由序列1的碱基序列表示，
上述核酸分子为核苷酸序列被2'-O-甲氧基乙基化而被修饰的核酸，
上述核酸分子的部分或全部骨架由硫代磷酸酯改性。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，在上述核酸分子中，从序列1的核苷酸中5’末端起第一至第四个核苷酸的骨架由硫代磷酸酯改性。
3.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，在上述核酸分子中，从序列1的核苷酸中3’末端起第一至第四个核苷酸的骨架由硫代磷酸酯改性。
4.一种核酸分子，靶向Let-7i-5p，其特征在于，
上述核酸分子由序列1的碱基序列表示，
上述核酸分子为核苷酸序列被2'-O-甲氧基乙基化而被修饰的核酸，
上述核酸分子的部分或全部骨架由硫代磷酸酯改性，
上述核酸分子与肝细胞靶向部分结合。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，上述肝细胞靶向部分为N-乙酰半乳糖胺或半乳糖基脂质纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，上述N-乙酰半乳糖胺由化学式1或化学式2表示：
化学式1：
化学式2：
7.一种用于预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的核酸分子作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，上述组合物抑制Let-7i-5p的表达。
9.根据权利要求7所述的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，上述组合物增加血小板反应蛋白1的表达。
10.根据权利要求7所述的用于预防或治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，上述组合物增加巨噬细胞的吞噬活性。
11.一种用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的核酸分子作为有效成分。
12.一种治疗肝癌的方法，其特征在于，包括向个体给药权利要求7所述的用于预防或治疗肝癌的药物组合物或权利要求11所述的用于治疗CD47-阳性肝癌的免疫抗癌剂的步骤。
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