KR101146113B1

KR101146113B1 - 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포를 포함하는 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101146113B1
Application number: KR1020090117614A
Authority: KR
Inventors: 성종혁; 정형민; 김주미
Original assignee: (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2012-05-16
Also published as: KR20110061079A

Abstract

본 발명은 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포(embryonic stem cell-derived vascular angiogenic progenitor cells)의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

배아줄기세포, 혈관형성전구세포, 미백

Description

배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포를 포함하는 미백용 화장료 조성물{Whitening cosmetic composition comprising embryonic stem cell-derived vascular angiogenic progenitor cells}

본 발명은 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포(embryonic stem cell-derived vascular angiogenic progenitor cells)의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 멜라노사이트(melanocyte)라 불리는 피부 세포에서 만들어진 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정된다. 자외선으로부터 유전자를 보호하고 자유 라디컬(free radical)을 제거하여 세포 내 단백질을 보호하는 기능을 가진 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후, 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 멜라닌의 생성 속도와 분포는 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다.

그러나, 멜라닌이 만들어지는 경로는 알려져 있지만, 티로시나제가 작용하는 이전 단계인 멜라닌 합성을 유도하는 메카니즘(mechanism)이 무엇인지에 대해서는 아직도 자세히 밝혀지지 않고 있다. 하지만, 멜라닌의 생성이 과도하게 활성화되면 전체적으로 피부톤이 어두워 질뿐만 아니라 기미나 주근깨, 점 등과 같이 부분적인 과색소 침착증도 유발하여 미용상으로 좋지않은 결과를 가져오게 된다. 또한, 레져 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 증가하게 되었다.

과도한 멜라닌 생성을 막는 미백제의 수요가 증가하고 있으며, 이를 개발하기 위한 많은 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 비타민 C(아스코르빈산), 코지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화 물질을 화장료에 배합함으로써 피부 미백을 유도하거나 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선하는 것이 보고된 바 있으나, 만족할만한 수준에는 이르지 못하고 있다.

최근, 본 발명자는 지방조직, 골수조직, 제대혈 등으로부터 유래된 성체줄기세포의 배양액이 멜라닌 생성을 억제하고 티로시나아제 저해활성를 가짐으로써 미백용 화장료로서 사용될 수 있음을 밝힌 바 있다(대한민국 특허등록 제10-0848056호). 또한, 대한민국 특허공개 제10-2009-0116659호는 FBS을 포함하는 줄기세포 배양액이 주름개선, 미백 또는 항산화 활성을 나타냄을 개시한 바 있다.

그러나, 줄기세포의 배양액을 미백 성분으로 활용하기 위하여는, 안정적으로 일정한 역가(활성) 이상을 가지는 줄기세포 배양액을 제조하는 것이 필요하다. 지방줄기세포 등의 성체줄기세포의 경우, 줄기 세포를 제공하는 공여자에 따라 미백 활성이 달라질 수 있고, 제공자 별로 바이러스나 박테리아 검사를 실시하여 세포를 배양해야 하며, 안전성 검사에 많은 비용이 소요된다. 또한 성체줄기세포는 증식 배양에 한계가 있어 10 계대 이상 배양할 경우, 노화 등에 의해 세포의 활성이 달라지는 문제점이 있어 그 활용에 한계가 있다.

본 발명자들은 성체줄기세포의 배양액을 사용하는 문제점을 회피하고 또한 우수한 미백 활성을 갖는 미백제를 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 놀랍게도 배아줄기세포로부터 분화된 혈관형성전구세포(vascular angiogenic progenitor cells)의 배양물 또는 분획물이 현저하게 우수한 미백 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 상기 배아줄기세포로부터 분화된 혈관형성전구세포의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포(embryonic stem cell-derived vascular angiogenic progenitor cells)의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양물은 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 배양물의 분획물은 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 ～ 100 kDa의 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다. 상기 배아줄기세포는 바람직하게는 인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells)일 수 있다.

본 발명에 의해, ESC-VAPCs, 특히 hESC-VAPCs의 배양물 또는 그의 분획물이 멜라닌 생성을 억제하고 티로시나아제 활성을 저해하는 것이 밝혀졌다. 특히, hESC-VAPCs의 배양물 또는 그의 분획물은, 대표적인 성체줄기세포인 지방유래 줄기세포의 배양물에 비하여, 현저하게 우수한 미백 활성을 나타내는 것이 발견되었다. 상기, hESC-VAPCs는 분화된 세포로서, 배아줄기세포 또는 성체줄기세포에 비하여, 장기간 동안 안정적인 대량증식이 가능하므로, 일정한 역가 이상을 가지는 미백용 화장료 조성물을 균일하고 안정적으로 제조할 수 있도록 한다.

본 명세서에서, "배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포(embryonic stem cell-derived vascular angiogenic progenitor cells, ESC-VAPCs)"라 함은 배아줄기세포로부터 분화된 혈관형성전구세포(vascular angiogenic progenitor cells, VAPCs)를 말한다. 상기 ESC-VAPCs 특히, 인간 배아줄기세포로부터 유래된 혈관형성전구세포(hESC-VAPCs)는 인간 배아줄기세포로부터 배상체를 형성한 다음, 저 산소 조건(hypoxia medium)에서 분화를 유도하고, CD133, KDR/Flk-1 등의 마커를 발현하는 세포를 분리함으로써 얻어질 수 있다.

"배아줄기세포"는 포유동물 유래의 모든 배아 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 인간 배아줄기세포를 포함한다. 상기 인간 배아줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다. 상기 인간 배아 줄기세포는 예를 들면, CHA-hES3 (Jumi Kim, Sung-Hwan Moon, Soo-Hong Lee, Dong-Ryul Lee, Gou-Young Koh, and Hyung-Min Chung, Effective Isolation and Culture of Endothelial Cellsin Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem cells (2007) STEM CELLS AND DEVELOPMENT 16:269.280) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.

본 발명은 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포(ESC-VAPCs)의 배양물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 hESC-VAPCs를 포함한 ESC-VAPCs는 통상의 배양방법, 예를 들어 젤라틴이 코팅된 배양 접시 상에서 배양될 수 있으며, 배양액은 통상의 세포 배양액 예를 들어 EGM-2 MV, DMEM, M199, 또는 이들의 혼합배지 등을 사용할 수 있다. 세포 증식은 통상의 계대 배양에 따라 수행할 수 있으며, 필요할 경우 각 계대 배양 단계별로 배양액의 구성을 조절할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기한 바와 같이 ESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 배양물 또는 그의 분획물을 포함한다. 상기 배양물은 ESC-VAPCs, 바람직하게는 hESC-VAPCs의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물일 수 있다. 또한, 상기 배양물의 분획물은 ESC-VAPCs, 바람직하게는 hESC-VAPCs의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 ～ 100 kDa의 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물일 수 있다.

상기 원심분리는 세포(즉, ESC-VAPCs), 거대 분자, 배지 성분들을 침강시켜 제거할 수 있는 조건, 예를 들어, 300 ～ 600 g로 5 ～ 10 분 동안, 바람직하게는 약 300 g로 약 5 분 동안 수행될 수 있다. 필요에 따라, 약 0.22㎛ 실린지 필터로 여과하여 잔여 세포와 미지의 거대분자들을 제거할 수도 있다. 또한, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 감압농축, 맴브레인 농축 등의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축함으로써 얻을 수 있다. 바람직하게는, 상기 농축물은 상기 배양액 또는 분획을 TFF (Tangential Flow Filtration) 맴브레인을 사용하여 약 50 배 이상으로 농축시킴으로써 얻을 수 있다.

또한 상기 분획(fractionizing)은 특정 포어 사이즈를 갖는 통상의 멤브레인을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 약 100 kDa의 포어 사이즈를 갖는 멤브레인으로 통과시킨 후, 막을 통과한 분획물을 다시 적절한 포어사이즈를 갖는 멤브레인으로 분획함으로써 수행될 수 있다. 필요에 따라, 얻어진 분획물은 적절한 포어 사이즈를 갖는 필터로 농축하거나, 감압 농축 등의 통상의 방법으로 원하는 단백질 농도가 얻어질 때까지 농축될 수 있다.

본 발명의 미백용 화장료 조성물은 상기한 유효성분을 포함하는 조성물 로서, 그 형태는 제한되지 않는다, 즉, 본 발명의 화장료 조성물의 형태는 크림, 팩, 로션, 에센스, 화장수, 파운데이션 및 메이크업 베이스 등의 통상의 화장료 조성물 형태일 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장료 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 통상의 방법에 따라 제제화될 수 있다. 단위 화장료 조성물 중에 함유되는 상기 유효성분 즉, ESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 배양물 또는 그의 분획물의 함량은 배양물 또는 분획물의 형태, 농축정도 등에 따라 상이할 수 있으며, 예를 들어 단위 화장료 당 0.001 ～ 100 mg/g 의 범위일 수 있다. 물론, 상기 함량은 개선하고자 하는 색소 침착의 정도 등에 따라 상이할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. hESC-VAPCs 의 제조

(1) 배상체의 형성

마이토마이신-C (mitomycin-c)를 2 시간 동안 처리하여 증식을 억제시킨 마우스 섬유아세포 (STO cell, 7.0 X 10⁵ cells/60mm dish)를 젤라틴이 코팅된 배양접시에서 지지세포 배양용 배지(10% 소태아혈청 (FBS), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비- 필수 아미노산(Gibco)이 첨가된 90% DMEM 고 글루코오즈(high glucose) 배지)를 넣고, 24 시간 동안 배양하였다. 배양접시를 DMEM/F-12로 1회 세척한 뒤, 20% 혈청 대체물 (SR), 0.1 mM 머캅토에탄올, 1% 비-필수 아미노산(Gibco), 및 4 ng/ml bFGF로 보충된 80% DMEM/F-12로 이루어진 배양액으로 교체하고, 인간 배아 줄기 세포(CHA-hES3)를 약 7일 동안 배양하였다. 배양액 중에 형성된 상기 인간 배아 줄기 세포의 콜로니를 알콜 램프 가열을 통해 임의적 일정 형태로 만들어진 유리 파이펫을 사용하여 주변 지지세포로부터 분리한 다음, bFGF가 제거된 배아 줄기 세포 배양액에서 약 2일 동안 부유 배양하여 배상체를 형성하였다.

(2) 저 산소 상태의 유도 및 배양

배상체를 함유하는 상기 배상체 배양액(즉, bFGF가 제거된 배아 줄기 세포 배양액) 50 mL 기준으로 약 5 분간 질소(N₂) 가스를 버블링하여 배양액에 저 산소 조건(배양액 중의 산소 분압: 약 2%)을 유도하였다. 가스의 유입량을 조절하기 위해 조절기(regulator)를 연결한 뒤, 배양액의 오염을 막기 위해 0.22㎛ 의 시린지 필터를 조절기와 배양액과 직접 닿는 유리 파이펫의 중간부위에 각각 설치한 후 버블링을 수행하였다. 질소(N₂) 가스 버블링을 마친 배양액 중 일부를 취해 용존산소 측정기(DO meter)를 이용하여 배양액내 용존 산소량을 측정하였다. 저 산소 조건이 유도된 배상체-함유 배양액을 저산소 상태의 인큐베이터 (인큐베이터의 산소 분압: 약 3%)에서 21 동안 배양하였다.

(3) hESC-VAPCs의 분리

상기 배양 기간(21일) 동안, 7일 간격으로 유세포 분석기를 이용하여 hESC-VAPCs의 마커인 CD133, CD34, KDR/Flk-1의 발현량을 측정하고, 유세포 분석기를 이용해 CD133 및 KDR/Flk-1 이중 양성 세포군(double positive population)을 분리하였다.

(4) 계대 배양

분리된 세포들을 EGM-2/MV(Cambrex) 배양액 중에서 배양하고, 세포의 농도가 약 70-80% 정도로 배양 접시에 분포되었을 때 트립신-EDTA (Gibco)를 이용하여 배양 접시로부터 때어낸 후 계대 배양을 실시하였다.

실시예 2. hESC-VAPCs 배양액의 농축물 제조

실시예 1의 상기 계대배양된 hESC-VAPCs 5 X10⁵ cells를 콜라겐이 코팅된 배양접시 위에서 EGM-2/MV(Cambrex 사) 배양액 중에 접종하고, 세포의 농도가 약 70-80% 정도로 배양 접시에 분포될 때가지 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였으며, 이후 추가로 48 시간 동안 동일한 조건으로 배양하였다. 얻어진 배액을 0.22 ㎛ filter membrane을 이용하여 여과한 다음, TFF (Tangential Flow Filtration) 맴브레인 농축 시스템(Millipore 사)을 사용하여 약 50배 농축하여 농축물(VAPC-CM)을 얻었다.

시험예 1. 미백활성 평가

실시예 2에서 얻어진 농축물(VAPC-CM)이 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 아래와 같이 평가하였다.

(1) B16 세포주의 멜라닌 억제실험

설치류 멜라노마 세포주인 B16 세포주(ATCC CRL-6323)를 10% 우태혈청과 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에 첨가하여 37℃, 5% CO₂,조건에서 배양하였다.

상기에서 배양된 B16 세포를 웰 플레이트에, 웰 당 1.5ⅹ10⁴ 개의 세포를 배지 DMEM (Invitrogen-Gibco-BRL, Grand Island, NY)를 이용하여 접종하고, VAPC-CM를 최종 농도가 0 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 8 ㎍/㎖가 되도록 시료액을 1 시간 동안 처리한 후, 인산완충용액으로 배지성분을 세척하였다. 배지성분이 제거된 웰 플레이트에 멜라닌 추출용액 (1N NaOH + 50% DMSO)을 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 80℃에서 세포를 용해시킨 후, B16 세포의 멜라닌 함유정도를 사진으로 찍어 비교 하였다. 그 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, VAPC-CM을 1 ㎍/㎖ 처리했을 때부터, 미처리군에 비하여 유의성 있게 세포내의 멜라닌의 함유 정도가 저하되었으며, 이 결과를 바탕으로 농도 의존적으로 맬라닌 생성이 억제된 것을 확인하였다.

(2) 티로시나아제 활성실험

실시예 2에서 얻어진 농축물 200 ㎕ 와 미리 반응하여 준비된 B16 세포에서 추출한 티로시나아제 20 ㎕ 그리고 버섯 티로시나아제 20 ㎕를 0.1 M 인산염 완충액(pH 6.5) 220 ㎕ 가 들어있는 시험관에 가하였다. 이 용액에 1.5 mM 티로신 액 40 ㎕를 가하였다. 콘트롤로서 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.5)을 가하였으며, 양성 대조군으로서 알부틴(Arbutin)을 100 uM의 농도로 처리하였다. 상기 반응액들을 37℃에서 약 15분 동안 반응시키고, 이를 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, VAPC-CM을 1 ㎍/㎖ 이상 처리한 군의 티로시나아제 저해율은 콘트롤인 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.5)에 비해 60% 이상 높았으며, 양성 대조군으로 사용된 알부틴(Arbutin)의 티로시나아제 활성 억제률 보다 50% 더 높았다.

(3) 웨스턴 블롯팅 분석

배양된 B16 세포를 웰 플레이트에 1.5ⅹ10⁵ 개씩 접종한 후, VAPC-CM의 최종 농도가 0 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 4 ㎍/㎖, 8 ㎍/㎖ 가 되도록 시료액을 2 시간 동안 처리하였다. 48 시간 후에 세포를 RIPA 완충용액(50 mM 트리스-HCl, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 1% SDS, 50 mM NaF, 1 mM Na₃PO₄, 5 mM 디티오쓰레이톨, 1 ㎍/㎖ 류펩틴 및 20 ㎍/㎖ PMSF, pH 7.4)을 이용하여 분해하여 단백질을 얻었다. 25 ㎎의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 단백질이 분리된 겔을 PVDF막에 전이시킨 후, PVDF막을 항-티로시나아제 항체 (희석비, 1:500), α-튜블린 항체(희석비, 1:10,000)와 반응시킨 후, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이티드 항-고우트 IgG 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibody)(희석비, 1:10,000)로 다시 반응시켰다. 얻어진 밴드를 이뮤노바이론 웨스턴 시약(immunobilon western reagent)으로 X-선 필름에 노출시켜 분석하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, VAPC-CM을 50% 이상 처리한 군부터는 티로시나아제의 발현이 크게 저해되었으며, 200%를 처리한 군에서는 티로시나아제가 거의 발현되지 않았다.

시험예 2. 줄기세포 배양물과의 미백활성 비교

본 발명자의 선행특허 즉, 대한민국 특허 제10-0848056호에 따른 지방유래 줄기세포의 배양액과의 미백활성을 비교하였다. 상기 지방유래 줄기세포의 배양액은 상기 특허 제10-0848056호의 실시예2에 따라 얻었으며, Amicon Ultra Centrifugal Devices 3k를 사용하여 약 50배 농축하여, 농축물을 얻었다(ASC-CM).

상기 VAPC-CM 및 ASC-CM을 시험예 1의 (1)과 동일하게 처리하여, 멜라닌 생성 및 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 측정한 결과는 도 4 및 도 5와 같다. 도 4의 사진을 비교해 보면 B16 세포주에 동일한 농도를 처리했을때, VAPC-CM을 처리한 군이 ASC-CM을 처리한 군보다 낮은 멜라닌 함유율을 보였다. 또한, 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 1 ㎍/㎖의 VAPC-CM을 처리한 군은 콘트롤인 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.5)에 비해 60% 이상의 티로시나아제의 활성을 저해하였으며, 양성 대조군으로 사용된 알부틴(Arbutin)의 티로시나아제 활성 억제률 보다 50% 더 높은 반 면, 1 ㎍/㎖의 ASC-CM을 처리한 군의 티로시나아제 활정 억제율은 콘트롤인 0.1 M 인산염완충액 (pH 6.5)에 비해 25% 이상의 티로시나아제의 활성을 저해하였으며, 양성 대조군으로 사용된 알부틴(Arbutin)의 티로시나아제 활성 억제률 보다 약 10% 증가하였다.

시험예 3. 단백질 분석

실시예 2에서 얻어진 VAPC-CM의 구성 단백질을 확인하기 위하여, 사이토카인 항체 어레이(cytokine antibody array) 분석을 수행하였다. 즉, 검출하고자 하는 특정 사이토카인이 집적 되어있는 멤브레인을 스킴 밀크(skim milk)로 상온에서 1시간 블록킹(blocking)시킨 뒤, 10 mM 인산염완충용액 (pH 7.0)으로 5분씩 3번 세척하였다. 그 다음 실시예 2에서 수득한 인간배아 줄기세포 유래 혈관형성 전구세포 배양액 또는 배양분비물과 대조군으로 DMEM 배양배지를 2-3시간 반응 시킨 후, 10 mM 인산염완충용액 (pH 7.0)으로 5분씩 3번 세척하였다. 항-사이토카인 항체와 2-3시간 반응 시킨 뒤 10 mM 인산염완충용액 (pH 7.0)으로 5분씩 3번 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제-컨쥬게이티드 항-고우트 IgG 항체(horseradish peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibody)(희석비, 1:10,000) 와 2-3시간 반응시켰다. 10 mM 인산염완충용액 (pH 7.0)으로 5분씩 3번 세척 과정을 거친 후 검출 용액과 반응시킨 후 X-선 필름에 노출시켜 검출하여 각각의 특정 사이토카인의 발현을 비교하였으며, 그 결과는 도 6과 같다. 도 6의 결과로부터, VAPC-CM에는 EGF, bFGF, VEGF, CM-CSF, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-6 등을 포함한 다양한 성장인자들이 과발 현되는 것을 알 수 있으며, 이러한 성장인자들의 조합이 미백 활성에 영향을 미치는 것으로 추정된다.

도 1은 hESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 농축물(VAPC-CM)의 농도에 따른 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과이다. 도 1에서 Ar 은 양성 대조군인 알부틴(Arbutin)을 의미하고, DMEM은 음성 대조군인 기본 배양배지를 의미한다.

도 2는 hESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 농축물(VAPC-CM)의 농도에 따른 티로시나아제 억제 활성을 특정한 결과이다. 도 2에서 콘트롤은 기본 배양배지인 DMEM을 의미한다.

도 3은 hESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 농축물(VAPC-CM)의 농도에 따른 B16 세포의 티로시나아제의 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 3에서 콘트롤은 기본 배양배지인 DMEM을 의미한다.

도 4는 hESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 농축물(VAPC-CM) 및 지방줄기세포 배양액으로부터 얻어진 농축물(ASC-CM)의 멜라닌 생성 억제 활성을 측정한 결과이다.

도 5는 hESC-VAPCs의 배양액으로부터 얻어진 농축물(VAPC-CM) 및 지방줄기세포 배양액으로부터 얻어진 농축물(ASC-CM)의 티로시나아제 억제 활성을 특정한 결과이다.

도 6는 배양액 종류에 따른 사이토카인 항체 어레이와 반응시킨 결과(사진)이다. 상하 2개의 점은 같은 사이토카인을 나타낸다. (a)는 배아줄기세포 유래 혈관형성 전구세포 배양액에서 발현되는 사이토카인이고, (b)는 기본 배양배지인 DMEM 에서 발현되는 사이토카인이다. 대조군에 비해 증가한 점들은 bFGF, EGF, CM- CSF, IGFBP-2, IGFBP-4, IGFBP-6, VEGF 등 이다. 이때, PC 는 사이토카인 항체 어레이의 항상 양성 반응점이다.

Claims

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인간 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액; 상기 상층액의 농축물; 또는 상기 상층액의 동결건조물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
인간 배아줄기세포-유래 혈관형성전구세포의 배양액을 원심분리하여 얻어진 상층액을 3 ～ 100 kDa의 단백질을 포함하도록 분획하여 얻어진 분획; 상기 분획의 농축물; 또는 상기 분획의 동결건조물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
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