BRPI0804314A2 - composição farmacêutica, método de triagem de drogas e método de tratamento para malária - Google Patents

Abstract

COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO DE TRIAGEM DE DROGAS E MéTODO DE TRATAMENTO PARA MALáRIA. A presente invenção trata do emprego dos receptores serpentinos presentes no parasita do gênero Plasmodium para o tratamento de malária.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO Le i RI AG EM DE DROGAS EMÉTODO DE TRATAMENTO PARA MALÁRIA

Campo de aplicação

A presente invenção aplica-se na área farmacêutica para a produção deantimaláricos.

Estado da Técnica

Malária, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero Plasmodium, é amaior doença parasitária humana. A cada ano-estima-se que cerca de 500 milhõesde pessoas são infectadas, ocasionando a morte de aproximadamente 2-3 milhõesde crianças africanas anualmente. No Brasil, o número de casos na AmazôniaLegal apresentou um aumento de 25% desde 2002, sendo relatados cerca de 460mil casos no ano de 2004, o que tem sido acompanhado também por um aumentode 27% na proporção do número de casos de malária ocasionados por P.falciparum, a espécie responsável pela forma mais letal da doença (Garcia CRS,Azevedo MF, Wunderlich G, Budu A, Young J and Bannister L. G (2008)Plasmodium in the Post Genome Era: New insights into the molecular cell biology ofthe malária parasites. International Review of Molecular and Cell Biology 266: 85-156).

Apesar dos inúmeros esforços direcionados para o controle da malária, onúmero de casos continua a crescer devido ao surgimento de parasitas resistentesà maior parte das drogas anti-maláricas disponíveis, bem como de mosquitosresistentes aos inseticidas, tornando necessário o desenvolvimento de estratégiasalternativas para a erradicação da doença. Neste sentido, um dos maioresobstáculos encontrados relaciona-se à complexidade dos parasitas da malária e desuas interações com seu hospedeiro humano e inseto-vetor.

O ciclo de vida do parasita da malária: interações parasita-hospedeiro

O ciclo assexuado de P. falciparum ocorre no hospedeiro humano, sendo ainfecção iniciada pela picada da fêmea do mosquito anofelino, que injetaesporozoítos junto com a saliva. Recentemente, foi demonstrado que osesporozoítos injetados primeiramente atravessam a derme e somente alguns delesentram em capilares sangüíneos, enquanto outros se dirigem aos vasos linfáticos edão origens a formas exoeritrocíticas até então desconhecidas, as quais podem teruma importante influência no sistema imune do hospedeiro (Amino R, Thiberge S,Martin B, Celli S, Shorte S, Frischknecht F & Menard R (2006) Quantitative imagingof Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med 12: 220-224). Umavez na corrente sangüínea, os esporozoítos invadem os hepatócitos e sedesenvolvem em formas exoeritrocíticas, que rompem as células liberandomerozoítos no sangue (Mota MM, Pradel G, Vanderberg JP, Hafalla JCR, Frevert U,Nussenzweig RS, Nussenzweig V & Rodríguez A (2001) Migration of Plasmodiumsporozoites through cells before infection). Os merozoítos invadem eritrócitos, e sedesenvolvem no interior do vacúolo parasitóforo, passando por diversastransformações bioquímicas e morfológicas, que podem ser identificadasbasicamente por três estágios denominados anel, trofozoíto e esquizonte. Orompimento do eritrócito libera merozoítos, dando continuidade ao ciclointraeritrocítico (Bannister LH, Hopkins JM, Fowler RE, Krishna S & Mitchell GH(2000) A brief illustrated guide to the ultrastucture of Plasmodium falciparumasexual blood stages. Parasito! Today 16: 427-433).

Alguns parasitas na circulação sangüínea diferenciam-se em gametócitos,que são a forma infectiva para o mosquito vetor, onde ocorre o ciclo sexuado. Nointestino do mosquito ocorre a maturação dos gametócitos, processo denominadogametogênese, que é seguida pela fertilização, com a união de gametas masculinoe feminino gerando um zigoto. Este migra e adere ao epitélio do intestino, onde sedesenvolve num oocisto. Quando o oocisto rompe, há liberação de esporozoítos, osquais vão até a glândula salivar e são liberados durante a alimentação do mosquito(Ghosh A, Edwards MJ & Jacobs-Lorena M (2000) The journey of the maláriaparasite into the mosquito: Hopes for the new century. Parasitol Today 16: 196-201).

Além da grande diversidade de formas do parasita no hospedeiro e nomosquito vetor, uma característica notável do ciclo de vida de diversas espécies dePlasmodium é sua sincronização e periodicidade. A marcada periodicidade naformação dos gametócitos, as formas sexuadas do parasita, tem sido observadadesde o início do século passado, sendo que trabalhos realizados com diversasespécies de Plasmodium mostram a existência de um pico de produção degametócitos à noite, a cada 24 horas, em horários geralmente coincidentes com osde alimentação do mosquito. Desta forma, o ritmo circadiano de gametócitos deveser uma importante adaptação para manutenção do ciclo sexuado do parasita nomosquito vetor (Garcia CRS, Markus RP & Madeira L (2001) Tertian and quartanfevers: temporal regulation in malarial infection. J Biol Rhythms 16: 436-443). Até omomento não foi identificado o sinal responsável pela indução da formação degametócitos na circulação sangüínea do hospedeiro vertebrado.Em relação às formas assexuadas, a alta sincronização dos estágiosintraeritrocíticos resulta em ataques recorrentes de febre e calafrios, sempre emperíodos de tempo múltiplos de 24 horas, coincidentes com a liberaçãopraticamente simultânea de bilhões de merozoítos na circulação sangüínea. Esteconstitui um importante mecanismo de evasão do sistema imune do hospedeiro quetem despertado o interesse de pesquisadores há décadas.

Em 2000, num estudo realizado por nosso laboratório, Hotta et al.reportaram a partir de experimentos in vitro, e in vivo com camundongospinealectomizados cirurgicamente (retirando-se a glândula pineal) efarmacologicamente (utilizando luzindol, um antagonista de melatonina), que amelatonina sincroniza os estágios de maturação de P. chabaudi e P. falciparum.

Também foi mostrado que, in vitro, este hormônio ocasiona liberação de Ca2+ apartir de estoques intracelulares de Plasmodium. Os efeitos da melatonina no ciclodo parasita são bloqueados por um inibidor de fosfolipase C (U73122), sugerindoum possível mecanismo de ação da melatonina por meio da ligação a receptoresacoplados à proteína G, ocasionando a ativação de fosfolipase C e aumento dosníveis intracelulares de Ca2+ via IP3 (Hotta CT, Gazarini M, Beraldo FH, Varotti FP,Lopes C, Markus RP, Pozzan T & Garcia CRS (2000) Calcium-dependentmodulation by melatonin of the circadian rhythm in malarial parasites. Nature CellBiology 2: 466-468). Provavelmente as mudanças circadianas na concentraçãodeste hormônio produzido pelo hospedeiro representam um sinal chave para ocontrole sincronizado da maturação deste parasita in vivo.Sinalização intracelular em Plasmodium

O complexo ciclo de vida dos parasitas da malária é caracterizado por umasucessão de estágios de desenvolvimento especializados e cada um delesindispensável para a continuidade do ciclo. Diversos estudos de microarranjorealizados para determinar o padrão de expressão do genoma de P. falciparumrevelaram que os estágios intraeritrocíticos do parasita possuem mecanismosespecializados de regulação transcricional, os quais resultam numa cascatacontínua de expressão de genes com funções correlatas (Bozdech Z, Llina M,Pulliam BL, Wong ED, Zhu J & DeRisi JL (2003) The Transcriptome of theIntraerythrocytic Developmental Cycle of Plasmodium falciparum. PLOS Biology 1:1-16; Le Roch KG, Zhou Y, Blair PL, Grainger M, Moch JK, Haynes JD, De La VegaP, Holder AA, Batalov S, Carucci DJ & Winzeler EA (2003) Discovery of genefunction by expression profiling of the malária parasite life cycle. Science 301: 1503-1508). Ainda mais, já se tem mostrado que alguns estágios do ciclo de vida dePlasmodium são capazes de responder a sinais provenientes do hospedeirovertebrado ou do inseto vetor, de forma que seu processo de diferenciação celularesteja em sincronia com o ambiente em que o parasita vive (Hotta CT, Gazarini M,Beraldo FH, Varotti FP, Lopes C, Markus RP, Pozzan T & Garcia CRS (2000)Calcium-dependent modulation by melatonin of the circadian rhythm in malarialparasites. Nature Cell Biology 2: 466-468.; Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM &Garcia CRS (2005) Cyclic AMP and calcium interplay as second messengers inmelatonin-dependent regulation of Plasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol170: 551-557; Garcia GE, Wirtz RA, Barr JR, Woolfitt & Rosenberg R (1998)Xanthurenic acid induces gametogenesis in Plasmodium, the malária parasite. JBiol Chem 273(20): 12003-12005).

A gametogênese no intestino do mosquito vetor pode ser utilizada como umexemplo da importância de estudos sobre as vias de sinalização envolvidas compercepção do ambiente e resposta fisiológica do parasita, ativando um processo demorfogênese que resulta num avanço no ciclo celular do parasita rumo à formaçãode gametas maduros para a fertilização. O ácido xanturênico, molécula produzidana glândula salivar do mosquito a partir do catabolismo do triptofano, foi identificadocomo um fator derivado do inseto vetor capaz de induzir a exflagelação do gametamasculino (Billker O, Lindo V, Pânico M, Etienne AE, Paxton T, Dell A, Rogers M,Sinden RE & Morris HR (1998) Identification of xanthurenic acid as the putativeinducer of malária development in the mosquito. Nature 392: 289-292.; Garcia GE,Wirtz RA, Barr JR, Woolfitt & Rosenberg R (1998) Xanthurenic acid inducesgametogenesis in Plasmodium, the malária parasite. J Biol Chem 273(20): 12003-12005.; Hirai M, Yoshida S, Ishii A & Matsuoka H (2001) Characterization andidentification of exflagellation-inducing factor in the salivary gland of Anophelesstephensi (Diptera: Culicidae). Biochem Biophys Res Comm 287: 859-864). Dentreos mecanismos de ação induzidos pelo XA, estão a hidrólise de fosfolipídeos demembrana durante a exflagelação, gerando IP3 e DAG, a liberação de cálcio a partirde estoques intracelulares do parasita e o aumento dos níveis intracelulares deGMPc (Kawamoto F, Alejo-Blanco R, Fleck SL, Kawamoto Y & Sinden RE (1990)Possible roles of Ca2+ and cGMP as mediators of the exflagellation of Plasmodiumberghei and Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasito! 42: 101-108.; MartinSK, Jett M & Scheneider I (1994) Correlation of phosphoinositide hydrolysis withexflagellation in the malária microgametocyte. J Parasito! 80: 371-378. Billker O,Dechamps S, Tewari R, Wenig G, Franke-Fayard B & Brinkmann V (2004) Calciumand calcium-dependent protein kinase regulate gamete formation and mosquitotransmission in a malária parasite. Cell 117: 503-514). Além disso, já foidemonstrado que como resultado da produção destes segundos mensageirosocorre ativação de enzimas efetoras como guanilil ciclase e quinase dependente decálcio CDPK4 (Muhia DK, Swales CA, Deng W, Kelly JM & Baker DA (2001) Thegametocyte-activating factor xanthurenic acid stimulates an increase in membrane-associated guanylyl cyclase activity in the human malária parasite Plasmodiumfalciparum. Mol Microbiol 42: 553-60.; Billker O, Dechamps S, Tewari R, Wenig G,Franke-Fayard B & Brinkmann V (2004) Calcium and calcium-dependent proteinkinase regulate gamete formation and mosquito transmission in a malária parasite.Cell 117: 503-514). A quinase dependente de cálcio CDPK4 foi identificada comoum dos alvos moleculares do cálcio que traduz o sinal do XA numa resposta deregulação da progressão do ciclo celular no gametócito masculino.

Quanto ao ciclo assexuado do parasita, nosso laboratório demonstrou que amelatonina, produzida circadianamente pela glândula pineal do hospedeirovertebrado, sincroniza os estágios assexuados de P. chabaudi e P. falciparum(Hotta CT, Gazarini M, Beraldo FH, Varotti FP, Lopes C, Markus RP, Pozzan T &Garcia CRS (2000) Calcium-dependent modulation by melatonin of the circadianrhythm in malarial parasites. Nature Cell Biology 2: 466-468.; Hotta CT, Markus RP& Garcia CRS (2003) Melatonin and N-acetyl-serotonin cross the red blood cellmembrane and evoke calcium mobilization in malarial parasites. Braz J Med BiolRes 36:1583-7). A melatonina é uma molécula lipofílica capaz de atravessarmembranas biológicas, de forma que pode interagir tanto com alvos extracelularesquanto intracelulares. Hotta CT, Markus RP & Garcia CRS (2003) Melatonin and N-acetyl-serotonin cross the red blood cell membrane and evoke calcium mobilizationin malarial parasites. Braz J Med Biol Res 36:1583-7. Beraldo FH, Almeida FM, daSilva AM & Garcia CRS (2005) Cyclic AMP and calcium interplay as secondmessengers in melatonin-dependent regulation of Plasmodium falciparum cell cycle.J Cell Biol 170: 551-557, mostraram que a melatonina é capaz de ocasionar amobilização de cálcio dos estoques intracelulares de P. chabaudi e P. falciparummesmo em eritrócitos infectados intactos, indicando que ela deve ser capaz deatravessar as membranas do eritrócito e vacúolo parasitóforo e então ativar osreceptores na membrana do parasita. Gazarini ML, Thomas AP, Pozzan T & GarciaCRS (2003) Calcium signaling in a low calcium environment: how the intracellularmalária parasite solves the problem. J Cell Biol 161: 103-110, demonstraram que ovacúolo parasitóforo é um microambiente rico em cálcio, o que é essencial paracriar condições para sinalização intracelular mediada por cálcio.

Além disso, foi demonstrado que outros produtos do catabolismo dotriptofano, como N-acetilserotonina, serotonina e triptamina, também são capazesde sincronizar o ciclo de P. falciparum e mobilizar Ca2+ (Beraldo, FH & Garcia CRS(2005) Products of tryptophan catabolism induce a Ca2+ release and modulate thecell cycle of P. falciparum malária parasites. J Pineal Res 39: 224-230). Dentre osalvos intracelulares da melatonina está uma tiol-protease dependente de Ca2+(Farias SL, Gazarini ML, Melo RL, Hirata IY, Juliano MA, Juliano L & Garcia CRS(2005) Cysteine-protease activity elicited by Ca(2+) stimulus in Plasmodium. MolBiochem Parasito! 141: 71-79). Além do segundo mensageiro Ca2+, Beraldo, FH &Garcia CRS (2005) Products of tryptophan catabolism induce a Ca2+ release andmodulate the cell cycle of P. falciparum malária parasites. J Pineal Res 39: 224-230). Beraldo FH, Almeida FM, da Silva AM & Garcia CRS (2005) Cyclic AMP andcalcium interplay as second messengers in melatonin-dependent regulation ofPlasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol 170: 551-557, demonstraram que amelatonina induz o aumento de AMPc e ativação de PKA, um evento que éprecedido pelo aumento de Ca2+ intracelular uma vez que é abolido pelo inibidor defosfolipase C (U73122) e pelo quelante intracelular de Ca2+, BAPTA-AM. De fato, foidemonstrado que o AMPc gerado em resposta à melatonina também induz aliberação de Ca2+, o que evidência uma complexa relação entre as vias destes doissegundos mensageiros nos parasitas da malária (Beraldo FH, Almeida FM, da SilvaAM & Garcia CRS (2005) Cyclic AMP and calcium interplay as second messengersin melatonin-dependent regulation of Plasmodium falciparum cell cycle. J Cell Biol170: 551-557). Desta forma, as vias de sinalização ativadas pela melatonina emPlasmodium apontam para uma sinalização mediada por receptores acoplados àproteína G (GPCRs), uma vez que implicam na ativação de fosfolipase C e adenililciclase, com produção dos segundos mensageiros Ca2+ e cAMP (Hotta CT,Gazarini M, Beraldo FH, Varotti FP, Lopes C, Markus RP, Pozzan T & Garcia CRS(2000) Calcium-dependent modulation by melatonin of the circadian rhythm inmalarial parasites. Nature Cell Biology 2: 466-468.; Beraldo FH, Almeida FM, daSilva AM & Garcia CRS (2005) Cyclic AMP and calcium interplay as secondmessengers in melatonin-dependent regulation of Plasmodium falciparum cell cycle.J Cell Biol 170: 551-557).Diversos trabalhos têm identificado proteínas que estão envolvidas nacascata de sinalização intracelular de P. falciparum, como adenilil ciclase (AC),guanilil ciclase (GC), PKA, PKG, RACK, Ca2+-ATPase, CDPKs, calmodulina eMAPKs (Aravind L, lyer LM, Wellems TE & Miller LH (2003) Plasmodium biology:genomic gleanings. Cell 115: 771-785.; Baker DA & Kelly JM (2004) Purinenucleotide cyclases in the malária parasite. TRENDS in Parasitol 20: 227-232.;Madeira L, DeMarco R, Gazarini ML, Verjovski-Almeida S & Garcia CRS (2003)Human malária parasites display a receptor for activated C kinase ortholog.Biochem Biophys Res Comm 306: 995-1001.; Ward P, Equinet L, Packer J andDoerig C (2004) Protein kinases of the human malária parasite Plasmodiumfalciparum: the kinome of a divergent eukaryote. BMC Genomics 5: 79.; Khan SM,Franke-Fayard B, Mair GR, Lasonder E, Janse CJ, Mann M & Waters AP (2005)Proteome analysis of separated male and female gametocytes reveals novel sex-specific Plasmodium biology. Cell 121: 675-687.; Anamika, Srinivasan N & Krupa A(2005) A genomic perspective of protein kinases in Plasmodium falciparum. Proteins58: 180-189). Porém, apesar da conclusão do projeto genoma de P. falciparum(Gardner MJ, Hall N, Fung E, White O, Berriman M, Hyman RW, Carlton JM, PainA, Nelson KE, Bowman S, Paulsen IT, James K, Eisen JA, Rutherford K, SalzbergSL, Craig A, Kyes S, Chan MS, Nene V, Shallom SJ, Suh B, Peterson J, Angiuoli S,Pertea M, Allen J, Selengut J, Haft D, Mather MW, Vaidya AB, Martin DM, FairlambAH, Fraunholz MJ, Roos DS, Ralph SA, McFadden Gl, Cummings LM,Subramanian GM, Mungall C, Venter JC, Carucci DJ, Hoffman SL, Newbold C,Davis RW, Fraser CM & Barrell B (2002) Genome sequence of the human maláriaparasite Plasmodium falciparum. Nature 419: 498-511), ainda não foramidentificadas as proteínas que agem início na cascata de sinalização, ou seja, osreceptores dos sinais extracelulares e as proteínas que fazem a mediação entreeles e seus efetores.

Tendo em vista toda a importância do reconhecimento de sinaisextracelulares provenientes do hospedeiro/vetor pelos parasitas da malária a fim deque seu próprio ciclo celular seja regulado de acordo com o ambiente em que seencontram, a identificação das proteínas envolvidas nestas vias de sinalizaçãotorna-se fundamental para elucidar mecanismos biológicos de tão granderelevância para a relação parasita-hospedeiro, que podem contribuir para aprodução de medicamentos anti-maláricos.

Descrição resumidaA presente invenção trata de uma composição farmacêutica caracterizadapelo fato de compreender um ou mais compostos que se ligam a receptoresserpentinos presente em parasitas do gênero Plasmodium além de excipientesfarmaceuticamente aceitáveis. A invenção trata ainda de método de triagem dedrogas e de método de tratamento para malária.

Descrição detalhada

Embora os receptores serpentinos sejam bem conhecidos, os receptores demembrana para sinais extracelulares ainda são desconhecidos em P. falciparum.Os receptores serpentinos são proteínas constituídas por sete domíniostransmembrana que atuam no reconhecimento de moléculas.

Receptores acoplados a proteína G (GPCRs), genericamente chamadosreceptores serpentina ou heptahélicos. Os receptores serpentinos são proteínasconstituídas por sete domínios transmembrana que atuam no reconhecimento demoléculas, esses receptores mediam respostas fisiológicas a estímulos tão diversosquanto luz, odores, feromônios, hormônios, neurotransmissores, pequenospeptídeos, proteínas, lipídeos e íons (Hall RA, Premont RT & Lefkowitz RJ (1999)Heptahelical receptor signaling: beyond the G-protein paradigm. J Cell Biol 145:927-932).

De acordo com a visão clássica, GPCRs acoplam a proteínas efetoras comoadenilil ou guanilil ciclases, fosfolipases A2 ou C e canais iônicos, via proteínasheterotriméricas que se ligam a nucleotídeos guanina (proteínas G). Entretanto,agora é evidente que muitos processos mediados por receptores heptahélicosfuncionam independentemente de proteínas G (Hall RA, Premont RT & LefkowitzRJ (1999) Heptahelical receptor signaling: beyond the G-protein paradigm. J CellBiol 145: 927-932.; Brzostowski JA & Kimmel AR (2001) Signaling at zero G: G-protein-independent functions for 7-TM-receptors. TRENDS Biochem Sei 26: 291-297.). GPCRs compreendem a mais expandida classe de receptores de membrana,com membros em bactérias, fungos, plantas e todos os organismos metazoários.Apesar de sua arquitetura conservada constituída por sete domíniostransmembrana (7-TM), os GPCRs são altamente divergentes, com membros emcada família compartilhando apenas 25% de identidade no nível de aminoácidosdentro da região transmembrânica conservada, enquanto pouca similaridade écompartilhada entre as diferentes famílias (Pierce KL, Premont RT & Lefkowitz RJ(2002) Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 3:639-50.).

Dessa forma a presente invenção trata de uma composição farmacêuticacaracterizada por compreender um ou mais compostos que se ligam a receptoresserpentinos presente em parasitas do gênero Plasmodium além de excipientesfarmaceuticamente aceitáveis. Os receptores serpentinos podem pertencer famíliadas: a rodopsinas (família A), secretinas (família B) e receptores de glutamatometabotrópico (família C). Além disso os receptores serpentinos podem serdependentes ou independentes da proteína G.

Os receptores podem estar presentes nas seguintes espécies do gêneroPlasmodium: Plasmodium falciparum, Plasmodium chabaudi, Plasmodium yoelli,Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium berghei.

A composição farmacêutica pode ser empregados por via oral, parenteral,retal ou tópica. Se por administração oral, podem ser utilizadas comprimidos,pílulas, pós (cápsulas de gelatina, hóstias) ou granulados, soluções, suspensões,emulsões, xaropes e elichires farmaceuticamente aceitáveis. Para paraadministração parenteral, podem ser de preferência soluções aquosas ou nãoaquosas, suspensões ou emulsões. A composição para administração retal sãosupositórios ou as cápsulas retais. Para a administração tópica podem ser, porexemplo, cremes, loções, colírios, colutórios, gotas nasais ou aerossóis.

A invenção trata também de método de triagem e método de tratamento demalária empregando os receptores serpentinos presentes em parasitas do gêneroPlasmodium.

Os receptores serpentinos podem se classificados em: rodopsinas (famíliaA), secretinas (família B) e receptores de glutamato metabotrópico (família C).Podendo os receptores serem dependentes ou independentes da proteína G.

Os compostos que se ligam a esses receptores serpentinos podem ser:feromônios, hormônios, neurotransmissores, pequenos peptídeos, proteínas,lipídeos e íons.

Os receptores podem estar presentes nas seguintes espécies do gêneroPlasmodium: Plasmodium falciparum, Plasmodium chabaudi, Plasmodium yoelli,Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium berghei.

O método de triagem emprega a transfecção de genes dos receptoresserpentino em células de mamíferos. Após a expressão destes genes em sistemaheterólogo, será medido a mudança na concentração de cálcio da célula pelaadição de diversos ligantes em potencial para os receptores serpentinos.

Segue exemplo que serve para melhor elucidar o escopo da invenção, semque com isso deva servir de base para «feitos limitativos da invenção.Exemplol: Método de triagem de droga

Ensaios funcionais de Ca2+

As células foram lavadas três vezes com 200 uL de DMEM sem soro emarcadas com Fluo-4 AM (5uM) em DMEM também sem soro por uma hora a37°C. Após a marcação, as células foram lavadas três vezes com 200 uL detampão HBSS (5,4 mM KCI, 0,3 mM Na2HP04, 0,4 mM KH2P04, 4,2 mMNaHC03, 0,5 mM MgCI2, 0,6 mM MgS04, 137 mM NaCI, 5,6 mM glicose)contendo 2 mM de CaCI2. A aquisição das imagens foi feita usando microscópioconfocal (LSM 510 microscopia de varredura a laser - Carl Zeiss) usando o softwareLSM 510, versão 2.5. A objetiva utilizada será de 40x (imersão em óleo). Asamostras foram excitadas a 488 nm com laser de argônio e a fluorescência emitidafoi coletada com filtro passa banda de 505-530 nm. Os ensaios consistiram naadição das drogas cuja resposta se desejava testar.

Ensaio de ligação com 2-[125l]-iodomelatonina

Células COS-7 transfectadas com os candidatos a receptor serpentina foramcentrifugadas a 3000 g durante 5 minutos e guardadas a -70 ° C até a utilização. Ascélulas foram lavadas duas vezes em tampão de ligação (10 mM Tris-HCI, 1 mMEDTA pH 7,5). 1x106 células foram incubadas a 37 °C por 2 horas com 100 pM 2-[125l]-iodomelatonina em 200 uL de tampão de ligação em presença ou ausência demelatonina 10"6 M para detecção de ligação específica. A reação foi paradaresfriando-se as amostras em gelo rapidamente, seguindo-se adição de 0,1% de y-globulina de carneiro e 1 ml_ de PEG 8000 24%, dissolvidos em tampão de ligaçãogelado. A fração ligada à 2-[125l3-iodomelatonina foi recuperada com centrifugaçãopor 30 minutos a 1800 g a 4 °C. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado foiressuspendido em 12% de PEG 8000 e 0,05% de y-globulina de carneiro. Oprecipitado foi recuperado através de nova centrifugação e deixado secar atemperatura ambiente (Conway et al. 1997). A radioatividade foi detectada emcintilômetro (Tri-Carb 2100 TR Packard).

Códon-otimização dos genes

A seqüência ORF completa do receptor putativo foi códon-otimizadacomercialmente (DNA 2.0). A fim de aumentar a expressão em células demamíferos, uma seqüência consenso Kozak (GCCGCC) foi acrescentada naextremidade 5'da construção e para monitorar a expressão no sistema heterólogoserá acrescentado o epítopo FLAG na extremidade 3'.

Claims (12)

1.. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um ou maiscompostos que se ligam a receptores serpentinos presente em parasitas do gêneroPlasmodium além de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composição farmacêutica segundo reivindicação 1 caracterizada pelo fato dosreceptores poderem ser do tipo rodopsinas (família A), secretinas (família B) ereceptores de glutamato metabotrópico (família C).

3. Composição farmacêutica segundo reivindicação 1 caracterizada pelo fato dosreceptores poderem ser dependentes ou independentes da proteína G.

4. Composição farmacêutica segundo reivindicação 1 caracterizada pelo fato deos compostos poderem ser feromônios, hormônios, neurotransmissores, pequenospeptídeos, proteínas, lipídeos e íons.

5. Composição farmacêutica segundo reivindicação 1 caracterizada pelo fato de oreceptor estar presente nas seguintes espécies: Plasmodium falciparum,Plasmodium chabaudi, Plasmodium yoelli, Plasmodium vivax, Plasmodiummalariae, Plasmodium berghei.

6. Método de triagem de drogas caracterizado pelo fato de empregar receptoresserpentinos presente em parasitas do gênero Plasmodium.

7. Método de triagem de drogas segundo reivindicação 6 caracterizado pelo fatode empregar a seguinte técnica: medidas de aumento de cálcio ou AMPC apóstriagem com ligantes em potencial em células transfectadas com os genescandidatos a receptores serpentino.

8. Método de tratamento de malária caracterizado pelo fato de empregar um oumais composto que se ligam a receptores serpentinos presente em parasitas dogênero Plasmodium.

9. Método de tratamento de malária segundo reivindicação 8 caracterizado pelofato dos receptores poderem ser do tipo rodopsinas (família A), secretinas {famíliaB) e receptores de glutamato metabotrópico (família C).

10. Método de tratamento de malária segundo reivindicação 8 caracterizado pelofato dos receptores poderem ser dependentes ou independentes da proteína G.

11. Método de tratamento de malária segundo reivindicação 8 caracterizado pelofato de os compostos poderem ser feromônios, hormônios, neurotransmissores,pequenos peptídeos, proteínas, lipídeos e íons.

12. Método de tratamento de malária segundo reivindicação 8 caracterizado pelofato de o receptor estar presente nas seguintes espécies do gênero Plasmodium:Plasmodium falciparum, Plasmodium chabaudi, Plasmodium yoelli, Plasmodiumvivax, Plasmodium malariae, Plasmodium berghei