KR101712874B1 - 인간화 항 TNF α 항체 및 그의 항원 결합 단편 (Fab) 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α 항체 및 그의 항원 결합 단편(Fab)을 개시한다. 본 발명은 또한 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편(Fab)을 포함하는 조성물, 및 상기 항체 또는 항원 결합 단편(Fab)의 종양 괴사인자-α와 관련된 질환의 치료에의 용도를 개시한다.
Description
본 발명은 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α(TNF-α) 항체와 그의 항원 결합 단편(Fabs) 및 그의 용도에 관한 것이다.
자가면역 질환의 발병 및 진행은 다수의 활성 사이토킨의 조절 불균형으로 인해 생기는 복합적인 과정이다. 종양 괴사인자-α(TNF-α)는 수많은 사이토킨 중에서 면역조절에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이의 과발현은 자가면역 질환 등을 일으키는 주요 원인 중 하나로 확인되었다. 따라서, TNF-α 활성을 억제하는 생물의약을 사용하는 것은 그러한 질환을 치료하기 위한 가장 성공적인 치료법 중 하나가 된다. 현재 입증된 징후는 주로 류머티스 관절염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 및 소아 특발성 관절염 등을 포함하는 한편, 기타 다수의 관련 질환은 현재 임상 실험 중에 있다.
현재, 유럽과 미주 시장에서는 약제학적 항-TNF-α 항체 및 유사 항체 Fc 융해 단백질 약제, 예컨대, 레미케이드가 시판되고 있다. 그러나 레미케이드는 체내 반감기가 약 9일 정도로 짧다. 또한, 1/3은 뮤린-유래 서열 및 2/3는 인간-유래 서열로 구성된 키메라 항체인 레미케이드는, 비록 우수한 결합 친화성, 생체활성 및 임상적 효능을 갖지만, 약 10% 내지 47%의 환자는 레미케이드 투여후 면역 반응이 발생하며, 결과적으로, 대개 인간 항마우스 항체(HAMA)를 생성하므로써, 항체의 효능 및 장기적인 이용에 영향을 준다. 따라서, 뮤린 기원의 정도를 낮추고 인간 질환의 치료에 안전하게 이용할 수 있도록, 인간화 수준이 높고 뮤린-유래 서열의 비율이 최대한으로 감소된 항-TNF-α 항체가 아주 많이 요구되고 있다. 일반적인 항체의 인간화 과정에서는 뮤린-유래 항체의 가변영역(VH, VK)의 상보성 결정 영역(CDRs)의 일부를 미리 선정한 인간 항체의 골격 영역에 이식하고(graft) 있다. 그 결과로 나온 항체는 대부분 인간-유래 서열로 이루어지며, 동일 항원에 대한 뮤린 기원의 개시 항체의 선택성을 유지할 수 있다. 그러나, 이러한 과정은 대개 항체 친화성의 손실을 초래한다.
본 발명의 하나의 목적은 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α(TNF-α) 항체와 그의 항원 결합 단편(Fabs)를 제공하는 데 있으며, 인간 종양 괴사인자-α에 대한 그의 친화력은 인간-뮤린 키메라 항체인 레미케이드의 친화력에 필적하거나 심지어 그보다 더 높다.
본 발명에서 제공한 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α(TNF-α) 항체나 Fabs는 중사슬 가변영역과 경사슬 가변영역을 포함하고, 상기 중사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1 또는 3으로 나타내고, 상기 경사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 15, 9, 11, 7, 13, 및 5중 하나로 나타내며, 상기 서열번호 1의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln 이다.
항체는 특히 다음의 (a) 내지 (l) 중 하나로부터 선택된다:
(a) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 15로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH08)을 갖는 KS10;
(b) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 9로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH05)을 갖는 KS03;
(c) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 11로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH06)을 갖는 KS06;
(d) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 15로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH08)을 갖는 KS12;
(e) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 9로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH05)을 갖는 KS04;
(f) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 11로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH06)을 갖는 KS07;
(g) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH03)을 갖는 KS02;
(h) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 7로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH04)을 갖는 KS08;
(i) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 13으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH07)을 갖는 KS11;
(j) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH03)을 갖는 KS01;
(k) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 7로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH04)을 갖는 KS05;
(l) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 13로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역(SH07)을 갖는 KS09,
여기서, 서열번호 1의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln 이다.
본 발명의 다른 목적은 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α항원 결합 단편(Fab)을 제공하는 데 있다. Fab는 서열목록의 서열번호 27 또는 서열번호 25의 위치 1 내지 120에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 중사슬 가변영역, 및 서열목록의 서열번호 31 또는 서열번호 29의 위치 1 내지 109에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 경사슬 가변영역을 포함한다.
본 발명에서 제공한 항체는 인간 항체의 중사슬 불변영역과 동일한 불변영역의 아미노산 서열을 갖는 중사슬, 및 인간 항체 경사슬 불변영역과 동일한 불변영역의 아미노산 서열을 갖는 경사슬로 이루어진다.
상술한 항체의 중사슬 불변영역은 임의 종류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) 또는 아종(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2)의 인간-유래 불변영역일 수 있으며, 또한 상술한 항체의 경사슬 불변영역은 임의 종류(κ 또는 λ) 또는 아종(λ1, λ2, λ3, λ4) 또는 별종(κm(1), κm(2), κm(3))의 인간-유래 경사슬 불변영역일 수 있다.
항체의 중사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 특히 서열번호 17로 나타내며, 항체의 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 특히 서열번호 19로 나타낸다.
상기 중사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 21로 나타내며, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 23으로 나타낸다. 서열번호 21의 위치 1 내지 120에 있는 아미노산 잔기는 중사슬의 가변영역에 상응하고, 서열번호 21의 위치 121 내지 450에 있는 아미노산 잔기는 중사슬의 불변영역에 상응한다. 서열번호 23의 위치 1 내지 109에 있는 아미노산 잔기는 경사슬의 가변영역에 상응하고, 서열번호 23의 위치 110 내지 214에 있는 아미노산 잔기는 경사슬의 불변영역에 상응한다. 서열번호 21의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln 이다.
본 발명에서 제공하는 Fab는 중사슬 Fd 단편 및 경사슬로 이루어지며, 상기 중사슬 Fd 단편은 VH 및 CH1을 포함하고 경사슬은 VK 및 경사슬 불변영역을 포함하며, 이때 CH1의 아미노산 서열은 인간 항체 중사슬의 불변영역 CH1의 아미노산 서열과 동일하고, 상기 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 인간 항체 경사슬의 불변영역의 아미노산 서열과 동일하다.
상술한 Fab의 Fd 단편의 CH1은 임의 종류(IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) 또는 아종(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2)의 인간-유래 불변영역 CH1일 수 있으며, 상기 Fab의 경사슬 불변영역은 임의 종류(κ 또는 λ) 또는 아종(λ1, λ2, λ3, λ4) 또는 별종(κm(1), κm(2), κm(3))의 인간-유래 경사슬 불변영역일 수 있다.
CH1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 33으로 나타내며, 상기 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타낸다.
특히, 본 발명의 구현예에서 Fab는 하기의 (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나이다:
(b1) 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27로 나타내고, 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7F;
(b2) 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7A;
(b3) 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 29로 나타내는 KS-2E.
본 발명의 또 다른 목적은 항원 결합 단편 A 또는 항원 결합 단편 B를 제공하는 데 있으며, 상기 항원 결합 단편 A는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv (항체의 가변영역 단편), 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역, 중사슬 가변영역에서 선택된 폴리펩티드 단편 또는 경사슬 가변영역에서 선택된 폴리펩티드 단편으로, 이들 단편은 상기 항체로부터 유래되며; 항원 결합 단편 B는 Fab', F(ab')2, Fv, 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역, 중사슬 가변영역에서 선택된 폴리펩티드 단편 또는 경사슬 가변영역에서 선택된 폴리펩티드 단편으로, 이들 단편은 상기 Fab로부터 유래된다.
상술한 F(ab')2는 한쌍의 경사슬 및 한쌍의 중사슬 (Fd'라고도 함)로 이루어지고, 이들은 Fd보다 약간 크다. 펩신에 의한 IgG 분자의 가수분해로 상기 F(ab')2 단편을 생성할 수 있으며, 이 단편은 두개의 Fab를 포함함으로써, 2개의 항원성 에피토프와 결합할 수 있다. Fd'는 VH, CH1, 및 힌지영역(hinge region)을 비롯하여 약 235개의 아미노산 잔기를 포함한다. Fv는 경사슬 가변영역(VL) 및 중사슬 가변영역 (VH)으로 이루어지며, 이들은 비공유결합을 통해 서로 연계되어 있다. Fv는 단일 항원 결합부위 때문에 본래의 항체 분자의 약 1/6에 해당하는 분자량을 갖는다. Fv는 ScFv (단일사슬 항체), DsFv (이황화물-결합 안정화 항체) 등을 포함한다. ScFv는 적절한 올리고뉴클레오티드 편 (링커)에 의해 서로 결합된 VH 및 VL 로 표현되는 단일 펩티드 사슬이다. DsFv는 하나의 시스테인을 적절한 부위에서 경사슬 및 중사슬 가변영역에 각각 도입함으로써 형성된 이황화물-결합 부동화 Fv 단편이다. DsFv는 결합력과 안정성 양 측면에서 ScFv보다 우월한 것으로 밝혀졌다.
또한, 하기 단백질 (A) 내지 (C) 중 어느 하나를 암호화하는 유전자가 본 발명의 특허청구범위에 속한다.
(A) 상술한 항체; (B) 상술한 Fab; 및 (C) 항원 결합 단편 A 또는 B.
항체 및 항원 결합 단편 A의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 2 또는 4로 나타낸다. 항체 및 항원 결합 단편 A의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 16, 10, 12, 8, 14 및 6 중의 하나에서 선택된다. Fab 및 항원 결합 단편 B의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은, 서열목록의 서열번호 2, 4, 28 중 어느 서열의 위치 1 내지 360과, 또한 서열번호 26의 위치 1 내지 360에 상응한다. Fab 및 항원 결합 단편 B의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은, 서열목록의, 서열번호 16, 10, 12, 8, 14, 6 및 32 중 어느 서열의 위치 1 내지 327과, 또한 서열번호 30의 위치 1 내지 327에 상응한다.
상기 서열에서, 서열번호 2 및 4는 모두 360개의 뉴클레오티드를 갖고, 서열번호 6, 8, 14, 10, 12 및 16은 모두 327개의 뉴클레오티드를 갖는다.
항체의 중사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 18로 나타내며, 항체의 경사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타낸다.
Fab의 CH1 영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 34로 나타내며, Fab의 경사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타낸다.
본 발명의 구현예에서, 항체의 중사슬의 암호화 서열은 서열목록의 특히 서열번호 22로 나타내며, 항체의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 특히 서열번호 24로 나타낸다.
상기 Fab의 암호화 서열은 다음 (c1) 내지 (c3) 중 어느 하나이다:
(c1) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 28로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7F;
(c2) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7A;
(c3) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 30으로 나타내는 KS-2E.
서열번호 22의 위치 1 내지 360 및 360 내지 1350에 있는 뉴클레오티드는 각각 중사슬의 상술한 가변영역 뉴클레오티드 및 중사슬의 불변영역 뉴클레오티드에 상응하고; 또한 서열번호 24의 위치 1 내지 327 및 328 내지 642에 있는 뉴클레오티드는 각각 경사슬의 상술한 가변영역 뉴클레오티드 및 경사슬의 불변영역 뉴클레오티드에 상응한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 다음의 유전물질: 예컨대, 재조합 벡터, 재조합 박테리아, 재조합 세포주, 재조합 바이러스 또는 상기 유전자군을 포함하는 발현 카세트를 제공하는 데 있다.
재조합 벡터는 항원, Fab 또는 항원 결합 단편을 발현하는 원핵세포 또는 진핵세포 발현 벡터이다. 재조합 박테리아는 상기 유전자군이 잠복하는 대장균(Escherichia coli)이다. 재조합 세포주는 전이유전성 세포주나 융해 세포주로서, 이러한 전이유전성 세포주는 본 발명의 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α 항체, Fab 또는 그의 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자가 내부에 전달된 포유동물 세포주, 바람직하게는 CHO 세포주 또는 293 세포주 및 그의 서브 세포주일 수 있으며; 융해 세포주는 본 발명의 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포이다. 재조합 바이러스는 상기 유전자군을 운반하는 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 아데노계 바이러스 등이다. 발현 카세트는 다음과 같이 상행류에서 하행류 방향으로 3개의 단편, 즉: 프로모터; 프로모터에 의해 전사가 개시되는 항체, Fab 또는 항원 결합 단편의 암호화 유전자; 및 종결자를 함유한 DNA 분자이다.
숙주세포를 항체, Fab 또는 항원 결합 단편의 암호화 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 트랜스펙트 또는 변형하는 경우, 상응하는 단백질을 발현할 수 있으며, 그 결과로 항체, Fab 또는 항원 결합 단편을 수득할 수 있다. 상기 숙주세포는 진핵세포일 수도 있으며 또한, 특별히 한정되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 박테리아, 이스트, 곤충 세포 등을 포함한 원핵세포일 수도 있다. 대형 단백질 발현에 유용한 광범위한 종류의 포유동물 세포, 예컨대, 293, CHO, SP20, NS0, COS, BHK, 또는 PerC6 세포 등이 있다. 비제한적으로, 전기영동, 리포좀-매개 트랜스펙션, 인산칼슘-매개 트랜스펙션 등을 포함하여 다양한 세포 트랜스펙션 방법이 있다.
항체, Fab 또는 항원 결합 단편의 바람직한 발현 방법은 다음과 같다: 안정하게 트랜스펙트된 숙주세포에서 다양한 재조합 벡터를 이용하여 유전자 증폭을 수행함으로써, 재조합 단백질의 발현 정도를 증가시킨다. 예를 들어, DHFR-결핍 숙주세포는 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)를 함유한 재조합 벡터에 의해 안정하게 트랜스펙트되며, 다음에, 메토트렉사이트(MTX)를 숙주세포내 재조합 벡터의 복제수를 증대하기에 충분한 농도로서 세포 배양 배지에 첨가할 수 있다.
암호화 유전자 서열의 조합을 포함한 Fab 또는 IgG의 발현 후, 효소 결합 면역흡수 분석(ELISA) 또는 그 밖의 분석법을 이용하여 배지내 단백질 농도를 결정할 수 있다. Fab 단편의 경우, 단백질 G를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있으며, IgG 단백질은 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다.
또한, 항체, Fab 또는 항원 결합 단편, 또는 유전자 또는 유전물질의 다음과 같은 용도도 본 발명의 특허청구범위에 포함된다:
(d1) 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조; 또는
(d2) 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물(product)의 제조; 또는
(d3) 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조.
여기서 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환은 인간 종양 괴사인자-α의 증가에 의해 야기된 질환, 바람직하게는 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 및 소아 특발성 괸절염 등이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 데 있으며, 상기 활성 성분은 다음의 물질, 즉, 상술한 항체, Fab, 항원 결합 단편, 유전자 및 유전물질 중 하나 이상을 포함하며; 또한 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체나 부형제이다. 상기 약제학적 조성물의 활성 성분은 상술한 Fab나 항체들 중 하나, 상술한 항원 결합 단편들 중 하나, 상술한 유전자들 중 하나, 또는 상술한 유전물질들 중 하나일 수 있다.
또한, 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환의 치료에 있어서, 다음의 물질, 즉, 항체, Fab, 항원 결합 단편, 유전자, 유전물질 중 어느 하나와, 또한 상술한 약제학적 조성물의 용도도 본 발명의 특허청구범위에 포함된다.
인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환은 인간 종양 괴사인자-α의 증가에 의해 야기되는 질환으로서, 바람직하게는, 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 류머티스 관절염(rheumatoid arthritis), 크론병(Crohn's disease), 판상형 건선(plaque psoriasis), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis) 등이 있다.
도 1은 ELISA에 의해 TNF-α 억제시 인간화 Fab의 생체활성도를 검출하는 것을 도시한다;
도 2는 L929 세포독성 실험에 의해 TNF-α의 중화시 인간화 Fab의 생체활성도를 검출하는 것을 도시한다;
도 3은 다양한 종으로부터 얻은 항원성 TNF-α에 대한 KS10의 결합 분석을 도시한다;
도 4는 류머티스 관절염이 있는 실험 래트에 대한 KS10을 이용한 치료 점수를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다;
도 5는 류머티스 관절염이 있는 실험 래트의 관절 활액(synovial fluid)/조직내 IL-1β 수준에 대한 KS10의 효과를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다;
도 6은 류머티스 관절염이 있는 실험 래트의 관절 활액/조직내 IL-6 레벨에 대한 KS10의 효과를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다.
도 2는 L929 세포독성 실험에 의해 TNF-α의 중화시 인간화 Fab의 생체활성도를 검출하는 것을 도시한다;
도 3은 다양한 종으로부터 얻은 항원성 TNF-α에 대한 KS10의 결합 분석을 도시한다;
도 4는 류머티스 관절염이 있는 실험 래트에 대한 KS10을 이용한 치료 점수를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다;
도 5는 류머티스 관절염이 있는 실험 래트의 관절 활액(synovial fluid)/조직내 IL-1β 수준에 대한 KS10의 효과를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다;
도 6은 류머티스 관절염이 있는 실험 래트의 관절 활액/조직내 IL-6 레벨에 대한 KS10의 효과를 도시하며, 좌측에서 우측으로, 정상군, 음성군, 모델군, KS10 5mg/kg 투약군, KS10 10mg/kg 투약군 및 KS10 20mg/kg 투약군 순으로 되어 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여 제공한 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 특별한 언급이 없는 한, 하기의 실험 방법은 모두 종래 기술에 따른다. 또한 별도의 언급이 없는 한, 실시예에서 이용한 실험 재료는 모두 시중의 생화학 시약 판매점에서 구입할 수 있다. 다음의 실시예에서 정량분석은 3회 중복 실시하며, 그 평균치를 결과값으로 취한다.
인간화 항-TNF-α 항체에서 중사슬 및 경사슬의 CDRs 이식은 PCR에 의한 위치-지향적 돌연변이이며, 본 발명에서 기술한 돌연변이체 라이브러리는 종래의 유전자 재조합 기술 및 항원-항체 상호작용에 기초한 면역학적 기술에 따라 스크리닝하였다. 또한, 세부적인 실험절차와 단계는 "Molecular Cloning: a Labratory Manual" (3rd edition, Joseph Sambrook 저서, Science Press) 및 기타 유사한 실험용 핸드북에 기술되어 있다. 다음과 같은 실시예에서 EC50은, 광학 밀도값(OD450)을 소프트웨어 GraphPad Prism 5에 입력하고, 그 결과 그래프를 제작하여 구했다.
실시예 1: 인간화 항-TNF-α 항체의 Fab의 발현 및 그의 활성도 검출
본 실시예는 인간화 항-TNF-α 항체의 3가지 Fab (Fab는 항체의 중사슬 Fd 단편 및 경사슬로 이루어진다), 즉, KS-2E, KS-7A 및 KS-7F와 연관된다.
1. KS-2E, KS-7A 및 KS-7F를 위한 발현 벡터의 구성
(1) 경사슬 및 중사슬의 서열 수득
인간 TNF-α에 의해 면역화된 생쥐(R & D사, 카탈로그 번호: 210-TA-050)로부터, 하이브리도마 세포를 수득하여 단일클론 스크리닝하고, 이어서 총 RNA를 추출하여 주형(template)으로 이용했다. 이 주형으로부터 중사슬 가변영역에 관한 뉴클레오티드 서열이 다음과 같은 일반 프라이머를 이용한 PCR에 따라 증폭되었고: P1: 5'-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3', P2: 5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3', 또한 경사슬 가변영역에 관한 뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 일반 프라이머를 이용한 PCR에 따라 증폭되었다: P3: 5'-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3', P4: 5'-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3'. 관심대상의 (유전자)밴드를 포함하는 겔 슬라이스를 회수용으로 절단했다. 항체의 경사슬 및 중사슬의 증폭 산물을 각각 벡터 pMD18-T에 삽입했다 ((TaKaRa사, 카탈로그 번호: D101C). 단일 집락을 분리 수집하여 서열화함으로써, 상기 항체의 중사슬 및 경사슬 가변영역에 관한 뉴클레오티드 서열을 동정하였다.
(2) 인간화 Fab의 구성
결과로 나온 경사슬 가변영역과 인간화 항체의 경사슬 가변영역 간의 아미노산 서열 유사성, 및 결과로 나온 중사슬 가변영역과 인간화 항체의 중사슬 가변영역 간의 아미노산 서열 유사성을 비교하였다. 서열 유사성은 각각 IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) 및 IMGT (ImMunoGeneTics, IMGT: http://www.imgt.org)으로 조사했다. 조사 결과에 근거하여, 경사슬 및 중사슬에 대해 더 큰 서열 유사성을 갖는 항체를 인간화 항체를 위한 주형으로 선택했다. 결과로 나온 중사슬 가변영역(VH)을 높은 서열 유사도를 갖는 인간 항체 IGHV3-15*07(수탁번호: M99406)의 골격영역에 이식하고, 또한 결과로 나온 경사슬 가변영역(VK)은 높은 서열 유사도를 갖는 인간 항체 IGKV6-21*01 (수탁번호: X63399)의 골격영역에 이식했다.
인간 본래의 중사슬 단편(Fd) 및 경사슬의 돌연변이 주기를 수회 반복한 뒤, 각종 경사슬 및 중사슬 단편(Fd)들의 조합물을 벡터 pTLR (변형 pET22b (+) 벡터) 안에 삽입했다. 특히, 각 말단에 제한 엔도뉴클레아제 부위 BamHI 및 EcoRI를 각각 구비한 경사슬을 위한 각종 DNAs, 및 각 말단에 제한 엔도뉴클레아제 부위 NotI 및 XhoI를 각각 구비한 중사슬 단편(Fd)을 위한 각종 DNAs를 준비한다. 2개의 DNA 그룹을 각각 상응하는 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 벡터 pTLR (변형 pET22b (+) 벡터) 속으로 클론화 했다. 즉, 경사슬을 위한 각종 DNAs를 제한 엔도뉴클레아제 부위 BamHI와 EcoRI 사이에 삽입하고 중사슬 단편(Fd)을 위한 각종 DNAs는 제한 엔도뉴클레아제 부위 NotI와 XhoI 사이에 삽입함으로써, 수개의 Fab 발현 벡터 (KS-2E, KS-7A 및 KS-7F를 각각 발현하는 3개의 Fab 발현 벡터를 포함)를 구성하게 된다.
상술한 경사슬 및 중사슬 단편(Fd)의 다양한 조합물은 상술한 3가지 Fab, 즉 KS-2E, KS-7F 및 KS-7A을 포함한다. KS-2E의 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26로 나타낸다. 또한 KS-2E의 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 29로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30으로 나타낸다. KS-7A의 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26으로 나타내고, KS-7A의 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32로 나타낸다. KS-7F의 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28로 나타내고, KS-7F의 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32로 나타낸다.
상술한 pTLR 벡터를 수득하기 위하여 pET22b (+) 벡터를 변형시키는 세부 절차는 다음과 같았다: 먼저, DNA 분절 (T-L-R DNA 서열로 약칭, 서열목록의 서열번호 35로 나타냄)은 인공 합성되었으며, 이는 T7 프로모터, 락토스 조작체 및 리보좀 결합부위(RBS)의 서열을 포함하고, 각 말단에는 제한 엔도뉴클레아제 부위 SalI 및 NotI 가 위치하며; 따라서, pET22b (+) 벡터 (Novage사 제품, USA) 및 T-L-R DNA 서열은 SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제에 의해 각각 소화되고, 이어서, T4 DNA 리가제에 의해 함께 결찰 및 변형되었다; 마지막으로, 종래의 방법으로 단일 집락을 취하여 서열화해서 적절히 변형된 벡터를 스크리닝하였다.
2. KS-2E, KS-7A 및 KS-7F의 원핵세포 발현
E. coli 균주 Top 10은 상기의 구성된 Fab 발현 벡터로 각각 변형시켜 (각각 KS-2E, KS-7A 및 KS-7F을 발현하는 3가지 Fab 발현 벡터를 포함), 클로르암페니콜을 함유한 2-YT 플레이트 상에 깔았다 (펩톤 1.6%, 이스트 추출물 1%, NaCl 0.5%, 및 한천분말 1.5%). 다음날, 적절한 집락 밀도의 플레이트를 선택하여 수개의 단일 집락물을 취했다. 각 양성 집락에서, 8개의 단일 집락을 꺼내 96-웰 딥 웰 플레이트에 넣고 IPTG로 발현을 유도했다. 각 단일 집락을 클로르암페니콜이 함유된 6 ml의 2-YT 액상 배지관에 가하고 (펩톤 1.6%, 이스트 추출물 1% 및 NaCl 0.5%), 37℃에서 250 rpm으로 12시간 동안 흔들었다. 0.2 μl의 박테리아 현탁액을 각 관에서 피펫으로 취해 클로르암페니콜이 함유된 2-YT 플레이트로 옮겨 보관했다. 5 ml의 박테리아 현탁액을 500 ml의 클로르암페니콜 함유의 2-YT 액상 배지에 접종하여 OD600이 0.6에 도달할 때까지 33℃에서 300 rpm으로 배양했다. 다음에, IPTG를 상기 배지에 가하여 50 μM의 최종 농도로 만들어 3시간의 유도 기간에 각종 Fab 발현을 유도하였다. 유도 발현이 완료된 후, 배양배지를 10℃에서 15분간 5100 rpm으로 원심분리했다. 상청액을 버리고 박테리아 침전물을 40 ml의 사전냉각 TES 용액을 이용하여 완전히 재현탁한 뒤; H2O 용액을 이용하여 20%로 희석한 66 ml의 사전냉각 TES을 상기의 재현탁 박테리아 용액에 추가하고 얼음 위에서 40분간 배양한 뒤, 4℃에서 10분간 13000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리후, 상청액을 수거하는데, 이는 Fab 단백질 (KS-2E, KS-7A 또는 KS-7F 단백질)을 함유하는 주변세포질(periplasmic) 추출물이다. 이 주변세포질 추출물은 G-25 (GE사, 17-0034-01)) 칼럼에 통과시켜 탈염처리했다. 단백질 G (GE사, 17-0618-04) 사전충전칼럼을 준비하여, 평형액 (20 mM 인산염 완충액, pH 6.5)으로 평형화 처리하고, 이어서 단백질 시료를 충전했다. 시료 충전후, 이 칼럼을 평형액으로 연속 세척한 뒤, 용리액(0.1 M Gly-HCl, pH2.5)을 이용하여 직접 용출했다. 용출된 분획물을 수거하고, 수거에 앞서, 1.0 M Tris-HCl 완충액(pH 9.0)을 분획물 수거관에 미리 첨가하여 상기 분획물의 pH를 7.0으로 조정했다. 이 때, 트리스 완충액 대 용출된 분획물의 부피비는 1:9 였다. 수거한 액체는 관심대상의 단백질을 포함하고 있다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE로 분석했고 단백질 시료의 단백질 농도를 측정하였다. 마지막으로, 단백질 시료를 서브패키징하고(subpackaged) -80℃에서 보관함으로써, 고순도 Fab 단백질 (3종의 단백질 즉, KS-2E, KS-7A 및 KS-7F)을 얻었다.
3. KS-2E, KS-7A 및 KS-7F의 생체활성도 측정
(1) ELISA를 이용한 TNF-α에 대한 인간화 Fab의 결합 분석
TNF-α에 결합하는 Fab 단백질을 다음의 단계에 따라 스크리닝했다: ELISA 플레이트를 웰당 기질로서 100 ng의 인간 유래 TNF-α(R & D사, 카탈로그 번호: 210-TA-050)로 코팅하고; 40 nM Fab 단백질로 된 2배 계단 희석액 (단계 2에서 조제한 것으로서, 3가지 단백질 즉, KS-2E, KS-7A 및 KS-7F을 포함하는)을 첨가하여 배양하고; 고추냉이 페록시다제로 표식화한 염소 항-인간 C-카파 2차 항체 (Sigma사, 카탈로그 번호: K3502)를 첨가한 뒤, 마지막으로 발색을 위해 TMB을 첨가하고 또한 2 M 황산을 도입하여 반응을 중지시킴으로써, TNF-α에 결합하는 Fab 단백질을 측정하였다. 이러한 스크리닝 공정에 따라, 3가지의 고활성도 Fabs, 즉; KS-2E, KS-7F 및 KS-7A를 수득했으며, 이들 3가지 단백질은 모두 2가지의 상이한 VHs (VH01 및 VH02, 여기서 VH01의 아미노산 서열은 서열번호 25로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 26로 나타내고; 또한 VH02의 아미노산 서열은 서열번호 27로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 28로 나타낸다) 및 2가지의 상이한 VKs (VK03 및 VK05, 여기서 VK03의 아미노산 서열은 서열번호 29로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 30로 나타내고; 또한 VK05의 아미노산 서열은 서열번호 31로 나타내며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 32로 나타낸다) (표 1).
ELISA를 이용한, TNF-α에 대한 인간화 Fab의 결합력 시험 결과는 도 1에 도시하였다. 이 결과에서, 상기와 같이 수득한 3가지 인간화 Fab는 인간-뮤린 키메라 항체인 레미케이드의 Fab 단편과 유사한 항원 친화도를 갖는 것으로 확인되었으며, TNF-α에 대한 KS-7A 및 KS-7F 결합용 EC50은 인간-뮤린 키메라 항체 레미케이드의 Fab 단편보다 우수하다 (표 2).
| Fab 단편 | VH | VK |
| KS-2E | VH01 | VK03 |
| N/A | VH02 | VK03 |
| KS-7F | VH02 | VK05 |
| KS-7A | VH01 | VK05 |
참고: N/A는 활성도가 매우 낮아 Fab 단편을 규정할 수 없음을 나타낸다.
| 시료 | EC50 (nM) |
| 레미케이드 Fab | 3.324 |
| KS-2E | 6.659 |
| KS-7A | 3.027 |
| KS-7F | 2.740 |
참고: 표 2의 데이터는 3회 중복 실험의 평균값이다.
2. L929 세포독성 실험에 따른 TNF -α의 억제에 있어서의 인간화 Fab의 생체활성의 검출
또한, TNF-α의 중화에 있어서 상기 3가지 인간화 Fab (KS-2E, KS-7F 및 KS-7A)의 생체활성을 세포 생물학 실험인 L929 세포독성 분석으로 확인하였다. 이 실험에서, 대수증식기에서 1×104 L929 세포를 96-웰 플레이트에 담긴 DMEM (10% FBS, Gibco) 배지에 시드했다. 24시간 후, 인간 기원의 0.5 ng/ml TNF-α(R & D사, 카탈로그 번호 : 210-TA-050) 및 0.5 μg/ml 악티노마이신 D (Fluka)을 첨가했다. 세포를 4개의 그룹으로 나누고, 상술한 3가지 인간화 Fab 및 대조군 항체의 Fab 단편을 각각의 그룹에 개별적으로 첨가했다. 세포를 추가 24시간 동안 배양했다. 마지막으로, CCK8 키트(Dojindo Laboratories)를 이용하여 세포의 생존력을 분석했다. 이 결과를 도 2에 나타내며, 이는 상술한 3가지 인간화 Fab가 TNF-α를 효능적으로 중화하는 생체활성을 제공할 수 있음을 보여주는 것으로서, TNF-α의 중화에 있어서 KS-7A의 생체활성은 인간-뮤린 키메라 항체 레미케이드의 Fab 단편보다 더욱 우수하다. 도 2의 데이터는 3회 중복 시행된 실험으로부터 얻은 평균값 ± 표준편차이다.
실시예 2: 인간화 항- TNF -α 항체의 Fab의 CDR3에 대한 친화도 증진 라이브러리의 구성
상술한 인간화 항-TNF-α 항체의 Fab 단편의 항원 친화도를 더욱 증대하기 위하여, 인간화 항-TNF-α 항체 Fab의 발현 벡터의 중사슬 VH02 CDR3 및 경사슬 VK05 CDR3에 대하여 친화도 증진 라이브러리를 각각 구성했다. 중사슬 및 경사슬의 CDR3 영역은 항체를 항원에 결합하는데 있어서 가장 중요한 영역이므로, CDR3 영역에 대한 위치-포화 돌연변이를 수행하고, 다시 스크리닝하여 고친화도 항체의 생성을 유도할 수 있다. 중사슬 및 경사슬 CDR3s을 위한 위치-포화 돌연변이 라이브러리의 구성에서, 위치-지향 돌연변이를 위한 프라이머 군을 설계하였고 이를 PCR 반응에 이용하였다. 상기 PCR 반응에서 증폭된 결과 산물을 프라이머 군과, 동일한 퇴화 비율로, 함께 혼합하여 인간화 항-TNF-α 항체의 Fab를 위한 발현 벡터에 클론화 하였다. 경사슬 CDR3을 위한 위치-지향 돌연변이 라이브러리의 구성은 다음과 같이 수행했다: 프라이머 5 시리즈와 경사슬 하행류 프라이머 6 (5'-CGGAATTCCGTACGTTTCACTTCCAGATTGG-3'), 또한 관심대상의 DNA 산물을 생성하기 위한 주형인 경사슬 DNA를 이용하여 PCR을 수행한 다음에, DNA 산물을 Fab 발현 벡터에 클론화하고, 전기이동 및 도금을 실시하여 경사슬 CDR3을 위한 위치-지향 돌연변이 라이브러리를 형성하였다. 프라이머 5 시리즈는 CDR3에 돌연변이체 부위를 갖고 표 3에 열거된 총 19개의 프라이머를 포함한다. 중사슬 CDR3을 위한 위치-지향 돌연변이 라이브러리는 다음과 같이 구성하였다: 돌연변이체 프라이머 7 시리즈와 중사슬 하행류 프라이머 8 (5'-CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3')에 의해 PCR을 수행하고, 주형으로서 중사슬 DNA을 이용하여 관심대상인 DNA 산물을 생성하였다. 이어서, DNA 산물을 Fab 발현 플라스미드에 클론화하고, 전기이동 및 도금을 실시하여 중사슬 CDR3을 위한 위치-지향 돌연변이 라이브러리를 형성하였다. 프라이머 7 시리즈는 CDR3에 돌연변이체 부위를 갖고, 표 4에 열거된 총 22개의 프라이머를 포함한다. 최종 형성된 경사슬 및 중사슬을 위한 돌연변이 라이브러리로부터, 항원 TNF-α에 대한 고 결합력을 갖는 항 TNF-α 항체 Fab (R & D사)를 ELISA 결과에 근거하여 선택했다. 중사슬 돌연변이체를 스크리닝하여 2개의 고활성도 중사슬 가변영역, 즉, SH01 및 SH02를 수득하였고, 또한 경사슬 돌연변이체를 스크리닝하여 6개의 고활성도 경사슬 가변영역, 즉, SH03, SH04, SH05, SH06, SH07 및 SH08을 수득하였다.
| 명명 | 서열 |
| 프라이머 5-1Q1 | GCAACCTACTACTGCNBKCAGAGCCATAGCTGG |
| 프라이머 5-1Q2 | GCAACCTACTACTGCDAKCAGAGCCATAGCTGG |
| 프라이머 5-1Q3 | GCAACCTACTACTGCCATCAGAGCCATAGCTGG |
| 프라이머 5-2Q1 | GCAACCTACTACTGCCAGNBKAGCCATAGCTGGCCG |
| 프라이머 5-2Q2 | GCAACCTACTACTGCCAGDAKAGCCATAGCTGGCCG |
| 프라이머 5-2Q3 | GCAACCTACTACTGCCAGCATAGCCATAGCTGGCCG |
| 프라이머 5-3S1 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGBDKCATAGCTGGCCGTTC |
| 프라이머 5-3S2 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGVCTCATAGCTGGCCGTTC |
| 프라이머 5-3S3 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAWKCATAGCTGGCCGTTC |
| 프라이머 5-4H1 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCNBKAGCTGGCCGTTCACC |
| 프라이머 5-4H2 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCDAKAGCTGGCCGTTCACC |
| 프라이머 5-4H3 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCAGAGCTGGCCGTTCACC |
| 프라이머 5-5S1 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATBDKTGGCCGTTCACCTTC |
| 프라이머 5-5S2 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATVCTTGGCCGTTCACCTTC |
| 프라이머 5-5S3 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAWKTGGCCGTTCACCTTC |
| 프라이머 5-6W1 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCHNKCCGTTCACCTTCGGC |
| 프라이머 5-6W2 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCNGTCCGTTCACCTTCGGC |
| 프라이머 5-6P1 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGNDKTTCACCTTCGGCAGC |
| 프라이머 5-6P2 | GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGDCTTTCACCTTCGGCAGC |
| 명명 | 서열 |
| 프라이머 7-1N1 | GTATTACTGCAGCCGTNBKTACTACGGCAGCACC |
| 프라이머 7-1N2 | GTATTACTGCAGCCGTBAKTACTACGGCAGCACC |
| 프라이머 7-1N3 | GTATTACTGCAGCCGTAAATACTACGGCAGCACC |
| 프라이머 7-2Y1 | GTATTACTGCAGCCGTAATNBKTACGGCAGCACCTACG |
| 프라이머 7-2Y2 | GTATTACTGCAGCCGTAATVAKTACGGCAGCACCTACG |
| 프라이머 7-3Y1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACNBKGGCAGCACCTACGATTAC |
| 프라이머 7-3Y2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACVAKGGCAGCACCTACGATTAC |
| 프라이머 7-4G1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACNHKAGCACCTACGATTACTG |
| 프라이머 7-4G2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACHGKAGCACCTACGATTACTG |
| 프라이머 7-5S1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCBDKACCTACGATTACTGGGC |
| 프라이머 7-5S2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCVCTACCTACGATTACTGGGC |
| 프라이머 7-5S3 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAWKACCTACGATTACTGGGC |
| 프라이머 7-6T1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCNDKTACGATTACTGGGCCC |
| 프라이머 7-6T2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCBCTTACGATTACTGGGCCC |
| 프라이머 7-7Y1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCNBKGATTACTGGGGCCAGG |
| 프라이머 7-7Y2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCVAKGATTACTGGGGCCAGG |
| 프라이머 7-8D1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACNBKTACTGGGGCCAGGGC |
| 프라이머 7-8D2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACHAKTACTGGGGCCAGGGC |
| 프라이머 7-8D3 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGAATACTGGGGCCAGGGC |
| 프라이머 7-9Y1 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATNBKTGGGGCCAGGGCACC |
| 프라이머 7-9Y2 | GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATVAKTGGGGCCAGGGCACC |
실시예 3: 인간화 항-TNF-α 항체의 고친화도 Fab의 발현 및 활성도 분석
이 실시예는 각각 FA01 및 FA02로 명명된 2개의 인간화 항-TNF-α 항체 Fab에 관한 것이다. FA01의 경사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 15로 나타내며 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 16으로 나타낸다), 동일 항체의 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타내고 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타낸다), 또한 동일 항체의 중사슬 Fd 단편의 중사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1로 나타내며 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 2로 나타낸다) 동일 항체의 중사슬 불변영역 CH1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 33으로 나타낸다 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 34로 나타낸다). FA02의 경사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 9로 나타내며 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 10으로 나타낸다), 동일 항체의 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타내고 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타낸다), 또한 동일 항체의 중사슬 Fd 단편의 중사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1로 나타내며 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 2로 나타낸다), 동일 항체의 중사슬 불변영역 CH1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 33으로 나타낸다 (그의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 34로 나타낸다).
1. 인간화 항-TNF-α 항체의 고친화도 Fab의 구성 및 발현
인간화 항-TNF-α 항체의 2개 Fab를 구성하는 과정은 실시예 1과 같았다. 상술한 인간화 항-TNF-α 항체의 두 Fab의 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 DNAs는 pTLR 벡터내의 각각 상응하는 부위에 개별 삽입하여 FA01의 발현 벡터 pFA01Fab 및 FA02의 발현 벡터 pFA02Fab를 각각 형성했다. 실시예 1에서 설명한 프로토콜에 따라 고순도의 FA01 및 FA02 단백질을 수득했다.
2. 인간화 항-TNF-α 항체의 고친화도 Fab의 생체활성도의 검출
*L929 세포독성 실험을 이용하여, 상술한 인간화 항-TNF-α 항체 Fabs (FA01 및 FA02)의 생체활성도를 분석했다. 세부 절차는 실시예 1과 같다. 결과로 나온 OD450 값을 소프트웨어 GraphPad Prism 5에 입력하여 EC50를 산출했다. 그 결과를 표 5에 나타내며, 이는 FA01 및 FA02의 활성도가 레미케이드 항체의 Fab 단편보다 더욱 강력함을 보여준다.
| 실험군 | EC50 (nM) |
| 레미케이드 Fab | 3.184 |
| FA01 | 2.582 |
| FA02 | 2.870 |
참고: 표 5의 데이터는 3회 중복 실험의 평균치이다.
실시예 4: 인간화 항-TNF-α 항체 IgG의 발현 및 그의 활성도의 검출
1. 인간화 항-TNF-α 항체 IgG를 위한 재조합 발현 벡터의 구성
실시예 1 및 2에서 수득한 2개의 중사슬 Fd 단편 (각각 SHO1 및 SH02를 포함함) 및 6개의 경사슬 (각각 SH03, SH05, SH04, SH06, SH07 및 SH08을 포함함)을 암호화하는 DNA 단편을 표 6에 나타낸 방식에 따라 서로 조합하였고, 오버랩 연장 PCR에 의해 IgGI Fc 불변영역을 위한 DNA 단편과 결합한 후, 재조합에 의해 발현 플라스미드 pcDNA3.1(+)에 삽입하였다. CHO 세포는 상기 구성된 재조합 발현 플라스미드와 트랜스펙트했고, 완전 길이(full length) 인간화 항체가 발현되었다.
세부 프로토콜은 다음과 같다: (1) 경사슬을 위한 DNA 단편은 재조합에 의해 진핵세포 발현 벡터 pcDNA3.1(+)에 직접 삽입하였다. 다음과 같은 프라이머를 설계하고: 5'-TGAAAGCTTATGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTC-3' (제한 엔도뉴클레아제 부위 HindIII를 밑줄 표시함); 5'-AATCTCGAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3' (제한 엔도뉴클레아제 부위 XhoI를 밑줄 표시함), 또한 이를 PCR 증폭반응에 이용했다. 증폭된 산물은 제한 엔도뉴클레아제 HindIII (R0104L, NEB사 제품) 및 XhoI (R0146L, NEB사 제품)에 의해 2중 소화되고 또한, 동일한 효소에 의해 2중 소화된, pcDNA3.1(+)의 큰 단편과 T4 DNA 리가제에 의해 결합하였다. (2) 중사슬을 위한 DNA 단편은 필요에 따라 오버랩 연장 PCR에 의해 IgG1 Fc 불변영역을 위한 DNA 단편과 함께 조립하였고, 재조합에 의해 pcDNA3.1 (+)에 삽입하였다. 5'-ACTGGTACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3'(제한 엔도뉴클레아제 부위 KpnI는 밑줄 표시함); 5'-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3'; 5'-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3'; 5'-AATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3' (제한 엔도뉴클레아제 부위 XhoI는 밑줄 표시함). 조립된 PCR 산물은 제한 엔도뉴클레아제 KpnI (R0142L, NEB사 제품) 및 XhoI (R0146L, NEB사 제품)로 이중 소화시키고, 재조합에 따라, 동일 효소에 의해 이중 소화된 발현 플라스미드 pcDNA3.1 (+)에 삽입하고, 제한 분석법으로 동정 및 서열화하여 적절한 재조합체를 수득하였다.
표 7에 나타낸 18개의 항체를 위한 발현 벡터를 상술한 절차에 따라 조제했다. KS01(Glu), KS03(Glu), KS05(Glu), KS06(Glu), KS09(Glu) 및 KS10(Glu)의 중사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 2로 나타내며 (위치 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열은 GAG임), 이들은 서열번호 1 (첫번째 아미노산은 Glu)로 나타내는 중사슬 가변영역을 암호화한다; KS01(Gln), KS03(Gln), KS05(Gln), KS06(Gln), KS09(Gln) 및 KS10(Gln)의 중사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 2로 나타내며, 이때 위치 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열은 CAG로 치환되었고, 또한 이들은 서열번호 1 (첫번째 아미노산은 Gln임)로 나타내는 중사슬 가변영역을 암호화한다; KS02, KS04, KS07, KS08, KS11 및 KS12의 중사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 4로 나타내며 이들은 서열번호 3으로 나타내는 중사슬 가변영역을 암호화한다; KS01(Glu), KS01 (Gln) 및 KS02의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 6으로 나타내며 이들은 서열번호 5로 나타내는 경사슬 가변영역을 암호화한다; KS03(Glu), KS03(Gln) 및 KS04의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 10으로 나타내며 이들은 서열번호 9로 나타낸 경사슬 가변영역을 암호화한다; KS05(Glu), KS05(Gln) 및 KS08의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 8로 나타내며 이들은 서열번호 7로 나타내는 경사슬 가변영역을 암호화한다.; KS06(Glu), KS06(Gln) 및 KS07의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 12로 나타내며 이들은 서열번호 11로 나타내는 경사슬 가변영역을 암호화한다; KS09(Glu), KS09(Gln) 및 KS11의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 14로 나타내며 이들은 서열번호 13으로 나타내는 경사슬 가변영역을 암호화한다; KS10(Glu), KS10(Gln) 및 KS12의 경사슬 가변영역을 암호화하는 모든 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 16으로 나타내며 이들은 서열번호 15로 나타내는 경사슬 가변영역을 암호화한다. 한편, 18개의 항체의 중사슬 불변영역을 암호화하는 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 18로 나타내며 이들은 서열번호 17로 나타내는 중사슬 불변영역을 암호화하고; 18개의 항체의 경사슬 불변영역을 암호화하는 DNA 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타내며 이들은 서열번호 19로 나타내는 경사슬 불변영역을 암호화한다.
2. 완전 길이 인간화 항-TNF-αIgG 항체의 발현 및 정제
단계 1에서 얻은 경사슬 재조합 플라스미드와 중사슬 재조합 플라스미드를 CHO 세포에 공동 트랜스펙트하여 완전 길이 인간화 항체를 발현하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이 조합시 상응하는 플라스미드를 종래의 방법에 따라 CHO 세포에 안정적으로 공동 트랜스펙트한 후, 12개의 상응한 재조합 완전 길이 항체가 세포 배양 상청액 속으로 분비되었다. 상청액을 정제하여, 상응하는 완전 길이 IgG 항체를 수득했다. 정제의 세부 단계는 다음과 같다:
(1) 크로마토그래피 충전재
맵셀렉트 슈어(Mabselect Sure) (GE사 제품), 수퍼덱스 200 (GE사 제품)
(2) 완충액
친화성 평형 완충액(PBS): 0.2 M 인산수소나트륨: 82.5 mL/L; 0.2 M 인산중수소나트륨: 17.5 mL/L; 2M 염화나트륨: 75 mL/L. 초순수를 첨가하고 충분히 저어서 잘 섞는다. 1M 수산화나트륨 또는 1M 염화수소로 pH를 7.1 내지 7.3으로 한다.
친화성 용리 완충액: NaCl 2.922g/L, 무수 아세트산나트륨 0.49 g/L. 2.9 mL/L의 빙초산을 첨가하여 pH 3.4 내지 3.6으로 한다.
친화성 재생 완충액: 5.8 mL/L 빙초산, pH 3.0.
친화성 정치세정(CIP) 완충액: 1M 수산화나트륨 100mL/L.
겔 여과 크로마토그래피 용액(PBS): 0.2 M 인산수소나트륨: 82.5 mL/L; 0.2 M 인산중수소나트륨: 17.5 mL/L; 2M 염화나트륨: 75 mL/L. 초순수를 첨가하고 충분히 저어서 잘 섞는다. 1M 수산화나트륨 또는 1M 염화수소로 pH를 6.8로 조정한다.
(3) 시료 조제 (정제여과)
원심분리: 5000 내지 6000 rpm으로 10분 내지 15분간 시료를 원심분리했다.
여과: 원심분리후, 시료의 상청액을 H7 (0.45 + 0.2㎛) 필터로 여과했다.
(4) 친화성 크로마토그래피
AKTA 정제장치 및 친화성 크로마토그래피 칼럼 (맵셀렉트나 맵셀레트 슈어)을 설치한다. 2배 칼럼 부피의 초순수로 세척한다. 5배 칼럼 부피의 친화성 평형 완충액으로 기준선이 안정화할 때까지 세척한 뒤 시료를 주입한다. 시료 주입후, 5 내지 10배 칼럼 부피의 친화성 평형 완충액으로 세척한다. 다음에, 칼럼을 친화성 용리 완충액으로 용출 처리하고 280 nm에서의 주 흡수 피크에 해당하는 분획물을 수거하여 1배 칼럼 부피의 완충액으로 연속 용출 처리했다. 다음에, 3배 칼럼 부피의 친화성 재생 완충액으로 칼럼을 용출 처리했다. 친화성 평형 완충액으로 중성 pH가 되도록 세척했다. 5배 칼럼 부피의 맵셀렉트 CIP 완충액 또는 맵셀렉트 슈어 CIP 완충액으로 정치 세정한다. 다시, 3배 칼럼 부피의 친화성 평형 완충액으로 기준선이 안정화할 때까지 세척한다. 3배 칼럼 부피의 초순수로 기준선이 안정화할 때까지 세척한다. 또한, 3배 칼럼 부피의 20% 에탄올로 세척한 뒤, 친화성 크로마토그래피 칼럼을 보관한다.
(5) 겔 여과 크로마토그래피
AKTA 소식자 정제장치 및 수퍼덱스 200 겔 여과 크로마토그래피 칼럼을 설치한다. 유속을 5 ml/분으로 조정하고, 1배 칼럼 부피의 초순수로 세척한 다음, 다시 2배 칼럼 부피의 수퍼덱스 200 칼럼 크로마토그래피 평형액으로 세척한다. 유속을 2.5 ml/분으로 조정하고, 친화성 크로마토그래피 정점에 상응하는 수거된 분획물에 대해 pH 값 조정을 실시한 후, 이를 직접 칼럼에 주입했다. 시료 주입후, 수퍼덱스 200 칼럼 크로마토그래피 평형액으로 용출 처리하고, 280 nm에서 원하는 정점을 얻는다. 1배 칼럼 부피의 액으로 세척하고, 이 크로마토그래피 칼럼을 0.01M NaOH에 보관했다.
3. 인간화 항-TNF-α 항체 IgG의 활성도 검출
단계 2에서 얻은 12개의 인간화 항-TNF-α항체 IgG에 대하여, L929 세포독성 실험에 의해 TNF-α의 중화에 대한 이들의 생체활성도를 시험했으며 (세부적인 조치는 실시예 1에 기술되었다), 결과로 나온 OD450 값을 소프트웨어 GraphPad Prism 5에 입력하여 EC50를 산출하였다. TNF-α의 생체활성을 억제하는 12개의 인간화 항-TNF-α 항체 IgG의 EC50값을 표 7에 나타냈다. 그 결과로부터, 인간화 항-TNF-α 항체의 생체활성도가 대폭 증가하고 KS10이 가장 높은 생체활성도를 갖는 사실을 확인하였다. 따라서, 항체 활성에 대한 후속 연구는 KS10에 대해 집중적으로 이루어졌다.
| IgG 항체 | VH | VK |
| KS01 | SH01 | SH03 |
| KS02 | SH02 | SH03 |
| KS03 | SH01 | SH05 |
| KS04 | SH02 | SH05 |
| KS05 | SH01 | SH04 |
| KS06 | SH01 | SH06 |
| KS07 | SH02 | SH06 |
| KS08 | SH02 | SH04 |
| KS09 | SH01 | SH07 |
| KS10 | SH01 | SH08 |
| KS11 | SH02 | SH07 |
| KS12 | SH02 | SH08 |
| 그룹 | EC50 (nM) |
| KS01 (Glu) | 0.081 |
| KS01 (Gln) | 0.087 |
| KS02 | 0.109 |
| KS03 (Glu) | 0.087 |
| KS03 (Gln) | 0.093 |
| KS04 | 0.126 |
| KS05 (Glu) | 0.051 |
| KS05 (Gln) | 0.064 |
| KS06 (Glu) | 0.059 |
| KS06 (Gln) | 0.068 |
| KS07 | 0.100 |
| KS08 | 0.113 |
| KS09 (Glu) | 0.036 |
| KS09 (Gln) | 0.032 |
| KS10 (Glu) | 0.028 |
| KS10 (Gln) | 0.025 |
| KS11 | 0.059 |
| KS12 | 0.136 |
| 레미케이드 | 0.174 |
실시예 5: hTNF-α에 대한 KS10(Glu) 결합의 반응속도 분석(kinetic assay)
hTNF-α(R & D사, 210-TA-050) 및 NHS-LCLC-비오틴 (카탈로그 번호: 21338, Thermo-fisher사에서 구입)을 1:3의 몰비로 균일하게 혼합하고 실온에서 1시간 동안 그대로 두었다. 다음에, 잔류 NHS-LCLC-비오틴을 PD-10 탈염 칼럼 (카탈로그 번호: 17-0851-01, GE사에서 구입)으로 제거했다. 수득된 최종 결합 산물은 50 μg/ml의 비오틴-hTNF-α 이었다.
hTNF-α에 대한 KS10 결합의 반응속도 파라미터는 옥텟(Octet) 테크놀러지 플랫폼에서 옥텟 RED 96 시스템 (ForteBio사)으로 측정했고, 그 실험 절차는 기기 사용 설명서에 따라 구성했다. 50 μg/ml 비오틴-hTNF-α는 로딩을 통해 스트렙타비딘 바이오센서(SA)에 연결되어 있고; 항체 농도의 적절한 범위는 파일럿 실험에 의해 다음과 같이 결정되었다: 6000 nM, 2000 nM, 666.7 nM, 222.2 nM, 74.1 nM 및 24.7 nM. 레미케이드는 양성 대조군으로 이용되었으며, PBS (pH 7.4)는 블랭크(blank) 대조군으로 이용되었다. 결과에 따르면(표 8), KS10의 KD값이 레미케이드보다 낮은 것으로 나타났으며 이는 hTNF-α에 대한 KS10의 친화도가 인간-뮤린 키메라 항체 레미케이드보다 우수한 것을 시사한다.
또한, 침팬지 TNF-α(서열번호 36으로 나타내는 아미노산 서열 및 서열번호 37로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 가짐), 레수스 TNF-α(서열번호 38로 나타내는 아미노산 서열 및 서열번호 39로 나타내는 뉴클레오티드 서열을 가짐), 마우스 TNF-α(mTNF-α)(카탈로그 번호: CYT-252, PROSPEC에서 구입) 및 인간 TNF β(카탈로그 번호: CYT-224, PROSPEC에서 구입)에 대한 KS10의 결합 친화도를 측정하였다. 옥텟 RED 96 시스템의 친화도 평가 기준에 따라, 항체에 대한 항원 결합으로 인한 광파(lightwave)의 변위거리는 두 물질 간의 친화도를 간접적으로 반영하며, 이러한 광파의 변위거리가 길수록 친화도는 높다. 결과 (도 3)를 보면, KS10이 인간 TNF-α에 매우 강하게, 침팬지 TNF-α에도 상당히 강하게, 레수스 TNF-α에는 약하게 결합되며, 또한 마우스 TNF-α 및 인간 TNF β에는 거의 결합되지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에서 제공한 항체는 인간화 후에 특이적인 결합력을 갖는 것으로 확인된다.
| 항체 종류 | KD (M) | kon (l/Ms) | kdis (l/s) |
| 레미케이드 | 8.12E-12 | 1.95E+04 | 1.58E-07 |
| KS10 | 2.18E-12 | 4.69E+04 | 1.02E-07 |
참고: KD는 친화도 상수; kon은 결합상수; 및 kdis는 분해상수이다.
실시예 6: 인간 TNF -α 유발 류머티스 관절염 래트 모델에 대한 KS10( Glu )의 영향
4 내지 6주령, SPF 등급, 수컷 및 암컷 각각 절반씩 및 체중이 140 내지 180 g인 72마리의 스프래그 다우리 래트(실험 동물 라이센스: SCXK (시츄안) 2008-24)를 사용했다. 래트를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 무작위로 그룹당 12마리씩 총 6개 그룹으로 나누었다. 즉, 정상군, 음성 대조군, 모델 대조군, 5 mg/kg의 KS10 투약군, 10 mg/kg의 KS10 투약군, 및 20 mg/kg의 KS10 투약군으로 구분했다. 실험 시작시에, 정상군을 제외하고, 각 그룹의 래트를 10% 클로랄 히드레이트(350 mg/kg)로 마취시켰다. 모델링에 앞서서, 투약군의 래트의 경우 KS10을 3가지 상이한 약량(5 mg/kg, 10 mg/kg 및 20 mg/kg)으로 꼬리 정맥 주사를 통해 투여했고, 음성 대조군 및 모델 대조군의 래트에 대해서는 등량의 생리 식염수를 꼬리 정맥 주사했다. 15분 후, 0.5 mg/ml의 hTNF-α(R & D사, 카탈로그 번호: 210-TA-050) (1% BSA에 용해된 상태 및 주입량: 60 μl/래트)를 1 ml 주사기를 이용하여 3가지 KS10 투약군 및 모델 대조군에 속하는 각 래트의 왼쪽 발목의 관절강에 주사함으로써 급성 관절염을 유발했고 (한쪽 다리의 모델링), 또한 등량의 1% BSA를 음성 대조군에 속한 각 래트의 왼쪽 발목의 관절강에 주사했다. 관절강의 좌우 홈이 점차 부풀어 오르면서 주사 투여가 성공한 것으로 드러났다. 정상군의 래트는 이러한 주사 투여를 실시하지 않았다.
모델을 설정한지 18시간 후, 각 그룹의 래트의 왼쪽 발목 관절의 팽창 정도를 다음과 같이 0 내지 4의 수정된 등급 기준에 따라 개별적으로 채점했다: 0: 발적 및 팽창 없음; 1: 발목 관절에만 발적이나 팽창 있음; 2: 발목 관절에 발적 및 팽창과, 발바닥에 팽창 있음; 3: 발목 관절과 발바닥에 발적 및 팽창 있음; 4: 발목 관절, 발바닥 및 발등에 발적 및 팽창 있음 [참고자료: R O Williams, M Feldmann, and R N Maini. Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 October 15; 89 (20): 9784-9788]. 모델 설정 20시간 후, 관절 활막액을 뽑았다. 관절 주변의 연조직을 분리하여 균질화하고, 원심분리 및 -70℃로 냉동했다. IL-lβ 및 IL-6의 레벨은 래트 ELISA 키트(IL-lβ는 R & D사에서 구입, 카탈로그 번호: RLB00; IL-6은 R & D사에서 구입, 카탈로그 번호: R6000B)로 측정했다.
점수에 따르면 (도 4), 3가지 약량의 KS10으로 래트의 관절에 생긴 hTNF-α 유발의 발적 및 팽창을 크게 완화시킬 수 있고, hTNF-α 유발 류머티스 관절염의 발병을 크게 방지할 수 있는 것으로 드러났다. 또한 사이토킨 분석에 따르면, 3가지 약량의 KS10이 활막액 및 관절 주변 연조직 내의 IL-lβ(도 5) 및 IL-6(도 6)의 레벨을 크게 낮출 수 있는 것을 보였고, 이는 KS10이 TNF-α에 의해 유발된 IL-lβ 및 IL-6의 레벨 증가를 완전히 저지할 수 있는 것을 나타내며, 또한 KS10의 항-인간 TNF-α 작용에 대한 직접적인 증거를 제공한다.
실시예 7: 인간 TNF -α 유발 포도막염 래트 모델에 대한 KS10( Glu )의 치료 효과
40마리의 건강한 루이스 래트를 무작위로 정상군, 모델군, 음성 대조군, 및 KS10 투약군으로 나누었다. 래트에게 10% 클로랄 히드레이트 (0.35 ml/kg의 투약량)를 복강내 주사했다. 래트를 마취시킨 후, 10 μl의 생리 식염수를 모델군 및 음성 대조군에 속한 각 래트의 섬모 근육의 편평부를 통해 유리체 속으로 주입했다 (30 G1/2 바늘 사용). 또한, 4 mg/ml의 농도를 갖는 10 μl의 KS10 용액 (PBS를 이용하여 제형화함)을 동일한 방식으로 KS10 투약군의 각 래트에게 주입했다. 30분 후, 10 μl의 hTNF-α (약 0.5 mg/ml)를 모델군 및 KS10 투약군의 각 래트에게 유리체 속으로 주입하고, 또한 10 μl의 1% BSA를 음성 대조군의 각 래트에게 유리체 속으로 주입했다. 1차 투여로 모델을 설정한지 24시간 및 48시간 후, 래트를 마취시키고 세극등(slit lamp) 아래서 관찰하여 각각 채점했다. 채점 기준은 문헌을 참조하였으나 [Fleisher LN, Ferrell JB, Smith MG, McGahan MC. Lipid mediators of tumor necrosis factor-α induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991 Jul; 32 (8): 2393-9.], 이를 약간 수정했다: 0-2: 홍채 충혈 0-2 (0: 충혈 없음, 1: 약간 충혈됨; 2: 충혈 심함); 동공 수축 0-1 (0: 정상 동공; 1: 동공 수축됨); 전방 삼출 0-2 (0: 전방 삼출 없음; 1: 전방 삼출 약간 있음; 2: 전방 삼출 심함), 동공 침침함(caligo pupillae) 또는 홍채 후방유착(posterior synechia) 0-2 (0: 유착 없음; 1: 어느 한쪽이 유착됨; 2: 양쪽이 유착됨).
채점 결과는 표 9에 도시되어 있으며, 이는 KS10이 포도막염 평가 기준의 점수를 크게 낮출 수 있음을 나타낸다. 즉, 홍채 충혈, 피브린 삼출 및 동공 침침함 또는 홍채 후방유착 등을 억제함으로써, 안구내 투명성을 증대시키는 것을 나타낸다. 따라서, KS10이 hTNF-α 유발 포도막염에 대해 큰 길항 효과를 발휘하는 것으로 드러났다.
| 그룹 | 1차 투여로 모델을 설정한 후의 시간 | |
| 24 h | 48 h | |
| 정상군 | 0.88±0.834 | 0.38±0.518 |
| 음성 대조군 | 0.90±0.737 | 0.38±0.744 |
| 모델군 | 3.5±0.971 | 3.78±1.202 |
| KS10 | 2.5±0.971* | 1.55±2.422* |
| 참고: *는 모델군과 대비하여 *P<0.05를 나타냄(X±SD, n=10) | ||
CDR-이식 항체의 돌연변이에 의해서, 본 발명은 항체의 친화도가 (뮤린 유래 항체 가변영역(VH, VK)의 상보성 결정영역 (CDR)이 인간 항체의 골격영역에 직접적으로 이식되는) 종래의 항체 인간화 방법에 의해 저하되는 문제점을 효과적으로 극복하고, 궁극적으로는 초기 항체와 유사한 인간화 항체를 수득한다. 본 발명에서 제공한 Fabs 및 IgG 항체는, 대폭 증가한 인간화도 (95% 이상까지)를 가지며, 인간-뮤린 키메라 항체 레미케이드와 유사하거나 그보다 우수한 친화도와 생체활성도 및 인간 TNF-α에 대한 중화 효과를 가지며, 또한 TNF-α와 관련된 질환, 바람직하게는, 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 치료시 더욱 효과적이라는 것이 실험적으로 확인되고 있다.
Sequence Listing
<110> Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
<120> HUMANIZED ANTI-TNF-┒ ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT (Fab) THEREOF AND USE OF THE SAME
<130> PCGNARI11034
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
65 70 75 80
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
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<220>
<223>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Phe Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
100 105
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<223>
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
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<211> 990
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 18
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
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ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
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<223>
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Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
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Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35 40 45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50 55 60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65 70 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85 90 95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 20
<211> 315
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 20
gtcgctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 60
gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 120
gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 180
gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 240
aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagtt caccggtgac aaagagcttc 300
aacaggggag agtgt 315
<210> 21
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Glu or Gln
<400> 21
Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 22
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 22
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta cgattactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Trp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 24
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgtcagcag agccattggt ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 25
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 26
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 26
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaaaacg 240
ttgtatctgg aaatgaacag cctgagagtt gaggacacag ctgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
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<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 28
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 28
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 30
gaaattgtgc tgactcagtc tccagatttt cagtctgtgt ctccaaagga gacagtcacc 60
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ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 32
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgccagcag agccataaat ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
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ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
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<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtt 294
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 35
gtcgactaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa 60
taattttgtt taactttaag aaggaggcgg ccgc 94
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 36
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Gly Ser Ser Ser
65 70 75 80
Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
85 90 95
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys
130 135 140
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val
145 150 155 160
Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
165 170 175
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro
180 185 190
Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
195 200 205
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln
210 215 220
Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 37
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 37
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagg atcatcttct 240
cgaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag 300
ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat 360
aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag 420
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc 480
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 540
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag 600
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Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
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Leu Pro Arg Lys Thr Ala Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Trp Phe
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Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
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Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
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Lys Asp Pro Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
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Cys Pro Ser Asn His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
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Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
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Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
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<110> Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 22
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 22
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta cgattactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Trp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 24
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgtcagcag agccattggt ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 25
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 26
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 26
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaaaacg 240
ttgtatctgg aaatgaacag cctgagagtt gaggacacag ctgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
<210> 27
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 28
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 28
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
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<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 30
gaaattgtgc tgactcagtc tccagatttt cagtctgtgt ctccaaagga gacagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gaccgttcat atgagtttac actggtacca gcagaaacca 120
aatcagtctc caaggctcct catcaagtat ggttcccagt ccttctcggg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaacct 240
gaagatgctg caacatacta ctgccagcag agccataaat ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 32
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgccagcag agccataaat ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
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ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 33
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 34
<211> 294
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 34
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ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtt 294
<210> 35
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 35
gtcgactaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa 60
taattttgtt taactttaag aaggaggcgg ccgc 94
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<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 36
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Gly Ser Ser Ser
65 70 75 80
Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
85 90 95
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys
130 135 140
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val
145 150 155 160
Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
165 170 175
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro
180 185 190
Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
195 200 205
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln
210 215 220
Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 37
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 37
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagg atcatcttct 240
cgaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag 300
ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat 360
aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag 420
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc 480
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 540
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag 600
ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc 660
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<210> 38
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 38
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Thr Ala Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Trp Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Lys Asp Pro Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Asn His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 39
<211> 699
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 39
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct cccaaggaag 60
acagcggggc cccagggctc caggcggtgc tggttcctca gcctcttctc cttcctgctc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgtctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccaaggaccc ctctctaatc agccctctgg ctcaggcagt cagatcatct 240
tctcgaaccc caagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaca 360
gataaccagc tggtggtgcc atcagaaggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420
aagggccaag gctgcccctc caaccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
actccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctacctagg aggggtcttt 600
cagctggaga agggtgatcg actcagcgct gagatcaatc tgcccgacta tctcgacttt 660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699
<110> Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
<120> HUMANIZED ANTI-TNF-┒ ANTIBODY AND ANTIGEN-BINDING FRAGMENT (Fab) THEREOF AND USE OF THE SAME
<130> PCGNARI11034
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is Glu or Gln
<400> 1
Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223>
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gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta cgattactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
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cattatgccg aaagcgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaaaacg 240
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aattactacg gcagcaccta cgattactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
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<213> Artificial sequence
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<223>
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
100 105
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<223>
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
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Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
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<212> DNA
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr
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<213> Artificial sequence
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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<213> Artificial sequence
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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165 170 175
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<213> Artificial sequence
<220>
<223>
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ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
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ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
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<223>
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aacaggggag agtgt 315
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
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Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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450
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<213> Artificial sequence
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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
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aattactacg gcagcaccta cgattactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<223>
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Trp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 24
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgtcagcag agccattggt ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 25
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 26
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 26
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaaaacg 240
ttgtatctgg aaatgaacag cctgagagtt gaggacacag ctgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
<210> 27
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Gln Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 28
<211> 669
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 28
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60
tcctgtgcag cctctggttt cactttcagt aacgcctgga tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gactggagtg ggtagccgaa attcgttcta aaagcattaa tagcgccacc 180
cattatgccg aaagcgtgaa aggccggttc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240
gtgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ctgcagccgt 300
aattactacg gcagcaccta ccagtactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgt 669
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Ser Pro Lys
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val His Met Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Gly Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 30
gaaattgtgc tgactcagtc tccagatttt cagtctgtgt ctccaaagga gacagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gaccgttcat atgagtttac actggtacca gcagaaacca 120
aatcagtctc caaggctcct catcaagtat ggttcccagt ccttctcggg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaacct 240
gaagatgctg caacatacta ctgccagcag agccataaat ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Phe Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Lys Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 32
gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60
atcacctgcc gggccagtca gagcatttat agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120
gatcagtctc caaagctcct catcaagttt gcttcccagt ccgtctcagg ggtcccctcg 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240
gaagatgctg caacgtacta ctgccagcag agccataaat ggccgttcac cttcggcagc 300
ggcaccaatg tggacatcaa acgtacggtc gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttcac cggtgacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 33
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val
<210> 34
<211> 294
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 34
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agtt 294
<210> 35
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 35
gtcgactaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc cctctagaaa 60
taattttgtt taactttaag aaggaggcgg ccgc 94
<210> 36
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 36
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Gly Ser Ser Ser
65 70 75 80
Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln
85 90 95
Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu
100 105 110
Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys
130 135 140
Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val
145 150 155 160
Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys
165 170 175
Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro
180 185 190
Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser
195 200 205
Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln
210 215 220
Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 37
<211> 696
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 37
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagg atcatcttct 240
cgaaccccga gtgacaagcc tgtagcccat gttgtagcaa accctcaagc tgaggggcag 300
ctccagtggc tgaaccgccg ggccaatgcc ctcctggcca atggcgtgga gctgagagat 360
aaccagctgg tggtgccatc agagggcctg tacctcatct actcccaggt cctcttcaag 420
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc 480
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 540
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag 600
ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc 660
gagtctggac aggtctactt tgggatcatt gccctg 696
<210> 38
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 38
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Thr Ala Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Trp Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Lys Asp Pro Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Thr Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Asn His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Leu Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 39
<211> 699
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223>
<400> 39
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct cccaaggaag 60
acagcggggc cccagggctc caggcggtgc tggttcctca gcctcttctc cttcctgctc 120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgtctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180
gaagagttcc ccaaggaccc ctctctaatc agccctctgg ctcaggcagt cagatcatct 240
tctcgaaccc caagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaca 360
gataaccagc tggtggtgcc atcagaaggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420
aagggccaag gctgcccctc caaccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540
actccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctacctagg aggggtcttt 600
cagctggaga agggtgatcg actcagcgct gagatcaatc tgcccgacta tctcgacttt 660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699
Claims (62)
- 중사슬 가변영역과 경사슬 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α 항체 또는 그의 항원 결합 단편(Fab)으로서,
상기 중사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1 또는 3으로 나타내고, 상기 경사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 15, 9, 11, 7, 13 및 5 중 어느 하나로 나타내며, 상기 서열번호 1의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln인 항체 또는 그의 항원 결합 단편(Fab). - 제1항에 있어서,
상기 항체는 다음의 (a) 내지 (l) 중 어느 하나이고,
(a) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 15로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH08)을 포함하는 KS10;
(b) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 9로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH05)을 포함하는 KS03;
(c) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 11로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH06)을 포함하는 KS06;
(d) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 15로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH08)을 포함하는 KS12;
(e) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 9로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH05)을 포함하는 KS04;
(f) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 11로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH06)을 포함하는 KS07;
(g) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH03)을 포함하는 KS02;
(h) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 7로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH04)을 포함하는 KS08;
(i) 서열번호 3으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH02) 및 서열번호 13으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH07)을 포함하는 KS11;
(j) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 5로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH03)을 포함하는 KS01;
(k) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 7로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH04)을 포함하는 KS05;
(l) 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변영역(SH01) 및 서열번호 13으로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 가변영역(SH07)을 포함하는 KS09;
상기 서열번호 1의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln인 것을 특징으로 하는 항체. - 중사슬 가변영역과 경사슬 가변영역을 포함하는 인간화 항-인간 종양 괴사인자-α항원 결합 단편(Fab)으로서,
상기 중사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27의 1 내지 120 위치 또는 서열번호 25의 1 내지 120번째의 아미노산이고, 또한 상기 경사슬 가변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31의 1 내지 109 번째의 아미노산 또는 서열번호 29의 1 내지 109번째의 아미노산인 Fab. - 제1항에 있어서,
상기 항체는 인간 항체의 중사슬 불변영역과 동일한 불변영역의 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬, 및 인간 항체의 경사슬 불변영역과 동일한 불변영역의 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬로 이루어진 것을 특징으로 하는 항체. - 제4항에 있어서,
상기 중사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 17로 나타내고, 상기 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타내는 것을 특징으로 하는 항체. - 제1항에 있어서,
상기 중사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 21로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 23으로 나타내며, 상기 서열번호 21의 첫번째 아미노산 잔기는 Glu 또는 Gln인 것을 특징으로 하는 항체. - 제1항에 있어서,
상기 Fab는 상기 중사슬 가변영역과 중사슬 불변영역(CH1)으로 이루어진 중사슬 단편 및 상기 경사슬 가변영역과 경사슬 불변영역으로 이루어진 경사슬을 포함하고, 상기 CH1의 아미노산 서열은 인간 항체 중사슬의 불변영역(CH1)의 아미노산 서열과 동일하며, 상기 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 인간 항체 경사슬의 불변영역의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 Fab. - 제7항에 있어서,
상기 CH1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 33으로 나타내고, 상기 경사슬의 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타내는 것을 특징으로 하는 Fab. - 제7항에 있어서,
상기 Fab는 하기의 (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 Fab:
(b1) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7F;
(b2) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7A;
(b3) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 29로 나타내는 KS-2E. - 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체로부터 유래된 항원 결합 단편 A 또는 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 Fab로부터 유래된 항원 결합 단편 B 중 어느 하나인 항원 결합 단편으로서,
상기 항원 결합 단편 A는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역, 중사슬 가변영역에서 선택되는 폴리펩티드 단편, 또는 경사슬 가변영역에서 선택되는 폴리펩티드 단편이며; 상기 항원 결합 단편 B는 Fab', F(ab')2, Fv, 중사슬 가변영역, 경사슬 가변영역, 중사슬 가변영역에서 선택되는 폴리펩티드 단편, 또는 경사슬 가변영역에서 선택되는 폴리펩티드 단편인 항원 결합 단편. - 다음과 같은 단백질 (A) 또는 (B)를 암호화하는 유전자:
(A) 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체;
(B) 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 Fab; - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 2 또는 4로 나타내고, 상기 항체의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 16, 10, 12, 8, 14 및 6 중 어느 하나로 나타내며,
상기 Fab의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 2, 4, 28 및 26 중 어느 서열의 1 내지 360번째의 아미노산이고, 상기 Fab의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 및 30 중 어느 서열의 1 내지 327번째의 아미노산인 것을 특징으로 하는 유전자. - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 18로 나타내고, 상기 항체의 경사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타내며;
상기 Fab의 CH1의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 34로 나타내고, 상기 Fab의 경사슬 불변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 20으로 나타내는 것을 특징으로 하는 유전자. - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 22로 나타내고, 상기 항체의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 24로 나타내며;
상기 Fab의 암호화 서열은 다음의 (c1) 내지 (c3) 중 어느 하나이고, 상기 Fab는 중사슬 가변영역의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 27의 1 내지 120 위치 또는 서열번호 25의 1 내지 120번째의 아미노산이며, 또한 경사슬 가변영역의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 31의 1 내지 109 번째의 아미노산 또는 서열번호 29의 1 내지 109번째의 아미노산인 것을 특징으로 하는 유전자:
(c1) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 28로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7F;
(c2) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7A;
(c3) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 30으로 나타내는 KS-2E. - 제11항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 세포주.
- 제15항에 있어서,
상기 재조합 세포주는 상기 유전자가 내부에 전달된 포유동물 세포주인 것을 특징으로 하는 재조합 세포주. - 제16항에 있어서,
상기 재조합 세포주는 CHO 세포주 또는 293 세포인 것을 특징으로 하는 재조합 세포주. - 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 Fab를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제18항에 있어서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환은 인간 종양 괴사인자-α의 증가에 의해 야기되는 질환인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 Fab를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 Fab를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 제10항에 기재된 항원 결합 단편을 암호화하는 유전자.
- 제22항에 있어서,
항원 결합 단편 A의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 2 또는 4로 나타내고, 항원 결합 단편 A의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 16, 10, 12, 8, 14 및 6 중 어느 하나로 나타내며,
항원 결합 단편 B의 중사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 2, 4, 28 및 26 중 어느 서열의 1 내지 360번째의 아미노산이고, 항원 결합 단편 B의 경사슬 가변영역의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 및 30 중 어느 서열의 1 내지 327번째의 아미노산인 것을 특징으로 하는 유전자. - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 22로 나타내고, 상기 항체의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 24로 나타내며,
상기 Fab의 암호화 서열은 다음의 (c1) 내지 (c3) 중 어느 하나이고, 상기 Fab는 중사슬 가변영역과 중사슬 불변영역(CH1)으로 이루어진 중사슬 단편 및 경사슬 가변영역과 경사슬 불변영역으로 이루어진 경사슬을 포함하며, 상기 CH1의 아미노산 서열은 인간 항체 중사슬의 불변영역(CH1)의 아미노산 서열과 동일하고, 상기 경사슬 불변영역의 아미노산 서열은 인간 항체 경사슬의 불변영역의 아미노산 서열과 동일한 것을 특징으로 하는 유전자:
(c1) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 28로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7F;
(c2) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7A;
(c3) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 30으로 나타내는 KS-2E. - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 22로 나타내고, 상기 항체의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 24로 나타내며,
상기 Fab의 암호화 서열은 다음의 (c1) 내지 (c3) 중 어느 하나이고, 상기 Fab는 가변영역과 중사슬 불변영역(CH1)으로 이루어진 중사슬 단편 및 경사슬 가변영역과 경사슬 불변영역으로 이루어진 경사슬을 포함하며, 상기 CH1의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 33으로 나타내고, 상기 경사슬의 불변영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 19로 나타내는 것을 특징으로 하는 유전자:
(c1) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 28로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7F;
(c2) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7A;
(c3) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 30으로 나타내는 KS-2E. - 제11항에 있어서,
상기 항체의 중사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 22로 나타내고, 상기 항체의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 24로 나타내며,
상기 Fab의 암호화 서열은 다음의 (c1) 내지 (c3) 중 어느 하나이고, 상기 Fab는 가변영역과 중사슬 불변영역(CH1)으로 이루어진 중사슬 단편 및 경사슬 가변영역과 경사슬 불변영역으로 이루어진 경사슬을 포함하며, 하기의 (b1) 내지 (b3) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 유전자:
(b1) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 27로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7F;
(b2) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 31로 나타내는 KS-7A;
(b3) 상기 중사슬 단편의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 25로 나타내고, 상기 경사슬의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 29로 나타내는 KS-2E;
(c1) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 28로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7F;
(c2) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 32로 나타내는 KS-7A;
(c3) Fab의 중사슬 단편의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 26으로 나타내고, Fab의 경사슬의 암호화 서열은 서열목록의 서열번호 30으로 나타내는 KS-2E. - 제10항에 기재된 항원 결합 단편을 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제11항에 기재된 유전자를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제15항에 기재된 재조합 세포주를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제10항에 기재된 항원 결합 단편을 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제11항에 기재된 유전자를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제15항에 기재된 재조합 세포주를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 제11항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제33항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 원핵세포 또는 진핵세포 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터. - 제11항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 박테리아.
- 제35항에 있어서,
상기 재조합 박테리아는 상기 유전자가 잠복하는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아. - 제11항에 기재된 유전자를 포함하는 재조합 바이러스.
- 제37항에 있어서,
상기 재조합 바이러스는 상기 유전자를 운반하는 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 아데노계 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스. - 제11항에 기재된 유전자를 포함하는 발현 카세트.
- 제33항에 기재된 재조합 벡터를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제35항에 기재된 재조합 박테리아를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제37항에 기재된 재조합 바이러스를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 제39항에 기재된 발현 카세트를 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 약제의 제조에 사용하는 방법으로서,
상기 인간 종양 괴사인자-α와 관련된 질환이 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염인 방법. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제33항에 기재된 재조합 벡터를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제35항에 기재된 재조합 박테리아를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제37항에 기재된 재조합 바이러스를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 보조물질 및 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 약제학적 조성물은 류머티스 관절염, 자가면역성 포도막염, 크론병, 판상형 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 궤양성 대장염 또는 소아 특발성 관절염의 예방 및 치료용이고,
상기 활성 성분은 제39항에 기재된 발현 카세트를 포함하며,
상기 보조물질은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제인 약제학적 조성물. - 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 기재된 항체, 또는 제1항, 제3항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 기재된 Fab를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제10항에 기재된 항원 결합 단편을 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제10항에 기재된 항원 결합 단편을 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제11항에 기재된 유전자를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제11항에 기재된 유전자를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제15항에 기재된 재조합 세포주를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제15항에 기재된 재조합 세포주를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제33항에 기재된 재조합 벡터를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제33항에 기재된 재조합 벡터를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제35항에 기재된 재조합 박테리아를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제35항에 기재된 재조합 박테리아를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제37항에 기재된 재조합 바이러스를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제37항에 기재된 재조합 바이러스를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
- 제39항에 기재된 발현 카세트를 인간 종양 괴사인자-α를 중화하는 산물의 제조에 사용하는 방법.
- 제39항에 기재된 발현 카세트를 인간 종양 괴사인자-α를 정성적 또는 정량적으로 검출하는 키트의 제조에 사용하는 방법.
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