KR101738808B1 - 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법 - Google Patents

혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법에 대한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 억제용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 유도용 조성물을 제공한다. 이를 통해, 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 활용한다면 과색소침착증 등의 피부 색소 질환에 효과적인 치료 전략을 제시할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법{Composition for regulating cutaneous pigmentation derived from endothelial cells or secretory factors from endothelial cells and method for screening skin whitening agents}
본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
표피 멜라노사이트(Epidermal melanocytes)는 멜라닌 색소를 합성한다. 피부 색소 형성의 결정적인 역할은 자외선(ultraviolet radiation; UV radiation)을 흡수하는 것인데, 이는 천연 자외선 차단제로서 작용하다. 하지만, 멜라닌의 과도한 생산은 과색소형성(hyperpigmentation)을 일으키는데, 이는 기미(melasma) 또는 일광흑자(solar lentigo)로 나타난다. 자외선에 의한 피부 색소 형성은 멜라노사이트와 케라티노사이트(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts) 또는 염증 세포와 같이 인접한 피부 세포(cutaneous cells) 간의 상호작용에 의해 조절된다. 최근에, 색소 형성의 조절에 있어서, 상기와 같은 형태의 상호작용이 진피 성분에 기여함이 강조되고 있다. 예를 들면, 특히 딕코프-연관 단백질-1(Dickkopf-related protein-1; DKK1) 및 뉴레귤린(neuregulin-1)과 같은 수용성 인자들의 분비를 통하여 인간의 타고난 피부색을 결정하는데 있어서, 진피 섬유아세포는 조절 기능을 하는 것으로 확인되었다. 또한, 일광흑자(solar lentigo) 또는 기미(melasma)와 같은 과색소침착증(hyperpigmentary disorders) 발병 과정에 있어서, UV-조사된 섬유아세포의 역할이 강조되고 있다.
기미(melasma)는 얼굴의 과색소침착증에 의해 흔하게 발생하지만, 그 발병기작은 잘 알려져 있지 않다. 이전에 본 발명자들은 피부 기미 병변이 색소형성의 증가 뿐만 아니라 맥관 구조(vasculature)의 증가에 의해 발생한다고 보고하였다. 기미 발생에 있어 맥관 구조의 증가는 UV 조사에 따른 결과 중 하나로, UV-조사된 피부의 주요 혈관형성 인자로 알려진 VEGF의 발현이 증가되어 나타나는 것으로 여겨졌다. 흥미롭게도, 색소 형성과 맥관 구조의 정도 사이에는 정적 상관관계(positive correlation)가 존재한다. 실제로, 임상에서도 혈관 표적 치료가 기미에 있어서 상당한 치료 효과를 나타냈다. 혈관 감소는 멜라노사이트 자극을 감소시키고, 피부 혈관 형성은 색소형성 과정에 관여하는 것으로 나타났다. 또한, 기미에 대한 혈관-표적 치료 효과는 오래 유지되는 것으로 나타났다. 상기 결과들을 종합하면, 멜라닌 형성의 조절 및 UV-유도 과색소침착증의 발병에 있어서, 피부 맥관 구조가 잠재적인 생물학적 역할을 할 것으로 제안된다.
한국공개특허 제10-2011-0061079호(2011.06.09 공개)
본 발명의 목적은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 이용한 피부 색소 억제제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 과색소침착증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 유도용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 이용한 피부 색소 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 조절용 조성물 및 피부 미백제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 피부 색소 형성의 조절에 있어서 내피세포(endothelial cells)의 역할에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 내피 세포가 색소 형성에 부정적 영향을 미친다는 것을 확인하였지만, UV를 조사한 후에는 그 효과가 달라졌는데, 멜라닌 형성의 유도에 긍정적인 영향을 나타냈다. 이를 통해, 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 활용한다면 과색소침착증 등의 피부 색소 질환에 효과적인 치료 전략을 제시할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 B16 melanoma 세포의 색소 형성에 있어 내피세포의 효과를 나타낸다. (A) 트렌스웰 플레이트를 이용하여 B16 melanoma 세포는 Bend3 (쥐 내피세포주)와 3일 동안 공동-배양되었다. 멜라닌 함량, 티로시나제 활성 및 MITF와 티로시나제 발현 수준을 분석하였다. (B) B16 melanoma 세포는 Bend3-유래 조건 배지(conditioned medium; CM)로 3일 동안 처리하였고, 멜라닌 함량, 티로시나제 활성 및 MITF/티로시나제 단백질 발현 수준을 분석하였다. (C) 농축된 조건 배지(concentrated conditioned medium; CCM)는 3일 동안의 B16 melanoma 세포 처리를 위해 사용되었고, 멜라닌 함량, 티로시나제 활성 및 MITF/티로시나제 단백질 발현 수준을 분석하였다. 모든 수치는 3번의 독립된 실험의 평균±SD로 나타냈다.
도 2는 정상 인간 멜라노사이트(normal human melanocytes; NHMs) 및 생체 외(ex vivo) 인간 피부 상에서 내피세포의 효과를 나타낸다. (A) HUVECs 및 NHMs의 최적 공동-배양 배지를 선별하기 위해서, HUVECs 및 NHMs는 HGM, F12 또는 MCDB153에서 3일 동안 배양되었다. 세포 형태가 확인되었고(왼쪽 패널), 세포독성은 MTT 분석을 사용하여 분석하였다(오른쪽 패널). (B) 트랜스웰 플레이트를 사용하여 NHMs은 HUVECs와 함께 MCDB153 배지에서 5일 동안 공동 배양되었다. 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성을 측정하였다. (C) mRNA 및 MITF와 티로시나제 단백질의 발현 수준을 나타낸다. (D) NHMs은 HUVEC-유래 CM으로 5일 동안 처리되었고, 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성 수준을 측정하였다. (E) 생체 외(ex vivo) 인간 피부는 HUVEC-유래 CM으로 3일 동안 유지하였다. 표피 부위 당 색소 부위(pigmented area per epidermal area; PA/EA) 비율 수치를 측정하였다(Fontana-Masson stain). 모든 수치는 3번의 독립된 실험의 평균±SD로 나타냈다.
도 3은 여러 배지 조성을 변경하여 HUVEC 및 멜라노사이트의 증식 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 색소 형성에 있어서 UV-조사된 내피세포의 효과를 나타낸다. (A) Bend3 세포는 UVB 50 mJ/cm2로 조사되었고, 세포 형태를 확인하였다. (B) 세포 펠렛 분석 결과를 나타낸다. B16 melanoma 세포는 UV-조사 또는 비-조사된 Bend3 세포 유래 CCM으로 3일 동안 처리하였다. (C) 세포 펠렛 상에서 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성 수준(왼쪽 패널) 및 MITF와 티로시나제의 단백질 발현(오른쪽 패널)을 분석하였다. (D) NHMs는 UV-조사된 HUVECs 유래 CCM으로 5일 동안 처리하였고, 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성 수준을 측정하였다.
도 5(A)는 UV-조사된 HUVECs 유래 CCM에서 3일 동안 유지된 생체 외(ex vivo) 인간 피부를 나타내고, 도 5(B)는 UV-조사된 HUVECs 존재하에서 3일 동안 유지된 생체 외(ex vivo) 인간 피부를 나타낸다. 표피 부위 당 색소 부위(pigmented area per epidermal area; PA/EA) 비율 수치를 측정하였다(Fontana-Masson stain). 모든 수치는 3번의 독립된 실험의 평균±SD로 나타냈다.
도 6은 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HDMEC)에 UVA 처리 후 배양액을 걷어 농축시킨 후, 멜라노사이트에 3일 처리한 결과를 나타낸다.
도 7은 UV-조사된 내피세포에 의해 분비되는 멜라닌 생성 인자로서 엔도텔린-1(endothelin-1)의 확인 결과를 나타낸다. (A) RNA 서열 분석을 통한 UV-조사 및 비-조사된 Bend3 세포의 차등적 유전자 발현 프로파일링을 나타낸다. (B) UV-조사 또는 비-조사된 Bend3 세포의 ET-1 mRNA의 발현 수준을 실시간 PCR 및 RT-PCR로 분석하였다. (C) B16 melanoma 세포는 UV-조사된 CCM과 함께 BQ-123(1μM)을 3일 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성 수준을 측정하였다. 모든 수치는 3번의 독립된 실험의 평균±SD로 나타냈다.
본 발명자들은 피부 색소 형성의 조절에 있어서 내피세포(endothelial cells)의 역할에 대해 조사하였다. 본 발명자들은 내피 세포가 색소 형성에 부정적 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 하지만, UV를 조사한 후에는 그 효과가 달라졌는데, 멜라닌 형성의 유도에 긍정적인 영향을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 억제용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 피부 색소는 멜라닌일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 과색소침착증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 색소 형성 유도용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 피부 색소는 멜라닌일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 혈관내피세포는 Bend3 세포, 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-D 또는 HDMEC), 인간 심장 내피세포(Human cardiac endothelial cells), 인간 대동맥 내피세포(Human aortic endothelial cells; HAEC), 인간 관상 및 장골 동맥 내피세포(Human coronary and iliac artery endothelial cells; HIAEC 또는 HCAEC), 인간 심장 미세 혈관내피세포(Human cardiac microvascular endothelial cells), 인간 방광 및 자궁 미세 혈관내피세포(Human bladder and uterine microvascular endothelial cells), 인간 폐동맥 내피세포(Human pulmonary artery endothelial cells; HPAEC 또는 PASMC), 인간 폐 미세 혈관내피세포(Human lung microvascular endothelial cells; HMVEC-L), 인간 완두 동맥 내피세포(Human brachiocephalic artery endothelial cells; HBcAEC), 인간 목동맥 내피세포(Human carotid artery endothelial cells; HCtAEC), 인간 진피 림프 미세 혈관내피세포(Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells; HDLMVEC), 인간 내흉 동맥 내피세포(Human internal thoracic artery endothelial cells; HITAEC), 인간 쇄골하 동맥 내피세포(Human subclavian artery endothelial cells; HScAEC) 또는 인간 제대 동맥 내피세포(Human umbilical artery endothelial cells; HUAEC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 UV-조사된 혈관내피세포는 엔도텔린-1(Endothelin-1; ET-1), 조직 형태 플라스미노겐 활성화인자(Tissue type plasminogen activator; tPA), ET-1 수용체 a(ET-1 receptor a; ET-1Ra), 골 형성 단백질 2(Bone morphogenetic protein 2; BMP-2) 및 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 유전자가 상향 발현되고, ET-1 수용체 b(ET-1 receptor b; ET-1Rb), 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(Basic fibroblast growth factor; bFGF) 유전자가 하향 발현될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 UV-조사는 20 내지 100 mJ/cm2의 UVA 또는 UVB로 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물, 기능성 건강식품 조성물 또는 화장료 조성물 중에서 선택된 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학조성물인 경우, 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화합물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 기능성 건강식품 조성물인 경우, 상기 건강식품은 유기산, 인산염, 항산화제, 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕 및 솔비톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 유기산은 이에 제한되는 것은 아니지만 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 또는 사과산일 수 있으며, 인산염은 이에 제한되는 것은 아니지만 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염 또는 폴리인산염(중합인산염)일 수 있으며, 항산화제는 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산 또는 피틴산 등의 천연 항산화제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 건강식품은 상기 유효성분 이외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명의 일실시예에 따른 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 건강식품의 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품은 이에 제한되는 것은 아니지만 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류 또는 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 음료류, 특수영양식품, 건강보조식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치절임식품, 건포류, 과일, 야채, 과일 또는 야채의 건조제품, 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등의 식품의 제조에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, (1) 혈관내피세포에 UV를 조사하는 단계; (2) 상기 UV-조사된 혈관내피세포를 멜라닌 세포와 공동배양하거나, 상기 UV-조사된 혈관내피세포의 배양물을 멜라닌 세포에 혼합하여 배양하는 단계; (3) 상기 (2) 단계의 공동배양물 또는 혼합배양물에 시험물질을 접촉시키는 단계; (4) 상기 시험물질을 접촉한 공동배양물 또는 혼합배양물의 멜라닌 함량 또는 티로시나제 활성을 측정하는 단계; 및 (5) 대조구 시료와 비교하여 상기 (4) 단계에서 측정한 멜라닌 함량 또는 티로시나제 활성이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 혈관내피세포는 Bend3 세포, 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-D 또는 HDMEC), 인간 심장 내피세포(Human cardiac endothelial cells), 인간 대동맥 내피세포(Human aortic endothelial cells; HAEC), 인간 관상 및 장골 동맥 내피세포(Human coronary and iliac artery endothelial cells; HIAEC 또는 HCAEC), 인간 심장 미세 혈관내피세포(Human cardiac microvascular endothelial cells), 인간 방광 및 자궁 미세 혈관내피세포(Human bladder and uterine microvascular endothelial cells), 인간 폐동맥 내피세포(Human pulmonary artery endothelial cells; HPAEC 또는 PASMC), 인간 폐 미세 혈관내피세포(Human lung microvascular endothelial cells; HMVEC-L), 인간 완두 동맥 내피세포(Human brachiocephalic artery endothelial cells; HBcAEC), 인간 목동맥 내피세포(Human carotid artery endothelial cells; HCtAEC), 인간 진피 림프 미세 혈관내피세포(Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells; HDLMVEC), 인간 내흉 동맥 내피세포(Human internal thoracic artery endothelial cells; HITAEC), 인간 쇄골하 동맥 내피세포(Human subclavian artery endothelial cells; HScAEC) 또는 인간 제대 동맥 내피세포(Human umbilical artery endothelial cells; HUAEC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 UV-조사는 20 내지 100 mJ/cm2의 UVA 또는 UVB로 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "배양물"은 본 발명에 따른 혈관내피세포를 적합한 고체 배지에 배양한 배양물 또는 적합한 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포 배양 및 처리
정상 인간 멜라노사이트(Normal human melanocytes; NHMs)는 이전에 보고된 방법을 변형하여 포피 절제 수술 과정에서 인간 포피로부터 분리되었다. NHMs는 F12 배지 또는 MCDB153 배지에서 배양되었다. F12 배지는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Gibco-BRL, Bethesda, MD), 24 ㎍/ml 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 80 nM 12-O-테트라데카노일 포르볼 13-아세테이트(12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate; TPA), 1.2 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 및 0.1 ㎍/ml 콜레라 독소(cholera toxin)가 첨가되어 있다(모든 시약은 Sigma, St. Louis, MO 구입). MCDB153 (Welgene, Daegu, Korea) 배지는 4% FBS, 0.6 ng/ml bFGF, 5 ㎍/ml 인슐린(insulin), 0.1 ㎍/ml 비타민 E(vitamin E) 및 1 ㎍/ml 트랜스페린(transfferin)을 포함한다(모든 시약은 Sigma로부터 구매). 실험에 있어서, NHMs는 2 내지 7 번 계대배양하여 사용하였다. 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC, Lifeline Cell Technology, Frederick, MD)는 HUVEC 성장 배지((HGM, Lifeline Cell Technology)에서 배양되었다. HUVECs는 5번까지 계대배양하여 사용하였다. Murine B16 melanoma cells 및 Bend3 (쥐 내피세포주)는 각각 ATCC (Manassas, VA)로부터 구입 및 Jung YS 교수(아주대학교 약대)로부터 제공받았고, 10% FBS가 포함된 DMEM에 배양하였다. 실험에서 B16 melanoma 세포는 UV-조사된 조건의 배지와 함께 1μM BQ-123 (Sigma)으로 3일 동안 처리되었다.
2. 트랜스웰 ( transwell ) 시스템을 이용한 공동-배양
B16 melanoma 세포 및 Bend3 세포의 공동 배양을 위해서, Bend3 세포를 DMEM 배지가 포함된 6-웰 트랜스웰 플레이트(Corning, Tewksbury, MA)의 내부에 접종하였다. 24시간 동안 안정화한 후, B16 melanoma 세포를 덮었다(overlying). 3일 동안 공동 배양한 후, B16 melanoma 세포를 수확하였다.
NHMs 및 HUVECs의 공동 배양에 있어서, 가장 적합한 배지를 미리 선별하는 작업을 수행하였다. 여러 형태의 상업적으로 판매하는 배지가 시험되었는데, 특히 MCDB153, F12, HGM 및 F12와 HGM가 1:1 및 1:4로 혼합된 배지가 시험되었다. 세포 표현형은 역상 현미경(Axiovert 200, Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 확인하였고, 세포독성은 MTT 분석을 이용하여 측정하였다. 배지의 선별 후, NHMs 및 HUVECs는 트랜스웰 플레이트에서 5일 동안 공동 배양되었다. HUVECs는 2일 마다 한 번씩 새로운 것으로 교환하였다.
3. Bend3 / HUVECs 조건 배지의 제조
조건 배지의 세포적 효과를 측정하기 위해서, Bend3 세포를 DMEM에서 24시간 동안 배양하였다. HUVECs는 앞서 언급한 첨가물이 포함된 MCDB153 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 성분 및 찌꺼기를 제거하기 위해서, 배지는 0.2-㎛ 필터(Millipore, Billerica, MA)로 수집되고 여과되었다. Bend3 세포로부터 얻어진 배지는 단백질 농축기(포어 크기 3kDa, Thermo, Rockford, IL)로 60배 농축되었다. 전체 1.5 ml 배지 부피에서 농축된 조건 배지 50 ㎕는 처리를 위해 사용되었다.
4. 내피세포의 자외선 조사
Bend3 및 HUVECs는 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 한 번 씻어냈고, 새로운 PBS에 두었다. 세포들은 TL 20W/12 RS UV lamps (Philips, Eindhoven, Netherlands)를 이용하여 50 mJ/cm2 UVB로 조사되었다. 조사 후, Bend3 및 HUVECs 세포들을 각각 DMEM 및 HGM에 24시간 동안 배양하였다.
5. 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성 분석
1% Triton X-100 및 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche, Basel, Switzerland)이 포함된 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 6.8)으로 세포들을 용해하였다. 단백질 농도를 결정하기 위해서 Lowry assay system을 이용하여 상등액을 측정하였다. 펠렛은 100 ㎕의 1N NaOH로 60℃에서 3시간 동안 녹였고, 멜라닌 함량을 분석하기 위해 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량은 합성 멜라닌(Sigma)을 이용한 표준 곡선으로부터 계산되었다. 티로시나제 활성 분석을 위해, 각 샘플은 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 6.8)에 녹인 2 mM L-DOPA (sigma)로 37℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응 후, 티로시나제 활성을 490 nm에서 측정하였다.
6. 실시간 PCR 및 RT -PCT
세포 총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 추출하였고, cDNA는 SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 이용하여 얻었다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 인간 티로시나제 센스(sense), 5'-CACCACTTGGGCCTCAATTTC-3' 및 안티센스(antisense) 5'-AAAGCCAAACTTGCAGTTTCCAC-3'; 인간 MITF 센스(sense), 5'-AGAACAGCAACGCGCAAAAGAAC-3' 및 안티센스(antisense) 5'-TGATGATCCGATTCACCAAATCTG-3'; 인간 GAPDH 센스(sense), 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3' 및 안티센스(antisense) 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'; 마우스 ET-1 센스(sense) 5'- GGAAACTACGAAGGTTGGAGGC-3' 및 안티센스(antisense) 5'- CTGTAGAAGCCACACAGATGGTCT-3'; 마우스 GAPDH 센스(sense) 5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3' 및 안티센스(antisense) 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'. PCR 증폭은 다음의 조건 하에서 수행하였다: 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 35초로 27회(ET-1); 94℃에서 30초, 52℃에서 30초 및 72℃에서 35초로 27회(GAPDH).
7. RNA 서열 분석
UV-조사된 또는 비-조사된 Bend3 세포의 세포 총 RNA는 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 추출하였다. RNA의 양 및 질은 nano-photometer (Implen GmbH, Munich, Germany) 및 아가로스 젤 전기영동법을 이용하여 측정하였다. 총 RNA는 poly(A) 선별을 통해 mRNA로 농축시켰다. Illumina HiSeq 2500 platform 상에서 서열분석된 2x100 bp paired-end read libraries를 제작하기 위해서, Standard Illumina protocols (Illumina, San Diego, CA)을 사용하였다. R package DESeq는 차등 발현되는 유전자를 동정하기 위해 활용되었다. 조정된 p-수치가 0.05를 넘지 않으면 유의적 차이가 있는 것으로 판단하였다.
8. 생체 밖( Ex vivo ) 피부 장기 배양 및 배양된 피부의 색소형성 분석
인간 피부 샘플은 동의서를 받은 후 성형 수술 과정에서 얻었고, 이전에 보고된 방법대로 배양하였다. 간단히 설명하면, 멸균된 스테인레스 철 격자는 4% FBS가 첨가된 DMEM을 함유한 배양 접시 상에 놓았다. 피부 시료를 스테인레스 철 격자 상에 놓고, 5% CO2의 37℃ 배양기에서 유지하였다. 3일 후, 시료는 10% 포르말린(formalin)으로 고정시켰고, 파라핀 절편에 포매하였다. 멜라닌 색소는 Fontana-Masson 염색에 의해 가시화되었다. 이미지 분석은 Image Pro Plus Version 4.5 software (Media Cybernetics Co., Rockville, MD)를 이용하여 수행하였고, 표피 부위 당 색소 부위(pigmented area per epidermal area; PA/EA)를 측정하였다.
9. 통계 분석
통계적 유의성은 student's t tests에 의해 시험되었다. p-수치가 <0.05이면 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
< 실시예 1> 색소형성에 부정적 효과를 갖는 내피세포의 존재
내피세포가 멜라닌 형성을 조절하는데 있어 어떤 역할을 하는지 확인하기 위해서, 트랜스웰 플레이트를 사용하여 B16 melanoma 세포를 마우스 내피 세포(Bend3)와 공동 배양하였다. Bend3 세포가 존재할 때, B16 세포의 멜라닌 함량은 상당히 감소하였다(도 1A, 오른쪽 패널). 티로시나제(Tyrosinase)는 멜라닌 생성에 있어 중요한 효소이다. 멜라닌 함량 변화와 일관성 있게, 티로시나제 활성 수준도 상당히 감소하였다(도 1A, 오른쪽 패널). 또한, 세포 내에서 멜라닌 생성-관련 단백질, 소안구증-관련 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor; MITF) 및 티로시나제의 발현 수준은 상당히 하향-조절되었다(도 1A, 왼쪽 패널). 색소 형성 과정에 있어, 내피세포의 주변분비(paracrine) 역할에 대해 좀 더 명확히 하기 위해서, Bend3 세포로부터 얻은 조건 배지로 B16 세포를 처리하였다. 그 결과, 세포의 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성은 상당히 감소하였다(도 1B, 오른쪽 패널). MITF 및 티로시나제의 단백질 수준 또한 상당히 감소하였다(도 1B, 왼쪽 패널). 멜라닌 생성에 있어, 글루코스의 소비 및 락테이트(lactates)의 생산과 관련된 조건 배지의 대사 효과(metabolic effect)를 제외하기 위해서, 2배 농축된 조건 배지의 효과를 평가하였다. Bend3-유래 농축된 조건 배지의 억제 효과는 일관되게 재현되었다(도 1C).
쥐 세포주로부터 얻은 결과들을 정상 인간 멜라노사이트(Normal human melanocytes; NHMs) 및 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)에서도 입증하였다. 본 발명자들은 최초로 공동 배양 시스템을 확립하였고, 두 가지 형태의 세포를 성공적으로 배양하기 위한 최적 배지를 선별하였다. 세포 형태 및 세포독성은 MCDB153, F12, HGM 및 F12와 HGM가 1:1 및 1:4로 혼합된 배지를 포함하는 여러 다양한 형태의 배양 배지에서 분석되었다. F12 배지에서 배양된 HUVECs는 그 형태적 특성을 상실하였고(조약돌 형태 없음), 길쭉한 형태의 세포가 되었다(도 2A). 또한, 상기 결과는 F12 및 HGM 혼합 배지에서도 관찰되었다. 또한, 상기 F12 및 HGM 혼합 배지와 더불어, 내피세포 배지 첨가물(VEGF) 및 멜라노사이트 배지 첨가물(TPA)을 추가한 배지에서도 실험한 결과, 모두 형태 변형 또는 성장 저하 등의 결과를 나타냈다(도 3).
한편, MCDB153 배지에서 배양한 HUVECs는 5일 이상 조약돌-유사 형태를 유지하였다. 따라서, MCDB153 배지가 추후 연구를 위해 선택되었다. MCDB153 배지로 트랜스웰 플레이트를 사용하여 NHMs 및 HUVECs를 공동 배양하였다. HUVECs의 존재 하에서, 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성이 상당히 감소하였다(도 2B). MITF 및 티로시나제의 mRNA 및 단백질 수준 또한 상당히 하향 조절되었다(도 2C). 또한, HUVECs로부터 얻은 조건 배지는 NHMs에 있어 색소 형성을 억제하였다(도 2D). 색소 형성에 있어 HUVECs의 역할을 조사하기 위해서, 생체 밖에서(Ex vivo) HUVECs-유래 조건 배지의 존재 하에 인간 피부를 유지하였다. 조건 배지의 존재하에서 3일 후, Fontana-Masson 염색에 의해 측정한 피부 색소 형성이 대조군 피부보다 상당히 감소되는 것을 나타냈다(도 2E). 종합하면, 상기 결과들은 내피세포의 존재가 색소 형성에 부정적 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
< 실시예 2> 비자극 세포와 반대로 색소 형성을 유도하는 UV -조사 내피 세포
UV는 직접 및/또는 간접적으로 색소 형성을 유도하는 가장 중요한 외부 인자이고, 특히 케라티노사이트 및 섬유아세포를 포함하는 피부 세포가 UV에 의해 자극을 받은 경우, 상기 피부 세포는 색소 형성 조절에 중심 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 색소 형성의 조절에 있어 UV-조사된 내피세포의 효과를 연구하였다. 내피 세포는 20~100 mJ/cm2의 UVB에 노출되었고, 세포 형태 및 트립판 블루 배제 분석에 따른 비-세포독성 에너지 수준으로는 50 mJ/cm2가 결정되었다(도 4A). 그 후, UV-조사된 Bend3 세포 유래 농축된 조건 배지를 B16 세포에 처리하였다. 흥미롭게도, UV-조사된 세포 유래 농축된 조건 배지는 비-조사 세포에 비해 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성을 증가시켰다(도 4B 및 도 4C). 또한, 세포 내 MITF 및 티로시나제의 단백질 수준도 증가시켰다(도 4C, 오른쪽 패널). 색소 형성에 있어 농축된 조건 배지의 자극 효과는 NHMs에서도 일관성 있게 나타났다. UV-조사된 HUVECs 유래 농축된 조건 배지로 처리된 세포 내의 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성은 상당히 증가되었다(도 4D). 상기 결과들은 생체 외(ex vivo) 배양된 피부에서도 평가되었다. Fontana-Masson 분석 결과, UV-조사된 HUVECs 유래 농축된 조건 배지(도 5A) 및 UV-조사된 HUVECs 존재 하(도 5B)에 배양한 두 종류 피부 모두 표피에 멜라닌이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 종합하면, 이러한 결과들은 멜라닌 생성 조절에 있어서 비-조사 세포와는 반대로 UV-조사된 내피 세포가 긍정적인 역할을 하는 것으로 나타났다.
또한, 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HDMEC)에 UVA 20 J/cm2을 처리 후 배양액을 걷어 농축시킨 후, 멜라노사이트에 3일 처리하였다. UVB를 조사한 HUVEC과 동일하게 멜라닌 함량 및 티로시나제 활성이 CCM에서는 감소하고, UVA를 조사한 CCM에서는 증가하는 동일한 결과를 얻었다(도 6). 즉, HUVEC 뿐만 아니라 다른 혈관내피세포에서도 감소하는 효과를 보이고, UVA 또는 UVB 조사 시에 증가하는 효과를 보였다.
< 실시예 3> UV -조사된 내피세포에 의해 분비되는 멜라닌 생성 인자로서 엔도텔린 -1( endothelin -1)의 확인
피부 색소 형성을 조절하는 능력에 있어, UV-조사 및 비-조사된 내피세포 간의 차이점을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 세포의 유전자 발현 프로파일링을 분석하였다. 생물통계학적 분석을 통해, UV-조사 및 비-조사된 Bend3 세포에 있어서 단지 396개의 유전자(254개의 상향-조절 및 142개의 하향-조절)가 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다(p<0.05). 상향-조절된 유전자의 대부분은 DNA 손상 반응 유전자 패밀리(p53 신호 경로)였다. 본 발명자들은 멜라노사이트 기능에 영향을 미친다고 알려진 여러 분비 인자들의 발현 수준을 확인하였다(도 7A). 흥미롭게도, 엔도텔린-1(endothelin-1; ET-1)은 UV 노출 후에 평균 2.98배 이상 상향 조절(log2 ratio: 1.57)되는 것으로 나타난 반면, 줄기세포 인자(stem cell factor; SCF)와 같은 알려진 주변분비(paracrine) 멜라닌 형성 인자를 코딩하는 유전자들은 UV 노출 후에 증가하지 않은 것으로 나타났다. 조직-형태 플라스미노겐 활성화인자(tissue-type plasminogen activator; tPA) 또는 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein-2; BMP-2)은 UV 노출 후에 약간 증가하는 것으로 나타났다. 유전자 발현 프로파일링과 일관되게, 비-조사된 세포에 비해 UV-조사된 Bend3 세포에서 ET-1의 mRNA는 상당히 상향조절되었다(도 7B). 더구나, ELISA 결과는 UV-조사된 내피세포 유래 농축된 조건 배지에서의 ET-1 수준이 대조군 보다 상당히 높은 것으로 나타났다(1.5배 상향-조절, p<0.05). UV-조사된 내피세포의 피부 색소 형성 조절에 있어서 ET-1의 역할을 입증하기 위해서, B16 세포를 UV-조사된 농축된 조건 배지와 함께 1μM ET-1 수용체 길항제(BQ-123)로 처리하였다.UV-조사된 내피세포-유래 농축된 조건 배지에 의해 유발된 색소 형성 증가가 ET-1 수용체 억제에 의해 사라졌다(도 7C). 이러한 결과들은 UV-조사된 내피세포로부터 분비된 ET-1이 주요 멜라닌 생성 인자 중 하나라는 것을 나타냈다.

Claims (14)

  1. 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 억제용 시약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈관내피세포는 Bend3 세포, 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-D 또는 HDMEC), 인간 심장 내피세포(Human cardiac endothelial cells), 인간 대동맥 내피세포(Human aortic endothelial cells; HAEC), 인간 관상 및 장골 동맥 내피세포(Human coronary and iliac artery endothelial cells; HIAEC 또는 HCAEC), 인간 심장 미세 혈관내피세포(Human cardiac microvascular endothelial cells), 인간 방광 및 자궁 미세 혈관내피세포(Human bladder and uterine microvascular endothelial cells), 인간 폐동맥 내피세포(Human pulmonary artery endothelial cells; HPAEC 또는 PASMC), 인간 폐 미세 혈관내피세포(Human lung microvascular endothelial cells; HMVEC-L), 인간 완두 동맥 내피세포(Human brachiocephalic artery endothelial cells; HBcAEC), 인간 목동맥 내피세포(Human carotid artery endothelial cells; HCtAEC), 인간 진피 림프 미세 혈관내피세포(Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells; HDLMVEC), 인간 내흉 동맥 내피세포(Human internal thoracic artery endothelial cells; HITAEC), 인간 쇄골하 동맥 내피세포(Human subclavian artery endothelial cells; HScAEC) 및 인간 제대 동맥 내피세포(Human umbilical artery endothelial cells; HUAEC)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 억제용 시약 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피부 색소는 멜라닌인 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 억제용 시약 조성물.
  4. 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 과색소침착증 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
  6. UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 유도용 시약 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈관내피세포는 Bend3 세포, 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-D 또는 HDMEC), 인간 심장 내피세포(Human cardiac endothelial cells), 인간 대동맥 내피세포(Human aortic endothelial cells; HAEC), 인간 관상 및 장골 동맥 내피세포(Human coronary and iliac artery endothelial cells; HIAEC 또는 HCAEC), 인간 심장 미세 혈관내피세포(Human cardiac microvascular endothelial cells), 인간 방광 및 자궁 미세 혈관내피세포(Human bladder and uterine microvascular endothelial cells), 인간 폐동맥 내피세포(Human pulmonary artery endothelial cells; HPAEC 또는 PASMC), 인간 폐 미세 혈관내피세포(Human lung microvascular endothelial cells; HMVEC-L), 인간 완두 동맥 내피세포(Human brachiocephalic artery endothelial cells; HBcAEC), 인간 목동맥 내피세포(Human carotid artery endothelial cells; HCtAEC), 인간 진피 림프 미세 혈관내피세포(Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells; HDLMVEC), 인간 내흉 동맥 내피세포(Human internal thoracic artery endothelial cells; HITAEC), 인간 쇄골하 동맥 내피세포(Human subclavian artery endothelial cells; HScAEC) 및 인간 제대 동맥 내피세포(Human umbilical artery endothelial cells; HUAEC)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 유도용 시약 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 UV-조사된 혈관내피세포는 엔도텔린-1(Endothelin-1; ET-1), 조직 형태 플라스미노겐 활성화인자(Tissue type plasminogen activator; tPA), ET-1 수용체 a(ET-1 receptor a; ET-1Ra), 골 형성 단백질 2(Bone morphogenetic protein 2; BMP-2) 및 간세포 성장인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 유전자가 상향 발현되고, ET-1 수용체 b(ET-1 receptor b; ET-1Rb), 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(Basic fibroblast growth factor; bFGF) 유전자가 하향 발현되는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 유도용 시약 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 피부 색소는 멜라닌인 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 유도용 시약 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 UV-조사는 20 내지 100 mJ/cm2의 UVA 또는 UVB로 조사하는 것을 특징으로 하는 시험관 내(in vitro) 피부 색소 형성 유도용 시약 조성물.
  11. UV-조사된 혈관내피세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 조성물.
  12. (1) 혈관내피세포에 UV를 조사하는 단계;
    (2) 상기 UV-조사된 혈관내피세포를 멜라닌 세포와 공동배양하거나, 상기 UV-조사된 혈관내피세포의 배양물을 멜라닌 세포에 혼합하여 배양하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계의 공동배양물 또는 혼합배양물에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (4) 상기 시험물질을 접촉한 공동배양물 또는 혼합배양물의 멜라닌 함량 또는 티로시나제 활성을 측정하는 단계; 및
    (5) 대조구 시료와 비교하여 상기 (4) 단계에서 측정한 멜라닌 함량 또는 티로시나제 활성이 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 색소 억제제 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 혈관내피세포는 Bend3 세포, 인간 제대정맥내피세포(Human umbilical vein endothelial cells; HUVEC), 인간 진피 미세 혈관내피세포(Human dermal microvascular endothelial cells; HMVEC-D 또는 HDMEC), 인간 심장 내피세포(Human cardiac endothelial cells), 인간 대동맥 내피세포(Human aortic endothelial cells; HAEC), 인간 관상 및 장골 동맥 내피세포(Human coronary and iliac artery endothelial cells; HIAEC 또는 HCAEC), 인간 심장 미세 혈관내피세포(Human cardiac microvascular endothelial cells), 인간 방광 및 자궁 미세 혈관내피세포(Human bladder and uterine microvascular endothelial cells), 인간 폐동맥 내피세포(Human pulmonary artery endothelial cells; HPAEC 또는 PASMC), 인간 폐 미세 혈관내피세포(Human lung microvascular endothelial cells; HMVEC-L), 인간 완두 동맥 내피세포(Human brachiocephalic artery endothelial cells; HBcAEC), 인간 목동맥 내피세포(Human carotid artery endothelial cells; HCtAEC), 인간 진피 림프 미세 혈관내피세포(Human dermal lymphatic microvascular endothelial cells; HDLMVEC), 인간 내흉 동맥 내피세포(Human internal thoracic artery endothelial cells; HITAEC), 인간 쇄골하 동맥 내피세포(Human subclavian artery endothelial cells; HScAEC) 및 인간 제대 동맥 내피세포(Human umbilical artery endothelial cells; HUAEC)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부 색소 억제제 스크리닝 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 UV-조사는 20 내지 100 mJ/cm2의 UVA 또는 UVB로 조사하는 것을 특징으로 하는 피부 색소 억제제 스크리닝 방법.
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