ES2293086T3 - Inhibicion de la inflamacion usando agonistas colinergicos de union al receptor alfa 7. - Google Patents

Inhibicion de la inflamacion usando agonistas colinergicos de union al receptor alfa 7. Download PDF

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Kevin J. Tracey
Hong Wang
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Abstract

Uso de un agonista colinérgico selectivo para un receptor nicotínico alfa7 para la preparación de un medicamento para tratar un estado inflamatorio: en el que dicho estado se selecciona de apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, peritonitis, pancreatitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinófilo, granulomatosis, sarcoidosis, aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis quística, neumonía, silicovulcanoconiosis neumoultramicroscópica, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía, sinusitis, gripe, infección por el virus respiratorio sincitial, infección por herpes, infección por VIH, infección por el virus de la hepatitis B, infección por el virus de la hepatitis C, bacteriemia diseminada, dengue, candidiasis, paludismo, filariasis, amebiasis, quistes hidatídicos, quemaduras, vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, periarteritis nudosa, fiebre reumática, enfermedad celíaca, insuficiencia cardiaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, meningitis, encefalitis, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, sinovitis, miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, síndrome de Retier y enfermedad de Hodgkin.

Description

Inhibición de la inflamación usando agonistas colinérgicos de unión al receptor \alpha7.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere generalmente a medicamentos para reducir la inflamación. Más específicamente, la invención se refiere a medicamentos para reducir la inflamación que usan agonistas colinérgicos de unión al receptor \alpha7.
Los vertebrados consiguen la homeostasia interna durante una infección o lesión equilibrando las actividades de las rutas proinflamatorias y antiinflamatorias. Sin embargo, en muchos estados patológicos, esta homeostasia interna se desequilibra. Por ejemplo, la endotoxina (lipopolisacárido, LPS) producida por todas las bacterias gram-negativas activa los macrófagos para liberar citocinas que son potencialmente mortales (Tracey et al., 1986; Wang et al., 1999; Nathan, 1987; Dinarello, 1994).
La inflamación y otros estados perjudiciales (tales como choque séptico producido por la exposición a la endotoxina) están inducidos con frecuencia por citocinas proinflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF; también conocido como TNF\alpha o caquectina), interleucina (IL)-1\alpha, IL-1\beta, IL-6, IL-8, IL-18, interferón-\gamma, factor activador de las plaquetas (PAF), factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y otros compuestos (Thompson, 1998). Otros determinados compuestos, por ejemplo, proteína 1 del grupo de alta movilidad (HMG-1), se inducen durante diversos estados tales como sepsis y también pueden servir como citocinas proinflamatorias (publicación PCT WO 00/47104). Estas citocinas proinflamatorias se producen por varios tipos celulares diferentes, de la manera más importante por las células inmunitarias (por ejemplo monocitos, macrófagos y neutrófilos), pero también células no inmunitarias tales como fibroblastos, osteoblastos, células del músculo liso, células epiteliales y neuronas (Zhang y Tracey, 1998). Las citocinas proinflamatorias contribuyen a diversos trastornos, en particular sepsis, a través de su liberación durante una cascada de citocinas inflamatorias.
Las cascadas de citocinas inflamatorias contribuyen a características perjudiciales, incluyendo la inflamación y la apoptosis (Pulkki, 1997), de numerosos trastornos. Se incluyen trastornos caracterizados por reacciones tanto localizadas como sistémicas, incluyendo, sin limitación, enfermedades que implican el tracto gastrointestinal y tejidos asociados (tales como apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerosa, colitis pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, enfermedad celíaca, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis y enfermedad de Whipple); enfermedades y estados inflamatorios locales o sistémicos (tales como asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, isquemia de un órgano, lesión por reperfusion, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinófilo, granulomatosis y sarcoidosis); enfermedades que implican el aparato genitourinario y tejidos asociados (tales como aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis y uretritis); enfermedades que implican el aparato respiratorio y tejidos asociados (tales como bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, neumonía, silicovulcanoconiosis neumoultramicroscópica, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía y sinusitis); enfermedades que surgen de la infección por diversos virus (tales como influenza, virus respiratorio sincitial, VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y herpes), bacterias (tales como bacteriemia diseminada, dengue), hongos (tales como candidiasis) y parásitos protozoarios y multicelulares (tales como paludismo, filariasis, amebiasis y quistes hidatídicos); enfermedades y estados dermatológicos de la piel (tales como quemaduras, dermatitis, dermatomiositis, quemadura solar, urticaria, verrugas y ronchas); enfermedades que implican el sistema cardiovascular y tejidos asociados (tales como vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocárdica, insuficiencia cardíaca congestiva, periarteritis nudosa y fiebre reumática); enfermedades que implican el sistema nervioso central o periférico y tejidos asociados (tales como la enfermedad de Alzheimer, meningitis, encefalitis, esclerosis múltiples, infarto cerebral, embolia cerebral, síndrome de Guillame-Barre, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis y uveítis); enfermedades de los huesos, las articulaciones, los músculos y tejidos conjuntivos (tales como las diversas artritis y artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide y sinovitis); otros trastornos autoinmunitarios e inflamatorios (tales como miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger y síndrome de Retier); así como diversos cánceres, tumores y trastornos proliferativos (tales como enfermedad de Hodgkin); y, en cualquier caso, la respuesta inmunitaria o inflamatoria del huésped frente a cualquier enfermedad primaria (Gattorno et al., 2000; Yeh y Schuster, 1999; McGuinness et al., 2000; Hsu et al., 1999; Prystowsky y Rege, 1997; Kimmings et al., 2000; Hirano, 1999; Lee et al., 1995; Waserman et al., 2000; Katagiri et al., 1997; Burugardner y Orosz, 1999; Dibbs et al., 1999; Blum y Miller, 1998; Blackwell y Christman, 1996; Fox, 2000; Carteron, 2000; Hommes y van Deventer, 2000; Gracie et al., 1999; Kanai et al., 2001; Jander y Stoll, 2001; Watanabe et al., 1997; Rayner et al., 2000; Amrani et al., 2000).
Los mamíferos responden a la inflamación producida por las cascadas de citocinas inflamatorias en parte a través de la regulación por el sistema nervioso central. Esta respuesta se ha caracterizado en detalle con respecto a mecanismos de respuesta humoral sistémica durante las respuestas inflamatorias a endotoxina (Besedovsky et al., 1986; Woiciechowsky et al., 1998; Hu et al., 1991; Lipton y Catania, 1997). En un grupo de respuestas, se activan fibras aferentes del nervio vago por la endotoxina o citocinas, estimulando la liberación de respuestas antiinflamatorias humorales a través de la liberación de la hormona glucocorticoide (Watkins y Maier, 1999; Sternberg, 1997; Scheinman et al., 1995). El trabajo previo dilucidó un papel de la señalización del nervio vago como un componente crítico en el asa aferente que modula las respuestas de fiebre y adrenocorticotropina frente a citocinemia y endotoxemia sistémicas (Gaykema et al., 1995; Fleshner et al., 1998; Watkins et al., 1995; Romanovsky et al., 1997).
Otro grupo de respuestas es a través de la señalización del nervio vago eferente, denominada la "ruta antiinflamatoria colinérgica" (Borovikova et al., 2000). La estimulación del nervio vago eferente atenúa las respuestas inflamatorias sistémicas e inhibe la liberación de TNF (íd.; Bernik et al., 2002; Tracey et al., 2001; solicitud de patente estadounidense número 09/855.446). La acetilcolina, el principal neurotransmisor del nervio vago, atenúa la síntesis de citocinas por macrófagos mediante la señalización a través de receptores nicotínicos de acetilcolina sensibles a \alpha-bungarotoxina, pero se desconoce la identidad del receptor de macrófagos esencial.
Los receptores nicotínicos de acetilcolina son una familia de canales iónicos pentaméricos, controlados por ligando. En los seres humanos, se han identificado 16 subunidades diferentes (\alpha1-7, \alpha9-10, \beta1-4, \delta, \varepsilon y \gamma) que forman un gran número de receptores homo y heteropentaméricos con propiedades estructurales y farmacológicas diferenciadas (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001; Le Novere y Changeux, 1995). La principal función conocida de esta familia de receptores es transmitir señales para el neurotransmisor acetilcolina en las uniones neuromusculares y en los sistemas nervioso central y periférico (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001; Le Novere y Changeux, 1995, Marubio y Changeux, 2000; Steinlein, 1998). El trabajo previó indicó la presencia de receptores nicotínicos sensibles a \alpha-bungarotoxina en macrófagos primarios humanos (Borovikova et al., 2000), pero se desconoce la identidad de la subunidad del receptor específica.
El conocimiento del receptor nicotínico particular que es responsable de inhibir la inflamación sería útil para identificar agonistas específicos del receptor que inhibirían la inflamación. Es probable que tales agonistas tengan menos efectos secundarios que los agonistas identificados actualmente que son relativamente inespecíficos. También se facilitaría la identidad de otros efectos fisiológicos influenciados por el receptor antiinflamatorio.
Descripción de la técnica relacionada Referencias citadas
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Sumario de la invención
En consecuencia, la presente invención se basa en el descubrimiento de que el receptor \alpha7 es el receptor sensible a \alpha-bungarotoxina que influye en la liberación de citocinas proinflamatorias desde los macrófagos. Con ese conocimiento, se entendería que diversas composiciones sean útiles para el tratamiento de estados inflamatorios y la identificación de compuestos útiles para ese tratamiento. Los estudios de las respuestas de macrófagos frente a agonistas y antagonistas colinérgicos también se ven facilitados por este conocimiento.
Por tanto, la presente invención se refiere a la preparación de composiciones para inhibir la liberación de una citocina proinflamatoria desde un macrófago que comprenden un agonista colinérgico en una cantidad suficiente para disminuir la cantidad de la citocina proinflamatoria que se libera desde el macrófago, en las que el agonista colinérgico es selectivo para un receptor nicotínico \alpha7.
En otras realizaciones, la invención se refiere a la preparación de una composición para inhibir una cascada de citocinas inflamatorias en un paciente que comprende un agonista colinérgico en una cantidad suficiente para inhibir la cascada de citocinas inflamatorias, en la que el agonista colinérgico es selectivo para un receptor nicotínico \alpha7. En estas realizaciones, el paciente padece preferiblemente, o está en riesgo de padecer, un estado mediado por la cascada de citocinas inflamatorias.
Breve descripción de los dibujos
Los objetos, características y ventajas anteriores y otros de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción más particular de realizaciones preferidas de la invención, tal como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes en todas las diferentes vistas. Los dibujos no están necesariamente a escala, haciéndose énfasis en su lugar en ilustrar los principios de la invención.
La figura 1 son micrografías fluorescentes que establecen que los receptores nicotínicos de unión a \alpha-bungarotoxina se agrupan en la superficie de los macrófagos. Se tiñeron macrófagos primarios humanos con \alpha-bungarotoxina marcada con FITC (\alpha-bgt, 1,5 \mug/ml) y se visualizaron con un microscopio de fluorescencia confocal. Los paneles 1a y b muestran micrografías con menor aumento. a. Se tiñeron células con \alpha-bungarotoxina sola. b. Se añadieron 500 \muM de nicotina antes de la adición de \alpha-bungarotoxina. Los paneles 1c y 1d muestran micrografías con mayor aumento para revelar las agrupaciones de receptores. c. Los planos focales se encontraban en las capas internas próximas al centro (tres células inferiores) o próximas a la superficie (célula superior) de las células. d. El plano focal se encontraba en la superficie superior de la célula.
La figura 2 son fotografías de geles e inmunotransferencias de tipo Western que muestran la expresión de ARNm y proteína de receptores nicotínicos \alpha7 y \alpha1 en macrófagos primarios humanos. El panel a muestra los resultados de RT-PCR con cebadores específicos para \alpha7, que genera una banda de \alpha7 de 843 pb. Se verificaron los productos de PCR mediante secuenciación (datos no mostrados). MAC 1 y MAC2: macrófagos derivados de dos donantes no relacionados. El panel b muestra inmunotransferencias de tipo Western. Se incubaron lisados celulares de células PC12 o macrófagos humanos (MAC) o bien con perlas de Sepharose control o perlas de Sepharose conjugadas con \alpha-bungarotoxina. Entonces se analizaron las proteínas unidas mediante anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para \alpha7 tal como se indica.
La figura 3 muestra gráficas y micrografías que establecen que los oligonucleótidos antisentido para la subunidad \alpha7 de los receptores nicotínicos de acetilcolina inhiben el efecto de la nicotina sobre la liberación de TNF. Los paneles a-c son gráficas que resumen los resultados experimentales, que muestran la liberación de TNF estimulada por LSP desde macrófagos primarios humanos pretratados con oligonucleótidos antisentido con respecto a diversas subunidades de los receptores nicotínicos. Cuando se indica, se añadió nicotina (Nic, 1 \muM) 5-10 min. antes de la inducción con LPS (100 ng/ml). Se determinaron los niveles de TNF en el medio de cultivo celular mediante ensayos con L929. CT: cultivos de macrófagos control (no estimulados). AS\alpha7, AS\alpha1 y AS\alpha10: oligonucleótidos antisentido para las subunidades \alpha7, \alpha1 y \alpha10, respectivamente. Los paneles d y e son micrografías fluorescentes que muestran la tinción con FITC-\alpha-bungarotoxina de macrófagos primarios humanos tratados (e) o sin tratar (d) con el oligonucleótido antisentido para \alpha7 (AS\alpha7) y visualizados mediante microscopía de fluorescencia confocal.
La figura 4 son gráficas que resumen experimentos que demuestran el aumento de la producción de citocinas en ratones deficientes en \alpha7 durante endotoxemia. Se inyectó a los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 (-/-) o ratones de tipo natural con edad y sexo coincidentes (+/+) LPS (0,1 mg/kg, i.p.). Se obtuvieron la sangre y los órganos o bien 1 h (para TNF) o bien 4 h (para IL-1\beta y IL-6) tras la estimulación con LPS. Se midieron los niveles de TNF, IL-1\beta e IL-6 en el suero o los órganos con ELISA. Panel a: niveles de TNF en suero. n=10 por grupo. Panel b: niveles de TNF en hígado. n=6 por grupo. Panel c: niveles de TNF en bazo. n=6 por grupo. Panel d: niveles de IL-1\beta en suero. n=8 por grupo. Panel e: niveles de IL-6 en suero. n=9 por grupo. * = P < 0,05 frente a los controles de tipo natural.
La figura 5 es una gráfica que muestra que la estimulación del nervio vago no inhibe TNF en los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina. Se sometieron los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 (-/-) o ratones de tipo natural con edad y sexo coincidentes (+/+) o bien a una operación simulada (SIMUL.) o bien a estimulación del nervio vago (ENV, vago izquierdo, 1 voltio, 2 ms, 1 Hz); se extrajo sangre 2 h tras la administración de LPS. Se determinaron los niveles de TNF en suero mediante ELISA. n=10 (SIMUL. \alpha7 +/+). n=11 (ENV \alpha7+/+, SIMUL. \alpha7-/-, ENV \alpha7-/-). * = P < 0,05 frente a SIMUL. \alpha7 +/+.
La figura 6 es un diagrama que muestra la mortalidad (supervivencia en porcentaje) de los ratones en el transcurso de la administración de o bien el compuesto (V) o bien el compuesto (VI) tras la inducción de sepsis usando el modelo de ligadura cecal y punción.
La figura 7 es una comparación en paralelo de diagramas que representan las cantidades medidas de liberación de TNF-\alpha inducida por LPS a partir de células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas tratadas con concentraciones incrementales o bien del compuesto (V) o bien de nicotina como una función de las concentraciones de estos compuestos.
La figura 8A es un diagrama que muestra la inhibición en porcentaje de la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS a partir de células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas tratadas con concentraciones incrementales de compuesto (VI) como una función del tiempo de preincubación.
La figura 8B es un diagrama que muestra la inhibición en porcentaje de la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS a partir de células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas tratadas con concentraciones incrementales de compuesto (VI) como una función de la concentración de compuesto (VI).
La figura 9 es un diagrama de barras de la concentración en el torrente sanguíneo medida de TNF-\alpha tras la administración de LPS a ratones a los que se administró previamente el compuesto (VI).
La figura 10 es una comparación en paralelo de diagramas de barras que representan el peso del colon (A) y la longitud del colon (B) de ratones a los que se ha administrado el compuesto (VI) tras la inducción de colitis mediante sulfato sódico de dextrano.
La figura 11 es un diagrama de barras que muestra la concentración medida de TNF-\alpha liberado a partir de células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas estimuladas con LPS tras la preincubación con cantidades incrementales de compuesto (VII).
Descripción detallada de la invención
Sigue una descripción de realizaciones preferidas de la invención.
Definiciones de sustituyentes
El término "alquilo", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye radicales hidrocarbonados monovalentes saturados que tienen restos lineales o ramificados, normalmente C_{1}-C_{10}, preferiblemente C_{1}-C_{6}. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo y t-butilo.
El término "alquenilo", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono en los que alquilo es tal como se definió anteriormente. Ejemplos de alquenilo incluyen etenilo y propenilo.
El término "alquinilo", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono en los que alquilo es tal como se definió anteriormente. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo y 2-propinilo.
El término "alcoxilo", tal como se usa en el presente documento, significa un grupo "alquil-O-", en el que alquilo es tal como se definió anteriormente.
El término "cicloalquilo", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye restos alquilo cíclicos saturados no aromáticos en los que alquilo es tal como se definió anteriormente. Ejemplos de cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. Los grupos "bicicloalquilo" son grupos carbocíclicos saturados no aromáticos que consisten en dos anillos. Ejemplos de grupos bicicloalquilo incluyen biciclo-[2.2.2]-octilo y norbornilo. El término "cicloalquenilo" y "bicicloalquenilo" se refieren a restos cicloalquilo y bicicloalquilo carbocíclicos no aromáticos tal como se definieron anteriormente, excepto porque comprenden uno o más dobles enlaces carbono-carbono que conectan miembros de anillo de carbono (un doble enlace "endocíclico") y/o uno o más dobles enlaces carbono-carbono que conectan un miembro de anillo de carbono y un carbono que no es de anillo adyacente (un doble enlace "exocíclico"). Ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo. Un ejemplo no limitante de un grupo bicicloalquenilo es norbornenilo. Los grupos cicloalquilo, cicloalquenilo, bicicloalquilo y bicicloalquenilo también incluyen grupos similares a los descritos anteriormente para cada una de estas categorías respectivas, pero que están sustituidos con uno o más restos oxo. Los ejemplos de tales grupos con restos oxo incluyen oxociclopentilo, oxociclobutilo, oxociclopentenilo y norcanforilo.
El término "cicloalcoxilo", tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye el grupo "cicloalquil-O-", en el que cicloalquilo se definió anteriormente.
El término "arilo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo carbocíclico. Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo y naftilo.
El término "heteroarilo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a grupos aromáticos que contienen uno o más heteroátomos (O, S o N). Un grupo heteroarilo puede ser monocíclico o policíclico. Los grupos heteroarilo de esta invención también pueden incluir sistemas de anillos sustituidos con uno o más restos oxo. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridinilo, piridazinilo, imidazolilo, pirimidinilo, pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, purinilo, oxadiazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotriazolilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, dihidroquinolilo, tetrahidroquinolilo, dihidroisoquinolilo, tetrahidroisoquinolilo, benzofurilo, furopiridinilo, pirrolopirimidinilo y azaindolilo.
Los grupos heteroarilo anteriores pueden unirse a través de C o unirse a través de N (cuando eso es posible). Por ejemplo, un grupo derivado de pirrol puede ser pirrol-1-ilo (unido a través de N) o pirrol-3-ilo (unido a través de C).
En el contexto de la presente invención, un grupo carbocíclico bicíclico es un compuesto bicíclico que sólo lleva carbono como átomo de anillo. La estructura de anillo puede ser, en particular, aromática, saturada o parcialmente saturada. Ejemplos de tales compuestos incluyen indanilo, naftalenilo, azulenilo.
En el contexto de la presente invención, un grupo amino puede ser primario (-NH_{2}), secundario (-NHR_{a}), o terciario (-NR_{a}R_{b}), en los que R_{a} y R_{b} pueden ser cualquiera de alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxilo, cicloalquilo, cicloalcoxilo, arilo, heteroarilo y un grupo carbocíclico bicíclico.
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de cultivo celular, biología molecular, microbiología, biología celular e inmunología, que se encuentran dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al. (1995), "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons; Methods in Enzymology (varios volúmenes); Methods in Cell Biology (varios volúmenes), y Methods in Molecular Biology (varios volúmenes).
Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento para poner en práctica la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, una "sal farmacéuticamente aceptable" del compuesto descrito es un producto que contiene un enlace iónico de la reacción de un compuesto de la invención con o bien un ácido o bien una base, adecuado para su administración a un sujeto. Por ejemplo, puede obtenerse una sal de ácido de un compuesto que contiene un grupo amina u otro básico haciendo reaccionar el compuesto con un ácido orgánico o inorgánico adecuado, tal como cloruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno, ácido acético, ácido perclórico y similares. Otros ejemplos de tales sales incluyen clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, metanosulfonatos, nitratos, maleatos, acetatos, citratos, fumaratos, tartratos (por ejemplo (+)-tartratos, (-)-tartratos o mezclas de los mismos incluyendo mezclas racémicas), succinatos, benzoatos y sales con aminoácidos tales como ácido glutámico. También pueden formarse sales con bases orgánicas adecuadas cuando el compuesto comprende un grupo funcional ácido tal como -COOH o -SO_{3}H. Tales bases adecuadas para la formación de sales de adición de base farmacéuticamente aceptables con compuestos de la presente invención incluyen bases orgánicas que no son tóxicas y lo suficientemente fuertes como para reaccionar con el grupo funcional ácido. Tales bases orgánicas se conocen bien en la técnica e incluyen aminoácidos tales como arginina y lisina, mono, di y trietanolamina, colina, mono, di y trialquilamina, tal como metilamina, dimetilamina, y trimetilamina, guanidina, N-bencilfenetilamina, N-metilglucosamina, N-metilpiperazina, morfolina, etilendiamina y tris(hidroximetil)aminometano.
Tal como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" es una formulación que comprende los compuestos descritos y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en una forma adecuada para la administración a un sujeto. La composición farmacéutica puede estar a granel o en una forma farmacéutica unitaria. La forma farmacéutica unitaria puede estar en cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa i.v., un comprimido, una bomba individual en un inhalador en aerosol, o un vial. La cantidad de principio activo (es decir, una formulación del compuesto descrito o sales del mismo) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y puede variarse según el tratamiento particular implicado. Puede apreciarse que puede ser necesario realizar variaciones rutinarias a la dosificación dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contempla una variedad de vías, incluyendo tópica, oral, pulmonar, rectal,
vaginal, parenteral, incluyendo transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e intranasal.
Los compuestos descritos en el presente documento, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos puede usarse en preparaciones farmacéuticas en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cargas o diluyentes sólidos inertes y disoluciones acuosas u orgánicas estériles. Los compuestos estarán presentes en tales composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proporcionar la cantidad de dosificación deseada en el intervalo descrito en el presente documento. Pueden hallarse técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente invención en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995).
Tal como se usa en el presente documento, un "sujeto" incluye mamíferos, por ejemplo, seres humanos, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, pájaros y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y aves de corral) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones y cobayas). En una realización preferida de los métodos descritos, el sujeto es humano.
Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la invención descrita es la cantidad que, cuando se administra a un sujeto que necesita tratamiento, mejora el pronóstico del sujeto, por ejemplo, retrasa la aparición de y/o reduce la gravedad de uno o más de los síntomas del sujeto asociados con una infección fúngica. La cantidad del compuesto descrito que ha de administrarse a un sujeto dependerá de la enfermedad particular, el modo de administración y las características del sujeto, tales como la salud general, otras enfermedades, edad, sexo, genotipo, peso corporal y tolerancia a fármacos. El experto podrá determinar dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Las cantidades eficaces de los compuestos descritos normalmente oscilan entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal al día y aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal al día, y preferiblemente entre 1 mg/kg de peso corporal al día y 100 mg/kg de peso corporal al día.
La presente invención se basa en la identificación del receptor sensible a \alpha-bungarotoxina que, cuando se expone a un agonista de ese receptor, inhibe la liberación de citocinas proinflamatorias desde los macrófagos cuando se estimulan de otro modo los macrófagos pata liberar citocinas inflamatorias. El receptor responsable de esta inhibición es el receptor \alpha7. Por tanto, el tratamiento de un macrófago con un agonista para el receptor \alpha7 inhibe que el macrófago libere citocinas proinflamatorias, particularmente TNF, si el macrófago se estimuló de otro modo, por ejemplo, con lipopolisacárido (LPS) bacteriano, para liberar las citocinas proinflamatorias.
En consecuencia, en algunas realizaciones la presente invención se refiere a la preparación de composiciones que inhiben la liberación de una citocina proinflamatoria desde una célula de mamífero, que comprenden un agonista colinérgico en una cantidad suficiente para disminuir la cantidad de citocinas proinflamatorias liberadas desde la célula, en las que el agonista colinérgico es selectivo para un receptor nicotínico \alpha7.
Tal como se usa en el presente documento, una citocina es una proteína o péptido soluble que se produce de manera natural por las células de mamífero y que actúan in vivo como reguladores humorales a concentraciones de micro a picomolares. Las citocinas pueden, en estados o bien normales o bien patológicos, modular las actividades funcionales de células y tejidos individuales. Una citocina proinflamatoria es una citocina que puede provocar cualquiera de las siguientes reacciones fisiológicas asociadas con la inflamación: vasodilatación, hiperemia, aumento de la permeabilidad de vasos con edema asociado, acumulación de granulocitos y fagocitos mononucleares, o deposición de fibrina. En algunos casos, la citocina proinflamatoria también puede provocar apoptosis, tal como en la insuficiencia cardíaca crónica, en la que se ha mostrado que TNF estimula la apoptosis de los cardiomiocitos (Pulkki, 1997; Tsutsui et al., 2000). Ejemplos de citocinas proinflamatorias son el factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina (IL)-1\alpha, IL-1\beta, IL-6, IL-8, IL-18, interferón-\gamma, HMG-1, factor activador de las plaquetas (PAF) y factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF). En realizaciones preferidas de la invención, la citocina proinflamatoria que se inhibe mediante el tratamiento con un agonista colinérgico es TNF, una IL-1, IL-6 o IL-18, dado que estas citocinas las producen los macrófagos y median estados perjudiciales para muchos trastornos importantes, por ejemplo choque endotóxico, asma, artritis reumatoide, enfermedad biliar inflamatoria, insuficiencia cardíaca y rechazo de aloinjerto. En las realizaciones más preferidas, la citocina proinflamatoria es TNF.
Las citocinas proinflamatorias han de distinguirse de las citocinas antiinflamatorias, tales como IL-4, IL-10 e IL-13, que no son mediadores de la inflamación. En realizaciones preferidas, la liberación de citocinas antiinflamatorias no se inhibe por agonistas colinérgicos.
En muchos casos, se producen citocinas proinflamatorias en una cascada de citocinas inflamatorias, definida en el presente documento como una liberación in vivo de al menos una citocina proinflamatoria en un mamífero, en la que la liberación de citocinas afecta a un estado fisiológico del mamífero. Por tanto, una cascada de citocinas inflamatorias se inhibe en realizaciones de la invención en las que la liberación de citocinas proinflamatorias provoca un estado fisiológico perjudicial.
Se concibe una célula de mamífero que produce citocinas proinflamatorias. Ejemplos son monocitos, macrófagos, mastocitos, neutrófilos, células epiteliales, osteoblastos, fibroblastos, células del músculo liso y neuronas. En realizaciones preferidas, la célula es un macrófago.
Tal como se usa en el presente documento, un "receptor colinérgico \alpha7" es un receptor que comprende una subunidad \alpha7. El receptor puede comprender sólo subunidades \alpha7; alternativamente el receptor comprende subunidad(es) \alpha7 y subunidad(es) de otros subtipos de receptor colinérgico. En una realización, el receptor es un homopentámero. En otra realización, el receptor es un heteropentámero.
Tal como se usa en el presente documento, un "agonista de receptor colinérgico \alpha7" es un compuesto que se une a un receptor que comprende una subunidad \alpha7, in vivo o in vitro, induciendo al receptor a realizar su función biológica. En una realización, un agonista de receptor colinérgico inhibe la liberación de citocinas proinflamatorias desde células que expresan receptores colinérgicos que comprenden subunidades \alpha7 cuando la célula se estimula de otro modo para liberar esas citocinas proinflamatorias. Los expertos pueden determinar si cualquier compuesto particular es un agonista de receptor \alpha7 mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos, por ejemplo los facilitados en el ejemplo 1 más adelante.
Cuando se hace referencia al efecto del agonista colinérgico sobre la liberación de citocinas proinflamatorias o una cascada de citocinas inflamatorias, o el efecto de la estimulación del nervio vago sobre una cascada de citocinas inflamatorias, el uso de los términos "inhibir" o "disminuir" engloba al menos una reducción pequeña pero medible en la liberación de citocinas proinflamatorias. En realizaciones preferidas, la liberación de la citocina proinflamatoria se inhibe en al menos un 20% con respecto a los controles no tratados; en realizaciones más preferidas, la inhibición es de al menos el 50%; en realizaciones todavía más preferidas, la inhibición es de al menos el 70%, y en las realizaciones más preferidas, la inhibición es de al menos el 80%. Tales reducciones en la liberación de citocinas proinflamatorias pueden reducir los efectos perjudiciales de una cascada de citocinas inflamatorias en realizaciones in vivo.
Se esperaría que cualquier agonista de \alpha7 inhiba la liberación de citocinas proinflamatorias desde células de mamífero. En realizaciones preferidas, el agonista colinérgico no es tóxico por lo demás para la célula a las concentraciones útiles. En realizaciones más preferidas, el agonista colinérgico se ha usado terapéuticamente in vivo o se produce de forma natural por las células de mamífero. Ejemplos incluyen acetilcolina, muscarina, nicotina, 3-2,4-dimetoxibencilidin-anabaseína (DMXB-A, también conocido como GTS-21) (Kem et al., 1997; Simosky et al., 2001), colina, metyoduro de cocaína (Francis et al., 2001).
En las realizaciones más preferidas, el agonista colinérgico es un agonista que es selectivo o específico para \alpha7, puesto que se esperaría que un agonista de este tipo produzca menos efectos secundarios que un agonista colinérgico inespecífico (por ejemplo, nicotina), a un sujeto que se está tratando para la inflamación. Tal como se usa en el presente documento, un agonista es selectivo para \alpha7 si ese agonista es un agonista que activa \alpha7 en mayor grado que el agonista activa al menos otro receptor nicotínico. Tal diferencia de activación puede medirse comparando la activación de los diversos receptores mediante cualquier método conocido, por ejemplo usando un ensayo de unión al receptor in vitro, tal como los producidos por NovaScreen Biosciences Corporation (Hanover, MD), o mediante los métodos descritos en el documento WO 02/44176 (\alpha4\beta2 sometido a prueba), la patente estadounidense número 6.407.095 (receptor nicotínico periférico de tipo ganglionar), la publicación de solicitud de patente estadounidense número 2002/0086871 (unión de ligando marcado a membranas preparadas a partir de células GH_{4}C1 transfectadas con el receptor de interés), la publicación de solicitud de patente estadounidense número 2002/0086871 (\alpha1 y \alpha4) y el documento WO 97/30998. Las referencias que describen métodos para determinar agonistas que son selectivos para los receptores \alpha7 incluyen: la patente estadounidense 5.977.144 (tabla 1), el documento WO 02/057275 (págs. 41-42) y Holladay et al. (1997). El experto conoce ensayos para otros subtipos de receptor nicotínico.
La unión o actividad (respuestas a corriente) de ovocitos de Xenopus que expresan o bien el subtipo de receptor \alpha7 o bien otro subtipo de receptor (por ejemplo, \alpha4\beta2) tras la administración del agonista. Se determinan que los agonistas que dan como resultado una mayor activación del subtipo de receptor \alpha7 son agonistas selectivos para \alpha7. Usando cualquiera de los métodos anteriores o un método equivalente, se prefiere que el agonista selectivo para \alpha7 sea al menos dos veces, más preferiblemente al menos cinco veces, incluso más preferiblemente al menos 10 veces, y lo más preferiblemente al menos 50 veces más capaz de activar el receptor \alpha7 que al menos otro receptor nicotínico.
Un agonista es específico para \alpha7 si ese agonista activa el receptor \alpha7 en un grado mucho mayor (es decir, al menos 10 veces, preferiblemente al menos 20 veces, más preferiblemente al menos 50 veces) que cualquier otro receptor nicotínico. Lo más preferiblemente, el agonista específico no activará otro receptor nicotínico en ningún grado medible (es decir, significativo a P = 0,05 frente al receptor no tratado en una comparación bien controlada). Ejemplos de agonistas específicos para \alpha7 son DMXB-A (compuesto (V)) y metyoduro de cocaína.
\newpage
En algunas realizaciones el agonista colinérgico nicotínico es un compuesto de fórmula I:
1
en la que,
R representa hidrógeno o metilo, y
n representa 0 ó 1;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En realizaciones particularmente preferidas, el agonista colinérgico nicotínico es (-)-espiro[1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,5'-oxazolidin-2'-ona] (compuesto VII). Se describen métodos de preparación de compuestos de fórmula I en la patente estadounidense número 5.902.814.
En otras realizaciones, el agonista colinérgico nicotínico es un compuesto de fórmula II:
2
en la que:
m es 1 ó 2;
n es 0 ó 1;
Y es CH, N o NO;
X es oxígeno o azufre;
W es oxígeno, H_{2} o F_{2};
A es N o C(R^{2});
G es N o C(R^{3});
D es N o C(R^{4});
con la condición de que no más de uno de A, G y D es nitrógeno pero al menos uno de Y, A, G y D es nitrógeno o NO;
R^{1} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R_{1}, -CN, -NO_{2}, -NR_{5}R_{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3}, o R^{2} y R^{3}, R^{3} y R^{4}, respectivamente, pueden formar juntos otro anillo aromático o heteroaromático de seis miembros que comparte A y G, o G y D, respectivamente, que contiene entre cero y dos átomos de nitrógeno, y está sustituido con de uno a dos de los siguientes sustituyentes: independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R^{1}, -CN, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3};
R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, C(O)R^{7}, C(O)NHR^{8}, C(O)OR^{9}, SO_{2}R^{10} o juntos pueden ser (CH_{2})_{j}Q(CH_{2})_{k} en el que Q es O, S, NR^{11}, o un enlace;
j es de 2 a 7;
k es de 0 a 2;
R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10} y R^{11} son independientemente alquilo C_{1}-C_{4}, arilo, o heteroarilo, o un enantiómero de los mismos;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En realizaciones preferidas, un agonista colinérgico es un compuesto de fórmula II en el que m es 1; n es 0; p es 0; x es oxígeno; A es C(R^{2}); G es C(R^{3}); y D es C(R^{4}). En una realización particularmente preferida, el agonista colinérgico nicotínico es (R)-(-)-5'-fenilespiro[1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,2'-(3'H)-furo[2,3-b]piridina]. Se describen métodos de preparación de compuestos de fórmula II en la patente estadounidense número 6.110.914.
En realizaciones adicionales, el agonista colinérgico nicotínico es un compuesto de fórmula III:
3
en la que R_{1}, R_{6} y R_{7} son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4}, y R_{2} se selecciona de un grupo de
4
40
en las que, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, alcoxilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, carboalcoxilo que tiene de 1 a 4 carbonos en el alcoxilo, amino, amido que tiene de 1 a 4 carbonos en el acilo, ciano, y N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, halógeno, hidroxilo o nitro.
En una realización preferida, un agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{2} está unido a la posición 3 del anillo de tetrahidropiridina, y además en el que R_{3}, que está unido a la posición 4 o la 2 del anillo de fenilo, se selecciona de amino, hidroxilo, cloro, ciano, dimetilamino, metilo, metoxilo, acetilamino, acetoxilo y nitro. En una realización particularmente preferida, el agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{3} es hidroxilo, y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno. En otra realización particularmente preferida, el agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{3} es acetilamino y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno. En otra realización particularmente preferida, el agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{3} es acetoxilo y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno. En otra realización particularmente preferida, el agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{3} es metoxilo, y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno. Aún en otra realización particularmente preferida, el agonista es un compuesto de fórmula III, en el que R_{3} es metoxilo y en el que R_{1} y R_{4} son hidrógeno, y además en el que R_{3} está unido a la posición 2 del anillo de fenilo, y R_{5}, que está unido a la posición 4 del anillo de fenilo, es metoxilo o hidroxilo. En realizaciones particularmente preferidas, el agonista colinérgico nicotínico se selecciona de 3-2,4-dimetoxibencilidin-anabaseína (DMXB-A; compuesto (V)), 3-(4-hidroxibenciliden)anabaseína, 3-(4-metoxibenciliden)anabaseína, 3-(4-aminobenciliden)anabaseína, 3-(4-hidroxi-2-metoxibenciliden)anabaseína (compuesto VI), 3-(4-metoxi-2-hidroxibenciliden)anabaseína, trans-3-cinamiliden-anabaseína, trans-3-(2-metoxi-cinamiliden)anabaseína y trans-3-(4-metoxicinamiliden)anabaseína. Se describen métodos de preparación de compuestos de fórmula III en la patente estadounidense número 5.977.144.
En realizaciones adicionales, el agonista es un compuesto de fórmula IV:
5
en la que
X es O o S; y
R se selecciona de H, OR_{1}, NHC(O)R_{1}, y un halógeno, en el que R_{1} es un hidrógeno o un alquilo C_{1}-C_{4}. En una realización particularmente preferida, el agonista colinérgico nicotínico se selecciona de un grupo que consiste en N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(4-hidroxifenoxi)benzamida, N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(4-acetamidofenoxi)benzamida, N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(fenilsulfanil)benzamida y N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(3-clorofenilsulfonil)-benzamida. Se describen métodos de preparación de compuestos de fórmula IV en la publicación de solicitud de patente PCT WO 01/85727.
Aún en otras realizaciones, el agonista es éster 1-(2-fluorofenil)-etílico del ácido (1-aza-biciclo[2.2.2]oct-3-il)-carbámico. Se han descrito métodos de preparación de este compuesto en la publicación de solicitud de patente estadounidense 2002/0040035.
Todavía en otras realizaciones, el agonista de \alpha7 es un anticuerpo que es un agonista selectivo (lo más preferiblemente un agonista específico) del receptor nicotínico \alpha7. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; pueden provenir de cualquiera de varias fuentes humana, eucariota no humana, celular, fúngica o bacteriana; pueden estar codificados por secuencias codificantes portadas por vector o genómicas; y pueden producirse frente a \alpha7 nativo o recombinante o fragmentos del mismo con o sin el uso de adyuvantes, todo según una variedad de métodos y procedimientos bien conocidos en la técnica para generar y producir anticuerpos. Otros ejemplos de tales anticuerpos útiles incluyen los tipos quiméricos, de cadena sencilla y diversos tipos humanos o humanizados de anticuerpos, así como diversos fragmentos de los mismos tales como fragmentos Fab y fragmentos producidos a partir de sistemas de expresión especializados.
Un ejemplo de métodos para generar anticuerpos para el receptor nicotínico \alpha7 es inmunizar un animal de laboratorio adecuado con el receptor \alpha7 o un fragmento del mismo y aislar los anticuerpos producidos mediante la inmunización que se unen a \alpha7. Un experto en la técnica conoce bien los procedimientos de inmunización y aislamiento. Pueden identificarse los anticuerpos que son agonistas mediante los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, combinando los anticuerpos aislados con un macrófago que se ha estimulado para liberar citocinas proinflamatorias, o cualquier otro método adecuado para evaluar la actividad del receptor \alpha7. La inhibición de la liberación de citocinas es indicativa de la actividad agonista. Puede evaluarse la selectividad para \alpha7 detectando la actividad frente a al menos uno de otro receptor nicotínico o colinérgico, tal como se trató anteriormente. Pueden evaluarse adicionalmente los anticuerpos que se encuentra que son agonistas selectivos para el receptor \alpha7 para determinar su eficacia en el tratamiento de una o más de las enfermedades inflamatorias descritas en el presente documento, por ejemplo, pruebas in vitro o pruebas in vivo adicionales en modelos con animales. La presente invención también incluye agonistas de anticuerpo selectivos de \alpha7 identificados mediante este método.
La presente invención es útil para estudiar células en cultivo, por ejemplo para estudiar el efecto de liberación de citocinas inflamatorias sobre la biología de los macrófagos, o para someter a prueba compuestos para determinar la actividad como agonista colinérgico. Sin embargo, las aplicaciones in vivo constituyen muchas de las realizaciones preferidas. En esas realizaciones, la célula está en un paciente que padece, o corre el riesgo de padecer, un estado mediado por una cascada de citocinas inflamatorias. Tal como se usa en el presente documento, un paciente puede ser cualquier mamífero. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el paciente es un ser humano.
Las composiciones pueden emplearse en el tratamiento de cualquier estado mediado por una cascada de citocinas inflamatorias. En realizaciones preferidas, el estado es uno en el que la cascada de citocinas inflamatorias se ve afectada por la liberación de citocinas proinflamatorias desde un macrófago. El estado puede ser uno en el que la cascada de citocinas inflamatorias produce una reacción sistémica, tal como con choque séptico. Alternativamente, el estado puede estar mediado por una cascada de citocinas inflamatorias localizada, tal como en la artritis reumatoide.
Estados que pueden tratarse de forma útil usando la presente invención son apendicitis, úlceras pépticas, gástricas o duodenales, peritonitis, pancreatitis o colitis aguda, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinófilo, granulomatosis, sarcoidosis, aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis quística, neumonía, silicovulcanoconiosis neumoultramicroscópica, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía, sinusitis, gripe, virus respiratorio sincitial, infección por herpes, bacteriemia diseminada, infección por VIH, infección por el virus de la hepatitis B, infección por el virus de la hepatitis C, dengue, candidiasis, paludismo, filariasis, amebiasis, quistes hidatídicos, quemaduras, vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, periarteritis nudosa, fiebre reumática, enfermedad celíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, meningitis, encefalitis, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, sinovitis, miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, síndrome de Retier o enfermedad de Hodgkin.
En una realización alternativa, el estado es cualquiera de los estados enumerados anteriormente, siempre que el estado no sea colitis ulcerosa, accidente cerebrovascular, diabetes tipo II, enfermedad de Crohn, enfermedad de Alzheimer o un estado cutáneo inflamatorio.
En una realización, el estado es apendicitis, úlceras pépticas, gástricas o duodenales, peritonitis, pancreatitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, asma, alergia, choque anafiláctico, isquemia de un órgano, lesión por reperfusión, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, aborto séptico, bacteriemia diseminada, quemaduras, enfermedad de Alzheimer, enfermedad celíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, infarto cerebral, embolia cerebral, lesión de la médula espinal, parálisis, rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped.
En otra realización, el estado es apendicitis, úlceras pépticas, gástricas o duodenales, peritonitis, pancreatitis, hepatitis, asma, alergia, choque anafiláctico, isquemia de un órgano, lesión por reperfusión, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, aborto séptico, bacteriemia diseminada, quemaduras, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, infarto cerebral, embolia cerebral, lesión de la médula espinal, parálisis, rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped. En una realización, el estado es sepsis.
Aún en otra realización, el estado se selecciona del grupo que consiste en peritonitis, pancreatitis, sepsis, choque endotóxico, caquexia, quemaduras, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, isquemia miocárdica y rechazo de aloinjerto.
En una realización alternativa, el estado se selecciona del grupo que consiste en peritonitis, pancreatitis, sepsis, choque endotóxico, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, isquemia miocárdica, rechazo de aloinjerto, asma, enfermedad de injerto contra huésped, insuficiencia cardíaca congestiva y fibrosis quística.
Estos estados se tratan preferiblemente con cualquiera de los compuestos I-VII o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
La vía de administración del agonista colinérgico depende del estado que va a tratarse. Por ejemplo, puede preferirse la inyección intravenosa para el tratamiento de un trastorno sistémico tal como choque séptico, y puede preferirse la administración oral para tratar un trastorno gastrointestinal tal como una úlcera gástrica. El experto puede determinar la vía de administración y la dosificación del agonista colinérgico que va a administrarse sin excesiva experimentación junto con estudios convencionales de dosis-respuesta. Las circunstancias relevantes que han de considerarse al realizar esas determinaciones incluyen el estado o estados que van a tratarse, la elección de la composición que va a administrarse, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente. Por tanto, dependiendo del estado, el agonista colinérgico puede administrarse por vía oral, por vía parenteral, por vía intranasal, por vía vaginal, por vía rectal, por vía lingual, por vía sublingual, por vía bucal, por vía intrabucal y por vía transdérmica al paciente.
En consecuencia, las composiciones de agonista colinérgico diseñadas para la administración oral, lingual, sublingual, bucal e intrabucal pueden prepararse sin excesiva experimentación por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo con un diluyente inerte o con un vehículo comestible. Las composiciones pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse para dar comprimidos. Para el fin de la administración terapéutica oral, a las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incorporarse excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y chicles.
Los comprimidos, píldoras, cápsulas y trociscos también pueden contener aglutinantes, recipientes, agentes disgregantes, lubricantes, agentes edulcorantes y agentes aromatizantes. Algunos ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina. Los ejemplos de excipientes incluyen almidón o lactosa. Algunos ejemplos de agentes disgregantes incluyen ácido algínico y almidón de maíz. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio o estearato de potasio. Un ejemplo de un deslizante es dióxido de silicio coloidal. Algunos ejemplos de agentes edulcorantes incluyen sacarosa y sacarina. Los ejemplos de agentes aromatizantes incluyen menta, salicilato de metilo y aroma de naranja. Los materiales usados en la preparación de estas diversas composiciones deben ser farmacéuticamente puros y no tóxicos en las cantidades usadas.
Las composiciones de agonista colinérgico de la presente invención pueden administrarse fácilmente por vía parenteral, tal como por ejemplo, mediante inyección intravenosa, intramuscular, intratecal o subcutánea. Puede lograrse la administración parenteral incorporando las composiciones de agonista colinérgico de la presente invención en una disolución o suspensión. Tales disoluciones o suspensiones también pueden incluir diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes antibacterianos tales como, por ejemplo, alcohol bencílico o metilparabenos, antioxidantes tales como, por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio y agentes quelantes tales como EDTA. También pueden añadirse tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis compuestos por vidrio o plástico.
La administración rectal incluye administrar las composiciones farmacéuticas en el recto o el intestino grueso. Esto puede lograrse usando supositorios o enemas. Las formulaciones de supositorio pueden prepararse fácilmente mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse formulaciones de supositorio calentando glicerina hasta aproximadamente 120ºC, disolviendo el agonista colinérgico en la glicerina, mezclando la glicerina calentada tras lo cual puede añadirse agua purificada, y vertiendo la mezcla caliente en un molde para supositorios.
La administración transdérmica incluye la absorción percutánea del agonista colinérgico a través de la piel. Las formulaciones transdérmicas incluyen parches (tales como el famoso parche de nicotina), pomadas, cremas, geles y ungüentos.
La presente invención incluye administrar por vía nasal al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del agonista colinérgico. Tal como se usa en el presente documento, administrar por vía nasal o administración nasal incluye administrar el agonista colinérgico a las membranas mucosas de las fosas nasales o la cavidad nasal del paciente. Tal como se usa en el presente documento, las composiciones farmacéuticas para la administración nasal de un agonista colinérgico incluyen cantidades terapéuticamente eficaces del agonista preparado mediante métodos bien conocidos que va a administrarse, por ejemplo, como un aerosol nasal, gotas nasales, suspensión, gel, pomada, crema o polvo. La administración del agonista colinérgico puede tener lugar usando un tapón nasal o una esponja nasal.
Tal como se trató previamente, los agonistas colinérgicos preferidos para esos métodos son selectivos o específicos para el receptor \alpha7, incluyendo por ejemplo DMXB-A (compuesto (V)), metyoduro de cocaína.
Se describen realizaciones preferidas de la invención en los siguientes ejemplos. Serán evidentes otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones en el presente documento para un experto en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva o la práctica de la invención tal como se describe en el presente documento. Se pretende que la memoria descriptiva, junto con los ejemplos, se consideren únicamente a modo de ejemplo.
Ejemplo 1 Receptor nicotínico \alpha7 como sustrato molecular de la sinapsis neuroinmunitaria Resumen del ejemplo
En el presente documento, se informa de que se requiere la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico para la inhibición por acetilcolina de la liberación de TNF desde macrófagos. La \alpha-bungarotoxina se une a agrupaciones diferenciadas de receptores expresadas en la superficie de macrófagos primarios humanos. La inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos para \alpha7 confirmó la identidad de la subunidad \alpha7 en proteínas aisladas mediante adherencia a perlas conjugadas con \alpha-bungarotoxina. La exposición de macrófagos a oligonucleótidos antisentido para \alpha7 disminuyó la unión a \alpha-bungarotoxina y restauró la liberación de TNF en presencia de nicotina. Los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico produjeron significativamente más TNF, IL-1\beta e IL-6 durante endotoxemia, en comparación con ratones de tipo natural. Los macrófagos aislados de ratones deficientes en \alpha7 no respondieron a los agonistas colinérgicos, y continuaron produciendo TNF. Finalmente, la estimulación eléctrica del nervio vago usando un protocolo que inhibía la liberación de TNF en ratones de tipo natural no inhibió la liberación de TNF en ratones deficientes en \alpha7. Por tanto, la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina es esencial para la inhibición colinérgica de las citocinas proinflamatorias.
Resultados y discusión
Como primera etapa en la identificación del receptor de macrófagos implicado en la inhibición de la liberación de citocinas proinflamatorias, se marcaron macrófagos primarios humanos con FITC-\alpha-bungarotoxina, un antagonista peptídico que se une a un subgrupo de receptores colinérgicos (Lindstrom, 1995; Leonard & Bertrand, 2001). Se observó una fuerte unión de la \alpha-bungarotoxina en la superficie del macrófago (figura 1a). El pretratamiento con nicotina redujo marcadamente la intensidad de unión (figura 1b). En las uniones neuromusculares y las sinapsis neuronales, los receptores nicotínicos forman agregados o agrupaciones de receptores que facilitan la rápida transmisión de señales (Lin et al., 2001; Feng et al., 1998; Shoop et al., 2000). Pueden observarse claramente agrupaciones diferenciadas de unión a \alpha-bungarotoxina con alto aumento en la superficie de los macrófagos, concentradas especialmente en la superficie del cuerpo celular (figura 1c, d).
Hasta la fecha, \alpha1, \alpha7 y \alpha9 son las subunidades del receptor nicotínico de unión a \alpha-bungarotoxina conocidas en las células humanas (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001). Las subunidades \alpha1 junto con \beta1, \delta y o bien \varepsilon (adulto) o bien \gamma (fetal), forman receptores nicotínicos heteropentaméricos que regulan la contracción muscular; \alpha7 y \alpha9 pueden formar cada una receptores nicotínicos homopentaméricos (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001). Para determinar si estas subunidades del receptor se expresan en macrófagos, se aisló ARN de macrófagos primarios humanos diferenciados in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se realizaron análisis por RT-PCR. Para aumentar la sensibilidad y especificidad de los experimentos, se llevaron a cabo dos rondas de PCR tras la transcripción inversa, usando cebadores anidados específicos para cada subunidad. Se confirmaron las identidades de los productos de PCR mediante secuenciación. Se detectó la expresión tanto de \alpha1, \alpha10, (datos no mostrados) como \alpha7 (figura 2a). Se detectó ARNm en macrófagos humanos derivados de donantes de sangre no relacionados. La misma estrategia de RT-PCR no detectó la expresión de ARNm de la subunidad \alpha9 en los macrófagos (datos no mostrados).
A continuación, se examinó la expresión de proteína de las subunidades \alpha1 y \alpha7 mediante inmunotransferencia de tipo Western. El anticuerpo específico de \alpha7 reconoció una banda clara con un peso molecular aparente de aproximadamente 55 kD (similar al peso molecular publicado para la proteína \alpha7 [Peng et al., 1994; Drisdel y Green, 2000]) tanto a partir de macrófagos primarios diferenciados como de PBMC no diferenciadas (datos no mostrados). La expresión de la proteína \alpha1 se reguló por disminución hasta niveles indetectables durante la diferenciación in vitro de PBMC en macrófagos (datos no mostrados). La subunidad \delta, a un componente necesario del receptor nicotínico de acetilcolina heteropentamérico \alpha1 no pudo detectarse mediante esta estrategia de RT-PCR anidada (datos no mostrados). Para confirmar que las señales positivas en los macrófagos representaban el receptor nicotínico \alpha7 que se une a \alpha-bungarotoxina, se usaron perlas conjugadas a \alpha-bungarotoxina para examinar las interacciones (pull down) de proteínas preparadas a partir de o bien macrófagos humanos o bien células PC12 (células de feocromocitoma de rata, que se ha mostrado que expresan el homopentámero de \alpha7 [Drisdel y Green, 2000]). Se analizaron las proteínas retenidas mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos de \alpha7 policlonales o monoclonales que reconocían la proteína \alpha7 tanto humana como de rata (las proteínas \alpha7 humana y de rata contienen el mismo número de aminoácidos y son idénticas en un 94% [Peng et al., 1994; Seguela et al., 1993]). Los resultados mostraron claramente que los macrófagos humanos expresan la proteína \alpha7 que se une a \alpha-bungarotoxina con un peso molecular aparente que es similar al de la subunidad \alpha7 en células PC12 (figura 2b). Se confirmó la identidad de la subunidad \alpha7 de macrófagos mediante la clonación de la \alpha7 expresada por macrófagos de longitud completa mediante métodos de RT-PCR. La subunidad \alpha7 de acetilcolina nicotínica de longitud completa en macrófagos contiene los exones 1 a 10, idénticos a los de la subunidad \alpha7 de acetilcolina nicotínica expresada en las neuronas (Gault et al., 1998). En conjunto, estos datos identifican la subunidad \alpha7 de acetilcolina nicotínica como el receptor de unión a \alpha-bungarotoxina expresado en la superficie de macrófagos humanos.
Para estudiar si se requiere el receptor \alpha7 para la inhibición colinérgica de la liberación de TNF, se sintetizaron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato que rodeaban el codón de iniciación de la traducción del gen de la subunidad \alpha7 humana. Se sintetizaron oligonucleótidos antisentido para regiones similares de los genes de la subunidad \alpha1 y \alpha10 como controles. Los macrófagos expuestos a los oligonucleótidos antisentido específicos para \alpha7 (AS\alpha7) respondieron significativamente menos a la acción inhibidora de TNF de la nicotina (figura 3a). Los oligonucleótidos antisentido para la subunidad \alpha7 de acetilcolina nicotínica restauraron la liberación de TNF desde macrófagos en presencia de nicotina. La exposición de macrófagos a AS\alpha7 no estimuló la síntesis de TNF en ausencia de LPS y nicotina. Los oligonucleótidos antisentido para las subunidades \alpha1 (AS\alpha1) y \alpha10 (AS\alpha10), en condiciones simulares, no cambiaron significativamente el efecto de la nicotina sobre la liberación de TNF inducida por LPS (figura 3b, c), indicando que la supresión de TNF por nicotina es específica para la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina. Conjuntos adicionales de oligonucleótidos antisentido para \alpha7, \alpha1 y \alpha10 proporcionaron resultados similares (datos no mostrados). La adición de oligonucleótidos antisentido para la subunidad \alpha7 de acetilcolina nicotínica a cultivos de macrófagos disminuyó la unión en superficie de \alpha-bungarotoxina marcada con FITC (figura 3d, e). En conjunto, estos datos indican que la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina es necesaria para la inhibición dependiente de la ruta antiinflamatoria colinérgica de la liberación de TNF en macrófagos.
Los macrófagos son la principal fuente de TNF producido en respuesta a la endotoxina bacteriana in vivo (Bianchi et al., 1995; Kumins et al., 1996). Para investigar si la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina es esencial para la ruta antiinflamatoria colinérgica in vivo, se midió la producción de TNF en ratones deficientes en el gen de \alpha7 generados mediante tecnología de desactivación genética (Orr-Urtreger et al., 1997). Los ratones que carecían de la subunidad \alpha7 del receptor se desarrollaron normalmente y no mostraron defectos anatómicos macroscópicos (íd.; Franceschini et al., 2000). El nivel de TNF en suero en los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 expuestos a endotoxina fue más de 5 veces superior al de los ratones control de tipo natural (TNF en suero en el tipo natural = 2,3 \pm 0,3 ng ml^{-1} frente a TNF en suero en ratones deficientes en \alpha7 = 12,2 \pm 4,7 ng ml^{-1}, p < 0,05 (prueba de la t de dos colas) (figura 4a). La producción de TNF en el hígado y el bazo también fue superior en los ratones deficientes (figura 4b, c), lo que indica una función crítica de la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina en la regulación de las respuestas inflamatorias in vivo. Los ratones deficientes en la subunidad \alpha7 endotoxémicos también produjeron niveles significativamente superiores de IL-1\beta (figura 4d) e IL-6 (figura 4e) en comparación con los ratones de tipo natural. Los macrófagos derivados de ratones deficientes en la subunidad \alpha7 tampoco respondieron a los agonistas colinérgicos, y produjeron TNF de forma normal en presencia de nicotina o acetilcolina (tabla 1). Por tanto, la expresión de la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina en macrófagos es esencial para la modulación colinérgica de TNF.
TABLA 1 Producción de TNF por macrófagos peritoneales de tipo natural y deficientes en \alpha7
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Se estimularon macrófagos peritoneales aislados de ratones de tipo natural inducidos con tioglicolato o ratones deficientes en la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina con LPS (100 ng/ml) durante 4 h en cultivo. Control: cultivos de macrófagos no estimulados. Cuando estaba indicado, se añadieron nicotina o acetilcolina (Ach) 5-10 min. antes del LPS. Se midieron los niveles de TNF mediante ELISA; los datos mostrados son la media \pm e.e.m. n = 8 por grupo. * = significativamente diferente de LPS a p < 0,05 mediante una prueba de la t de dos colas.
Para determinar si se requiere la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina para la inhibición por el nervio vago del TNF sistémico, se aplicó estimulación eléctrica (Borovikova et al., 2000) a los nervios vagos de ratones deficientes en la subunidad \beta7 o de tipo natural endotoxémicos. La estimulación eléctrica del nervio vago atenuó significativamente los niveles de TNF en suero inducido por endotoxina en ratones de tipo natural (figura 5). La estimulación del nervio vago usando este protocolo en ratones deficientes en la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina, sin embargo, no pudo reducir los niveles de TNF en suero durante endotoxemia (figura 5). Por tanto, una respuesta funcional frente a la estimulación del nervio vago in vivo requiere las subunidades \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina para inhibir la liberación de TNF.
Estas observaciones tienen varias implicaciones en la comprensión de la regulación de la inflamación y la liberación de TNF, y para el diseño de futuros agentes terapéuticos. Los datos previos indican que la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina forma receptores homopentaméricos que están implicados en la rápida señalización química entre células (Lindstrom, 1995; Leonard & Bertrand, 2001; Le Novere & Changeux, 1995). Los receptores nicotínicos \alpha7 de acetilcolina neuronales son altamente permeables al calcio (Vijayaraghavan et al., 1992; Shoop et al., 2001), y se ha observado que la nicotina induce un flujo de entrada de calcio transitorio en los macrófagos (datos no mostrados). El/los papel(es) de este aumento del flujo de calcio y los mecanismos intracelulares para inhibir la liberación de TNF requieren un estudio adicional. La perturbación de la expresión de la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina in vivo aumentó significativamente la liberación de TNF inducida por endotoxina e hizo ineficaz el estimulador del nervio vago como método para inhibir la liberación de TNF. Esto indica que el producto del gen de la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina es esencial para la regulación por el nervio vago de la liberación aguda de TNF durante la respuesta inflamatoria sistémica frente a la endotoxemia. Parece que la liberación de acetilcolina desde las terminaciones del nervio vago, o quizá otras fuentes (por ejemplo, linfocitos o células epiteliales) puede inhibir específicamente la activación de los macrófagos. Existe la posibilidad de desarrollar agonistas colinérgicos que seleccionan como diana las subunidades \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina en células inmunitarias periféricas para su uso como agentes antiinflamatorios para inhibir la liberación de TNF. También puede ser factible desarrollar estimuladores del nervio vago con actividad antiinflamatoria; los dispositivos similares son clínicamente seguros y se usan en el tratamiento de algunos pacientes con trastornos convulsivos. El TNF es una diana farmacológica clínicamente validada para la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn, de modo que parece razonable considerar una estrategia de inhibición de TNF que seleccione como diana la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina.
Métodos
Tinción de \alpha-bungarotoxina y microscopía confocal. Se realizó el aislamiento y cultivo de macrófagos humanos tal como se describió anteriormente (Borovikova et al., 2000). Se diferenciaron las células durante siete días en presencia de MCSF (2 ng/ml) en medio de cultivo completo (RPMI 1640 con un 10% de suero humano inactivado por calor). Se incubaron los macrófagos diferenciados con \alpha-bungarotoxina marcada con FITC a 1,5 \mug ml^{-1} (SIGMA) en el medio de cultivo celular a 4ºC durante 15 min. Cuando estaba indicado, se añadió nicotina a una concentración final de 500 \muM antes de la adición de \alpha-bungarotoxina. Se lavaron las células tres veces con medio RPMI (GIBCO) y luego se fijaron durante 15 min. a temperatura ambiente en disolución de paraformaldehído al 4%-PBS (pH 7,2). Tras la fijación, se lavaron las células con PBS una vez y se montaron para la visualización con el microscopio de fluorescencia confocal.
RT-PCR. Se preparó ARN total a partir de macrófagos humanos diferenciados in vitro usando reactivo TRIzol. Se realizó la transcripción inversa y la primera ronda de PCR usando el kit de RT-PCR Titan One Tube (Roche Molecular Biochemicals) según el protocolo del fabricante. Se llevó a cabo la segunda ronda de PCR anidada usando la mezcla madre para PCR Promega 2x. Se sometieron a electroforesis los productos de PCR procedentes de la PCR anidada sobre un gel de agarosa y se recuperaron usando el kit Gene Clean III (Biolab) y se enviaron a secuenciación para confirmar los resultados. Los conjuntos de cebadores para la transcripción inversa y la primera ronda de PCR fueron: \alpha1: cebador sentido 5'-CCAGACCTGAGCAACTTCATGG-3', cebador antisentido 5'-AATGAGTC
GACCTGCAAACACG-3'; \alpha: cebador sentido 5'-GACTGTTCGTTTCCCAGATGG-3', cebador antisentido 5'-AC
GAAGTTGGGAGCCGACATCA-3'; \alpha9: cebador sentido 5'-CGAGATCAGTACGATGGCCTAG-3', cebador antisentido 5'-TCTGTGACTAATCCGCTCTTGC-3'. Los conjuntos de cebadores para la PCR anidada fueron: \alpha1: cebador sentido 5'-ATCACCTACCACTTCGTCATGC-3', cebador antisentido 5'-GTATGTGGTCCATCACCATTGC-3'; \alpha7: cebador sentido 5'-CCCGGCAAGAGGAGTGAAAGGT-3'; cebador antisentido 5'-TGCAGATGATGGTGAA
GACC-3'; \alpha: cebador sentido 5'-AGAGCCTGTGAACACCAATGTGG-3', cebador antisentido 5'-ATGACTTTCGC
CACCTTCTTCC-3'. Para la clonación del ADNc de \alpha7 de longitud completa, se usaron los siguientes cebadores: 5' AGGTGCCTCTGTGGCCGCA 3' con 5' GACTACTCAG-TGGCCCTG 3'; 5' CGACACGGAGACGTGGAG 3' con 5' GGTACGGATG-TGCCAAGGAGT 3'; 5' CAAGGATCCGGACTCAACATGCGCTGCTCG3' con 5' CGGCTC
GAGTCACCAGTGTGGTTACGCAAAGTC 3'.
Inmunotransferencia de tipo Western y ensayo "pull-down" de \alpha-bungarotoxina. Se prepararon lisados celulares incubando PC12 o macrófagos primarios humanos con tampón de lisis (NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 50 mM pH 7,4, 0,02% de azida sódica, 1% de Triton X-100 y cóctel de inhibidores de proteasas) en hielo durante 90 min. Se cargaron cantidades iguales de proteína total en geles de SDS-PAGE para la inmunotransferencia de tipo Western o bien con anticuerpo específico de \alpha7 (Santa Cruz sc-1447) o bien anticuerpo monoclonal de \alpha1 (Oncogene). Para el ensayo "pull-down" de \alpha-bungarotoxina, se conjugó \alpha-bungarotoxina (SIGMA) con perlas de Sepharose activadas con CNBr (Pharmacia) y luego se incubaron con los lisados celulares a 4ºC durante la noche. Se lavaron las perlas y las proteínas unidas cuatro veces con tampón de lisis y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpos específicos de \alpha7 (policlonal: Santa Cruz H-302, monoclonal: Sigma M-220).
Experimentos con oligonucleótidos antisentido. Se sintetizaron oligonucleótidos antisentido de fosforotioato y se purificaron mediante Genosys. Las secuencias de los oligonucleótidos son: AS\alpha7: 5'-gcagcgcatgttgagtcccg-3'; AS\alpha1: 5'-gggctccatgggctaccgg\alpha-3'; AS\alpha10: 5'-ccccatggccctggcactgc-3'. Estas secuencias cubren las regiones de iniciación de la traducción divergentes de los genes de \alpha7, \alpha1 y \alpha10. Se llevó a cabo el suministro de los oligonucleótidos antisentido como en Cohen et al. (1997) a una concentración 1 \muM de los oligonucleótidos durante 24 h. Para experimentos de cultivo celular, se lavaron los cultivos de macrófagos pretratados con oligonucleótidos con medio nuevo y se estimularon con LPS 100 ng ml^{-1} con o sin nicotina (1 \muM, añadida 5-10 min. antes del LPS). Cuatro horas después de añadir LPS, se midieron las cantidades de TNF liberado mediante el ensayo de L929 y luego se verificaron mediante ELISA para TNF. Para la tinción de la \alpha-bungarotoxina, se lavaron las células pretratadas y se procesaron para la tinción de FITC-\alpha-bungarotoxina tal como se describió anteriormente. La nicotina y otros agonistas de la subunidad \alpha7 del receptor nicotínico de acetilcolina también inhibieron significativamente la liberación de TNF inducida por LPS en la línea de células similares a macrófagos murina RAW264.7 (datos no mostrados).
Ratones deficientes en el receptor nicotínico \alpha7. Se adquirieron ratones deficientes en el \betareceptor nicotínico \alpha7 (origen C57BL/6) y crías de tipo natural de The Jackson Laboratory (B6.1297-Chrna^{7tmlBay}, nº 003232). Se establecieron líneas reproductoras de ratones de tipo natural o ratones deficientes homocigóticos para obtener las progenies. Se usaron ratones macho o hembra de aproximadamente 8 a 12 semanas de edad (junto con controles de tipo natural con edad y sexo coincidentes) para los experimentos con endotoxina. Se pesaron individualmente los ratones y se les administró en consecuencia LPS 0,1 mg kg^{-1} (i.p.). Para los experimentos con TNF, se extrajeron sangre, el hígado y el bazo una hora tras la administración de LPS. Para los experimentos con IL-1\beta e IL-6, se extrajeron muestras de sangre cuatro horas tras la administración de LPS. Se midieron las cantidades de TNF, IL-1\beta e IL-6 mediante ELISA. Se confirmaron los genotipos de los ratones mediante estrategias de PCR genómicas. Se aislaron los macrófagos peritoneales de ratones macho y hembra de tipo natural y deficientes en \alpha7 inducidos con tioglicolato (48 horas) de aproximadamente 8 semanas de edad (n = 8/grupo). Se reunieron los macrófagos para cada grupo y se cultivaron durante la noche. Se añadieron nicotina y acetilcolina 5-10 min. antes de la administración de LPS (100 ng ml^{-1}). Se añadió bromuro de piridostigmina (100 \muM) con acetilcolina. Cuatro horas tras la inducción con LPS, se midieron los niveles de TNF mediante ELISA.
Estimulación del nervio vago. Se anestesiaron ratones deficientes en el receptor nicotínico \alpha7 (origen C57BL/6, machos y hembras) y ratones C57BL/6 de tipo natural con edad y sexo coincidentes con ketamina (100 mg kg^{-1}, por vía intramuscular) y xilazina (10 mg kg^{-1}, por vía intramuscular). Los ratones se sometieron o bien a una operación simulada o bien a estimulación del nervio vago (nervio vago izquierdo, 1 voltio, 2 ms, 1 Hz) con un módulo de estimulación eléctrica (STM100A, Harvard Apparatus). Se realizó la estimulación durante 20 min. (10 min. antes y 10 min. después de la administración de LPS). Se administró LPS a una dosis letal (75 mg kg^{-1}, por vía intraperitoneal). Se extrajo sangre dos horas tras la administración de LPS. Se midieron los niveles de TNF mediante ELISA.
Análisis estadístico. Se realizó un análisis estadístico usando una prueba de la t de dos colas cuando estaba indicado; P < 0,05 se considera significativo. Se realizaron los experimentos por duplicado o triplicado; para experimentos in vivo y ex vivo, "n" se refiere al número de animales en cada condición.
Ejemplo 2 Los compuestos (V) y (VI) son protectores en el modelo murino de ligadura cecal y punción de sepsis
Se mostró que los compuestos de fórmulas (V) y (VI) eran particularmente eficaces en el tratamiento de la sepsis en el modelo murino de ligadura cecal y punción.
7
3-(2,4-dimetoxibenciliden)anabaseína \hskip4cm (V)
8
3-(4-hidroxi-2-metoxi-benciliden)anabaseína \hskip4cm (VI)
Se realizó la ligadura cecal y punción (CLP) tal como se describe en Fink y Heard, J. of Surg. Res. 49:186-196 (1990), Wichman et al., Crit. Care Med. 26:2078-2086 (1998) y Remick et al., Shock 4:89-95 (1995). Brevemente, se anestesiaron ratones Balb/c con ketamina 75 mg/kg (Fort Dodge, Fort Dodge, Iowa) y 20 mg/kg de xilazina (Bohringer Ingelheim, St. Joseph, MO) por vía intramuscular. Se realizó una incisión en la línea media, y se aisló el ciego. Se situó una ligadura de sutura con Prolene 6-0 a un nivel a 5,0 mm de la punta cecal alejada de la válvula ileocecal.
Entonces se sometió a punción el muñón cecal ligado una vez con una aguja de calibre 22, sin extrusión directa de las heces. Entonces se colocó de nuevo el ciego en su posición intrabdominal normal. Luego se cerró el abdomen con una sutura continua de Prolene 6-0 en dos capas, peritoneo y fascia por separado para evitar la fuga de fluido. Se reanimaron todos los animales con una solución salina normal administrada por vía subcutánea a 20 ml/kg de peso corporal. Cada ratón recibió una inyección subcutánea de imipenem (0,5 mg/ratón) (Primaxin, Merck & Co., Inc., West Point, PA) 30 minutos tras la cirugía. Entonces se permitió que se recuperasen los animales.
Se trataron los ratones con o bien 3-2,4-dimetoxibenciliden-anabaseína (compuesto (V)) a 4 mg/kg o bien 3-(4-hidroxi-2-metoxibenciliden-anabaseína (compuesto (VI)) a 4 mg/kg o bien con control de vehículo. Se administraron los compuestos y el control de vehículo por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces al día en el día 1 y el día 2 (24 y 48 horas después de la cirugía, respectivamente) y se administraron una vez el día 3. Se monitorizó la mortalidad diariamente durante catorce días tras la cirugía. Los resultados se presentan en la figura 6, que muestra el porcentaje de animales supervivientes tras el tratamiento con o bien el compuesto (V), el compuesto (VI) o bien control de vehículo. En el día 14, sobrevivió el 91% (p < 0,01) de los ratones tratados con el compuesto (V) y el 82% (p < 0,02) de los ratones tratados con el compuesto (VI) mientras que sólo había sobrevivido el 30% de los ratones tratados con el control de vehículo. Estos resultados demuestran que los compuestos (V) y (VI) mejoraron significativamente la supervivencia del modelo murino de CLP de sepsis.
Ejemplo 3 El compuesto (V) y la nicotina inhiben la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS desde células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas
Se hicieron crecer células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., EE.UU.) en DMEM complementado con un 10% de suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina. Se sembraron las células en placas de cultivo tisular de 24 pocillos en medio Opti-MEM 1 y se usaron a una confluencia del 90%. Se trataron las células con o bien el compuesto (V) o bien nicotina (Sigma) a 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 \muM. Cinco minutos después de la adición del compuesto (V) o la nicotina, se trataron las células con LPS (500 ng/ml). Se recogieron los sobrenadantes tras 4 horas y se midió el TNF-\alpha mediante ELISA (kit de ELISA para ratón de R&D Systems Inc., Mineápolis, MN).
Se muestran los resultados en la figura 7, que demuestran que como la nicotina, el compuesto (V) inhibe de manera dependiente de la dosis la liberación de TNF-\alpha desde células RAW 264.7.
Ejemplo 4 El compuesto (VI) inhibe la liberación de TNF-\alpha inducida por LPS desde células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas
Se hicieron crecer células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., EE.UU.) en DMEM complementado con un 10% de suero bovino fetal, penicilina y estreptomicina. Se sembraron las células en placas de cultivo tisular de 24 pocillos en medio Opti-MEM 1 y se usaron a una confluencia del 90%.
En la figura 8A, se trataron las células con el compuesto (VI) a 0,1, 1 y 10 \muM. A las 0, 1, 4 ó 24 horas tras la preincubación con el compuesto (VI), se trataron las células con LPS (500 ng/ml). Se recogieron los sobrenadantes tras 4 horas y se midió el TNF-\alpha mediante ELISA (kit de ELISA para ratón de R&D Systems Inc., Mineápolis, MN). Se presentan los resultados mostrados en la figura 8a como inhibición en porcentaje de TNF-\alpha. El compuesto (VI) inhibe TNF-\alpha de manera dependiente de la dosis.
La figura 8B presenta los resultados de la condición de preincubación de 0 horas de la figura 8A y se presenta como la inhibición en porcentaje de TNF-\alpha. La CI_{50} estimada para el compuesto (VI) es de 0,9 \muM.
Ejemplo 5 El tratamiento con compuesto (VI) antes de la exposición a LPS inhibe el TNF circulante en ratones
Se trataron ratones C57B/6 con compuesto (VI) 4 mg/kg o control de vehículo por vía intraperitoneal (i.p.). Cinco minutos después del tratamiento con compuesto (VI) o control de vehículo, se les inyectó a los ratones con LPS 100 \mug i.p. Se sacrificaron los ratones 2 horas después del tratamiento con LPS y se extrajeron muestras de sangre para la medición de TNF-\alpha. Se midió el TNF-\alpha mediante ELISA tal como se describió anteriormente.
Tal como se muestra en la figura 9, el tratamiento con compuesto (VI) antes de la exposición a LPS diminuyó el nivel de TNF-\alpha circulante en aproximadamente un 50% comparado con los ratones tratados con control de vehículo.
Ejemplo 6 El compuesto (VI) reduce la inflamación de colon en la colitis por DSS murina
Se produjo colitis inducida por sulfato sódico de dextrano (DSS) tal como se describe en Hove et al., Dig. Dis, Sci. 47(9): 2056-2063 (2002). Se alimentaron ratones C57B/6 con DSS al 3% (p/v) (peso mol. de 40 kDa; TdB Consultancy, Uppsala, Suecia) en su agua para beber durante siete días. 12 horas tras el comienzo de la administración de DSS, se les inyectó a los ratones compuesto (VI) 4 mg/kg i.p. dos veces al día durante 7 días. Se sacrificaron los ratones en el día 7.
Se les extirpó el colon tras su muerte y se extrajeron a través de una incisión en la línea media. Se midió la longitud total del colon y se presentan los resultados en la figura 10(B). El acortamiento del colon es indicativo de una mayor gravedad de la colitis. Los ratones tratados con compuesto (VI) tuvieron una longitud del colon ligeramente superior que los ratones control (p = 0,07), lo que indica una menor gravedad de la colitis en los ratones tratados con compuesto (VI). También se midió otro indicador de la gravedad de la enfermedad, el peso del colon. Se registró el peso húmedo del colon y se usó como un índice de edema inflamatorio. Los resultados se muestran en la figura 10 (A). El peso del colon en los ratones tratados con compuesto (VI) disminuyó en comparación con los ratones en la condición de control. Estos resultados sugieren que el compuesto (VI) reduce la inflamación del colon en la colitis por DSS murina.
Ejemplo 7 El compuesto (VII) inhibe la liberación de TNF-\alpha desde células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas estimuladas con LPS
El compuesto (VII) mostró un efecto significativo en la inhibición de la liberación de TNF-\alpha
9
(-)-espiro-1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,5'-oxazolidin-2'-ona \hskip2cm (VII)
Se hicieron crecer células similares a macrófagos RAW 264.7 murinas (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md., EE.UU.) tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3. Se trataron las células con (-)-espiro-[1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,5'-oxazolidin-2'-ona] (compuesto (VII)) a 0, 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 \muM. Cinco minutos después de la adición del compuesto (VII), se trataron las células con LPS (500 ng/ml). Se midió el TNF-\alpha mediante ELISA tal como se describió anteriormente.
Se muestran los resultados en la figura 11, que demuestran que las concentraciones superiores del compuesto (VII) inhiben la liberación de TNF-\alpha desde células RAW 264.7. La liberación de TNF-\alpha disminuyó en más de cuatro veces en las células tratadas con compuesto (VII) 100 \muM en comparación con las células control.
En vista de lo anterior, se observará que se consiguen las diversas ventajas de la invención y otras ventajas logradas.

Claims (22)

1. Uso de un agonista colinérgico selectivo para un receptor nicotínico \alpha7 para la preparación de un medicamento para tratar un estado inflamatorio:
en el que dicho estado se selecciona de apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, peritonitis, pancreatitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Whipple, asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinófilo, granulomatosis, sarcoidosis, aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis quística, neumonía, silicovulcanoconiosis neumoultramicroscópica, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía, sinusitis, gripe, infección por el virus respiratorio sincitial, infección por herpes, infección por VIH, infección por el virus de la hepatitis B, infección por el virus de la hepatitis C, bacteriemia diseminada, dengue, candidiasis, paludismo, filariasis, amebiasis, quistes hidatídicos, quemaduras, vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, periarteritis nudosa, fiebre reumática, enfermedad celíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, meningitis, encefalitis, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis, uveítis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, sinovitis, miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, síndrome de Retier y enfermedad de Hodgkin.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico se selecciona de un análogo cuaternario de la cocaína; éster 1-(2-fluorofenil)-etílico del ácido (1-aza-biciclo[2.2.2]oct-3-il)-carbámico; un compuesto de fórmula I:
10
en la que,
R representa hidrógeno o metilo, y
n representa 0 ó 1; una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula I; un compuesto de fórmula II:
11 
\global\parskip0.950000\baselineskip
en la que:
m es 1 ó 2,
n es 0 ó 1,
Y es CH, N o NO,
X es oxígeno o azufre,
W es oxígeno, H_{2} o F_{2},
A es N o C(R^{2}),
G es N o C(R^{3}),
D es N o C(R^{4}),
con la condición de que no más de uno de A, G y D es nitrógeno pero al menos uno de Y, A, G y D es nitrógeno o NO,
R^{1} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4},
R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R_{1}, -CN, -NO_{2}, -NR_{5}R_{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3}, o R^{2} y R^{3}, R^{3} y R^{4}, respectivamente, pueden formar juntos otro anillo aromático o heteroaromático de seis miembros que comparte A y G, o G y D, respectivamente, que contiene entre cero y dos átomos de nitrógeno, y está sustituido con de uno a dos de los siguientes sustituyentes: independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R_{1}, -CN, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3},
R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, C(O)R^{7}, C(O)NHR^{8}, C(O)OR^{9}, SO_{2}R^{10} o juntos pueden ser (CH_{2})_{j}Q(CH_{2})_{k} en el que Q es O, S, NR^{11}, o un enlace,
j es de 2 a 7,
k es de 0 a 2,
R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10} y R^{11} son independientemente alquilo C_{1}-C_{4}, arilo, o heteroarilo, o un enantiómero de los mismos; una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula II; un compuesto de fórmula III:
12
en la que R_{1}, R_{6} y R_{7} son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4}, y R_{2} se selecciona de un grupo de
13
130 
\vskip1.000000\baselineskip
en las que, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, alcoxilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, carboalcoxilo que tiene de 1 a 4 carbonos en el alcoxilo, amino, amido que tiene de 1 a 4 carbonos en el acilo, ciano, y N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, halógeno, hidroxilo o nitro; y un compuesto de fórmula IV:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es O o S, y R se selecciona del grupo que consiste en H, OR_{1}, NHC(O)R_{1}, y un halógeno, en la que R_{1} es un alquilo C_{1}-C_{4}.
\global\parskip1.000000\baselineskip
3. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que,
R representa hidrógeno o metilo, y
n representa 0 ó 1;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que el agonista colinérgico es (-)-espiro[1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,5'-oxazolidin-2'-ona]
16
5. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula II:
17
en la que:
m es 1 ó 2;
n es 0 ó 1;
Y es CH, N o NO;
X es oxígeno o azufre;
W es oxígeno, H_{2} o F_{2};
A es N o C(R^{2});
G es N o C(R^{3});
D es N o C(R^{4});
con la condición de que no más de uno de A, G y D es nitrógeno pero al menos uno de Y, A, G y D es nitrógeno o NO;
R^{1} es hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4};
R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R_{1}, -CN, -NO_{2}, - NR_{5}R_{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3}, o R^{2} y R^{3}, R^{3} y R^{4}, respectivamente, pueden formar juntos otro anillo aromático o heteroaromático de seis miembros que comparte A y G, o G y D, respectivamente, que contiene entre cero y dos átomos de nitrógeno, y está sustituido con de uno a dos de los siguientes sustituyentes: independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo C_{2}-C_{4}, alquinilo C_{2}-C_{4}, arilo, heteroarilo, OH, O-alquilo C_{1}-C_{4}, CO_{2}R^{1}, -CN, -NO_{2}, -NR^{5}R^{6}, -CF_{3} o -OSO_{2}CF_{3};
R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4}, C(O)R^{7}, C(O)NHR^{8}, C(O)OR^{9}, SO_{2}R^{10} o juntos pueden ser (CH_{2})_{j}Q(CH_{2})_{k} en el que Q es O, S, NR^{11}, o un enlace;
j es de 2 a 7;
k es de 0 a 2;
R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10} y R^{11} son independientemente alquilo C_{1}-C_{4}, arilo, o heteroarilo,
o un enantiómero del mismo,
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula II en la que m es 1; n es 0; p es 0; x es oxígeno; A es C(R^{2}); G es C(R^{3}); y D es C(R^{4}).
7. Uso según la reivindicación 6, en el que el agonista colinérgico es 5'-fenilespiro[1-azabiciclo[2.2.2]octano-3,2'-(3'H)-furo[2,3-b]piridina].
8. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula III:
18
en la que R_{1}, R_{6} y R_{7} son hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{4}; y R_{2} se selecciona de un grupo de
19
en los que, R_{3}, R_{4} y R_{5} se seleccionan de hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{4} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, alcoxilo C_{1}-C_{6} opcionalmente sustituido con N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, carboalcoxilo que tiene de 1 a 4 carbonos en el alcoxilo, amino, amido que tiene de 1 a 4 carbonos en el acilo, ciano, y N,N-dialquilamino que tiene de 1 a 4 carbonos en cada uno de los alquilos, halógeno, hidroxilo o nitro.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula III, en el que R_{2} está unido a la posición 3 del anillo de tetrahidropiridina, y además en el que R_{3}, que está unido a la posición 4 o la 2 del anillo de fenilo, se selecciona del grupo que consiste en amino, hidroxilo, cloro, ciano, dimetilamino, metilo, metoxilo, acetilamino, acetoxilo y nitro.
10. Uso según la reivindicación 8, en el que el agonista colinérgico es un compuesto seleccionado de fórmula III, en el que R_{3} es hidroxilo, y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno; fórmula III, en el que R_{3} es acetilamino y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno; fórmula III, en el que R_{3} es acetoxilo y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno; fórmula III, en el que R_{3} es metoxilo, y en el que R_{1}, R_{4} y R_{5} son hidrógeno; fórmula III, en el que R_{3} es metoxilo y en el que R_{1} y R_{4} son hidrógeno, y además en el que R_{3} está unido a la posición 2 del anillo de fenilo, y R_{5}, que está unido a la posición 4 del anillo de fenilo, es metoxilo o hidroxilo.
11. Uso según la reivindicación 8, en el que el agonista colinérgico se selecciona de 3-2,4-dimetoxibencilidin-anabaseína (DMXB-A), 3-(4-hidroxibenciliden)anabaseína, 3-(4-metoxibenciliden)anabaseína, 3-(4-aminobenciliden)anabaseína, 3-(4-hidroxi-2-metoxibenciliden)anabaseína, 3-(4-metoxi-2-hidroxibenciliden)anabaseína, trans-3-cinamiliden-anabaseína, trans-3-(2-metoxi-cinamiliden)anabaseína y trans-3-(4-metoxicinamiliden)anabaseína.
12. Uso según la reivindicación 8, en el que el agonista colinérgico es 3-(4-hidroxi-2-metoxibenciliden)anabasina
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
13. Uso según la reivindicación 8, en el que el agonista colinérgico es 3-(2,4-dimetoxibenciliden)anabaseína.
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\newpage
14. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico es un compuesto de fórmula IV:
22
en la que
X es O o S; y
R se selecciona de H, OR_{1}, NHC(O)R_{1}, y un halógeno, en la que R_{1} es un alquilo C_{1}-C_{4}.
15. Uso según la reivindicación 13, en el que el agonista colinérgico se selecciona de N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(4-hidroxifenoxi)benzamida, N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(4-acetamidofenoxi)benzamida, N-
[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(fenilsulfanil)benzamida y N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(3-clorofenilsulfonil)-benzamida.
16. Uso según la reivindicación 13, en el que el agonista colinérgico es N-[(3R)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il]-4-(fenilsulfanil)benzamida.
17. Uso según la reivindicación 1, en el que el agonista colinérgico es metyoduro de cocaína.
18. Uso según la reivindicación 1, en el que el estado se selecciona de apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, peritonitis, pancreatitis, hepatitis, asma, alergia, choque anafiláctico, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, aborto séptico, bacteriemia diseminada, quemaduras, enfermedad celíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lesión de la médula espinal, parálisis, rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto contra huésped.
19. Método de uso según la reivindicación 1, en el que el estado se selecciona de apendicitis, úlceras pépticas, gástricas o duodenales, peritonitis, pancreatitis, hepatitis, asma, alergia, choque anafiláctico, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, aborto séptico, bacteriemia diseminada, quemaduras, insuficiencia cardíaca congestiva, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, lesión de la médula espinal, parálisis, rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped.
20. Uso según la reivindicación 1, en el que el estado se selecciona de peritonitis, pancreatitis, sepsis, choque endotóxico, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, rechazo de aloinjerto, asma, enfermedad de injerto contra huésped, insuficiencia cardíaca congestiva y fibrosis quística.
21. Uso según la reivindicación 1, en el que el estado se selecciona de peritonitis, pancreatitis, sepsis, choque endotóxico, caquexia, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico y rechazo de aloinjerto.
22. Uso según la reivindicación 1, en el que el estado es sepsis.
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