KR101751965B1 - 암 치료를 위한 claudin-18에 대한 모노클로날 항체 - Google Patents

암 치료를 위한 claudin-18에 대한 모노클로날 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR101751965B1
KR101751965B1 KR1020167036984A KR20167036984A KR101751965B1 KR 101751965 B1 KR101751965 B1 KR 101751965B1 KR 1020167036984 A KR1020167036984 A KR 1020167036984A KR 20167036984 A KR20167036984 A KR 20167036984A KR 101751965 B1 KR101751965 B1 KR 101751965B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
cells
cld18
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020167036984A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170005160A (ko
Inventor
우구르 사힌
외츨렘 튀레치
군다 브란덴부르크
디르크 우제너
Original Assignee
가니메드 파마슈티칼스 아게
요하네스 구텐베르크-유니버시타트 마인츠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가니메드 파마슈티칼스 아게, 요하네스 구텐베르크-유니버시타트 마인츠 filed Critical 가니메드 파마슈티칼스 아게
Publication of KR20170005160A publication Critical patent/KR20170005160A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101751965B1 publication Critical patent/KR101751965B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K47/48—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 이의 전이를 비롯한 종양 관련 질병을 포함하는 CLD18을 발현하는 세포와 관련된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제로서 유용한 항체를 제공한다.

Description

암 치료를 위한 CLAUDIN-18에 대한 모노클로날 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CLAUDIN-18 FOR TREATMENT OF CANCER}
항체 기반 암 치료법은 기존의 약물에 비하여 특이성이 더 높고 부작용이 더 적다. 그 이유는 항체가 정상 세포와 종양 세포를 정확히 구분한다는 점과, 이들의 작용 방식이 보체 활성화 및 세포 독성 면역 세포의 리쿠르트먼트 (recruitment) 등의 독성이 더 낮은 면역학적 항암 메카니즘에 의존한다는 점 때문이다.
항체 기반 치료법의 표적에는, 특히 정상 세포와 종양 세포와의 적절한 차이의 기반이 되는 특정한 품질이 요구된다. 명백하게, 종양 세포에만 독점적으로 국한되거나, 정상 세포에서는 완전히 검출 불가능한 표적이 효율적이고 안전한 항체 치료법의 개발을 위해 이상적이다. 또 다른 관점에 있어서, 고수준 과발현은 인간 상피 성장 인자 수용체 타입 2 (HER-2)로 예시되는 치료법과 낮은 부작용에 대한 기초가 될 수 있으며, 상기 HER-2는 유전자 증폭의 결과 항체 트라스투주맙 [trastuzumab (헤르셉틴; Herceptin)]에 대한 양호한 표적이 된다.
종양 치료용으로 이미 승인되었거나, 임상 개발 중에 있는 항체에 대한 기타 표적들은 종양 세포에 대한 표적 분자의 수치적 과발현을 기반으로 하지 않는 뚜렷한 품질을 갖는다. 프로테오글리칸 MUC-1에 대한 항체의 경우에, 표적의 백본에 있는 펩티드 반복 에피토프는 종양 세포에서 언더글리코실화되고 (underglycosylated), 이 때문에, 이의 정상적인 대응부 (counterpart)가 변화된다. CD20 (리툭시맙; rituximab), CD52 (Campath-1H) 및 CD22 (에프라주투맙; epratuzumab)에 대한 항체의 경우, 항체 표적은 종양 세포 및 정상 림프구에서 비슷한 수준으로 발현된다. 여기에서, 항체에 의한 정상 세포의 제거 (ablation)는, 표적에 음성인 줄기 세포가 정상 림프구의 레퍼토리를 회복하기 때문에 내성이다 (tolerable). 항체 표적의 상이한 접근성의 다른 예로는 암배아 항원 (CEA)과, 카르보안하이드라아제 (carboanhydrase) IX (CA9)가 있다. 상기 두 가지 항원은 각각 결장과 신장의 정상적인 외피 상에서 발현된다. 그러나, 방사선 표지된 항체를 영상화하면 종양 조직과 정상 조직을 잘 구분해 주며, 세포 독성 항체는 내성이다. 이는 정상적인 외피 조직의 루멘, 즉 IgG 항체가 접근 불가능한 쪽에서 CA9와 CEA가 제한되어 발현되기 때문이다. 항원 외피 세포 접착 분자 (Ep-CAM)도 역시 이 카테고리에 속한다. 이는 외피 세포에 대한 호모타입 세포 접착 분자로서, 세포내 공간 중에 자리를 잡는다. 흥미롭게도, 고친화성 항-Ep-CAM 항체는 매우 독성이 강한 반면에, 중간 친화성 항체는 내성이다. 이는 정상 세포 상의 Ep-CAM 표적의 접근 가능성을 암시하지만, 항체 결합의 역학은 치료법을 개발해 줄 수 있다는 점도 역시 나타낸다.
세포/세포 접착에 관여하는 다른 상피 세포 특이적 단백질의 한 가지 가능성은, 이들이 구조화된 상피에서 항체에 거의 접근 가능하지 않지만, 종양 세포에서 노출될 수 있기 때문에, 항체 접근에 대하여 매력적일 수 있다. 그러므로, 치료용 항체에 대한 표적으로서 이들이 적절한지에 대하여 상피 조직 구조를 조직화하는 데에 관여하는 단백질을 분석하였다. 특히 본 발명자가 주목한 단백질은 claudin 18이다.
claudin 18 (CLD18) 분자 (Genbank 수탁 번호: 스플라이스 변이체 1 (CLD18A1): NP_057453, NM_016369, 스플라이스 변이체 2 (CLD18A2): NM_001002026, NP_001002026)는, 분자량이 약 27.9 / 27.72 kD인 인티그랄 (integral) 막통과 단백질이다. Claudin은 외피와 내피의 타이트 정션 (tight junction) 사이에 위치하는 인티그랄 막 단백질이다. 타이트 정션에서는, 근접하는 세포 사이의 막간 분자의 연결된 스트랜드가 네트워크를 이룬다. 타이트 정션에서는, 오클루딘 (occludin) 및 클라우딘 (claudins)이 가장 풍부한 막통과 단백질 성분이다. 이들의 강한 세포간 접착성에 기인하여, 이들은 용질의 세포외 수송을 예방 및 조절하기 위한 1차 배리어를 생성해 내며, 막 지질 및 단백질이 측면으로 확산되는 것을 제한하여, 세포내 극성을 유지하도록 해 준다. 타이트 정션 형성 단백질은 상피 조직 구조체를 이루는 데에 중요하게 관여한다. 본 발명의 발명자들은 이러한 단백질은 잘 구조화된 상피에서는 항체가 거의 근접 불가능할 수 있으나, 종양 세포에서는 노출될 것이라고 예상하였다.
CLD18은 테트라스패닌 (tetraspanin)이고 이러한 4개의 소수성 영역을 가진다. 본 발명의 발명자들은 CLD18이 항체에 의하여 선택적으로 다루어질 수 있는 몇 가지 상이한 입체 배열을 보이는 것을 나타내는 데이터를 생성하였다. 한 가지 입체 배열 (CLD18-Conformation-1)의 경우, 클라우딘 패밀리 구성원 대부분에 대하여 설명된 바와 같이, 모든 4개의 소수성 영역이 레귤러 막통과 도메인 (TM)으로서 작용하며, 2개의 세포외 루프 (소수성 영역 1 및 소수성 영역 2에 의하여 포섭된 루프 1, 소수성 영역 3 및 4에 의하여 포섭된 루프 2)가 형성된다. 두번째 입체 배열 (CLD18-Conformation-2)의 경우에는 또다른 트랜스패닌 패밀리의 구성원인 PMP22에 대하여 설명된 바와 같이 (Taylor et al., J. Neurosc. Res. 62:15-27, 2000), 제2 및 제3 소수성 도메인은 제1 및 제4의 막통과 도메인 간의 부분 (루프 D3)이 세포외에 위치할 수 있도록 원형질막을 완전히 통과하지 않는다. 세번째 입체 배열 (CLD18-Conformation-3)은 레귤러 막통과 도메인으로서 작용하는 제1 및 제4의 소수성 영역에 의하여 포섭된 2개의 내부 소수성 영역을 함유하는 대형 세포외 도메인이다. 루프 D3에서의 전통적인 N-글리코실화 부위의 존재로 인하여, Claudin-18의 위상학적 변이체인 CLD18 토폴로지 (topology)-2 및 CLD18 토폴로지-3에는 부가적인 세포외 N-글리코실화 부위가 존재한다.
마우스 및 인간에서 설명된 바와 같이 (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001), 다른 수준의 복합성이 2개의 상이한 스플라이스 변이체의 존재에 의하여 CLD18 분자에 첨가된다. 스플라이스 변이체 CLD18A1 및 CLD18A2는 제1 TM 및 루프1을 포함하는 제1 21개의 N-말단 아미노산이 상이한 반면, c-말단의 1차 단백질 서열은 동일하다.
CLD18A1은 정상적인 폐 및 위 상피에서 선택적으로 발현되는 반면에, CLD18A2는 위 세포에서만 발현된다 (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21 :7380-90, 2001). 가장 중요한 것은, CLD18A2는 위 상피 중 분화된 단기간 생존 세포에 제한될 뿐, 위의 줄기 세포 영역에는 존재하지 않는다는 점이다. 고감도 RT-PCR을 사용하여, 본 발명자들은 모든 여하한 인간의 정상 기관에서는 이 두 가지 변이체 모두 검출 가능하지 않지만, 위, 식도, 췌장, 폐 암세포를 비롯하여 인간의 암세포주를 포함한 여러 가지 암 타입에서는 강하게 발현되는 것을 밝혀내었다. 상기 질병명의 선암종의 세부 분류에서는 발현이 더욱 두드러진다.
단백질의 분자량은 일부 암과 주위 정상 조직 간에 서로 상이하다. 건강한 조직에서 관찰되는 고분자량 단백질은 탈글리코실화 화합물 PNGase F로 조직 용해물을 처리함으로써 암에서 관찰되는 것과 동일한 분자량으로 전환할 수 있다. 이는, CLD18은 정상 조직의 대응부와 비교하여 암에서 덜 N-글리코실화된다는 점을 암시한다. 이 구조적 차이는 에피토프의 변형을 유발시킬 것으로 생각된다. 전통적인 N-글리코실화 모티프는 분자의 루프 D3 도메인 중의 아미노산 116번째 위치에 있다.
본 발명에 따른 "CLD18" 및 "CLD18-변이체"는 (i) CLD18-스플라이스 변이체, (ii) CLD18-N-글리코실화 변이체, (iii) CLD18-입체 배열 변이체, (iv) CLD18-프리 (free) 및 세포간 타이트 정션에 위치하는 호모타입/헤테로타입 관련 변이체 및 (v) CLD18-암 관련 및 CLD18-비암 세포 관련 변이체를 포함하려 하는 것이다.
CLD18의 분자적 특징 및 기능적 특징으로 인하여, 이 분자는 항체 기반 암 치료법을 위한 매우 우수한 표적이 된다. 특히 (i) 독성 관련 정상 조직의 거의 대부분에는 CLD18이 부재하고, (ii) CLD18A2 변이체 발현은 위(胃)의 표적 음성 줄기 세포에 의하여 재공급될 수 있는, 분화된 위(胃) 세포로서 교체 가능한 세포 집단에 제한되며, (iii) 정상 세포와 종양 세포 간의 잠재적인 상이한 글리코실화에 대한 힌트를 제공하고, (iv) 상이한 입체 배열 위상학이 존재한다. 더욱이, 타이트 정션 단백질로서의 CLD18의 역할로 인하여 양호한 치료법을 제공할 수 있다. 종양 세포는 클라우딘을 발현하지만, 정상 상피 조직에서 발견된 클라우딘의 호모타입 및 헤테로타입 회합에 의하여 전통적인 타이트 정션을 형성하지는 않는 경우가 있기 때문에, 종양 세포는 세포외 항체 결합 및 면역 치료에 사용될 수 있는 자유 클라우딘의 상당한 풀 (pool)을 가질 수 있다. 건강한 상피 중의 클라우딘의 결합 에피토프는 타이트 정션 속에서 이러한 항체가 접근하는 것으로부터 차단되는 경우가 있다.
더욱이, 본 발명에 따라 관찰된 원형질막 고발현은 1차 종양 뿐 아니라, CLD18A2를 발현하는 1차 종양, 특히, 위 종양에서 유래된 전이에 대하여 CLD18A2 특이적 항체를 암 전이, 특히 위 종양에서 유래된 전이, 예컨대 림프절 전이, 복막 전이 및 크루켄베르크 (Krukenberg) 종양의 예방, 치료 및/또는 진단을 위한 유용한 도구가 되게 하여 준다.
본 발명의 목적은 종양 등의 CLD18이 발현되는 질병의 치료를 위하여 유용한 항체를 제공하는 것이다. 본 발명에 기재된 항체는 이러한 질병을 진단하는 데에 또한 유용하다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 위암, 식도암, 췌장암, 비소세포 폐암 (NSCLC) 등의 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암 및 담낭암 및 이의 전이, 특히 크루켄베르크 종양, 복막 전이 및 림프절 전이 등의 위암 전이 등의 종양 관련 질병을 비롯하여 CLD18을 발현하는 세포와 관련된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제로서 유용한 항체를 제공한다.
본 발명의 한 가지 관점에 있어서, 본 발명은 CLD18에 대한 결합능이 있는 항체에 관한 것이다. 좋기로는, 본 항체는 세포 표면에서 발현되는 CLD18에 대한 결합능이 있고, 좋기로는 CLD18의 세포외 부분내에 위치한 1개 이상의 에피토프에 대한 결합능이 있으며, 좋기로는 제1 세포외 도메인 (CLD18의 아미노산 위치 29 내지 78) 내에 위치한 1개 이상의 에피토프에 대한 결합능이 있다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 151, 153, 155, 156 및 157로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 펩티드에 결합한다. 좋기로는, 이 항체는 암 세포에, 특히 전술한 바와 같은 타입의 암 세포에 결합하고, 좋기로는 비암 (non-cancerous) 세포에는 실질적으로 결합하지 않는다. 좋기로는, 상기 항체가 암세포 등의 CLD18을 발현하는 세포에 결합하는 것은 CLD18을 발현하는 세포의 사멸을 매개한다. 좋기로는, 이 항체는 CLD18A1 및 CLD18A2에 결합하고 더욱 좋기로는 CLD18A2에 결합하지만 CLD18A1에는 결합하지 않는다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 CLD-conformation-1의 루프1 또는 루프2에 결합하고 이들에 대해 특이적이다. 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD-conformation-2의 루프 D3에 결합하고 이에 특이적이며, 특히 루프 D3 내의 위치 116에 있는 잠재적인 N-글리코실화 부위에서 또는 그 근처에서 결합한다. 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 루프 D3 내부에 있는 위치 116에 있는 잠재적인 N-글리코실화 부위의 글리코실화되지 않은 형태에 특이적이다.
좋기로는, 본 발명의 항체가 CLD18A2에 결합하는 것에는 CLD18A2 (SEQ ID NO:2)의 위치 42의 Ala, 위치 45의 Asn, 위치 56의 Glu로 이루어지는 군으로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 관여한다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 상기 지적한 위치에서의 1개 이상의 아미노산, 좋기로는 모든 아미노산이 다른 아미노산으로, 특히 CLD18A1의 대응하는 위치에서 발견되는 아미노산 (SEQ ID NO:8) (Ala42Ser, Asn45Gln 및 Glu56Gln)으로 치환되어 있는 CLD18A2 변이체 또는 이의 단편과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 항체에 의한 세포의 사멸은 좋기로는 상기 세포에 의하여 발현되는 CLD18에 대한 항체의 결합에 의하여, 더욱 좋기로는 상기 세포에 의하여 발현된 CLD18A2에 대한 항체의 결합에 의하여 유도된다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체가 상기 세포에 의하여 발현된 CLD18A1에 결합하는 것은 상기 세포의 사멸을 유도하지 않는다. 세포의 이러한 사멸은 본 명세서에 기재된 바와 같이 치료적으로 활용될 수 있다. 특히, 세포의 사멸은 암, 특히 암 전이 및 암세포의 전이적 스프레드를 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
CLD18을 발현하는 세포는 좋기로는 암세포이고, 특히 종양 형성 위암 세포, 식도암 세포, 췌장암 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 두경부암 세포 및 담낭암 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암세포이다.
좋기로는, 본 발명의 항체는 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 매개 세포 용해, 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC) 매개 세포 용해, 세포 자멸, 호모타입 접착 및/또는 식세포 작용을 유도함으로써, 좋기로는 CDC 매개 세포 용해 및/또는 ADCC 매개 세포 용해를 유도함으로써 세포 사멸을 매개한다.
본 발명의 항체의 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 세포의 CDC 매개 세포 용해를 유도하지 않는다.
좋기로는, 세포의 ADCC 매개 세포 용해는 단구, 단핵 세포, NK 세포 및 PMN으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이펙터 세포의 존재시 일어나고, 식세포 작용은 마크로파지에 의하여 일어난다.
본 발명의 항체는 모노클로날, 키메라, 인간 또는 인간화 항체여도 좋고, 또는 항체의 단편이어도 좋으며, IgGl, IgG2, 특히 그 중에서도 IgG2a 및 IgG2b와, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비 IgA, IgD, 및 IgE 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되어도 좋다.
본 발명의 모든 관점에 따르면, CLD18은 좋기로는 인간 CLD18이고, 좋기로는 인간 CLD18A2이며, CLD18A2의 아미노산 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:2에 따르는 것이고, CLD18A1의 아미노산 서열은 좋기로는 SEQ ID NO:8에 따르는 것이다.
구체적인 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명의 항체는 살아 있는 세포의 표면에 존재하는 CLD18의 네이티브 에피토프에 결합한다. 다른 한 가지의 실시 상태에 따르면, 본 발명의 항체는 암세포, 특히 위암 세포에 특이적이다.
본 발명의 구체적인 실시 상태에 있어서, CLD18은 세포 표면에서 발현된다.
본 발명의 항체는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 16, 18, 20, 21-23, 26-31, 151, 153, 및 155-157로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 면역원성 단편 또는 유도체, 또는 상기 단백질 또는 펩티드 또는 이들의 면역원성 단편 또는 이의 유도체를 발현하는 핵산 또는 숙주 세포를 사용하여 동물을 면역화하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 전술한 단백질, 펩티드 또는 이들의 면역원성 단편 또는 유도체에 특이적이다. 면역화에 사용된 단백질 또는 펩티드에 있어서, 이 유도체는 이러한 단백질 또는 펩티드가 유래된 것과 면역원성이 동일하거나 유사한 이러한 단백질 또는 펩티드의 변이체를 말한다. 특히, 항체, 특히 모노클로날 항체의 생산을 위한 면역화에 사용되었을 때 단백질 또는 펩티드의 유도체는 면역화에서 이 단백질 또는 펩티드를 사용한 경우에 얻어지는 항체와 특이성이 동일한 항체를 제공하게 된다. 예를 들어, 이러한 유도체는 1개 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 첨가를 포함할 수 있다. 특히, N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나 또는 양쪽 말단에 있는 시스테인 등의 1개 이상의 아미노산의 첨가, 또는 세린 잔기로 이들 시스테인 잔기를 치환하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 데이터는 항체 결합에 중요하지 않은 CLD18 내에 있는 아미노산은 포함하지 않는다. 따라서, 면역화에 사용된 본 명세서에 기재된 CLD 단백질, 펩티드, 이들의 면역원성 단편 또는 유도체는 항체 결합을 위하여 중요하지 않은 아미노산 위치에 있는 아미노산의 1개 이상의 치환을 포함할 수 있는 것이다.
특히 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 수탁 번호 DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182- D1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294), 또는 DSM ACC2810 (182-D1106-362)의 클론에 의하여 생성된다.
본 발명의 항체의 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 독소, 방사성 동위 원소, 약물 또는 세포 독성제 등의 치료제와 함께 커플링된다.
본 발명의 또 다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마에 관한 것이다. 양호한 하이브리도마는 수탁 번호가 DSM ACC2737 (182-D1106-055), DSM ACC2738 (182-D1106-056), DSM ACC2739 (182-D1106-057), DSM ACC2740 (182-D1106-058), DSM ACC2741 (182-D1106-059), DSM ACC2742 (182-D 1106-062), DSM ACC2743 (182-D1106-067), DSM ACC2745 (182-D758-035), DSM ACC2746 (182-D758-036), DSM ACC2747 (182-D758-040), DSM ACC2748 (182-D1106-061), DSM ACC2808 (182-D1106-279), DSM ACC2809 (182-D1106-294), 또는 DSM ACC2810 (182-D1106-362)인 것들이다.
본 발명의 항체는 항체의 명칭, 예컨대 182-D758-035 및/또는 항체를 생성하는 클론, 예컨대 26D12로서 본 명세서에서 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 항체 및/또는 치료제와 이들의 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 및/또는 이들과 치료제와의 컨쥬게이트의 유효량을 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 이루어지는 CLD18, 좋기로는, CLD18A2를 발현하는 세포의 성장 억제 및/또는 사멸 방법에 관한 것이다. CLD18은 좋기로는 상기 세포의 표면에서 발현된다.
본 발명의 또 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체, 이들과 치료제와의 컨쥬게이트, 또는 본 발명의 항체 또는 이들 항체의 치료제와의 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하여 이루어지는 CLD18, 좋기로는 CLD18A2를 발현하는 세포가 관여하는 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 좋기로는, 질병 또는 질환은 종양 관련 질병이고, 특히 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 이들 암으로부터 유래되는 전이로 이루어지는 군으로부터 선택된다. CLD18은 좋기로는 상기 세포의 표면에서 발현된다.
좋기로는, 본 발명의 항체는 암세포와 비악성 세포를 비롯한 상이한 세포 타입에 의하여 발현되는 CLD-18 변이체를 구분할 수 있는 능력이 있다. 특히 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD18A2에 결합하는 능력이 있지만, CLD18A1과는 결합하지 않거나, CLD18A2에 대한 결합 특이성에 비하여 낮은 특이성으로 CLD18A1에 결합한다.
본 발명에 따른 "결합"이라는 용어는 좋기로는 특이적인 결합에 관한 것이다. "특이적인 결합"이란 항체 등의 여하한 제제가 다른 표적에 결합하는 것에 비하여 특이적인 에피토프 등의 표적에는 더욱 강하게 결합하는 것을 말한다. 어떠한 제제가 제2 표적에 대한 해리 상수보다 더 낮은 해리 상수 (KD)로 제1 표적에 결합하는 경우에 이 제제는 제2 표적에 비하여 제1 표적에 더욱 강하게 결합하는 것이다. 좋기로는, 이러한 제제가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수 (KD)는 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수 (KD)보다 좋기로는 10배 이상, 좋기로는 20배 이상, 더 좋기로는 50배 이상, 더욱 더 좋기로는 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상 또는 1000배 이상 더 낮다.
좋기로는, 본 발명의 항체의 CLD18, 좋기로는 CLD18A2에 대한 해리 상수는 좋기로는 10-6 M 이하, 좋기로는 10-7 M 이하, 좋기로는 10-8 M 이하, 또는 좋기로는 10-9 M 이하이다. 좋기로는, 본 발명의 항체의 CLD18, 좋기로는 CLD18A2에 대한 해리 상수는 10-8 M 내지 10-9 M 범위이다.
본 발명의 항체는 좋기로는 CLD18, 좋기로는 CLD18A2를 발현하는 세포의 표면에서 발현되는 CLD18에 이 세포를 결합시킴으로써 상기 세포를 사멸시키는 것을 매개한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD18을 발현하는 세포의 보체 의존성 세포 독성 (CDC)을, 예컨대 적어도 약 20 내지 40% CDC 매개 세포 용해, 좋기로는 약 40 내지 50 % CDC 매개 세포 용해, 더욱 좋기로는 50% 이상의 CDC 매개 세포 용해를 유발한다. 이러한 항체는 다음의 항체, 즉 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 163E12, 175D10, 45C1, 125E1, ch-163E12 및 ch-175D10로서 예시된다. CDC를 대체하여, 또는 CDC에 부가하여, 본 발명의 항체는 이펙터 세포의 존재하에 (예컨대, 단구, 단핵 세포, NK 세포 및 PMN), CLD18을 발현하는 세포의 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC)을 유발할 수 있다. 이러한 항체는 다음의 항체, 즉 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 61C2, 26B5, 26D12, 28D10, 42E12, 163E12, 175D10, 45C1 및 125E1으로서 예시된다. 본 발명의 항체는 CLD18을 발현하는 세포의 세포 자멸을 유도하는 능력이 있고, CLD18을 발현하는 세포의 호모타입 접착을 유도하는 능력이 있으며, 그리고/또는 마크로파지의 존재하에 CLD18을 발현하는 세포의 식세포 작용을 유도하는 능력이 있다. 본 발명의 항체는 전술한 바와 같은 기능적 특징을 1가지 이상 가질 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 항체는 CLD18을 발현하는 세포의 CDC 매개 세포 용해 및 ADCC 매개 세포 용해를 유도하며, 더욱 좋기로는, CLD18을 발현하는 세포의 ADCC 매개 세포 용해를 유도하지만, 상기 세포의 CDC 매개 세포 용해를 유도하지 않는다. 본 발명의 항체에 대한 예시적인 표적 세포에는 CLD18, 좋기로는 CLD18A2를 발현하는 암세포, 예컨대 종양 형성 위암 세포, 췌장암 세포, 식도암 세포, 폐암세포가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체에 의하여 매개되는 세포의 사멸은 CLD18A2 특이적인데, 즉, 본 발명의 항체는 세포, CLD18A2를 발현하는 세포의 사멸, 좋기로는 CDC 및/또는 ADCC 매개 세포 용해를 매개하는 반면에, CLD18A1을 발현하나, CLD18A2를 발현하지 않는 세포의 사멸은 매개하지 않는다. 전술한 항체는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암 및 담낭암 및/또는 이들 암의 전이 등의 암의 치료 또는 예방에서 종양 세포를 사멸시키는 것을 매개하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 이들의 결합 특성과, CLD18을 발현하는 세포에 대한 이펙터 기능을 매개하는 능력에 따라 별개의 부류로 카테고리를 나눌 수 있다. 본 발명의 항체는
● CLD18A1 또는 CLD18A2를 발현하는 세포에 대한 결합 특성 및/또는 매개되는 이펙터 기능 (CLD18 스플라이스 변이체의 구별),
● 글리코실화 또는 비글리코실화된 CLD18 변이체 중 어느 하나를 발현하는 세포에 대한 결합 특성 및/또는 매개되는 이펙터 기능 (N-글리코실화가 있거나 없는 CLD18-변이체 간의 구별),
● 암세포 또는 정상 세포 타입에 대한 결합 특성 및/또는 매개되는 이펙터 기능 (종양 세포 또는 정상 비악성 세포에 의하여 발현되는 CLD18-변이체 간의 구별),
● 타이트 정션의 형성에 의하여 차폐되는 CLD-18 에피토프에 대한 결합 특성,
● 살아 있는 세포 상에서 CLD18의 응집체 형성을 유발하는 능력,
● 비인간 CLD18 변이체, 특히 마우스, 래트, 토끼 및 영장류로부터의 CLD18 변이체에 결합하는 능력
에 따라 카테고리를 나눌 수 있다.
본 발명의 항체는 다음의 특성 1가지 이상을 보유하기 때문에, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체의 구체적인 예는 이들을 참조로 하여 제공된다 (24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10).
a) CLD18A2 뿐만 아니라 CLD18A1에도 결합하는 것 (예컨대, 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 61C2 및 41C6)
b) CLD18A2에는 결합하나, CLD18A1에는 결합하지 않는 것 (예컨대, 26B5, 37G11, 38G5, 42E12, 및 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10, ch-43A11, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, ch-175D10)
c) 종양 세포에 의하여 천연 발현되는 CLD18에는 결합하나, 위 및 폐 세포 등의 비암 (non-cancer) 세포 또는 조직에 의하여 천연 발현되는 CLD18에는 결합하지 않는 것 (예컨대, 26B5, 75B8, 24H5, 39F11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10)
d) CLD18A2를 발현하는 세포의 CDC 유도성 사멸을 매개하나, CLD18A1을 발현하는 세포의 CDC 유도성 사멸은 매개하지 않는 것 (예컨대, 26D12, 28D10, 37H8, 및 39F11, 163E12, ch-125E1, ch-163E12, ch-175D10)
e) CLD18을 발현하는 세포의 ADCC 유도성 사멸을 매개하는 것 (예컨대, 26B5, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 43A11, 47D12, 및 61C2, ch-163E12, ch-175D10)
f) CLD18을 발현하는 세포의 ADCC 유도성 사멸을 매개하지만, CDC 매개 사멸은 매개하지 않는 것 (예컨대, 37G11, 42E12, 및 43A11)
g) CLD18A2를 발현하는 세포의 ADCC 유도성 사멸 및 CDC 유도성 사멸을 매개하는 것 (예컨대, 37H8, 38H3, 39F11, ch-163E12, ch-175D10).
본 명세서에 예시된 본 발명의 항체는 다음의 분자들도 더 포함한다.
a) 정상 위(胃)의 분화된 세포에는 결합하나, 위(胃)의 줄기 세포에는 결합하지 않는 것 (예컨대, 39F11)
b) 정상 위 조직 및 기타의 정상 기관에는 결합하지 않으나, 암세포에만 결합하는 것 (예컨대, 26B5)
c) CLD18의 위치 116에 있는 비글리코실화된 Asn을 포함하는 에피토프에 결합하는 것
d) 마우스에서 전임상 독성 연구를 완전히 수행하도록 허용하여 주는 인간 및 마우스 CLD18에 결합하는 것.
본 발명의 항체는 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 인간을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 항체는 한 가지 종, 좋기로는 인간으로부터 유래된 항체 불변 영역이, 다른 종으로부터 유래된 하원 결합 자리와 결합된 키메라 분자도 더 포함한다. 더욱이, 본 발명의 항체는 인간이 아닌 종으로부터 유래된 항체의 항원 결합 자리가 인간 유래의 불변 영역 및 프레임워크 영역과 조합된 인간화 항체도 포함한다.
본 발명의 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 있고, IgG2a (예컨대, IgG2a, κ, λ), IgG2b (예컨대, IgG2b, κ, λ), IgG3 (예컨대, IgG3, κ, λ) 및 IgM 항체가 있다. 그러나, 다른 항체 아이소타입도 본 발명에 포함되며, 여기에는 IgG1, IgA1, IgA2, 분비 IgA, IgD, 및 IgE 항체가 있다. 이 항체는 전항체이거나, 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv 단편 또는 이중 특이적 항체이다. 더욱이, 항원 결합 단편에는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합된 결합 도메인 폴리펩티드 (중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역)와, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역과, (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역 글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이 있다. 이러한 결합-도메인 면역 글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 자세히 설명되어 있다.
본 발명의 항체는 좋기로는 약 1 내지 100 nM 이하의 해리 평형 상수 (KD)로 CLD18과 해리한다. 좋기로는, 본 발명의 항체는 관련된 세포 표면 항원과 교차 반응하지 않고, 그에 따라 이들의 기능을 억제하지 않는다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 다음에 기재하는 특성 중 1가지 이상의 특징을 가질 수 있다.
a) CLD18에 대한 특이성, 특히 CLD18A2에 대한 특이성과,
b) 약 100 nM 이하, 좋기로는 약 5 내지 10 nM 이하, 더욱 좋기로는 약 1 내지 3 nM 이하의 CLD18에 대한 결합 친화도, 특히 CLD18A2에 대한 결합 친화도와,
c) CD55/59 네거티브 또는 CD55/59 포지티브 세포에 대한 고수준의 CDC를 매개하는 능력과,
d) CLD18을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 능력과,
e) CLD18을 발현하는 세포의 세포 자멸을 유도하는 능력과,
f) CLD18을 발현하는 세포의 호모 타입 접착을 유도하는 능력과,
g) 이펙터 세포의 존재 하에 CLD18을 발현하는 세포의 ADCC를 유도하는 능력과,
h) CLD18을 발현하는 종양 세포를 가지는 개체의 생존율을 연장시키는 능력과,
i) CLD18을 발현하는 세포를 파괴시키는 능력과,
j) 저수준의 CLD18을 발현하는 세포를 파괴시키는 능력 및/또는
k) 살아 있는 세포의 표면에서 CLD18을 응집시키는 능력.
본 발명의 항-CLD18 항체는 유도체화되거나, 다른 결합 특이성과 연결되거나 이들과 공발현될 수 있다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명은 CLD18에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성(예컨대, 항CLD18 항체 또는 그 유사체)과, Fc 수용체 (예컨대, Fc-감마 수용체, 예컨대 Fc-감마 RI, 또는 임의의 기타 Fc 수용체) 또는 T 세포 수용체, 예컨대, CD3에 대한 결합 특이성 등의 이펙터 세포에 대한 제2의 결합 특이성을 포함하는 이중 특이적 또는 다중 특이적 분자를 제공한다.
따라서, 본 발명은 CLD18 및 Fc 수용체 또는 T 세포 수용체, 예컨대 CD3 양자에 모두 결합하는 이중 특이적 및 다중 특이적 분자를 포함한다.
Fc 수용체의 예는 IgG 수용체, Fc-감마 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD 16)가 있다. 예컨대 IgA 수용체 (예컨대, FcαRI) 등의 다른 Fc 수용체도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 좋기로는 이펙터 세포, 예컨대 단구, 마크로파지 또는 활성화된 단핵 세포의 표면에 위치한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 이중 특이적 분자 및 다중 특이적 분자는 수용체의 면역 글로불린 Fc (예컨대, IgG 또는 IgA) 결합 자리에서 떨어져 있는 자리에 있는 Fc 수용체에 결합한다. 그러므로, 이중 특이적 및 다중 특이적 분자의 결합은 생리학적 수준의 면역 글로불린에 의하여 차단되지 않는다.
또 한가지의 관점에 있어서, 본 발명의 항-CLD18 항체는 다른 기능적 분자, 예컨대, 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 단편)로 유도체화되고, 이에 연결되거나, 이와 공동 발현된다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다른 항체 (예컨대, 이중 특이적 또는 다중 특이적 항체를 발생시키기 위한 것), 사이토톡신, 세포내 리간드 및 항원 (예컨대, 이뮤노톡신 등의 이뮤노컨쥬게이트를 발생시키기 위한 것) 등의 1종 이상의 다른 분자체와 (예컨대, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 기타 방법에 의하여) 기능적으로 연결될 수 있다. 본 발명의 항체는 다른 치료용 모이어티, 예컨대, 방사성 동위원소, 소형 분자 항암 약물, 재조합 사이토킨 또는 케모카인 등에 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명은 CLD18을 발현하는 세포에 결합하여 이러한 세포에 기타 분자를 표적화시키는 데 사용될 수 있는 것인 여러 가지 항체 컨쥬게이트, 이중 특이적 및 다중 특이적 분자, 융합 단백질을 포함하는 것이다.
또 다른 한가지 관점에 있어서, 본 발명은 비면역글로불린 도메인에서 유래한 CLD18-결합 단백질, 특히 단쇄 단백질도 포함하는 것이다. 이러한 결합 단백질 및 이들의 제조 방법은 예컨대, 문헌 [Binz et al. (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 통합된다. 면역 글로불린 또는 면역 글로불린 유래 결합 분자에 관하여 본 발명에서 교시된 것들은 비면역글로불린 도메인에서 유래한 결합 분자에도 적용된다는 것을 이해하여야 한다. 특히, 비면역글로불린 도메인에서 유래한 이러한 결합 분자를 사용하면, 상기 표적을 발현하는 세포의 CLD18을 차단할 수 있어서, 본 발명의 항체에 대하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 효과를 유발할 수 있으며, 특히 종양 세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 필수적인 것은 아니지만, 이러한 비면역글로불린 결합 분자에 항체의 Fc 영역을 융합시킴으로써 항체의 이펙터 기능을 부여하는 것이 가능하다.
또 한 가지의 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 중 1종 또는 항체 혼합물과 함께 제형된 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 포함하는, 조성물, 예컨대 약학 조성물 및 진단 조성물/키트를 제공한다. 특정 실시 상태에 있어서, 이 조성물은 CDC 및/또는 ADCC를 유도하고 세포 자멸을 유도하는 등의 구별되는 기능적 특징을 보유하거나, 구별되는 에피토프에 결합하는 항체의 혼합물을 포함한다. 이러한 본 발명의 실시 상태에 있어서, 항체는 혼합물로, 예컨대 2종 이상의 항-CLD18 모노클로날 항체를 포함하는 약학 조성물로서 사용될 수 있다. 예컨대, 상이하지만 상보적인 활성을 가지는 항-CLD18 항체는 희망하는 치료 효과를 달성하기 위하여 단일 치료 안에서 혼합될 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 조성물은 세포 자멸을 유도하는 다른 항-CLD18 항체와 함께 혼합된 CDC를 매개하는 항-CLD18 항체를 포함한다. 다른 실시 상태에 있어서, 조성물은 CLD18을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 다른 항-CLD18 항체와 함께 혼합된, 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포의 효과적인 사멸을 고도로 매개하는 항-CLD18 항체를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 항-CLD18 항체 2종 이상을 동시 또는 순차적 투여하는 것도 포함하는데, 여기에서 상기 항체 1종 이상은 키메라 항-CLD18 항체이고, 다른 항체 1종 이상은 인간 항-CLD18 항체이며, 이 항체들은 CLD18의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합한다. 좋기로는, 본 발명의 키메라 CLD18 항체를 먼저 투여한 후 본 발명의 인간 항-CLD18 항체를 투여하는데, 여기에서 인간 항-CLD18 항체는 좋기로는 연장된 기간 동안에 투여되는 것으로서, 즉 유지 치료로서 투여된다.
본 발명의 항체, 이뮤노컨쥬게이트, 이중 특이적 및 다중 특이적 분자 및 조성물은, CLD18, 특히 CLD18A2를 발현하는 세포의 성장이 억제되고 그리고/또는 상기 세포가 사멸될 수 있도록, 항체, 이뮤노컨쥬게이트, 이중 특이적/다중 특이적 분자 또는 조성물의 유효량과 상기 세포를 접촉시킴으로써, 세포 성장의 억제 및/또는 CLD18, 특히 CLD18A2를 발현하는 세포를 선택적 사멸하기 위한 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 방법은 임의로는 이펙터 세포의 존재하에, CDC, 세포 자멸, ADCC, 식세포 작용 또는 이들 기작의 2가지 이상의 조합에 의하여, CLD18을 발현하는 세포를 사멸시키는 것을 포함한다. 본 발명의 항체를 이용하여 억제되거나 사멸될 수 있는 CLD18을 발현하는 세포에는 종양 형성 위, 췌장, 식도, 폐, 난소, 결장, 간, 두경부, 및 담낭 세포 등의 암세포가 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 CLD18을 발현하는 세포가 관여하는 각종 질병을 앓고 있는 환자에게 상기 항체를 투여함으로써, 이러한 질병을 치료 및/또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 치료 (예를 들면, 완화) 또는 예방될 수 있는 예시적인 질병으로는 종양 형성 질병이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 이러한 종양 형성 질병의 예로는 위암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 직장결장암, 간암, 두경부암, 담낭암 및 이들 암의 전이가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 항체를 투여받는 개체는 화학 치료제, 방사선 또는 Fc 수용체, 예컨대 Fc-감마 수용체의 발현 또는 활성을 향상시키거나 억제시키는 등 조절하는 사이토킨 등의 제제로 더 치료받는다. 치료 동안에 투여되는 전형적인 사이토킨에는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다. 전형적인 치료제에는 그 중에서도 특히 독소루비신, 시스플라틴, 탁소테르, 5-플루오로우라실, 메토트렉재트, 겜지타빈 및 사이클로포스파미드 등의 항종양제가 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명은 인간 CLD18 또는 이의 펩티드 단편, 좋기로는 CLD18A2 또는 이의 펩티드 단편으로 마우스 등의 인간이 아닌 동물을 면역화하여 항체를 얻는 면역화 방법에 관한 것이다. 면역화를 위한 양호한 펩티드로는 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 16, 18, 20-23, 26-31, 151, 153, 및 155-157, 또는 이들 서열을 포함하는 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것들이 있다. 따라서, 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체로는 SEQ ID N0:2, 4, 6, 16, 18, 20-23, 26-31, 151, 153, 및 155-157로 이루어지는 군으로부터 선택된 펩티드를 사용하여, 또는 이들 서열을 포함하는 펩티드를 사용하여 면역화함으로써 얻어지는 것들이 있다. 유사하게, CLD18에 대한 항체는 트랜스제닉 마우스 등의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물에서 발생될 수 있다. 인간이 아닌 트랜스제닉 동물은 항체의 전부 또는 일부를 코딩하는 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 유전체를 가지는 트랜스제닉 마우스일 수 있다.
인간이 아닌 야생형 및 트랜스제닉 동물은 CLD18 항원의 정제 또는 농축 조제물 및/또는 핵산 및/또는 CLD18을 발현하는 세포 또는 이들의 펩티드 단편으로 면역화될 수 있다. 좋기로는, 상기 인간이 아닌 동물은 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭에 의하여, CLD18에 대한 인간 모노클로날 항체의 다양한 아이소타입 (예컨대, IgG, IgA 및/또는 IgM)을 생성할 수 있다. 아이소타입 스위칭은 예컨대, 전통적인 또는 비전통적인 아이소타입 스위칭에 의하여 일어날 수 있다.
따라서, 다른 한 가지 관점에 있어서, 본 발명은 전술한 바와 같은 인간이 아닌 동물로부터 분리된 B 세포를 제공한다. 분리된 B 세포는 본 발명의 항체의 급원 (예컨대, 하이브리도마)을 제공하기 위하여 불멸화 세포에 융합함으로써 불멸화처리될 수 있다. 이러한 하이브리도마 (즉, 본 발명의 항체를 생산하는 것)도 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 명세서에 예시된 바와 같은 본 발명의 항체는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 얻을 수 있으며, 또는 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포, 또는 림프구) 중에서 클로닝되어 재조합 발현될 수 있다. 숙주 세포의 다른 예로는 대장균 등의 미생물과, 효모 등의 균류가 있다. 또는 상기 항체들은 인간이 아닌 트랜스제닉 동물 또는 식물에서 재조합 생성될 수 있다.
본 발명의 항체 생성을 위한 양호한 하이브리도마 세포는 DSMZ (주소: Mascheroder Weg 1b, 31824 Braunschweig, Germany; 변경된 주소: Inhoffenstr. 7B, 31824 Braunschweig, Germany)에 다음의 수탁 번호 및 서열명으로서 기탁되어 있거나 서열이 결정된 것들이다.
a. 182-D1106-055, 수탁 번호: DSM ACC2737, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
b. 182-D1106-056, 수탁 번호: DSM ACC2738, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
c. 182-D1106-057, 수탁 번호: DSM ACC2739, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
d. 182-D1106-058, 수탁 번호: DSM ACC2740, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
e. 182-D1106-059, 수탁 번호: DSM ACC2741, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
f. 182-D1106-062, 수탁 번호: DSM ACC2742, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
g. 182-D1106-067, 수탁 번호: DSM ACC2743, 수탁년월일: 2005년 10월 19일
h. 182-D758-035, 수탁 번호: DSM ACC2745, 수탁년월일: 2005년 11월 17일
i. 182-D758-036, 수탁 번호: DSM ACC2746, 수탁년월일: 2005년 11월 17일
j. 182-D758-040, 수탁 번호: DSM ACC2747, 수탁년월일: 2005년 11월 17일
k. 182-D1106-061, 수탁 번호: DSM ACC2748, 수탁년월일: 2005년 11월 17일
l. 182-D1106-279, 수탁 번호: DSM ACC2808, 수탁년월일: 2006년 10월 26일
m. 182-D1106-294, 수탁 번호: DSM ACC2809, 수탁년월일: 2006년 10월 26일
n. 182-D1106-362, 수탁 번호: DSM ACC2810, 수탁년월일: 2006년 10월 26일.
본 발명의 양호한 항체는 전술한 바와 같은 하이브리도마로부터 생성되고 얻을 수 있는 것들인데, 즉, 182-D1106-055의 경우에는 37G11, 182-D1106-056의 경우에는 37H8, 182-D1106-057의 경우에는 38G5, 182-D1106-058의 경우에는 38H3, 182-D1106-059의 경우에는 39F11, 182-D1106-062의 경우에는 43A11, 182-D1106-067의 경우에는 61C2, 182-D758-035의 경우에는 26B5, 182-D758-036의 경우에는 26D12, 182-D758-040의 경우에는 28D10, 182-D1106-061의 경우에는 42E12, 182-D1106-279의 경우에는 125E1, 182-D1106-294의 경우에는 163E12, 182-D1106-362의 경우에는 175D10이 될 것이고, 이들의 키메라 형태 및 인간화 형태들도 포함된다.
양호한 실시 상태에 있어서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라된 형태에는 SEQ ID NO: 46 또는 150으로 나타내는 아미노산 또는 이들의 단편 등의 인간 중쇄 불변 영역에서 유래된 아미노산 서열을 비롯한 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 항체가 있다. 또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라된 형태에는 SEQ ID NO: 41 또는 148로 나타내는 아미노산 또는 이들의 단편 등의 인간 경쇄 불변 영역에서 유래된 아미노산 서열을 비롯한 경쇄 불변 영역 (CH)을 포함하는 항체가 있다. 또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 항체, 특히 본 발명에 따른 항체의 키메라된 형태에는 SEQ ID NO: 46 또는 150으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이들의 단편 등의 인간 CH에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 CH와, SEQ ID NO: 41 또는 148로 나타내는 아미노산 서열 또는 이들의 단편 등의 인간 CL에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 CL을 포함하는 항체가 있다.
SEQ ID NO: 46으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CH는 SEQ ID NO: 45로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 150으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CH는 SEQ ID NO: 149로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 41로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CL은 SEQ ID NO: 40으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 148로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 CL은 SEQ ID NO: 147로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다.
특정 양호한 실시 상태에 있어서, 항체의 키메라 형태로는 SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120 및 이들의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 및 이들의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 있다.
특정 양호한 실시 상태에 있어서, 항체의 키메라 형태에는 다음 (i) 내지 (ix)의 가능성으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄의 조합을 포함하는 항체가 포함된다.
(i) SEQ ID NO: 115로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 122로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(ii) SEQ ID NO: 116으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 121로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(iii) SEQ ID NO: 117로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 123으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(iv) SEQ ID NO: 119로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 126으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(v) SEQ ID NO: 118로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 125로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(vi) SEQ ID NO: 120으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 124로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(vii) SEQ ID NO: 120으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 127로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(viii) SEQ ID NO: 120으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 128로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄,
(ix) SEQ ID NO: 120으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄와, SEQ ID NO: 129로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄.
위에서 사용된 "단편" 또는 "아미노산 서열의 단편"은 항체 서열의 일부를 말하는 것인데, N-말단 및/또는 C-말단에서 짧아진 항체 서열로서, 상기 항체 서열 대신에 이들 단편이 치환되었을 때에 CLD18에 대한 항체의 결합능을 보유하고, 좋기로는 전술한 바와 같은 항체의 기능, 예컨대 CDC 매개 세포 용해 또는 ADCC 매개 세포 용해 기능을 보유하는 서열을 말하는 것이다. 좋기로는, 아미노산 서열의 단편은 상기 아미노산 서열로부터의 아미노산 잔기의 80% 이상, 좋기로는 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상을 포함한다. 아미노산 서열의 단편은 SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 및 129로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 좋기로는 N-말단에서의 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23개 아미노산이 제거된 아미노산 서열을 말하는 것이다. 전술한 아미노산 서열의 단편은 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 각 단편에 의하여 코딩될 수 있다.
SEQ ID NO: 115로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 100으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 116으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 101로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 117로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 102로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 119로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 104로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 118로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 103으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 120으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 SEQ ID NO: 105로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다.
SEQ ID NO: 122로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 107로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 121로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 106으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 123으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 108로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 126으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 111로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 125로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 110으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 124로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 109로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 127로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 112로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 128로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 113으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 129로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 SEQ ID NO: 114로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 132, 133, 134, 135, 136, 137 및 이들의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 SEQ ID NO: 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 및 이들의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다.
특정 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 (i) 내지 (ix)의 가능성으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL)의 조합을 포함한다.
(i) VH는 SEQ ID NO: 132로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 139로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(ii) VH는 SEQ ID NO: 133으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 138로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(iii) VH는 SEQ ID NO: 134로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 140으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(iv) VH는 SEQ ID NO: 136으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 143으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(v) VH는 SEQ ID NO: 135로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 142로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(vi) VH는 SEQ ID NO: 137로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 141로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(vii) VH는 SEQ ID NO: 137로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 144로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(viii) VH는 SEQ ID NO: 137로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 145로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하며,
(ix) VH는 SEQ ID NO: 137로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고, VL은 SEQ ID NO: 146으로 나타내는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
SEQ ID NO: 132로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 55로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 133으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 56으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 134로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 57로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 136으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 59로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 135로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 58로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 137로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VH는 SEQ ID NO: 60으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다.
SEQ ID NO: 139로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 62로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 138로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 61로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 140으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 63으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 143으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 66으로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 142로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 65로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 141로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 64로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 144로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 67로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 145로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 68로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다. SEQ ID NO: 146으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 VL은 SEQ ID NO: 69로 나타내는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의하여 코딩될 수 있다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 (i) 내지 (vi) 실시 상태로부터 선택되는 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VH를 포함한다.
(i) CDR1: SEQ ID NO: 115의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 115의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 115의 위치 116-125,
(ii) CDR1: SEQ ID NO: 116의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 116의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 116의 위치 116-126,
(iii) CDR1: SEQ ID NO: 117의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 117의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 117의 위치 116-124,
(iv) CDR1: SEQ ID NO: 118의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 118의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 118의 위치 116-126,
(v) CDR1: SEQ ID NO: 119의 위치 44-51, CDR2: SEQ ID NO: 119의 위치 69-76, CDR3: SEQ ID NO: 119의 위치 115-125,
(vi) CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 다음 (i) 내지 (ix) 실시 상태로부터 선택된 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 포함하는 VL을 포함한다.
(i) CDR1: SEQ ID NO: 121의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 121의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 121의 위치 115-123,
(ii) CDR1: SEQ ID NO: 122의 위치 49-53, CDR2: SEQ ID NO: 122의 위치 71-73, CDR3: SEQ ID NO: 122의 위치 110-118,
(iii) CDR1: SEQ ID NO: 123의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 123의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 123의 위치 109-117,
(iv) CDR1: SEQ ID NO: 124의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 124의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 124의 위치 115-123,
(v) CDR1: SEQ ID NO: 125의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 125의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 125의 위치 115-123,
(vi) CDR1: SEQ ID NO: 126의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 126의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 126의 위치 115-122,
(vii) CDR1: SEQ ID NO: 127의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 127의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 127의 위치 115-123,
(viii) CDR1: SEQ ID NO: 128의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 128의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 128의 위치 115-123,
(ix) CDR1: SEQ ID NO: 129의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 129의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 129의 위치 109-117.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 다음의 (i) 내지 (ix) 실시 상태로부터 선택된 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트를 각각 포함하는 VH 및 VL의 조합을 포함한다.
(i) VH: CDR1: SEQ ID NO: 115의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 115의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 115의 위치 116-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 122의 위치 49-53, CDR2: SEQ ID NO: 122의 위치 71-73, CDR3: SEQ ID NO: 122의 위치 110-118,
(ii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 116의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 116의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 116의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 121의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 121의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 121의 위치 115-123,
(iii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 117의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 117의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 117의 위치 116-124, VL: CDR1: SEQ ID NO: 123의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 123의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 123의 위치 109-117,
(iv) VH: CDR1: SEQ ID NO: 119의 위치 44-51, CDR2: SEQ ID NO: 119의 위치 69-76, CDR3: SEQ ID NO: 119의 위치 115-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 126의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 126의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 126의 위치 115-122,
(v) VH: CDR1: SEQ ID NO: 118의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 118의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 118의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 125의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 125의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 125의 위치 115-123,
(vi) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 124의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 124의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 124의 위치 115-123,
(vii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 127의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 127의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 127의 위치 115-123,
(viii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 128의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 128의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 128의 위치 115-123,
(ix) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 129의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 129의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 129의 위치 109-117.
또 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 좋기로는 1개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하고, 좋기로는 CLD18에 대한 모노클로날 항체, 졸기로는 본 명세서에 기재된 CLD18에 대한 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL)의 최소한 CDR3 가변 영역을 포함하고, 좋기로는 본 명세서에 기재된 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL)의 1개 이상의 상보성 결정 영역 (CDR), 좋기로는 최소한 CDR3 가변 영역을 포함한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 상보성 결정 영역 (CDR)의 1개 이상은 본 명세서에 기재된 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 세트로부터 선택된다. 구체적으로 양호한 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD18에 대한 모노클로날 항체, 좋기로는 본 명세서에 기재된 CLD18에 대한 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL)의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 좋기로는, 본 명세서에 기재된 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL)의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 1개 이상의 CDR, CDR의 세트, CDR 세트의 조합을 포함하는 항체는 상기 CDR들을 가운데에 삽입된 프레임워크 영역과 함께 포함한다. 좋기로는, 이 부분은 제1 및 제4의 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 양자의 적어도 약 50%를 포함하는데, 이 50%는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50%와, 제4의 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 재조합 DNA 기술에 의하여 제조한 본 발명의 항체의 구조화는 면역글로불린 중쇄, 기타의 가변 도메인 (예컨대, 다이아바디의 제조에서) 또는 단백질 표지를 비롯한 또다른 단백질 서열에 본 발명의 가변 영역을 결합하기 위하여 링커를 도입하는 것을 비롯하여, 클로닝 단계 또는 그 외의 조작 단계를 용이하게 하기 위하여 도입된 링커를 사용하여 코딩된 가변 영역에 N-말단 또는 C-말단 잔기를 도입하게 되는 결과를 초래할 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 명세서에 기재된 1개 이상의 CDR, CDR의 세트, CDR 세트의 조합을 포함하는 본 발명의 항체는, 인간 항체 프레임 워크 중에 상기 CDR들을 포함한다.
중쇄가 특정 쇄, 또는 특정 영역 또는 서열을 포함하는 항체라 함은, 좋기로는 상기 항체의 모든 중쇄가 상기 특정 쇄, 영역 또는 서열을 포함하는 상황을 말하고자 하는 것이다. 이것은 항체의 경쇄에 대해서도 적용된다.
본 발명은 항체 또는 이의 일부, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 쇄를 코딩하는 유전자 또는 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 이 핵산은 벡터 중에, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 또는 가령 통상적으로 유전자 조작에 사용되는 다른 벡터 중에 포함될 수 있다. 이 벡터는 적당한 숙주 세포 안에, 적당한 조건 하에 벡터를 선택하도록 해 주는 마커 유전자 등의 유전자를 더 포함할 수 있다. 더욱이, 이 벡터는 적당한 숙주 중에서 코딩 영역의 적당한 발현을 허용해 주는 발현 조절 인자를 포함할 수도 있다. 이러한 조절 인자는 숙련자들이 잘 알고 있으며, 프로모터, 스플라이스 카세트, 해독 개시 코돈 등이 있을 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 핵산은 진핵 세포 또는 원핵 세포 중에서의 발현을 허용하는 상기 발현 조절 서열에 작동적으로 부착된다. 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 발현을 허용하는 조절 인자는 이 기술 분야의 숙련자에게 익히 알려져 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 구조화 방법, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터의 구조화 방법, 적절히 선택된 숙주 세포로 벡터를 도입하는 방법, 발현을 유발시키거나 달성하는 방법은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 다른 관점은, 전술한 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 그린 형광체에 커플링시킨 CLD18A2를 사용하여 형질 감염시킨 후, 헬퍼 에피토프에 융합시킨 SEQ ID NO: 15를 사용하여 DNA 면역화한 후 마우스 혈청과 반응시킨 HEK293 세포의 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
도 2는, CLD18A2- myc (SEQ ID NO: 3)를 사용하여 형질 감염시킨 HEK293 세포와, 모노클로날 마우스-항-c-myc 항체 9E11를 사용하여 형질 감염시키지 않은 HEK293 세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다 (Serotec, CRL MCA2200).
도 3은, CLD18A2 및 폴리클로날 토끼-항-CLD18 항체 (Zymed, CRL 38-8000)를 사용하여 형질 감염시킨 CHO 세포를 사용한 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
도 4A 및 B는, 유세포 분석법 (flow cytometry)으로 측정한 인간 CLD18A2 및 형광 마커를 사용하여 일시적으로 형질 감염시킨 HEK293 세포에 대한 하이브리도마 상징액 24H5 및 85A3의 결합 결과를 나타낸다. 도 4C는 인간 CLD18A2로 안정하게 형질 감염시키고 프로피듐 아이오다이드로 반대 염색한 HEK293 세포에 대한 하이브리도마 상징액 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10의 결합 결과를 나타낸다.
도 5는 유세포 분석법으로 측정한, 형광 마커 및 인간 CLD18A2 또는 CLD18A2-Myc 또는 CLD18A2-HA로 일시적으로 형질 감염시킨 HEK293 세포에 대한 하이브리도마 상징액 24H5 (A), 9E8 (B), 26B5 (C) 및 19B9 (D)의 결합 결과를 나타낸다.
도 6A 및 B는 유세포 분석법으로 측정한, 인간 CLD18A2 또는 CLD18A1으로 안정하게 형질 감염시킨 HEK293 세포에 대한 하이브리도마 상징액 37H8, 43A11, 45C1 및 163E12에 대한 결합 결과를 나타낸다.
도 7은 네이티브 (A, B) 및 파라포름알데히드 고정 (C, D) 조건 하에서 각각 CLD18A2 (A, C) 및 CLD18A1 (B, D)로 형질 감염시킨 HEK293 세포를 염색함으로 인한 CLD18A2 아이소폼 특이적 모노클로날 항체 37G11의 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 네이티브 (A, B) 및 파라포름알데히드 고정 (C, D) 조건 하에서 각각 CLD18A2 (A, C) 및 CLD18A1 (B, D)로 형질 감염시킨 HEK293 세포를 염색함으로 인한 CLD18 모노클로날 항체 26B5의 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
도 9. 세포주 RT-PCR
CLD18A2-특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석 결과, 4/5 시험 세포주에서 분명한 발현이 관찰되었다.
도 10은 DAN-G 세포 (서브클론 F2) 및 폴리클로날 토끼-항-CLD18 항체 (Zymed, CRL 38-8000)의 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
도 11은 KATO-III 세포 (서브클론 3B9 4D5) 및 폴리클로날 토끼-항-CLD18 항체 (Zymed, CRL 38-8000)의 면역 형광 분석 결과를 나타낸다.
*도 12A는 폴리클로날 토끼-항-CLD18 항체 (Zymed, CRL 38-8000)와 함께 SNU-16 세포 (서브클론 G5)의 면역형광 분석 결과를 나타낸다. 도 12B는 본 발명의 모노클로날 항체를 사용한 KATO-III 세포의 면역형광 분석 결과를 나타낸다.
도 13은 모노클로날 항체 61C2 및 163E12로 세포를 염색한 다음에 유세포 분석법으로 분석한 KATO-III 및 NUGC-4 세포 상에서의 CLD18의 표면 발현을 나타낸다.
도 14는 인간 CLD18A1 (NP_057453), 인간 CLD18A2 (NP_001002026), 마우스 CLD18A1 (NP_062789) 및 마우스 CLD18A2 (AAL15636)의 단백질 정렬도이다.
도 15A 및 B는 유세포 분석법으로 분석한, 형광 마커 및 쥣과 CLD18A1 또는 쥣과 CLD18A2 중 어느 하나로 일시적으로 형질 감염시킨 HEK 293 세포에 대한 하이브리도마 상징액 38G5, 38H3, 37G11, 45C1, 및 163E12의 각각의 결합 결과를 나타낸다.
도 16. 폴리클로날 AB P105를 사용한 면역 조직 화학 검사 결과. 정상 조직의 세부 부류 (위, 폐, 골수 및 전립선)에 대한 면역 조직 화학 검사 결과는 위 조직에 대한 특이성을 확인해 주었다 (A). 발현은 위암종에서도 검출되었으며 (윗줄) 폐암종에서도 검출되었다 (B). 분화된 세포에서는 CLD18A2가 발현되었지만 줄기 세포에서는 발현되지 않았다 (C).
도 17. 모노클로날 AB 39F11D7을 사용한 면역 조직 화학 분석.
(A) 정상적인 위 점막에서는 특이적인 단백질 발현이 관찰된 반면, 기타의 시험된 모든 정상 조직에서는 발현이 나타나지 않았다.
(B) 위암종 및 폐암종에서 강한 CLD18A2 발현이 관찰되었다.
도 18. 모노클로날 AB 26B5 (A) 175D10 (B), 43A11 (C), 163E12 (D) 및 45C1 (E)을 사용한 면역 조직 화학 분석 결과. 모든 항체들은 HEK293-CLD18A2 이종이식편 종양 및 위암 표본의 강한 염색을 나타내었지만, HEK293-Mock 대조군으로 형질 감염시킨 종양에서는 그러하지 아니하였다.
도 19는 유세포 분석법을 사용하여, 인간 CLD18A2로 안정하게 형질 감염시킨 HEK293 세포에 대한 85A3, 28D10, 24H5, 또는 26D12에 의한 CDC의 유도 후 사멸한 세포의 %를 비교한 그래프이다.
도 20은 형광 측정법으로 측정하여, 인간 CLD18A2 또는 인간 CLD18A1 중 어느 하나로 안정하게 형질 감염시킨 접착 CHO 세포에 대한 24H5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 또는 61C2에 의하여 CDC가 유도된 후 특이적인 세포 용해의 %를 비교한 그래프이다.
도 21은 형광 측정법으로 측정한, 인간 CLD18A2로 안정하게 형질 감염시킨 CHO 세포에 대한 75B8 (A), 28D10 (B), 또는 37H8 (C)에 의한 CDC의 농도 의존적 유도를 나타낸다.
도 22는 MNC의 존재하에 각각 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, 및 61C2에 의한 HEK293-CLD18A2 세포의 용해를 나타낸다.
도 23은 MNC의 존재하에 각각 26B5, 37H8, 38G5, 47D12, 및 61C2에 의한 HEK293-CLD18A1 세포의 용해를 나타낸다.
도 24는 HEK293-CLD18A2 세포를 사용한 조기 치료 이종 이식편 모델에서 본 발명의 항체에 의한 종양 성장 억제를 나타낸다.
도 25A 및 B는 HEK293-CLD18A2 세포를 사용한 2개의 조기 치료 이종 이식편 모델에서 본 발명의 항체로 처리함으로 인한 생존율 연장을 나타낸다.
도 26은 HEK293-CLD18A2 세포를 사용한 어드밴스드 치료 이종 이식편 모델에서 본 발명의 항체로 인한 생존율 연장을 나타낸다.
도 27A는 조기 치료 이종 이식편 모델에서 본 발명의 항체로 인한 종양 성장 억제를 나타낸다. 도 27B는 조기 치료 이종 이식편 모델에서 본 발명의 항체로 인한 생존율 연장을 나타낸다. 내생적으로 CLD18A2를 발현하는 DAN-G 세포를 사용하였다.
도 28은 마우스 조직에서의 CLD18A2 mRNA 발현을 나타낸다. CLD18A2에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR 분석 결과, 모든 시험된 정상 조직에서는 위를 제외하고 상당한 발현이 나타나지 않았다. 다음과 같은 정상 조직을 분석하였다. 1: 소장, 2: 비장, 3: 피부, 4: 위, 5: 폐, 6: 췌장, 7: 림프절, 8: 흉선, 9: 음성 대조군.
도 29는 정상 위(胃)에서의 CLD18 발현을 나타낸다. 마우스 위의 CLD18 특이적인 항체를 사용한 면역 조직 화학 분석 결과는, 보존된 발현 패턴을 보여주었다. 외피 및 더 안쪽의 선와부 (crypts)에서는 세포 표면에서 CLD18를 발현한 반면에, 중심의 경부 (neck)에서는 CLD18이 발현되지 않았다.
도 30은 마우스 위 조직의 해마톡실린 및 에오신 염색 결과를 나타낸다. PBS 만으로 처리한 대조군 마우스 (C 및 D)에 대비한, 37G11로 처리된 마우스의 개괄도 (A) 및 세부도 (B)를 나타내고 있다.
도 31A 및 B는 인간 CLD18A1 및 A2 각각으로 안정하게 형질 감염시킨 HEK293 세포와 내생적으로 발현하는 KATO-III 세포의, 본 발명의 항체를 사용한 유세포 분석 염색 결과를 나타낸다 (43A11, 125E1, 163E12, 166E2, 및 175D10).
도 32는 본 발명의 키메라 항체에 의하여 매개되는 CLD18A2 발현 세포에 대한 CDC를 나타낸다.
도 33은 본 발명의 키메라 항체에 의하여 매개되는 KATO-III 세포에 대한 ADCC를 나타낸다.
도 34는 조기 치료 이종 이식편 모델에서 ch-175D1O 및 ch-163E12 키메라 항체를 사용하여 치료함으로 인한 생존율 연장을 나타낸다.
도 35는 어드밴스드 치료 이종 이식편 모델에서 키메라 항체 ch-175D10 및 ch-163E12로 치료함으로 인한 생존율 연장을 나타낸다.
도 36은 항체 ch-175D10 및 ch163E12을 사용한 에피토프 매핑 실험을 나타낸다. 변형시키지 않은 (윗줄, Cys-Ser 교환 없음) 또는 시스테인-세린 교환이 있는 (아랫줄, Cys-Ser 교환) CLD18A2의 제1 세포외 도메인의 아미노산 서열을 분석하였다.
도 37은 CLD18A2의 제1 세포외 도메인에 대한 3가지의 상이한 단백질 폴딩 (folding) 모델을 나타낸다.
도 38A, B 및 C는 유세포 분석으로 분석한, 형광 마커 및 쥣과 CLD18A1 / CLD18A2 또는 인간 CLD18A1 / CLD18A2로 일시적으로 형질 감염시킨 HEK293 세포에 대한 ch-175D10, ch-163E12 및 ch-125E1의 결합을 나타낸다. 형질 감염된 세포만을 분석하였고, 사멸한 세포는 PI 염색으로 분석하는 것에서 배제시켰다.
도 39는 1차 위종양 및 위암 전이에서의 고수준 CLD18A2 원형질막 발현을 나타낸다. 1차 위암 및 위암 전이 (크루켄베르크 종양 & 림프절)로부터 임의추출한 표본을 GC 182 특이적 토끼 항혈청으로 염색하였다. 면역 조직 화학 분석 및 염색 강도 평가 (음성, 약=1, 중=2, 강=3)와, 원형질막 염색을 나타내는 종양 세포의 비율 (0 내지 100%)를 전문적인 임상 병리학적 방법으로 수행하였다. 각 원은 독립적인 종양 표본을 나타낸다. 전이 표본에서 통계학적으로 유의하게 증가된 염색 강도가 관찰되었다 [p=0.034, 피셔 (Fisher) 시험].
본 발명에 기재되어 있는 항체는 CLD18에 존재하는 에피토프, 좋기로는 CLD18의 세포외 도메인 내에 위치한 에피토프, 특히 제1 세포외 도메인 내에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명에 포함되는 분리된 모노클로날 항체로는 IgA, IgG 1-4, IgE, IgM 및 IgD 항체가 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 항체는 IgG1 항체, 더욱 구체적으로는 IgG1, 카파 또는 IgG1, 람다 아이소타입이다. 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 항체는 IgG3 항체, 더욱 구체적으로는 IgG3, 카파 또는 IgG3, 람다 아이소타입이다. 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 항체는 IgG4 항체, 더욱 구체적으로는 IgG4, 카파 또는 IgG4, 람다 아이소타입이다. 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 항체는 IgA1 또는 IgA2 항체이다. 또 다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 이 항체는 IgM 항체이다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 CLD18을 발현하는 세포에 특이적으로 결합하고, 좋기로는 (i) CLD18A2를 발현하는 세포에 결합하며, (ii) CLD18A2를 발현하지 않으나 CLD18A1를 발현하는 세포에는 결합하지 않는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 좋기로는 (i) CLD18A2를 발현하는 세포의 사멸을 매개하고, (ii) CLD18A2를 발현하지 않으나 CLD18A1를 발현하는 세포의 사멸은 매개하지 않는다.
다른 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명은 (i) CLD18를 발현하는 종양 세포에 결합하고, (ii) 정상적인 위 점막의 CLD18 발현 세포에는 결합하지 않고, 그리고/또는 (iii) 비암 폐 조직의 CLD18 발현 조직에는 결합하지 않는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 (i) CLD18을 발현하는 종양 세포의 사멸을 매개하고, (ii) 정상 위 점막의 CLD18 발현 세포의 사멸은 매개하지 않으며, 그리고/또는 (iii) 비암 폐 조직의 CLD18 발현 세포의 사멸은 매개하지 않는 항체도 포함한다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 (i) CLD18A1에는 존재하지 않는 CLD18A2 상의 에피토프, 좋기로는 SEQ ID NO: 21, 22 및 23에는 결합하고, (ii) CLD18A2-루프1에 위치한 에피토프, 좋기로는 SEQ ID NO: 28에 결합하며, (iii) CLD18A2-루프2에 존재하는 에피토프, 좋기로는 SEQ ID NO: 30에 결합하고, (iv) CLD18A2-루프D3에 존재하는 에피토프, 좋기로는 SEQ ID NO: 31에 결합하며, (v) CLD18A2-루프1 및 CLD18A2-루프D3를 포함하는 에피토프에 결합하고, (vi) CLD18A2-루프D3에 존재하는 비글리코실화 에피토프, 좋기로는 SEQ ID NO: 29에 결합하며, 또는 (vii) 인간 및 마우스 CLD18에 존재하는 에피토프 (각각 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37)에 결합한다.
특히 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD18A1에 존재하지 않는 CLD18A2 상의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체는 완전한 인간의 항체를 포함한다. 이러한 항체는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭을 겪음으로써 CLD18에 대한 인간 모노클로날 항체의 다양한 아이소타입을 생성할 수 있는, 인간이 아닌 트랜스제닉 동물, 예컨대 트랜스제닉 마우스에서 생성될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 동물은 US 2003/0017534에 기재되어 있는 바와 같은 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 트랜스제닉 토끼일 수 있다.
CLD18 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합은 CLD18를 발현하는 세포 (예컨대, 종양 세포)의 사멸을 예컨대, 보체 시스템을 활성화함으로써 매개할 수 있다. CLD18을 발현하는 세포의 사멸은 다음 기작, 즉 CLD18을 발현하는 세포의 보체 의존성 세포 독성 (CDC)과, CLD18을 발현하는 세포의 세포 자멸, CLD18을 발현하는 세포의 이펙터 세포 식세포 작용, 또는 CLD18을 발현하는 세포의 이펙터 세포 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC) 중 1가지 이상에 의하여 발생할 수 있다.
본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 정의하기로 한다. 그 외의 용어의 정의들은 본 명세서 전반에 기재되어 있다.
용어 정의
"CLD18"이라는 용어는 claudin-18을 나타내는 것으로서, 이 용어에는 세포에 의하여 천연 발현되거나, CLD18 유전자로 형질 감염된 세포에 의하여 발현되는 CLD18A1 및 CLD18A2를 비롯한 CLD18의 변이체, 입체 배열, 아이소폼 및 종유사체가 포함된다. 좋기로는, "CLD18"은 인간 CLD18, 특히 인간 CLD18A2 및/또는 인간 CLD18A1, 더 좋기로는 인간 CLD18A2를 말하는 것이다. 인간 CLD18A2에는 (i) SEQ ID NO: 1의 핵산 서열을 포함하는 핵산 등의 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산, 또는 (ii) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과, 세포에 의하여 천연 발현되거나, CLD18A2 유전자로 형질 감염시킨 세포에 의하여 발현되는 이의 변이체, 입체 배열, 아이소폼 및 종유사체를 말하는 것이다. 인간 CLD18A1은 좋기로는 (i) SEQ ID NO: 7의 핵산 서열을 포함하는 핵산 등의 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산, 또는 (ii) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과, 세포에 의하여 천연 발현되거나, CLD18A1 유전자로 형질 감염시킨 세포에 의하여 발현되는 이의 변이체, 입체 배열, 아이소폼 및 종유사체를 말하는 것이다.
"CLD18의 변이체"는 CLD18의 세포외 도메인 또는 엑토도메인으로 본질적으로 이루어지는 CLD18의 형태를 포함한다. CLD18의 "세포외 도메인" 또는 "엑토도메인"이란 막통과 도메인 및 세포질 도메인이 실질적으로 존재하지 않는 CLD18 폴리펩티드의 형태를 말한다. 본 발명의 CLD18 폴리펩티드로 확인된 막통과 도메인은 소수성 도메인 타입을 확인하기 위하여 이 기술 분야에서 흔히 사용되는 범주에 따라서 확인된다는 것은 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 막통과 도메인의 정확한 경계는 다양하지만, 대부분 본 명세서에서 최초로 확인된 도메인의 어느 한 쪽에 있는 약 5개의 아미노산 이하가 대부분이다. 그러므로, 임의로는 CLD18 폴리펩티드의 세포외 도메인은 실시예 또는 명세서에서 확인된 바와 같은 막통과 도메인/세포외 도메인 경계의 어느 한쪽에서 관련 시그널 펩티드를 함유하거나 함유하지 않으면서 약 5개 이하의 아미노산을 함유할 수 있으며, 이를 코딩하는 핵산도 본 발명에 포함된다.
"CLD18 변이체"라는 용어는 (i) CLD18 스플라이스 변이체, (ii) CLD18의 해독후 변형 변이체, 특히 N-글리코실화 상태가 상이한 변이체, (iii) CLD18-conformation-1, CLD18-conformation-2 및 CLD18-conformation-3를 비롯한 입체 배열 변이체, (iv) 세포간 타이트 정션에 위치한 CLD18 프리 (free) 및 호모타입/헤테로타입 관련 변이체, (v) CLD18 암 관련 및 CLD18 비암 관련 변이체를 포함하려는 것이다.
"래프트 (raft)"라는 용어는 세포의 원형질막의 외부 리플렛 (leaflet)에 위치한 스핑고리피드 및 콜레스테롤 풍부 막 마이크로도메인을 말한다. 어떠한 단백질이 이러한 도메인 내에서 회합되는 능력과 "집합체 (aggregate)" 또는 "포컬 (focal) 집합체"를 형성하는 능력은 단백질의 기능에 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체에 의하여 결합된 이후 이러한 구조체에 CLD18 분자가 이동되면, 원형질막 중에 고밀도 CLD18 항원-항체 복합체를 생성시킨다. 이러한 고밀도 CLD18 항원-항체 복합체는 CDC 동안에 보체계가 효율적으로 활성화될 수 있도록 하여 준다.
"입체 배열 (conformation)" 및 "위상 (topology)"이라는 용어는 인티그랄 막 분자가 어떻게 세포 표면 막에 배치되는지를 설명하여 주며, 특히 세포외 부분에서 어떻게 배치됨으로써 항체가 적합한지를 설명하여 준다. 예컨대 CLD18은 세 가지 상이한 입체 배열로 존재할 수 있는데, 이는 호모머인지 또는 헤테로머인지와, 그리고 초분자 타이트 정션 구조체로 막에 통합되는지 또는 "프리" 형태인지에 따라 대부분 좌우된다. 이와 같은 상이한 상태로 인해, 항체가 적합한 형태의 에피토프가 만들어진다.
본 발명에 따르면, "질병"이라는 용어는 암, 특히 본 명세서에 기재된 형태의 암을 비롯한 병리학적 상태를 일컫는다. 암 및 암의 특정 형태로서 암의 전이도 포함된다.
"종양"이란 새로운 성장을 멈추게 하는 자극이 있은 후에도 계속 신속하고 비제어적인 방식으로 세포 증식을 함으로써 성장하는 세포 또는 조직의 비정상적인 군을 의미한다. 종양은 정상적인 조직과의 사이에서의 구조적 조직화 및 기능적 조화가 부분적으로 또는 완전히 부재하는 것을 나타내며, 보통 양성 또는 악성일 수 있는 특유의 조직 덩어리를 형성한다.
"전이"란 신체 어느 한 부위에서 다른 부위로 암 세포가 퍼지는 것을 말한다. 전이 형성은 매우 복잡한 과정이고, 1차 종양으로부터 악성 세포가 떨어져서, 세포외 기질을 침입한 후, 내피 기저막을 뚫고 체강 및 혈관 등에 유입된 다음, 혈관을 타고 이동하여 표적 기관에 들어가게 되는 것에 따라 좌우된다. 최종적으로, 표적 부위에서 새로운 종양이 성장하는 것은 혈관 신생에 의하여 좌우된다. 종양 전이는 종양 세포 또는 성분이 남아서 전이 상태로 발전될 수 있기 때문에, 1차 종양을 제거한 후에도 일어나는 경우가 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 1차 종양 및 지역적 림프절계로부터 떨어져 있는 전이인 "원거리 전이"를 말하는 것이다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 "전이"라는 용어는 림프절 전이를 말하는 것이다. 본 발명의 항체를 사용하여 치료 가능한 전이의 구체적인 형태는 1차 부위로서 위암으로부터 유래되는 전이이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 이러한 위암 전이는 크루켄베르크 종양, 복막 전이 및/또는 림프절 전이이다.
크루켄베르크 종양은 전체 종양의 1% 내지 2%를 차지하는 흔하지 않은 난소에 전이된 종양이다. 크루켄베르크 종양의 예후는 여전히 매우 양호하지 못하고, 크루켄베르크 종양에 대한 확립된 치료 방법은 없다. 크루켄베르크 종양은 난소의 전이성 시그넷 링 세포 선암종 (metastatic signet ring cell adenocarcinoma)이다. 위는 대부분의 크루켄베르크 종양 사례 (70%)에 있어서 1차 부위이다. 결장, 충수 및 유방 (주로 침습성 소엽 암종) 암종이 그 다음으로 흔한 1차 부위이다. 흔하지 않은 사례지만, 담낭, 담즙선, 췌장, 소장, 바터 평대부 (ampulla of Vater), 자궁 경부 및 방광/요도의 암종에서 유래된 크루켄베르크 종양도 보고되어 있다. 1차 암종으로 진단 받고 난소에 전이되는 것을 발견하기 까지의 시간 간격은 보통 6개월 이하이지만, 더욱 긴 사례도 보고된 바 있다. 다수의 사례에 있어서, 1차 종양은 매우 소형이고 검출되지 않을 수 있다. 위 또는 다른 기관에서 암종이 존재하였던 병력이 있는 것은 모든 사례 중 20 내지 30%에 불과하다.
크루켄베르크 종양은 암의 선택적인 스프레드의 일례인데, 대부분 위-난소 방향으로 일어난다. 이러한 종양 스프레드의 방향은 다수의 병리학자의 주의를 끌었는데, 특히 다른 조직이 관여되지 않고 난소에만 선택적으로 이 종양이 전이된다는 것을 발견하였을 때 더 그러하였다. 난소에 위암종이 전이되는 경로는 장기간 수수께끼로 남아 있었지만, 레트로그레이드 (retrograde) 림프 전이가 가장 유력한 전이 경로라는 것이 지금은 증명되어 있다.
크루켄베르크 종양에 걸린 여성은 평균 연령 45세인데, 전이 암종에 걸리는 환자가 보통 50대라는 점에서, 흔하지 않게도 연령층이 젊은 경향이 있다. 이러한 연령 분포는 젊은 여성에서 위 시그넷 링 세포 암종의 증가된 경향과 일부 관련되어 있을 수 있다. 보통 나타나는 징후는 난소에 전이되는 것이고, 이 중 가장 흔하게는 복통 및 복부 팽만감 (주로 좌우 양측에 있고, 보통은 대형 난소 크기)이 있다. 그 외의 환자들은 비특이적인 위장 징후를 보이거나, 징후가 없다. 덧붙이면, 크루켄베르크 종양은 난소 스트로마 (stroma)에 의한 호르몬 생성에서 유래된 남성화 (virilization)와 관련되어 있는 것으로 보고되어 있다. 복수가 차는 것은 사례의 50%에서 나타나고, 보통 악성 세포를 나타내었다.
크루켄베르크 종양은 보고된 사례 중 80% 이상에서 양쪽 난소에서 발생한다. 난소는 보통 비대칭형으로 확대되어 있고 둥근 자갈 모양 (bosselated) 윤곽이다. 횡단면은 황색 또는 백색이고, 보통 고형이며 가끔 포낭이 있는 형태이다. 중요한 것은 크루켄베르크 종양에 걸린 난소의 캡슐 표면은 보통 매끄럽고 접착부 또는 복막 침착물이 없다는 점이다. 난소에 전이된 다른 부류의 종양은 표면 이식물과 회합되는 경향이 있기 때문이다. 이는 크루켄베르크 종양의 전체 형태가 왜 1차 난소 종양으로 오진되는지를 설명해 줄 수 있다. 그러나, 크루켄베르크 종양이 양쪽 난소에서 발생하는 점은 이의 전이 성질과 연관되어 있다.
크루켄베르크 종양에 걸린 환자들은 유의하게 높은 전반적 치사율을 보인다. 대부분의 환자는 2년 이내에 사망한다 (중간 생존율 14개월). 몇몇 연구들은 난소로의 전이가 발견된 후 1차 종양이 발견되었을 때는 예후가 좋지 않고, 1차 종양이 잠복 상태로 남아 있는 경우 예후는 나빠진다는 것을 증명하였다.
크루켄베르크 종양에 대한 최적의 치료 방법은 아직까지 문헌에서 확실히 수립되지 못했다. 외과적 절제술이 수행되어야 하는지에 대하여 적절히 다루어지지 않았다. 화학 치료 또는 방사선 치료는 크루켄베르크 종양에 걸린 환자의 예후에 대하여 유의한 효과를 보이지 못하였다.
"질병의 치료"라는 용어는 질병 또는 이의 징후의 치료, 기간 단축, 완화, 예방, 진행 또는 악화의 늦춤 또는 억제, 또는 시작의 예방 또는 지연을 포함하는 용어이다.
본 발명에 따르면, 시료는 본 발명에 따라 유용한 임의의 시료일 수 있으며, 특히 체액 및/또는 세포 시료를 비롯하여 조직 시료 등의 생물학적 시료일 수 있으며, 천공 생검법 및 채혈, 기관지 흡입, 가래, 소변, 대변 또는 기타 체액을 비롯한 조직 생검법 등의 통상적인 방식으로 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, "생물학적 시료"라는 용어는 생물학적 시료의 분획도 포함한다.
"항체"라는 용어는 이황화 결합에 의하여 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H)와, 2개의 경쇄 (L), 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 당단백질을 말한다. "항체"라는 용어에는 항체, 특히 본 명세서에 설명된 항체의 모든 재조합 형태가 포함되는데, 예컨대 원핵 세포에서 발현된 항체, 글리코실화되지 않은 항체와, 아래에 설명하는 바와 같은 임의의 항원 결합 항체 단편과 유도체가 포함된다. 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH로 약칭)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변영역 (VL로 약칭)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. VH와 VL 영역은 그들의 다양성에 따라 더욱 세부적으로 세분될 수 있는데, 이를 상보성 결정 부분 (CDR)이라고 하며, 더 보존된 영역, 즉 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 부분이 사이에 삽입되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지는데, 아미노 말단에서 카르복시 말단은 다음 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호 작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 각종 세포 (예컨대, 이펙터 세포)와, 전통적인 보체계의 제1 성분 (C1q)를 비롯하여 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린이 결합하는 것을 매개할 수 있다.
"인간화된 항체"라는 용어는 인간이 아닌 종으로부터의 면역글로불린에서 실질적으로 유래한 항원 결합 자리를 갖는 분자를 말하는 것으로서, 여기서 분자 중 그 외의 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한다. 항원 결합 자리는 불변부 도메인 위에 융합된 완전한 가변부 도메인을 포함하거나, 가변부 도메인 내의 적당한 프레임워크 영역에 그래프트된 상보성 결정 영역 (CDR)만 포함할 수도 있다. 항원 결합 자리는 야생형 또는, 1개 이상의 아미노산 치환에 의하여 변형된 것, 예컨대 인간의 면역글로불린에 더욱 가깝게 변형된 것일 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열을 보존한다 (예컨대, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 형태는 오리지날 항체에 대해 변경된 1개 이상의 CDR을 가진다.
"키메라 항체"라는 용어는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 각 서열의 일부가 특정 부류에 속하는 또는 특정 종에서 유래된 항체의 해당 영역과 상동성이지만, 쇄의 나머지 부분은 다른 것의 해당 서열에 상동성인 항체를 말한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 통상적으로 다른 포유류 종에서 유래한 항체의 가변 영역을 모사하지만, 불변 영역은 다른 것에서 유래한 항체의 서열에 상동성이다. 이러한 키메라 항체의 뚜렷한 장점은, 가변 영역은 가령, 인간 세포 조제물에서 유래한 불변 영역과 조합하여 인간이 아닌 숙주 개체로부터 용이하게 사용 가능한 B-세포나 하이브리도마를 사용하여 기지의 급원으로부터 용이하게 유래할 수 있다는 점이다. 가변 영역은 조제가 쉽다는 장점이 있고, 다른 급원에 의하여 특이성이 영향을 받지 않는다는 장점이 있지만, 인간 불변 영역은 항체가 주사되었을 때 인간이 아닌 급원으로부터의 불변부보다 더 인간 개체로부터 면역 반응을 잘 일으키지 못한다. 그러나, 이 정의는 특정한 예에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 (또는 간단히 "결합부")는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여도 수행될 수 있는 것이 밝혀졌다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어지는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의하여 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어지는 Fd 단편, (iv) 항체의 한쪽 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 합성 링커에 의하여 임의로 연결될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합이 있다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의하여 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄 (단일쇄 Fv (scFv)로도 알려져 있음; 예컨대, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 참조)로서 만들어지도록 하는 합성 링커에 의하여, 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 역시 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 것이다. 다른 예로는, (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 힌지 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합되는 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합 도메인 면역 글로불린 융합 단백질이 있다. 결합 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역일 수 있다. 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에도 자세히 설명되어 있다. 이들 항체 단편들은 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려져 있는 통상의 기술을 사용하여 얻을 수 있고, 이들 단편들은 완전한 항체에서와 동일한 방식으로 용도에 따라 스크리닝된다.
"에피토프"라는 용어는 항체에 결합할 수 있는 단백질 결정부를 의미하고, 여기서 "결합"이라는 용어는 좋기로는 특이적인 결합을 말하는 것이다. 에피토프는 보통 아미노산이나 당 측쇄 등의 분자의 화학적으로 활성인 표면의 짝짓기 (grouping) 이루어지고, 보통 3차원 구조적 특징을 가지며, 특이적인 전하의 특징을 가진다. 입체 배열 에피토프와 비입체 배열 (non-conformational) 에피토프는 변성 (denaturing) 용매 존재하에서 전자는 결합하지만 후자는 결합하지 않는다는 점에서 구분된다.
본 명세서에 사용된 "비연속적 에피토프"라는 용어는 단백질의 1차 서열 중에 2개 이상의 구분되는 영역으로부터 형성된 단백질 항원 상의 입체 배열적 에피토프를 말한다.
"이중 특이적 분자"라는 용어에는, 예컨대 2가지 상이한 결합 특이성이 있는 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체 등의 여하한 제제가 포함된다. 예를 들면, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면 위에 있는 Fc 수용체에 결합하거나, 또는 이들과 상호 작용할 수 있다. "다중 특이적 분자" 또는 또는 "이중 특이적 분자"라는 용어는 2가지 이상의 상이한 결합 특이성을 갖는 예컨대 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체 등의 여하한 제제를 말하고자 하는 것이다. 예를 들면, 이 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면 위에 있는 Fc 수용체, (c) 한 개 이상의 다른 성분에 결합하거나, 이들과 상호 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명에는 CLD18과, 기타의 표적, 예컨대 이펙터 세포 상의 Fc 수용체 등에 관한 2중 특이적, 3중 특이적, 4중 특이적 및 기타의 다중 특이적 분자가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. "이중 특이적 항체"라는 용어는 다이아바디 (Diabody)도 역시 포함하는 것이다. 다이아바디는 VH와 VL 도메인이 단일 폴리펩티드쇄에서 발현되지만, 동일한 쇄 위에 있는 두 개의 도메인 간의 페어링을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 짓도록 하여 두개의 항원 결합 자리를 만들어 내는 2가의 2중 특이적 항체를 말한다 (참조: 예컨대, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 항체의 유도체도 포함한다. "항체 유도체"라는 용어는 항체의 컨쥬게이트 및 기타 제제 또는 기타 항체와 같은 항체의 변형된 형태를 말하는 것이다. 본 명세서에 사용된 항체는, 항체가 동물을 면역화함으로써 또는 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 시스템으로부터 얻어진 경우 특정 생식 계열 (germline) 서열"로부터 유래되며", 여기서 선택된 항체는 생식 계열 면역글로불린 유전자에 의하여 코딩된 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%, 더욱 좋기로는 적어도 95%, 더욱 더 좋기로는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 보통 특정 생식 계열 서열로부터 유래된 항체는 생식 계열 면역 글로불린 유전자에 의하여 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산이 상이하고, 더욱 좋기로는, 5개 이하의 아미노산이 상이하며, 더욱 더 좋기로는, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 아미노산이 상이하게 된다.
본 명세서에 사용된 "이종 항체 (heteroantibodies)"라는 용어는 특이성이 상이한 2개 이상의 항체, 이의 유도체, 또는 항원 결합 영역이 서로 연결된 것을 말한다. 이들 상이한 특이성에는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성과, 예컨대 종양 세포와 같은 표적 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성이 포함된다.
본 명세서에 기재되어 있는 항체는 인간 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "인간 항체"라는 용어는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변영역과 불변 영역을 가지는 항체를 포함시키고자 하는 것이다. 본 발명의 인간 항체에는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에 의하여 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관내에서 랜덤 또는 자리 특이적 돌연변이 발생법에 의하여 도입된 돌연변이, 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의하여 도입된 돌연변이)도 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 조제물을 말하는 것이다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 보인다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된, 인간이 아닌 동물, 가령 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의하여 생성된다.
본 명세서에 사용된 "재조합 항체"라는 용어는 (a) 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 관해 트랜스진이거나 트랜스염색체인 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예컨대 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합 복합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, (d) 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 기타 수단에 의하여 제조되고, 발현되고, 생성되었거나 단리된 항체 등의, 재조합 수단을 사용하여 제조되고, 발현되고, 생성되었거나 단리된 모든 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "트랜스펙토마 (transfectoma)"라는 용어는 CHO 세포, NS/O 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 비롯한 균류 등의 항체를 발현하는 재조합 진핵 생물 숙주 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "이종 항체"라는 용어는 항체 등을 생성하는 트랜스제닉 생물에 관하여 정의하는 것이다. 이 용어는 트랜스제닉 생물을 구성하지 않는 생물에서 발견되는 것에 해당하는 핵산 서열을 코딩하거나 아미노산 서열을 갖는 항체를 말하는 것이며, 트랜스제닉 생물 이외의 종으로부터 일반적으로 유래된 것을 말한다.
본 명세서에 사용된 "이종하이브리드 항체"라는 용어는 기원이 서로 다른 경쇄와 중쇄를 갖는 항체를 말하는 것이다. 예컨대, 쥣과 경쇄와 회합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 이종하이브리드 항체이다.
본 명세서에 기재된 항체는 단리된 것이 좋다. 본 명세서에 사용된 "단리된 항체"라는 용어는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 말하려는 것이다 (예컨대, CLD18에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 CLD18 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는 것). 그러나, 인간 CLD18의 아이소폼이거나 변이체인 에피토프에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종 (예컨대, CLD18 종 상동체)으로부터의 다른 관련 항원에 교차 반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포성 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, "단리된" 모노클로날 항체의 배합물은 특이성이 상이하고, 잘 정의되어 있는 조성물과 배합된 항체를 말하는 것이다.
본 발명에 따르면, "결합"이라는 용어는 좋기로는 "특이적인 결합"을 말하는 것이다. 본 명세서에 사용된 "특이적인 결합"이라는 용어는 기지의 항원에 결합하는 항체를 말한다. 보통, 항체는 약 1x 10-7M 이하의 KD에 해당하는 친화도로 결합하고, 기지 항원 또는 밀접하게 관련된 항원 이외의 비특이적인 항체 (예컨대, BSA, 카세인)에 결합하는 것에 대한 친화도보다는 최소한 두 자리 더 낮은 KD에 해당하는 친화도로 항원과 결합한다.
본 명세서에 사용된 "KD" (M)이라는 용어는 특정 항체-항원 상호 작용의 평형 해리 상수를 말하고자 하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "아이소타입"이라는 용어는 중쇄 불변 영역 유전자에 의하여 코딩되는 항체 부류 (예컨대, IgM 또는 IgG1)를 말한다.
본 명세서에 사용된 "아이소타입 스위칭"이라는 용어는 한 종류의 Ig에서 다른 종류의 Ig로 항체의 종류 또는 아이소타입이 변화하는 현상을 말한다.
본 명세서에 사용된 "천연 발생"이라는 용어는 해당 객체가 천연 상태에서 발견될 수 있다는 사실을 말할 때 그 개체에게 적용하는 말이다. 예컨대, 천연 상태에서 단리될 수 있는 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 실험실에서 인간이 의도적으로 변형시키지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 발생한 것이다.
본 명세서에 사용된 "재배열된"이라는 용어는 각각 완전한 VH 또는 VL을 필수적으로 코딩하는 입체 배열로 D-J 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 V 세그먼트가 배치되는 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 좌위의 배열을 말하는 것이다. 재배열된 면역글로불린 (항체) 유전자 좌위는 생식 계열 DNA와 비교함으로써 확인할 수 있고, 재배열된 좌위는 1종 이상의 재조합 헵타머/노나머 상동성 요소를 가지게 된다.
V 세그먼트와 관련하여 본 명세서에 사용된 "재배열되지 않은" 또는 "생식 계열 배열"이라는 용어는 V 세그먼트가 D 또는 J 세그먼트에 바로 인접하여 재조합되지 않는 배열을 말한다.
본 명세서에 사용된 "핵산 분자"라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하려는 것이다. 핵산 분자는 단일 스트랜드 또는 이중 스트랜드일 수 있지만, 좋기로는 이중 스트랜드 DNA이다.
본 발명에 기재된 핵산은 좋기로는 단리된 것이다. 본 발명에 따르면, "단리된 핵산"이라는 용어는 핵산이 (i) 시험관내에서, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의하여 증폭되고, (ii) 클로닝에 의하여 재조합 생성되고, (iii) 절단 및 겔-전기 영동 분획화에 의하여 정제되거나, (iv) 예컨대 화학 합성법에 의하여 합성된다는 것을 말한다. 단리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의하여 조작될 수 있는 핵산을 말한다.
본 발명에 따르면, 핵산은 상동성이거나 이종성일 수 있는 다른 핵산과 조합하여, 또는 단독으로 존재할 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 핵산은 상기 핵산에 대해 상동성이거나 이종성일 수 있는 발현 조절 서열과 기능적으로 연결된다. "상동성 (homologous)"이라는 용어는 핵산이 천연적으로 발현 조절 서열에 기능적으로 연결되는 것을 말하고, "이종성 (heterologous)"이라는 용어는 천연적으로 발현 조절 서열에 기능적으로 연결되지 않는 것을 말한다.
RNA 및/또는 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 핵산 등이 상기 핵산의 발현 또는 전사가 상기 발현 조절 서열의 영향을 받거나 이의 조절하에 있도록 하는 방식으로 발현 조절 서열과 공유 결합되는 경우에, 상기 핵산과 발현 조절 서열은 서로 "기능적으로" 연결된다고 한다. 핵산이 기능적인 단백질로 해독된 경우에는, 코딩 서열에 발현 조절 서열이 기능적으로 연결되고, 이 발현 조절 서열이 유도되면, 소망하는 단백질 또는 펩티드로 해독되지 않는다거나 코딩 서열 또는 코딩 서열에서의 프레임 쉬프트를 유발시키는 일이 없이, 핵산을 전사시키는 것을 유도한다.
"발현 조절 서열"이라는 용어는 본 발명에 따르면 프로모터, 리보좀 결합 자리, 인핸서 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 해독을 조절하는 다른 조절 인자를 포함한다. 본 발명의 특정한 실시 상태에 있어서, 발현 조절 서열은 조절될 수 있다. 발현 조절 서열의 정확한 구조는 종 타입이나 세포 타입에 따라 다양해질 수 있지만, 전사 및 해독의 개시에 관여하는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비해독 서열, 즉, 각각 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열 등을 일반적으로 포함한다. 더욱 구체적으로는, 5'-비전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 조절 서열은 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, "프로모터" 또는 "프로모터 영역"은 발현될 핵산 서열의 상류 (5')에 위치하여, RNA 폴리머라아제에 대한 인식 및 결합 자리를 제공함으로써 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 말하는 것이다. "프로모터 영역"은 유전자의 전사 조절에 관여하는 추가의 인자에 대한 인식 및 결합 자리도 더 제공할 수 있다. 프로모터는 원핵세포 유전자 또는 진핵세포 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 더욱이, 프로모터는 "유도성"일 수 있고, 유도제에 대한 응답으로 전사를 개시시킬 수 있거나, 전사가 유도제에 의하여 조절되지 않는 경우에는 "구조적 (constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터의 조절 하에 있는 유전자는 유도제가 부재하는 경우에 발현되지 않거나, 소량만 발현된다. 유도제의 존재시, 유전자는 활성화 상태로 스위치되거나, 전사되는 양이 증가된다. 이는 일반적으로 특정한 전사 인자가 결합함으로써 매개된다.
본 발명에 따라 양호한 프로모터는 SP6, T3 및 T7 폴리머라아제, 인간 U6 RNA 프로모터, CMV 프로모터 및 이의 인공 하이브리드 프로모터 (예를 들어, CMV)가 있다. 인공 하이브리드 프로모터는 예컨대 이들 프로모터의 일부 또는 일부들이 인간 GAPDH (글리세르알데하이드-3 -포스페이트 데하이드로게나아제) 등의 다른 세포 단백질의 유전자의 프로모터의 일부 또는 일부들에 융합되고, 추가의 인트론을 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명에 따르면, "발현"이라는 용어는 가장 일반적인 의미로 사용되고, RNA 또는 RNA 단백질/펩티드의 생산을 포함하는 용어이다. 이는 핵산의 부분적인 발현을 포함한다. 더욱이, 발현은 일시적으로 또는 안정적으로 수행될 수 있다.
양호한 실시 상태에 있어서, 핵산 분자는 본 발명에 따르면 벡터 내에 존재하고, 적절한 경우 이 벡터에는 핵산의 발현을 조절하는 프로모터가 있다. 본 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 가장 일반적인 의미로 사용되는 것이고, 상기 핵산을, 예컨대, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포로 도입되게 하고, 적당한 경우에는 게놈으로 도입되게 하는 핵산에 대한 매개 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 좋기로는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터에는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈이 있다. 본 명세서에 사용된 "플라스미드"라는 용어는 일반적으로는 염색체외 유전 물질의 구조체를 말하는 것이고, 보통은 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 환형 DNA 듀플렉스를 말한다.
항체 발현 벡터로서, 항체의 중쇄 및 경쇄가 상이한 벡터 중에 존재하는 벡터 타입이거나, 또는 중쇄 및 경쇄가 동일한 벡터 중에 존재할 수 있는 벡터 타입인 벡터 타입을 사용할 수 있다.
특정 핵산 및 아미노산 서열과 관련하여 본 명세서에 교시된 것, 예컨대 서열 목록에 제시된 것들은 특정 서열과 기능적으로 등가물인, 예컨대 특정 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 성질을 보이는 아미노산 서열과, 특정 핵산 서열에 의하여 코딩된 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 성질을 보이는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 등의 서열을 생성시키는 상기 특정 서열에서의 변형인 것으로 해석된다. 한 가지 중요한 특성은 항체의 이펙터 기능을 유지하도록 또는 표적에 대한 항체의 결합을 유지하도록 하는 것이다. 좋기로는, 항체에서 특정 서열이 치환되었을 때 특정 서열에 관해 변형된 서열은 CLD18에 대한 상기 항체의 결합을 유지하며, 좋기로는 본 명세서에 기재된 상기 항체의 기능, 예를 들어, CDC 매개 용해 작용이나 ADCC 매개 용해 작용을 유지한다.
특히 CDR의 서열의 과가변 영역 및 가변 영역은 CLD18에 결합하는 능력을 손실하는 일이 없이 변형될 수 있다는 점은 이 기술 분야의 숙련자들이 잘 알고 있을 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본 명세서에 기재된 항체의 영역과 동일하거나 매우 상동성이게 된다. "고도로 상동성"이라는 용어는, 1 내지 5개, 좋기로는 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 치환이 CDR에 일어날 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 더욱이, 과가변 영역 및 가변 영역은 본 명세서에 특별히 기재된 항체의 영역과 실질적으로 상동성이도록 변형될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 특정 핵산에는 특정 숙주 세포나 유기체에서의 코돈의 활용이 최적화되도록 변형된 핵산이 포함된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 유기체 중의 코돈 활용의 차이는 이종 유전자 발현에 관한 여러 가지 문제점을 유발할 수 있다. 본래 서열 중 1개 이상의 뉴클레오티드의 변화에 의한 코돈 최적화에 의하여, 핵산이 발현되는 동종 또는 이종 숙주 중에서의 상기 핵산의 발현의 최적화, 특히 해독 효율의 최적화가 초래될 수 있다. 예컨대, 인간으로부터 유래되고 항체의 불변 영역 및/또는 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산이 예컨대 키메라 또는 인간화 항체를 제조하기 위하여 본 발명에 따라 사용되는 경우, 특히 상기 핵산, 즉 본 명세서에 기재된 다른 유기체로부터 유래된 핵산 등의 이종 핵산에 임의로는 융합된 핵산이 마우스 또는 햄스터 등의 인간과는 상이한 유기체로부터 유래된 세포에서 발현되는 경우에, 코돈 활용의 최적화를 위하여 상기 핵산을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 각각 SEQ ID NO: 40 및 45에 따른 것 등의 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열은 좋기로는 최적화된 코돈 활용을 유발시키나, 아미노산 서열의 변화는 일으키지 않도록 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개, 좋기로는, 최대 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70 또는 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 치환은 좋기로는 각각 이들의 변형된 대응부를 함유하지만, 아미노산 서열 변화를 유발시키지 않는 SEQ ID NO: 40 및 45의 뉴클레오티드의 다음 정렬에 제시된 치환으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 40 및 45의 뉴클레오티드의 치환, 또는 각각 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 다른 핵산 서열 중에서의 해당 좌위에서의 해당 치환에 관한 것이다. 좋기로는, 코딩된 아미노산 서열 중의 변화를 유발시키지 않는 이들의 변형된 대응부를 갖는, 각각 SEQ ID NO: 40 및 45의 다음 정렬에 제시된 모든 치환은 각각 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열에서 효과적이다.
SEQ ID NO : 40과 SEQ ID NO : 147의 정렬
Figure 112016129308532-pat00001
SEQ ID NO : 45와 SEQ ID NO : 149의 정렬
Figure 112016129308532-pat00002
Figure 112016129308532-pat00003
더욱이, 본 발명에 따르면 본 명세서에 기재된 아미노산 서열을, 특히 인간 중쇄 불변 영역을 희망하는 알로타입 (allotype)에 서열을 맞추도록, 예컨대 백인종 (Caucasian)에서 발견되는 알로타입에 서열을 맞추도록 변형시키는 것이 좋을 수 있다. 이러한 변형은 좋기로는 SEQ ID NO:46내의 다음 아미노산 치환 또는 기타 인간 중쇄 불변 영역인 K93R, D235E 및 L237M 중 대응 위치에서의 치환으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 이러한 모든 변형은 인간 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열 중에 포함된다.
본 발명에 따르면, "대응 위치"라는 용어는 두 개의 핵산 서열 또는 단백질 서열에서 서로 정렬되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 말한다.
좋기로는, 본 명세서에 기재된 특정 핵산 서열과, 변형된 상기 특정 핵산 서열, 또는 상기 특정 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 간의 상동성의 정도는 적어도 70%, 좋기로는 적어도 75%, 더욱 좋기로는 적어도 80%, 더욱 더 좋기로는 적어도 90%, 가장 좋기로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. CLD18 핵산 변이체에 관하여, 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 300, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 500, 적어도 약 550, 적어도 약 600, 또는 적어도 약 650, 적어도 약 700, 적어도 약 750, 또는 적어도 약 780 뉴클레오티드로 된 영역에 대하여 주어진다. 양호한 실시 상태에 있어서, 동일성의 정도는 기준 핵산 서열, 예컨대 서열 목록에 제공된 핵산 서열의 전체 길이에 대하여 제공된다. 두 개의 서열은 좋기로는 폴리뉴클레오티드 간의 특이적인 하이브리드화를 허용하는 조건 (엄중 조건)하에 수행되는 하이브리드화에 의하여, 좋기로는 서로 하이브리드화하여 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있다. 엄중 조건은 예컨대, 다음 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 기재되어 있고, 예컨대 하이브리드화 완충액 (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중에서 65℃에서 하이브리드화하는 것을 말한다. SSC는 0.15 M 소듐 클로라이드/0.15 M 소듐 시트레이트, pH 7이다. 하이브리드화 후, DNA가 전달된 막을 예컨대 실온에서 2X SSC로 세척한 다음에, 68℃에서 0.1-0.5 x SSC/0.1 x SDS 중에서 세척한다.
유사도의 정도, 좋기로는, 실질적인 상동성을 보이는 아미노산 서열 간과 같이, 본 명세서에 기재된 특정 아미노산 서열과, 변형된 특정 아미노산 서열, 또는 특정 아미노산 서열의 변이체의 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 적어도 70%, 좋기로는 적어도 80%, 더욱 더 좋기로는 적어도 90%, 가장 좋기로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. CLD18 폴리펩티드 변이체에 관하여, 유사도 또는 동일성의 정도는 좋기로는 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 적어도 약 200, 적어도 약 220, 적어도 약 240, 적어도 약 250 또는 260 아미노산의 영역에 대하여 제공된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 유사도 또는 동일성의 정도는 서열 목록에 주어진 아미노산 서열 등의 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대하여 제공된다.
전술한 변형된 서열 또는 서열 변이체 모두는 본 발명의 범위에 속한다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 %를 말한다. 두 개의 폴리펩티드 또는 핵산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드의 %를 말한다.
"동일성 %"는 최적 상태로 정렬한 후에 얻어지는데, 이 %는 순수하게 통계학적인 %이고 랜덤하게 전체 길이에 걸쳐 분포된 두 개의 서열 간의 차이를 말하는 것이다. 두개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 서열 비교는 최적 상태로 정렬한 후 이러한 서열을 비교함으로써 통상적으로 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소적인 영역을 확인 및 비교하기 위하여 세그먼트 또는 "비교 창"에 의하여 수행된다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 수동적인 방법 이외에도, 스미스 및 워터맨의 국소적 상동성 알고리즘에 의하여 (Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482), 네들맨 및 운스크의 국소적 상동성 알고리즘에 의하여 (Neddleman and Wunsch 1970, J. Mol. Biol. 48, 443), 또는 피어슨 및 립맨의 유사성 조사법에 의하여 (Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444), 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.) 생성될 수 있다.
동일성의 %는 비교한 두개의 서열 간의 동일한 위치의 수를, 비교한 위치의 갯수로 나눈 다음에, 여기에 100을 곱하여 두 서열 간의 동일성 %를 얻음으로써 계산한다.
"보존적 치환"은 예컨대, 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사도에 근거하여 이루어질 수 있다. 예컨대, (a) 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌이 있고, (b) 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 있으며, (c) 양전하를 띤 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 있고, (d) 음전하를 띤 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 있다. 치환은 보통 상기 (a) 내지 (d) 경우 안에서 이루어진다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-헬릭스를 방해하는 능력에 따라서 다른 것으로 치환될 수 있다. 일부의 양호한 치환은 다음의 경우 내에서 이루어질 수 있다. (i) S와 T, (ii) P와 G, (iii) A, V, L 및 I. 알려져 있는 유전자 코드와, 재조합 기술 및 합성 DNA 기술을 고려하여, 숙련된 과학자라면 보존적 아미노산 변이체를 코딩하는 DNA를 손쉽게 작제할 수 있다.
본 발명은 항체의 약동학적 성질 또는 기능을 변경시키기 위하여 Fc 영역에서 변경이 이루어지는 항체를 포함한다. 이러한 변경은 C1q 결합 및 CDC의 감소 또는 증가, 또는 FcγR 결합 및 ADCC의 감소 및 증가를 초래할 수 있다. 치환은 예컨대 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔기 중 1개 이상에서 이루어질 수 있으며, 이로 인하여 변형된 항체와 비교하였을 때 항원에 결합하는 능력은 보유하면서도 이펙터 기능의 변경을 유발시킨다. 참고: US 5,624,821 및 US 5,648,260.
항체의 생체내 반감기는 분자가 온전한 CH2 도메인 또는 온전한 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 하는 방식으로 Ig 불변 도메인 또는 Ig형(-like) 불변 도메인의 셀비지 (salvage) 수용체 에피토프를 변형함으로써 개선시킬 수 있다. 참조: US 6,121,022 및 US 6,194,551. 생체내 반감기는 Fc 영역에서 돌연변이를 만듬으로써 추가로 증가시킬 수 있는데, 예컨대, 위치 252에서 루신 대신에 트레오닌을 치환함으로써, 위치 254에서 세린 대신에 트레오닌을 치환함으로써, 또는 위치 256에서 페닐알라닌 대신에 트레오닌을 치환함으로써 증가시킬 수 있다. 참조: US 6,277,375.
더욱이, 항체의 이펙터 기능을 변화시키기 위하여 항체의 글리코실화 패턴을 변형시킬 수 있다. 예컨대, Fc-수용체에 대한 Fc 영역의 친화도를 증강시키고, 결국에는 NK 세포의 존재하에 항체의 증가된 ADCC를 유발시키게 하기 위하여 Fc 영역의 위치 297에서 Asn에 보통 부착되는 퓨코즈 (fucose) 유닛을 첨가하지 않은 트랜스펙토마에서 항체를 발현시킬 수 있다. 참조: Shield et al. (2002) JBC, 277: 26733. 더욱이, CDC를 변형시키기 위하여 갈락토실화 변형을 실시할 수 있다.
또는 다른 실시 상태에 있어서, 포화 돌연변이 발생 등에 의하여 항-CLD18 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부에 무작위로 돌연변이가 도입될 수 있으며, 생성된 변형된 항-CLD18 항체는 결합 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")라는 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말하는 것이다. 이러한 용어는 특정한 개별 세포만을 이르는 것이 아니라, 이러한 세포의 자손까지도 이르는 것이다. 어떤 변형은 돌연변이나 환경적 영향 때문에 생장중인 세대에서도 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 설명된 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 포함된다. 재조합 숙주 세포에는 예컨대 CHO 세포, NS/O 세포, 림프구 등과 같은 트랜스펙토마가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "개체"라는 용어에는 인간 또는 인간이 아닌 동물이 포함된다. "인간이 아닌 동물"이라는 용어에는 포유류 및 비포유류, 예컨대 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등의 모든 척추 동물이 포함된다.
"트랜스제닉 동물"이라는 용어는 1개 이상의 트랜스진, 좋기로는 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스진, 또는 트랜스염색체 (동물의 본래 게노믹 DNA에 통합되어 있거나 통합되지 않은 형태)를 포함하는 게놈을 가진 것으로서, 트랜스진을 발현시킬 수 있는 동물을 말한다. 예컨대, 트랜스제닉 마우스는, CLD18 항원 및/또는 CLD18을 발현하는 세포로 면역화하는 경우 마우스가 인간 항-CLD18 항체를 생성할 수 있도록, 인간 중쇄 트랜스진 또는 인간 중쇄 트랜스염색체 중 하나와, 인간 경쇄 트랜스진을 가질 수 있다. 인간 중쇄 트랜스진은 예컨대 HuMAb 마우스, 가령 HCo7 또는 HCo12 마우스에 대한 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA에 통합될 수 있고, 또는 WO 02/43478에 기재된 바와 같은 트랜스염색체 (예컨대, KM) 마우스의 경우와 같이, 인간 중쇄 트랜스진은 염색체외에서 유지될 수 있다. 이러한 트랜스진 및 트랜스염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭에 의하여 CLD18에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 아이소타입 (예컨대, IgG, IgA 및/또는 IgE)을 생성시킬 수 있다.
본 명세서에 사용된 "감소시키다" 또는 "억제시키다"라는 용어는 가령 세포의 증식 수준과 같은 어떤 수준을 좋기로는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 더욱 좋기로는 50% 이상, 가장 좋기로는 75% 이상으로 감소시키는 등의 전반적인 감소를 유발시킬 수 있는 능력을 말한다.
mAb 작용의 메카니즘
다음에 기재하는 내용은 본 발명의 항체의 치료 효능에 대한 메카니즘에 관한 사항이지만, 본 발명을 어떠한 방식으로든지 한정하려 한 것이 아니다.
본 명세서에 기재된 항체는 좋기로는 면역계의 성분과 상호 작용하고, 좋기로는 ADCC 또는 CDC를 통하여 상호 작용한다. 본 발명의 항체는 종양 세포를 직접적으로 사멸시키기 위하여 페이로드 (예컨대, 방사성 동위원소, 약물 또는 독소)를 표적화하는 데 사용될 수 있거나, 또는 T 림프구에 대한 화학치료제의 세포 독성 효과 때문에 훼손되었을 수 있는 항종양 면역 반응을 포함할 수 있는 보체 작용 메카니즘을 통해 종양을 공격하며 전통적인 화학치료제와 함께 시너지 효과를 일으킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 항체는 세포 표면 상의 CLD18에 단순히 결합함으로써 효과를 발휘할 수 있으며, 따라서, 예컨대, 세포의 증식을 차단할 수 있다.
항체 의존성 세포 매개 세포 독성
ADCC는 본 명세서에 기재된 이펙터 세포, 특히 림프구의 세포 사멸 능력을 말하는데, 이는 항체에 의하여 마킹되는 (marked) 표적 세포를 필요로 한다.
ADCC는 좋기로는 항체가 종양 세포 상의 항원에 결합하여, 항체 Fc 도메인이 면역 이펙터 세포의 표면 위에 있는 Fc 수용체 (FcR)를 작동시키는 경우에 일어난다. Fc 수용체의 몇 가지 패밀리가 동정된 바 있고, 특정한 세포 집단은 정의된 Fc 수용체를 특징적으로 발현한다. ADCC는 항원 제시 및 종양 유도성 T 세포 반응을 유발시키는 다양한 정도의 즉각적인 종양 파괴를 직접적으로 유도하는 메카니즘으로서 관망될 수 있다. 좋기로는, ADCC가 생체내에서 유도되면 종양에 대한 T 세포 반응과 숙주에 대한 항체 반응을 유도하게 된다.
보체 의존성 세포 독성
CDC는 항체에 의하여 발휘될 수 있는 또다른 세포 사멸법이다. IgM은 보체 활성화를 위한 가장 효과적인 아이소타입이다. IgG1과 IgG3은 또한 전형적인 보체 활성화 경로를 통하여 CDC를 유도할 때에 매우 효과적이다. 좋기로는, 이 캐스케이드에서, 항원-항체 복합체의 형성은 IgG 분자 등의 항체 분자를 참가시키는 CH2 도메인 상에 아주 근접한 곳에서 다중 C1q 결합 자리의 언클로킹 (uncloaking)을 유발시킨다 (C1q는 보체 C1의 세 가지 구성 성분 중 하나이다). 좋기로는 이들 언클로킹된 C1q 결합 자리는 저친화도 CIq-IgG 상호 작용을 높은 결합능 (avidity) 중 하나로 전환시키고, 이는 다른 일련의 보체 단백질을 포함하는 이벤트의 캐스케이드를 촉발시키며, 이펙터 세포 주화소/활성화제 C3a 및 C5a의 단백질 분해로 인한 방출을 유발시킨다. 좋기로는, 보체 캐스케이드는 막 공격 복합체의 형성을 유도하게 되고, 이는 물과 용질이 세포 내외부로 자유롭게 통과하는 것을 촉진하는 세포막 내부의 세공을 형성시킨다.
항체의 생성
본 발명의 항체는 각종 기술에 의하여 생성될 수 있는데, 이러한 것들로는 기존의 모노클로날 항체 생성법, 예컨대, 쾰러 및 밀스타인 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975))의 표준 체세포 하이브리드화 기술이 있다. 체세포 하이브리드화법이 양호하지만, 원칙적으로는 모노클로날 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예컨대 B-림프구의 바이러스 또는 온코진 형질전환 또는 항체 유전자 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이법이 사용될 수도 있다.
모노클로날 항체를 방출시키는 하이브리도마를 제조하기 위한 양호한 동물 시스템은 쥣과 시스템이다. 마우스에서의 하이브리드마 생성은 매우 잘 수립되어 있는 방법이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위하여 면역화된 비장 세포를 분리하는 기술은 이 기술 분야에 잘 알려져 있다. 융합 파트너 (예컨대, 쥣과 미엘로마 세포) 및 융합 절차는 익히 알려져 있다.
모노클로날 항체를 분비하는 하이브리드마를 제조하기 위한 다른 양호한 동물 시스템은 래트 및 토끼 시스템이다 (예컨대, 문헌 [Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995)]에 기재되어 있는 것, 또한 참조: Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
다른 양호한 실시 상태에 있어서, CLD18에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 사용하여 발생될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스유전자 마우스에는 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 각각 알려져 있는 마우스가 포함되고, 이를 "트랜스제닉 마우스"라고 본 명세서에서 통칭한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체를 생성하는 것은 WO2004 035607에서 CD20에 대하여 자세히 기재되어 있는 사항에 따라 수행할 수 있다.
모노클로날 항체를 생성시키기 위한 다른 전략은 정의된 전략에서의 림프구 생성 항체로부터 항체를 코딩하는 유전자를 직접적으로 분리해 내는 것이다. 참조: 문헌 [Babcock et al., 1996: A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy]. 재조합 항체 엔지니어링 기술에 대해 자세한 사항은 문헌 [Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 and Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1]을 참조하면 된다.
면역화
CLD18에 대한 항체를 생성시키기 위하여, 전술한 바와 같이 마우스를 CLD18 서열로부터 유래한 캐리어와 컨쥬게이팅된 펩티드, 재조합 발현된 CLD18 항원 또는 이의 단편의 농축 조제물 및/또는 CLD18을 발현하는 세포로 면역화할 수 있다. 또는, 마우스는 전장 인간 CLD18 (예컨대, SEQ ID NO: 1) 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA로, 특히 SEQ ID NO: 15, 17 및 19로 면역화할 수 있다. CLD18 항원의 정제 또는 농축 조제물을 사용하여 면역화한 것이 항체를 생성시키지 못한 경우, 면역 반응을 촉진시키기 위하여 CLD18을 발현하는 세포, 예컨대 세포주를 사용하여 마우스를 면역화할 수도 있다.
면역 반응은 꼬리 정맥 또는 안와후방 (retroorbital) 혈액에 의하여 얻은 혈장 및 혈청 샘플을 사용하는 면역화 프로토콜 코스를 통해 관찰하는 것이 가능하다. 항-CLD18 면역글로불린의 충분한 역가를 갖는 마우스는 융합을 위해 사용될 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 제거하기 3일 전에 CLD18을 발현하는 세포를 사용하여 복강내 또는 정맥내 경로를 통하여 부스팅함으로써, 특정 항체를 분비하는 하이브리도마의 비율을 증가시킬 수 있다.
모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 발생
CLD18에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 발생시키기 위하여, 면역화된 마우스로부터의 비장 세포와 림프구 세포를 분리하여 마우스 미엘로마 세포주 등의 적당한 불멸 세포주에 융합시킨다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원 특이적인 항체의 생성에 대하여 스크리닝하는 것이 가능하다. 개별 웰은 항체 분비 하이브리드마에 대한 ELISA로 스크리닝하는 것이 가능할 수 있다. CLD18 발현 세포를 사용하는 면역형광법 및 FACS 분석법에 의하여, CLD18에 대한 특이성을 갖는 항체를 동정할 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 재이식하고 재스크리닝할 수 있는데, 만일 항-CLD18 모노클로날 항체에 대하여 여전히 양성인 경우 한계 희석에 의하여 서브클로닝할 수 있다. 이어서 안정한 서브클론은 특징 분석을 위한 조직 배양 배지 중에서 항체를 발생시키기 위하여 시험관내에서 배양될 수 있다.
모노클로날 항체를 생성하는 트랜스펙토마의 발생
본 발명의 항체는 예컨대, 재조합 DNA 기술과 유전자 형질 감염 기술의 조합, 그 외에도 이 기술 분야에 알려져 있는 방법 (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)을 사용하여 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생성될 수도 있다.
예컨대, 한 가지 실시 상태에 있어서, 해당 유전자, 예컨대 항체 유전자는 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338 841에 기재되어 있는 GS 유전자 발현 시스템 또는 이 기술 분야에 알려져 있는 다른 발현 시스템에 의하여 사용되는 것 등의 진핵세포 발현 플라스미드 등의 발현 벡터에 연결될 수 있다. 클로닝된 항체 유전자를 함유하는 정제된 플라스미드는 CHO 세포, NS/O 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293 세포 또는 달리 식물 유래 세포, 균류 또는 효모 세포 등의 다른 진핵 세포와 같은 진핵 생물 숙주 세포 중에 도입될 수 있다. 이러한 유전자를 도입하기 위하여 사용되는 방법은 일렉트로포레이션, 리포펙틴, 리포펙타민 또는 기타 등의 이 기술 분야에서 설명되어 있는 방법일 수 있다. 이러한 항체 유전자를 숙주 세포에 도입한 이후, 항체를 발현하는 세포를 동정하여 선별하는 것이 가능하다. 이러한 세포들은 이들의 발현 수준에 대하여 증폭될 수 있는 트랜스펙토마를 나타내고, 항체를 생성하도록 규모를 키운다. 재조합 항체는 배양액 상징액 및/또는 세포로부터 분리되어 정제된다.
또는, 클로닝된 항체 유전자는 미생물, 예컨대 대장균 등의 원핵 세포를 비롯한 기타의 발현계에서 발현되는 것도 가능하다. 더욱이, 항체는 양 및 토끼의 젖 그리고 계란 등의 인간이 아닌 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물에서 생성될 수도 있다. 참조: 예컨대, 문헌 [Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231 : 147-157; 및 Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839].
온전한 항체를 발현하기 위한 부분적 항체 서열의 사용 (즉, 인간화 및 키메라화)
a) 키메라화
쥣과 모노클로날 항체는 독소 또는 방사성 동위원소로 표지한 경우 인간에서 치료용 항체로서 사용될 수 있다. 표지하지 않은 쥣과 항체는 치료 효과를 감소시키도록 반복하여 적용되는 경우에 인간에 있어서 매우 면역원성을 띤다. 주요 면역원성은 중쇄 불변 영역에 의하여 매개되는 것이다. 인간에 있어서 쥣과 항체의 면역원성은 해당 항체가 키메라화 또는 인간화되는 경우에 감소시킬 수 있거나 완전히 회피할 수 있다. 키메라 항체는 쥣과 항체에서 유래한 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역 등의 상이한 동물 종으로부터 유래한 상이한 부분이 있는 항체이다. 항체의 키메라화는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역과 함께 쥣과 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 합침으로써 달성한다 (예컨대, 문헌 [Kraus et al., Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-O-89603-918-8]에 기재되어 있는 것 참조). 양호한 실시 상태에 있어서, 키메라 항체는 인간 카파-경쇄 불변 영역을 쥣과 경쇄 가변 영역과 함침으로써 생성된다. 또 한가지의 양호한 실시 상태에 있어서, 키메라 항체는 인간 람다-경쇄 불변 영역을 쥣과 경쇄 가변 영역과 함침으로써 생성된다. 키메라 항체의 생성을 위한 양호한 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG3 및 IgG4이다. 키메라 항체의 생성을 위한 기타의 양호한 중쇄 불변 영역으로는 IgG2, IgA, IgD 및 IgM이 있다.
b) 인간화
항체는 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치한 아미노산 잔기를 통해 주로 표적 항원과 상호 작용한다. 이러한 이유로, CDR 내부에 있는 아미노산 서열은 CDR 외부에 있는 서열보다 각 항원간에 더욱 다양성이 높다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호 작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 위에 그래프팅된 특이적인 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구조체화함으로써 특이적인 천연 발생 항체의 성능을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것도 가능하다. [참조: 예컨대, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 : 522-525; 및 Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033)]. 이러한 프레임워크 서열은 생식 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개된 DNA 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 생식 계열 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과는 상이할 것인데, 왜냐하면 이들은 B 세포 성숙 과정에서 V (D) J 조합에 의하여 형성된 완전히 조립된 가변 영역 유전자를 포함하지 않게 될 것이기 때문이다. 생식 계열 유전자 서열은 가변 영역 상에서 골고루 고친화성 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이하게 된다. 예컨대, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노 말단과, 프레임워크 영역 4의 카르복시 말단 부에서 비교적 흔하지 않다. 더욱이, 다수의 체세포 돌연변이는 항체의 결합 특성을 상당히 변화시키지 않는다. 이러한 이유로, 본래 항체와 유사한 결합 특성을 갖는 완전한 재조합 항체를 재발생시키기 위하여 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요가 없다 (참조: WO 99/45962). CDR 영역에서 뻗어나가는 부분적인 중쇄 및 경쇄 서열만으로도 이러한 목적을 위해 충분하다. 부분적 서열은 생식 계열 가변 영역 및 조합 유전자 세그먼트가 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는 지를 결정하는 데에 사용된다. 이어서 생식 계열 서열은 가변 영역에서 손실된 부위를 채우는데 사용된다. 중쇄 및 경쇄 리더 (leader) 서열은 단백질 성숙 동안에 절단되며, 최종 항체의 특성에는 영향을 미치지 않는다. 손실된 서열에 첨가하기 위하여, 클로닝된 cDNA 서열을 라이게이션 또는 PCR 증폭법에 의하여 합성 올리고뉴클레오티드와 함께 결합시킬 수 있다. 또는, 전체 가변 영역을 짧은 오버래핑 올리고뉴클레오티드의 세트로서 합성하여 PCR 증폭시켜 조합함으로써 전체적인 합성 가변 영역 클론을 생성시키는 방안도 가능하다. 이러한 방법은 특정 제한 자리의 제거 또는 포함, 또는 특정 코돈의 최적화 등의 특별한 장점을 가지고 있다.
하이브리도마로부터의 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열은 합성 올리고뉴클레오티드의 오버래핑 세트를 디자인하는 데 사용되어, 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩 능력을 가지는 합성 V 서열을 생성시킬 수 있다. 합성 중쇄 및 카파쇄 서열은 천연 서열과 세가지 면에서 상이할 수 있다. 첫번째는 반복되는 뉴클레오티드 염기의 스트링 (string)이 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 촉진하기 위하여 방해받는 것이고, 두번째는, 최적 해독 개시 자리가 코작의 법칙 (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870)에 따라 도입되는 것이며, 세번째는 HindIII 사이트는 해독 개시 자리의 조작된 상류에 있다는 점이다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두에 대하여, 최적화된 코딩 및 해당 비코딩 스트랜드 서열은 해당 비코딩 올리고뉴클레오티드의 중간 지점에서 대략 30 내지 50개 짜리 올리고뉴클레오티드로 파괴된다. 그러므로, 각 쇄에 대하여 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400개의 뉴클레오티드 세그먼트의 오버래핑 이중 스트랜드 세트로 조립될 수 있다. 이어서 풀 (pool)을 150 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 제조하기 위한 주형으로서 사용한다. 보통 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트는 두개의 오버래핑 PCR 생성물을 발생시키기 위하여 별도로 증폭되는 두 개의 풀로 파괴될 것이다. 이들 오버래핑 생성물은 그 이후 PCR 증폭에 의하여 조합되어, 완전한 가변 영역을 형성한다. PCR 증폭에서 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 오버래핑 단편을 포함시켜, 발현 벡터 구조체로 용이하게 클로닝될 수 있는 단편을 발생시키는 것도 역시 좋다.
이어서 재조합된 키메라화 또는 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터, 리더, 해독 개시, 불변 영역, 3'비해독부, 폴리아데닐화, 및 전사 중단 서열과 함께 조합하여 발현 벡터 구조체를 형성하도록 한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조체는 숙주 세포에 단일 벡터로 동시 형질 감염, 계대 형질 감염, 또는 독립적 형질 감염 및 융합되어 두개의 쇄를 모두 발현하는 숙주 세포를 형성하도록 한다. 인간 IgGκ에 대한 발현 벡터의 구조체화에 사용하기 위한 플라스미드는 아래에 설명하기로 한다. 플라스미드는, PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열이 완전한 중쇄 및 경쇄 미니유전자를 재구성할 수 있도록 하는 방식으로 구조체화된다. 이들 플라스미드는 완전히 인간, 또는 키메라 IgG1 카파 또는 IGG4 카파 항체를 발현하는 데 사용될 수 있다. 유사한 플라스미드는 다른 중쇄 아이소타입의 발현을 위해, 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위해 작제할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 또 한가지의 관점에 있어서, 본 발명의 항-CLD18의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 적어도 한 가지의 기능적 특성, 예컨대 CLD18에 결합하는 것과 같은 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 인간화 항-CLD18 항체를 생성시키는 데 사용된다는 점이다. 더욱 구체적으로는, 마우스 모노클로날 항체 중 1개 이상의 CDR 영역은 기지의 인간 프레임워크 영역과 CDR과 재조합적으로 결합되어, 본 발명의 추가의 재조합 조작된 인간화 항-CLD18 항체를 생성시킬 수 있다.
항원 발현 세포에 결합
항체가 CLD18에 결합하는 능력은 실시예 부분에 기재되어 있는 것과 같은 표준 결합 분석법 (예컨대, ELISA, 웨스턴 블롯, 면역형광법 및 유세포 분석법)을 사용하여 측정할 수 있다.
항체의 결합 특성
항-CLD18 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마를 2리터 들이 회전 플라스크에서 모노클로날 항체 정제를 위해 생장시킬 수 있다. 또는, 항-CLD18은 투석 기반 생물학적 반응기중에서 생성될 수 있다. 상징액은 여과할 수 있고, 필요한 경우 농축 후 단백질 G-세파로스 또는 단백질 A-세파로스로 친화 크로마토그래피할 수 있다. 겔 전기 영동과 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 용리된 IgG의 순도를 확인할 수 있다. 완충액은 PBS로 교환할 수 있고, 농도는 소광 계수 1.43을 사용하여 OD280으로 측정할 수 있다. 모노클로날 항체는 분취하여 -80℃에서 보관할 수 있다. 선택된 항-CLD18 모노클로날 항체가 특유의 에피토프에 결합하는지를 측정하기 위하여, 자리 지향적 또는 다중 자리 지향적 돌연변이 발생법을 사용할 수 있다.
아이소타입 측정
정제된 항체의 아이소타입을 측정하기 위하여, 각종 시판 키트 (Zymed, Roche Diagnostics)로 아이소타입 ELISA를 실시할 수 있다. 마이크로적정 플레이트의 웰은 항-마우스 Ig로 코팅할 수 있다. 차단 단계 후에, 플레이트를 대기 온도에서 2시간 모노클로날 항체 또는 정제된 아이소타입 대조군과 함께 반응시킨다. 웰들을 마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3, IgA 또는 마우스 IgM-특이적 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 프로브와 함께 반응시킬 수 있다. 세척 단계 후에, 플레이트를 ABTS 기질 (1 mg/ml)을 사용하여 형성하고, 405-650의 OD로 분석한다. 또는, 아이소트립 마우스 모노클로날 안티바디 아이소타이핑 키트 [IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027)]를 제조업자의 설명대로 사용할 수 있다.
유세포 분석법
면역화된 마우스의 혈청 중에 항-CLD18 항체가 존재하는지 여부, 또는 CLD18을 발현하는 살아 있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 측정하기 위하여, 유세포 분석법을 사용할 수 있다. CLD18을 형질 감염시킨 후 또는 천연적으로 발현하는 세포주와 CLD18이 발현되지 않는 음성 대조군 (표준 생장 조건에서 생장된 것)을 하이브리도마 상징액 또는 1% FBS를 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 함께 혼합하여, 4℃에서 30분간 배양할 수 있다. 세척 단계 후에, APC- 또는 알렉사647-표지된 항 IgG 항체를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에 CLD18-결합된 모노클로날 항체와 결합시킬 수 있다. 시료는 단일한 살아 있는 세포 상의 게이트에 대하여 빛과 사이드 스캐터 성질을 사용하여 FACS 장치로 유세포 계수함으로써 분석할 수 있다. 1회 측정으로 CLD18 특이적 모노클로날 항체와 비특이적 결합제를 구분해 내기 위하여, 공동 형질 감염법을 사용할 수 있다. CLD18을 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질 감염된 세포와 형광 마커를 전술한 바와 같이 염색할 수 있다. 형질 감염된 세포는 항체로 염색된 세포와는 상이한 형광 채널 중에서 검출될 수 있다. 형질 감염된 세포 대부분은 두 가지 트랜스진을 발현하기 때문에, CLD18 특이적 모노클로날 항체는 형광 마커를 발현하는 세포에 더 잘 결합하는 반면에, 비특이적인 항체는 필적하는 비율로 형질 감염되지 않은 세포에 결합한다. 형광 현미경을 사용한 다른 방법을 유세포 계수법 대신에, 또는 유세포법과 함께 사용 가능하다. 세포는 전술한 바와 같이 정확하게 염색하여 형광 현미경으로 검사 가능하다.
특히 접착 세포인 주변 세포에 세포가 접촉하는 것이 세포가 떨어짐으로 인해서 손실되는 경우에 타이트 정션 단백질은 내부에 위치하는 경향이 있다. CLD18의 세포 표면 발현은 a) 배양 조건을 조정하여, 예컨대 순한 탈착을 사용하여 표준 방식으로 고밀도 세포 중에서 배양하고 (2 mM EDTA/PBS 또는 아큐타아제 (accutase)), 실온에서 가공 후, 엔도사이토시스 억제제 (예컨대, 소듐 아지드) 또는 CLD18 전사 또는 해독 활성화제를 첨가하는 것에 의하여, b) 세포 표면에서 고수준으로 CLD18을 유지하는 세포를, 예컨대, 형질 감염된 세포에 대한 항생제로 선별하거나, 이뮤노마그네틱 또는 FACS 세포 소팅에 의하여, 또는 제한 희석 클로닝에 의하여 선별 및 클로닝함으로써 최적화될 수 있다.
면역 형광 현미경
면역화된 마우스의 혈청 중에 항-CLD18 항체가 존재하는지 여부, 또는 CLD18을 발현하는 살아 있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 측정하기 위하여, 면역 형광 현미경 분석법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 자발적으로 또는 CLD18을 형질 감염시킨 뒤에 CLD18을 발현하는 세포주와, CLD18이 발현되지 않는 음성 대조군을 표준 생장 조건의 DMEM/F12 배지 (10 % 송아지 혈청 (FCS), 2 mM L-글루타민, 100 IU/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 것) 중의 챔버 슬라이더에서 성장시킨다. 세포를 메탄올 또는 파라포름알데히드로 고정할 수도 있고, 처리하지 않고 둘 수도 있다. 세포를 CLD18에 대한 모노클로날 항체와 30분간 25℃에서 반응시킬 수 있다. 세척 단계 후에, 세포를 동일한 조건하에 알렉사555로 표지된 항 마우스 IgG 2차 항체 (Molecular Probes)와 반응시킬 수 있다. 그 다음 세포를 형광 현미경으로 관찰할 수 있다.
세포 중의 총 CLD18은 세포가 메탄올로 고정되거나, 파라포름알데히드로 고정되고 세포를 트리톤 X-100으로 투과시킨 경우에 관찰할 수 있다. 살아 있는 세포와 투과되지 않은 파라포름알데하이드로 고정된 세포 표면에서, CLD18의 분포를 검사할 수 있다. 또한, 타이트 정션에 대한 CLD18의 표적화도 ZO-1 등의 타이트 정션 마커와 함께 동시 염색함으로써 분석 가능하다. 더욱이, 항체 결합 효과 및 세포막 중의 CLD18 분포를 검사할 수 있다.
웨스턴 블롯
항-CLD18 IgG는 웨스턴 블롯팅에 의하여 CLD18 항원과의 반응성에 대하여 추가로 검사할 수 있다. 약술하자면, CLD18을 발현하는 세포로부터의 세포 추출물과 적당한 음성 대조군을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동한다. 전기 영동 후에, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막에 전달하고, 차단시키고, 시험할 모노클로날 항체로 탐침한다. IgG 결합은 항-마우스 IgG 퍼옥시다아제를 사용하여 검출할 수 있고, ECL 기질을 사용하여 현상한다.
면역 조직 화학법
항-CLD18 마우스 IgG는 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 방식으로, 예를 들어, 비암 조직 또는 통상의 수술 절차 동안에 환자로부터 얻은 암 조직 시료로부터의 또는 CLD18을 형질 감염시킨 후 발현하는 세포주 (예컨대, HEK293) 또는 자발적으로 발현하는 세포주 (예컨대, DAN-G, SNU-16, KATO-III)로 주사한 이종 이식편 종양 (xenografted tumor)을 보유하는 마우스로부터의 파라포름알데하이드 또는 아세톤 고정된 크리오섹션 (cryosection)을 사용하거나, 또는 파라포름알데히드로 고정한 파라핀 매립된 조직 섹션을 사용하여 면역 조직 화학법으로 CLD18 항원과의 반응성에 대하여 추가로 시험할 수 있다. 면역 염색을 위하여, CLD18에 반응성인 항체를 호스래디쉬-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 염소 항-마우스 또는 염소 항-토끼 항체 (DAKO)를 제조업자의 지침에 따라 인큐베이트할 수 있다.
시험관내에서 항체의 식세포 작용 및 세포 사멸 작용
CLD18에 특이적으로 결합하는 것 이외에도, 항-CLD18 항체를 CLD18을 발현하는 세포의 식세포 작용 및 사멸을 매개하는 이들의 능력에 대하여 시험할 수 있다. 시험관내에서 모노클로날 항체의 시험은, 생체내 모델에서 시험하기 전의 초기 스크리닝을 제공한다.
항체 의존성 세포 매개 세포 독성 ( ADCC ):
약술하자면, 건강한 수여자로부터의 다형핵 세포 (PMN), NK 세포, 단구, 단핵 세포 또는 기타의 이펙터 세포를 피콜 하이파크 밀도 원심 분리 (Ficoll Hypaque density centrifugation)와, 그에 이은 오염된 적혈구의 용해 단계에 의하여 정제하였다. 10% 가열불활성화된 송아지 혈청, 또는 5% 가열 불활성화된 인간 혈청이 보충된 RPMI 중에 세척된 이펙터 세포를 현탁시키고, CLD18을 발현하는 51Cr 로 표지된 표적 세포와 함께, 다양한 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율로 혼합한다. 또는, 표적 세포를 형광 증강 리간드 (BATDA)로 표지할 수 있다. 사멸한 세포로부터 방출되는 증강 리간드를 갖는 유로퓸의 고형광 킬레이트는 형광측정기로 측정할 수 있다. 다른 기술에서는 루시페라아제를 사용하여 표적 세포를 형질 감염시키는 것을 활용할 수 있다. 첨가된 루시페르 황색은 생존한 세포만 산화시키게 된다. 정제된 항-CLD18 IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 무관한 인간 IgG를 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 분석은 사용된 이펙터 세포 타입에 따라 37℃에서 4 내지 20시간 동안 수행할 수 있다. 시료는 배양 상징액 중의 51Cr 방출량 또는 EuTDA 킬레이트의 존재 여부를 측정함으로써 세포 분해에 대하여 분석할 수 있다. 또는, 루시페르 황색의 산화로부터 유래하는 발광 (luminescence)은 생존 세포의 척도가 될 수 있다.
항-CLD18 모노클로날 항체는 각종 배합으로 시험하여, 세포 분해가 다양한 모노클로날 항체를 사용하여 증강될 수 있는지 여부에 대하여 측정할 수 있다.
보체 의존성 세포 독성 ( CDC ):
각종 알려져 있는 기술을 사용하여 모노클로날 항-CLD18 항체를 CDC를 매개하는 능력에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 보체를 위한 혈청은 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 방식에 따라 혈액으로부터 얻을 수 있다. mAb의 CDC 활성을 측정하기 위하여, 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 51Cr 방출량을 측정할 수 있거나, 상승된 막 투과성을 프로피디윰 아이오다이드 (PI) 배제 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 약술하자면, 표적 세포를 세척하고, 5 x 105/ml를 다양한 농도의 mAb와, 37℃ 또는 실온에서, 10~30분 인큐베이트할 수 있다. 혈청 또는 혈장을 최종 농도 20% (v/v)로 첨가할 수 있고, 세포를 37℃에서 20~30분 인큐베이트할 수 있다. 각 시료로부터의 모든 세포를 FACS관에서의 PI 용액에 첨가할 수 있다. 이어서 혼합물을 FACSArray를 사용하여 유세포 계수 분석으로 즉시 분석할 수 있다.
다른 분석법에 있어서, CDC 유도는 접착 세포 상에서 측정할 수 있다. 이 분석법의 한 가지 실시 상태에 있어서, 세포를 조직 배양액 편평 바닥 미세적정 플레이트 중에서 3 x 104/웰의 밀도로 분석하기 24시간 전에 접종한다. 이튿날, 생장 배지를 제거하고, 세포를 항체와 함께 3회 인큐베이트한다. 대조군 세포를 배경 용해 및 최대 용해의 측정을 위하여 각각 생장 배지 및 0.2% 사포닌을 함유하는 생장 배지와 함께 인큐베이트한다. 20분간 실온에서 인큐베이션한 후, 상징액을 제거하고 DMEM (37℃로 예열) 중의 20% (v/v) 인간 혈장 또는 혈청을 세포에 첨가한 다음, 37℃에서 20분 더 인큐베이트한다. 각 샘플로부터의 모든 세포를 프로피디움 아이오다이드 용액 (10 ㎍/ml)에 첨가하였다. 그 다음에, 상징액을 2.5 ㎍/ml 에티디움 브로마이드를 함유하는 PBS로 갈아준 다음에, 520 nm에서의 여기시 형광 발광을 테칸 사파이어 (Tecan Safire)를 사용하여 600 nm에서 측정한다. 특이적인 용해의 %는 다음과 같이 계산한다: 특이적인 용해 (%) = (시료의 형광값- 배경 형광값)/(최대 용해 형광값 - 배경 형광값) x 100.
모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 억제:
세포 자멸을 개시하는 능력을 시험하기 위하여, 모노클로날 항-CLD18 항체를 예컨대 37℃에서 약 20시간 CLD18 양성 종양 세포, 예컨대 SNU-16, DAN-G, KATO-III, 또는 CLD18로 형질 감염된 종양 세포와 함께 인큐베이트할 수 있다. 세포들을 수확하고, Annexin-V 결합 완충액 (BD biosciences) 중에서 세척한 후, 15분간 암소에서 FITC 또는 APC (BD biosciences)와 컨쥬게이팅된 아넥신 V와 함께 인큐베이트한다. 각 시료로부터의 모든 세포를 FACS관 중의 PI 용액 (PBS 중의 10 ㎍/ml)에 첨가할 수 있고, 이를 유세포 계수법으로 즉시 측정한다 (전술한 바와 같다).
또는, 모노클로날 항체에 의한 세포 증식의 일반적인 억제는 시판되는 키트로 검출 가능하다. 키트 [DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200)]는 마이크로플레이트 중에서 증식하는 세포의 DNA 합성 중에 도입되는 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU)의 측정을 기초로 한 비방사성 동위원소 면역측정법을 적용한다. 도입된 BrdU는 유로퓸 표지된 모노클로날 항체를 사용하여 검출된다. 항체 검출을 위하여, 세포를 고정하고, Fix 용액을 사용하여 DNA를 변성시킨다. 결합되지 않은 항체를 세척해 버리고, DELFIA 인듀서를 표지된 항체로부터 용액으로 유로품 이온을 해리시키기 위해 첨가함으로써, DELFIA 인듀서의 성분과 함께 고형광을 띠는 킬레이트를 형성하도록 한다. 검출 중에 시간의 경과에 따라 형광 광도법을 활용하여 측정된 형광은 각 웰의 세포의 DNA 합성량에 비례한다.
전임상 연구
CLD18에 결합하는 모노클로날 항체를 생체내 모델에서 시험하여 (예를 들면, 가능하게는 형질 감염 후 CLD18을 발현하는 세포주, 예컨대 HEK293, 또는 CLD18을 발현하는 세포주, 예컨대, DAN-G, SNU-16, 또는 KATO-III를 접종한 타종 이식편 종양을 보유하는 면역 결핍 마우스에서) CLD18을 발현하는 종양 세포의 성장을 조절하는 데 있어서의 이들의 능력을 측정할 수 있다.
생체내 연구는 CLD18을 발현하는 종양 세포를 면역결핍 마우스 또는 기타의 동물에 이식한 후 본 발명의 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 항체를 종양이 없는 마우스에 투여한 다음에, 종양의 형성이나 종양 관련 징후를 예방하기 위한 항체의 효과를 측정하기 위하여 종양 세포를 주사한다. 종양의 생장, 전이 또는 종양 관련 징후를 감소시키는 관련 항체의 치료 효과를 측정하기 위하여 종양을 보유한 마우스에 항체를 투여할 수 있다. 항체의 적용은 세포정지용 약물, 생장 인자 억제제, 세포 주기 차단제, 혈관 신생 억제제 또는 다른 항체 등과 같은 기타의 물질과 함께 병용함으로써 시너지 효과 및 병용으로 인한 잠재적인 독성을 측정할 수 있다. 본 발명의 항체에 의하여 매개되는 독성 부작용을 분석하기 위하여, 동물에 항체 또는 대조군 약물을 주사하고, CLD18-항체 치료와 관련되어 있을 가능성이 있는 증후에 대하여 꼼꼼히 조사하는 것이 가능하다. CLD18 항체의 생체내 적용의 가능한 부작용으로는 특히 위 및 폐를 비롯한 CLD18 발현 조직에서의 독성이 있다. 인간 및 다른 종, 예를 들어, 마우스에서 CLD18을 인지하는 항체는 인간에서 모노클로날 CLD18-항체의 적용에 의하여 매개되는 잠재적인 부작용을 예측하는 데에 특히 유용하다.
에피토프 매핑
본 발명의 항체에 의하여 인식되는 에피토프의 매핑을 문헌 ["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9] 및 ["Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay]에 상세히 기재되어 있는 바와 같이 수행할 수 있다.
I. CLD18 에 결합하는 이중 특이적/다중 특이적 분자
본 발명의 다른 실시 상태에 있어서, CLD18에 대한 항체는 유도체화 될 수 있거나 다른 기능적 분자, 예컨대 다른 펩티드 또는 단백질 (가령, Fab' 단편)에 연결되어, 다중 결합 자리 또는 표적 에피토프에 결합하는 이중 특이적 또는 다중 특이적 분자를 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 1개 이상의 다른 결합 분자에, 예컨대 다른 항체, 펩티드 또는 결합 유사체에 기능적으로 연결될 수 있다 (예컨대, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 기타의 방식에 의하여).
그러므로, 본 발명은 CLD18에 대한 적어도 1개의 제1 결합 특이성과, 제2의 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중 특이적 및 다중 특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시 상태에 있어서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예컨대 인간 Fc-감마RI (CD64) 또는 인간 Fc-알파 수용체 (CD89), 또는 T 세포 수용체, 예컨대 CD3이다. 그러므로, 본 발명은 Fc-감마R, Fc-알파R 또는 Fc-엡실론R를 발현하는 이펙터 세포 (예컨대, 단구, 마크로파지 또는 다형핵 세포 (PMNs))와, CLD18을 발현하는 표적 세포와 결합할 수 있는 이중 특이적 및 다중 특이적 분자를 포함한다. 이들 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 CLD18을 발현하는 세포를 이펙터 세포에 표적화할 수 있고, CLD18을 발현하는 세포의 식세포 작용, 항체 의존성 세포 독성 (ADCC), 사이토카인 분비, 또는 과산화 음이온 발생 등의 Fc 수용체 매개 이펙터 세포 활성화를 유발시킬 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 및 항-CLD18 결합 특이성 외에도, 제3의 결합 특이성을 포함할 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 제3 결합 특이성은 항-인핸스먼트 인자 (EF) 부분, 예를 들어 세포 독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합함으로써 표적 세포에 대하여 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-인핸스먼트 인자 부분"이란 해당 분자, 예컨대 항원 또는 수용체에 결합함으로써, Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정부의 효과를 증대시키는 항체, 기능성 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-인핸스먼트 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 또는, 제1 및 제2 결합 특이성이 결합하는 매체 (entity)와는 상이한 매체에 결합할 수도 있다. 예를 들어, 항-인핸스먼트 인자 부분은 세포 독성 T 세포에 결합할 수 있다 (예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대하여 증가된 면역 반응을 초래하는 다른 면역 세포를 통하여).
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 결합 특이성으로서 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단쇄 Fv를 비롯한 1개 이상의 항체를 포함한다. 항체는 경쇄 또는 중쇄 이량체일 수 있거나, 문헌 [Ladner et al., US 4,946,778]에 기재된 바와 같은 Fv 또는 단쇄 구조체 등의 임의의 최소의 단편일 수도 있다. 항체는 US2003/0118592 및 US 2003/0133939에 기재된 바와 같은 결합 도메인 면역글로불린 융합 단백질일 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 이펙터 세포의 표면에 존재하는 Fc-감마R 또는 Fc-알파R에 대한 결합 특이성을 포함하며, 예컨대 CLD18 등의 표적 세포 항원에 대한 제2 결합 특이성을 포함한다.
한 가지 실시 상태에 있어서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 모노클로날 항체에 의하여 제공되는데, 이것의 결합은 인간 면역글로불린 G (IgG)에 의하여 차단되지 않는다. 본 명세서에 사용된 "IgG 수용체"라는 용어는 1번 염색에 상에 위치한 8개의 감마쇄 유전자를 말한다. 이들 유전자는 3개의 Fc-감마 수용체 군, 즉 Fc-감마RI (CD64), Fc-감마RII (CD32), 및 Fc-감마RIII (CD 16)으로 분류되는 총 12개의 막통과 또는 가용성 수용체 아이소폼을 코딩한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, Fc-감마 수용체는 인간의 고친화성 Fc-감마RI이다.
이들 양호한 모노클로날 항체의 생산 및 특징은 WO 88/00052 및 US 4,954,617에서 Fanger 등이 설명하고 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 자리와는 구분되는 자리에 있는 Fc-감마RI, Fc-감마RII 또는 Fc-감마yRIII의 에피토프에 결합함으로써, 이들의 결합이 생리학적 수준의 IgG에 의하여 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에서 유용한 특이적인 항-Fc-감마RI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. 다른 실시 상태에 있어서, 항-Fcγ 수용체 항체는 모노클로날 항체 22의 인간화된 형태 (H22)이다. H22 항체의 생산 및 특징은 문헌 [Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol. 155 (10): 4996-5002]과, WO 94/10332에 설명되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection)에 수탁 번호 CRL 11177로서 HA022CL1이라는 명칭으로, 수탁년월일 1992년 11월 4일에 기탁되어 있다.
양호한 실시 상태에 있어서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성은 인간 IgA 수용체, 예컨대 Fc-알파 수용체 (Fc-알파RI (CD89))에 결합하는 항체에 의하여 제공되는데, 이의 결합은 좋기로는 인간 면역글로불린 A (IgA)에 의하여 차단되지 않는다. "IgA 수용체"라는 용어는 19번 염색체에 위치한 1개의 알파-유전자 (Fc-알파RI)의 유전자 산물을 포함시키려고 하는 것이다. 이 유전자는 55 내지 110 kDa의 얼터네이티브 스플라이싱된 막통과 아이소폼 여러개를 코딩한다. Fc-알파RI (CD89)은 단구/마크로파지, 호산성구 및 호중성 과립구 상에서 조직적으로 발현되지만, 이펙터 세포가 아닌 세포 집단에서는 그러하지 아니하다. Fc-알파RI은 IgA1 및 IgA2에 대한 중간 정도의 친화성이 있고, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되었을 때 증가된다 (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). A3, A59, A62 및 A77으로 동정된 4개의 Fc-알파RI에 특이적인 모노클로날 항체는 IgA 리간드 결합 도메인 외부에 있는 Fc-알파RI에 결합한다는 것이 문헌 [(Monteiro, R. C. et al. (1992) J.Immunol. 148: 1764)]에 기재되어 있다.
Fc-알파RI 및 Fc-감마RI는 본 발명에 사용하기 위한 양호한 트리거 수용체인데, 그 이유는 이들은 (1) 면역 이펙터 세포, 예컨대 단구, PMN, 마크로파지 및 수지 세포 상에서 주로 발현되며, (2) 고수준으로 발현되며 (예컨대, 세포당 5000-100,000개), (3) 세포 독성 활성의 매개자이며 (예컨대, ADCC, 식세포 작용), (4) 이들에게 표적화되는 자가 항원을 비롯한 항원이 향상된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
다른 한 가지의 실시 상태에 있어서, 이중 특이적 분자는 CDC를 유도함으로써 주로 작동하는 하나의 항체 및 세포 자멸을 유도함으로써 주로 작동하는 다른 항체 등과 같이, 보체 기능 활성을 갖는 본 발명에 따른 2개의 모노클로날 항체로 이루어지는 것이다.
본 명세서에 사용된 "이펙터 세포 특이적인 항체"라는 용어는 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합하는 항체 또는 기능적인 항체 단편을 말하는 것이다. 본 발명에 사용하기에 양호한 항체는 내인성 면역 글로불린에 의하여 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체에 결합한다.
본 발명에 사용된 "이펙터 세포"라는 용어는 면역 반응의 인식기 및 활성기와는 대조적으로, 면역 반응의 이펙터기 (phase)에 관여하는 면역 세포를 말한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 유래의 세포가 있는데, 그러한 것들로 예컨대 림프구 (예컨대, B 세포, 세포 독성 T 세포 (CTL))을 비롯한 T 세포, 킬러 세포, 내츄럴 킬러 세포, 마크로파지, 단구, 호산성구, 호중성구, 다핵구, 과립구, 비만 세포 및 호염기성구가 있다. 일부의 이펙터 세포는 특이적인 Fc 수용체를 발현하며, 특이적인 면역 반응을 수행한다. 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 이펙터 세포는 항체 의존적인 세포내 세포 독성 (ADCC)을 유발할 수도 있는데, 예를 들면, 호중성구는 ADCC를 유발할 수도 있다. 예를 들어, 단구, 마크로파지는 FcR을 발현하는데, 이들은 표적 세포를 특이적으로 사멸시키고, 면역계의 다른 성분에 항원을 제시하거나, 항원을 제시하는 세포에 결합한다. 다른 실시 상태에 있어서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포, 또는 미생물에 대하여 식세포 작용을 할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토킨 등의 체액 인자에 의하여 조절될 수 있다. 예를 들어, Fc-감마RI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의하여 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 향상된 발현은 표적에 대한 Fc-감마RI 함유 세포의 세포 독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 용해시키거나 이들에 대하여 식세포 작용할 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 항체에 의하여 표적화될 수 있는 개체 (예컨대, 인간 또는 동물)에서 바람직하지 않은 세포를 말하는 것이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 표적 세포는 CLD18을 발현 또는 과발현하는 세포이다. CLD18을 발현하는 세포는 보통 종양 세포이다.
본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 화학 기술 (참조: D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (참조: US 4,474,893, to Reading), 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 이 기술 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여, 항-FcR 및 항-CLD18 결합 특이성과 같은 구성적 결합 특이성 매체를 컨쥬게이팅함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중 특이적 및 다중 특이적 분자의 각 결합 특이성을 개별적으로 생성시킨 다음에, 서로 컨쥬게이팅시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우에, 각종 커플링제 또는 가교결합제가 공유 결합을 위해 사용될 수 있다. 가교결합제의 예에는 프로테인 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'- 디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC) [참조: 예컨대, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648)]가 있다. 다른 방법으로는 Paulaus가 기재한 것 (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83)과, Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)이 있다. 양호한 컨쥬게이트제로는 SATA와 술포-SMCC가 있으며, 모두 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)로부터 입수 가능하다.
결합 특이성이 항체인 경우에, 이들은 두개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통하여 컨쥬게이팅될 수 있다. 특히 양호한 실시 상태에 있어서, 힌지 영역은 홀수개의 술프히드릴 잔기, 좋기로는, 1개의 술프히드릴 잔기를 컨쥬게이션 전에 함유하도록 변형된다.
*또는, 2개의 결합 특이성은 동일한 벡터에서 코딩되어 동일한 숙주 세포내에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중 특이적 및 다중 특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자, 예컨대 이중 특이적 분자는, 단쇄 이중 특이적 항체, 하나의 단쇄 항체와 결합 결정부를 포함하는 단쇄 이중 특이적 분자, 또는 두개의 결합 결정부를 포함하는 단쇄 이중 특이적 분자 등의, 단쇄 분자일 수 있다. 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는 단쇄 분자일 수 있거나, 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중 특이적 및 다중 특이적 분자를 제조하는 방법은 예컨대, US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; 및 US 5,482,858에 기재되어 있다.
특이적인 표적에 대한 이중 특이적 및 다중 특이적 분자의 결합은, 효소 연결 면역 흡착법 (ELISA), 방사 면역 분석법 (RIA), FACS 분석법, 생물학적 분석법 (예컨대, 생장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석법에 의하여 확인할 수 있다. 이들 분석법은 일반적으로는 해당 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예컨대, 항체)을 사용함으로써 해당되는 단백질-항체 복합체의 존재를 검출하는 것들이다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 항체-FcR 복합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소와 연결된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출해 낼 수 있다. 또는, 복합체는 각종 다른 면역분석법을 사용하여 검출해 낼 수 있다. 예컨대, 항체를 방사성 동위 원소로 표지하여, 방사 면역 분석법 (RIA)에서 사용할 수 있다 (참조: 예컨대, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). 방사성 동위 원소는 γ-카운터 또는 신틸레이션 카운터 또는 오토래디오그래피를 사용하는 등의 수단을 사용하여 검출해낼 수 있다.
II . 이뮤노컨쥬게이트
다른 관점에 있어서, 본 발명은 치료적 모이어티 또는 치료제, 예컨대 사이토톡신, 약물 (가령, 면역억제제) 또는 방사성 동위 원소에 컨쥬게이팅된 항-CLD18 항체를 다룬다. 이러한 컨쥬게이트를 본 명세서에서 "이뮤노컨쥬게이트"라고 부른다. 1개 이상의 사이토톡신을 포함하는 이뮤노컨쥬게이트는 "이뮤노톡신"이라고 부른다. 사이토톡신 또는 세포 독성제는 세포에 유해하고, 특히 세포를 사멸시키는 모든 약제를 포함한다. 그 예로는, 택솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인 (procaine), 테트라카인 (tetracaine), 리도카인 (lidocaine), 프로프란올올 (propranolol), 및 퓨로마이신 (puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다.
본 발명의 이뮤노컨쥬게이트를 형성하기 위한 적당한 치료제에는, 항대사제(예컨대, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예컨대, 다우노루비신 (구 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (구 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC), 및 항 세포분열제 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 양호한 실시 상태에 있어서, 치료제는 세포 독성제 또는 방사선 독성제이다. 다른 실시 상태에 있어서, 치료제는 면역억제제이다. 다른 실시 상태에 있어서, 치료제는 GM-CSF이다. 양호한 실시 상태에 있어서, 치료제는 독소루비신, 시스플라틴, 블레오마이신, 술페이트, 카르무스틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드 또는 리신 A이다.
본 발명의 항체는 방사선 동위 원소, 예컨대, 요오드-131, 이트륨-90, 또는 인듐-111에 컨쥬게이팅되어 암과 같은 CLD18 관련 질환을 치료하기 위한 세포 독성 방사선 약물을 제조할 수 있다. 본 발명의 항체 컨쥬게이트는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위하여 사용될 수 있고, 약물 모이어티는 기존의 화학 치료제에 한정하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 예컨대, 약물 모이어티는 소망하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은 예컨대, 효소 활성이 있는 독소, 또는 이의 활성 단편, 예컨대 아브린 (abrin), 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신, 또는 디프테리아 독소등이 있고, 또한 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ 등의 단백질일 수도 있고, 또는 예컨대, 림포카인, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 생장 인자 등의 생물학적 반응 변형제가 있다.
이러한 치료적 모이어티를 항체에 컨쥬게이팅하기 위한 기술은 익히 알려져 있다. 참조: 예컨대, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds. ), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (eds. ), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)].
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 방사선 동위 원소에 항체가 컨쥬게이트될 수 있도록 하는 링커-킬레이터, 예컨대 티우세탄에 부착될 수 있다.
III . 약학 조성물
다른 관점에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체 중 하나 또는 항체 혼합물을 함유하는 조성물, 예컨대 약학 조성물을 제공한다. 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 캐리어 또는 희석제를 비롯하여, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995]에 기재되어 있는 기존 기술에 따라 다른 기지의 애쥬번트 및 부형제들과 함께 제형될 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 조성물은 상이한 메카니즘에 의하여 작용하는 여러 개의 (예컨대 2개 이상의) 분리된 항체의 배합물, 예컨대, 세포 자멸을 유도함으로써 주로 작용하는 다른 항체와 배합된 CDC를 유도함으로써 주로 작동하는 하나의 항체의 배합물을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 병행 치료에서 투여될 수 있는데, 즉 다른 약제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 병행 치료는 본 발명의 조성물과 함께, 1종 이상의 항염증제 또는 1종 이상의 면역 억제제를 포함한다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 이러한 치료제는 스테로이드성 약물 또는 NSAID (비스테로이드성 항염증제) 등의 1종 이상의 항염증제를 포함한다. 양호한 약제로는, 예컨대 아스피린과 기타의 살리실산염, Cox-2 억제제, 예컨대 로페콕십 (rofecoxib (Vioxx)), 셀레콕십 (celecoxib (Celebrex))과, 이부프로펜 [ibuprofen (Motrin, Advil)], 페노프로펜 [fenoprofen (Nalfon)], 나프록센 [naproxen (Naprosyn)], 술린닥 [sulindac (Clinoril)], 디클로페낙 [diclofenac (Voltaren)], 피록시캄 [piroxicam (Feldene)], 케토프로펜 [ketoprofen (Orudis)], 디플루니살 [diflunisal (Dolobid)], 나부메톤 [nabumetone (Relafen)], 에토돌락 [etodolac (Lodine)], 옥사프로진 [oxaprozin (Daypro)], 및 인도메타신 [indomethacin (Indocin)] 등의 NSAID가 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 이러한 치료제에는 소량의 사이클로포스파미드, 항-CTLA4 항체, 항-IL2 또는 항-IL2 수용체 항체 등과 같은, 조절 T 세포의 결핍 또는 기능적 불활성화를 유도하는 제제가 포함된다.
다른 실시 상태에 있어서, 이러한 치료제에는 택솔 유도체, 탁소테르, 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 독소루시빈 (Adriamycin), 시스플라틴 (Platinol), 사이클로포스파미드 (Cytoxan, Procytox, Neosar) 등의 1종 이상의 화학치료제가 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 위암, 식도암, 췌장암 및 폐암을 앓고 있는 환자에서 치료 효과를 바람직하게 보이는 화학 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 방사선 치료 및/또는 자가 조직 말초 줄기 세포 또는 골수 이식 등과 병행하여 투여될 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 항-CD25 항체, 항-EPCAM 항체, 항-EGFR, 항-Her2/neu, 항-CD40 항체로부터 선택된 1종 이상의 항체와 함께 투여될 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 보체 활성화를 증강시키기 위하여, 항-C3b(i) 항체와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 캐리어"라는 용어에는 생리학적으로 허용되는 모든 용매, 분산용 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 좋기로는, 캐리어는 정맥내, 근육내, 피하내, 비경구, 척수 또는 내피 투여 (예컨대, 주사 또는 주입)를 위해 적합하다. 투여되는 경로에 따라서, 활성 화합물, 즉 이중 특이적 및 다중 특이적 분자인 항체는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산과 다른 천연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하기 위하여 어떤 재료로 코팅될 수도 있다.
"약학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는 모화합물의 소망하는 생물학적 활성을 보유하지만, 불필요한 독성 작용은 생기게 하지 않는 염을 말한다 (참조: 예컨대, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
이러한 염의 예에는 산 첨가염과 염기 첨가염이 있다. 산 첨가염에는 예컨대, 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등의 비독성 무기 산으로부터 유래된 것들과, 예컨대 지방산 모노카르복실산 및 디카르복실산, 페닐치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등의 비독성 유기산으로부터 유래된 것들이 있다. 염기 첨가염에는 예컨대, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속에서 유래된 것들과, 예컨대, N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 클로린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등의 비독성 유기 아민으로부터 유래된 것들이 있다.
본 발명의 조성물은 이 기술 분야에 알려져 있는 각종 방법으로 투여할 수 있다. 숙련자들에게 알려져 있는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 희망하는 결과에 따라 매우 다양해질 수 있다. 활성 화합물은 신속한 방출에 대하여 화합물을 보호해주는 캐리어와 함께 조제될 수 있는데, 그 예로서 임플란트, 경피용 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 비롯한 조절 방출형 제형물이 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성·생적합성 중합체도 사용할 수 있다. 이러한 제형물의 제조 방법은 이 기술 분야의 숙련자들에게 일반적으로 알려져 있다. 참조: 예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delay Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위하여는, 화합물의 불활성화를 예방하기 위하여 어떤 물질로 화합물을 코팅하거나, 또는 어떤 물질과 함께 화합물을 투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 화합물은 적당한 캐리어 중에 있는 상태로 개체에게 투여할 수 있는데, 예컨대, 이러한 캐리어로는 리포좀, 또는 희석제가 있다. 약학적으로 허용 가능한 희석제에는 염수 및 완충 수용액이 있다. 리포좀에는 수중유중수 (water-in-oil-in-water) CGF 에멀전을 비롯하여, 기존의 리포좀이 있다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
약학적으로 허용 가능한 캐리어에는 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 조제물을 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 파우더가 있다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 약제의 사용은 이 기술 분야에 알려져 있다. 기존의 매질 또는 약제가 활성 화합물과 함께 사용가능하지 못한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물 중에 사용하는 것이 예상된다. 보충 활성 화합물 또한 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다.
치료용 조성물은 보통 제조 및 저장 조건에서 멸균 상태이고 안정하여야 한다. 이 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀으로, 또는 고농도의 약물에 적합한 구조로 제형될 수 있다. 캐리어는 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적당한 상기 물질의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은 예컨대, 레시틴 등의 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우에는 입자 크기 조건을 유지함으로써, 그리고 표면활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다. 다수의 경우, 당과, 만니톨, 소르비톨 등의 폴리알콜 또는 소듐 클로라이드 등의 등장성제를 조성물 중에 포함시키는 것이 좋을 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수율은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물 중에 포함시킴으로써, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유발시킬 수 있다.
멸균용 주사액은 전술한 바와 같은 성분 한 가지 또는 요구되는 성분의 배합물과 함께, 적당한 용매 중에 요구되는 양의 활성 화합물을 포함시킨 다음에, 멸균 미세여과를 함으로써 제조할 수 있다.
일반적으로는, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질과 전술한 바와 같은 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 포함시킴으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 파우더의 경우에는, 양호한 조제 방법은 이의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 요구되는 추가 성분으로 이루어지는 분말을 생산하는 진공 건조법과 동결 건조법이다.
투여 계획은 최적의 소망하는 반응 (예컨대, 치료 반응)이 제공되도록 조정한다. 예컨대, 단일 볼루스를 투여할 수 있고, 수회로 나누어진 투여량을 일정 시간을 두고 투여할 수 있거나, 투여량은 치료 상황의 위급성에 따라 지시된 대로 비율에 따라 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여의 간편함과 투여량의 일정함을 위한 투여량 단위 형태 중에 비경구용 조성물을 제형하는 것이 특이 유리하다. 본 명세서에 기재된 투여량 단위 형태는 치료할 개체를 위한 일정한 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위량을 말하고, 각 단위량은 희망하는 약학적 캐리어와 함께 희망하는 치료 효과를 발생하기 위하여 계산된 활성 화합물의 기지의 양을 함유하고 있다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 설명은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징과 달성하고자 하는 구체적인 치료 효과와, (b) 각 개인의 민감성의 치료를 위한 활성 화합물 등의 조제 분야에서의 내재적인 한계점에 따라 직접적으로 설명하고자 한다.
약학적으로 허용 가능한 항산화제의 예에는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술피트, 소듐 술피트 등과, (2) 유성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔 (BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등이 있으며, (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 포스포르산 등이 있다.
치료용 조성물에 대하여, 본 발명의 제형물은 구강, 코, 국소 (볼 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여를 위해 적합한 것들을 포함한다. 이 제형물은 단위 투여량 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 약학 분야에 알려져 있는 방법에 의하여 조제될 수 있다. 단일 투여량 형태를 제조하기 위하여 캐리어 물질과 함께 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 개체에 따라 다양할 수 있고, 구체적인 투여 방식에 따라 다양할 수 있다. 단일 투여량 형태를 제조하기 위하여 캐리어 물질과 함께 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 발생시키는 조성물의 양이다.
일반적으로, 100% 중에서, 이 양은 활성 성분 0.01 내지 99% 범위, 더욱 좋기로는 약 0.1 내지 약 70% 범위, 더욱 좋기로는 약 1 내지 약 30% 범위이다.
질 투여를 위해 적합한 본 발명의 제형물로는 적합한 것으로 이 기술 분야에 알려져 있는 캐리어를 함유하는 패서리, 탬폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형물이 있다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여량 형태는 파우더, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 있다. 활성 화합물은 약학적으로 허용 가능한 캐리어, 임의의 보존제, 완충액 또는 필요한 프로펠런트 (propellant)와 함께 멸균 조건 하에서 혼합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된다"라는 용어는 보통은 장 투여 및 국소 투여를 제외한 주사를 통한 투여 방식을 의미하는 것인데, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 진피내, 복강내, 기관경유, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 복장뼈내 주사 및 주입을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적당한 수성 및 비수성 캐리어의 예에는 물, 에탄올, 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 적당한 상기 화합물의 혼합물, 올리브유 등의 식물유, 에틸 올리에이트 등의 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 적당한 유동성은 예컨대, 레시틴 등의 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우에는 요구되는 크기 조건을 유지시킴으로써, 그리고 표면 활성제를 사용함으로써 유지할 수 있다.
이들 조성물은 보존제, 습윤제, 에멀젼제 및 분산화제 등의 애쥬번트를 함유할 수 있다. 미생물의 존재를 예방하기 위하여, 멸균 절차와, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 각종 항박테리아제 및 항균제를 포함시킬 수 있다. 당, 소듐 클로라이드 등의 등장성제를 조성물 중에 포함시키는 것도 좋다. 뿐만 아니라, 주사 가능한 약제 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 등의 흡수를 늦추는 제제를 포함시킴으로써 유발시킬 수 있다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 모노클로날 항체는 피하 주사에 의하여 결정질 형태로 투여된다. 참조: Yang et al. (2003) PNAS, 100 (12): 6934-6939. 본 발명의 화합물이 인간 및 동물에게 약제로서 투여된 경우에는, 이들은 단독으로 또는 예컨대 약학적으로 허용 가능한 캐리어와 함께 활성 성분을 0.01 내지 99.5% (더욱 좋기로는, 0.1 내지 90%) 함유하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다.
선택된 투여 경로와는 무관하게, 적당한 수화된 형태 및/또는 본 발명의 약학 조성물 중에 사용된 경우에, 본 발명의 화합물은 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 통상의 방식에 의하여 약학적으로 허용 가능한 투여량 형태로 제형된다.
본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량은 구체적인 환자, 조성물의 종류, 투여 방식, 환자에게 독성이 없는지 여부에 대하여 희망하는 치료 효과를 달성하기 위하여 효과적인 활성 성분의 양을 얻을 수 있도록 다양할 수 있다. 선택된 투여량은 사용된 본 발명의 구체적인 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 기간, 사용된 구체적인 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용된 구체적인 조성물과 병용된 기타의 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 상태 및 그 이전의 병력 등과 같은 각종 약물동태인자 및 의료계에 알려져 있는 인자들에 따라 달라질 것이다.
이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 약학 조성물의 유효량을 결정하고 처방할 수 있을 것이다. 예컨대, 의사 및 수의사는 소망하는 치료 효과를 달성하기 위하여 필요한 것보다 더 적은 양으로 약학 조성물 중에 사용된 본 발명의 화합물의 투여량으로 시작하여, 소망하는 치료 효과가 달성될 때까지 그 투여량을 점점 늘려갈 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적당한 1일 투여량은 치료 효과를 발생시키기 위하여 효과적인 최저 투여량인 화합물의 양이다. 이러한 유효 투여량은 일반적으로 전술한 바와 같은 인자에 의하여 좌우된다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내, 피하로 이루어지는 것이 좋고, 좋기로는 표적 부위에 근접한 곳에서 투여되는 것이 좋다. 원하는 경우, 치료용 조성물의 효과적인 1일 투여량은 하루에 적당한 간격을 두고 별개로 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그보다 더 세분하여 투여할 수 있고, 임의로는 단위 투여량 형태를 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 약학 제형물 (즉, 조성물)로서 화합물을 투여하는 것이 좋다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 독성 부작용을 감소시키기 위하여, 본 발명의 항체는 주입에 의하여, 좋기로는 장기간, 예컨대 24시간 이상 연속적으로 서서히 주입하는 것에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 2 내지 12시간 등의, 2 내지 24시간 의 기간 동안에 연속 주입함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방식은 필요에 따라 1회 이상 반복될 수 있는데, 예컨대 6 내지 12개월 후에 반복될 수 있다. 투여량은 항-CLD18 항체를 표적화하는 항-이디오타입 항체를 사용함으로써 생물학적 시료 중에 투여하였을 때 순환하는 모노클로날 항-CLD18 항체의 양을 측정함으로써 결정 또는 조정할 수 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 항체는 예컨대 6개월 이상의 기간 동안에 1주일에 1번 정도로 유지 치료로서 투여된다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 항체는 CLD18에 대한 항체를 1회 주입한 다음에, 방사선 동위 원소에 컨쥬게이팅된 CLD18에 대한 항체를 주입하는 것을 포함하는 방식으로 투여될 수 있다. 이 방식은 예컨대, 7 내지 9일 후에 반복될 수 있다.
치료용 조성물은 이 기술 분야에 알려져 있는 의료 장치로 투여될 수 있다. 예컨대, 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 치료용 조성물은 US 5,399,163; US 5,383,851 ; US 5,312,335; US 5,064,413; US 4,941,880; US 4,790,824; 또는 US 4,596,556에 기재된 장치 등의 바늘이 없는 피하 주사 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에서 유용한 잘 알려져 있는 임플란트 및 모듈의 예에는 US 4,487,603에 기재되어 있는 것, 즉 조절 가능한 속도로 약물을 방출시키기 위한 이식가능한 마이크로 주입 펌프와, US 4,486,194에 기재되어 있는 것, 즉 피부를 통하여 약물을 투여하기 위한 치료 장치와, US 4,447,233에 기재되어 있는 것, 즉 정확한 주입 속도로 약물을 전달시키는 의료용 주입 펌프와, US 4,447,224에 기재되어 있는 것, 즉 지속적인 약물 전달을 위하여 속도가 변화하는 이식 가능한 주입 장치와, US 4,439,196에 기재되어 있는 것, 즉 멀티-챔버 구획이 구비된 삼투압 약물 전달 시스템과, US 4,475,196에 기재되어 있는 것, 즉, 삼투압 약물 전달 시스템이 있다.
그 외에도 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈들은 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려져 있다. 특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 생체내에 적절하게 분포되도록 제형될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고친수성 화합물을 차단시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 (원하는 경우) BBB를 통과하도록 하려면, 이들은 예컨대 리포좀 내에 제형될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는, 예컨대, 다음을 참조하면 된다: US 4,522,811 ; US 5,374,548; 및 US 5,399,331. 리포좀은 특정한 세포 또는 기관으로 선택적으로 수송해 주어, 결과적으로 표적화된 약물의 전달을 향상시키는 1종 이상의 모이어티를 포함할 수 있다 (참조: 예컨대, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). 예시적인 표적화 모이어티에는 폴레이트 (folate) 또는 바이오틴 (참조: 예컨대, Low et al.의 US 5,416,016); 만노사이드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 및 표면 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134)가 있다.
본 발명의 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀 중에 제형화한다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 리포좀은 표적화 모이어티를 포함한다. 더욱 양호한 실시 상태에 있어서, 리포좀 내의 치료 화합물은 소망하는 곳, 예컨대 종양이 있는 부위와 근접한 자리에 볼루스 주사함으로써 전달된다. 조성물은 쉽게 주사기를 빠져나갈 수 있을 정도로 유동성이 있어야만 한다. 또한 조성물은 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아와 균류 등의 미생물의 오염에 대하여 예방될 수 있어야 한다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 태반을 통과하는 것을 방지 또는 감소시킬 수 있도록 제형될 수 있다. 이는 이 기술 분야에 알려져 있는 방법을 통하여, 예컨대, 항체를 PEG화함으로써, 또는 F(ab)2' 단편을 사용함으로써 수행할 수 있다. 자세한 사항은 문헌 ["Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; 및 "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol. 74: 279-283]을 참조하라.
종양 치료에 있어서 "치료 유효 투여량"은 완전하거나 부분적일 수 있는 객관적인 종양 반응에 의하여 측정할 수 있다. 완전한 반응 (CR)이란, 질병에 대한 임상적 증거, 방사선 증거 또는 기타의 증거가 전혀 없다는 것을 말한다. 부분적인 반응 (PR)이란, 종양 집합체 크기가 50% 이상 줄어든 것으로부터 유래된다. 진행되는 중간 시간 (median time)은 객관적인 종양 반응의 내구성을 특징 분석하는 척도이다.
종양 치료에 있어서 "치료 유효 투여량"은 질병의 진행을 안정화시키는 이의 능력에 의하여 측정가능한 것이기도 하다. 화합물의 암을 억제하는 능력은 인간 종양에 있어서 효능의 동물 모델 시스템 예측치로 평가할 수 있다. 또는, 조성물의 이러한 특성은 숙련자들에게 알려져 있는 시험관내 분석법에 의하여 세포 생장 또는 세포 자멸을 억제하는 화합물의 능력을 시험함으로써 평가할 수도 있다. 치료 화합물의 치료 유효량은 종양 크기를 줄일 수 있거나, 그렇지 않으면 환자의 징후를 완화시킬 수도 있다. 이 기술 분야의 숙련자는 개체의 크기, 개체 징후의 심각도, 구체적인 조성물 및 선택된 투여 경로 등의 인자에 근거하여 이러한 양을 결정할 수 있게 된다.
조성물은 주사기에 의하여 전달될 수 있도록 하는 정도로 유동성이 있고 멸균 상태이어야 한다. 물 외에도, 캐리어는 등장성으로 완충되는 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들 화합물의 적당한 혼합물일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들면 레시틴 등의 코팅을 사용하여, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 표면활성제를 사용함으로써 유지된다. 다수의 경우, 당과, 만니톨, 소르비톨 등의 폴리알콜 또는 소듐 클로라이드 등의 등장제를 조성물 중에 포함시키는 것이 좋을 수 있다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제를 조성물 중에 포함시킴으로써, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 유발시킬 수 있다.
활성 화합물이 전술한 바와 같이 적절히 보호된 경우에는, 이 화합물을 예컨대 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 (assimilable) 식용 캐리어와 함께 경구로 투여할 수 있다.
IV . 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체 (이뮤노컨쥬게이트, 이중 특이적/다중 특이적 항체 및 조성물과 본 명세서에 기재된 기타의 유도체 포함)는 CLD18을 발현하는 세포가 관여하는 질병의 치료와 관련된 다수의 치료적 용도를 갖는다. 예를 들어, 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 각종 질환을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 예컨대, 시험관내 또는 생체외에서 배양중인 세포에, 또는 예컨대 생체내로 인간에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "개체"라는 용어는 CLD18에 대한 항체에 반응하는 인간과 인간이 아닌 동물 모두를 가리키는 것이다. 양호한 개체로는 병든 세포, 특히 정상 세포에 비하여 CLD18의 발현 패턴이 변화된 것이 특징인 세포를 사멸시킴으로써 고쳐지거나 완화될 수 있는 질병을 갖는 인간 개체가 있다.
본 명세서에서 논하고 있는 치료에서의 치료 효과는 좋기로는, 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 매개 용해, 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC) 매개 용해, 세포 자멸, 호모타입 접착 및/또는 식세포 작용을 유발함으로써, 좋기로는 CDC 매개 용해 및/또는 ADCC 매개 용해를 유발함으로써 세포를 사멸시키는 것을 매개할 수 있는 본 발명의 항체의 기능적 특성을 통하여 달성된다.
예를 들어, 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 종양성 질환, 예컨대, CLD18을 발현하는 종양 세포의 존재가 특징인 질환, 예컨대 위암과 같은 종양성 질환을 가진 개체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 종양성 질병의 예로는, 모든 CLD18 발현 암 및 종양들이 있고, 여기에는 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 난소암, 유방암, 결장 직장암, 간암, 담낭암 및 두경부암이 있다. 이들 암은 초기, 중기 또는 이미 진행된 상태, 예컨대, 전이 상태일 수 있다.
본 발명에 설명되어 있는 약학 조성물 및 치료 방법은 본 명세서에 기재되어 있는 질병에 대하여 면역화 또는 백신접종하기 위하여, 또는 이러한 질병들을 예방하기 위한 목적으로도 사용할 수 있다.
또 한가지의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 항체는 CLD18, 또는 CLD18의 특정 형태의 수준을 검출하기 위하여, 또는 막 표면에 있는 CLD18을 함유하는 세포의 수준을 검출하기 위하여 사용될 수 있는데, 상기 수준들은 전술한 바와 같은 특정 질병 또는 질병의 징후와 관련되어 있을 수 있는 것들이다. 또는 항체는, CLD18을 발현하는 세포의 기능을 훼손시키거나, 이 기능과 상호 작용함으로써, 이들 세포를 질병의 중요한 매개자로 작용할 수 있게 하는 데에 사용될 수 있다. 이는, 항체와 CLD18 간에 복합체를 형성하도록 하는 조건 하에 시료와 대조군 시료를 항-CLD18 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 CLD18 간에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 이를 시료와 대조군 시료, 즉 기준 시료 간에 서로 비교한다.
본 발명의 항체는 시험관내에서 치료 또는 진단과 관련된 이들의 결합 활성에 대해 초기에 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체는 전술한 바와 같은 유동 계수법을 사용하여 시험할 수 있다.
더욱이, CLD18을 발현하는 세포의 생장을 억제하고 그리고/또는 이러한 세포를 사멸시키는 것을 비롯한, 적어도 1종 이상의 이펙터가 매개하는 이펙터 세포의 활성을 촉발시키는 데에 있어서의 항체의 활성을 검사할 수 있다. 예를 들어, 항체의 CDC를 촉발하는 능력 및/또는 세포 자멸을 촉발하는 능력을 검사할 수 있다. CDC, 호모타입 접착, 분자 클러스팅 또는 세포 자멸에 대한 분석 프로토콜은 본 명세서에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 다음의 생물학적 활성 중 한 가지 이상을 생체내 또는 시험관내에서 일으키는 데 사용될 수 있는데, 즉, CLD18을 발현하는 세포의 생장 및/또는 분화를 억제하는 데에, 그리고 CLD18을 발현하는 세포를 사멸하는 데에, 그리고 이펙터 세포의 존재하에 CLD18을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 데에, 그리고 보체의 존재하에 CLD18을 발현하는 세포의 CDC를 매개하는 데에, 그리고 CLD18을 발현하는 세포의 세포 사멸을 매개하는 데에, 그리고 호모타입 접착을 유도하는 데에, 그리고/또는 CLD18과 결합시 리피트 래프트로의 이송을 유도하는 데에 사용될 수 있다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 항체를 각종 CLD18 관련 질병을 치료, 예방 또는 진단하는 데에 생체내 또는 시험관내에서 사용할 수 있다. CLD18 관련 질병의 예로는 특히, 위암, 췌장암, 식도암, 폐암 등의 암과, 전술한 바와 같은 암이 있다.
CLD18A2는 분화된 정상 위 세포에서도 발현된다. 이들 세포의 사멸에 의한 가능한 항체 유도성 임상학적 부작용은 제산제 등의 위 보호용 약물과 함께 투여함으로써, 또는 오메프라졸 등의 위 프로톤 펌프의 억제제 또는 관련 약물과 함께 투여함으로써 감소시키거나 회피할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물을 투여하는 적당한 생체내 및 시험관내 경로는 이 기술 분야에 알려져 있고, 이 기술 분야의 숙련자들이 선택할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 항-CLD18 항체는 본 발명의 항체에 대한 면역 반응 유도를 감소시키기 위하여 치료제 1종 이상, 예컨대 세포 독성제, 방사선 독성제, 항혈관신생제 및 면역 억제제와 함께 투여될 수 있다. 이 항체는 제제에 연결될 수 있거나 (면역복합체로서), 또는 제제와는 별개로 투여될 수도 있다. 제제와 별개로 투여되는 경우 (별도 투여)의 경우에는, 이 항체는 이 제제를 투여하기 전에, 후에 또는 동시에 투여할 수 있고, 또는 기지의 다른 치료법과 병행할 수 있는데, 이러한 기지의 다른 치료법으로는, 예컨대 항암 치료, 방사선 치료 등이 있다. 이러한 치료제에는 특히 전술한 것과 같은 항종양제가 있다. 본 발명의 항-CLD18 항체와 화학치료제를 동시에 투여하는 것은, 종양 세포에 대한 세포 독성 효과를 생성시키는 상이한 메카니즘을 통하여 작동되는 2개의 항암제를 제공하게 된다. 이러한 동시 투여는 항체와 이들이 반응하지 않도록 유발하는 종양 세포의 항원성의 변화 또는 약물에 대한 내성을 발전시키는 것으로 인한 문제를 해결할 수 있게 하여 준다.
본 발명의 또 한가지 구체적인 실시 상태에 있어서, 항체를 투여받는 개체는 VEGF 또는 VEGFR를 표적화하는 항체를 포함하는 항혈관제 및 혈관 신생을 억제하는 1종 이상의 화합물로 추가로 치료받는다. 이러한 약물로 전처리 하거나 또는 이러한 약물과 병행 치료하는 것은 암 덩어리 (bulk)에 항체가 침투하는 것을 개선시켜 줄 수 있다.
본 발명의 또 한가지 구체적인 실시 상태에 있어서, 항체를 투여받는 개체는 EGFR 수용체에 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는 생장 인자 수용체 신호전달을 억제하는 화합물 및 EGFR, Her1 또는 Her2/neu 수용체에 의하여 개시되는 신호 전달을 억제하는 화합물로 추가로 치료받는다.
표적 특이적인 이펙터 세포, 예컨대, 본 발명의 조성물에 연결된 이펙터 세포 (예컨대 항체, 다중 특이적 및 이중 특이적 분자)는 치료제로서 사용될 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 대식 세포, 호중구 또는 단구 등의 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포로는 호산성구, 내츄럴 킬러 세포 및 기타의 IgG-수용체 함유 세포 또는 IgA 수용체 함유 세포가 있다. 원하는 경우, 이펙터 세포는 치료될 개체로부터 얻을 수 있다. 표적 특이적인 이펙터 세포는 생리학적으로 허용 가능한 용액 중의 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여된 세포 수는 108 내지 109정도일 수 있지만, 이는 치료 목적에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 그 양은 표적 세포에, 예컨대, CLD18을 발현하는 종양 세포에 분포되도록 하기에 충분하고, 예컨대 식세포 작용에 의하여 상기 표적 세포를 사멸시키기에 충분한 양이 될 것이다. 투여 경로는 다양할 수 있다.
표적 특이적인 이펙터 세포로 치료하는 것은 표적 세포를 제거하기 위한 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및/또는 이러한 조성물에 있는 이펙터 세포를 사용하여 항암 치료하는 것은 화학치료법과 병행될 수 있다. 또한, 2개의 구별되는 세포 독성 이펙터 집단을 종양 세포 거부에 사용하는 데에도 복합 면역치료법을 활용할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-RI 또는 항-CD3에 연결된 항-CLD18 항체는 IgG-수용체 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
본 발명의 이중 특이적 및 다중 특이적 분자는, 예컨대, 세포 표면 상의 수용체를 캐핑 및 제거함으로써, 이펙터 세포 상의 Fc-감마R 또는 Fc-알파R 수준을 조절하는 데에도 사용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물도 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
보체에 결합하는 IgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM 으로부터의 부분과 같은 보체 결합 자리를 갖는 본 발명의 조성물 (예컨대, 항체, 다중 특이적 및 이중 특이적 분자와 이뮤노컨쥬게이트)도 보체의 존재하에 사용할 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명의 결합제와 함께 표적 세포 및 적당한 이펙터 세포를 포함하는 세포 집단으로 이루어지는 생체외 치료법은 보체 또는 혈청 함유 보체의 첨가에 의하여 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포 작용은 보체 단백질의 결합에 의하여 개선될 수 있다. 또 한가지의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 조성물로 코팅된 표적 세포는 보체에 의하여 용해될 수도 있다. 또 한가지의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화하지 않는다.
본 발명의 조성물은 보체와 함께 투여될 수도 있다. 따라서, 항체, 다중 특이적 또는 이중 특이적 분자와 함께 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물도 본 발명의 범위에 속한다. 이들 조성물은, 보체가 항체, 다중 특이적 또는 이중 특이적 분자에 근접하여 위치한다는 점에서 장점이 있다.
또는, 본 발명의 항체, 다중 특이적 또는 이중 특이적 분자 및 보체 또는 혈청은 따로 따로 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물이 표적 세포에 결합하면, 세포막의 리피드 래프트로 CLD18 항원-항체 복합체가 이송되는 것을 유발시킬 수 있다. 이러한 이송은 고밀도의 항원-항체 복합체를 생성시키고, 이러한 고밀도는 CDC를 효과적으로 활성화시키고 그리고/또는 증강시킨다.
본 발명의 항체 조성물 (예컨대, 항체 및 이뮤노컨쥬게이트)과, 사용 설명서를 포함하는 키트도 본 발명의 범위에 속한다. 이 키트는 1종 이상의 추가의 시약, 예컨대 면역억제제, 세포 독성제 또는 방사선 독성제와, 1종 이상의 본 발명의 추가의 항체 (예컨대, 보체 활성을 지닌 항체)를 더 함유할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료받는 환자는 본 발명의 항체의 치료 효과를 증강 또는 증대시키는 세포 독성제 또는 방사선 독성제 등의 다른 치료제를 추가로 투여받을 수 있다 (본 발명의 항체를 투여하기 전, 동시에 또는 투여 후에).
또 한가지의 실시 상태에 있어서, 가령 사이토킨으로 개체를 치료하는 것에 의하여, Fc-감마 또는 Fc-알파 수용체의 발현 또는 활성을 증강 또는 억제하는 등 조절하는 제제로 개체를 추가로 치료할 수 있다. 양호한 사이토킨에는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ), 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다. 본 명세서에 기재된 항체 및 약학 조성물의 치료 효과를 증대시키기 위한 다른 중요한 제제로는 측쇄 글루코스 잔기의 호모폴리사카라이드로서, 각종 식물 및 미생물, 예컨대 박테리아, 조류, 균류, 효모 및 곡물에 의하여 제조되는 β-글루칸이 있다. 유기체에 의하여 생성되는 β-글루칸의 단편도 역시 사용 가능하다. 좋기로는, β-글루칸은 β(1,3) 글루코스의 중합체인데, 여기서 백본 글루코스 유닛의 적어도 일부, 예컨대 백본 글루코스 유닛의 3 내지 6%는 β(1,6) 측쇄 등의 측쇄를 가진다.
구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명은 항체 또는 이의 일부가 CLD18과 복합체를 형성하도록 하는 조건 하에, 시료와 대조군 시료를 CLD18과 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 시료 중의 CLD18 항원의 존재를 검출하거나, CLD18 항원의 양을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 이어서 복합체가 형성되었는지를 검출하는데, 여기서 대조군 시료에 대한 시료의 복합체 형성의 차이는 시료 중의 CLD18 항체의 존재의 지표가 된다.
다른 한가지의 실시 상태에 있어서, 본 발명은 CLD18을 발현하는 세포의 존재 여부 또는 양을 생체내 또는 시험관내에서 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은, (i) 검출 가능한 마커에 컨쥬게이팅된 본 발명의 조성물을 개체에게 투여하는 단계와, (ii) CLD18을 발현하는 세포를 함유하는 지역을 동정하기 위하여 상기 검출가능한 마커를 검출하기 위한 수단을 개체에게 노출시키는 단계를 포함한다.
전술한 방법은 특히 암 질환 등의 CLD18 관련 질병을 진단 및/또는 위치 파악 (localization)하는 데에 유용하다. 좋기로는, 대조군 시료 중의 CLD18, 좋기로는 CLD18-A2의 양보다 더 많은 시료 중의 CLD18, 좋기로는 CLD18-A2의 양은 개체에서, 특히 시료가 유래된 인간에서의 CLD18 관련 질병의 존재에 대한 지표가 된다.
또 한가지의 실시 상태에 있어서, 본 발명의 이뮤노컨쥬게이트는 항체에 표적 화합물 (예컨대, 치료제, 표지, 세포 독성제, 방사선 독성제, 면역억제제 등)을 연결시킴으로써 표면에서 발현된 CLD18을 가지는 세포에 상기 화합물들을 표적화시키는 데에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CLD18을 발현하는 세포, 예컨대 순환하는 종양 세포를 생체외 또는 시험관내에서 위치 파악하기 위한 방법도 역시 제공한다.
실시예
본 발명은, 다음에 제공되는 실시예로 더욱 자세히 설명하고자 하는데, 본 발명의 범위를 이러한 실시예로 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
1. CLD18 에 대한 쥣과 항체의 생성
a. 면역화:
인간 CLD18 단편 (SEQ ID NO: 15, 16; 17, 18)을 코딩하는 진핵 생물 발현 벡터를 사용하여 Balb/c 또는 C57/BL6 마우스를 면역화하였다. Set1의 모노클로날 항체 생성을 위해 1일째 및 10일째에 플라스미드 DNA 50 ㎍ 또는 25 ㎍을 대퇴사두근 (근육내, i.m.)에 주사하거나, 또는 Set2의 모노클로날 항체의 생성을 위하여 애쥬번트, 예컨대 CpG의 존재하에 1일째 및 9일째, 1일째 및 11일째, 또는 1일째, 16일째 및 36일째에 주사하였다 (이에 관해서는 표 1b를 참조). CpG를 비롯하여 CLD18A2 (SEQ ID NO: 1)로만 형질 감염시킨 세포 또는 쥣과 가용성 CD4OL를 코딩하는 RNA로 공형질 감염시킨 세포를 근육내 주사하고, PEI-Man를 근육내 또는 복강내 주사하였다. 마우스의 혈청 중에 인간 CLD18에 대한 항체가 존재하는 지를 사용된 구체적인 면역화 프로토콜에 따라서 16일째 및 43일째 사이에 면역 형광 현미경으로 관찰하였다. 인간 CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2) 및 형광 리포터 단백질을 포함하는 융합 구조체를 코딩하는 핵산으로 일시적으로 형질 감염된 HEK293 세포를 사용하여 면역 형광을 측정하였다. 검출 가능한 면역 반응을 보이는 마우스 (도 1)를 Set1의 모노클로날 항체 생성을 위해 비장 절제하기 3일전에 부스팅하였고, 또는 인간 CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2)를 코딩하는 핵산으로 일시적으로 형질 감염된 5 x107 또는 1 x108 HEK293 세포를 복강 주사함으로써 set2의 모노클로날 항체를 생성시키기 위하여 비장 절제하기 3일 전에, 3 및 2일 전에 또는 4, 3, 2일 전에 부스팅하였다 (자세한 것은 표 1b 참조). 표 1a는 각 모노클로날 항체에 대하여 사용된 면역화 프로토콜을 나타낸다.
[표 1a]
Figure 112016129308532-pat00004
표 1b는 구체적인 면역화 프로토콜을 나타낸다.
[표 1b]
Figure 112016129308532-pat00005
b. CLD18 에 대한 인간 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 생성
마우스 비장 세포를 분리하고 이를 표준 프로토콜에 따라서 마우스 미엘로마 세포주에 PEG를 사용하여 융합시켰다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 FACS 분석에 의하여 인간 CLD18을 코딩하는 핵산으로 형질 감염된 HEK293 세포를 사용하여 CLD18 특이성을 가지는 면역 글로불린 생성에 대하여 스크리닝하였다.
면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 P3X63Ag8U.1 비분비 마우스 미엘로마 세포 (ATCC, CRL 1597)와 50% PEG (Roche Diagnostics, CRL 738641)를 사용하여 2:1의 비율로 융합하였다. 세포를 편평 바닥 미세적정 플레이트에 약 3 x 104/웰로 접종하고, 10% 송아지 혈청, 2% 하이브리도마 융합 및 클로닝 보충액 (HFCS, Roche Diagnostics, CRL 1 363 735)과, 10 mM HEPES, 0.055 mM 2-머캅토에탄올, 50 ㎍/ml 젠타마이신 및 1x HAT (Sigma, CRL H0262)를 함유하는 선별 배지 중에서 약 2주 인큐베이션하였다. 10일 내지 14일 후에, 각 웰을 항-CLD18 모노클로날 항체에 대하여 유세포 분석으로 스크리닝하였다. 여전히 항-CLD18 모노클로날 항체에 대하여 양성인 경우에 항체 분비 하이브리도마를 재접종하고 다시 스크리닝한 다음에, 한계 희석법으로 서브클로닝하였다. 안정한 서브클론을 시험관내로 배양하여 특징 분석을 위한 조직 배양 배지 중의 소량의 항체를 생성시켰다. 모세포의 반응성을 보유한 각 하이브리도마로부터의 적어도 1개의 클론을 선택하였다 (FACS법으로). 각 클론에 대하여 9개의 바이얼 세포 뱅크를 생성시키고 액체 질소 중에 저장하였다.
c. CLD18 에 대한 모노클로날 항체 결합의 선별:
항체의 아이소타입을 결정하기 위하여, 아이소타입 ELISA를 수행하였다. 마우스 monoAB ID Kit (Zymed, CRL 90-6550) 또는 IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No. 1493027)를 사용하여, 확인된 CLD18 반응성 모노클로날 항체의 Ig 서브클래스를 측정하였다. 다음 항체들을 발현하는 Set1으로서 이름 붙여진 19개의 하이브리도마 세포주, 즉 CLD18A2-루프D3 (SEQ ID NOs: 17, 18)로 면역화된 C57/BL6 마우스로부터의 세포의 융합물로부터 6개, CLD18A2-루프1 (SEQ ID NOs: 15, 16)로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 세포의 융합물로부터의 13개를 발생시켰다.
24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9
24H5 : 마우스 모노클로날 IgG2b, κ 항체, 182-D758-034
26B5: 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D758-035, DSM ACC2745
26D12: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D758-036, DSM ACC2746
28D10: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D758-040, DSM ACC2747
37G11 : 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D1106-055, DSM ACC2737
37H8: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-056, DSM ACC2738
38G5: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-057, DSM ACC2739
38H3: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-058, DSM ACC2740
39F11: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-059, DSM ACC2741
41C6 : 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D1106-060
42E12: 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D1106-061, DSM ACC2748
43A11 : 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D1106-062, DSM ACC2742
44E10: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-063
47D12: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-064
61C2: 마우스 모노클로날 IgG2b, κ 항체, 182-D1106-067, DSM ACC2743
75B8: 마우스 모노클로날 IgM, κ 항체, 182-D756-001
85A3: 마우스 모노클로날 IgM, κ 항체, 182-D756-002
9E8: 마우스 모노클로날 IgM, κ 항체, 182-D758-011
19B9: 마우스 모노클로날 IgM, κ 항체, 182-D758-024
다음 항체들을 발현하는 Set2로서 이름 붙여진 5개의 하이브리도마 세포주, 즉 CLD18A2-루프D3 (SEQ ID NO: 17, 18) 및 CLD18A2-루프1 (SEQ ID NO: 15, 16)로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 세포의 융합물로부터 1개, CLD18A2-루프1 (SEQ ID NOs: 15, 16)로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 세포의 융합물로부터의 4개를 발생시켰다.
45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10
45C1: 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D758-187
125E1 : 마우스 모노클로날 IgG2a, κ 항체, 182-D1106-279, DSM ACC2808
163E12: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-294, DSM ACC2809
166E2: 마우스 모노클로날 IgG3, κ 항체, 182-D1106-308
175D10: 마우스 모노클로날 IgG1, κ 항체, 182-D1106-362, DSM ACC2810
2. 모노클로날 항체의 생산
CLD18에 대해 반응성인 모노클로날 항체의 생산 및 정제:
기능 분석을 위한 항체의 양 (mg)을 생성시키기 위하여, 하이브리도마 세포를 투석 기반 바이오리액터에 2 x 106 cells/ml로 접종하였다 (CELLine CL1OOO, Integra, Chur, CH). 항체를 함유하는 상징액을 1주에 1회 수확하였다. 마우스 모노클로날 항체를 Melon Gel (Pierce, Rockford, USA)을 사용하여 정제하고 암모늄 술페이트 침전법에 의하여 농축시키거나, FPLC를 사용하여 ProteinA로 정제하였다. 항체 농도 및 순도를 BCA 분석법으로 측정하고, 순도를 소듐 도데실술페이트 겔 전기영동법 및 쿠마시 염색법으로 확인하였다.
3. 모노클로날 항체의 결합 특성
a. WB , IF 에서 형질 감염체의 품질 조절:
CLD18A2 발현 세포를 생성시키기 위하여, HEK293 또는 CHO 세포를 CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) 또는 CLD18A2-myc (SEQ ID NOs: 3, 4)를 코딩하는 핵산으로 형질 감염시켰다.
HEK293 세포를 CLDN1 8A2-myc (SEQ ID NOs: 3, 4)로 형질 감염시키거나, 형질 감염시키지 않고 그대로 두었다. 형질 감염 24시간 후에 세포를 수확하고, 용해시켜 소듐 도데실술페이트 겔 전기영동에 투입하였다. 겔을 블롯팅하고, 마우스 항-myc 항체로 염색하였다. 퍼옥시다아제로 표지한 항 마우스 항체와 함께 인큐베이션한 후, 블롯을 ECL 시약으로 전개시킨 후 LAS-3000 이미저 (Fuji)를 사용하여 가시화시켰다. 형질 감염된 세포 뿐 아니라, 음성 대조군에서도 예상되는 분자량의 CLD18-myc가 관찰되었다 (도 2).
CHO 세포는 CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2)로 형질 감염시켰고, 24시간 동안 챔버 슬라이드에서 생장시켰다. 세포를 메탄올로 고정시키고, CLD18에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용하여 1 ㎍/ml로 60분간 25℃에서 염색하였다. 세척 후에 세포를 Alexa488로 표지된 염소 항-토끼 IgG (Molecular Probes)로 염색하였고, 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 3은 세포막에서 CLD18을 발현하는 형질 감염된 CHO 세포를 비롯하여, 형질 감염되지 않은 세포도 나타내고 있다. 이들 CLD18을 이종 조직에서 발현하는 세포를 항체 결합의 특이성을 시험하기 위한 다음 시험에서 사용하였다.
b. CLD18 에 대한 모노클로날 항체 결합의 선택/ 유세포 분석에 의한 1차 스크리닝:
HEK293 세포를 인간 CLD18A2 (SEQ ID NO: 1, 2) 및 형광 리포터 단백질을 코딩하는 발현 벡터와 함께 분석 40시간 전에 공형질 감염시키거나, 또는 인간 CLD18A2를 안정하게 발현하는 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2)를 사용하고, 프로피듐 아이오다이드 (PI)로 대조 염색하였다. 2 mM EDTA/PBS를 사용하여 세포 탈착 후 세포를 완전한 생장 배지로 세척하였고, U-형 바닥 미세적정 플레이트에 약 1-5 x 105 세포/웰로 접종하였다. 세포를 30분간 4℃에서 하이브리도마 상징액과 함께 인큐베이션한 후 1% 가열불활성화 FBS/PBS로 2단계 세척한 다음에, APC 또는 Alexa647-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 특이적 2차 항체와 함께 최종 인큐베이션하였다. 2단계의 세척 단계 후에, 공형질 감염된 세포를 CellFIX (BD Biosciences)로 고정하였다. BD FACSArray를 사용하여 유세포 분석으로 결합을 분석하였다. 형광 마커 발현을 x축에 나타내고, 항체 결합을 y축에 나타내었다. 모든 마우스 항체 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10는, 모노클로날 항체 24H5 (도 4a, Q2에서의 세포), 85A3 (도 4b), 175D10, 125E1, 163E12, 166E2 및 45C1 (도 4c, Q1에서의 세포)를 함유하는 하이브리도마 상징액에 대하여 예시된 바와 같이 형광 마커 발현 세포 표면 (도 4, Q2에서의 세포)에 특이적으로 결합하는 것으로 검출되었다.
c. Myc - 또는 HA -태깅된 CLD18A2 에 대한 항체 결합의 비교:
확인된 CLD18에 특이적인 모노클로날 항체의 결합 특성을 더 구체화하였다. 따라서, 모노클로날 항체 결합을 에피토프 태그를 삽입함으로써 만들어진 CLD18A2 돌연변이체에 대하여 분석하였다. CLD18A2-HA (SEQ ID NO: 6)는 CLD18A2-루프1에서 HA-에피토프를 함유한 반면에, CLD18A2-Myc (SEQ ID NO: 4)는 CLD18A2-루프2로 삽입되는 Myc-에피토프를 함유하였다. 이들 태그는 에피토프의 파괴를 유발하기 때문에, 확인된 모노클로날 항체는 돌연변이 중 어느 하나에 대한 결합이 손실되는 것에 따라서 세분할 수 있다. 형광 마커 및 인간 CLD18A2로, 또는 형광 마커 및 CLD18A2-HA로, 또는 형광 마커 및 CLD18A2-Myc로 일시적으로 공 형질 감염된 HEK293 세포를 30분간 4℃에서 CLD18-특이적 모노클로날 항체를 함유하는 하이브리도마 상징액과 함께 인큐베이트한 다음에, Alexa647-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트하였다. BD FACSArray로 분석하기 전에, 세포를 CellFIX를 사용하여 고정하였다. 도 5에서 24H5, 9E8, 26B5 및 19B9에 대하여 예시된 바와 같이, 모노클로날 항체는 이들의 결합 특성에 따라 다음의 4개의 군으로 세분할 수 있다. (i) 변형되지 않은 CLD18A2 및 CLD18A2-HA과 CLD18A2-Myc에 결합하는 항체, 예컨대, 24H5, (도 5a), 또는 (ii) CLD18A2-HA에 결합하지 않는 항체, 예컨대, 9E8, (도 5b), 또는 (iii) CLD18A2-Myc에 결합하지 않는 항체, 예컨대 26B5, (도 5c), 또는 (iv) CLD18A2-HA 뿐만 아니라 CLD18A2-Myc에도 결합하지 않는 항체, 예컨대 19B9, (도 5d).
d. 유세포 분석에 의한 인간 CLD18A1 대 CLD18A2 형질 감염체에 대한 항체 결합의 비교:
CLD18A2 아이소폼에 대한 확인된 모노클로날 항체의 결합 특성을 유세포 분석으로 분석하였다. 인간 CLD18A2을 안정하게 발현하는 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2)와 인간 CLD18A1 (SEQ ID NOs: 7, 8)를 안정하게 발현하는 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A1)를 30분간 4℃에서 모노클로날 항체를 함유하는 하이브리도마 상징액과 함께 인큐베이트한 다음에, Alexa647-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트하고, 세포를 고정하거나, 또는 고정하지 않고 PI 대조 염색을 하였다. BD FACSArray를 사용하여 유세포 분석으로 결합을 분석하였다. 도 6은 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 175D10로 이루어지는 패널에서 확인되었던 모노클로날 항체의 2개의 군에 대한 예를 나타낸다. 즉, (i) 인간 CLD18A2에는 특이적으로 결합하지만, 인간 CLD18A1에는 결합하지 않는 모노클로날 항체 43A11, 45C1, 및 163E12 (도 6a,b) 및 (ii) 인간 아이소폼 모두에 대하여 결합하는 모노클로날 항체 37H8 (도 6a)이 그것이다.
e. 면역형광 현미경을 사용한 인간 CLD18A1 대 CLD18A2 형질 감염체에 대한 항체 결합의 비교:
HEK293 세포를 CLD18A1 (SEQ ID NO: 8) 또는 CLD18A2 (SEQ ID NO: 2)의 융합 단백질 및 형광 리포터를 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질 감염시키고, 챔버 슬라이드 상에서 성장시켰다. 세포를 고정하지 않고 염색하거나, 조직 배양 상징액을 함유하는 모노클로날 항체와 함께 파라포름알데히드로 30분 동안 37℃에서 고정한 후 염색하였다. 세척 후에, 세포를 Alexa555로 표지된 항-마우스 Ig 항체 (Molecular Probes)로 염색하였다. 항체의 결합을 형광 현미경으로 관찰하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 항체 37G11는 CLD18A2 (도 7a)와 특이적으로 반응하였지만 CLD18A1 (도 7b)와는 반응하지 않는다. 대조적으로, 항체 26B5는 CLD18A2 및 CLD18A1 양자와 모두 반응한다 (도 8).
항체 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9에 대하여, 살아 있는 세포와 파라포름알데히드로 고정된 세포의 염색 간에는 선명한 차이가 관찰되었다. 세포를 고정한 경우에는 항체는 일정한 막을 형성하였다 (도 7c, 8c, 8d). 대조적으로, 이들 항체와 함께 살아 있는 세포를 인큐베이션한 것은 작은 반점처럼 보이는 염색 패턴 (도 7a, 8a, 8b)으로 단백질 클러스트를 생성시킨다. 이들은 살아 있는 세포의 표면에서 발견되었기 때문에 네이티브 에피토프에 모든 항체가 결합하는 것임을 보여준다.
f. 내생적으로 발현하는 세포주의 측정:
CLD18A2 유전자 특이적 프라이머 페어 (SEQ ID NO: 11, 12)를 RT-PCR 분석에 사용하여 CLD18A2의 발현에 대하여 세포주를 스크리닝하였다. 인간 위암종 세포주 NCI-SNU-16 (ATCC CRL-5974), NUGC-4 (JCRB0834) 및 KATO-III (ATCC HTB-103) 및 인간 췌장 선암종 세포주 DAN-G (DSMZ ACC249)는 CLD18를 강하게 내생적으로 발현하는 것으로 밝혀졌다 (도 9). CLD18에 대한 토끼 폴리클로날 혈청을 사용하여 염색함으로써 단백질 수준에서 발현을 확인하였다.
g. CLD18 특이적인 항체를 사용하여 내생적으로 발현하는 세포주를 염색하고 면역 형광 분석함:
DAN-G, SNU-16, NUGC-4 및 KATO-III 세포를 표준 조건 하에 있는 챔버 슬라이드에서 성장시켰다. 세포를 고정하지 않거나, 또는 메탄올로 고정한 후, 각 항체로 염색하였다. 항체 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9에 대하여, 세포 표면 염색 결과는 도 10, 11 및 12a에 예시된 것과 같이 관찰되었다. 항체 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 및 175D10에 대하여, 네이티브 에피토프 인식을 측정하였고, 세포 표면 염색을 도 12b에 나타낸 바와 같이 고정되지 않은 세포 상에서 관찰하였다. 항체의 하위군은 세포-세포 계면 상에서 우세하거나, 다른 세포에 근접하지 않은 막의 자유로운 부분에서 세포막의 균질한 염색을 나타내었다. 다른 항체는 별개의 포사이 (foci)를 염색하였고, 세포막 상의 집합체는 함께 CLD18의 호모타입 또는 헤테로타입 회합에 의하여 마스킹되는 에피트포와, 이미 형성된 타이트 정션에서 접근 가능한 CLD18 에피토프를 비롯하여 상이한 에피토프에 결합하는 것임을 증명한다.
h. 유세포 분석을 사용하여 내생적으로 발현하는 세포주를 염색함
살아 있는 KATO-III 및 NUGC-4 세포 상에서 구조적으로 발현된 CLD18A2의 표면 발현을 유세포 분석으로 분석하였다. 이는 KATO-III 및 NUGC-4 세포를 모노클로날 항체 61C2 또는 163E12로 염색하고, Alexa647-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트한 다음, 세포를 고정하거나 고정하지 않는 것에 의하여 예시된다. 결합은, BD FACS Array를 사용하여 유세포 분석에 의하여 측정하였다. 도 13은, KATO-III 세포의 최소한 70.3%에 대한 61C2의 강한 결합과, KATO-III 및 NUGC-4 세포 상의 CLD18A2에 대한 163E12의 강한 발현을 나타낸다.
i. 마우스 및 인간 CLD18A1 및 CLD18A2 의 서열 정렬:
서열 비교에서 인간 CLD18A2 (NP_ 001002026) 및 인간 CLD18A1 (NP_057453)는 N-말단이 다르고, 마우스 CLD18 변이체 (NP_062789 및 AAL15636)는 분자 간의 고상동성 및 서열 변이 부위를 증명하였다 (도 14 참조).
j. 유세포 분석을 사용하여 분석된 쥣과 CLD18A1 및 쥣과 CLD18A2 와의 항체 반응성:
쥣과 CLD18A2 및 CLD18A1에 대한 확인된 모노클로날 항체의 결합을 유세포 분석으로 분석하였다. 형광 마커 및 쥣과 CLD18A2 (SEQ ID NO: 33, 35)로, 또는 형광 마커 및 쥣과 CLD18A1 (SEQ ID NOs: 36, 37)로 일시적으로 공형질 감염된 HEK293 세포를 각각 인간 CLD18-특이적 모노클로날 항체 38G5, 38H3, 37G11, 45C1 및 163E12를 함유하는 하이브리도마 상징액과 함께 30분간 4℃에서 인큐베이트한 후, Alexa647-컨쥬게이티드 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트하고 세포를 고정하였다. 결합은, BD FACSArray를 사용하여 유세포 분석으로 측정하였다. 도 15는 세 가지 상이한 결합 특성을 나타내고 있다. 즉, 쥣과 CLD18 아이소폼에는 결합하지 않는 38G5 및 45C1, 쥣과 CLD18A2에는 결합하지만 쥣과 CLD18A1에 결합하지 않는 37G11, 및 163E12와, 쥣과 CLD18A1 및 CLD18A2 양자에 모두 결합하는 38H3. 이들 항체는 전임상 연구에서 CLD18 모노클로날 항체의 잠재적인 독성을 측정하기 위한 유용한 도구이다.
이들 데이터를 종합하면, 본 발명의 CLD18에 대하여 생성시킨 모노클로날 항체인 24H5, 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12, 61C2, 75B8, 85A3, 9E8, 19B9, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 및 175D10는 인간 CLD18의 상이한 에피토프에 대한 결합 특성 및 위상학을 나타낸다.
실시예 3b, c, d, e, g, h, 및 j에 여러 가지 특성을 종합하면, 이들 모노클로날 항체를 상이한 부류로 카테고리를 나눌 수 있다.
4. 면역 조직 화학 ( IHC )
SEQ ID NO: 21의 펩티드를 사용하여 면역화함으로써 생성된 항체에 특이적인 CLD18A2 에피토프를 CLD18A2 발현의 면역 조직 화학 특징 분석을 위하여 사용하였다. 정상 및 종양 조직의 폭넓은 패널로부터 유래한 파라핀 매립 조직 절편을 단백질 발현 및 위치 파악 분석에 사용하였다. 위를 제외한 다른 정상적인 기관 조직에서는 유의한 발현이 검출되지 않았다 (표 2, 도 16a 참조). 대조적으로, CLD18A2 발현은 위암 및 폐암을 포함한 상이한 암에서 면역 조직 화학으로 확인하였다 (도 16b).
위 점막에서의 CLD18A2의 발현은 베이스 (base) 및 피트 (pit) 영역에서 위 상피의 최종적으로 분화된 세포에 한정되었다는 점이 흥미롭다. 대조적으로, 위 점막의 넥 (neck) 부위에 있는 세포, 특히 전체 점막을 재공급하는 이스트무스 (isthmus) 부분에 있는 위 줄기 세포는 CLD18A2를 발현하지 않는다 (도 16c).
[표 2]
Figure 112016129308532-pat00006
모노클로날 항체 39F11을 면역 조직 화학 CLD18A2 특이적 연구에 사용하였다. 도 17a에 나타난 바와 같이, 위를 제외하고는 모든 시험된 정상 조직 상에서 유의한 반응성이 검출되지 않았지만 (도 17a), 위암종 및 폐암종이 강하게 양성을 유지하였다 (도 17b).
본 발명의 다른 그룹의 항체들은 위암에 결합하는 특이적인 암 염색 패턴을 보였지만, 정상적인 위 조직과는 반응성을 보이지 않았다. 이러한 염색 패턴은 모노클로날 항체 26B5를 사용하여 도 18a에 나타나 있다.
HEK293 종양 세포주로부터 유래한 절편에서 175D10 (도 18b), 43A11 (도 18c), 163E12 (도 l8d) 및 45C1 (도 18e)의 특이성 분석을 위하여 면역 조직 화학 분석을 사용하였다. 인간 CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) 또는 CLD18A1 (HEK293-CLD18A1)를 안정하게 발현하거나 또는 선별을 위한 항생제 내성 유전자만을 함유하는 발현 대조군 플라스미드로 형질 감염된 (HEK293-mock) HEK293 종양 세포주를 마우스에 이식하여 고형 종양을 만들었다. mock-형질 감염된 HEK293 이종 이식편 종양에서 발현은 검출되지 않았다. 대조적으로, HEK293-CLD18A2 이식편 종양 및 위암종 표본에서는 강하고 균질한 막 염색이 관찰되었다.
5. 보체 의존성 세포 독성 ( CDC )
a. 유세포 분석에 의하여 측정된 Set1 의 모노클로날 항체의 CDC :
건강한 지원자로부터 혈액을 튜브 [S-Monovette-EDTA vacutainer tubes (Sarstedt, Nurmbrecht, Germany)]에 채취하고, 600 g에서 20분간 원심분리하여, 보체 용해를 위한 혈장을 준비하였다. 혈장을 수확하여 -20℃에서 보관하였다.
첫번째 실험에서, 하이브리도마 상징액을 인간 CLD18A2를 안정하게 발현하는 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2)에 대한 보체 의존성 세포 독성 (CDC)를 유발하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다. 세포를 각각 모노클로날 항체 85A3, 28D10, 24H5 또는 26D12를 함유하는 하이브리도마 상징액과 함께 각각 20분간 실온에서 인큐베이트하였다. 원심분리 (450 g로 5분)한 후, 상징액을 제거하고 DMEM 중의 20% 인간 혈장 (37℃로 예열)을 세포에 가하고, 20분 더 37℃에서 인큐베이트하였다. 그 다음, 세포 용해를 피로피듐 아이오다이드 (PI) 염색법을 사용하여 FACS로 측정하였다. PI를 최종 농도 2.5 ㎍/ml로 첨가하였다. 유세포 분석을 위해서, BD FACSArray 유세포 분석을 사용하였다 (BD Biosciences, Mountain View, CA). 전면 측면 스캐터 (FCS) 역치를 보정함으로써 세포 데브리 (debris)는 배제시키고, 최소한 10000회의 자료를 모아서 분석에 사용하였다. 용해된 세포 (PI-양성 세포)의 비율을 도 19에 나타내었다. 모노클로날 항체 85A3, 28D10 및 26D12는 HEK293-CLD18A2 세포의 각각 33.5%, 38.2% 및 39.2%의 용해를 유발하였지만, 24H5에 의하여 매개되는 CDC는 단 19.3%에 불과하였다.
b. Set1 의 모노클로날 항체의 CDC :
두번째 실험에서는, CLD18A2 발현 세포에 대한 CDC를 유발하는 모노클로날 항체의 특이성을 분석하였다. 그러므로, 인간 CLD18A2에 특이적으로 결합하거나, 또한 인간 CLD18A1에 결합하는 항체의 세트를 인간 CLD18A2 (CHO-CLD18A2) 또는 인간 CLD18A1 (CHO-CLD18A1)로 안정하게 형질 감염된 CHO 세포에 대한 CDC-유도에 대하여 시험하였다. CHO-CLD18A2 및 CHO-CLD18A1 세포를 조직 배양 편평 바닥 미세적정 플레이트 중에 3 x 104 /웰의 밀도로 분석하기 24시간 전에 접종하였다. 이튿날, 성장 배지를 제거하고, 세포를 모노클로날 항체 24H5, 26D12, 28D10, 37G1 1, 37H8, 38G5, 38H3, 39F11, 41C6, 42E12, 43A11, 44E10, 47D12 및 61C2 각각을 함유하는 10 ㎍/ml 농도로 조정한 하이브리도마 상징액과 함께 3회 인큐베이트하였다. 배경 용해 및 최대 용해를 측정하기 위하여 대조군 세포를 성장 배지와 함께 인큐베이트하거나, 0.2% 사포닌을 함유하는 성장 배지와 함께 인큐베이트하였다. 실온에서 20분간 인큐베이션한 후 상징액을 제거하고, DMEM 중의 20% 인간 혈장 (37℃로 예열)을 세포에 가하고 37℃에서 20분 더 인큐베이트하였다. 이어서, 상징액을 2.5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 PBS로 갈아주고, 520 nm에서 여기시킨 후 형광 발광을 테칸 사파이어를 사용하여 측정하였다. 특이적 용해 %는 다음과 같이 계산하였다: 특이적 용해 (%) = (시료의 형광 - 배경 형광)/(최대 용해 형광 - 배경 형광 ) x 100. 도 20은 모노클로날 항체 26D12, 28D10, 37H8, 38H3 및 39F11는 CHO-CLD18A2 세포에 대한 CDC를 고수준으로 매개하고, 모노클로날 항체 38G5는 CHO-CLD18A2 세포에 대한 CDC를 중간 수준으로 매개하고, 모노클로날 항체 41C6 및 61C2는 CHO-CLD18A2 세포에 대한 CDC를 저수준으로 매개하고, 모노클로날 항체 24H5, 37G11, 42E12, 43A11, 44E10 및 47D12는 CHO-CLD18A2 세포에 대한 CDC를 매개하지 않았음을 나타낸다. 대조적으로, 항체 중 어느 것도, CHO-CLDA1 세포에 대한 CDC를 유도할 수 없었지만, 26D12, 28D10, 37H8, 38H3, 39F11, 41C6, 47D12 및 61C2는 유세포 분석 및 면역 형광으로 측정하였을 때 CLD18A1에 결합하였다.
c. Set1 의 모노클로날 항체를 사용한 모노클로날 항체 적정 및 CDC :
저농도 CDC를 유도하기 위한 항-CLD18 항체의 능력을 측정하기 위하여, 이 3가지 상이한 항체를 적정하는 실험을 수행하였다. 미세적정 플레이트 중에서 자라고 있는 CHO-CLD18A2 세포를 실온에서 20분간 각각 75B8 (100, 30, 10, 3 및 1 ㎍/ml), 37H8 (10, 3.3 및 1 ㎍/ml) 및 28D10 (10, 1 및 0.1 ㎍/ml) 농도 범위로 함께 인큐베이트하였다. 상징액을 제거하고, DMEM 중의 20% 인간 혈장 (37℃로 예열)을 세포에 첨가하고, 37℃에서 20분 간 더 인큐베이트하였다. 테칸 사파이어를 사용하여 분석하기 전에, 상징액을 2.5 ㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는 PBS로 대체하였다. 도 21a-c는 항체 농도에 대한 특이적 용해 %를 나타내고 있다. 모노클로날 항체 75B8은 10 ㎍/ml에서 31.0%의 CHO-CLD18A2 세포의 용해를 유발하고, 1 ㎍/ml (도 21a)에서 6.2%로 감소되는 반면에, 모노클로날 항체 28D10 및 37H8는 각각 1 ㎍/ml에서 39% 및 26.5% 특이적 용해를 유발하였다 (도 21b, 21c).
d. 유세포 분석에 의하여 측정한 Set2 의 모노클로날 항체의 CDC :
건강한 지원자로부터 혈액을 튜브 [S-Monovette-EDTA vacutainer tubes (Sarstedt, Nurmbrecht, Germany)]로 채취하고, 600 g에서 20분간 원심분리하여, 보체 용해를 위한 혈청을 준비하였다. 혈청을 수확하여 -20℃에서 보관하였다. 대조군 혈청을 56℃에서 30분간 가열불활성화시킨 다음에 보관하였다.
하이브리도마 상징액을 인간 CLD18A2를 내생적으로 발현하는 KATO-III 세포에 대한 보체 의존성 세포 독성 (CDC)을 유발하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다. 세포를 각각 모노클로날 항체 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 및 175D10를 함유하는 비정제 또는 정제 하이브리도마 상징액과 함께 30분간 37℃에서 인큐베이트하였다. RPMI 중의 20% 인간 혈청을 세포에 가하고, 30분 더 37℃에서 인큐베이트하였다. 그 다음, 세포 용해를 프로피듐 아이오다이드 (PI) 염색법을 사용하여 FACS로 측정하였다. PI를 최종 농도 2.5 ㎍/ml로 가하였다. 유세포 분석을 위해서, BD FACSArray 유세포 분석에서는 유세포 분석을 사용하였다 (BD Biosciences, Mountain View, CA). 전면 측면 스캐터 (FCS/SSC) 역치를 보정함으로써 세포 데브리 (debris)는 배제시키고, 최소한 10000회의 자료를 모아서 분석에 사용하였다. 특이적인 용해는 다음 식에 따라 계산하였다: 특이적 용해 (%) = (시료 중 PI 양성 세포 % - 가열 불활성화시킨 혈청 시료 중 PI 양성 세포 %). 163E12에 대해 특히 강한 CDC 매개 용해가 관찰되었다.
6. 항체 의존성 세포내 세포 독성 ( ADCC )
안정하게 인간 CLD18A2 (HEK293-CLD18A2) 또는 인간 CLD18A1 (HEK293-CLD18A1)를 발현하는 HEK293 세포에 대한 항체 의존성 세포내 세포독성 (ADCC)를 유발시키는 능력에 대하여 하이브리도마 상징액을 분석하였다.
a. 인간 말초 혈액 단핵구의 농축:
건강한 수여자로부터의 인간 혈액을 인산 완충액 (PBS)으로 2회 희석하고, 혈구 세포를 Ficoll (Lymphocyte Separation Medium 1077 g/ml, PAA Laboratories, cat. no. Jl 5-004)에 레이어드하였다. 말초 혈액 단핵구 (MNC)를 계면으로부터 모으고, 세척한 후 10% 가열 불활성화 송아지 혈청, 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배양 배지 중에 재현탁시켰다.
b. ADCC 셋 업 ( set up ):
표적 세포를 형광 증강 리간드 (BADTA, Perkin Elmer cytotoxicity assay kit DELFIA EuTDA Cytotoxicity Reagents, cat. no. ADOl 16)로 30분간 표지하였다. 10 mM 프로펜시드 [probenecid; (Sigma, cat. no. P8761)], 10-20 mM HEPES, 및 10% 가열 불활성화 송아지 혈청이 보충된 RPMI-10 중에서 강력 세척한 후, 세포들을 1 x 105 세포/ml로 조정하였다. 표지된 표적 세포, 이펙터 세포 (MNC) 및 10 ㎍/ml로 농도로 조정된 모노클로날 항체를 함유하는 상징액을 둥근 바닥 미세적정 플레이트에 가하였다. 분리된 이펙터 세포에 대하여, 이펙터 대 표적 (E:T) 비율 100:1을 사용하였다 (50:1 및 25:1에 대한 데이터는 나타내지 않음). 인큐베이션 (2시간, 37℃)후에, 원심분리하여 분석을 멈추고, 듀플리케이트로부터의 형광 리간드 방출을 시간에 따라 형광측정기를 사용하여 유로품 수로서 측정하였다. 세포내 세포 독성의 %는 다음 식을 사용하여 계산하였다. 특이적 용해 (%) = (실험적 방출 갯수 - 자발적 방출 갯수)/(최대 방출 갯수 - 자발적 방출 갯수) x 100. 이 때 최대 형광 리간드 방출은 트리톤 X-100 (0.25% 최종 농도)을 표적 세포에 첨가함으로써 측정되며, 자발적 방출은 항체 및 이펙터 세포의 부재하에 측정한 것이다. 도 22는 모노클로날 항체 26B5, 37H8, 38G5, 47D12 및 61C2는 HEK293-CLD18A2 세포에 대한 ADCC를 매개함을 보여준다. 대조적으로, 이들 항체는 CLD18A1 표적에 대하여 유의하지 않거나 매우 낮은 수준의 세포 독성을 유발하는데, 이는 곧 CLD18A2 특이적 ADCC를 증명해 주는 것이다 (도 23).
7. 증식 억제
정제된 쥣과 모노클로날 항체를 인간 CLD18A2를 내생적으로 발현하는 KATO-III 세포의 세포 성장을 억제하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다. CLD18A2를 내생적으로 발현하는 1 x 104 개의 표적 세포 (KATO-III)를 모노클로날 항체 약 lO㎍의 존재하에 배양하였다.
DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200)는 마이크로플레이트에서 증식 중인 세포의 DNA 합성 도중 도입되는 5-브로모-2'-데옥시우리딘 (BrdU) 양을 측정하는 것에 기반한 비방사선 동위원소면역 분석법이다. 도입된 BrdU는 유로퓸으로 표지된 모노클로날 항체를 사용하여 검출한다. 항체를 검출하기 위하여, 세포들을 고정하고 픽스 (Fix) 용액을 사용하여 DNA를 변성시켰다. 결합되지 않은 항체를 세척해 내고 DELFIA 인듀서를 표지된 항체로부터 용액으로 유로품 이온을 해리시키기 위하여 첨가한다. 상기 용액에서 이들은 DELFIA 인듀서의 성분과 매우 강한 형광 킬레이트를 형성한다. 시간에 따른 형광 측정법을 사용하여 형광을 측정한 것은 각 웰의 세포에서의 DNA 합성과 비례한다.
강한 증식 억제가 각각 항체 125E1, 163E12, 45C1, 37G11, 37H8, 28D10 및 166E2을 사용하여 관찰되었다. 중간 정도의 증식 억제가 쥣과 항체 각각 43A11, 175D10, 42E12, 26D12, 61C2 및 38H3을 사용하여 관찰되었다.
8. 치료용 마우스 이종 이식 모델에서의 성능
CLD18A2에 특이적으로 결합하는 확인된 모노클로날 항체의 치료 잠재성을 치료용 이종 이식 모델에서 연구하였다.
a. 마우스에서 고도로 CLD18A2 를 발현하는 종양의 조기 치료
SCID 마우스에 인간 CLD18A2를 고수준으로 안정하게 발현하는 1 x 107 개의 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2)를 피하 접종하였다. HEK293-CLD18A2 세포 중의 인간 CLD18A2 발현 수준은 환자로부터의 1차 위암 중의 발현 수준에 필적하였다. 각 실험 처리군은 10마리의 마우스로 이루어진다 (그룹당 마우스 마리수 n=10). 종양 접종 3일 후에 마우스 치료를 시작하였다. 쥣과 모노클로날 항체 26B5, 26D12, 28D10, 37G11, 37H8, 38G5, 39F11, 42E12, 43A11, 38H3, 또는 61C2를 나타내는 정제된 하이브리도마 상징액 200 ㎍을 4주간에 걸쳐 1주에 1회 정맥내 주사하였다. 또는 쥣과 모노클로날 항체 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 또는 175D10를 함유하는 정제된 하이브리도마 상징액 200 ㎍을 6주간에 걸쳐 1주에 2회 정맥내 및 복강내 주사법을 교대로 사용하여 투여하였다. 치료된 마우스의 종양 성장을 1주에 2회 관찰하였다 [(종양 부피 = (길이 x 폭 x 폭) /2 (mm3)]. 마우스는 심각한 경우 또는 종양 부피가 500 mm3에 이르렀을 경우에 사망하였다. 도 24는 본 발명의 항체에 의하여 HEK293-CLD18A2 종양 세포 성장이 강하게 억제된 것을 예시한다. 도 25A 및 25B는 HEK293-CLD18A2 세포를 사용하는 조기 치료용 이종 이식 모델에서 본 발명의 항체를 사용한 치료에 의한 생존율 연장을 나타낸다.
b. 마우스에서 고도로 CLD18A2 를 발현하는 종양에서 후반에 시작한 치료
전술한 바와 같은 조기 치료와는 반대로 후반에 치료를 시작하는 프로토콜로서, 동일한 HEK293-CLD18A2 세포에 기반한 종양 이종 이식 모델을 고안하였다. 종양 세포를 접종 후 27일째에, 하나의 시험군이 5 내지 6마리의 마우스군을 포함하도록 마우스를 섞은 다음에, 각각 쥐과 모노클로날 항체 43A11, 163E12, 및 175D10를 함유하는 정제된 하이브리도마 상징액 200 ㎍을 사용하여 치료를 시작하였다. 항체를 6주간에 걸쳐 1주에 2회 정맥내 및 복강내 주사법을 교대로 사용하여 투여하였다. 이 모델에서 본 발명의 항체는 종양 성장을 억제시키는 것으로 보였다. 몇 가지 항체에서 이는 생존율의 연장이라는 결과를 가져왔다 (도 26).
c. 저수준의 CLD18A2 를 발현하는 종양의 조기 치료
SCID 마우스에 DAN-G 종양 세포주 2 x 105개 세포로 피하 접종한 후에, CLD18A2 단백질을 저수준으로 보존적으로 발현하는 침습형 인간 췌장 선암종 세포주를 접종하였다. 종양 이식 후 3일째에 마우스 (그룹당 10마리)의 치료를 시작하였다. 쥣과 모노클로날 항체 45C1, 125E1, 163E12, 166E2, 또는 175D10를 함유하는 정제된 하이브리도마 상징액 200 ㎍을 6주간에 걸쳐 1주에 2회 정맥내 주사 및 복강내 주사법을 교대로 사용하여 투여하였다. 생체내에서의 췌장 DAN-G 종양 세포주의 공격적이고 신속한 종양 성장에 기인하여, 마우스에서는 몇 일 안에 종양 카켁시아가 발달되었고 마우스가 수일 내에 사망하였다. 결과적으로 치료 효과를 측정하기 위한 도구가 협소함에도 불구하고 본 발명의 항체에 의하여 매개되는 종양 성장 억제 및 생존율 연장을 이 모델에서 관찰할 수 있었다 (도 27a 및 27b).
d. 본 발명의 항체는 마우스에서 부작용을 유발하지 않음
쥣과 CLD18A2-특이적 프라이머 페어 (s: CTA CCA AGG GCT ATG GCG TTC, as: GCA CCG AAG GTG TAC CTG GTC)를 정상적인 마우스 조직의 폭넓은 패널로부터 유래된 cDNA를 증폭시키기 위한 RT-PCR 분석에 사용하였다 (도 28 참조).
쥣과 CLD18A2의 발현은 위를 제외하고는 시험된 여하한 정상 조직에서는 검출되지 않았다 (도 28 참조). 더욱이, 인간 및 마우스 CLD18A2와 교차 반응하는 CLD18A2 특이적 항체를 정상적인 마우스 조직의 대형 패널 중에서 CLD18A2 발현의 면역 조직 화학 분석에 사용하였다 (표 3 참조). 정상적인 위 조직을 제외하고, 모든 시험된 정상 조직은 CLD18A2를 발현하지 않았다. 인간 CLD18A2에서 관찰한 바와 같이, 본 발명자들은 마우스의 대응부에 대하여 표면 상피 및 더 안쪽의 선와부 (crypt) 세포가 이들의 세포 표면에서 CLD18A2를 발현하고, 중심부의 경부 (neck) 영역은 CLD18A2에 음성이라는 사실을 발견하였다 (도 29 a 내지 c 참조). 요약하면, CLD18A2의 조직 분포는 사람과 마우스 간에 동일한 것으로 보인다.
[표 3]
Figure 112016129308532-pat00007
본 발명자들은 또한 항체 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10에 의하여 매개되는 마우스에서의 잠재적인 부작용을 연구하였다. 이들 항체들은 모두 쥣과 CLD18A2 및 인간 단백질과 반응하는 것으로 FACS 분석에 의하여 이미 밝혀져 있었다.
이들 항체로 치료를 하는 도중 또는 그 후에 마우스에서 눈에 띄는 부작용은 없었을 뿐 아니라, 미처리된 (PBS-처리된) 마우스와 비교하여 항체로 처리한 마우스의 위 점막에서 관찰된 독성과 면역 조직학적 특성이 관련있지도 않았다 (도 30 참조).
e. 키메라 모노클로날 항체를 사용하여 마우스에서 고도로 CLD18A2 를 발현하는 종양의 조기 치료
키메라 모노클로날 항체를 사용한 것을 제외하고 실시예 8과 유사한 방식으로, 본 발명의 항체를 사용하여 마우스에서 고도로 CLD18A2를 발현하는 종양의 조기 치료를 연구하였다. 약술하자면, SCID 마우스에 고도로 인간 CLD18A2를 안정하게 발현하는 1 x 107개 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2)를 피하 접종하였다. 각 실험군에는 10마리의 마우스를 포함시켰다. 종양 접종 3일 후에 마우스 치료를 시작하였다. 키메라 모노클로날 항체 ch-163E12 또는 ch-175D10 (아래의 실시예 9 참조)를 생성하도록 일시적으로 형질 감염시킨 HEK293T 세포의 정제된 세포주 상징액 200 ㎍을 6주간에 걸쳐 1주에 2회 정맥내 주사 및 복강내 주사법을 교대로 사용하여 투여하였다. 본 발명의 키메라 항체에 의한 HEK293-CLD18A2 종양 세포 성장의 강한 억제가 관찰될 수 있었다. 도 34는 HEK293-CLD18A2 세포를 사용하여 조기 치료용 이종 이식 모델에서 본 발명의 키메라 항체를 사용하여 치료함으로 인한 생존율 연장을 보여주고 있다.
f. 마우스에서 고도로 CLD18A2 을 발현하는 종양의 키메라 모노클로날 항체를 사용하여 후반에 시작하는 치료
전술한 바와 같은 HEK293-CLD18A2 세포를 기준으로 한 동일한 종양 이종 이식 모델을, 전술한 바와 같은 조기 치료와는 반대의 후기 치료 시작 프로토콜로서 고안하였다. 종양 세포 접종 8일 후, 하나의 그룹당 9마리를 포함하는 시험군으로 무작위로 마우스를 나누었고, 키메라 모노클로날 항체 ch-163E12 또는 ch-175D10 (아래의 실시예 9 참조)를 생성하도록 일시적으로 형질 감염시킨 HEK293T 세포의 정제된 세포 배양 상징액 200 ㎍을 사용하여 치료를 시작하였다. 항체를 6주간에 걸쳐 1주에 2회 정맥내 및 복강내 주사 방법을 교대로 사용하여 투여하였다. 이 모델에서, 본 발명의 키메라 항체는 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 몇 가지 키메라 항체에서도, 이는 생존율 연장이라는 결과를 가져왔다 (도 35).
9. 항체의 키메라화
a. 마우스/인간 키메라 모노클로날 항체의 생성
전체 RNA 및 이어서 단일 스트랜드 cDNA를 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 인간 비장 조직으로부터 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려져 있는 표준 방법에 의하여, 예컨대 RNeasy Midi Kit (Qiagen) 및 Superscript II 역전사효소 (Invitrogen)를 사용함으로써 제조하였다.
*인간 카파 경쇄의 불변 영역을 PCR에 의하여 PBMC cDNA로부터 증식시켰다. 센스 올리고머 (SEQ ID NO: 38)를 불변 영역의 5' 말단의 BamHI 제한 부위에 첨가하고, 불변 영역에서 처음 나오는 두개 아미노산 (Arg-Thr)을 코딩하는 원래 핵산 서열 5'-CGAACT-3'을 5'-CGTACG-3'로 변화시켜, 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 BsiWI 제한 부위를 만들었다. 안티센스 올리고머 (SEQ ID NO: 39)는 정지 코돈을 포함하였고, 증폭된 불변 영역의 3' 말단에는 NotI 제한 부위가 첨가되었다. PCR 산물 및 표준 발현 벡터 (예컨대 pcDNA3.1(+), Invitrogen)를 BamHI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 순서대로 인큐베이션하였다. 이 벡터를 송아지의 소장 알칼리 포스파타아제로 추가 처리하여 재순환되는 것을 방지하였다. 불변 영역을 벡터에 마지막으로 연결함으로써, 이제 불변 영역 앞에 있는 가변 영역의 그 다음에 오게 되는 융합이 잔여 벡터 다중 클로닝 자리로부터의 HindIII 제한 자리 (5'-AAGCTT-3')를 통하여, 그리고 PCR 산물로 생성된 BsiWI 제한 자리 (5'-CGTACG-3')를 통하여 가능해진다. 벡터에 삽입된 인간 카파 경쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO:40으로 나타내고, 인간 카파 불변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:41로 나타낸다.
인간 감마-1 중쇄의 불변 영역을 PCR로 비장 cDNA로부터 증폭시켰다. 5' 인산화 센스 올리고머 (SEQ ID NO:42)를 천연 발생 ApaI 제한 자리에 위치하게 하고, 불변 영역의 시작 부위에서 하류 쪽으로 11개의 뉴클레오티드를 배치시키며, 불변 영역의 증폭된 부위의 5' 말단에 있는 HindIII 제한 자리에 첨가하였다. 5' 인산화된 안티센스 올리고머 (SEQ ID NO: 43)는 정지 코돈을 포함하였고, 증폭된 불변 영역의 3' 말단에 있는 NotI 제한 자리에 첨가하였다. 이렇게 생성된 PCR 생성물은 블런트 엔드 (blunt end)이었고, 5'에 인산화된 형태이다. 증폭된 감마 불변 영역을 분별되는 안티센스 올리고머 (SEQ ID NO: 44)를 사용한 PCR과 서열 분석에 의하여 IgG1의 어떤 서브클래스인지를 확인하였다. 경쇄의 발현에 사용된 벡터의 항생제 내성 (예컨대, 네오마이신)과 상이한 항생제 내성 (예컨대, 하이그로마이신)을 갖는 표준 발현 벡터 (예컨대, pcDNA3.1(+)/Hygro, Invitrogen)를 PmeI 제한 효소와 함께 인큐베이션하여, 다중 클로닝 자리를 완전히 제거하고 블런트 엔드를 남기도록 하였다. 벡터를 송아지 소장 알칼리 포스파타아제로 추가 처리하여 재순환을 방지하였다. 불변 영역을 벡터에 최종적으로 연결하여, 불변 영역 앞에 있는 가변 영역의 그 다음에 오게 되는 융합이, PCR 생성물을 사용하여 생성된 HindIII 제한 자리(5'-AAGCTT-3')를 통하여, 그리고 ApaI 제한 자리 (5'-GGGCCC-3')를 통하여 이제 가능하게 된다. 벡터 중의 불변 영역의 올바른 방향, 즉 벡터의 프로모터가 진행하기에 적합한 방향을 서열 분석에 의하여 확인하였다. ApaI 제한 자리의 위치에 기인하여, 이러한 목적에 맞는 가변 영역의 임의의 증폭은 ApaI 자리의 서열에 더하여 인간 감마-1 불변 영역의 서열의 처음에 오는 11개 뉴클레오티드를 포함하여야 한다. 벡터에 삽입된 이와 같은 방법으로 증폭된 인간 감마-1 중쇄 불변 영역의 서열은 SEQ ID NO:45로 나타내며, 발현된 인간 감마-1 불변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 46으로 나타낸다.
[표 4]
Figure 112016129308532-pat00008
키메라 모노클로날 항체의 쥣과 대응부에 해당하는 것은 "ch-"라는 접두어를 사용하여, 예컨대 ch-43A11, ch-163E12, ch-125E1, ch-166E2, ch-175D10, ch-45C1과 같이 명명하였다.
경쇄 및 중쇄의 쥣과 가변 영역의 증폭을 Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.6)에 설명된 바와 같은 "스텝 아웃 (step-out) PCR" 방법에 따라 수행하였다. 이를 위하여, 전체 RNA를 이 기술 분야의 숙련자들에게 알려진 표준 방법에 의하여, 예컨대 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 모노클로날 하이브리도마 세포주 (표 4 참조)로부터 제조하였다. 단일 스트랜드 cDNA를 Matz et al. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558)에 기재된 바와 같은 "주형 스위치 (template-switch)" 방법에 따라 제조하였다. (dT)30 올리고머 (SEQ ID NO: 47) 외에도, 이는 cDNA 스트랜드의 중합 동안에 주형 스위칭에 대한 5' 어댑터로서 작용하는 DNA/RNA 하이브리드 올리고머 (SEQ ID NO: 48)를 포함하였다. 이 어댑터 올리고머에서, 마지막 세개의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 대신에 리보뉴클레오티드였다. 이어서 안티센스 올리고머에 사용된 후속 "스텝 아웃 PCR"은 감마쇄의 서브클래스 1, 2a 또는 3 (각각 SEQ ID NO: 49 내지 52)의 불변 영역 또는 마우스 카파쇄의 불변 영역에 표적화되었다. 하이브리도마 세포주에 의하여 생성된 쥣과 모노클로날 항체의 IgG 서브클래스를 IsoStrip를 사용하여 면역학적으로 분석하였고 (실시예 1 참조), 적당한 안티센스 올리고머를 이에 따라 선택하였다 (표 4 참조). 프라이머 믹스는 SEQ ID NO: 53 및 54로 나타낸 두 개의 올리고머를 포함하는 "스텝 아웃 PCR"에서 센스 올리고머로서 작용하였다. 일부 하이브리도마 세포주는 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄를 발현하였다 (하이브리도마의 생성을 위하여 사용된 미엘로마 세포주에 의하여 발현된 쇄 외에도). 표 4는 쥣과 항체 쇄의 클로닝되고 서열 분석된 가변 영역의 SEQ ID NO (SEQ ID NO: 55 내지 69 및 SEQ ID NO: 132 내지 146) 및 클로닝 되고 서열 분석된 전장 키메라 항체 쇄 (SEQ ID NO: 100 내지 129)를 요약한 것이다.
확인된 쥣과 가변 영역을 5' UTR 및 3' 마우스 불변 영역을 생략하고, 인간 불변 영역을 보유하는 제조된 발현 벡터로 서브클로닝하게 하는 말단의 제한 부위를 첨가하여, PCR로 증폭시켰다. 더욱이, 센스 올리고머는 컨센서스 Kozak 서열 (5'-GCCGCCACC-3' 또는 5'-AGCCACC-3')을 제공하였고, 중쇄 가변 영역에 대한 안티센스 올리고머는 ApaI 제한 자리 외에도 인간 감마-1 불변 영역의 처음 11개 뉴클레오티드를 포함하였다 (참조: 표 4, SEQ ID NO: 70 내지 99). 카파 경쇄 가변 영역을 HindIII 및 BsiWI 제한 효소, HindIII 및 Apa1 제한 효소가 필요한 감마 중쇄 가변 영역을 사용하여 클로닝하였다. 모노클로날 항체 45C1의 감마 중쇄 가변 영역은 내부 HindIII 제한 자리를 포함하였다. 여기에서 호환 가능한 BsaI 효소를 대신 사용하였다 (참조: SEQ ID NO: 80). SEQ ID NO: 100 내지 114는 생성된 키메라 항체의 핵산 서열을 나타내고 있다 (참조: 표 4). SEQ ID NO: 115 내지 129는 발현된 키메라 항체의 아미노산 서열을 나타내고 있다 (표 4 참조).
b. CLD18 에 대한 키메라 항체의 생성 및 생산
CLD18 특이성을 갖는 키메라 항체를 생성하는 포유류 세포주를 생성시켰다. 이 세포주는 HEK293T 세포로부터 유래한 것이다 (ATCC CRL-11268). 형질 감염시키기 하루 전에, 2.5 x 107개 세포를 14.5 cm 조직 배양 접시에 플레이팅하고, 완전 배지 20 ml에서 배양시키거나, 또는 1 x 107개 세포를 10 cm 조직 배양 접시에 플레이팅하고, 완전 배지 10 ml 중에서 배양시키거나, 또는 12-웰 조직 플레이트에 0.6 x 106개 세포를 플레이팅하고, 완전 배지 2 내지 3 ml 중에서 배양하였다 (완전 배지: DMEM:항생제 없이 10% FBS가 보충된 F12 배지). 형질 감염 시에 권장되는 세포 농도는 90% 컨플루언스 정도여야 한다. 형질 감염 직전에, 배지를 새 배지로 갈아주었다. HEK293T 세포를 형질 감염 시약, 예컨대 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) 또는 폴리에틸렌이민 (Sigma-Aldrich, 408727)으로 형질 감염시켰다. HEK293T 세포의 형질 감염에 대하여 예시된 것은, 14.5 cm 조직 접시에 대하여 총 DNA 양 110 ㎍ 또는 296 ㎍, 그리고 Lipofectamine 2000 및 PEI 각각에 대한 형질 감염제 대 DNA의 비율은 1:2.5 및 1:12였다. 형질 감염 24시간 후에, 배지를 GMP 적합 배지, 예컨대, X-Vivo 15 (Cambrex) 또는 혈청을 함유하지 않는 Pro293a (Cambrex) 등의 화학적 배지로 갈아주었다. CLD18에 대한 키메라 모노클로날 항체를 생성하는 형질 감염된 HEK293T 세포를 96시간 더 배양하였다. 조질 상징액을 수확하고, 멸균 여과한 다음에 단백질 A-세파로스로 정제하였다. 항체 농도는 BCA 분석으로 결정하고, 소듐 도데실술페이트 겔 전기영동 및 쿠마시 염색으로 순도를 확인하였다.
c. 키메라 모노클로날 항체의 결합 특징
CLD18A2에 대하여 클로닝되고 생성된 키메라 모노클로날 항체의 결합 특이성을 실시예 3에 설명된 바와 같이 유세포 분석으로 분석하였다. 인간 CLD18A2을 안정하게 발현하는 살아 있는 HEK293 세포 (HEK293-CLD18A2) 및 인간 CLD18A1를 안정하게 발현하는 HEK293 세포 (SEQ ID NO: 7, 8)(HEK293-CLD18A1)를 키메라 모노클로날 항체를 함유하는 정제된 HEK293T 세포 배양 상징액과 함께 4℃에서 30분간 인큐베이트한 다음에, APC-컨쥬게이트 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcγ 2차 항체와 함께 인큐베이트하고, PI로 반대 염색하였다. BD FACSArray를 사용하여 유세포 분석으로 결합을 분석하였다.
마찬가지로, 예컨대 KATO-III 및 NUGC-4 세포와 같이 내생적으로 CLD18A2를 발현하는 인간 종양 세포주를 유세포 분석으로 분석하였다.
도 31a 및 31b는 키메라 항체 ch-43A11, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2, 및 ch-175D10의 유세포 분석 결과를 나타낸다. 이들 모두 네이티브 에피토프 인식을 보여주었으며, CLD18A2에 대한 특이적이고 강한 결합을 보여주었으나, CLD18A1 발현 세포에 대하여는 그러하지 아니하였다.
d. 보체 의존성 세포 독성 ( CDC )
Serum-Monovette vacutainer 튜브 (Sarstedt, Nurmbrecht, Germany)에 건강한 지원자로부터 혈액을 채취하고 이를 600 g로 20분간 원심분리하여 보체 용해용 혈청을 준비하였다. 혈청을 수확하여 -20℃에서 보관하였다. 대조군 혈청을 56℃에서 30분간 가열 불활성화시킨 후 보관하였다.
단백질 A-세파로스로 정제된 본 발명의 키메라 항체를 인간 CLD18A2를 내생적으로 발현하는 KATO-III 세포와, 안정하게 형질 감염된 CHO-CLD18A2 세포에 대한 보체 의존적 세포 독성 (CDC)를 유도하는 능력에 대하여 분석하였다. 최종 농도 2.5 ㎍/ml 내지 35 ㎍/ml로 모노클로날 항체 ch-163E12, ch-166E2, 및 ch-175D10과 함께 각각 30분간 37℃에서 세포를 인큐베이트하였다. RPMI 중의 20% 인간 혈청을 세포에 첨가하고, 이를 30분 37℃에서 더 인큐베이트하였다. 그 이후, 사멸한 세포와 살아 있는 세포를 최종 농도 2.5 ㎍/ml로 PI 염색하여 구분하고, 항체 매개 세포 용해의 %를 유세포 분석으로 측정하였다. 유세포 분석을 위하여, BD FACSArray 유세포 분석을 사용하였다 (BD Biosciences, Mountain View, CA). 전방향 측방향 스캐터 (FSC/SSC) 역치를 조정함으로써 세포 데브리는 배제시키고 최소 10000회 분석 결과를 수집하였다. 특이적 용해는 다음 식에 따라 계산하였다. 특이적 용해 = (시료 중 PI 특이적인 세포 % - 가열 불활성화시킨 혈청이 함유된 시료 중의 PI 양성 세포 %). CDC에 의하여 매개된 특이적 용해가 몇 가지 항체에 대하여 관찰되었다. 모든 세 가지 항체는 CHO-CLD18A2 세포에 대한 강한 CDC를 매개하였다 (도 32). KATO-III 세포에 대하여, 항체 ch-163E12 및 ch-175D10는 강한 CDC의 유발자 (inducer)였다.
e. 항체 의존성 세포내 세포 독성 ( ADCC )
FPLC로 정제된 본 발명의 키메라 항체를 내생적으로 인간 CLD18A2를 발현하는 KATO-III 세포에 대하여 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC)을 유도하는 이들의 능력에 대하여 분석하였다.
건강한 수여자로부터의 인간 혈액을 인산 완충액 (PBS) 중에 2회 희석시키고, 혈구 세포를 Ficoll (1077 g/ml, Pharmacia)에 레이어드하였다. 원심 분리 후에, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 계면으로부터 모으고, 세척하여 5% 가열 불활성화된 인간 혈청이 보충된 X-Vivo-15 배양 배지 중에 재현탁시켰다.
분석 15시간 전에, KATO-III 세포를 루시페라아제로 형질 감염시키고, 백색 마이크로플레이트 중에 5 x 104 세포/웰로 플레이팅하였다.
이 분석을 위하여, 이펙터 대 표적 (E:T) 비율 20:1로 이펙터 세포 (PBMC, 전술한 바와 같이 준비한 것) 및 FPLC로 정제된 키메라 항체를 첨가하고 2 내지 3시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이트하였다. 웰 중의 항체의 최종 농도는 50 ㎍/ml였다. 예비 배양 2-3시간 후에, 루시페르 옐로우 (BD Biosciences, San Jose USA)를 1 mg/ml로 첨가하였다. 생존 세포에 있는 루시페라아제에 의한 루시페르 옐로우의 산화로부터 유래한 발광을 마이크로플레이트-리더 (Infinite200, Tecan, Switzerland)를 사용하여 최대 6시간까지 연속 측정하였다. 세포내 세포 독성의 %를 다음 식을 사용하여 계산하였다. 특이적 용해 % = 100-((시료의 발광 카운트 (count) -자발적 발광 카운트)/(최대 발광 카운트-자발적 발광 카운트)x100, 여기서 자발적 발광은 Triton X-100 (최종 농도 0.2%)를 첨가함으로써 측정하고, 최대 신호는 항체가 부재할 때 측정하였다.
이 분석법을 사용하여, 모노클로날 항체 ch-163E12 및 ch-175D10는 KATO-III 세포에 대하여 강한 ADCC를 매개하는 것으로 나타났다 (도 33).
f. 증식 억제
FPLC로 정제된 본 발명의 키메라 항체를 내생적으로 인간 CLD18A2를 발현하는 KATO-III 세포의 성장을 억제하는 이의 능력에 대하여 분석하였다. 표적 세포 (KATO-III)를 키메라 항체의 존재 하에 배양하였다 (참조: 쥣과 항체의 증식 억제, 실시예 7). FPLC로 정제된 키메라 항체 ch-163E12 및 ch-166E2는 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다.
10. 임상적인 선도 ( clinical lead ) 후보자로서 항체의 선별
이상적인 임상적인 선도 후보자는 광범위한 치료적 및 진단적 용도 모두를 포함한다 (여기에 관해서는 섹션 IV - 본 발명의 용도 및 방법도 역시 참조하라). 본 발명에 따르면, CLD18-A2에 대한 항체가 제공된다. 본 발명에 따른 항체는 특이성, CDC 및 ADCC를 유도하는 능력 및 CLD18을 발현하는 세포, 특히 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 관한 폭넓은 범위의 특성을 제공한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 항체의 키메라화는 부모 세대의 쥣과 분자에 존재하지 않는 추가의 Fc-의존적 이펙터 기능의 획득을 유도하였음이 증명되었다. 예를 들어, 쥣과 IgG1을 사용한 항체 175D10는 보체 의존성 세포 독성을 유발하지 않지만 (실시예 5 참조), 인간 IgG1을 사용한 ch-175D10는 CLD18를 발현하는 종양 세포의 특이적 용해를 유발한다 (표 5 및 표 6 참조).
본 발명에 따라 제공되는 항체는 이들의 결합 특성, 또는 CLD18을 발현하는 세포에 대한 이펙터 기능을 매개하는 이들의 능력에 따라 별개의 부류로서 카테고리를 나눌 수 있다. 본 발명에 따라 제공되는 항체로부터, 임상적인 선도 후보자는 이들의 기능 특징에 기초하여 선별할 수 있다. 본 발명의 선택된 쥣과 및 키메라 항체에 대한 특성을 종합한 것은 각각 아래의 표 5 및 6에 제공된다.
본 발명의 임상적인 선도 후보자는 다음 나열하는 특성 중 한가지 이상을 지닐 수 있다.
a) 인간 CLD18A2에 대하여 결합하나, 인간 CLD18A1에는 결합하지 않음 (예컨대, 43A11, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10, 및 ch-43A1l, ch-45C1, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 및 ch-175D10). 예컨대, 도 6a 및 6b 참조.
b) 마우스 CLD18A2에는 결합하나, 마우스 CLD18A1에는 결합하지 않음 (예컨대, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10). 예컨대, 도 15a 및 15b 참조.
c) 종양 세포에 의하여 천연 발현되는 CLD18에 대하여 결합 (예컨대, 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10, 및 ch-45C1, ch-43A1l, ch-125E1, ch-163E12, ch-166E2 및 ch-175D10). 예컨대, 도 13 참조.
d) 세포내 접촉 지역에서 CLD18에 대하여 결합 (예컨대, 45C1, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10). 예컨대, 도 12a 및 12b 참조.
e) CLD18을 발현하는 세포의 CDC 유도 사멸을 매개 (예컨대, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10, 및 ch-163E12 및 ch-175D10). 예컨대, 도 32 참조.
f) CLD 18을 발현하는 세포의 ADCC 유도 사멸을 매개 (예컨대, ch-163E12 및 ch-175D10). 예컨대, 도 33 참조.
g) CDL18을 발현하는 세포의 증식 억제 (예컨대, 45C1, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10, 및 ch-163E12 및 ch-166E2).
h) CLD18을 발현하는 세포로 이종 이식한 모델에서 종양 성장을 억제함 (예컨대, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2, 및 175D10). 예컨대, 도 24 참조.
i) CLD18을 발현하는 세포로 이종 이식한 모델에서 생존율 연장 (예컨대, 43A11, 125E1, 163E12, 166E2 및 175D10). 예컨대, 도 25b 참조.
리드 후보자 선별을 위한 특성의 예시적인 개요
[표 5]
Figure 112016129308532-pat00009
[표 6]
Figure 112016129308532-pat00010
11. 에피토프 분석
본 발명의 항체에 의하여 인식되는 에피토프의 매핑은 문헌 ["Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) by Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9] 및 ["Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 by Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay]에 설명된 바와 같이 수행할 수 있다.
약술하자면, 에피토프 매핑을 위하여, 항원의 아미노산 서열에서 유래한 합성 오버래핑 펩티드 (SPOT-합성에 의하여 제조)에 의하여 펩티드 스캔이 생성될 수 있다. 펩티드 스캔 멤브레인을 TBS로 세척하고, 10% 밀크/Tween 20-TBS으로 차단하고, 철야로 4℃에서 5% 밀크/Tween 20-TBS로 희석된 퍼옥시다아제와 컨쥬게이팅한 본 발명의 항체와 함께 인큐베이트한 다음, Tween20-TBS 및 TBS로 세척하고, 예컨대, ECL Lumi-Light (Roche)로 현상한 후 Lumi Imager로 검출한다.
a. 분자 에피토프 분석
인간 CLD18의 제1 세포외 도메인 (ECD1)은 아미노산 서열 8개 위치에서만 차이가 있었고, 두 가지 아이소폼 간의 높은 상동성을 보여주었다 (도 14 참조).
위(胃)에 특이적인 아이소폼 CLD18A2만을 선택적으로 인식하는 모노클로날 항체를 선택하였다 (실시예 1 참조). 두 가지 아이소폼에서의 차이 중에서 중요한 아미노산을 결정하기 위하여, 한 가지 아이소폼에 있는 대응 위치에서 발견되는 것으로 다른 아이소폼에 있는 아미노산을 교환함으로써 CLD18 단백질에 아미노산 치환을 만들었다. 구체적으로는, 8개의 변이체가 만들어졌는데, CLD18A1의 아미노산 서열과 상이한 CLD18A2 ECD1에서 8개의 아미노산의 각 변이체는 CLD18A1에서의 대응 위치에서 발견되는 아미노산으로 치환된 것이었다. 3개의 CLD18A2 변이체를 만들었는데, 여기에서 각 변이체에서 2개의 아미노산은 CLD18A1의 대응 위치에서 발견되는 아미노산, 즉 8개 아미노산의 두 번째 및 세 번째, 세 번째 및 네 번째, 및 네 번째 및 다섯 번째 아미노산으로 치환되어 있다. 다른 아이소폼 CLD18A1에 대한 해당 11개 구조체는 CLD18A1에서의 해당 아미노산을 CLD18A2에서 발견되는 것으로 치환함으로써 만들어진다.
변경된 CLD18 단백질은 각 CLD18 아이소폼에 대한 핵산 코딩을 돌연변이시키고, 돌연변이된 핵산을 표준 발현 벡터로 클로닝함으로써 생성된다.
만들어진 CLD18A2 변이체에 대하여 시험된 항체의 감소된 결합 특성 및 만들어진 CLD18A1 변이체에 대하여 증가된 결합 특성을 유세포 분석을 통하여 관찰하였다. 변형되지 않은 야생형 CLD18A1 및 CLD18A2도 분석에 포함시켰다.
이를 위하여, HEK293 세포를 야생형 CLD18A1 또는 CLD18A2 또는 이의 돌연변이 변이체를 코딩하는 핵산으로 일시적으로 형질 감염시켜 인간 CLD18A1 또는 CLD18A2 발현 세포를 생성하였다. 형질 감염체를 본 발명의 시험된 항체와 함께 인큐베이트하고, 유세포 분석으로 결합 특성을 분석하였다.
마우스 모노클로날 항체 44 E4 D3 F11 (182-D1106-179, IgG2a, κ)는 세포 표면 상의 CLD18A1 및 CLD18A2 양자를 모두 인식한다. 항체 ch-175D10는 야생형 CLD18A2에 대한 강하고 특이적인 결합을 보여주었다 (표 7 참조). 항체 ch-175D10는 다음 아미노산 치환, 즉 변이체 3: A42S; 변이체 4: N45Q; 변이체 6: E56Q을 갖는 CLD18A2 변이체 3, 4, 및 6에는 결합하지 않는다. 변이체 3 및 4의 단일 아미노산 치환 중 적어도 하나를 함유하는 CLD18A2 이중 변이체에 결합하지 않는 것도 관찰되었다.
[표 7]
Figure 112016129308532-pat00011
b. 펩티드 스캔을 통한 에피토프 매핑
본 발명의 항체에 의하여 인식되는 에피토프를 확인하고 매핑하기 위하여, CLD18A2의 제1 세포외 도메인의 아미노산 서열에서 유래한 합성 오버래핑 펩티드 (SPOT-Synthesis에 의하여 제조)에 의하여 펩티드 스캔을 제조하였다. 전체 항원 서열을 직선형 15mer 펩티드 (11개 아미노산의 오버랩이 있음)로서 Jerini AG, Berlin, Germany에 의하여 합성하였으며, 본 발명의 항체의 결합에 대하여 추후 시험하였다. 더욱이, 직선형 펩티드 사이에 이황화 결합 형성을 회피하기 위하여 직선형 펩티드의 모든 시스테인을 세린으로 치환하였다. 본 발명의 키메라 모노클로날 항체를 제조업자의 지침 (Pierce, EZ-Link Plus Activated Peroxidase Kit)에 따라 퍼옥시다아제와 함께 컨쥬게이트하고, 펩티드 스캔과 함께 인큐베이트하였다. CLD18A2에 대한 특이적 에피토프 인식을 발광에 의하여 관찰하였다. 표 8에서는, CLD18A2의 제1 세포외 도메인의 아미노산 서열에서 유래한 합성 펩티드에 대한 키메라 모노클로날 항체 ch-175D10 및 ch-163E12의 결합 강도가 나타나 있다.
[표 8]
Figure 112016129308532-pat00012
항체 ch-175D10 및 ch-163E12 양자는 적어도 두 개의 결합 자리를 갖는 불연속적인 (입체 배열) 에피토프를 인식하는데, 이는 핵심 아미노산 잔기가 1차 단백질 구조에서 떨어진 채로 두 개 이상의 결합 부위에 분포되어 있다는 것을 말한다. 폴딩할 때에 이들 결합 영역은 단백질 표면에서 함께 조합되어 복합 에피토프를 형성한다. 시스테인 교환이 없는 펩티드 1 및 7에 대한 항체 ch-175D10의 강한 결합과, 두 개의 시스테인 대신에 세린을 함유하는 펩티드 7에 대한 약한 결합은, 시스테인이 에피토프 인식이라는 중추 역할을 하고, 단백질 폴딩에도 관여할 것이라는 것을 암시한다 (도 36). 이러한 데이터들은 두 가지 키메라 항체에 대한 에피토프를 함유하는 CLD18A2의 제1 세포외 도메인에 대하여 3가지 상이한 단백질 폴딩 모델을 제시한다 (도 37). 도 37에 제시된 제1 모델에서는, 시스테인 모두를 함유하는 직선형 펩티드 7을 나타내며, 제2 모델에서는 분자간 이황화 결합은 루프를 만들어냄을 나타내며, 제3 모델에서는 2개의 분자간 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인을 나타내고 있다.
12. 항체 친화도의 결정
Scatchard 분석을 통하여 결합 상수를 측정하기 위하여, 본 발명의 항체가 인간 CLD18A2에 결합하는 것을 안정하게 CLD18A210를 발현하는 HEK293 세포에 대하여 적정할 수 있고, 유세포 분석으로 분석할 수 있다. 또는 본 발명의 인간 항체 또는 키메라 항체는 컨쥬게이트되지 않은 마우스-항-인간 IgG 및 FITC-컨쥬게이트된 염소-항-마우스 IgG의 샌드위치에 의하여 검출될 수 있다. 각 항체 인큐베이트 단계는 FACS 완충액 중에서 2회 세척한 후 40℃에서 30분간 수행할 수 있다. 본 발명의 쥣과 항체는 FITC와 컨쥬게이트된 2차 항체 염소-항-마우스를 사용하여 바로 검출 가능하다. 2차 및 3차 항체를 사용하여 본 발명의 항체를 샌드위치 검출하는 것은 QIFIKIT 키트 (DAKO, Glostrup, Denmark)를 사용하여 본 발명의 결합된 항체 수를 정량 분석하는 것을 필요로 할 수 있다. 이 키트를 사용하여, 결합된 항체수는 제조업자의 지침에 따라 유세포 분석으로 측정할 수 있다. 평균 형광 강도와 결합된 IgG 간의 매우 비례하는 관계가 얻어졌다. 데이터를 Scatchard plotting으로 분석하고, 결합 곡선으로부터 직접 KD를 측정하는 것이 가능하다. 해리 상수는 문헌 [Krause et al., Behring Inst. Mitt. 87: 56-67, 1990 및 Nauendorf et al., Int J Cancer 100:101-120, 2002]에 따라 계산할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체의 해리 상수는 CLD18A2를 안정하게 발현하는 HEK293-CLD18A2 세포를 사용하는 유세포 분석 기반 결합 분석에 의하여 측정하였다. 세포 결합 데이터의 Scatchard 분석 결과, 쥣과 및 키메라 175D10 및 163E12에 대하여 10-8 M 내지 10-9 M 해리 상수가 얻어졌다. 문헌 [Krause et al., Behring Inst. Mitt. 87: 56- 67, 1990 및 Nauendorf et al., Int J Cancer 100:101-120, 2002]에 따라 해리 상수를 계산하였다.
13. 오르토로거스 교차 반응성 ( Orthologous cross - reactivity )
인간 및 쥣과 CLD18A2 및 CLD18A1에 대한 결합을 유세포 분석으로 분석하였다. 형광 마커 및 쥣과 CLD18A2 (SEQ ID NOs: 33, 35)로 일시적으로 공형질 감염되었거나, 또는 형광 마커 및 쥣과 CLD18A1 (SEQ ID NOs: 36, 37)로 일시적으로 공형질 감염되었거나, 또는 형광 마커 및 인간 CLD18A2 (SEQ ID NOs: 1, 2)로 일시적으로 공형질 감염되었거나, 또는 형광 마커 및 인간 CLD18A1 (SEQ ID NOs: 7, 8)로 공형질 감염된 HEK293 세포를 ch-175D10, ch-163E12 및 ch-125E1과 함께 30분간 4℃에서 인큐베이트한 다음에, 알로피코시아닌과 커플링된 항-인간 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이트하였다 (30분, 4℃).
도 38은 항체 ch-175D10, ch-163E12 및 ch-125E1에 대한 결합 특성을 나타내고 있다. 이들 항체는 이들의 쥣과 대응부에 대하여 실시예 3j에서 기재된 바와 같이, 전임상 연구에서 CLD18 모노클로날 항체의 잠재적 독성을 결정하기 위한 유용한 도구이다.
14. CLD18A2 는 1차 위종양 및 위암 전이에서 고수준 원형질막 발현을 나타낸다
1차 위암 및 위암 전이 (크루켄베르크 종양 & 림프절)로부터 유래한 임의 추출의 표본을 GC182-특이적 토끼 항 혈청으로 염색하였다. 면역 조직 화학 및 염색 강도로 평가하고 (음성, 약=l, 중=2, 강=3), 원형질막이 염색된 것을 나타내는 종양 세포의 비율 (0-100%) 측정을 전문적 임상 병리학적 방법으로 수행하였다 (도 39 참조). 도 39에서, 각 원은 독립적인 종양 표본을 나타낸다. 염색 강도가 통계학적으로 유의하게 증가된 것이 전이에서 관찰되었다 (p=0,034, Fisher's exact test).
미생물 또는 생물학적 물질 기탁에 관한 기재 (PCT 규칙 13 bis )
Figure 112016129308532-pat00013
신규 국제 출원 마니메드 파마슈티컬스 아게 등
"암 치료를 위한 Claudin-18에 대한 모노클로날 항체"
레퍼런스 번호:342-38 PCT
생물학적 물질에 대한 별지
기탁 사항에 대한 추가 기재:
1) 수탁물 (DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSM ACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는
DSMZ-독일 미생물보존센터 (독일 38124 브라운슈바이크 마스체로데르 베그 1b)이다.
2) 수탁물 (DSM ACC2808, DSM ACC2809, DSM ACC2810)에 대한 수탁 기관의 명칭 및 주소는
DSMZ-독일 미생물보존센터 (독일 38124 브라운슈바이크 인호펜슈트라세 7B)이다.
Figure 112016129308532-pat00014
상기에 언급된 모든 기탁에 대한 추가 기재 사항
-마우스 (Mus musculus) 비장 세포와 융합된 마우스 미엘로마 P3X63Ag8U.1
-인간 Claudin-18A2에 대한 항체를 분비하는 하이브리도마
3) 기탁자:
상기 언급된 모든 기탁은 가니메드 파마슈티칼스 아게 (독일 55131 마인츠 프라일리히라트슈트라세 12)에 의하여 이루어졌다.
DSMZ DSMACC2737 20051019 DSMZ DSMACC2738 20051019 DSMZ DSMACC2739 20051019 DSMZ DSMACC2740 20051019 DSMZ DSMACC2741 20051019 DSMZ DSMACC2742 20051019 DSMZ DSMACC2743 20051019 DSMZ DSMACC2745 20051117 DSMZ DSMACC2746 20051117 DSMZ DSMACC2747 20051117 DSMZ DSMACC2748 20051117 DSMZ DSMACC2808 20061026 DSMZ DSMACC2809 20061026 DSMZ DSMACC2810 20061026
SEQUENCE LISTING <110> Ganymed Pharmaceuticals AG et al. <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST CLAUDIN-18 FOR TREATMENT OF CANCER <130> 342-38 PCT <150> EP 07 010 622.4 <151> 2007-05-29 <150> US 60/932,099 <151> 2007-05-29 <160> 157 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786 <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 3 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtgaa 480 caaaaactca tctcagaaga ggatctgggg atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca 540 tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg 600 atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct 660 tatcatgcct cgggccacag tgttgcctac aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc 720 tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag 780 gtacaatctt atccttccaa gcacgactat gtgtaa 816 <210> 4 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Glu 145 150 155 160 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Met Val Gln Thr Val Gln 165 170 175 Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly 180 185 190 Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly 195 200 205 Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser 210 215 220 Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly 225 230 235 240 Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg 245 250 255 Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 260 265 270 <210> 5 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgtac ccatacgacg tgccagacta cgcactgggg 240 ctgccagcca tgctgcaggc agtgcgagcc ctgatgatcg taggcatcgt cctgggtgcc 300 attggcctcc tggtatccat ctttgccctg aaatgcatcc gcattggcag catggaggac 360 tctgccaaag ccaacatgac actgacctcc gggatcatgt tcattgtctc aggtctttgt 420 gcaattgctg gagtgtctgt gtttgccaac atgctggtga ctaacttctg gatgtccaca 480 gctaacatgt acaccggcat gggtgggatg gtgcagactg ttcagaccag gtacacattt 540 ggtgcggctc tgttcgtggg ctgggtcgct ggaggcctca cactaattgg gggtgtgatg 600 atgtgcatcg cctgccgggg cctggcacca gaagaaacca actacaaagc cgtttcttat 660 catgcctcgg gccacagtgt tgcctacaag cctggaggct tcaaggccag cactggcttt 720 gggtccaaca ccaaaaacaa gaagatatac gatggaggtg cccgcacaga ggacgaggta 780 caatcttatc cttccaagca cgactatgtg taa 813 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Leu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile 85 90 95 Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys 100 105 110 Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu 115 120 125 Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly 130 135 140 Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr 145 150 155 160 Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr 165 170 175 Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly 180 185 190 Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu 195 200 205 Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser Gly 210 215 220 His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe 225 230 235 240 Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr 245 250 255 Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser Lys His Asp Tyr Val 260 265 270 <210> 7 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgtccacca ccacatgcca agtggtggcg ttcctcctgt ccatcctggg gctggccggc 60 tgcatcgcgg ccaccgggat ggacatgtgg agcacccagg acctgtacga caaccccgtc 120 acctccgtgt tccagtacga agggctctgg aggagctgcg tgaggcagag ttcaggcttc 180 accgaatgca ggccctattt caccatcctg ggacttccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786 <210> 8 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 9 <211> 795 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 atggccacca ccacgtgcca ggtggtaggg cttctcctgt ccctcctggg tctggccggc 60 tgcatagccg ccactgggat ggacatgtgg agcactcaag acctgtatga caacccagtc 120 accgccgtgt tccagtatga agggctctgg aggagttgcg tgcaacagag ctcggggttc 180 accgagtgcc ggccatactt caccatcctg ggccttccag ccatgctgca agctgtacga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgtc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggccaagat gactctgact 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacagcgg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgacac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 795 <210> 10 <211> 795 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atgtcggtga ccgcctgcca gggcttgggg tttgtggtgt cactgatcgg gtttgcgggc 60 atcattgcag ccacttgtat ggaccagtgg agcacccagg atttatacaa caacccggtg 120 accgctgtat tcaactacca agggctatgg cgttcatgcg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc gaggctactt caccctgttg gggttgccag ccatgctgca agctgtacga 240 gccctgatga tcgtgggcat tgttctgggg gtcatcggta tcctcgtgtc catcttcgcc 300 ctgaagtgca ttcgcattgg tagcatggat gactctgcca aggccaagat gactctgact 360 tctgggatct tgttcatcat ctccggcatc tgtgcaatca ttggtgtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgaccaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacagcgg catgggcggc 480 atgggtggca tggtgcagac cgttcagacc aggtacacct ttggtgcagc tctgttcgtg 540 ggctgggttg ctggaggcct caccctgatt gggggagtga tgatgtgcat cgcctgccgt 600 ggcctgacac cagatgacag caacttcaaa gctgtgtctt accatgcctc tggccaaaat 660 gttgcctaca ggcctggagg ctttaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccagaaac 720 aagaagatct acgatggggg tgcccgcaca gaagacgatg aacagtctca tcctaccaag 780 tatgactatg tgtag 795 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 11 tggctctgtg tcgacactgt g 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 12 gtgtacatgt tagctgtgga c 21 <210> 13 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser 1 5 10 15 Val Phe Gln Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gln Ala Val Arg Ala 50 55 <210> 14 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser 1 5 10 15 Val Phe Gln Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly 50 55 60 Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 85 90 95 Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val 100 105 110 Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met 115 120 125 Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr 130 135 140 Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 150 <210> 15 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 120 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcatggacc agtggagcac ccaagacttg 180 tacaacaacc ccgtaacagc tgttttcaac taccaggggc tgtggcgctc ctgtgtccga 240 gagagctctg gcttcaccga gtgccggggc tacttcaccc tgctggggct gccagccatg 300 ctgcaggcag tgcgagcggc catccagcac agtggcggcc gctcgaggag ggcccgaaca 360 aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag 390 <210> 16 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Asn Ser Ala 35 40 45 Asp Gly Arg Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro 50 55 60 Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg 65 70 75 80 Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Ala Ile Gln His Ser Gly 100 105 110 Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys Thr His Leu Arg Arg Gly Ser 115 120 125 Glu <210> 17 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 120 actccagtgt ggtggaattc tgcagatggc cgcgccctga tgatcgtagg catcgtcctg 180 ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat gcatccgcat tggcagcatg 240 gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acatccggga tcatgttcat tgtctcaggt 300 ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacgcgg ccatccagca cagtggcggc 360 cgctcgagga gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag gatctgaata g 411 <210> 18 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Asn Ser Ala 35 40 45 Asp Gly Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly 50 55 60 Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe 85 90 95 Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 100 105 110 Ala Ala Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Arg Arg Ala Arg Thr Lys 115 120 125 Thr His Leu Arg Arg Gly Ser Glu 130 135 <210> 19 <211> 531 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccatg gaccagtgga gcacccaaga cttgtacaac 120 aaccccgtaa cagctgtttt caactaccag gggctgtggc gctcctgtgt ccgagagagc 180 tctggcttca ccgagtgccg gggctacttc accctgctgg ggctgccagc catgctgcag 240 gcagtgcgag ccctgatgat cgtaggcatc gtcctgggtg ccattggcct cctggtatcc 300 atctttgccc tgaaatgcat ccgcattggc agcatggagg actctgccaa agccaacatg 360 acactgacct ccgggatcat gttcattgtc tcaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420 gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagctaacat gtacaccggc 480 atgggtggga tggtgcagac tgttcagacc aggtacacat ttggtgcgta g 531 <210> 20 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Met Asp Gln 20 25 30 Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn 35 40 45 Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 50 55 60 Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln 65 70 75 80 Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly 85 90 95 Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met 100 105 110 Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe 115 120 125 Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn 130 135 140 Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 145 150 155 160 Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile 1 5 10 <210> 28 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala 1 5 10 15 Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gln Ala Val Arg Ala 50 55 <210> 29 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys 1 5 10 15 Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 20 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr 1 5 10 15 Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 35 40 <210> 31 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala 1 5 10 15 Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser 20 25 30 Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala 35 40 45 Met Leu Gln Ala Val Arg Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly 50 55 60 Ala Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile 65 70 75 80 Gly Ser Met Glu Asp Ser Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly 85 90 95 Ile Met Phe Ile Val Ser Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val 100 105 110 Phe Ala Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met 115 120 125 Tyr Thr Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr 130 135 140 Phe Gly Ala Ala Leu Phe Val Gly Trp 145 150 <210> 32 <211> 3359 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 cacaccttcg gcagcaggag ggcggcagct tctcgcaggc ggcagggcgg gcggccagga 60 tcatgtccac caccacatgc caagtggtgg cgttcctcct gtccatcctg gggctggccg 120 gctgcatcgc ggccaccggg atggacatgt ggagcaccca ggacctgtac gacaaccccg 180 tcacctccgt gttccagtac gaagggctct ggaggagctg cgtgaggcag agttcaggct 240 tcaccgaatg caggccctat ttcaccatcc tgggacttcc agccatgctg caggcagtgc 300 gagccctgat gatcgtaggc atcgtcctgg gtgccattgg cctcctggta tccatctttg 360 ccctgaaatg catccgcatt ggcagcatgg aggactctgc caaagccaac atgacactga 420 cctccgggat catgttcatt gtctcaggtc tttgtgcaat tgctggagtg tctgtgtttg 480 ccaacatgct ggtgactaac ttctggatgt ccacagctaa catgtacacc ggcatgggtg 540 ggatggtgca gactgttcag accaggtaca catttggtgc ggctctgttc gtgggctggg 600 tcgctggagg cctcacacta attgggggtg tgatgatgtg catcgcctgc cggggcctgg 660 caccagaaga aaccaactac aaagccgttt cttatcatgc ctcaggccac agtgttgcct 720 acaagcctgg aggcttcaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaaa aacaagaaga 780 tatacgatgg aggtgcccgc acagaggacg aggtacaatc ttatccttcc aagcacgact 840 atgtgtaatg ctctaagacc tctcagcacg ggcggaagaa actcccggag agctcaccca 900 aaaaacaagg agatcccatc tagatttctt cttgcttttg actcacagct ggaagttaga 960 aaagcctcga tttcatcttt ggagaggcca aatggtctta gcctcagtct ctgtctctaa 1020 atattccacc ataaaacagc tgagttattt atgaattaga ggctatagct cacattttca 1080 atcctctatt tcttttttta aatataactt tctactctga tgagagaatg tggttttaat 1140 ctctctctca cattttgatg atttagacag actccccctc ttcctcctag tcaataaacc 1200 cattgatgat ctatttccca gcttatcccc aagaaaactt ttgaaaggaa agagtagacc 1260 caaagatgtt attttctgct gtttgaattt tgtctcccca cccccaactt ggctagtaat 1320 aaacacttac tgaagaagaa gcaataagag aaagatattt gtaatctctc cagcccatga 1380 tctcggtttt cttacactgt gatcttaaaa gttaccaaac caaagtcatt ttcagtttga 1440 ggcaaccaaa cctttctact gctgttgaca tcttcttatt acagcaacac cattctagga 1500 gtttcctgag ctctccactg gagtcctctt tctgtcgcgg gtcagaaatt gtccctagat 1560 gaatgagaaa attatttttt ttaatttaag tcctaaatat agttaaaata aataatgttt 1620 tagtaaaatg atacactatc tctgtgaaat agcctcaccc ctacatgtgg atagaaggaa 1680 atgaaaaaat aattgctttg acattgtcta tatggtactt tgtaaagtca tgcttaagta 1740 caaattccat gaaaagctca ctgatcctaa ttctttccct ttgaggtctc tatggctctg 1800 attgtacatg atagtaagtg taagccatgt aaaaagtaaa taatgtctgg gcacagtggc 1860 tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggagga aggatcactt gagcccagaa 1920 gttcgagact agcctgggca acatggagaa gccctgtctc tacaaaatac agagagaaaa 1980 aatcagccag tcatggtggc ctacacctgt agtcccagca ttccgggagg ctgaggtggg 2040 aggatcactt gagcccaggg aggttggggc tgcagtgagc catgatcaca ccactgcact 2100 ccagccaggt gacatagcga gatcctgtct aaaaaaataa aaaataaata atggaacaca 2160 gcaagtccta ggaagtaggt taaaactaat tctttaaaaa aaaaaaaaag ttgagcctga 2220 attaaatgta atgtttccaa gtgacaggta tccacatttg catggttaca agccactgcc 2280 agttagcagt agcactttcc tggcactgtg gtcggttttg ttttgttttg ctttgtttag 2340 agacggggtc tcactttcca ggctggcctc aaactcctgc actcaagcaa ttcttctacc 2400 ctggcctccc aagtagctgg aattacaggt gtgcgccatc acaactagct ggtggtcagt 2460 tttgttactc tgagagctgt tcacttctct gaattcacct agagtggttg gaccatcaga 2520 tgtttgggca aaactgaaag ctctttgcaa ccacacacct tccctgagct tacatcactg 2580 cccttttgag cagaaagtct aaattccttc caagacagta gaattccatc ccagtaccaa 2640 agccagatag gccccctagg aaactgaggt aagagcagtc tctaaaaact acccacagca 2700 gcattggtgc aggggaactt ggccattagg ttattatttg agaggaaagt cctcacatca 2760 atagtacata tgaaagtgac ctccaagggg attggtgaat actcataagg atcttcaggc 2820 tgaacagact atgtctgggg aaagaacgga ttatgcccca ttaaataaca agttgtgttc 2880 aagagtcaga gcagtgagct cagaggccct tctcactgag acagcaacat ttaaaccaaa 2940 ccagaggaag tatttgtgga actcactgcc tcagtttggg taaaggatga gcagacaagt 3000 caactaaaga aaaaagaaaa gcaaggagga gggttgagca atctagagca tggagtttgt 3060 taagtgctct ctggatttga gttgaagagc atccatttga gttgaaggcc acagggcaca 3120 atgagctctc ccttctacca ccagaaagtc cctggtcagg tctcaggtag tgcggtgtgg 3180 ctcagctggg tttttaatta gcgcattctc tatccaacat ttaattgttt gaaagcctcc 3240 atatagttag attgtgcttt gtaattttgt tgttgttgct ctatcttatt gtatatgcat 3300 tgagtattaa cctgaatgtt ttgttactta aatattaaaa acactgttat cctacagtt 3359 <210> 33 <211> 849 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 gagaacctgc ctgtctcttg tcctctccat ttgtgtggac tctgtgctcc atcatgtcgg 60 tgaccgcctg ccagggcttg gggtttgtgg tgtcactgat cgggtttgcg ggcatcattg 120 cagccacttg tatggaccag tggagcaccc aggatttata caacaacccg gtgaccgctg 180 tattcaacta ccaagggcta tggcgttcat gcgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccgaggcta cttcaccctg ttggggttgc cagccatgct gcaagctgta cgagccctga 300 tgatcgtggg cattgttctg ggggtcatcg gtatcctcgt gtccatcttc gccctgaagt 360 gcattcgcat tggtagcatg gatgactctg ccaaggccaa gatgactctg acttctggga 420 tcttgttcat catctccggc atctgtgcaa tcattggtgt gtctgtgttt gccaacatgc 480 tggtgaccaa cttctggatg tccacagcta acatgtacag cggcatgggc ggcatgggtg 540 gcatggtgca gaccgttcag accaggtaca ccttcggtgc agctctgttc gtgggctggg 600 ttgctggagg cctcaccctg attgggggag tgatgatgtg catcgcctgc cgtggcctga 660 caccagatga cagcaacttc aaagctgtgt cttaccatgc ctctggccaa aatgttgcct 720 acaggcctgg aggctttaag gccagcactg gctttgggtc caacaccaga aacaagaaga 780 tctacgatgg gggtgcccgc acagaagacg atgaacagtc tcatcctacc aagtatgact 840 atgtgtagt 849 <210> 34 <211> 3350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 agaattgcgc tgtccacttg tcgtgtggct ctgtgtcgac actgtgcgcc accatggccg 60 tgactgcctg tcagggcttg gggttcgtgg tttcactgat tgggattgcg ggcatcattg 120 ctgccacctg catggaccag tggagcaccc aagacttgta caacaacccc gtaacagctg 180 ttttcaacta ccaggggctg tggcgctcct gtgtccgaga gagctctggc ttcaccgagt 240 gccggggcta cttcaccctg ctggggctgc cagccatgct gcaggcagtg cgagccctga 300 tgatcgtagg catcgtcctg ggtgccattg gcctcctggt atccatcttt gccctgaaat 360 gcatccgcat tggcagcatg gaggactctg ccaaagccaa catgacactg acctccggga 420 tcatgttcat tgtctcaggt ctttgtgcaa ttgctggagt gtctgtgttt gccaacatgc 480 tggtgactaa cttctggatg tccacagcta acatgtacac cggcatgggt gggatggtgc 540 agactgttca gaccaggtac acatttggtg cggctctgtt cgtgggctgg gtcgctggag 600 gcctcacact aattgggggt gtgatgatgt gcatcgcctg ccggggcctg gcaccagaag 660 aaaccaacta caaagccgtt tcttatcatg cctcaggcca cagtgttgcc tacaagcctg 720 gaggcttcaa ggccagcact ggctttgggt ccaacaccaa aaacaagaag atatacgatg 780 gaggtgcccg cacagaggac gaggtacaat cttatccttc caagcacgac tatgtgtaat 840 gctctaagac ctctcagcac gggcggaaga aactcccgga gagctcaccc aaaaaacaag 900 gagatcccat ctagatttct tcttgctttt gactcacagc tggaagttag aaaagcctcg 960 atttcatctt tggagaggcc aaatggtctt agcctcagtc tctgtctcta aatattccac 1020 cataaaacag ctgagttatt tatgaattag aggctatagc tcacattttc aatcctctat 1080 ttcttttttt aaatataact ttctactctg atgagagaat gtggttttaa tctctctctc 1140 acattttgat gatttagaca gactccccct cttcctccta gtcaataaac ccattgatga 1200 tctatttccc agcttatccc caagaaaact tttgaaagga aagagtagac ccaaagatgt 1260 tattttctgc tgtttgaatt ttgtctcccc acccccaact tggctagtaa taaacactta 1320 ctgaagaaga agcaataaga gaaagatatt tgtaatctct ccagcccatg atctcggttt 1380 tcttacactg tgatcttaaa agttaccaaa ccaaagtcat tttcagtttg aggcaaccaa 1440 acctttctac tgctgttgac atcttcttat tacagcaaca ccattctagg agtttcctga 1500 gctctccact ggagtcctct ttctgtcgcg ggtcagaaat tgtccctaga tgaatgagaa 1560 aattattttt tttaatttaa gtcctaaata tagttaaaat aaataatgtt ttagtaaaat 1620 gatacactat ctctgtgaaa tagcctcacc cctacatgtg gatagaagga aatgaaaaaa 1680 taattgcttt gacattgtct atatggtact ttgtaaagtc atgcttaagt acaaattcca 1740 tgaaaagctc actgatccta attctttccc tttgaggtct ctatggctct gattgtacat 1800 gatagtaagt gtaagccatg taaaaagtaa ataatgtctg ggcacagtgg ctcacgcctg 1860 taatcctagc actttgggag gctgaggagg aaggatcact tgagcccaga agttcgagac 1920 tagcctgggc aacatggaga agccctgtct ctacaaaata cagagagaaa aaatcagcca 1980 gtcatggtgg cctacacctg tagtcccagc attccgggag gctgaggtgg gaggatcact 2040 tgagcccagg gaggttgggg ctgcagtgag ccatgatcac accactgcac tccagccagg 2100 tgacatagcg agatcctgtc taaaaaaata aaaaataaat aatggaacac agcaagtcct 2160 aggaagtagg ttaaaactaa ttctttaaaa aaaaaaaaaa gttgagcctg aattaaatgt 2220 aatgtttcca agtgacaggt atccacattt gcatggttac aagccactgc cagttagcag 2280 tagcactttc ctggcactgt ggtcggtttt gttttgtttt gctttgttta gagacggggt 2340 ctcactttcc aggctggcct caaactcctg cactcaagca attcttctac cctggcctcc 2400 caagtagctg gaattacagg tgtgcgccat cacaactagc tggtggtcag ttttgttact 2460 ctgagagctg ttcacttctc tgaattcacc tagagtggtt ggaccatcag atgtttgggc 2520 aaaactgaaa gctctttgca accacacacc ttccctgagc ttacatcact gcccttttga 2580 gcagaaagtc taaattcctt ccaagacagt agaattccat cccagtacca aagccagata 2640 ggccccctag gaaactgagg taagagcagt ctctaaaaac tacccacagc agcattggtg 2700 caggggaact tggccattag gttattattt gagaggaaag tcctcacatc aatagtacat 2760 atgaaagtga cctccaaggg gattggtgaa tactcataag gatcttcagg ctgaacagac 2820 tatgtctggg gaaagaacgg attatgcccc attaaataac aagttgtgtt caagagtcag 2880 agcagtgagc tcagaggccc ttctcactga gacagcaaca tttaaaccaa accagaggaa 2940 gtatttgtgg aactcactgc ctcagtttgg gtaaaggatg agcagacaag tcaactaaag 3000 aaaaaagaaa agcaaggagg agggttgagc aatctagagc atggagtttg ttaagtgctc 3060 tctggatttg agttgaagag catccatttg agttgaaggc cacagggcac aatgagctct 3120 cccttctacc accagaaagt ccctggtcag gtctcaggta gtgcggtgtg gctcagctgg 3180 gtttttaatt agcgcattct ctatccaaca tttaattgtt tgaaagcctc catatagtta 3240 gattgtgctt tgtaattttg ttgttgttgc tctatcttat tgtatatgca ttgagtatta 3300 acctgaatgt tttgttactt aaatattaaa aacactgtta tcctacagtt 3350 <210> 35 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Met Ser Val Thr Ala Cys Gln Gly Leu Gly Phe Val Val Ser Leu Ile 1 5 10 15 Gly Phe Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gln Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Val Ile Gly Ile Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Asp Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Ser 115 120 125 Gly Ile Cys Ala Ile Ile Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175 Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly 180 185 190 Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Asn 195 200 205 Phe Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser Gly Gln Asn Val Ala Tyr Arg 210 215 220 Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 240 Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gln Ser 245 250 255 His Pro Thr Lys Tyr Asp Tyr Val 260 <210> 36 <211> 2786 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 36 ggccgggaac cttcccagca agagggtggt ggttgctcct ggaagcctgc gcccagcagc 60 tgaagccatg gccaccacca cgtgccaggt ggtagggctt ctcctgtccc tcctgggtct 120 ggccggctgc atagccgcca ctgggatgga catgtggagc actcaagacc tgtatgacaa 180 cccagtcacc gccgtgttcc agtatgaagg gctctggagg agttgcgtgc aacagagctc 240 ggggttcacc gagtgccggc catacttcac catcctgggc cttccagcca tgctgcaagc 300 tgtacgagcc ctgatgatcg tgggcattgt tctgggggtc atcggtatcc tcgtgtccat 360 cttcgccctg aagtgcattc gcattggtag catggatgac tctgccaagg ccaagatgac 420 tctgacttct gggatcttgt tcatcatctc cggcatctgt gcaatcattg gtgtgtctgt 480 gtttgccaac atgctggtga ccaacttctg gatgtccaca gctaacatgt acagcggcat 540 gggcggcatg ggtggcatgg tgcagaccgt tcagaccagg tacaccttcg gtgcagctct 600 gttcgtgggc tgggttgctg gaggcctcac cctgattggg ggagtgatga tgtgcatcgc 660 ctgccgtggc ctgacaccag atgacagcaa cttcaaagct gtgtcttacc atgcctctgg 720 ccaaaatgtt gcctacaggc ctggaggctt taaggccagc actggctttg ggtccaacac 780 cagaaacaag aagatctacg atgggggtgc ccgcacagaa gacgatgaac agtctcatcc 840 taccaagtat gactatgtgt agtgctctaa gacccgccaa cctgtgtgca ggaggaaccc 900 ttccccaaga agagctcacc ccaaagcaac gggagtctac cttgttccct tgttgatttc 960 aactgacatc tgaaagttgg taaagcctga ttttcatcca tagggaggct agacagtctt 1020 ggccacatgt gtctgcctct aaatatccca tcacaaaaca gctgagttat cgtttatgag 1080 ttagaggcca taacactcac tttagcccaa ccctctgctt tttaccgtag actttctttt 1140 catctggtga tggaatggaa tttgactcac agactaatac tttaatggtt tagagaaact 1200 ttccttcctc gtacttaata agcctgctga tggtcgattt tccagcttga ccaccaaggg 1260 aaattttaaa aggaaaaaaa aatacattaa aaggcattat ttcctactca attgtgcctt 1320 acccaccccc aacttgactg ataataataa tgaacaccac ttaaagaaag aatgccagag 1380 gaaagatagt tgtgtttccc cccagccagt catctgagtc cccctatgtg gtgatctaga 1440 acattactcg ccacagtgat tttcaaagaa ggcaagcgag cctgttcgct ctgctcagca 1500 tctgctgatt ccagcaaggc ccttccagag ctttccacta gaagtcctcc ttctctcgga 1560 agtcagaaat tccccctaga agagtaagaa atagattctt ttgggtaacc tgagtcctag 1620 gtatagttat aataaatagt atattagcaa aacggtttgg tatctcagtg aattagtttc 1680 agccttacat atagaaaaag ctggggaaaa aaaaagcatc ccttgacatt gtctatagcg 1740 taagatccta tataaatcca agcttcaaca aaagctcact gagtctaata gttttctttt 1800 gaggtctcca cggccttagt actcatagat gcagcccctg tttaaaagta aaaaaattaa 1860 agtagcttaa aacgggttct tttttttttt ttttttttca aaaaatccaa tagagacctg 1920 tgtgtctggc atagctacag ttactgccaa tcgacagggc cacttctttg gtcctgtagg 1980 cagttttgca gttctgacag ctgcgccggg catcaatatg cagaccacac ccttctctgt 2040 gcttgtagga cgacccgttc aaggagaaag catgaactcc atctccatgt gagcctgaat 2100 gctcccagga aatggagata gggtgctctc caaaacccac ctgaacctga aacagctgta 2160 gcgctatgct gtaagagcct ggccatcaag ttcctatgga gaaaaagggc agtccttgca 2220 ttaatagtgc atatataagt ggcctctggg gggcagggat gaatattcag tggtggctcc 2280 gagtatgtac agaccgtcta aggagctgtg ttgaccaaga gccaggttaa tacgcagagt 2340 ttttcccact gggactacag tgattttaga ctatactgaa gaaggccctc tggaaaatca 2400 ttatctgaaa tggcataaag aatgaacaga ccaaacaatt taaggggagg gggcaggtgg 2460 aaggaggggg aaggaggtag aaataagaat ctagggcatg aagattgtta aggttcttgg 2520 ggtccaaatg gaaggtcacc cctttgaggc catggacaca atgcacccca cccctacccc 2580 cacctgccca cccaccagaa agtccctggt cggactggag gcagtgagaa tcagctgttt 2640 tcagttagtg ggtctcggtg tagcacctgg ctgtttcaaa gcttcccctt gctttgccgt 2700 tttttccgcc attgctgtct tgttttctgt gttattaacc tccatgtttt gtacgttaaa 2760 tattaaaaca ctgttaacat ccattc 2786 <210> 37 <211> 264 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Met Ala Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Gly Leu Leu Leu Ser Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Gln Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Val Ile Gly Ile Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Asp Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Lys Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Leu Phe Ile Ile Ser 115 120 125 Gly Ile Cys Ala Ile Ile Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Ser Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala 165 170 175 Ala Leu Phe Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly 180 185 190 Val Met Met Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Thr Pro Asp Asp Ser Asn 195 200 205 Phe Lys Ala Val Ser Tyr His Ala Ser Gly Gln Asn Val Ala Tyr Arg 210 215 220 Pro Gly Gly Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Arg Asn 225 230 235 240 Lys Lys Ile Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Asp Glu Gln Ser 245 250 255 His Pro Thr Lys Tyr Asp Tyr Val 260 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 38 gagaggatcc cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 40 <210> 39 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 39 gagagcggcc gcctaacact ctcccctgtt gaagctc 37 <210> 40 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 40 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324 <210> 41 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 41 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 42 gagaaagctt tccaccaagg gcccatcggt cttc 34 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 43 gagagcggcc gctcatttac ccggagacag ggagag 36 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 44 taccagttga acttgacctc a 21 <210> 45 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 45 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 60 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 120 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 180 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 300 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaatg a 981 <210> 46 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 46 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 35 40 45 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 50 55 60 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 65 70 75 80 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 85 90 95 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 47 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is a, c, g, or t <400> 47 tttttttttt tttttttttt tttttttttt nn 32 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 48 aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg 30 <210> 49 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 49 ctgctcactg gatggtggga agatgg 26 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 50 gggacagtca ctgagctgct cagag 25 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 51 acaggggcca gtggatagac cgatg 25 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 52 agccagggac caagggatag acagatg 27 <210> 53 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 53 gtaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 54 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 55 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 55 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt agctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtgc aagatatgat 300 tacccctggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 56 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 56 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaacatat 180 gctgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgc aagactgggt 300 tttggtaatg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 57 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 57 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagagg 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagatcgtat 300 ggtgcctttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 58 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 58 caggtccaac tgcagcagcc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga taaactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggaaat atttatcctt ctgatagtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcccgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatcgtgg 300 aggggtaact cctttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 59 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 59 caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatgtta taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagtggtag tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccaa cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagaggggta 300 ttactacggg ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 60 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 60 caggttcacc tacaacagtc tggttctgaa ctgaggagtc ctgggtcttc agtaaagctt 60 tcatgcaagg attttgattc agaagtcttc ccttttgctt atatgagttg gattaggcag 120 aagcctgggc atggatttga atggattgga gacatactcc caagtattgg tagaacaatc 180 tatggagaga agtttgagga caaagccaca ctggatgcag acacagtgtc caacacagcc 240 tacttggagc tcaacagtct gacatctgag gactctgcta tctactactg tgcaaggggg 300 gagggctacg gtgcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 61 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 61 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 62 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 62 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120 acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 63 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 63 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 64 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 64 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 65 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 65 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 66 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 66 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336 <210> 67 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 67 gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 68 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 68 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 69 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: PCR product <400> 69 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatgttt cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 70 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 70 gagaaagctt gccgccacca tggaatggac ctgggtcttt ctc 43 <210> 71 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 71 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtc 43 <210> 72 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 72 gagaaagctt gccgccacca tggattggct gtggaacttg ctattcc 47 <210> 73 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 73 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 74 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 74 gagaaagctt gccgccacca tggaatggat ctggatcttt ctcttc 46 <210> 75 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 75 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtgc 44 <210> 76 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 76 gagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttc 46 <210> 77 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 77 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg gtg 43 <210> 78 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 78 gagaaagctt gccgccacca tggaatggag gatctttctc ttcatcc 47 <210> 79 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 79 gagagggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gttc 44 <210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 80 gagaggtctc aagcttagcc accatggact ggatttggat catgctccat c 51 <210> 81 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 81 gagagggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gtcc 44 <210> 82 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 82 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctc 43 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 83 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cagc 34 <210> 84 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 84 gagaaagctt gccgccacca tgcattttca agtgcagatt ttcagc 46 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 85 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 86 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 86 gagaaagctt gccgccacca tggagtttca gacccaggtc tttg 44 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 87 cacacgtacg tttgatttcc agcttggtgc ctc 33 <210> 88 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 88 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 89 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 89 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 90 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 90 gagaaagctt gccgccacca tggaatcaca gactcaggtc ctcatg 46 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 91 cacacgtacg ttttatttcc aactttgtcc 30 <210> 92 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 92 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatattg 49 <210> 93 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 93 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 94 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 94 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccaggtt cttatg 46 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 95 cacacgtacg ttttatttcc agcttggtcc 30 <210> 96 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 96 gagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggctcaggtt cttatg 46 <210> 97 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 97 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc cag 33 <210> 98 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 98 gagaaagctt agccaccatg gaatcacaga ctctggtctt c 41 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 99 cacacgtacg tttcagctcc agcttggtcc 30 <210> 100 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 100 atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc 120 tgcaaggcta ctggctacac attcagtagc tactggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa gtggtagtac taactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gccgtctatt actgtgcaag atatgattac 360 ccctggtttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 101 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 101 atggattggc tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 180 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacaccaaca ctggagagcc aacatatgct 240 gaagagttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgcaag actgggtttt 360 ggtaatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 102 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 102 atggaatgga tctggatctt tctcttcatc ctctcaggaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg gcgaggcccg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcactgac tactatataa actgggtgaa gcagaggact 180 ggacagggcc ttgagtggat tggagagatt tatcctggaa gtggtaatac ttactacaat 240 gagaagttca agggcaaggc cacactgact gcagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt tctgtgcaag atcgtatggt 360 gcctttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcctc caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatga 1398 <210> 103 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 103 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc agcagcctgg ggctgagctg gtgaggcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggataa actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacaaggcc ttgagtggat cggaaatatt tatccttctg atagttatac taactacaat 240 caaaagttca aggacaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300 cagctcagca gcccgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaag atcgtggagg 360 ggtaactcct ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agcctccacc 420 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1140 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260 gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380 ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404 <210> 104 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 104 atggaatgga ggatctttct cttcatcctg tcaggaactg caggtgtcca ctcccaggtt 60 cagctgcagc agtctggacc tgagctggtg aagcctgggg cttcagtgaa gatgtcctgc 120 aaggcttctg gatacacatt cactgactat gttataagct gggtgaagca gagaactgga 180 cagggccttg agtggattgg agagatttat cctggaagtg gtagtactta ctacaatgag 240 aagttcaagg gcaaggccac actgactgca gacaaatcct ccaacacagc ctacatgcag 300 ctcagcagcc tgacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagagg ggtattacta 360 cgggctatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 420 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 480 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 540 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 600 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 720 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 105 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 105 atggactgga tttggatcat gctccatctg ctggcagcag ctacaggtat ccaatcccag 60 gttcacctac aacagtctgg ttctgaactg aggagtcctg ggtcttcagt aaagctttca 120 tgcaaggatt ttgattcaga agtcttccct tttgcttata tgagttggat taggcagaag 180 cctgggcatg gatttgaatg gattggagac atactcccaa gtattggtag aacaatctat 240 ggagagaagt ttgaggacaa agccacactg gatgcagaca cagtgtccaa cacagcctac 300 ttggagctca acagtctgac atctgaggac tctgctatct actactgtgc aaggggggag 360 ggctacggtg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1410 <210> 106 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 106 atggaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 107 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 107 atgcattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag 120 gtcaccataa cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttaca tgcactggtt ccagcagaag 180 ccaggcactt ctcccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccct 240 gctcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttactctc tcacaatcag ccgaatggag 300 gctgaagatg ctgccactta ttactgccag caaaggagta gttacccacc cacgttcgga 360 ggggggacca agctggaaat aaaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 108 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 108 atggagtttc agacccaggt ctttgtattc gtgttgctct ggttgtctgg tgttgatgga 60 gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120 atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180 gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcatccaacc ggcacactgg agtccctgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 300 gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaatt atcctctgac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 109 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 109 atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 110 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 110 atggaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 360 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 111 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 111 atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 120 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 360 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgta cggtggctgc accatctgtc 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 720 <210> 112 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 112 atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacatcgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc 300 atcagcagtg tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat 360 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 113 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 113 atggattcac aggctcaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 240 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 360 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct 420 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480 ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720 tag 723 <210> 114 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 114 atggaatcac agactctggt cttcatatcc atactgctct ggttatatgg agctgatggg 60 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 120 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatgttt cctggtatca acagaaacca 180 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 240 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctca ccatcagcag tgtgaaggct 300 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatagct atccgctcac gttcggtgct 360 gggaccaagc tggagctgaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 115 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 115 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 116 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 116 Met Asp Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 117 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 117 Met Glu Trp Ile Trp Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 245 250 255 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 290 295 300 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 370 375 380 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 Lys 465 <210> 118 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 118 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 119 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 119 Met Glu Trp Arg Ile Phe Leu Phe Ile Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val 1 5 10 15 His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 20 25 30 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 35 40 45 Asp Tyr Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu 50 55 60 Trp Ile Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr 85 90 95 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 120 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 120 Met Asp Trp Ile Trp Ile Met Leu His Leu Leu Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ile Gln Ser Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val 35 40 45 Phe Pro Phe Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly 50 55 60 Phe Glu Trp Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Glu Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser 85 90 95 Asn Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 100 105 110 Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 121 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 121 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 122 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 122 Met His Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 100 105 110 Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 123 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 123 Met Glu Phe Gln Thr Gln Val Phe Val Phe Val Leu Leu Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser 20 25 30 Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Arg Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp 100 105 110 Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 124 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 124 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 125 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 125 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 126 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 126 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 127 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 127 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr 100 105 110 His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 128 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 128 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 129 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: chimeric monoclonal antibody <400> 129 Met Glu Ser Gln Thr Leu Val Phe Ile Ser Ile Leu Leu Trp Leu Tyr 1 5 10 15 Gly Ala Asp Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser 20 25 30 Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn 35 40 45 Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 100 105 110 Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 130 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 130 ccaagggcta tggcgttc 18 <210> 131 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Oligonucleotide <400> 131 ccgaaggtgt acctggtc 18 <210> 132 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 132 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Tyr Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 133 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 133 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 134 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 134 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 135 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 135 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 136 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 136 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Leu Leu Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 137 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 137 Gln Val His Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Arg Ser Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Asp Phe Asp Ser Glu Val Phe Pro Phe 20 25 30 Ala Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Lys Pro Gly His Gly Phe Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Asp Ile Leu Pro Ser Ile Gly Arg Thr Ile Tyr Gly Glu Lys 50 55 60 Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Asp Ala Asp Thr Val Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 138 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 138 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 139 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 139 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 140 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 140 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 141 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 141 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 142 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 142 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 143 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 143 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 144 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 144 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln 85 90 95 Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 145 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 145 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 146 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: Translation of PCR product <400> 146 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 147 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: codon optimized nucleic acid <400> 147 cgtacggtgg ccgctcccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagtcc 60 ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc cccgggaggc caaggtgcag 120 tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtcac cgagcaggac 180 agcaaggact ccacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240 aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgtccagccc cgtgaccaag 300 agcttcaaca ggggcgagtg ctag 324 <210> 148 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: codon optimized protein <400> 148 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 149 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: codon optimized nucleic acid <400> 149 ggcccaagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgcc 60 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcgga 120 gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 180 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 240 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag tggagcccaa gagctgcgac 300 aagacccaca cctgcccccc ctgcccagcc ccagagctgc tgggcggacc cagcgtgttc 360 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggaccca gaggtgaagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtacaacag cacctacagg 540 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 600 aaggtctcca acaaggccct gccagccccc atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc 660 cagccacggg agccccaggt gtacaccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ccccagtgct ggacagcgac 840 ggcagcttct tcctgtacag caagctgacc gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 900 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 960 agcctgagcc ccggcaagta g 981 <210> 150 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of artificial sequence: codon optimized protein <400> 150 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 20 25 30 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 35 40 45 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 50 55 60 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 65 70 75 80 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 85 90 95 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 100 105 110 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 165 170 175 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 151 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 151 Met Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr 1 5 10 15 <210> 152 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 152 Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn 1 5 10 15 <210> 153 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 153 Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu 1 5 10 15 <210> 154 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 154 Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys 1 5 10 15 <210> 155 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 155 Val Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser 1 5 10 15 <210> 156 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 156 Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr 1 5 10 15 <210> 157 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitope <400> 157 Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Gly 1 5 10 15

Claims (36)

  1. 서열번호 16 또는 18의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드에 대한 모노클로날 항체를 포함하는, 크루켄베르크(Krukenberg) 종양 치료 또는 예방용 약학적 조성물로서,
    상기 항체는 CLD18(claudin-18)에 대한 결합능을 가지고 CLD18 발현 세포의 사멸 및/또는 증식 억제를 매개하는 능력이 있는 것이고, 다음의 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3의 상보결정부위 세트를 각각 포함하는 VH 및 VL의 조합을 포함하는 것인 약학적 조성물:
    (i) VH: CDR1: SEQ ID NO: 115의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 115의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 115의 위치 116-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 122의 위치 49-53, CDR2: SEQ ID NO: 122의 위치 71-73, CDR3: SEQ ID NO: 122의 위치 110-118,
    (ii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 116의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 116의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 116의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 121의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 121의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 121의 위치 115-123,
    (iii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 117의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 117의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 117의 위치 116-124, VL: CDR1: SEQ ID NO: 123의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 123의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 123의 위치 109-117,
    (iv) VH: CDR1: SEQ ID NO: 119의 위치 44-51, CDR2: SEQ ID NO: 119의 위치 69-76, CDR3: SEQ ID NO: 119의 위치 115-125, VL: CDR1: SEQ ID NO: 126의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 126의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 126의 위치 115-122,
    (v) VH: CDR1: SEQ ID NO: 118의 위치 45-52, CDR2: SEQ ID NO: 118의 위치 70-77, CDR3: SEQ ID NO: 118의 위치 116-126, VL: CDR1: SEQ ID NO: 125의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 125의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 125의 위치 115-123,
    (vi) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 124의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 124의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 124의 위치 115-123,
    (vii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 127의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 127의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 127의 위치 115-123,
    (viii) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 128의 위치 47-58, CDR2: SEQ ID NO: 128의 위치 76-78, CDR3: SEQ ID NO: 128의 위치 115-123, 및
    (ix) VH: CDR1: SEQ ID NO: 120의 위치 45-53, CDR2: SEQ ID NO: 120의 위치 71-78, CDR3: SEQ ID NO: 120의 위치 117-128, VL: CDR1: SEQ ID NO: 129의 위치 47-52, CDR2: SEQ ID NO: 129의 위치 70-72, CDR3: SEQ ID NO: 129의 위치 109-117.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 다음의 (i) 내지 (ix)로부터 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)의 조합을 포함하는 것인 약학적 조성물:
    (i) SEQ ID NO: 132로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 139로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (ii) SEQ ID NO: 133으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 138로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (iii) SEQ ID NO: 134로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 NO: 140으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (iv) SEQ ID NO: 136으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 143으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (v) SEQ ID NO: 135로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 142로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (vi) SEQ ID NO: 137로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 141로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (vii) SEQ ID NO: 137로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 144로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (viii) SEQ ID NO: 137로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 145로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL,
    (ix) SEQ ID NO: 137로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VH및 SEQ ID NO: 146으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 VL.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    (i) SEQ ID NO: 115, 116, 117, 118, 119및 120으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및
    (ii) SEQ ID NO: 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128및 129로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄
    를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 CLD18A1(claudin-18 splice variant 1) 및 CLD18A2(claudin-18 splice variant 2)에 결합하는 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 CLD18A2에는 결합하지만 CLD18A1에는 결합하지 않는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포의 사멸 및/또는 증식 억제는 상기 세포에 의하여 발현되는 CLD18A1에 상기 항체가 결합함으로써 유도되는 것이 아닌 것인 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CLD18을 발현하는 세포는 암세포인 것인 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암세포는 종양 형성 위암 세포, 식도암 세포, 췌장암 세포 및 폐암 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 보체 의존성 세포 독성 (CDC) 매개 용해 및/또는 항체 의존성 세포내 세포 독성 (ADCC) 매개 용해를 유발함으로써 세포 사멸을 유도하는 것인 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 상기 세포의 CDC 매개 용해는 유도하지 않는 것인 약학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 ADCC 매개 용해는 단구, 단핵 세포, NK(natural killer) 세포 및 PMN(polymorphonuclear leukocytes)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 이펙터 세포 존재 하에 일어나는 것인 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체이거나, 항체의 단편인 것인 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비 IgA, IgD, 및 IgE 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
  14. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 CLD18A2는 서열번호 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 약학적 조성물.
  15. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 CLD18A1는 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 약학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 살아 있는 세포의 표면에 존재하는 CLD18의 네이티브 에피토프에 결합하는 것인 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 암세포에 대하여 특이적인 것인 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 CLD18은 세포 표면에서 발현되는 것인 약학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 치료제에 커플링된 것인 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 치료제는 독소, 방사성 동위 원소, 약물 또는 세포독성제인 것인 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체의 유효량을 CLD18을 발현하는 크루켄베르크 종양 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 상기 세포의 성장을 억제하는 것을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체의 유효량을 CLD18을 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 상기 세포를 사멸시키는 것을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 치료 또는 예방은 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체의 유효량을 CLD18을 발현하는 세포와 접촉시키는 것을 포함하여 상기 세포의 전이성 스프레드의 억제하는 것을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
KR1020167036984A 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 claudin-18에 대한 모노클로날 항체 KR101751965B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93209907P 2007-05-29 2007-05-29
EP07010622.4 2007-05-29
US60/932,099 2007-05-29
EP07010622A EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2007-05-29 Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
PCT/EP2008/004197 WO2008145338A2 (en) 2007-05-29 2008-05-27 Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157003504A Division KR101693365B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170005160A KR20170005160A (ko) 2017-01-11
KR101751965B1 true KR101751965B1 (ko) 2017-07-11

Family

ID=38650052

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157003504A KR101693365B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체
KR1020167036984A KR101751965B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 claudin-18에 대한 모노클로날 항체
KR1020097024616A KR101585990B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157003504A KR101693365B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097024616A KR101585990B1 (ko) 2007-05-29 2008-05-27 암 치료를 위한 ｃｌａｕｄｉｎ-18에 대한 모노클로날 항체

Country Status (24)

Country Link
US (1) US8425902B2 (ko)
EP (4) EP1997832A1 (ko)
JP (3) JP5816431B2 (ko)
KR (3) KR101693365B1 (ko)
CN (2) CN103694353B (ko)
BR (1) BRPI0811907A2 (ko)
CA (1) CA2687206C (ko)
DK (1) DK3401334T5 (ko)
ES (2) ES2675375T3 (ko)
FI (1) FI3401334T3 (ko)
HR (1) HRP20230282T3 (ko)
HU (1) HUE061795T2 (ko)
IL (3) IL201666A (ko)
LT (1) LT3401334T (ko)
MX (1) MX2009012906A (ko)
NZ (1) NZ581365A (ko)
PL (1) PL3401334T3 (ko)
PT (1) PT3401334T (ko)
RS (1) RS64065B1 (ko)
RU (2) RU2682285C2 (ko)
SG (1) SG183773A1 (ko)
SI (1) SI3401334T1 (ko)
WO (1) WO2008145338A2 (ko)
ZA (1) ZA200907675B (ko)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6358588A (ja) * 1986-08-29 1988-03-14 Toshiba Corp バ−コ−ド読取装置
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
CA2711843C (en) 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
CA2722466A1 (en) 2008-04-29 2009-11-05 Tariq Ghayur Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
CA2749846C (en) * 2009-01-15 2018-08-07 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
FI2398902T3 (fi) 2009-02-20 2023-11-28 Astellas Pharma Inc Menetelmiä ja koostumuksia syövän diagnoosia ja hoitoa varten
BRPI1012195A2 (pt) * 2009-05-01 2018-04-24 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
NZ598929A (en) 2009-09-01 2014-05-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201119676A (en) 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
KR102126964B1 (ko) 2009-11-11 2020-06-25 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 클라우딘 6 특이적 항체
CA2786940C (en) 2010-03-16 2019-09-24 Biontech Ag Tumor vaccination involving a humoral immune response, and proteins therefor including all or a portion of a hepatitis b virus core antigen protein and an epitope of claudin 18.2
EP2366709A1 (en) * 2010-03-16 2011-09-21 BioNTech AG Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
JP2013537415A (ja) 2010-08-03 2013-10-03 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用
AU2011293253B2 (en) 2010-08-26 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
ES2683953T3 (es) * 2011-02-07 2018-09-28 Aggamin Llc Procedimientos y sistemas para tratar o prevenir trastornos hipertensivos gestacionales
EP3508500A1 (en) * 2011-04-29 2019-07-10 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
DK3026064T3 (en) 2011-05-13 2019-01-14 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER EXPRESSING CLAUDIN 6
CA2861610A1 (en) 2011-12-30 2013-07-04 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against il-13 and/or il-17
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174403A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP3725810B1 (en) 2012-05-23 2022-07-06 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP4364756A3 (en) * 2012-05-23 2024-07-31 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
NZ707641A (en) 2012-11-01 2016-09-30 Abbvie Inc Anti-vegf/dll4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2890438C (en) * 2012-11-13 2022-10-18 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
EP4177273A1 (en) * 2013-02-20 2023-05-10 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
TW201512219A (zh) 2013-03-15 2015-04-01 Abbvie Inc 針對ＩＬ－１β及／或ＩＬ－１７之雙特異性結合蛋白
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2015014376A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Biontech Ag Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
WO2018089300A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Ilt3 ligand
WO2018148595A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Washington University Antibodies to tip1 and methods of use thereof
US20180298094A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-18 Ksl Biomedical Llc Monoclonal antibodies targeted to human taxilin alpha and methods for use of same
CN110945024B (zh) * 2017-04-18 2023-05-12 古德T细胞有限公司 Lrig-1蛋白特异性结合分子及其用途
CN107779500A (zh) * 2017-10-25 2018-03-09 上海药明生物技术有限公司 一种快速获取大鼠杂交瘤细胞单克隆抗体序列的测序方法及引物序列
EP3762031A4 (en) * 2018-03-08 2021-12-22 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-CLAUDINE ANTIBODIES 18.2 AND THEIR USES
CN112020512A (zh) * 2018-03-13 2020-12-01 塔斯克疗法有限公司 用于肿瘤特异性细胞清除的抗-cd25
CA3087423A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Beijing Xuanyi Pharmasciences Co., Ltd. Anti-claudin 18.2 antibodies
CN112654638B (zh) * 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18.2抗体及其应用
BR112021011014A2 (pt) * 2018-12-07 2021-08-31 Zlip Holding Limited Anticorpos anti-claudina e usos destes
US20230192840A1 (en) * 2018-12-28 2023-06-22 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody and use thereof
BR112021012608A2 (pt) * 2018-12-28 2021-09-08 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Porção de ligação que se liga especificamente à claudina18.2, receptor de antígeno quimérico, ácido nucleico, célula imune manipulada, composição farmacêutica, e, método de tratamento de um tumor ou câncer que expressa claudina18.2
CN111434692B (zh) * 2019-01-15 2021-12-31 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
WO2020160560A2 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
AU2020250601A1 (en) * 2019-04-01 2021-11-18 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-Claudin 18.2 antibody and application thereof
CN111978402B (zh) * 2019-05-24 2022-06-28 三优生物医药(上海)有限公司 新型cldn18.2结合分子
CA3141504A1 (en) * 2019-05-24 2020-12-03 Sanyou Biopharmaceuticals Co., Ltd. Novel cldn18.2 binding molecule
CN114364701A (zh) 2019-07-17 2022-04-15 加利福尼亚大学董事会 密封蛋白18抗体和治疗癌症的方法
AU2020332585A1 (en) * 2019-08-20 2022-02-17 Suzhou Transcenta Therapeutics Co., Ltd. Novel anti-CLDN18.2 antibodies
CN112574307B (zh) * 2019-09-29 2023-11-28 迈威(上海)生物科技股份有限公司 抗人Claudin18.2抗体及其应用
AU2020398045A1 (en) * 2019-12-06 2022-06-09 Sotio Biotech A.S. Humanized CLDN18.2 antibodies
CN114901365A (zh) 2019-12-23 2022-08-12 斯迪安生物技术公司 肿瘤特异性密蛋白18.2抗体
WO2021136550A1 (zh) * 2020-01-03 2021-07-08 佧珐药业有限公司 抗Claudin18.2的抗体及其应用
BR112022019769A2 (pt) 2020-03-30 2022-12-13 BioNTech SE Composições de rna que direcionam claudina-18.2
CN113493515B (zh) * 2020-04-02 2023-03-28 广东菲鹏制药股份有限公司 抗cldn18a2的抗体以及治疗肿瘤的药物
CN115715202A (zh) * 2020-05-15 2023-02-24 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗体药物缀合物及其制备方法和用途
CN111808194B (zh) * 2020-07-13 2021-04-20 北京凯因科技股份有限公司 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
WO2022140556A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Eutropics Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions related to bcl2 and bim heterodimer antibodies
JP2024500242A (ja) 2020-12-23 2024-01-05 ソティオ バイオテック エイ．エス． 腫瘍特異的クローディン１８．２抗体と薬物との複合体
WO2023161457A1 (en) 2022-02-27 2023-08-31 Evobright Gmbh Bispecific antibodies against cd277 and a tumor-antigen
CN114836388A (zh) * 2022-06-07 2022-08-02 江苏亲科生物研究中心有限公司 Claudin18.2单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2024074211A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074634A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
JPH05504476A (ja) 1989-12-27 1993-07-15 アメリカ合衆国 ヒト胃癌検出用診断プローブ
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU2001284703B2 (en) 2000-08-03 2007-03-22 Therapeutic Human Polyclonals Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
GB0020685D0 (en) * 2000-08-22 2000-10-11 Novartis Ag Organic compounds
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2003250367A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody pam4 and its use for diagnosis and therapy of pancreatic cancer
EP3502133A1 (en) * 2002-09-27 2019-06-26 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
MXPA05004022A (es) 2002-10-17 2005-10-05 Genmab As Anticuerpos monoclonales humanos contra cd20.
DE10254601A1 (de) * 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
CA2627873A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 Scott Wilhelm Treatment of cancer with sorafenib
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gynecol. Oncol. 47(2): 272-274(1992. 11.)*
Hear Res. 187(1-2): 25-34(2004. 1.)
Mol. Cell Biol. 21(21): 7380-7390(2001. 11.)

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200907675B (en) 2011-04-28
EP1997832A1 (en) 2008-12-03
JP2015007053A (ja) 2015-01-15
CN101687929B (zh) 2013-11-13
WO2008145338A3 (en) 2009-02-12
RU2009149205A (ru) 2011-07-10
CN103694353A (zh) 2014-04-02
HUE061795T2 (hu) 2023-08-28
EP2152754A2 (en) 2010-02-17
NZ581365A (en) 2012-02-24
EP4242236A3 (en) 2023-11-22
ES2940775T3 (es) 2023-05-11
MX2009012906A (es) 2010-01-25
PT3401334T (pt) 2023-03-27
IL238668A0 (en) 2015-06-30
HRP20230282T3 (hr) 2023-05-12
KR20100021573A (ko) 2010-02-25
US20100166779A1 (en) 2010-07-01
CN101687929A (zh) 2010-03-31
AU2008256489A1 (en) 2008-12-04
SG183773A1 (en) 2012-09-27
BRPI0811907A2 (pt) 2014-11-18
DK3401334T3 (da) 2023-03-27
DK3401334T5 (da) 2024-09-23
PL3401334T3 (pl) 2023-05-15
US8425902B2 (en) 2013-04-23
IL201666A (en) 2016-03-31
KR101585990B1 (ko) 2016-01-19
ES2675375T3 (es) 2018-07-10
EP4242236A2 (en) 2023-09-13
RU2015149617A (ru) 2019-01-14
CA2687206C (en) 2019-07-16
LT3401334T (lt) 2023-03-27
WO2008145338A2 (en) 2008-12-04
EP2152754B1 (en) 2018-04-25
CA2687206A1 (en) 2008-12-04
JP5995919B2 (ja) 2016-09-21
KR20170005160A (ko) 2017-01-11
IL201666A0 (en) 2010-05-31
FI3401334T3 (fi) 2023-03-17
JP5816431B2 (ja) 2015-11-18
KR20150023951A (ko) 2015-03-05
CN103694353B (zh) 2017-12-12
RS64065B1 (sr) 2023-04-28
IL238667A0 (en) 2015-06-30
JP6337053B2 (ja) 2018-06-06
SI3401334T1 (sl) 2023-05-31
EP2152754B8 (en) 2018-07-04
RU2682285C2 (ru) 2019-03-18
EP3401334A1 (en) 2018-11-14
RU2571923C2 (ru) 2015-12-27
RU2015149617A3 (ko) 2019-02-04
JP2010528075A (ja) 2010-08-19
EP3401334B1 (en) 2023-02-15
JP2017048170A (ja) 2017-03-09
KR101693365B1 (ko) 2017-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101751965B1 (ko) 암 치료를 위한 claudin-18에 대한 모노클로날 항체
KR101535292B1 (ko) 암 치료를 위한 클라우딘-18에 대한 모노클로날 항체
AU2023208150A1 (en) Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant