CN102657651A - 用α 7受体结合胆碱能激动剂抑制炎症 - Google Patents

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凯文·J·翠西
王红
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North Shore Long Island Jewish Research Institute
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Abstract

提供了抑制巨噬细胞释放促炎性因子的方法，包括用α7烟碱受体选择性胆碱能激动剂处理巨噬细胞。还提供了抑制炎性细胞因子级联的方法，包括用所述胆碱能激动剂治疗受试体。还提供了确定化合物是否是与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂的方法，包括确定化合物是否抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子，或确定所述化合物是否降低胆碱能激动剂抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力。还提供了抑制哺乳动物巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂时脂多糖诱导的TNF释放减少的寡核苷酸或其模拟物，其基本上由大于5个核苷酸的α7受体mRNA互补序列组成。提供了抑制哺乳动物巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂时TNF释放减少的方法，包括用寡核苷酸和模拟物处理巨噬细胞。

Description

用α 7受体结合胆碱能激动剂抑制炎症
本申请是申请日为2003年12月05日，申请号为200380108261.5(国际申请号为PCT/US2003/038708)，发明名称为“用α7受体结合类胆碱激动剂抑制炎症”的申请的分案申请。 
相关申请 
本申请要求2002年12月6日提交的美国临时申请序列号60/431，650的权利。在此引入上述申请的全文作为参考。 
政府资助 
本发明的全部或部分受到国家卫生研究院的资助，许可号GM57226。政府对于本发明具有一定的权利。 
发明背景 
本发明涉及减少炎症的方法。特别是，本发明涉及用α7受体结合的胆碱能激动剂减少炎症的方法。 
脊椎动物在感染或者损伤期间可以通过平衡促炎性和抗炎性途径获得体内动态平衡。但是，在许多疾病状况下，这种体内动态平衡会变得不平衡。例如，所有革兰氏阴性细菌产生的内毒素(脂多糖，LPS)可以激活巨噬细胞释放可能是致命的细胞因子(Tracey et al.，1986；Wang et al.，1999；Nathan，1987；Din arello，1994)。 
炎症和其它有害的情况(例如由内毒素引起的脓毒性休克)通常是由促炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF；也称为TNFα或恶病质素)，白介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-18，干扰素γ，血小板激活因子(PAF)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)，和其它化合物诱导的(Thompson，1998)。某些其它化合物，例如高迁移率族蛋白1(HMG-1)，是在不同的情况例如脓毒症中被诱导的，也可作为促炎性细胞因子(PCT公开号WO 00/47104)。这些促炎性细胞因子是由几种不同的细胞类型产生的，最重要的是免疫细胞(例如单核细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞)，也包括非免疫细胞例如成纤维细胞，成骨细胞，平滑肌细胞，上皮细胞，和神经细胞(Zhang and Tracey，1998)。促炎性细胞因子通过在炎性细胞因子级联中的释放可导致各种疾病，特别是脓毒症。 
炎性细胞因子级联可导致有害的症状，包括多种疾病的炎症和细胞凋亡(Pulkki，1997)。所包括的具有局部和系统反应的疾病包括但不限于涉及胃肠道以及相关组织的疾病(例如阑尾炎，消化器官，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃疡性结肠炎，伪膜性肠炎，急性和缺血性结肠炎，憩室炎，会厌炎，弛缓不能，胆管炎，乳糜泄，胆囊炎，肝炎，克罗恩氏病，肠炎，和惠普尔病)；系统或局部炎性疾病和状况(例如哮喘，变态反应，过敏性休克，免疫复合体疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，高烧，嗜伊红细胞肉芽肿，肉芽肿，和肉样瘤)；涉及泌尿生殖系统和相关组织的疾病(例如脓毒性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎和尿道炎)；涉及呼吸系统和相关组织的疾病(例如支气管炎，肺气肿，鼻炎，囊肿性纤维化，成人呼吸窘迫综合症，肺炎，黑肺病(pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis)，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，和窦炎)；各种病毒(例如流行性感 冒，呼吸道合胞病毒，HIV，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，疱疹)，细菌(例如散播菌血症，登革热)，真菌(例如念珠菌病)和原生动物和多细胞寄生虫(例如疟疾，丝虫病，阿米巴病，和水泡囊)感染引起的疾病；皮肤病和皮肤状况(例如烧伤，皮炎，皮肌炎，晒斑，风疹疣，和水疱)；涉及心血管系统和相关组织的疾病(例如angiitis，血管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉硬化症，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，充血性心力衰竭，动脉周炎，和风湿热)；涉及中枢或外周神经系统和相关组织的疾病(例如阿尔茨海默病，脑膜炎，脑炎，多发性硬化，大脑梗塞，大脑栓塞，guillame-barre综合症，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，和葡萄膜炎)；骨骼，关节，肌肉和结缔组织疾病(例如各种关节炎和关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特式病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎，和滑膜炎)；其它自体免疫和炎性失调(例如重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑狼疮，古德帕斯丘综合征，白塞氏综合症，和同种异体移植物排斥，移植物抗宿主症，I型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger病，I型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger病，和瑞特综合症)；以及各种癌症，肿瘤和增殖性失调(例如何杰金氏病)；以及对任何原发性疾病的任何炎性或免疫宿主反应(Gattorno et al.，2000；Yeh and Schuster，1999；McGuinness et al.，2000；Hsu et al.，1999；Prystowsky and Rege，1997；Kimmings et al.，2000；Hirano，1999；Lee et al.，1995；Waserman et al.，2000；Katagiri et al.，1997；Bumgardner and Orosz，1999；Dibbs et al.，1999；Blum and Miller，1998；Blackwell and Christman，1996；Fox，2000；Carteron，2000；Hommes and van Deventer，2000；Gracie et al.，1999；Kanai et al.，2001；Jander and Stoll，2001；Watanabe etal.，1997；Rayner et al.，2000；Amrani et al.，2000)。 
哺乳动物对由炎性细胞因子级联引起的炎症的反应部分通过中枢神经系统的调控。这种反应具体涉及对内毒素的炎性反应过程中的体液反应机制(Besedovsky et al.，1986；Woiciechow sky et al.，1998；Hu et al.，1991；Lipton and Catania，1997)。在反应的一开始，传入迷走神经纤维被内毒素或细胞因子激活，通过糖皮质激素的释放刺激体液抗炎性反应(Watkins and Maie r，1999；Sternberg，1997；Scheinman et al.，1995)。早先的研究阐述了迷走神经信号传导作为输入环中的重要组成调节对于系统性内毒素血症和细胞因子血症的促肾上腺皮质激素和发热反应(Gaykema et al.，1995；Fleshner et al.，1998；Watkins et al.，1995；Romanovsky et al.，1997) 
另一系列反应是通过传出迷走神经信号传导，称为“胆碱能抗炎性途径”(Borovikova et al.，2000)。传出迷走神经的刺激减少了系统炎性反应并抑制TNF的释放(Id.；Bernik et al.，2002；Tracey et al.，2001；美国专利申请序列号09/855,446)。乙酰胆碱，迷走神经的主要神经递质，能够通过α-银环蛇毒素-敏感的烟碱乙酰胆碱受体的信号传导减少巨噬细胞细胞因子的合成，但是还未识别出基本的巨噬细胞受体。 
烟酸乙酰胆碱受体是一类配体门控的五聚离子通道家族。在人中，已识别了16个不同的亚基(α1-7，α9-10，β1-4，δ，ε，和γ)，形成具有不同结构和药学性质的大量的同五聚或异五聚受体(Lindstrom，1995；Leonard and Bertrand，2001；Le Novere and Changeux，1995)。这个受体家族的主要的已知功能是在神经肌肉连接处以及中枢和外周神经系统中传递信号给神经递质乙酰胆碱(Lindstrom，1995；Leonard and Bertrand，2001；Le No vere and Changeux，1995；Marubio and Changeux，2000；Steinlein，1998)。我们先前的工作表明在初级人巨噬细胞中存在α-银 环蛇毒素-敏感的烟碱受体(Borovikova et al.，2000)，但是还未识别出特异的受体亚基。 
对能够抑制炎症的特定烟碱受体的认识有助于识别能够抑制炎症的受体的特异性激动剂。这种激动剂与目前已鉴别的相对非特异性的激动剂相比可能具有较小的副作用。也更容易鉴别抗炎性受体的其它生理学效果。 
相关技术描述 
引用的参考文献 
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发明简述 
相应地，本发明是基于发现了α7受体是能影响巨噬细胞释放促炎性细胞因子的α-银环蛇毒素敏感的受体。基于这个认识，应当理解可以使用不同的方法和组合物治疗炎性疾病和鉴别可用于该治疗的化合物。基于这个认识也有助于进行关于巨噬细胞对胆碱能激动剂和拮抗剂的反应的研究。 
因此，本发明涉及抑制巨噬细胞释放促炎性细胞因子的方法。所述方法包括用足量的可减少巨噬细胞释放的促炎性细胞因子的量的胆碱能激动剂处理所述巨噬细胞，其中所述胆碱能激动剂对α7烟碱受体是选择性的。 
在其它实施方案中，本发明涉及在受试体中抑制炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括用足量的可抑制炎性细胞因子级联的胆碱能激动剂治疗所述受试体，其中所述胆碱能激动剂对α7烟碱受体是选择性的。在这些实施方案中，优选所述受试体患有由炎性细胞因子介导的疾病或具有其患病危险。 
此外，本发明涉及确定化合物是否是选择性地与α7烟碱受体结合的胆碱能激动剂的方法。所述方法包括确定所述化合物是否 能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子，并确定所述化合物是否是可与至少一种非α7的烟碱受体反应的胆碱能激动剂。在这些方法中，能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子，但是并不是可与至少一种非α7的烟碱受体反应的胆碱能激动剂的化合物是对α7烟碱受体具有选择性的胆碱能激动剂。 
在相关的实施方案中，本发明涉及确定化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂的方法。这些方法包括确定所述化合物是否能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力。在这些方法中，能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的化合物是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂。 
在其它实施方案中，本发明涉及确定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法。这些方法包括确定所述检测化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂。 
其它确定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法也是本发明的一部分。这些方法包括确定所述检测化合物是否能抑制拮抗剂与α7烟碱受体的结合。 
本发明还涉及能抑制哺乳动物巨噬细胞在所述巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中脂多糖诱导的TNF的释放的减少的寡核苷酸或其模拟物。所述寡核苷酸或其模拟物基本上由大于5个核苷酸长的与α7受体的mRNA互补的序列组成。 
此外，本发明涉及抑制哺乳动物巨噬细胞在所述巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中TNF释放的减少的方法。这些方法包括用上述寡核苷酸或模拟物处理巨噬细胞。 
具体地，本发明涉及： 
1.一种治疗患有由促炎性细胞因子的释放介导的疾病的受试者的方法，包括 
用足量的能减少巨噬细胞中促炎性细胞因子释放的量的对α7烟碱受体选择性的胆碱能激动剂治疗受试者， 
其中所述疾病选自阑尾炎，消化器官、胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，会厌炎，弛缓不能，胆管炎，胆囊炎，肝炎，惠普尔病，哮喘，变态反应，过敏性休克，免疫复合体疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，高烧，嗜伊红细胞肉芽肿，肉芽肿病，肉样瘤，脓毒性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道炎，支气管炎，肺气肿，鼻炎，囊肿性纤维化，局限性肺炎，黑肺病(pneumoultramicroscopic silicovolcanoconiosis)，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，窦炎，流行性感冒，呼吸道合胞病毒，疱疹感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，散播菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，水泡囊，烧伤，血管炎，angiitis，心内膜炎，动脉炎，动脉硬化症，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，动脉周炎，风湿热，乳靡泄，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，阻塞性肺病，脑膜炎，脑炎，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，葡萄膜炎，关节炎，关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特式病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎，滑膜炎，重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑狼疮，古德帕斯丘综合征，白塞氏综合症，同种异体移植物排斥，移植物抗宿主症，僵直性脊椎炎，Berger病，僵直性脊椎炎，Berger病，瑞特综合症和何杰金氏病。 
2.根据上述第1项的方法，其中所述促炎性细胞因子选自肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1β，IL-6，IL-18和HMG-1。 
3.根据上述第1项的方法，其中所述促炎性细胞因子是TNF。 
4.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂选自可卡因的四元类似物；(1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)-氨基甲酸1-(2-氟苯基)-乙酯；式I的化合物： 
Figure BSA00000666376400151
其中，R代表氢或甲基， 
n代表0或1；式I的化合物的药学可接收的盐；式II的化合物： 
Figure BSA00000666376400152
其中： 
m是1或2； 
n是0或1； 
Y是CH，N或NO； 
X是氧或硫； 
W是氧，H2或F2； 
A是N或C(R2)； 
G是N或C(R3)； 
D是N或C(R4)； 
条件是A，G和D中不超过一个是氮，但是Y，A，G和D中至少一个是氮或NO； 
R1是氢或C1-C4烷基； 
R2，R3和R4独立地是氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN， -NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3，或者R2和R3，R3和R4分别一起形成另一个六元芳香环或者共同具有A和G，或G和D，分别含有零到两个氮原子，并被一种或两种下述取代基取代的杂芳环：独立地氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN，-NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3； 
R5和R6独立地是氢，C1-C4烷基，C(O)R7，C(O)NHR8，C(O)OR9，SO2R10或一起构成(CH2)jQ(CH2)k，其中Q是O，S，NR11， 
或一个键； 
j是2到7； 
k是0到2； 
R7，R8，R9，R10，R11独立地是C1-C4烷基，芳基，或杂芳基，或其对映异构体。 
或其药学可接收的盐；式II的化合物的药学可接收的盐；式III的化合物： 
Figure BSA00000666376400161
其中R1，R6和R7是氢或C1-C4烷基；R2选自下组 
Figure BSA00000666376400162
Figure BSA00000666376400171
其中R3，R4和R5选自氢，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C4烷基，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C6烷氧基，在烷氧基上具有1到4个碳的烷氧羰基，氨基，在酰基上具有1到4个碳的酰氨基，氰基，和在每个烷基上具有1到4个碳的二烷基氨基，卤素，羟基或硝基；以及式IV的化合物： 
Figure BSA00000666376400172
其中X是O或S；并且R选自H，OR1，NHC(O)R1，和卤素，其中R1是C1-C4烷基。 
5.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂是式I的化合物： 
Figure BSA00000666376400173
R代表氢或甲基， 
n代表0或1； 
或其药学可接收的盐。 
6.根据上述第5项的方法，其中所述胆碱能激动剂是(-)-螺[1- 氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，5′-恶唑啉-2′-酮] 
Figure BSA00000666376400181
7.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂是式II的化合物： 
其中 
m是1或2； 
n是0或1； 
Y是CH，N或NO； 
X是氧或硫； 
W是氧，H2或F2； 
A是N或C(R2)； 
G是N或C(R3)； 
D是N或C(R4)； 
条件是A，G和D中不超过一个是氮，但是Y，A，G和D中 至少一个是氮或NO； 
R1是氢或C1-C4烷基； 
R2，R3和R4独立地是氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN，-NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3，或者R2和R3，R3和R4分别一起形成另一个六元芳香环或者共同具有A和G，或G和D，分别含有零到两个氮原子，并被一种或两种下述取代基取代的杂芳环：独立地氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN，-NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3； 
R5和R6独立地是氢，C1-C4烷基，C(O)R7，C(O)NHR8，C(O)OR9，SO2R10或一起构成(CH2)jQ(CH2)k，其中Q是O，S，NR11， 
或一个键； 
j是2到7； 
k是0到2； 
R7，R8，R9，R10，R11独立地是C1-C4烷基，芳基，或杂芳基， 
或其对映异构体， 
或其药学可接收的盐。 
8.根据上述第7项的方法，其中所述胆碱能激动剂是式II的化合物，其中m是1；n是0；p是0；x是氧；A是C(R2)；G是C(R3)；D是C(R4)。 
9.根据上述第7项的方法，其中所述胆碱能激动剂是5′-苯基螺[1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，2′-(3′H)-呋喃并[2，3-b]吡啶]。 
10.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂是式III的化合 
物： 
Figure BSA00000666376400201
其中R1，R6和R7是氢或C1-C4烷基；R2选自下组 
Figure BSA00000666376400202
和 
其中R3，R4和R5选自氢，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C 1-C4烷基，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C6烷氧基，在烷氧基上具有1到4个碳的烷氧羰基，氨基，在酰基上具有1到4个碳的酰氨基，氰基，和在每个烷基上具有1到4个碳的二烷基氨基，卤素，羟基或硝基。 
11.根据上述第10项的方法，其中所述胆碱能激动剂是式III的化合物，其中R2与四氢吡啶环的3-位置相连，进一步其中与苯环的4-或2-位置相连的R3选自下组：氨基，羟基，氯，氰，二甲基氨基，甲基，甲氧基，乙酰氨基，乙酰氧基，和硝基。 
12.根据上述第10项的方法，其中所述胆碱能激动剂是选自下组的化合物：通式III，其中R3是羟基，其中R1，R4和R5是氢；通式III，其中R3是乙酰氨基，其中R1，R4和R5是氢；通式III，其中R3是乙酰氧基，其中R1，R4和R5是氢；通式III，其中R3是甲氧基，其中R1，R4和R5是氢；通式III，其中R3是甲氧基， 其中R1和R4是氢，进一步其中R3与苯环的2-位置相连，与苯环的4-位置相连的R5是甲氧基或羟基。 
13.根据上述第10项的方法，其中所述胆碱能激动剂选自3-2，4-二甲氧基苯亚甲基anabaseine(DMXB-A)，3-(4-羟基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-甲氧基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-氨基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-羟基-2-甲氧基苯亚甲基)anabaseine(化合物(VI))，3-(4-甲氧基-2-羟基苯亚甲基)anabaseine，反-3-亚肉桂基anabaseine，反-3-(2-甲氧基-亚肉桂基)anabaseine和反-3-(4-甲氧基亚肉桂基)anabaseine。 
14.根据上述第10项的方法，其中所述胆碱能激动剂是3-(4-羟基-2-甲氧基苯亚甲基)anabaseine 
Figure BSA00000666376400211
15.根据上述第10项的方法，其中所述胆碱能激动剂是3-(2，4-二甲氧基苯亚甲基)anabaseine。 
Figure BSA00000666376400212
16.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂是通式IV的化合物： 
Figure BSA00000666376400221
其中X是O或S；并且 
R选自H，OR1，NHC(O)R1，和卤素，其中R1是C1-C4烷基。 
17.根据上述第15项的方法，其中所述的胆碱能激动剂选自N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-羟苯氧基)苯甲酰胺，N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-乙酰氨基苯氧基)苯甲酰胺，N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(苯基硫烷基)苯甲酰胺，和N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(3-氯苯基磺酰基)苯甲酰胺。 
18.根据上述第15项的方法，其中所述胆碱能激动剂是N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-羟苯氧基)苯甲酰胺。 
19.根据上述第1项的方法，其中所述胆碱能激动剂是甲碘化可卡因。 
20.根据上述第1项的方法，其中所述疾病选自阑尾炎，消化器官，胃或十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，肝炎，哮喘，变态反应，过敏性休克，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，脓毒性流产，散播菌血症，烧伤，乳靡泄，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，脊髓损伤，瘫痪，同种异体移植物排斥或移植物抗宿主症。 
21.根据上述第1项的方法，其中所述疾病选自阑尾炎，消化器官，胃或十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，肝炎，哮喘，变态反应，过敏性休克，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，脓毒性流产，散播菌血症，烧伤，充血性心力衰 竭，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，大脑梗塞，大脑栓塞，脊髓损伤，瘫痪，同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病。 
22.根据上述第1项的方法，其中所述疾病选自腹膜炎，胰腺炎，脓毒症，内毒素性休克，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，同种异体移植物排斥，哮喘，移植物抗宿主病，充血性心力衰竭和囊肿性纤维化。 
23.根据上述第1项的方法，其中所述疾病选自腹膜炎，胰腺炎，内毒素性休克，恶病体质，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，和同种异体移植物排斥。 
24.根据上述第1项的方法，其中所述疾病是脓毒症。 
25.确定化合物是否是对α7烟碱受体具有选择性的胆碱能激动剂的方法，所述方法包括 
确定化合物是否能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子，并且确定所述化合物是否是能与至少一个非α7的烟碱受体反应的胆碱能激动剂， 
其中能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子，并且不是能与至少一个非α7的烟碱受体反应的胆碱能激动剂的化合物是对α7烟碱受体具有选择性的胆碱能激动剂。 
26.根据上述第25项的方法，其中所述促炎性细胞因子选自肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1β，IL-6，IL-18和HMG-1。 
27.根据上述第25项的方法，其中所述促炎性细胞因子是TNF。 
28.根据上述第25项的方法，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。 
29.根据上述第25项的方法，其中所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。 
30.根据上述第25项的方法，进一步包括用能刺激促炎性细胞 因子级联的试剂处理所述哺乳动物细胞。 
31.根据上述第30项的方法，其中所述试剂是LPS。 
32.根据上述第25项的方法，其中促炎性细胞因子释放的抑制的确定包括测定所述促炎性细胞因子的mRNA。 
33.根据上述第25项的方法，其中促炎性细胞因子释放的抑制的确定包括测定所述促炎性细胞因子的蛋白。 
34.根据上述第25项的方法，其中促炎性细胞因子释放的抑制的确定包括测定所述促炎性细胞因子的活性。 
35.确定化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂的方法，所述方法包括确定化合物是否能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力， 
其中能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的化合物是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂。 
36.根据上述第35项的方法，其中所述促炎性细胞因子选自肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1β，IL-6，IL-18和HMG-1。 
37.根据上述第35项的方法，其中所述促炎性细胞因子是TNF。 
38.根据上述第35项的方法，其中所述哺乳动物细胞是免疫细胞。 
39.根据上述第35项的方法，其中所述哺乳动物细胞是巨噬细胞。 
40.根据上述第35项的方法，进一步包括用能刺激促炎性细胞因子级联的试剂处理所述哺乳动物细胞。 
41.根据上述第40项的方法，其中所述试剂是LPS。 
42.根据上述第35项的方法，其中对所述化合物是否能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的确定包括测定所述促炎性细胞因子的mRNA。 
43.根据上述第35项的方法，其中对所述化合物是否能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的确 定包括测定所述促炎性细胞因子的蛋白。 
44.根据上述第35项的方法，其中对所述化合物是否能降低胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的确定包括测定所述促炎性细胞因子的活性。 
45.确定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法，所述方法包括确定检测化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂。 
46.根据上述第45项的方法，其中所述受体是巨噬细胞。 
47.确定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法，所述方法包括确定检测化合物是否能抑制α7烟碱受体拮抗剂的结合。 
48.根据上述第47项的方法，其中所述α7受体拮抗剂是银环蛇毒素。 
49.一种能抑制哺乳动物巨噬细胞在所述巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中脂多糖诱导的TNF释放的减少的寡核苷酸或其模拟物，其中所述寡核苷酸或模拟物基本由大于5个核苷酸长的与α7受体mRNA互补的序列组成。 
50.根据上述第49项的寡核苷酸或模拟物，其中所述序列与所述mRNA的转录起始区域互补。 
51.根据上述第49项的寡核苷酸，其中所述序列包括5′-gcagcgcatgttgagtcccg-3′。 
52.根据上述第49项的寡核苷酸，其中所述序列基本由5′-gcagcgcatgttgagtcccg-3′组成。 
53.一种抑制哺乳动物巨噬细胞在所述巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中TNF释放的减少的方法，所述方法包括用根据上述第49项的寡核苷酸或模拟物处理巨噬细胞。 
54.根据上述第53项的方法，其中所述巨噬细胞是在哺乳动物体内。 
55.根据上述第54项的方法，其中所述哺乳动物是人。 
附图简述 
本发明的前述和其它目的，特征和优点可以从下述更具体的对本发明优选实施方案的描述中明显看出，如下述附图所示，其中相同的参考标记在不同的部分表示相同的意义。附图不必需按比例绘制，其重点在于举例说明本发明的原理。 
图1是荧光图，表明α-银环蛇毒素结合的烟碱受体在巨噬细胞表面成簇分布。初级人巨噬细胞用FITC标记的α-银环蛇毒素(α-bgt，1.5μg/ml)染色，然后用荧光共焦显微镜观察。1a和b显示了较低放大倍数的显微图。a.细胞单独用α-银环蛇毒素染色。b.在加入α-银环蛇毒素之前加入500μM烟碱。1c和1d显示了较高放大倍数的显微图，显示出受体簇。c.聚焦面在靠近细胞中间(三簇较下面的细胞)或靠近细胞表面(上面的细胞)的内层上。d.聚焦面在细胞的上表面上。 
图2是在初级人巨噬细胞中α7和α1烟碱受体的mRNA和蛋白表达的凝胶和western blot的照片。a是α7特异性引物的RT-PCR结果，产生一个843bp的α7条带。PCR产物通过测序验证(数据未显示)。MAC 1和MAC2：来自两个无关供体的巨噬细胞。b显示了western blot的结果。将PC 12细胞或人巨噬细胞(MAC)的细胞溶解物与对照Sepharose珠或与α-银环蛇毒素结合的Sepharose珠培育。然后用α7特异的多克隆和单克隆抗体分析结合蛋白。 
图3显示了烟碱乙酰胆碱受体的α7亚基的反义寡核苷酸抑制烟碱对于TNF释放的作用的图和显微图。a-c是用不同烟碱受体亚基的反义寡核苷酸预处理的初级人巨噬细胞中LPS刺激的TNF释放的图。烟碱(Nic，1μM)在LPS诱导(100ng/ml)之前5-10分钟加入。细胞培养基中的TNF水平用L929检测来测定。 CT：对照(未刺激的)巨噬细胞培养物。ASα7，ASα1和ASα10：分别是α7，α1和α10亚基的反义寡核苷酸。d和e是用α7反义寡核苷酸(ASα7)处理的(e)或未处理的(d)初级人巨噬细胞用FITC-α-银环蛇毒素染色并用荧光共焦显微镜观察的荧光显微图。 
图4是实验总结图，证明了α7缺陷的小鼠在内毒素血症期间细胞因子的产生增加。向α7亚基缺陷的小鼠(-/-)或年龄和性别匹配的野生型小鼠(+/+)中注射LPS(0.1mg/kg，i.p.)。LPS刺激后1小时(对于TNF)或4小时(对于IL-1β和IL-6)获取血液和器官。血清或器官中TNF，IL-1β和IL-6的水平用ELISA测定。a：血清中TNF水平。每组n＝10。b：肝中TNF水平。每组n＝6。c：脾中TNF水平。每组n＝6。d：血清中IL-1β水平。每组n＝8。e：血清中IL-6水平。每组n＝9。*＝P＜0.05，相对于野生型对照。 
图5显示了迷走神经刺激不能抑制烟碱乙酰胆碱受体α7亚基缺陷型小鼠中的TNF。α7亚基缺陷的小鼠(-/-)或年龄和性别匹配的野生型小鼠(+/+)进行假手术(SHAM)或迷走神经刺激(VNS，左迷走神经，1伏，2ms，1Hz)；给予LPS后2小时收集血液。用ELISA测定血清TNF水平。n＝10(SHAM α7+/+).n＝11(VNS α7+/+，SHAM α7-/-，VNS α7-/-).*＝P＜0.05vs SHAM α7+/+。 
图6显示了用盲肠结扎和穿刺模型诱导脓毒症之后进行化合物(V)或化合物(VI)给药的过程中小鼠的死亡率(存活百分率)。 
图7是用递增浓度的化合物(V)或烟碱处理的鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放的测定量随这些化合物浓度变化的比较图。 
图8A显示了用递增浓度的化合物(VI)处理的鼠RAW 26 
4.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放的抑制百分率随预培育时间的变化图。 
图8B显示了用递增浓度的化合物(VI)处理的鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放的抑制百分率随化合物(VI)浓度的变化图。 
图9是给预先给予了化合物(VI)的小鼠给予LPS后检测的血管中TNF-α浓度的条形图。 
图10是用右旋糖苷硫酸钠诱导结肠炎后给予化合物(VI)的小鼠的结肠重量(A)和结肠长度(B)的条形图的比较图。 
图11是用递增量的化合物(VII)预培育后LPS刺激的鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中释放的TNF-α的检测浓度的条形图。 
发明详述 
下面是对本发明优选实施方案的描述。 
取代基的定义 
这里所说的术语“烷基”，除非另外指出，包括具有直链或枝链部分的饱和的单价烃基，典型地是C1-C10，优选是C1-C6。 烷基基团的实例包括但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，和t-丁基。 
这里所说的术语“烯基”，除非另外指出，包括具有至少一个碳-碳双键的烷基部分，其中烷基如上所定义。烯基的实例包括但不限于乙烯基和丙烯基。 
这里所说的术语“炔基”，除非另外指出，包括具有至少一个碳-碳三键的烷基部分，其中烷基如上所定义。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基和2-丙炔基。 
这里所说的术语“烷氧基”是指“烷基-O-”基团，其中烷基如上所定义。 
这里所说的术语“环烷基”，除非另外指出，包括非芳香族的饱和环状烷基部分，其中烷基如上所定义。环烷基的实例包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，和环庚基。“双环烷基”基团是非芳香族的具有两个环的饱和碳环基团。双环烷基的实例包括但不限于，双环-[2.2.2]-辛基和降莰烷基。术语“环烯基”和“双环烯基”是指如上所述的非芳香族的碳环环烷基和双环烷基分子，除了含有一个或多个连接碳环成分的碳-碳双键(“内环”双键)和/或一个或多个连接碳环成分和相邻的非环碳的碳-碳双键(“外环”双键)。环烯基的实例包括但不限于环戊烯基和环己烯基。双环烯基基团的一个非限制性实例是降莰烯基。环烷基，环烯基，双环烷基，和双环烯基基团还包括与上述每个类别相似的，但是被一个或多个氧取代的基团。这些具有氧的基团的实例包括但不限于氧代环戊基，氧代环丁基，氧代环戊烯基和降莰酰基。 
这里所说的术语“环烷氧基”，除非另外指出，包括“环烷基-O-”基团，其中环烷基如上定义。 
这里所说的术语“芳基”指碳环基团。芳基基团的实例包括但不限于苯基和萘基。 
这里所说的术语“杂芳基”指含有一个或多个杂原子(O，S，或N)的芳香基团。杂芳基可以是单环的或是双环的。本发明的杂芳基还可以包括被一个或多个氧分子取代的环系统。杂芳基基团的实例包括但不限于吡啶基，哒嗪基，咪唑基，吡啶基，吡唑基，三唑基，吡嗪基，喹啉基，异喹啉基，四唑基，呋喃基，噻吩基，异恶唑基，噻唑基，恶唑基，异噻唑基，吡咯基，喹啉基，异喹啉基，吲哚基，苯并咪唑基，苯并呋喃基，哙啉基，吲唑基，氮茚基，酞嗪基，哒嗪基，三嗪基，异氮杂茚基，嘌呤基，恶二唑基，噻唑基，噻二唑基，呋咱基，苯并呋咱基，苯并噻吩基，苯并三唑，苯并噻唑基，苯并恶唑基，喹唑啉基，喹喔啉基，萘啶基，二氢喹啉基，四氢喹啉基，二氢异喹啉基，四氢异喹啉基，苯并呋喃基，呋喃并吡啶基，pyrolopyrimidinyl，和氮杂吲哚基。 
上述杂芳基基团可以是C连接或是N连接的(如果可能的话)。例如吡咯的基团可以是吡咯-1-基(N连接的)或是吡咯-3-基(C连接的)。 
在本发明中，双环碳环化合物是其中碳仅作为环原子的双环化合物。环结构特别可是芳香族的，饱和的，或部分饱和的。这种化合物的实例包括但不限于，茚满基，萘基，甘菊环基。 
在本发明中，氨基基团可以是基本的(-NH2)，二级的(-NHRa)，或三级的(-NRaRb)，其中Ra和Rb可以是烷基，烯基， 炔基，烷氧基，环烷基，环烷氧基，芳基，杂芳基，和双环碳环基团中的任一种。 
本发明可以使用，除非另外指出，传统的细胞培养，分子生物学，微生物，细胞生物学，和免疫学技术，这些都是本领于技术人员公知的。这些技术在文献中已有详细描述。参见，例如S ambrook et al.，1989，″Molecular Cloning：A Laboratory Man ual″，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel et al.(1995)，″Short Protocols in Molecular Biology″，John Wiley and So ns；Methods in Enzymology(几卷)；Methods in Cell Biology(几卷)，和Methods in Molecular Biology(几卷)。 
本文公开的化合物的药学可接收的盐可以用于实施本发明。这里所说的所公开的化合物的“药学可接收的盐”是将本发明的化合物与酸或碱反应形成的含有离子键的产物，适合于给受试体施用。例如含有氨基或其它碱性基团的化合物的酸式盐可以通过使所述化合物与适当的有机或无机酸，例如氯化氢，溴化氢，乙酸，过氯酸等反应获得。这种盐的其它实例包括盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，甲基磺酸盐，硝酸盐，马来酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，延胡索酸盐，酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐，(-)-酒石酸盐或其含有外消旋混合物的混合物)，琥珀酸盐，安息香酸盐以及氨基酸例如谷氨酸盐。当所述化合物含有酸性功能基团如-COOH或-SO3H的时候可以与适当的有机碱形成盐。适合于与本发明的化合物形成药学可接收的碱加成盐的碱包括无毒的并且足以和酸性功能基团反应的有机碱。这种有机碱是本领域公知的，包括氨基酸例如精氨酸和赖氨酸，单-，二-，和三乙醇胺，胆碱，单-，二-和三烷基胺，例如甲胺，二甲胺，和三甲胺，胍，N-苯甲基苯乙基氨基，N-甲基葡糖胺，N-甲基哌嗪，吗啉，乙烯二胺，三(羟甲基)氨基甲烷等。 
这里所说的“药物组合物”是含有本文公开的化合物和药学可接收的稀释剂或载体的制剂，制备成适合于给受试体施用的形式。所述药物组合物可以是散装的或者制成单位剂量形式。单位剂量形式可以是任何不同的形式，包括，例如，胶囊，IV袋，片剂，喷雾剂中的单向泵，或小瓶。单位剂量的组合物中的活性成分(即所公开的化合物或其盐的制剂)的量是有效量，根据特定的治疗可以不同。应当认识到有必要根据受试体的年龄和情况对剂量进行常规的变化。剂量还取决于给药的方式。预期的不同方式包括局部，口服，肺部，直肠，阴道，肠胃外，包括经皮，皮下，静脉内，肌肉内，腹膜内和鼻内。 
这里所说的所述组合物，和其药学可接收的盐可以与药学可接收的载体或稀释剂一起用于制备药物制剂。合适的药学可接收的载体包括惰性固体填充剂或稀释剂以及无菌水溶液或有机溶剂。所述化合物在这种药物组合物中的量足以提供本文所述范围内的所需剂量。本发明的所述化合物的制备方法和给药方法如Rerziragton：tlae Science and Practice of Plaarmacy，19th editio n，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1995)所述。 
这里所说的“受试体”包括哺乳动物，例如人，伴侣动物(例如狗，猫，鸟等)，畜养动物(例如牛，羊，猪，马，家禽等)和实验室动物(例如大鼠，小鼠，豚鼠等)。在本发明的方法的优选实施方案中，所述受试体是人。 
本文所述的本发明的化合物的“治疗有效量”是指当给予需要治疗的受试体的时候，可以促进受试体的预后，例如延迟与真菌感染有关的一种或多种受试体症状的发作和/或降低其严重性的量。给予受试体的所述化合物的量取决于特定的疾病，给药的模式，受试体的特征，例如一般健康状况，其它疾病，年龄，性别，基因型，体重和药物耐受性。技术人员可以根据这些因素和 其它因素确定合适的剂量。所述化合物的有效量典型地在每天大约0.1mg/kg体重到每天大约1000mg/kg体重之间，优选在每天大约1mg/kg体重到每天大约100mg/kg体重之间。 
本发明是基于发现了α-银环蛇毒素敏感的受体，当它暴露于该受体的激动剂的时候，可以抑制巨噬细胞释放促炎性细胞因子，否则所述巨噬细胞受到刺激会释放炎性细胞因子。具有这种抑制作用的受体是α7受体。因此，如果巨噬细胞受到例如细菌脂多糖(LPS)的刺激可以释放促炎性细胞因子，那么用α7受体的激动剂处理巨噬细胞可以抑制巨噬细胞释放促炎性细胞因子，特别是TNF。 
相应地，在一些实施方案中，本发明涉及抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的方法。所述方法包括用足量的能减少所述细胞释放的促炎性细胞因子的量的胆碱能激动剂处理细胞，其中所述胆碱能激动剂对α7烟碱受体是选择性的。 
这里所说的细胞因子是一种由哺乳动物细胞天然产生的可溶性蛋白或肽，其在体内可以微摩尔到皮摩尔量级作为体液调节剂。细胞因子在正常情况或病理情况下可以调节单个细胞或组织的功能活性。促炎性细胞因子是一种能引起任何下述与炎症有关的生理反应的细胞因子：血管舒张，充血，脉管渗透性增加并伴随水肿，粒细胞与单核吞噬细胞的积聚，或者纤维蛋白沉淀。在一些情况下，所述促炎性细胞因子还可引起细胞凋亡，例如慢性心力衰竭，其中TNF刺激了心肌细胞的凋亡(Pulkki，1997；Ts utsui et al.，2000)。促炎性细胞因子的非限制性实例是肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-18，干扰素γ，HMG-1，血小板激活因子(PAF)，和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)。在本发明的优选实施方案中，所述能通过胆碱能激动剂处理受到抑制的促炎性细胞因子是TNF，IL-1，IL-6，IL- 18，这是由于这些细胞因子是由巨噬细胞产生的并介导多种重要疾病的有害状况，所述疾病例如内毒素性休克，哮喘，风湿性关节炎，炎性胆囊疾病，心力衰竭，和同种异体移植物排斥。在最优选的实施方案中，所述促炎性细胞因子是TNF。 
促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子如IL-4，IL-10，和IL-13不同，后者不能介导炎症。在优选的实施方案中，抗炎性细胞因子的释放不受到胆碱能激动剂的抑制。 
在一些例子中，在炎性细胞因子级联中产生促炎性细胞因子，在本文中称为在哺乳动物体内释放至少一种促炎性细胞因子，其中所述细胞因子的释放影响所述哺乳动物的生理状况。因此，在本发明的实施方案中，在促炎性细胞因子的释放引起严重的生理状况的情况下，炎性细胞因子级联被抑制。 
任何能产生促炎性细胞因子的哺乳动物细胞都可用于本发明。非限制性实例是单核细胞，巨噬细胞，肥大细胞，嗜中性粒细胞，上皮细胞，成骨细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞，和神经细胞。在优选的实施方案中，所述细胞是巨噬细胞。 
这里所说的“α7胆碱能受体”是含有α7亚基的受体。所述受体可以只含有α7亚基；或者所述受体可以含有α7亚基和其它胆碱能受体亚型的亚基。在一个实施方案中，所述受体是同五聚体。在另一个实施方案中，所述受体是异五聚体。 
这里所说的“α7胆碱能受体激动剂”是一种能与含有α7亚基的受体在体内或体外结合的化合物，其能诱导所述受体行使其生理学功能。在一个实施方案中，胆碱能受体激动剂抑制能表达含有α7亚基的胆碱能受体的细胞释放促炎性细胞因子，否则所述细胞受到刺激可释放所述促炎性细胞因子。技术人员可以用任 何公知的方法确定任何特定的化合物是否是α7受体激动剂，例如下述实施例1中所提供的方法。 
在意指胆碱能激动剂对于促炎性细胞因子的释放或炎性细胞因子剂量的作用，或者迷走神经刺激对于炎性细胞因子级联的作用的时候，使用术语“抑制”或“减少”包括至少少量但是可检测到的促炎性细胞因子释放的减少。在优选的实施方案中，所述促炎性细胞因子的释放与未处理的对照相比被抑制至少20％；在更优选的实施方案中，所述抑制至少是50％；在更优选的实施方案中，所述抑制至少是70％，在最优选的实施方案中，所述抑制至少是80％。在体内实施方案中，这种促炎性细胞因子释放的减少能够减少炎性细胞因子剂量的有害作用。 
任何α7激动剂，现在已知的或是以后发现的，应当能够抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子。在优选的实施方案中，所述胆碱能激动剂在可用浓度对细胞没有毒性。在更优选的实施方案中，所述胆碱能激动剂在体内用于治疗，或者由哺乳动物细胞天然产生。非限制性实例包括乙酰胆碱，蕈毒碱，烟碱，3-2，4-二甲氧基苯亚甲基anabaseine(DMXB-A，也称为GTS-21)(Kem et al.，1997；Simosky et al.，2001)，胆碱，甲碘化可卡因(Francis et al.，2001)。 
在最优选的实施方案中，所述胆碱能激动剂是对α7选择性或特异性的激动剂，这种激动剂对于正在进行炎症治疗的受试体来说比非特异性的胆碱能激动剂(例如烟碱)引起的副作用较小。如这里所说的，如果该激动剂是一种比激活至少一种其它烟碱受体更大程度地激活α7的激动剂，那么该激动剂是对α7选择性的。这种激活上的差别可以通过比较用任何已知方法对各种受体的激活来检测，例如用体外受体结合检测，例如由NovaScreen Bi osciences Corporation(Hanover，MD)生产的，或者用WO02/4417 6(α4β2检测)，美国专利序列号6,407,095(所述神经节受体的外周烟碱受体)，美国专利申请序列号2002/0086871(标记配体与由所述受体转染的GH4Cl细胞制备而得的膜结合)，美国专利申请序列号2002/0086871(α1和α4)，和WO 97/30998中所述的方法。确定对α7受体选择性的激动剂的方法见参考文献：美国专利5,977,144(表1)，WO 02/057275(p 41-42)和Hollada y et al.(1997)。在此引入其全文作为参考。其它烟碱受体的检测是所述领域技术人员公知的。 
在优选的方法中，在给予激动剂以后表达α7受体亚型或另一种受体亚型(例如α4β2)的爪蟾卵母细胞的结合或活性(电流反应)。能导致更强激活α7受体亚型的激动剂确定为α7选择性激动剂。用任何上述方法或等同的方法，优选所述选择性α7激动剂激活α7受体比至少一种其它烟碱受体强至少两倍，更优选至少五倍，更优选至少10倍，最优选至少50倍。 
如果激动剂对α7受体的激活与任何其它烟碱受体相比达到最大程度(即至少10倍，优选至少20倍，更优选至少50倍)，那么该激动剂是对α7特异性的。最优选地，所述特异性激动剂不以任何可检测到的程度(即在良好控制的对照种相对于未处理的受体显著性为P＝0.05)激活另一种烟碱受体。特异性α7激动剂的非限制性实例是DMXB-A(化合物(V)和甲碘化可卡因)。 
在一些实施方案中，所述烟碱胆碱能激动剂是一种具有通式I的化合物： 
Figure BSA00000666376400371
其中R代表氢或甲基， 
n代表0或1； 
或其药学可接收的盐。在特别优选的实施方案中所述烟碱胆碱能激动剂是(-)-螺[1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，5′-恶唑烷-2′-酮](化合物(VII))。通式I的化合物的制备方法如美国专利序列号5,902,814中所述，在此引入其全文作为参考。 
在其它实施方案中所述烟碱胆碱能激动剂是通式II的化合物： 
Figure BSA00000666376400381
其中 
m是1或2； 
n是0或1； 
Y是CH，N或NO； 
X是氧或硫； 
W是氧，H2或F2； 
A是N或C(R2)； 
G是N或C(R3)； 
D是N或C(R4)； 
条件是A，G和D中不超过一个是氮，但是Y，A，G和D中至少一个是氮或NO； 
R1是氢或C1-C4烷基； 
R2，R2和R4独立地是氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C 2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN，-NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3，或者R2和R3，R3和R4分别一起形成另一个共享A和G或G和D、分别含有零到两个氮原子、并被一种或两种下述取代基取代的六元芳香环或者杂芳环：独立地氢，卤素，C1-C4烷基，C2-C4烯基，C2-C4炔基，芳基，杂芳基，OH，OC1-C4烷基，CO2R1，-CN，-NO2，-NR5R6，-CF3或-OSO2CF3； 
R5和R6独立地是氢，C1-C4烷基，C(O)R7，C(O)NHR8，C(O)OR9，SO2R10或一起构成(CH2)jQ(CH2)k，其中Q是O，S，NR11， 
或一个键； 
j是2到7； 
k是0到2； 
R7，R8，R9，R10，R11独立地是C1-C4烷基，芳基，或杂芳基，或其对映异构体。 
或其药学可接收的盐。在优选的实施方案中，胆碱能激动剂是一种具有通式II的化合物，其中m是1；n是0；p是0；x是氧；A是C(R2)；G是C(R3)；D是C(R4)。在特别优选的实施方案中，所述烟碱胆碱能激动剂是(R)-(-)-5′-苯基螺[1-氮杂双环[2.2. 2]辛烷-3，2′-(3′H)-呋喃并[2，3-b]吡啶]。通式II的化合物的制备方法如美国专利序列号6,110,914所述，在此引入其全文作为参考。 
在另外的实施方案中所述烟碱胆碱能激动剂是通式III的化合物： 
Figure BSA00000666376400401
其中R1，R6和R7是氢或C1-C4烷基；R2选自下组 
Figure BSA00000666376400402
其中R3，R4和R5选自氢，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C4烷基，任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C6烷氧基，在烷氧基上具有1到4个碳的烷氧羰基，氨基，在酰基上具有1到 4个碳的酰氨基，氰基，和在每个烷基上具有1到4个碳的二烷基氨基，卤素，羟基或硝基。 
在优选的实施方案中，激动剂是通式III的化合物，其中R2与四氢吡啶环的3-位置相连，进一步其中与苯环的4-或2-位置相连的R3选自下组：氨基，羟基，氯，氰，二甲基氨基，甲基，甲氧基，乙酰氨基，乙酰氧基，和硝基。在一个特别优选的实施方案中，所述激动剂是通式III的化合物，其中R3是羟基，其中R1，R4和R5是氢。在另一个特别优选的实施方案中，所述激动剂是通式III的化合物，其中R3是乙酰氨基，其中R1，R4和R5是氢。在另一个特别优选的实施方案中，所述激动剂是通式III的化合物，其中R3是乙酰氧基，其中R1，R4和R5是氢。在另一个特别优选的实施方案中，所述激动剂是通式III的化合物，其中R3是甲氧基，其中R1，R4和R5是氢。在另一个特别优选的实施方案中，所述激动剂是通式III的化合物，其中R3是甲氧基，其中R1和R4是氢，进一步其中R3与苯环的2-位置相连，与苯环的4-位置相连的R5是甲氧基或羟基。在特别优选的实施方案中，所述烟碱胆碱能激动剂选自3-2，4-二甲氧基苯亚甲基anabaseine(DMXB-A，化合物(V))，3-(4-羟基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-甲氧基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-氨基苯亚甲基)anabaseine，3-(4-羟基-2-甲氧基苯亚甲基)anabaseine(化合物(VI))，3-(4-甲氧基-2-羟基苯亚甲基)anabaseine，反-3-亚肉桂基anabaseine，反-3-(2-甲氧基-亚肉桂基)anabaseine和反-3-(4-甲氧基亚肉桂基)anabaseine。制备通式III的化合物的方法如美国专利序列号5,977,144所述，在此引入其全文作为参考。 
在另一个实施方案中，所述激动剂是通式IV的化合物： 
Figure BSA00000666376400421
其中X是O或S；并且 
R选自H，OR1，NHC(O)R1，和卤素，其中R1是氢或C1-C4烷基。在特别优选的实施方案中所述烟碱胆碱能激动剂选自N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-羟苯氧基)苯甲酰胺，N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-乙酰氨基苯氧基)苯甲酰胺，N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(苯基硫基)苯甲酰胺，和N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(3-氯苯基磺酰基)苯甲酰胺。制备通式IV的化合物的方法如PCT专利申请公开号WO 01/85727所述，在此引入其全文作为参考。 
在另一个实施方案中，所述激动剂是(1-氮杂-双环[2.2.2]辛-3-基)-氨基甲酸1-(2-氟苯)-乙酯。制备该化合物的方法如美国专利申请公开号2002/0040035中所述，在此引入其全文作为参考。 
在另一个实施方案中，α7激动剂是α7烟碱受体的选择性激动剂(更优选是特异性激动剂)的抗体。所述抗体可以是多克隆或单克隆；可以来自人，非人的真核生物，细胞，真菌或细菌；可以是由基因组或载体编码序列编码；可以在使用或不使用佐剂的情况下结合天然的或重组的α7或其片段，可通过本领域熟知的各种方法和工艺产生和生产抗体。可用抗体的其它实例包括但 不限于嵌合的，单链的，和各种人的或人化的抗体，以及它们的片段例如Fab片段和由专门的表达系统产生的片段。 
本发明还涉及抗体，其是α7激动剂，如上所述。 
产生α7烟碱受体的抗体的方法的一个非限制性的实例是用α7受体或其片段免疫合适的实验室动物，通过与α7结合的免疫作用分离释放出的抗体。免疫和分离步骤是本领域普通技术人员熟知的。作为激动剂的抗体可以用本文公开的方法鉴别，例如使分离的抗体与已受到刺激释放促炎性细胞因子的巨噬细胞混和，或者通过能评价α7受体活性的任何其它适当的方法鉴别。对细胞因子释放的抑制表示具有激动剂活性。对α7的选择性可以通过检测对至少一种其它烟碱或胆碱能受体的活性来评价，如前所述。已确定是α7受体的选择性激动剂的抗体可以进一步评价其治疗一种或多种本文所述的炎性疾病的功效，例如在动物模型中另外进行体外检测或体内检测。本发明还包括用此方法鉴别的α7选择性抗体激动剂。 
本发明可用于研究培养的细胞，例如研究炎性细胞因子释放对于巨噬细胞生物学的作用，或者检测化合物的胆碱能激动剂活性。但是体内的应用具有许多优选的实施方案。在那些实施方案中，细胞是患有由炎性细胞因子级联介导的疾病或具有其患病危险的受试体中的细胞。这里所说的受试体可以是任何哺乳动物。但是，在优选的实施方案中，所述受试体是人。 
因此，在一些实施方案中，本发明涉及在受试体中抑制炎性细胞因子级联的方法。所述方法包括用足量的能抑制炎性细胞因子级联的胆碱能激动剂治疗所述受试体，其中所述受试体患有由炎性细胞因子级联介导的疾病或具有其患病危险。优选地，所述胆碱能激动剂对α7烟碱受体是选择性的。 
对任何由炎性细胞因子级联介导的疾病的治疗都在本发明的范围之内。在优选的实施方案中，所述疾病是其中炎性细胞因子级联受到巨噬细胞释放促炎性细胞因子的影响的疾病。所述疾病可以是其中炎性细胞因子级联引起系统性反应，例如脓毒性休克的疾病。另外，所述疾病可以由局部炎性细胞因子级联介导，例如风湿性关节炎。 
可用本发明治疗的疾病的非限制性实例包括那些在说明书的背景技术部分列举的疾病。优选地，所述疾病是阑尾炎，消化器官，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，急性或缺血性肠炎，憩室炎，会厌炎，弛缓不能，胆管炎，胆囊炎，肝炎，克罗恩氏病，肠炎，惠普尔病，哮喘，变态反应，过敏性休克，免疫复合体疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，高烧，嗜伊红细胞肉芽肿，肉芽肿病，肉样瘤，脓毒性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道炎，支气管炎，肺气肿，鼻炎，囊肿性纤维化，局限性肺炎，黑肺病(pneumoultramicroscopic silicovolcanoconiosis)，alvealiti s，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，窦炎，流行性感冒，呼吸道合胞病毒，疱疹，散播菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，水泡囊，烧伤，皮炎，皮肌炎，晒斑，风疹，疣，水疱，血管炎，angiitis，心内膜炎，动脉炎，动脉硬化症，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，动脉周炎，风湿热，阿尔茨海默病，乳靡泄，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，脑膜炎，脑炎，多发性硬化，大脑梗塞，大脑栓塞，guillame-barre综合症，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，葡萄膜炎，关节炎，关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特式病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎，滑膜炎，重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑狼疮，古德帕斯丘综合征，白塞氏综合症，同种异体移植物排斥，移植 物抗宿主症，I型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger病，II型糖尿病，僵直性脊椎炎，Berger病，和瑞特综合症，或何杰金氏病。 
在另外的实施方案中，所述疾病是上述列举的任何疾病，条件是该疾病不是溃疡性结肠炎，中风，II型糖尿病，克罗恩氏病，阿尔茨海默病或炎性皮肤疾病。 
在一个实施方案中，所述疾病是阑尾炎，消化器官，胃或十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，肝炎，克罗恩氏病，哮喘，变态反应，过敏性休克，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，脓毒性流产，散播菌血症，烧伤，阿尔茨海默病，乳靡泄，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，大脑梗塞，大脑栓塞，脊髓损伤，瘫痪，同种异体移植物排斥或移植物抗宿主症。在一个实施方案中，所述疾病是脓毒症。 
在另一个实施方案中，所述疾病是阑尾炎，消化器官，胃或十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，肝炎，哮喘，变态反应，过敏性休克，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，脓毒性流产，散播菌血症，烧伤，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，大脑梗塞，大脑栓塞，脊髓损伤，瘫痪，同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病。在一个实施方案中，所述疾病是脓毒症。 
在另一个实施方案中，所述疾病选自腹膜炎，胰腺炎，器官缺血，再灌注损伤，脓毒症，内毒素性休克，恶病体质，烧伤，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，牛皮癣，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，和同种异体移植物排斥。 
在另一个实施方案中，所述疾病选自腹膜炎，胰腺炎，脓毒症，内毒素性休克，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，心肌缺血，同种异体移植物排斥，哮喘，移植物抗宿主病，充血性心力衰竭和囊肿性纤维化。 
这些疾病优选用化合物I-VII中的任何一种或其药学可接收的盐治疗。 
胆碱能激动剂的给药方式取决于要治疗的疾病。例如静脉注射优选用于治疗系统性疾病例如脓毒性休克，口服给药优选用于治疗胃肠疾病例如胃溃疡。给药的方式和所给予胆碱能激动剂的剂量可由所属领域技术人员用标准的剂量-反应研究确定，而无需过度的实验。进行确定的时候要考虑有关的环境，包括要治疗的疾病，给药组合物的选择，受试体个体的年龄，体重和反应，以及受试体症状的严重程度。因此，依赖于所述疾病，胆碱能激动剂可以口服，肠胃外，鼻内，阴道，直肠，向舌，舌下，脸颊，脸颊内和经皮肤给药给受试体。 
相应地，设计用于口腔，向舌，舌下，脸颊，脸颊内给药的胆碱能激动剂组合物可以用本领域公知的方法制备而无需过度的试验，例如用惰性稀释剂或用可食用载体。所述组合物可以包裹在明胶胶囊中或压缩成片剂。为口服治疗给药的目的，本发明的药物组合物可以与赋形剂混合，制成片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，薄膜，口香糖等。 
片剂，丸剂，胶囊，锭剂等还可以含有粘合剂，赋形剂，崩解剂，润滑剂，甜味剂，调味剂。粘合剂的一些实例包括维晶纤维素，黄蓍胶或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。崩解剂的实例包括褐藻酸，玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的一个实例是胶体二氧化硅。甜味剂的一些实例 包括蔗糖，糖精等。调味剂的一些实例包括薄荷，甲基水杨酸盐，橙调味料等。用于制备这些不同的组合物的物质应当是药物纯的，并且所使用的量应当是无毒的。 
本发明的胆碱能激动剂组合物可以容易地通过肠胃外给药，例如静脉内，肌肉内，脊髓内或皮下注射。肠胃外给药可以将本发明的胆碱能激动剂组合物制成溶液或悬液进行。这种溶液或悬液还可以包含无菌稀释剂例如注射水，盐溶液，不挥发性油，聚乙二醇，丙三醇，丙二醇或其它合成溶剂。肠胃外制剂还可以包括抗细菌剂例如苯甲醇或苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠和鳌合试剂例如EDTA。还可以加入缓冲液例如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐，以调整渗透压，如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以放入玻璃或塑料制作的安瓿瓶，一次性注射器或多剂量小瓶中。 
直肠给药包括将药物组合物给入到直肠或大肠中。这可以用栓剂或灌肠剂实现。栓剂制剂可以容易地用本领域公知的方法制备。例如栓剂制剂的制备可以通过将丙三醇加热至大约120℃，将胆碱能激动剂溶解于丙三醇中，加入纯净水后搅拌加热的丙三醇，将热的混合物注入到栓剂模具中。 
经皮肤给药包括胆碱能激动剂通过皮肤吸收。经皮制剂包括贴剂(例如公知的尼古丁贴片)，油膏，乳剂，凝胶，软膏等。 
本发明包括经鼻给予哺乳动物治疗有效量的胆碱能激动剂。这里所说的经鼻给药或鼻内给药包括将胆碱能激动剂给予到受试体鼻腔通道或鼻腔的粘膜上。这里所说的鼻内给予胆碱能激动剂的药物组合物包括用公知的方法制备的适于以鼻喷雾剂，滴鼻剂，悬液，凝胶，油膏，乳剂或粉末的形式给药的治疗有效量的 该激动剂。胆碱能激动剂的给药也可以通过鼻塞或鼻用棉球实现。 
如前所述，这些方法中优选的胆碱能激动剂对α7受体是选择性的或是特异性的，包括例如DMXB-A(化合物(V))，甲碘化可卡因。 
本发明还涉及确定一种化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂的方法。所述方法包括确定所述化合物是否能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子。在这些方法中，能抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的化合物是能与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂。 
这些方法优选包括用所述化合物和能刺激促炎性细胞因子级联的试剂处理哺乳动物细胞。优选试剂是细菌脂多糖(LPS)。所述化合物可以在所述试剂之前，与所述试剂同时，或在所述试剂之后给予哺乳动物细胞。优选地，所述化合物在所述试剂之前给药。参见，例如美国专利申请序列号09/855,446。 
在优选的实施方案中，确定为α7激动剂的化合物可进一步检测其激活至少一种其它烟碱受体亚型的能力，以确定所述α7激动剂是否是选择性的或特异性的。能选择性或特异性激活α7亚型的检测化合物可以进一步进行更进一步的检测，例如进一步在动物模型中进行体外检测或体内检测以进一步评价所述化合物用于治疗患有炎性疾病的受试体的适宜性。 
这些方法不仅仅限于任何要检测的特定化合物。虽然大部分胆碱能激动剂已知是小分子，α7激动剂活性也可能存在于蛋白质(例如抗体，如前所述)，寡核苷酸或其类似物(例如适配体) 或任何其它化合物中。这些方法适用于检测任何可能的α7激动剂。 
在这些方法中，所述细胞可以是任何可被诱导产生促炎性细胞因子的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞是免疫细胞，例如巨噬细胞，单核细胞，或嗜中性粒细胞。在最优选的实施方案中，所述细胞是巨噬细胞。 
用于测量其受到抑制的促炎性细胞因子可以是任何能被诱导从细胞中释放的促炎性细胞因子。在优选的实施方案中，所述细胞因子是TNF。 
可以用任何已知的方法评价细胞因子产生的抑制，包括细胞因子的定量测定(例如用ELISA)，或者通过生物检测，(例如测定促炎性细胞因子活性是否降低)，或者通过测量促炎性细胞因子mRNA。技术人员可以使用这些检测方法而无需过度的实验，参见美国专利申请序列号09/855,446中几种可用于这方面的检测。 
这些方法可以在体内进行，其中动物，例如大鼠用所述化合物和能刺激促炎性细胞因子级联的试剂一起处理，通过例如检测血清TNF水平来检测所述试剂对促炎性细胞因子级联的诱导作用。但是，由于用细胞培养物进行这些类型的检测比用完整的动物更容易，所述方法优选在体外进行，例如使用巨噬细胞培养物。 
在相关的实施方案中，本发明涉及确定一种化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂的方法。所述方法包括确定所述化合物是否降低了胆碱能激动剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力。在这些实施方案中，能降低胆碱能激动 剂的抑制哺乳动物细胞释放促炎性细胞因子的能力的化合物是能与α7烟碱受体反应的胆碱能拮抗剂。 
这些方法优选包括用所述化合物和α7激动剂以及能刺激促炎性细胞因子级联的试剂一起处理哺乳动物细胞。因此这些方法基本上类似于上述的方法，除了前述检测中的化合物是能抑制受到所述试剂诱导的细胞释放促炎性细胞因子的α7激动剂。对检测化合物进行评价，确定其是否能阻止α7激动剂抑制由所述试剂(例如LPS)引起的促炎性细胞因子级联。所述细胞和试剂如前述方法中所述；所述α7激动剂可以是任何非特异性的，选择性的，或特异性的α7激动剂，例如烟碱或DMXB-A。同样与前述方法相同，这些方法可以在体内进行，但是优选在体外进行。 
与前述方法相同，所述用于检测α7拮抗剂活性的化合物不限于小分子化合物，可以包括任何化合物，包括蛋白质，寡肽，或寡肽类似物。同样与前述方法相同，通过检测细胞因子产生的抑制评价所述检测化合物的功效，可以用任何已知的方法，包括细胞因子的定量测定(例如用ELISA)，或者通过生物检测，(例如测定促炎性细胞因子活性是否降低)，或者通过测量促炎性细胞因子mRNA。技术人员可以使用这些检测方法而无需过度的实验。 
在其它实施方案中，本发明涉及确定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法。在一些方面，这些方法包括确定所述检测化合物是否是能与α7烟碱受体反应的胆碱能激动剂。优选所述方法进一步包括通过检测所述检测化合物激活至少一种其它烟碱受体的能力来确定所述检测化合物对α7是否是选择性的。这些测定可以如前所述进行，例如通过测定所述化合物是否能抑制哺乳动物细胞，优选巨噬细胞释放促炎性细胞因子。 
在其它方面，所述测定检测化合物是否具有抑制炎症的能力的方法包括测定所述检测化合物是否能抑制拮抗剂与α7烟碱受体的结合，例如通过测定所述检测化合物是否能抑制巨噬细胞中FITC-α-银环蛇毒素的结合。参见实施例1，在一些实施方案中所述方法可使用α-银环蛇毒素染色和共焦显微镜方法，除了加入所述检测化合物以测定所述化合物是否能抑制α-银环蛇毒素与巨噬细胞的结合。 
在一些情况下希望能够限制哺乳动物细胞的抑制促炎性细胞因子释放的能力。这种情况的实例是当希望促炎性细胞因子能够防止癌症或者抵抗癌症的时候，或者当研究α7受体的生理作用的时候。因此本发明还涉及抑制哺乳动物细胞在所述细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中促炎性细胞因子的释放的减少的方法。所述方法包括用能抑制胆碱能激动剂与α7受体的结合的试剂处理所述细胞。与前述方法相同，这些方法中优选的细胞是巨噬细胞。 
技术人员能够预见有几种使胆碱能激动剂与细胞上的α7受体结合的途径可受到抑制。其实例包括用α7拮抗剂处理所述细胞；用能与α7受体结合的抗体或适配体处理所述细胞，防止胆碱能激动剂与所述受体的结合；或者，优选地，用能与α7mRNA互补的并能抑制该mRNA翻译成α7受体的反义寡核苷酸或其模拟物处理细胞。参见实施例1可以证明这种反义模拟物的效果。这里所说的模拟物是一种寡核苷酸类似物，其在化学上与天然的寡核苷酸不同，但是能以类似于寡核苷酸的方式与互补的核苷酸序列非共价结合。参见，例如美国专利6,436,909，其中有关于可用的模拟物的讨论。在优选的实施方案中，所述试剂是硫代磷酸酯寡核苷酸模拟物，与相关的α7基因互补。在Peng et al.，1994中给出了α7基因。有效的反义序列的实例是5′-gcagcgcatgttgag tcccg-3′(参见实施例1)或类似的序列，优选是人α7亚基基因翻译起始密码子周围的序列。 
因此，本发明还涉及能抑制哺乳动物巨噬细胞在所述巨噬细胞暴露于胆碱能激动剂的时候其中脂多糖诱导的TNF释放的减少的寡核苷酸或其模拟物。所述寡核苷酸或其模拟物包括大于5个核苷酸长的与α7受体的mRNA互补的序列。优选地，所述寡核苷酸或模拟物与α7mRNA的转录起始区域互补。最优选地，所述寡核苷酸或模拟物包括序列5′-gcagcgcatgttgagtcccg-3′。 
本发明的优选实施方案将在下述实施例中描述。根据说明书的描述或本发明的实践，权利要求保护范围内的其它实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。应当理解说明书，以及实施例仅仅是在由实施例后面的权利要求所表示的本发明的范围和精神范围内的示例性描述。 
实施例1.α7烟碱受体作为神经免疫突触的分子底物
实施例概述 
这里我们发现了乙酰胆碱对巨噬细胞TNF释放的抑制需要有烟碱受体α7亚基。α-银环蛇毒素与初级人巨噬细胞表面表达的不连续的受体簇相结合。与α7特异性抗体的免疫杂交证明了通过α-银环蛇毒素结合的珠子的粘附分离的蛋白质中α7亚基的同一性。将巨噬细胞暴露于α7反义寡核苷酸会减少α-银环蛇毒素的结合并且在存在烟碱的条件下能恢复TNF的释放。缺少烟碱受体α7亚基的小鼠与野生型小鼠相比，在内毒素血症期间产生显著更多的TNF，IL-1β和IL-6。从α7剔除小鼠中分离的巨噬细胞对胆碱能激动剂没有反应，继续产生TNF。结果，用在野生型小鼠中能抑制TNF释放的方法对迷走神经进行电刺激不能抑 制α7缺陷型小鼠中的TNF释放。因此，烟碱乙酰胆碱受体α7亚基对于促炎性细胞因子的胆碱能抑制是必需的。 
结果和讨论 
在促炎性细胞因子释放的抑制中鉴别巨噬细胞受体的第一步是用FITC-α-银环蛇毒素，一种能结合胆碱能受体子集的肽拮抗剂对初级人巨噬细胞进行标记(Lindstrom，1995；Leonard & Bertrand，2001)。观察到α-银环蛇毒素在巨噬细胞表面的强烈结合(图1a)。进行烟碱预处理显著降低了结合的强度(图1b)。在神经肌肉连接处和神经元突触处，烟碱受体形成受体聚合体或受体簇，促进了快速信号传递(Lin et al.，2001；Feng et al.，1998；Shoop et al.，2000)。在更高的放大倍数下在巨噬细胞表面可以清楚观察到不连续的α-银环蛇毒素簇的结合，特别是集中在细胞体表面(图1c，d)。 
到目前为止，α1，α7和α9是已知的人细胞中α-银环蛇毒素结合的烟碱受体亚基(Lindstrom，1995；Leonard and Bertrand，2001)。α1和β1，δ以及ε(成人)或γ(胎儿)亚基一起形成异五聚体的烟碱受体，调节肌肉收缩；α7和α9每个形成同五聚体的烟碱受体(Lindstrom，1995；Leonard and Bertrand，2001)。为了确定这些受体亚基是否在巨噬细胞中表达，我们从外周血单核细胞(PBMC)体外分化得到的初级人巨噬细胞中分离RNA并进行RT-PCR分析。为了增加实验的灵敏度和特异性，我们用对每个亚基特异的巢式引物在逆转录后进行了两轮PCR。通过测序验证PCR产物的同一性。在来自不相干血液供体的人巨噬细胞中检测到α1，α10(数据未显示)和α7(图2a)mRNA的表达。用同样的RT-PCR策略在巨噬细胞中没有检测到α9亚基mRNA的表达(数据未显示)。 
接下来用western blotting检测α1和α7亚基的蛋白表达。在两个分化的初级巨噬细胞和未分化的PBMC中用α7特异性抗体都识别出一个清晰的条带，其分子量大约是55kD(与已公开的α7蛋白的分子量类似[Peng et al.，1994；Drisdel and Green，20 
00])(数据未显示)。在PBMC体外分化成巨噬细胞的过程中，α1受到负调控至检测不到的水平(数据未显示)。δ亚基，一种α1异五聚体烟碱乙酰胆碱受体所必需的组分用这种巢式RT-PCR策略检测不到(数据未显示)。为了验证巨噬细胞中的阳性信号是代表与α-银环蛇毒素结合的α7烟碱受体，我们用α-银环蛇毒素结合珠粘附由人巨噬细胞或PC 12细胞(大鼠嗜铬细胞瘤细胞，已知能表达α7同五聚体[Drisdel and Green，2000])制备而得的蛋白。用western blotting用能识别人和大鼠α7蛋白的多克隆或单克隆α7特异性抗体(人和大鼠的α7蛋白含有相同数目的氨基酸，具有94％的相同性[Peng et al.，1994；Seguela et al.，1993])分析保留的蛋白。从结果明显看出人巨噬细胞表达α-银环蛇毒素结合的α7蛋白，其分子量与PC 12细胞的α7亚基类似(图2b)。用RT-PCR方法克隆全长的巨噬细胞表达的α7以验证巨噬细胞α7亚基的同一性。巨噬细胞中的全长烟碱乙酰胆碱α7亚基包括外显子1到10，与神经元中表达的烟碱乙酰胆碱α7亚基相同(Gault et al.，1998)。总的来说，这些数据确定了烟碱乙酰胆碱α7亚基就是人巨噬细胞表面表达的α-银环蛇毒素结合的受体。 
为了研究α7受体是否是TNF释放的胆碱能抑制所必需的，我们合成了人α7亚基基因的翻译起始密码子周围的硫代磷酸酯反义寡核苷酸。合成α1和α10亚基基因的类似区域的反义寡核苷酸作为对照。暴露于α7特异的反义寡核苷酸(ASα7)中的巨噬细胞对烟碱的TNF抑制作用的反应显著地减小(图3a)。在存在烟碱的条件下烟碱乙酰胆碱α7亚基的反义寡核苷酸恢复了巨噬细胞TNF的释放。在缺乏LPS和烟碱的条件下，巨噬细胞暴露 于ASα7中不能刺激TNF的合成。α1(ASα1)和α10(ASα10)亚基的反义寡核苷酸，在相似条件下，不能显著改变烟碱对于L 
PS诱导的TNF释放的作用(图3b，c)，表明烟碱对于TNF的抑制作用是对烟碱乙酰胆碱受体α7亚基特异性的。其它α7，α1和α10的反义寡核苷酸也具有类似的效果(数据未给出)。向巨噬细胞培养基中加入烟碱乙酰胆碱α7亚基反义寡核苷酸可以减少FITC-标记的α-银环蛇毒素的表面结合(图3d，e)。综合这些数据表明烟碱乙酰胆碱受体α7亚基烟碱受体对于巨噬细胞中依赖于胆碱能抗炎性途径的TNF释放的抑制来说是必需的。 
巨噬细胞是在体内对细菌内毒素反应时产生的TNF的主要来源(Bianchi et al.，1995；Kumins et al.，1996)。为了研究烟碱乙酰胆碱受体α7亚基对于体内的胆碱能抗炎性途径是否是必需的，我们检测了通过基因剔除技术产生的α7基因缺陷型的小鼠中产生的TNF(Orr-Urtreger et al.，1997)。缺少α7受体亚基的小鼠发育正常，总体上没有表现出解剖学缺陷(Id.；Frances chini et al.，2000)。暴露于内毒素的α7亚基缺陷型小鼠中的血清TNF水平比野生型对照小鼠高5倍(野生型血清TNF＝2.3±0.3ng ml-1，α7剔除小鼠的血清TNF＝12.2±4.7ng ml-1，p＜0.05(双尾t检验))(图4a)。剔除小鼠的肝和脾中产生的TNF也较高(图4b，c)，表明烟碱乙酰胆碱受体α7亚基对于体内炎性反应的调节具有重要作用。内毒素血症的α7亚基缺陷型的小鼠与野生型小鼠相比也产生显著更高水平的IL-1β(图4d)和IL-6(图4e)。来自α7亚基剔除的小鼠的巨噬细胞能抵抗胆碱能激动剂，在存在烟碱或乙酰胆碱的时候也能正常产生TNF(表1)。因此烟碱乙酰胆碱受体α7亚基在巨噬细胞中的表达对于TNF的胆碱能调节是必需的。 
表1.野生型和α7-缺陷型腹膜巨噬细胞的TNF产生 
从硫乙醇酸盐诱导的野生型小鼠或烟碱乙酰胆碱受体α7亚基剔除小鼠分离的腹膜巨噬细胞用LPS(100ng/ml)在培养基中刺激4小时。对照：未刺激的巨噬细胞培养基。需要指出，烟碱或乙酰胆碱(Ach)在LPS之前5-10分钟加入。用ELISA检测TNF水平；数据显示为平均值±s.e.m.每组n＝8。*＝与LPS具有显著性差异，p＜0.05，双尾t检验结果。 
为了确定烟碱乙酰胆碱受体α7亚基是否是系统性TNF的迷走神经抑制所必需的，我们对内毒素血症的野生型或α7亚基缺陷型小鼠的迷走神经进行电刺激(Borovikova et al.，2000)。对迷走神经的电刺激在野生型小鼠中显著减少了内毒素诱导的血清TNF水平(图5)。但是，在烟碱乙酰胆碱受体α7亚基缺陷型小鼠中用这种方法进行迷走神经的刺激并不减少内毒素血症期间的血清TNF水平(图5)。因此，在体内对迷走神经刺激的功能反应需要烟碱乙酰胆碱受体α7亚基来抑制TNF释放。 
这些结果暗示对于炎症和TNF释放的调控可以有几种理解，也可以设计几种治疗方案。以前的数据表明烟碱乙酰胆碱受体α7 亚基形成参与细胞间快速化学信号传导的同五聚体受体(Lindstr om，1995；Leonard & Bertrand，2001；Le Novere & Changeux，1995)。神经元烟碱乙酰胆碱α7受体对于钙是高度渗透的(Vija yaraghavan et al.，1992；Shoop et al.，2001)，我们已经观察到烟碱在巨噬细胞中可诱导暂时的钙流量(数据未显示)。这种增加的钙流量的作用和抑制TNF释放的细胞内机制还需要进一步研究。破坏烟碱乙酰胆碱受体α7亚基在体内的表达显著增加内毒素诱导的TNF释放，使迷走神经刺激剂无效，这可作为抑制TNF释放的方法。这表明烟碱乙酰胆碱受体α7亚基的产物对于内毒素血症的系统性炎性反应期间的急性TNF释放的迷走神经调节是必需的。迷走神经末梢释放的，或者其它来源(例如淋巴细胞或者上皮细胞)的乙酰胆碱特别可抑制巨噬细胞的激活。有可能研究胆碱能激动剂，将烟碱乙酰胆碱受体α7亚基靶定于外周免疫细胞，作为抗炎性试剂抑制TNF释放。还有可能研究具有抗炎性活性的迷走神经刺激剂；类似的物质在临床上是安全的，可用于治疗一些疾病发作的受试体，因此关注能靶定烟碱乙酰胆碱受体α7亚基的TNF抑制策略是合情合理的。 
方法 
α-银环蛇毒素染色和共焦显微镜方法人巨噬细胞的分离和培养如前所述(Borovikova et al.，2000)。细胞在完全培养基(具有10％热灭活的人血清的RPMI 1640)中在存在MCSF(2ng/ml)的条件下分化七天。分化的巨噬细胞与1.5μg ml-1的FITC标记的α-银环蛇毒素(SIGMA)一起在细胞培养基中在4℃培育15分钟。在加入α-银环蛇毒素之前加入烟碱使其终浓度为500μM。用RPMI培养基(GIBCO)洗涤细胞三次，然后在4％的多聚甲醛-PB S溶液(pH 7.2)中室温固定15分钟。固定之后用PBS洗涤细胞一次，用荧光共焦显微镜观察计数。 
RT-PCR.用TRIzol试剂从体外分化的人巨噬细胞中提取总RNA。用Titan One Tube RT-PCR试剂盒(Roche Molecular Bi ochemicals)进行逆转录和第一轮PCR，根据制造商的手册操作。用Promega 2x PCR master mix进行第二轮巢式PCR。巢式PCR的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，用Gene Clean III试剂盒(Biolab)回收并进行测序以验证结果。逆转录和第一轮PCR所用的引物是：α1：有义引物5′-CCAGACCTGAGCAACTTCATGG-3′5′-AATGAGTCGACCTGCAAACACG-3′；α：有义引物5′-GACTGTTCGTTTCCCAGATGG-3′，反义引物5′-ACGAAGTTGGGAGCCGACATCA-3′；α9：有义引物5′-CGAGATCAGTACGATGGCCTAG-3′，反义引物5′-TCTGTGACTAATCCGCTCTTGC-3′。巢式PCR的引物是：α1：有义引物5′-ATCACCTACCACTTCGTCATGC-3′，反义引物5′-GTATGTGGTCCATCACCATTGC-3′；α7：有义引物5′-CCCGGCAAGAGGAGTGAAAGGT-3′，反义引物5′-TGCAGATGATGGTGAAGACC-3′；α：有义引物5′-AGAGCCTGTGAACACCAATGTGG-3′，反义引物5′-ATGACTTTCGCCACCTTCTTCC-3′。要克隆全长α7cDNA，使用下述引物：5′AGGTGCCTCTGTGGCCGCA 3′和5′GACTACTCAG-TGGCCCTG 3′；5′CGACACGGAGACGTGGAG 3′和5′GGTACGGATG-TGCCAAGGAGT 3′；5′CAAGGATCCGGACTCAACATGCGCTGCTCG 3′和5′CGGCTCGAGTCACCAGTGTGGTTACGCAAAGTC 3′。 
Western blotting和α-银环蛇毒素pull-down检测.将PC12或初级人巨噬细胞与裂解缓冲液(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH7.4，0.02％叠氮钠，1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上共培育90分钟制备得到细胞溶解物。在SD S PAGE凝胶上将等量的总蛋白与α7特异性抗体(Santa Cruz sc-1447)或α1单克隆抗体(Oncogene)进行western blotting。在 α-银环蛇毒素pull-down检测中，α-银环蛇毒素(SIGMA)与CNBr-活化的Sepharose珠(Pharmacia)结合，然后与细胞溶液物在4℃培育过夜。将珠子和结合蛋白用裂解缓冲液洗涤四次，用o7特异性抗体(多克隆：Santa Cruz H-302，单克隆：SigmaM-220)进行western blotting进行分析。 
反义寡核苷酸实验.合成硫代磷酸酯反义寡核苷酸并用Gen osys纯化。寡核苷酸序列是：ASα7：5′-gcagcgcatgttgagtcccg-3′；ASα1：5′-gggctccatgggctaccgga-3′；ASα10：5′-ccccatggccctggcactgc-3′。这些序列覆盖了α7，α1和α10基因的不同的翻译起始区域。这些反义寡核苷酸的递送如Cohen et al.(1997)所述，寡核苷酸浓度为1μM，时间为24小时。在细胞培养实验中，用所述寡核苷酸预处理的巨噬细胞培养物用新鲜培养基洗涤并用100ng ml-1LPS和烟碱(1μM，在LPS之前5-10分钟加入)进行刺激，或者不用烟碱。LPS刺激后用L929检测测定释放的TNF的量，然后用TNF ELISA进行验证。在α-银环蛇毒素染色中，洗涤预处理的细胞并进行处理，如上所述地进行FITC-α-银环蛇毒素染色。烟碱和其它烟碱乙酰胆碱受体α7亚基激动剂也能显著抑制鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7中LPS诱导的TNF释放(数据未显示)。 
α7烟碱受体缺陷型小鼠.α7烟碱受体缺陷型小鼠(C57BL/6背景)和野生型同窝出生仔鼠购自The Jackson Laboratory(B6.1297-Chrna7tmlBay，#003232)。繁殖纯合体剔除小鼠或野生型小鼠得到其后代。用大约8到12周龄的雌性和雄性小鼠(年龄和性别都与野生型对照相匹配)进行内毒素实验。将小鼠逐个称重，相应地给予0.1mg kg-1LPS(i.p.)。在TNF实验中，在给予LPS一小时后收集血液，肝和脾。在IL-1β和IL-6实验中，在给予LPS四小时后收集血液样品。用ELISA检测TNF，IL-1β和IL-6。 用基因组PCR策略验证小鼠的基因型。从大约8周龄(每组n＝8)的硫乙醇酸盐诱导的(48小时)α7剔除和野生型雄性和雌性小鼠中分离腹膜巨噬细胞。每组收集巨噬细胞并培养过夜。在加入LPS(100ng ml-1)之前5-10分钟加入烟碱和乙酰胆碱。与乙酰胆碱一起加入溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1-甲基吡啶(100μM)。LPS诱导后四个小时，用ELISA检测TNF水平。 
迷走神经刺激.α7烟碱受体缺陷型小鼠(C57BL/6背景)和年龄和性别相匹配的野生型C57BL/6小鼠用克他命(100mg kg-1，肌肉内)和甲苯噻嗪(100mg kg-1，肌肉内)进行麻醉。对小鼠施以假手术或用电刺激组件(STM100A，Harvard Apparatus)对迷走神经进行刺激(左迷走神经，1伏，2ms，1Hz)。刺激进行20分钟(给予LPS之前10分钟，之后10分钟)。给予致命量的LPS(75mg kg-1，腹膜腔内)。给予LPS之后2小时收集血液。用ELISA检测TNF水平。 
统计学分析.用双尾t检验进行统计学分析；P＜0.05则认为具有显著性。实验重复两次或三次；在体内实验或离体实验中，“n”指每种条件下动物的数目。 
实施例2：化合物(V)和(VI)在盲肠结扎和穿孔鼠模型的脓毒症中起保护作用
式(V)和(VI)的化合物在治疗盲肠结扎和穿孔鼠模型的脓毒症中特别有效。 
Figure BSA00000666376400611
3-(2，4-二甲氧基苯亚甲基)anabaseine       (V) 
Figure BSA00000666376400612
3-(4-羟基-2-甲氧基-苯亚甲基)anabaseine    (VI) 
如Fink and Heard，J.of Surg.Res.49：186-196(1990)，Wichman et al.，Crit.Care Med.26：2078-2086(1998)和Remick et al.，Shock 4：89-95(1995)所述进行盲肠结扎和穿孔(CLP)。简短来说，肌肉内施用75mg/kg克他命(Fort Dodge，Fo rt Dodge，Iowa)和20mg/kg甲苯噻嗪(Bohringer Ingelheim，St.Joseph，MO)进行麻醉。进行中线切割并分离盲肠。在距离 远离回盲瓣的盲肠末端5.0mm的位置处进行6-0聚丙烯纺织纤维缝合结扎。 
用22标准尺寸针对结扎的盲肠参与部分进行一次穿孔，不直接挤出粪便。然后将盲肠放回其在腹部内的正常位置。然后用6-0聚丙烯纺织纤维进行两层缝合封闭腹腔，即分别对腹膜和肌膜缝合以防止体液外泻。 
以20ml/kg体重给所有动物皮下给予生理盐水使其复苏。手术后给每只小鼠皮下注射imipenem(0.5mg/小鼠)(Primaxin，Merck & Co.，Inc.，West Point，PA)30分钟。然后使动物复苏。 
小鼠用4mg/kg的3-2，4-二甲氧基苯亚甲基anabaseine(化合物(V))或者4mg/kg的3-(4-羟基-2-甲氧基-苯亚甲基anabaseine(化合物(VI))以及载体对照处理。这些化合物和载体对照给予到腹腔内(i.p.)，在第1天和第2天(分别是手术后24小时和48小时)一天两次，在第3天给予一次。每天监测其死亡率直至手术后14天。结果如图6所示，其中显示了用化合物(V)，化合物(VI)或载体对照处理后存活动物的百分数。在第14天，有91％(p＜0.01)的用化合物(V)处理的小鼠和82％(p＜0.02)的用化合物(VI)处理的小鼠存活，而只有30％的用载体对照处理的小鼠存活。这些结果证明化合物(V)和化合物(VI)能显著提高脓毒症的鼠CLP模型中的存活率。 
实施例3：化合物(V)和烟碱抑制鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放
鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞(美国典型组织培养物保藏中心，Rockville，Md.，USA)在加入10％胎牛血清，青霉素和 链霉素的DMEM中培养。将细胞接种于24孔的组织培养板中的Opti-MEM 1培养基中，90％汇合。细胞用0.001，0.01，0.1，1，10或100μM的化合物(V)或烟碱(Sigma)处理。加入化合物(V)或烟碱后五分钟，将细胞用LPS(500ng/ml)处理。4小时后收集上清，用ELISA(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN的鼠ELISA试剂盒)检测TNF-α。 
结果如图7所示，证明化合物(V)与烟碱一样以剂量依赖的方式抑制RAW 264.7细胞的TNF-α释放。 
实施例4：化合物(VI)抑制鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放
鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞(美国典型组织培养物保藏中心，Rockville，Md.，USA)在加入10％胎牛血清，青霉素和链霉素的DMEM中培养。将细胞接种于24孔的组织培养板中的Opti-MEM 1培养基中，90％汇合。 
在图8A中，用0.1，1和10μM的化合物(VI)处理细胞。在与化合物(VI)预培育0.1，4或24小时后，用LPS(500ng/ml)处理细胞。4小时后收集上清，用ELISA(R & D Systems Inc.，Minneapolis，MN的鼠ELISA试剂盒)检测TNF-α。结果如图8A所示，显示为TNF-α抑制的百分数。化合物(VI)以剂量依赖的方式抑制TNF-α。 
图8B显示了图8A中预培育0小时的结果，显示为TNF-α抑制的百分数。化合物(VI)的估计IC50为0.9μM。 
实施例5：在LPS刺激之前的化合物(VI)处理抑制小鼠中的循环TNF
将C57B/6小鼠用4mg/kg化合物(VI)或载体对照进行腹膜腔内处理(i.p.)。用化合物(VI)或载体处理后5分钟，给小鼠i.p.注射100μg LPS。LPS处理后2小时处死小鼠，收集血液样品检测TNF-α。如上所述用ELISA检测TNF-α。 
如图9所示，在LPS刺激之前用化合物(VI)处理使循环TNF-α水平与用载体对照处理的小鼠相比降低了大约50％。 
实施例6：化合物(VI)在鼠DS S结肠炎中减少了结肠炎症
右旋硫酸钠诱导的(DS S)结肠炎的操作如Hove et al.，D ig.Dis，Sci.47(9)：2056-2063(2002)所述。C57B/6小鼠在其饮用水中给予3％(w/v)DSS(分子量40kDa；TdB Consultanc y，Uppsala，Sweden)，持续7天。开始给予DSS后12小时，给小鼠i.p.注射4mg/kg化合物(VI)一天两次，持续7天。第7天处死小鼠。 
小鼠死亡后收集结肠，通过中线切割摘除。测量结肠总长度，结果如图10(B)所示。结肠缩短表示结肠炎更加严重。用化合物(VI)处理的小鼠结肠比对照小鼠的结肠长度略长(p＝0.07)，表明化合物(VI)处理的小鼠的结肠炎较轻。另一个表示疾病严重程度的特征，结肠重量也进行了测量。记录结肠湿重作为炎症水肿的指标。结果如图10(A)所示。用化合物(VI)处理的小鼠的结肠与对照条件的小鼠相比重量减轻。这些结果表明化合物(VI)在鼠DSS结肠炎中减少了结肠炎症 
实施例7：化合物(VII)抑制鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞中LPS诱导的TNF-α释放
化合物(VII)在抑制TNF-α释放上显示出显著的效果。 
Figure BSA00000666376400651
(-)-螺-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，5′-恶唑烷-2′-酮 
(VII) 
鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞(美国典型组织培养物保藏中心，Rockville，Md.，USA)如实施例3所述进行培养。将细胞用0.001，0.01，0.1，1，10或100μM的(-)-螺[1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，5′-恶唑烷-2′-酮](化合物(VII))。加入化合物(VII)后5分钟，用LPS(500ng/ml)处理细胞。如上所述用ELISA检测TNF-α。 
结果如图11所示，其中证明了较高浓度的化合物(VII)抑制RAW 264.7细胞的TNF-α释放。用100μM的化合物(VII)处理的细胞中的TNF-α释放与对照细胞降低了四倍多。 
综上所述，可以看到本发明具有几个优点，也具有其它优点。 
可以对上述方法和组合物进行各种改变而不背离本发明的范围，上述说明书中所包含的所有内容以及附图中所显示的内容都是举例说明而不具有限制作用。 
说明书中所有引用的参考文献都在此引入作为参考。本文中对参考文献的讨论仅仅是作者的观点，而不应当将任何参考文献作为现有技术。申请人保留置疑所引用的参考文献的准确性和相关性的权利。 
本发明特别给出了优选的实施方案，本领域技术人员应当理解可以对其形式和细节上进行各种变化而不背离由权利要求包括的本发明的范围。 
Figure ISA00000666376600011
Figure ISA00000666376600041
Figure ISA00000666376600051
Figure ISA00000666376600061
Figure ISA00000666376600071
Figure ISA00000666376600081

Claims (19)

1.对α7烟碱受体具有选择性的胆碱能激动剂在制备治疗由促炎性细胞因子介导的疾病的药物中的应用，其中所述药物降低巨噬细胞释放的所述促炎性细胞因子的量，其中所述疾病选自阑尾炎，消化器官、胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，会厌炎，弛缓不能，胆管炎，胆囊炎，肝炎，惠普尔病，哮喘，变态反应，过敏性休克，免疫复合体疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，花粉热，脓毒症，败血病，内毒素性休克，恶病体质，高烧，嗜伊红细胞肉芽肿，肉芽肿病，肉样瘤，脓毒性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎，尿道炎，支气管炎，肺气肿，鼻炎，囊肿性纤维化，局限性肺炎，黑肺病，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，窦炎，流行性感冒，呼吸道合胞病毒感染，疱疹病毒感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，散播菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，水泡囊，烧伤，血管炎，脉管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉硬化症，血栓性静脉炎，心包炎，心肌炎，心肌缺血，动脉周炎，风湿热，乳靡泄，充血性心力衰竭，成人呼吸窘迫综合症，慢性阻塞性肺病，脑膜炎，脑炎，神经炎，神经痛，脊髓损伤，瘫痪，葡萄膜炎，关节炎，关节痛，骨髓炎，筋膜炎，佩吉特式病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎，滑膜炎，重症肌无力，甲状腺炎，系统性红斑狠疮，古德帕斯丘综合征，白塞氏综合症，同种异体移植物排斥，移植物抗宿主症，僵直性脊椎炎，Berger病，瑞特综合症和何杰金氏病。
2.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂选自甲碘化可卡因；(1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)氨基甲酸1-(2-氟苯基)-乙酯；式I的化合物：
Figure FSA00000666376300021
其中，R代表氢或甲基，和
n代表0或1；式I的化合物的药学可接受的盐；
式II的化合物：
Figure FSA00000666376300022
其中：
m是1或2；
n是0或1；
Y是CH、N或NO；
X是氧或硫；
W是氧、H2或F2；
A是N或C(R2)；
G是N或C(R3)；
D是N或C(R4)；
条件是A、G和D中不超过一个是氮，但是Y、A、G和D中至少一个是氮或NO；
R1是氢或C1-C4烷基；
R2、R3和R4独立地是氢、卤素、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、芳基、杂芳基、OH、OC1-C4烷基、CO2R1、-CN、-NO2、-NR5R6、-CF3或-OSO2CF3，或者R2和R3、R3和R4分别一起形成另一个分别共享A和G、或G和D、含有零到两个氮原子、并被一种或两种下述取代基取代的六元芳香环或者杂芳环：独立地氢、卤素、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、芳基、杂芳基、OH、OC1-C4烷基、CO2R1、-CN、-NO2、-NR5R6、-CF3或-OSO2CF3；
R5和R6独立地是氢、C1-C4烷基、C(O)R7、C(O)NHR8、C(O)OR9、SO2R10或一起构成(CH2)jQ(CH2)k，其中Q是O、S、NR11，或一个键；
j是2到7；
k是0到2；
R7、R8、R9、R10和R11独立地是C1-C4烷基、芳基或杂芳基，或其对映异构体；
式II的化合物的药学可接受的盐；
式III的化合物：
Figure FSA00000666376300041
其中R1、R6和R7是氢或C1-C4烷基；R2选自下组
Figure FSA00000666376300042
Figure FSA00000666376300051
其中R3、R4和R5选自氢、任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C4烷基、任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C6烷氧基、在烷氧基上具有1到4个碳的烷氧羰基、氨基、在酰基上具有1到4个碳的酰氨基、氰基、和在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基、卤素、羟基或硝基；
以及式IV的化合物.
Figure FSA00000666376300052
其中X是O或S；并且R选自H、OR1、NHC(O)R1和卤素，其中R1是C1-C4烷基。
3.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是式I的化合物：
其中，R代表氢或甲基，
n代表0或1；
或其药学可接受的盐。
4.权利要求3的应用，其中所述胆碱能激动剂是(-)-螺[1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，5’-噁唑烷-2’-酮]
5.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是式II的化合物：
Figure FSA00000666376300071
其中：
m是1或2；
n是0或1；
Y是CH、N或NO；
X是氧或硫；
W是氧、H2或F2；
A是N或C(R2)；
G是N或C(R3)；
D是N或C(R4)；
条件是A、G和D中不超过一个是氮，但是Y、A、G和D中至少一个是氮或NO；
R1是氢或C1-C4烷基；
R2、R3和R4独立地是氢、卤素、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、芳基、杂芳基、OH、OC1-C4烷基、CO2R1、-CN、-NO2、-NR5R6、-CF3或-OSO2CF3，或者R2和R3、R3和R4分别一起形成另一个分别共享A和G、或G和D、含有零到两个氮原子、并被一种或两种下述取代基取代的六元芳香环或者杂芳环：独立地氢、卤素、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、芳基、杂芳基、OH、OC1-C4烷基、CO2R1、-CN、-NO2、-NR5R6、-CF3或-OSO2CF3；
R5和R6独立地是氢、C1-C4烷基、C(O)R7、C(O)NHR8、C(O)OR9、SO2R10或一起构成(CH2)jQ(CH2)k，其中Q是O、S、NR11，或一个键；
j是2到7；
k是0到2；
R7、R8、R9、R10和R11独立地是C1-C4烷基、芳基、或杂芳基，
或其对映异构体；
式其药学可接受的盐。
6.权利要求5的应用，其中所述胆碱能激动剂是式II的化合物，其中m是1；n是0；p是0；x是氧；A是C(R2)；G是C(R3)和D是C(R4)。
7.权利要求5的应用，其中所述胆碱能激动剂是5’-苯基螺[1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3，2’-(3’H)-呋喃并[2，3-b]吡啶]。
8.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是式III的化合物：
Figure FSA00000666376300091
其中R1、R6和R7是氢或C1-C4烷基；R2选自下组
Figure FSA00000666376300092
其中R3、R4和R5选自氢、任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C4烷基、任选地被在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基取代的C1-C6烷氧基、在烷氧基上具有1到4个碳的烷氧羰基、氨基、在酰基上具有1到4个碳的酰氨基、氰基、和在每个烷基上具有1到4个碳的N，N-二烷基氨基、卤素、羟基或硝基。
9.权利要求8的应用，其中所述胆碱能激动剂是式III的化合物，其中R2与四氢吡啶环的3-位置相连，进一步其中与苯环的4-或2-位置相连的R3选自下组：氨基、羟基、氯、氰基、二甲基氨基、甲基、甲氧基、乙酰氨基、乙酰氧基和硝基。
10.权利要求8的应用，其中所述胆碱能激动剂是选自下组的化合物：通式III，其中R3是羟基，其中R1、R4和R5是氢；通式III，其中R3是乙酰氨基，其中R1、R4和R5是氢；通式III，其中R3是乙酰氧基，其中R1、R4和R5是氢；通式III，其中R3是甲氧基，其中R1、R4和R5是氢；通式III，其中R3是甲氧基，其中R1和R4是氢，且进一步其中R3与苯环的2-位置相连，与苯环的4-位置相连的R5是甲氧基或羟基。
11.权利要求8的应用，其中所述胆碱能激动剂选自3-2，4-二甲氧基苯亚甲基anabaseine(DMXB-A)、3-(4-羟基苯亚甲基)anabaseine、3-(4-甲氧基苯亚甲基)anabaseine、3-(4-氨基苯亚甲基)anabaseine、3-(4-羟基-2-甲氧基苯亚甲基)anabaseine、3-(4-甲氧基-2-羟基苯亚甲基)anabaseine、反-3-亚肉桂基anabaseine、反-3-(2-甲氧基-亚肉桂基)anabaseine和反-3-(4-甲氧基亚肉桂基)anabaseine。
12.权利要求10的应用，其中所述胆碱能激动剂是3-(4-羟基-2-甲氧基苯亚甲基)anabaseine
Figure FSA00000666376300111
13.权利要求10的应用，其中所述胆碱能激动剂是3-(2，4-二甲氧基苯亚甲基)anabaseine
Figure FSA00000666376300112
14.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是通式IV的化合物：
Figure FSA00000666376300113
其中X是O或S；并且
R选自H、OR1、NHC(O)R1和卤素，其中R1是C1-C4烷基。
15.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂选自N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-羟苯氧基)苯甲酰胺、N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-乙酰氨基苯氧基)苯甲酰胺、N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-苯基硫基)苯甲酰胺和N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(3-氯苯基磺酰基)苯甲酰胺。
16.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是N-[(3R)-1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基]-4-(4-苯基硫基)苯甲酰胺。
17.权利要求1的应用，其中所述胆碱能激动剂是甲碘化可卡因。
18.权利要求1的应用，其中所述疾病是脓毒症。
19.权利要求1的应用，其中所述疾病选自腹膜炎、胰腺炎、脓毒症、内毒素性休克、恶病体质、成人呼吸窘迫综合症、慢性阻塞性肺病、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和同种异体移植物排斥。
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