BR112013007501B1

BR112013007501B1 - Anticorpo humanizado anti-fator de necrose tumoral a, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112013007501B1
Application number: BR112013007501-5A
Authority: BR
Inventors: Ke Xiao; Gao Xiaoping
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd.
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2022-04-19
Also published as: KR20150092766A; JP5767708B2; CA2812430A1; KR101712874B1; CN102443063A; KR20130062366A; RU2556815C2; CA2812430C; AU2011307886C1; EP2623515B1; CN102443063B; AU2011307886A1; RU2013109392A; JP2014503177A; EP2623515A4; AU2011307886B2; US9096669B2; WO2012041018A1; BR112013007501A2; SG188987A1

Abstract

ANTICORPO ANTI-TNF-a HUMANIZADO E SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO (Fab) E USO DO MESMO. A presente invenção revela um anticorpo humanizado fator-a de necrose do tumor anti-humano e seu fragmento de ligação ao antígeno (Fab). A presente invenção também revela uma composição que compreende o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno (Fab), e o uso do referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno (Fab) para o tratamento de doenças associadas ao fator de necrose de tumor.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

(001) A presente invenção se refere aos anticorpos humanizados (TNF-α) fator-α de necrose de tumor anti-humano e fragmentos de ligação a seus antígenos (Fabs) e uso do mesmo.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

(002) O desenvolvimento e a progressão da doença autoimune é um processo complexo devido ao desequilíbrio na regulação de muitas citoquinas ativas. Demonstrou-se que o fator-α (TNF-α) de necrose de tumor desempenha um papel importante na regulação imune entre numerosas citoquinas. Entretanto, sua sobre expressão tem demonstrado ser uma das principais causas de doenças autoimunes, etc. Assim, o uso de produtos biofarmacêuticos supressores da atividade TNF-α se tornam uma das terapias com mais sucesso para o tratamento dessas doenças. As indicações que foram aprovadas compreendem principalmente artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase de placa, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, e artrite idiopática juvenil, enquanto várias das outras doenças relacionadas estão sendo submetidas a experimentos clínicos.

(003) Atualmente, nos mercados americano e europeu, estão disponíveis os anticorpos farmacêuticos anti-TNF-α e os medicamentos proteicos de fusão Fc tipo anticorpo, como Remicade. Mas o Remicade tem uma meia vida mais curta in vivo de aproximadamente 9 dias. Além disso, apesar de o Remicade ter boa afinidade de ligação, bioatividade, e eficácia clínica, como um anticorpo quimérico que consiste de 1/3 de sequências derivadas de murina e 2/3 de sequências derivadas de humanos, em cerca de 10% - 47% dos pacientes aparece uma resposta imune após a administração de Remicade, geralmente resultando na produção de anticorpos anticamundongo humanos (HAMA), que afetam a potência e a aplicação de longo prazo do anticorpo. Assim, existe uma grande necessidade de um anticorpo anti-TNF-α com maior grau de humanização e máxima proporção reduzida das sequências derivadas de murina para reduzir o grau de origem murina e permitir o uso seguro no tratamento das doenças de humanos. Um processo comum para a humanização de um anticorpo é enxertar partes das regiões determinantes complementares (CDRs) das regiões variáveis (VH, VK) de um anticorpo derivado murino nas regiões enquadradas de um anticorpo humano previamente selecionado. O anticorpo resultante consistirá principalmente de sequências derivadas de humanos e poderá reter a seletividade do anticorpo de partida de origem murina para o mesmo antígeno. Entretanto, o processo leva geralmente à perda da afinidade do anticorpo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

(004) Um objetivo da presente invenção é prover anticorpos humanizados (TNF- α) fator-α de necrose de tumor anti-humano e seus fragmentos de ligação ao antígeno (Fabs), cuja afinidade pelo fator-α de necrose de tumor humano é comparável ou até maior que o do Remicade, um anticorpo quimérico humano- murino.

(005) Os anticorpos humanizados (TNF-α) fator-α de necrose de tumor anti- humano ou os Fabs providos na presente invenção compreendem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a sequência aminoácida da região variável de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 1 ou 3 na listagem de sequência e a sequência aminoácida da região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 15, 9, 11, 7, 13 ou 5 na listagem de sequência, e o primeiro resíduo aminoácido de SEQ ID NO: 1 é Glu ou Gln.

(006) O anticorpo é particularmente selecionado a partir de um dos seguintes a) a l): a) KS10, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH08 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 15; b) KS03, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH05 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 9; c) KS06, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH06 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 11; d) KS12, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH08 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 15; e) KS04, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH05 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 9; f) KS07, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH06 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 11; g) KS02, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH03 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 5; h) KS08, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH04 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 7; i) KS11, tendo uma região variável de cadeia pesada SH02 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 3, e uma região variável de cadeia leve SH07 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 13; j) KS01, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH03 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 5; k) KS05, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH04 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 7; l) KS09, tendo uma região variável de cadeia pesada SH01 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve SH07 com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 13; em que, o primeiro resíduo aminoácido da SEQ ID NO: 1 é Glu ou Gln.

(007) Outro objetivo da presente invenção é prover um fragmento (Fab) humanizado de ligação ao antígeno fator-α de necrose do tumor anti-humano. O Fab compreende uma região variável de cadeia pesada, uma sequência aminoácida que corresponde às posições 1-120 da SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência, e uma região variável de cadeia leve, a sequência aminoácida que corresponde às posições 1-109 da SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 29 na listagem de sequência.

(008) O anticorpo provido pela invenção consiste de uma cadeia pesada, em que uma sequência aminoácida da região constante é idêntica à da cadeia pesada do anticorpo humano, e uma cadeia leve, em que a sequência aminoácida da região constante é idêntica à da cadeia leve do anticorpo humano.

(009) A região constante de cadeia pesada do anticorpo descrito pode ser uma região constante derivada de humano de quaisquer das classes (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) ou subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2), e a região constante de cadeia leve do anticorpo descrito pode ser uma região constante derivada de humano de cadeia leve de quaisquer classes (K ou À) ou subclasses (À1, À2, À3, À4), ou alotipos (Km (1), Km (2), Km (3)).

(0010) A sequência aminoácida da região constante de cadeia pesada do anticorpo é particularmente mostrada na SEQ ID NO: 17 na listagem de sequência; e a sequência aminoácida da região constante de cadeia leve do anticorpo é particularmente mostrada na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequência.

(0011) A sequência aminoácida da referida cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 21 na listagem de sequência; e a sequência aminoácida da referida cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 23 na listagem de sequência. Os resíduos aminoácidos nas posições 1-120 da SEQ ID NO: 21 correspondem à região variável da cadeia pesada, e os resíduos aminoácidos em suas posições 121-450 correspondem à região constante da cadeia pesada. Os resíduos aminoácidos nas posições 1-109 da SEQ ID NO: 23 correspondem à região variável da cadeia leve, e os resíduos aminoácidos em suas posições 110-214 correspondem à região constante da cadeia leve. O primeiro resíduo aminoácido da SEQ ID NO: 21 é Glu ou Gln.

(0012) O Fab provido na presente invenção consiste de um fragmento Fd de cadeia pesada e uma cadeia leve; em que o referido fragmento Fd de cadeia pesada inclui VH e CH1 e a referida cadeia leve inclui VK e uma região constante de cadeia leve; em que a sequência aminoácida do CH1 é idêntica à da região constante CH1 da cadeia pesada de anticorpo humano, e a sequência aminoácida da referida região constante de cadeia leve é idêntica à da região constante da cadeia leve de anticorpo humano.

(0013) O CH1 do fragmento Fd do FAB acima pode ser uma região constante derivada de humano CH1 de quaisquer classes (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) ou subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2); a região constante de cadeia leve do Fab acima pode ser uma região constante de cadeia leve derivada de humano de quaisquer classes (K ou À) ou subclasses (À1, À2, À3, À4), ou alotipos (Km (1), Km (2), Km (3)).

(0014) A sequência aminoácida do CH1 é mostrada na SEQ ID NO: 33 na listagem de sequência; a sequência aminoácida da região constante na referida cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequência.

(0015) Em determinadas realizações da invenção, o Fab é um dos seguintes b1) - b3):

(0016) b1) KS-7F: a sequência aminoácida do fragmento de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 27 na listagem de sequência; e a sequência aminoácida da cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 31 na listagem de sequência;

(0017) b2) KS-7A: a sequência aminoácida do fragmento da referida cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência; e a sequência aminoácida da referida cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 31 na listagem de sequência;

(0018) b3) KS-2E: a sequência aminoácida do fragmento da referida cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência; e a sequência aminoácida da referida cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 29 na listagem de sequência.

(0019) Ainda outro objetivo da presente invenção é prover o fragmento A de ligação ao antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno B, em que o fragmento A de ligação ao antígeno é um Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv (fragmentos da região variável de um anticorpo), uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, fragmentos polipeptídios selecionados a partir da região variável de cadeia pesada ou fragmentos polipeptídios selecionados a partir da região variável de cadeia leve, que são obtidos a parir do referido anticorpo; e o fragmento de ligação ao antígeno B é um Fab', um F(ab')2, um Fv, uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, fragmentos polipeptídios selecionados a partir da região variável de cadeia pesada ou fragmentos polipeptídios selecionados a partir da região variável de cadeia leve, que são obtidos a partir do referido Fab.

(0020) O F(ab')2 supramencionado é composto de um par de cadeias leves e um par de cadeias pesadas (denominadas Fd') que são um pouco maiores que Fd. A hidrólise das moléculas IgG por pepsina pode produzir este fragmento F(ab')2, que compreende dois Fabs, e assim pode se ligar a dois epítopos antigênicos. Fd' compreende cerca de 235 resíduos aminoácidos, reunindo VH, CH1, e uma região de articulação. Fv consiste de uma região variável de cadeia leve (VL) e uma região variável de cadeia pesada (VH), que se associam por meio de ligações não covalentes. Fv tem um peso molecular de cerca de um sexto do peso de uma molécula de anticorpo intacto, pertencendo a um único sítio de ligação ao antígeno. Fv inclui ScFv (anticorpos de cadeia simples), DsFv (anticorpos estabilizados com ligação dissulfeto) etc. ScFv é uma simples cadeia peptídia expressa a partir de VH e VL ligados entre si por meio de uma peça adequada de oligonucleotídio (um linker). DsFv é um fragmento Fv imobilizado de ligação dissulfeto formado por meio da introdução de respectivamente uma cisteína na cadeia leve e nas regiões variáveis de cadeia pesada em um sítio adequado. DsFv demonstrou ser superior a ScFv tanto na capacidade de ligação como na estabilidade.

(0021) Também se situa no escopo reivindicado da invenção um gene que codifica qualquer uma das seguintes proteínas A) - C): A) o referido anticorpo; B) o referido Fab; C) o fragmento A ou B de ligação ao antígeno.

(0022) As sequências de codificação da das regiões variáveis de cadeia pesada tanto do anticorpo como o fragmento A de ligação ao antígeno são mostradas na SEQ ID NO: 2 ou 4 na listagem de sequência. As sequências de codificação das regiões variáveis de cadeia leve tanto do anticorpo como do fragmento A de ligação ao antígeno são selecionadas entre uma das SEQ ID NOs: 16, 10, 12, 8, 14, e 6 na listagem de sequência. As sequências de codificação das regiões variáveis de cadeia pesada tanto do Fab como o fragmento de ligação ao antígeno B correspondem às posições 1-360 de quaisquer das sequências de SEQ ID NOs: 2, 4, 28 e posições 1-360 da SEQ ID NO: 26 na listagem de sequência. As sequências de codificação das regiões variáveis de cadeia leve tanto do Fab como do fragmento de ligação ao antígeno B correspondem às posições 1-327 de quaisquer das sequências de SEQ ID NOs: 16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 e posições 1-327 de SEQ ID NO: 30 na listagem de sequência.

(0023) Nas sequências acima, tanto SEQ ID NO: 2 como 4 têm 360 nucleotídios; enquanto todas as SEQ ID NO: 6, 8, 14, 10, 12, e 16 têm 327 nucleotídios.

(0024) A sequência de codificação da região constante de cadeia pesada do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 18 na listagem de sequência; e a sequência de codificação da região constante de cadeia leve do anticorpo é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequência.

(0025) A sequência de codificação da região CH1 do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 34 na listagem de sequência; a sequência de codificação da região constante de cadeia leve do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequência.

(0026) Na realização da presente invenção, a sequência de codificação da cadeia pesada do anticorpo é particularmente mostrada na SEQ ID NO: 22 na listagem de sequência; a sequência de codificação da cadeia leve do anticorpo é particularmente mostrada na SEQ ID NO: 24 na listagem de sequência.

(0027) A sequência de codificação do referido Fab é uma dos seguintes c1) - c3):

(0028) c1) KS-7F: a sequência de codificação do fragmento de cadeia pesada do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 28 na listagem de sequência; e a sequência de codificação da cadeia leve do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 32 na listagem de sequência;

(0029) c2) KS-7A: a sequência de codificação do fragmento de cadeia pesada do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 26 na listagem de sequência; e a sequência de codificação da cadeia leve do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 32 na listagem de sequência;

(0030) c3) KS-2E: a sequência de codificação do fragmento de cadeia pesada do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 26 na listagem de sequência; e a sequência de codificação da cadeia leve do Fab é mostrada na SEQ ID NO: 30 na listagem de sequência.

(0031) Apesar de os nucleotídios nas posições 1-360 e 360-1350 da SEQ ID NO: 22 corresponderem à região variável mencionada de nucleotídios da cadeia pesada e à região constante nucleotídios da cadeia pesada, respectivamente; os nucleotídios nas posições 1-327 e 328-642 da SEQ ID NO: 24 correspondem à região variável mencionada de nucleotídios da cadeia leve e à região constante nucleotídios da cadeia leve, respectivamente.

(0032) Ainda outro objetivo da presente invenção é prover os seguintes materiais genéticos: um vetor recombinante, uma bactéria recombinante, uma linha celular recombinante, um vírus recombinante ou um cassete de expressão que compreenda o gene apresentado acima.

(0033) O vetor recombinante é um vetor de expressão procariótica ou eucariótica para a expressão do anticorpo, o Fab, ou do fragmento de ligação ao antígeno. A bactéria recombinante é uma Escherichia coli que abriga o gene apresentado acima. A linha celular recombinante é uma linha celular transgênica ou uma linha celular de fusão, em que a linha celular transgênica pode ser uma linha celular de mamífero na qual o referido gene que codifica o anticorpo humanizado fator-α de necrose do tumor anti-humano, ou Fab, ou seu fragmento de ligação ao antígeno na presente invenção foi transferido, de preferência, uma linha celular CHO, ou linha celular 293 e suas sublinhas; a linha celular de fusão são células hibridoma que podem secretar o anticorpo humanizado fator-α de necrose do tumor anti- humano mencionado na presente invenção. O vírus recombinante é um adenovírus recombinante ou um vírus recombinante adenoassociado, etc, que transporta o gene apresentado acima. O cassete de expressão é uma molécula DNA que inclui três fragmentos de montante e jusante como segue: um promotor; o gene de codificação do anticorpo, ou o Fab, ou o fragmento de ligação ao antígeno do qual a transcrição é iniciada pelo promotor; e um terminador.

(0034) Se a célula hospedeira for transfectada ou transformada com um vetor recombinante compreendendo o gene de codificação do anticorpo, o Fab, ou o fragmento de ligação ao antígeno, as proteínas correspondentes podem ser expressas, obtendo assim o anticorpo ou Fab, ou o fragmento de ligação ao antígeno. A referida célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica, e pode também ser uma célula procariótica, incluindo, entre outras, uma célula de mamífero, uma bactéria, um fermento, uma célula de inseto, etc. Existe uma ampla variedade de células de mamíferos úteis para a expressão em grande escala da proteína, como as células 293, CHO, SP20, NS0, COS, BHK, ou PerC6, etc. Existem vários métodos para a transfecção de uma célula, incluindo, entre outros, a eletroporação, a transfecção mediada por lipossomo, a transfecção mediada por fosfato de cálcio, etc.

(0035) Uma forma preferida para a expressão do anticorpo, o Fab, ou o fragmento de ligação ao antígeno é a seguinte: realizar a amplificação do gene com o vetor recombinante em uma célula hospedeira transfectada de forma estável para aumentar o nível de expressão da proteína recombinante. Por exemplo, uma célula hospedeira DHFR-deficiente é transfectada de forma estável com um vetor recombinante compreendendo uma diidrofolato reductase (DHFR), podendo então ser adicionado metotrexato (MTX) no meio de cultura celular em uma concentração suficiente para aumentar o número de cópias do vetor recombinante na célula hospedeira.

(0036) Após a expressão do Fab ou IgG compreendendo a combinação de sequências do gene de codificação, pode ser usado o ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) ou outros ensaios para determinar a concentração da proteína no meio de cultura. Para os fragmentos Fab, estes podem ser purificados por cromatografia de afinidade usando Proteína G; e as proteínas IgG podem ser purificadas por cromatografia de afinidade usando Proteína A.

(0037) Também se situam no escopo de reivindicações da invenção o uso do anticorpo, ou do Fab, ou do fragmento de ligação ao antígeno, ou o gene, ou do material genético na:

(0038) d1) preparação de uma medicação para evitar e/ou tratar as doenças associadas ao fator-α de necrose de tumor humano, ou

(0039) d2) preparação de um produto para neutralizar o fator-α de necrose de tumor humano, ou

(0040) d3) preparação de um kit para detectar qualitativa ou quantitativamente o fator-α de necrose de tumor humano.

(0041) Em que a doença associada ao fator-α de necrose de tumor humano é uma doença causada pelo aumento do fator-α de necrose de tumor humano, de preferência artrite reumatóide, uveíte autoimune, doença de Crohn, psoríase de placa, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, ou artrite idiopática juvenil.

(0042) Ainda outro objetivo da presente invenção é prover uma composição farmacêutica compreendendo materiais auxiliares e princípios ativos, em que os princípios ativos incluem pelo menos um dos seguintes materiais: o anticorpo, o Fab, o fragmento de ligação ao antígeno, o gene, e o material genético apresentado acima; e o material auxiliar é um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Os princípios ativos na composição farmacêutica podem somente ser um dos Fabs ou anticorpos acima mencionados, ou qualquer dos fragmentos de ligação ao antígeno acima mencionado, ou qualquer dos genes acima mencionados, ou qualquer dos materiais genéticos acima mencionados.

(0043) Também se situam no escopo de reivindicações da invenção o uso de quaisquer dos seguintes materiais no tratamento de doenças associadas ao fator- α de necrose de tumor humano: o anticorpo, o Fab, o fragmento de ligação ao antígeno, o gene, o material genético, e a composição farmacêutica apresentada acima.

(0044) A doença associada ao fator-α de necrose de tumor humano é causada pelo aumento do fator-α de necrose de tumor humano, de preferência uveíte autoimune, artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase de placa, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, ou artrite idiopática juvenil. Descrição dos Desenhos de Acompanhamento

(0045) A Fig.1 mostra a detecção da bioatividade do Fab humanizado na supressão do TNF-α por ELISA.

(0046) A Fig.2 mostra a detecção da bioatividade do Fab humanizado na neutralização de TNF-α por meio de um experimento de citotoxicidade L929.

(0047) A Fig.3 mostra a análise de ligação do KS10 ao TNF-α antigênico a partir de diferentes espécies.

(0048) A Fig.4 mostra as classificações para o tratamento de ratos experimentais tendo artrite reumatóide com KS10. A partir da esquerda para a direita, existe o grupo normal, o grupo negativo, o grupo modelo, o grupo KS10 5mg/kg, o grupo KS10 10mg/kg, e o grupo KS10 20mg/kg.

(0049) A Fig.5 mostra o efeito do KS10 nos níveis IL-1β no fluido/tecidos articulares sinoviais dos ratos experimentais com artrite reumatóide. Da esquerda para a direita, existe o grupo normal, o grupo negativo, o grupo modelo, o grupo KS10 5mg/kg, o grupo KS10 10mg/kg, e o grupo KS10 20mg/kg.

(0050) A Fig.6 mostra o efeito do KS10 nos níveis IL-6 no fluido/tecidos articulares sinoviais dos ratos experimentais com artrite reumatóide. Da esquerda para a direita, existe o grupo normal, o grupo negativo, o grupo modelo, o grupo KS10 5mg/kg, o grupo KS10 10mg/kg, e o grupo KS10 20mg/kg.

Exemplos

(0051) Os seguintes exemplos são fornecidos para uma melhor compreensão da invenção, e não para limitar a invenção. A menos que especialmente declarado, os métodos experimentais apresentados abaixo são todos convencionais. A menos que especialmente declarado, os materiais experimentais usados nos exemplos são todos comprados em lojas comuns de reagentes bioquímicos. Os ensaios quantitativos nos exemplos a seguir são realizados em triplicata, e os resultados são valores médios.

(0052) O enxerto de CDRs das cadeias leves e pesadas de um anticorpo humanizado anti-TNF-α, de mutagênese direcionada ao sítio por PCR, e triagem de uma biblioteca mutante descrita na invenção são feitos por tecnologias convencionais de recombinação genética e técnicas imunológicas baseadas na interação antígeno-anticorpo, e nos procedimentos e etapas experimentais detalhadas estão documentados em "Molecular Cloning: a Laboratory Manual”, 3rd edition, by Joseph Sambrook, Science Press, e manuais de experimentos similares. EC50 nos exemplos a seguir foi obtido entrando com os valores da densidade ótica (OD450) no software GraphPad Prism 5, e gerando os gráficos de resultados.

(0053) Exemplo 1: Expressão do Fab do anticorpo anti-TNF-α humanizado e detecção de sua atividade.

(0054) Neste exemplo, estão envolvidos três Fabs de anticorpos anti-TNF-α humanizados (o Fab consiste de um fragmento Fd de cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo), isto é, KS-2E, KS-7A, e KS-7F.

1. Construção dos vetores de expressão para KS-2E, KS-7A, e KS-7F (1) Obtenção das sequências de cadeias leves e pesadas.

(0055) A partir de camundongos imunizados com TNF-α humano (R & D Co., Número de Catálogo: 210-TA-050), foram obtidas células hibridoma e submetidas à triagem monoclonal, sendo então extraído o RNA total e usado como gabarito, a partir do qual foram amplificadas as sequências nucleotídias para a região variável de cadeia pesada por PCR usando os primers gerais P1: 5'- GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3', P2: 5'- TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3' e as sequências nucleotídias para a região variável de cadeia leve foram amplificadas por PCR usando os primers gerais P3: 5'-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3', P4: 5'- GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3'. As fatias de gel compreendendo as bandas de interesse foram extraídas para recuperação. Os produtos amplificados das cadeias leves e pesadas do anticorpo foram individualmente inseridas no vetor pMD18-T (TaKaRa Co., Número de Catálogo: D101C). As colônias simples foram coletadas separadamente e sequenciadas para identificar as sequências nucleotídias das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas do anticorpo.

(2) Construção do Fab humanizado

(0056) Foram feitas as comparações da similaridade da sequência aminoácida entre a região variável de cadeia leve resultante e da região variável de cadeia leve de um anticorpo humanizado, entre a região variável de cadeia pesada resultante e a região variável de cadeia pesada de um anticorpo humanizado. As similaridades das sequências foram buscadas separadamente em IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) e IMGT (ImMunoGeneTics, IMGT: http://www.imgt.org). Com base nos resultados da busca, foi escolhido um anticorpo com maiores similaridades de sequência com ambas as cadeias leves e pesadas como gabarito para o anticorpo humanizado. A região variável de cadeia pesada resultante VH foi enxertada na região de enquadramento [região de enquadramento] do anticorpo humano IGHV3-15*07 (Número de acesso: M99406) tendo maior similaridade sequencial, e a região variável de cadeia leve resultante VK foi enxertada na região de enquadramento do anticorpo humano IGKV6-21*01 (Número de acesso: X63399) tendo uma maior similaridade sequencial.

(0057) Após múltiplos ciclos de mutações nos fragmentos de cadeia pesada original humana (Fd) e cadeias leves, as combinações de vários fragmentos de cadeias leves e cadeia pesada (Fd) foram inseridos no vetor pTLR (um vetor pET22b (+) modificado). Especificamente, preparar vários DNAs para as cadeias leves com os sítios de restrição de endonuclease Bam HI e Eco RI respectivamente em cada extremidade, e vários DNAs para os fragmentos de cadeia pesada (Fd) com os sítios de restrição de endonuclease Not I e Xho I respectivamente em cada extremidade. Os dois grupos de DNA foram clonados separadamente no vetor pTLR (um vetor pET22b (+) modificado) entre os correspondentes sítios de restrição de endonuclease, isto é, foram inseridos vários DNAs para as cadeias leves entre os sítios de restrição de endonuclease Bam HI e Eco RI, foram inseridos vários DNAs para os fragmentos de cadeia pesada (Fd) entre os sítios de restrição de endonuclease Not I e Xho I, resultando na construção de vários vetores de expressão Fab (incluindo três vetores de expressão Fab que expressam KS-2E, KS-7A, e KS-7F, respectivamente).

(0058) Várias combinações de cadeias leves e dos fragmentos de cadeia pesada (Fd) mencionados acima incluem os três Fabs, KS-2E, KS-7F, e KS-7A. A sequência aminoácida do fragmento de cadeia pesada do KS-2E é mostrada na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 26, e a sequência aminoácida da cadeia leve do KS-2E é mostrada na SEQ ID NO: 29 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 30. A sequência aminoácida do fragmento de cadeia pesada do KS-7A é mostrada na SEQ ID NO: 25 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 26, e a sequência aminoácida da cadeia leve do KS-7A é mostrada na SEQ ID NO: 31 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 32. A sequência aminoácida do fragmento de cadeia pesada do KS-7F é mostrada na SEQ ID NO: 27 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 28, e a sequência aminoácida da cadeia leve do KS-7F é mostrada na SEQ ID NO: 31 na listagem de sequência, sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 32.

(0059) O procedimento detalhado para a modificação do vetor pET22b (+) para obter o vetor pTLR acima mencionado foi como segue: primeiramente, um segmento DNA (abreviado para a sequência DNA T-L-R, mostrada na SEQ ID NO: 35 na listagem de sequência) foi sintetizada artificialmente, o que compreende as sequências de um promotor T7, um operador de lactose, e um sítio de ligação ribossômica (RBS), com os sítios de restrição de endonuclease Sal I e Not I localizados em cada extremidade; então, o vetor pET22b (+) (produto da Novage Co., USA) e a sequência DNA T-L-R foram digeridos separadamente tanto com endonucleases de restrição Sal I e Not I, depois ligados pela ligase DNA T4, e transformados; finalmente, a única colônia foi coletada por método convencional e sequenciada para triar o vetor adequadamente modificado.

(0060) 2. Expressão procariótica de KS-2E, KS-7A, e KS-7F

(0061) A cepa E. coli Top10 foi transformada separadamente com os vetores de expressão Fab acima mencionados construídos (incluindo três vetores de expressão Fab que expressam KS-2E, KS-7A, e KS-7F, respectivamente), e então plaqueados em uma placa 2-YT (peptona 1,6%, extrato de levedura 1%, NaCl 0,5%, e pó agar 1,5%) com cloranfenicol. No outro dia, foi selecionada a placa com a adequada densidade de colônia para coletar várias colônias simples. Para cada colônia positiva, foram coletadas oito colônias simples e colocadas em uma placa de poço profundo com 96 poços e induzidas com IPTG para expressão. Cada colônia simples foi adicionada a um tubo com 6 ml de meio líquido 2-YT (peptona 1,6%, extrato de levedura 1%, e NaCl 0,5%) contendo cloranfenicol e agitada a 250 rpm e a 37° C por 12 horas. 0,2 μl da suspensão bacteriana foi pipetada a partir de cada tubo e transferida para a placa 2-YT com cloranfenicol para armazenagem. 5 ml da suspensão bacteriana foi inoculada em 500 ml do meio líquido 2-YT contendo cloranfenicol e feita cultura a 33°C, 300 rmp até OD600 ter atingido 0,6. O IPTG foi então adicionado ao meio até uma concentração final de 50 μM, para induzir a expressão de vários Fabs com um tempo de indução de 3 horas. Depois de completada a expressão induzida, o meio de cultura foi centrifugado a 5100 rpm e 10°C por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado bacteriano foi ressuspenso completamente com 40 ml de solução TES prérresfriada; 66 ml de diluído TES prérresfriado a 20% com solução de H2O foi novamente adicionado à solução bacteriana ressuspensa e incubado em gelo por 40 minutos, seguido pela centrifugação a 13000 rpm, 4°C por 10 minutos. Após a centrifugação, foi coletado o sobrenadante, que é um extrato periplásmico contendo proteínas Fab (proteína KS-2E, KS-7A ou KS-7F). O extrato periplásmico foi dessalgado passando por uma coluna G-25 (GE Co., 17-0034-01)). Foi preparada uma coluna pré-empacotada Proteína G (GE Co., 17-0618-04), equilibrada com uma solução de equilíbrio (20 mM tampão fosfato, pH 6,5), sendo então carregada a amostra de proteína. Após o carregamento da amostra, a coluna foi lavada com a solução de equilíbrio sequencialmente, e então eluída diretamente com uma solução de eluição (0,1 M Gly-HCl, pH2,5). As frações eluídas foram coletadas e o pH das frações eluídas foi rapidamente ajustado para 7,0 pela adição prévia de um tampão 1,0 M Tris-HCl (pH 9,0) nos tubos de coleta de fração antes da coleta, a razão volumétrica do tampão Tris em relação às frações eluídas foi 1:9. O líquido coletado compreende a proteína de interesse. A pureza da proteína foi ensaiada por SDS-PAGE e determinadas as concentrações proteicas nas amostras de proteína. Finalmente, a amostra de proteína foi subempacotada e armazenada a - 80 °C, obtendo assim as proteínas Fab com maior pureza (incluindo três proteínas, KS-2E, KS-7A, e KS-7F).

3. Determinação da bioatividade de KS-2E, KS-7A, e KS-7F 1) Ensaio de ligação dos Fabs humanizados a TNF-α por ELISA

(0062) As proteínas Fab que se ligam ao TNF-α foram triadas por meio das seguintes etapas: foi revestida uma placa ELISA com 100 ng de TNF-α derivada de humano (R & D Co., Número de Catálogo: 210-TA-050) como um substrato por poço; foram adicionadas diluições seriais duplas de 40 nM das proteínas Fab (preparadas na etapa 2, incluindo três proteínas, KS-2E, KS-7A, e KS-7F), e então incubadas; foi adicionado um anticorpo secundário C-Kappa anti-humano de cabra rotulado com peroxidase de raiz forte (Sigma Co., Número de Catálogo: K3502), e finalmente adicionado TMB para desenvolvimento e introduzido ácido sulfúrico 2 M para interromper a reação, determinando assim as proteínas Fab de ligação ao TNF-α. De acordo com este processo de triagem, foram obtidos três Fabs com maior atividade: KS-2E, KS-7F, e KS-7A, essas proteínas compreendem totalmente dois diferentes VHs (VH01 e VH02, a sequência aminoácida de VH01 é mostrada na SEQ ID NO: 25 e sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 26; a sequência aminoácida de VH02 é mostrada na SEQ ID NO: 27 e sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 28) e dois diferentes VKs (VK03 e VK05, a sequência aminoácida de VK03 é mostrada na SEQ ID NO: 29 e sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 30; a sequência aminoácida de VK05 é mostrada na SEQ ID NO: 31 e sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 32 (Tabela 1).

(0063) O resultado do teste da capacidade de ligação do Fab humanizado ao TNF-α por ELISA foi ilustrado na Fig.1. O resultado indica que os três Fab humanizados obtidos acima têm uma afinidade ao antígeno similar à do fragmento Fab do Remicade, um anticorpo quimérico humano-murino, em que o EC50 para a ligação do KS-7A e KS-7F ao TNF-α é superior ao do fragmento Fab do Remicade anticorpo quimérico humano-murino (tabela 2).

(0064) Tabela 1 Fabs de anticorpos anti-TNF-α humanizados

(0065) Nota: N/A indica que o fragmento Fab não foi indicado devido à má atividade.

(0066) Tabela 2 EC50 para a ligação dos Fabs dos anticorpos anti-TNF-α humanizados ao TNF-α no ensaio ELISA

(0067) Nota: Os dados na tabela 2 foram os valores médios dos experimentos em triplicata.

(0068) 2. Detecção da bioatividade dos Fab humanizados na supressão do TNF-α pelo experimento de toxicidade L929.

(0069) Além disso, a bioatividade dos três Fabs humanizados acima (KS-2E, KS- 7F e KS-7A) na neutralização do TNF-α foi verificada por meio de um experimento de biologia celular, um ensaio de citotoxicidade L929. Neste experimento, 1xi04 células L929 em fase de crescimento logarítmico foram semeadas em meio DMEM (10% FBS, Gibco) em uma placa de 96 poços. Após 24 horas, foram adicionados 0,5 ng/ml TNF-α de origem humana (R & D Co., Número de Catálogo : 210-TA-050) e 0,5μg/ml de actinomicina D (Fluka). As células foram divididas em quatro grupos, e os três Fabs humanizados mencionados acima e o fragmento Fab do anticorpo de controle Remicade foi adicionado individualmente em cada grupo, as células foram mantidas em cultura por outras 24 horas. Finalmente, foi analisada a viabilidade das células com um kit CCK8 (Dojindo Laboratories). O resultado é mostrado na Fig. 2 e indica que os três Fabs humanizados acima mencionados podem exercer a bioatividade de neutralizar eficazmente o TNF-α, em que a bioatividade do KS-7A na neutralização do TNF-α é superior ao do fragmento Fab do Remicade de anticorpo quimérico humano-murino. Os dados da Fig. 2 são valores médios ± desvio padrão dos experimentos realizados em triplicata.

(0070) Exemplo 2: Construção de uma biblioteca de maturação de afinidade para o CDR3 do Fab do anticorpo anti-TNF-α humanizado.

(0071) Para mais aumentar a afinidade dos fragmentos Fab do anticorpo anti- TNF-α humanizado acima mencionado ao antígeno, foi separadamente construída uma biblioteca de maturação de afinidade para a cadeia pesada VH02 CDR3 e para a cadeia leve VK05 CDR3 em um vetor de expressão do anticorpo anti-TNF- α humanizado Fab. Como as regiões CDR3 da cadeia pesada e da cadeia leve são as regiões mais importantes para a ligação de um anticorpo a um antígeno, a realização da mutagênese de saturação de sítio na região CDR3 e então a triagem podem levar à produção de um anticorpo com maior afinidade. Para a construção de uma biblioteca de mutagênese de saturação de sítio para os CDR3s de cadeia pesada e a cadeia leve, foi indicada uma série de primers para a mutagênese sítio direcionada e usada em uma reação PCR. Os produtos resultantes amplificados a partir da reação PCR foram misturados em uma proporção de degeneração idêntica da série primer e clonados em um vetor de expressão para o Fab do anticorpo anti-TNF-α humanizado. A construção da biblioteca de mutagênese sítio direcionada para o CDR3 de cadeia leve foi realizada como segue: realização de um PCR com a série Primer 5 e o primer 6 a jusante de cadeia leve (5'-CGGAATTCCGTACGTTTCACTTCCAGATTGG-3') e usando um DNA de cadeia leve as como gabarito para produzir produtos DNA de interesse, e então clonando os produtos DNA em um vetor de expressão Fab, conduzindo eletrotransfência e plaqueamento para estabelecer a biblioteca de mutagênese sítio direcionada para o CDR3 de cadeia leve. A série Primer 5 compreende um sítio mutante em CDR3, e inclui totalmente 19 primers listados na Tabela 3. A construção da biblioteca de mutagênese sítio direcionada para o CD3 de cadeia pesada foi feita como segue: realização de um PCR com a série Primer 7 mutante e o primer 8 a jusante de cadeia pesada (5'- CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3') e usando um DNA de cadeia pesada como gabarito para produzir produtos DNA de interesse, e depois clonando os produtos DNA em um plasmídeo de expressão FAB, realizando eletrotransferência e plaqueando para estabelecer a biblioteca de mutagênese sítio direcionada para o CD3 de cadeia pesada. A série Primer 7 compreende o sítio mutante em CDR3, e inclui totalmente 22 primers listados na Tabela 4. A partir da biblioteca de mutagênese finalmente estabelecida para as cadeias leves e pesadas, Fabs de anticorpo anti-TNF-α com maior capacidade de ligação ao antígeno TNF-α (R & D Co.,) foram selecionados com base no resultado ELISA. A triagem dos mutantes de cadeia pesada para a obtenção de duas regiões variáveis de cadeia pesada com maior atividade, isto é, SH01 e SH02; e a triagem dos mutantes de cadeia leve para a obtenção de seis regiões variáveis de cadeias leve com maior atividade, isto é, SH03, SH04, SH05, SH06, SH07 e SH08.

(0072) Tabela 3 Séries Primer 5 para mutagênese sítio direcionada no CDR3 de cadeia leve.

(0073) Tabela 4 Séries Primer 7 para mutagênese sítio direcionada no CDR3 de cadeia pesada.

(0074) Exemplo 3 Expressão do Fab de alta afinidade do anticorpo anti-TNF- α humanizado e o ensaio de atividade

(0075) Este exemplo se refere a dois Fabs de anticorpo anti-TNF-α humanizado com as designações de FA01 e FA02 respectivamente. A sequência aminoácida da região variável de cadeia leve de FA01 é mostrada na SEQ ID NO: 15 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 16 na listagem de sequência), sua sequência aminoácida da região constante de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequência), sua sequência aminoácida da região variável de cadeia pesada do fragmento Fd de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência), a sequência aminoácida de seu CH1 de região constante de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 33 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 34 na listagem de sequência). A sequência aminoácida da região variável de cadeia leve de FA02 é mostrada na SEQ ID NO: 9 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 10 na listagem de sequência), sua sequência aminoácida da região constante de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 19 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequência), a sequência aminoácida da região variável de cadeia pesada de seu fragmento Fd de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 1 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência), a sequência aminoácida de seu CH1 de região constante de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 33 na listagem de sequência (sua sequência nucleotídia é mostrada na SEQ ID NO: 34 na listagem de sequência).

1. Construção e a expressão do Fab de alta afinidade do anticorpo anti- TNF-α humanizado

(0076) O processo para a construção de dois Fabs do anticorpo anti-TNF-α humanizado foi a mesma do exemplo 1. Os DNAs que codificam as cadeias leves e pesadas dos dois Fabs do anticorpo anti-TNF-α humanizado acima mencionados foram inseridos separadamente nos sítios correspondentes no vetor pTLR para obter os vetores de expressão pFA01 Fab para FA01 e pFA02Fab para FA02. Seguindo o protocolo apresentado no exemplo 1, foram obtidas as proteínas FA01 e FA02 com maior pureza.

(0077) 2. Detecção da bioatividade dos Fabs de alta afinidade do anticorpo anti-TNF-α humanizado.

(0078) Por meio do experimento de citotoxicidade L929, os dois Fabs de anticorpo anti-TNF-α humanizado (FA01 e FA02) acima mencionados foram analisados com relação à bioatividade. O procedimento detalhado é o mesmo do exemplo 1. Os valores OD450 resultantes foram inseridos no software GraphPad Prism 5 para calcular o EC50. Os resultados estão mostrados na tabela 5, que indica que as atividades do FA01 e do FA02 são mais potentes que a do fragmento Fab do anticorpo Remicade.

(0079) Tabela 5 Bioatividade dos Fabs humanizados na neutralização do TNF-α

(0080) Nota: Os dados da tabela 5 foram valores médios dos experimentos em triplicata.

(0081) Exemplo 4 Expressão do anticorpo IgG anti-TNF-α humanizado e detecção de sua atividade.

1. Construção do vetor de expressão recombinante para o anticorpo IgG anti-TNF-α humanizado.

(0082) Fragmentos DNA que codificam os dois fragmentos Fd de cadeia pesada (compreendendo SH01 e SH02 respectivamente) e seis cadeias leves (compreendendo SH03, SH05, SH04, SH06, SH07 e SH08 respectivamente) obtidos nos exemplos 1 e 2 foram mutuamente combinados da maneira mostrada na tabela 6, montados em conjunto com o Fragmento DNA para a região constante Fc IgG1 por extensão de sobreposição PCR, e depois inseridos no plasmídeo de expressão pcDNA3.1(+) por recombinação. As células CHO foram transfectadas com os plasmídeos de expressão recombinantes construídos e expressos os anticorpos humanizados de comprimento total.

(0083) O protocolo detalhado é descrito como segue: (1) Fragmentos DNA para as cadeias leves foram diretamente inseridos no vetor de expressão eucariótica pcDNA3.1(+) por recombinação. Os seguintes primers foram projetados: 5'- TGAAAGCTTATGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTC-3' (um sítio de endonuclease de restrição Hind III sendo sublinhado); 5'- AATCTCGAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3' (um sítio de endonuclease de restrição Xho I sendo sublinhado) e usado em uma reação de amplificação PCR. Os produtos amplificados foram duplamente digeridos com a endonuclease de restrição Hind III (R0104L, produto da NEB Co.,) e Xho I (R0146L, produto da NEB Co.,) e ligados com os grandes fragmentos de pcDNA3.1(+) que foram duplamente digeridos com as mesmas enzimas por ligase DNA T4. (2) Fragmentos DNA para cadeias pesadas precisam ser montados em conjunto com o Fragmento DNA para a região constante Fc IgG1 por extensão de sobreposição PCR, e inseridos no pcDNA3.1 (+) por recombinação. 5'- ACTGGTACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3'(um sítio endonuclease de restrição Kpn I sendo sublinhado);5'-GATGGGCCCTTGGTGCT AGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3';5'-GATGGGCCCTTGGTGCT AGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3';5'- AATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3' (um sítio endonuclease de restrição XhoI sendo sublinhado). Os produtos PCR montados foram duplamente digeridos com a endonuclease de restrição Kpn I (R0142L, produto da NEB Co.,) e Xho I (R0146L, produto da NEB Co.,), depois inseridos no plasmídeo de expressão pcDNA3.1 (+)que foi duplamente digerido com as mesmas enzimas por recombinação, e identificados por análise de restrição e sequenciados para obter os recombinantes adequados.

(0084) Foram preparados os vetores de expressão para 18 anticorpos na tabela 7 de acordo com o procedimento descrito acima. Todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada de KS01 (Glu), KS03 (Glu), KS05 (Glu), KS06 (Glu), KS09 (Glu), e KS10 (Glu) são mostradas na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência (a sequência nucleotídia nas posições 1-3 sendo GAG) e codificam as regiões variáveis de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 1 (o primeiro aminoácido sendo Glu); todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada de KS01 (Gln), KS03 (Gln), KS05 (Gln), KS06 (Gln), KS09 (Gln), e KS10 (Gln) são mostradas na SEQ ID NO: 2 na listagem de sequência, em que a sequência nucleotídia na posição 1-3 foi substituída por CAG, e codifica as regiões variáveis de cadeia pesada mostradas na SEQ ID NO: 1 (o primeiro aminoácido sendo Gln); todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada de KS02, KS04, KS07, KS08, KS11, e KS12 são mostradas na SEQ ID NO: 4 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia pesada como mostradas na SEQ ID NO: 3; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS01 (Glu), KS01 (Gln) e KS02 são mostradas na SEQ ID NO: 6 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 5; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS03 (Glu), KS03 (Gln) e KS04 são mostradas na SEQ ID NO: 10 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 9; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS05 (Glu), KS05 (Gln) e KS08 são mostradas na SEQ ID NO: 8 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve como mostradas na SEQ ID NO: 7; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS06 (Glu), KS06 (Gln) e KS07 são mostradas na SEQ ID NO: 12 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 11; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS09 (Glu), KS09 (Gln) e KS11 são mostradas na SEQ ID NO: 14 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 13; todas as sequências DNA que codificam as regiões variáveis de cadeia leve de KS10 (Glu), KS10 (Gln) e KS12 são mostradas na SEQ ID NO: 16 na listagem de sequência e codificam as regiões variáveis de cadeia leve mostradas na SEQ ID NO: 15. A sequência DNA que codifica a região constante de cadeia pesada dos dezoito anticorpos é mostrada na SEQ ID NO: 18 na listagem de sequência e codifica a região constante de cadeia pesada mostrada na SEQ ID NO: 17; A sequência DNA que codifica a região constante de cadeia leve de dezoito anticorpos é mostrada na SEQ ID NO: 20 na listagem de sequência e codifica a região constante de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 19.

(0085) 2. Expressão e purificação do anticorpo IgG anti-TNF-α humanizado de comprimento total

(0086) Os plasmídeos recombinantes de cadeia leve e os plasmídios recombinantes de cadeia pesada obtidos na Etapa 1 foram cotransfectados em células CHO para expressarem os anticorpos humanizados de comprimento total. Após os plasmídeos correspondentes na combinação mostrada na tabela 6 terem sido transfectados de forma estável em células CHO, respectivamente, por um método convencional, doze dos correspondentes anticorpos recombinantes de comprimento total foram secretados no sobrenadante da cultura celular. O sobrenadante foi purificado para a obtenção do correspondente anticorpo IgG de comprimento total. As etapas detalhadas da purificação são como segue:

1) Carga cromatográfica

(0087) Mabselect Sure (produto da GE Co.,), Superdex 200 (produto da GE Co.,)

(0088) 2) Tampão

(0089) Tampão de equilíbrio por afinidade (PBS): Fosfato hidrogenado de sódio 0,2 M: 82.5 mL/L; Fosfato diidrogenado de sódio 0,2 M: 17,5 mL/L; cloreto de sódio 2M: 75 mL/L; adicionar água ultrapura, agitar totalmente e misturar bem, ajustar o pH com hidróxido de sódio 1 M ou cloreto de hidrogênio 1M até 7,1-7,3.

(0090) Tampão de equilíbrio por afinidade: NaCl 2.922g/L, acetato anidro de sódio 0,49 g/L, adicionar 2,9 mL/L de ácido acético glacial, pH3,4-3,6.

(0091) Tampão de regeneração por afinidade: 5,8 mL/L de ácido acético glacial, pH3,0.

(0092) Tampão de afinidade Clean in-place (CIP): Hidróxido de sódio 1M 100mL/L.

(0093) Solução de cromatografia de gel filtração (PBS): Fosfato hidrogenado de sódio 0,2 M: 82,5 mL/L; Fosfato diidrogenado de sódio 0,2 M: 17,5 mL/L; cloreto de sódio 2M: 75 mL/L; adicionar água ultrapura, agitar totalmente e misturar bem, ajustar o pH com hidróxido de sódio 1 M ou cloreto de hidrogênio 1M até 6,8.

(0094) 3) Preparação da amostra (filtração de clarificação)

(0095) Centrifugação: a amostra foi centrifugada a 5000-6000 rpm por 10 -15 minutos.

(0096) Filtração: após a centrifugação, o sobrenadante da amostra foi filtrado com o filtro H7 (0,45 + 0,2 μm).

(0097) 4) Cromatografia por afinidade

(0098) Instalar o sistema de purificação AKTA e uma coluna de cromatografia por afinidade (Mabselect ou Mabselect Sure). Lavar com 2 volumes de coluna de água ultrapura. Lavar com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio por afinidade até que a linha basal esteja estável, e injetar a amostra. Após a injeção da amostra, lavar com 5-10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio por afinidade. Então, a coluna foi eluída com tampão de eluição por afinidade, foram coletadas as frações correspondendo ao principal pico de absorbância a 280 nm, eluídas sequencialmente com 1 volume de coluna. A coluna foi eluída com 3 volumes de coluna de tampão de regeneração por afinidade. Lavar com tampão de equilíbrio por afinidade até um pH neutro. Realizar o clean in-place com 5 volumes de coluna de tampão CIP Mabselect ou tampão CIP Mabselect Sure. Lavar com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio por afinidade até a linha de base ficar estável. Lavar com 3 volumes de coluna de água ultrapura até a linha de base ficar estável. Lavar com 3 volumes de coluna de 20% de etanol, e guardar em uma coluna de cromatografia por afinidade.

(0099) 5) Cromatografia de gel filtração

(00100) Instalar o sistema de purificação explorador AKTA e uma coluna de cromatografia por filtração de gel Superdex 200. Ajustar a vazão em 5 ml/min, lavar com 1 volume de coluna de água ultrapura, e lavar com 2 volumes de coluna de solução de equilíbrio de cromatografia de coluna Superdex 200. Ajustar a vazão em 2,5 ml/min, sendo as frações coletadas correspondentes os picos de cromatografia por afinidade submetidas a ajuste de valore de pH e injetadas diretamente na coluna. Após a injeção da amostra, eluir a coluna com a solução de equilíbrio de cromatografia de coluna Superdex 200 e coletar o pico de interesse em 280 nm. Continuar a lavar com 1 volume de coluna. A coluna cromatográfica foi guardada com NaOH 0,01 M.

(00101) 3. Detecção da atividade do anticorpo IgG anti-TNF-α humanizado

(00102) Os 12 anticorpos IgG anti-TNF-α humanizados obtidos na etapa 2 foram testados em relação à bioatividade na neutralização do TNF-α pelo experimento de citotoxicidade L929 (a manipulação detalhada foi descrita no exemplo 1), os valores OD450 resultantes foram obtidos e introduzidos no software GraphPad Prism 5 para o cálculo do EC50. Foram mostrados na tabela 7 os valores EC50 dos doze anticorpos IgG anti-TNF-α humanizados para a supressão da bioatividade do TNF-α. Os resultados indicam que as bioatividades dos anticorpos anti-TNF-α humanizados são consideravelmente aumentadas e que o KS10 tem a maior bioatividade. Assim, um foi feita outra investigação sobre a atividade do anticorpo, principalmente no KS10.

(00103) Tabela 6 Anticorpo anti-TNF-α humanizado de alta afinidade

(00104) Tabela 7 Bioatividade do anticorpo anti-TNF-α humanizado de comprimento total na neutralização do TNF-α

(00105) Exemplo 5 Ensaio cinético da ligação do KS10 (Glu) ao hTNF-α

(00106) O hTNF-α (R & D Co., 210-TA-050) e a biotina NHS-LCLC (NHS- LCLC-biotin) (Número de Catálogo: 21338, adquirida da Thermo-Fisher Co.,) foram uniformemente misturados com uma razão molar de 1:3 e mantidos em temperatura ambiente por 1 hora. Depois, a NHS-LCLC-biotin restante foi removida por meio de uma coluna de dessalinização PD-10 (Número de Catálogo: 17-0851-01, adquirida da GE Co.,). Os produtos conjugados finais obtidos foram 50 μg/ml de biotina-hTNF-α.

(00107) Os parâmetros cinéticos do KS10 de ligação ao hTNF-α foram determinados pelo sistema Octet RED 96 (ForteBio Co.,) na plataforma de tecnologia Octet, sendo o procedimento experimental configurado de acordo com o manual de instruções do instrumento. 50 μg/ml de biotina-hTNF-α foram ligadas ao biossensor Streptavidin (SA);) por Carregamento; foi determinada a faixa adequada de concentração do anticorpo por meio de um experimento piloto como segue: 6000 nM, 2000 nM, 666,7 nM, 222,2 nM, 74,1 nM e 24,7 nM. Foi usado o Remicade como controle positivo e usado PBS (pH 7,4) como controle em branco. O resultado (na tabela 8) mostra que o valor KD de KS10 é menor que o do Remicade, o que sugere que a afinidade do KS10 com o hTNF-α é maior que a do Remicade de anticorpo quimérico humano-murino.

(00108) Além disso, foi determinada a afinidade de ligação do KS10 ao TNF- α de chimpanzés (com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 36 e a sequência nucleotídia mostrada na SEQ ID NO: 37), TNF-α de rhesus (com a sequência aminoácida mostrada na SEQ ID NO: 38 e a sequência nucleotídia mostrada na SEQ ID NO: 39), TNF-α de camundongos (mTNF-α) (Número de Catálogo: CYT-252, adquirida da PROSPEC), e TNFβ humano (Número de Catálogo: CYT-224, adquirida da PROSPEC). De acordo com os critérios de avaliação de afinidade do sistema Octet RED 96, a distância de deslocamento da onda luminosa devida à ligação de um antígeno a um anticorpo reflete indiretamente a afinidade entre as duas substâncias, quanto maior a distância de deslocamento da onda luminosa, maior a afinidade. O resultado (Fig.3) mostra que o KS10 liga-se muito fortemente ao TNF-α humano, como também significativamente ao TNF-α de chimpanzés, fracamente ao TNF-α de rhesus, raramente ao TNF-α de camundongos e ao TNFβ humano. Portanto, fica confirmado que os anticorpos providos na invenção possuem uma capacidade específica de ligação após a humanização.

(00109) Tabela 8 Parâmetros cinéticos da ligação do KS10 ao hTNF-α

(00110) Nota: KD é a constante de afinidade; kon é a constante de ligação; e kdis é a constante de dissociação.

(00111) Exemplo 6: Efeito do KS10 (Glu) no modelo de rato induzido por TNF-α humano de artrite reumatóide

(00112) Foram utilizados setenta e dois ratos Sprague Dawley (licença para animais de laboratório: SCXK (Sichuan) 2008-24) com 4-6 semanas de idade, grau SPF, metade machos e metade fêmeas com pesos corporais de 140-180 g. Os ratos foram aclimatados por uma semana e então randomizados em seis grupos com 12 ratos por grupo, sendo, grupo normal, grupo de controle negativo, grupo modelo de controle, grupo de 5 mg/kg de KS10, grupo de 10 mg/kg de KS10, e grupo de 20mg/kg de KS10. No início do experimento, os ratos de cada grupo foram anestesiados com 10% hidrato de cloral (350 mg/kg), exceto por aqueles do grupo normal. Antes do modelamento, os ratos nos grupos de dose receberam por meio da veia caudal uma injeção com três doses diferentes de KS10 (5 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg), e os ratos no grupo de controle negativo e no grupo modelo de controle receberam pela veia caudal iguais volumes de soro salino fisiológico. Quinze minutos depois, foram injetados 0,5 mg/ml hTNF-α (R & D Co., Número de Catálogo : 210-TA-050) (dissolvidos com 1% BSA, com um volume de injeção de 60 μl/rato) com uma seringa de 1 ml na cavidade de junta do calcanhar esquerdo dos ratos nos três grupos de doses KS10 e no grupo modelo de controle para a indução de artrite aguda (modelamento de pé único) e igual volume de 1% BSA foi injetado na cavidade de junta do calcanhar esquerdo dos ratos do grupo de controle negativo. As injeções com sucesso foram indicadas pelo intumescimento gradual das depressões bilaterais da cavidade de junta. Os ratos no grupo normal não receberam a injeção acima mencionada.

(00113) 18 horas após o modelo ter sido estabelecido, o grau de intumescimento da junta do calcanhar esquerdo dos ratos de cada grupo for classificado individualmente de acordo com critérios de gradação modificados de 0 - 4 como segue: 0: nenhuma vermelhidão e intumescimento; 1: vermelhidão e/ou intumescimento somente na junta do calcanhar; 2: vermelhidão e intumescimento na junta do calcanhar e intumescimento no plantar; 3: vermelhidão e intumescimento na junta do calcanhar e plantar; 4: vermelhidão e intumescimento na junta do calcanhar, plantar e na superfície do pé [Referência: R O Williams, M Feldmann, e R N Maini. Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 October 15; 89 (20): 9784-9788]. 20 horas depois de o modelo ter sido estabelecido, foi removido o fluido sinovial da junta. Foram separados os tecidos moles à volta da junta, homogeneizados, centrifugados e congelados em conjunto a -70°C. Os níveis de IL-lβ e IL-6 foram determinados com um kit ELISA para ratos (IL-lβ sendo adquirido de R & D Co., Número de Catálogo: RLB00; IL-6 sendo adquirido de R & D Co., Número de Catálogo: R6000B).

(00114) De acordo com as classificações (Figura 4), é mostrado que três dosagens de KS10 podem aliviar significativamente a vermelhidão e intumescimento induzidos pelo hTNF-α das juntas dos ratos e antagonizar significativamente o desenvolvimento da artrite reumatóide induzida pelo hTNF-α. É mostrado no ensaio de citoquina que as três dosagens de KS10 podem reduzir significativamente os níveis do IL-lβ (Fig.5) e IL-6 (Fig.6) no fluido sinovial e nos tecidos moles à volta da junta, o que indica que o KS10 pode bloquear completamente os crescentes níveis de IL-lβ e IL-6 induzidos pelo TNF-α e serve como evidência direta da ação do TNF-α anti-humano do KS10.

(00115) Exemplo 7: Efeito do tratamento de KS10 (Glu) no modelo de ratos induzido por TNF-α humano de uveíte.

(00116) 40 ratos hígidos lewis foram randomizados no grupo normal, no grupo modelo, no grupo de controle negativo e no grupo KS10. Os ratos receberam injeções intraperitoneais com 10% de hidrato de cloral (uma dosagem de 0,35 ml/kg). Depois que os ratos foram anestesiados, foram injetados 10 μl de soro salino fisiológico (usando uma agulha 30 G1/2) no vítreo pela parte plana do músculo ciliar de cada rato no modelo e nos grupos de controle negativo, injetados 10 μl de solução KS10 em uma concentração de 4 mg/ml (formulada com PBS) da mesma forma em cada rato no grupo KS10. Trinta minutos depois, foram injetados 10 μl de hTNF-α (cerca de 0,5 mg/ml) intravitreamente em cada rato no modelo e nos grupos KS10, e injetados 10 μl de BSA 1% intravitreamente em cada rato no grupo de controle negativo. 24 horas e 48 horas após o modelo ter sido estabelecido pela primeira administração, os ratos foram anestesiados, observados sob uma lâmpada de fenda, e classificados respectivamente. Os critérios de classificação foram indicados na literatura [Fleisher LN, Ferrell JB, Smith MG, McGahan MC. Lipid mediators of tumor necrosis factor-α-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991 Jul; 32 (8): 2393-9.] e moderadamente revisados: 0-2: hiperemia da íris 0-2 (0: sem hiperemia, 1: leve hiperemia; 2: hiperemia severa); pupila contraída 0-1 (0: pupila normal; 1: pupila contraída); exsudação da câmara anterior 0-2 (0: sem exsudação da câmara anterior; 1: leve exsudação da câmara anterior; 2: severa exsudação da câmara anterior), caligo pupillae ou sinéquia posterior 0-2 (0: sem sinéquia; 1: sinéquia em qualquer sítio; 2: sinéquia em ambos os sítios).

(00117) O resultado da classificação é mostrado na tabela 9 e indica que o KS10 pode reduzir significativamente a classificação dos critérios de avaliação de uveíte, que é representada pela supressão da hiperemia da íris, exsudação de fibrina, e caligo pupillae ou sinéquia posterior, aumentado a transparência intraocular. Assim, foi demonstrado que o KS10 exerce um efeito antagonístico significativo na uveíte induzida por hTNF-α.

(00118) Tabela 9. Classificações do KS10 para o tratamento da uveíte induzida por TNF-α humano no modelo de rato.

(00119) Nota: * indica *P<0,05, comparado ao grupo modelo (^ ± SD, n=10)

(00120) Aplicação Industrial

(00121) Pela mutagênese de um anticorpo CDR-enxertado, a presente invenção supera efetivamente o defeito de que a afinidade de um anticorpo é prejudicada pelo método convencional para a humanização de um anticorpo (em que a região determinante complementar (CDR) de uma região variável de anticorpo murino-derivado (VH, VK) é diretamente enxertado na região de enquadramento de um anticorpo humano), finalmente obtém um anticorpo humanizado similar ao anticorpo inicial. Os anticorpos Fabs e IgG providos na presente invenção têm um grau consideravelmente aumentado (até acima de 95%) e são experimentalmente confirmados para ter uma afinidade e bioatividade similar ou mesmo maior que a do anticorpo quimérico humano-murino Remicade, melhor efeito neutralizador no TNF-α humano, sendo mais eficaz no tratamento de doenças associadas ao TNF-α, de preferência artrite reumatóide, uveíte autoimune, doença de Crohn, psoríase de placa, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa, ou artrite idiopática juvenil.

Claims

1. Anticorpo humanizado anti-fator de necrose tumoral α, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada consiste na SEQ ID NO: 1; a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve consiste na SEQ ID NO: 15 e o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 1 é Glu ou Gln.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo consiste em uma cadeia pesada em que a sequência de aminoácidos da região constante é idêntica à da região constante da cadeia pesada do anticorpo humano, e uma cadeia leve na qual a sequência de aminoácidos da região constante é idêntica à da região constante da cadeia leve do anticorpo humano.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da região constante na referida cadeia pesada consiste na SEQ ID NO: 17; e a sequência de aminoácidos da região constante na referida cadeia leve consiste na SEQ ID NO: 19.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos da referida cadeia pesada consiste na SEQ ID NO: 21; e a sequência de aminoácidos da referida cadeia leve consiste na SEQ ID NO: 23, em que o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 21 é Glu ou Gln.

5. Sequência nucleotídica, caracterizado pelo fato de que as sequências das regiões variáveis da cadeia pesada dos anticorpos definidas nas reivindicações 1-4 consistem na SEQ ID NO: 2; as sequências das regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos definidas nas reivindicações 1-4 consistem na SEQ ID NO: 16.

6. Sequência nucleotídica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência da região constante da cadeia pesada do anticorpo consiste na SEQ ID NO: 18; e a sequência da região constante da cadeia leve do anticorpo consiste na SEQ ID NO: 20.

7. Sequência nucleotídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a sequência da cadeia pesada do anticorpo consiste na SEQ ID NO: 22; e a sequência da cadeia leve do anticorpo consiste na SEQ ID NO: 24.

8. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que: compreende a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-8.

9. Vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor recombinante é um vetor de expressão procariótica ou eucariótica para expressar o referido anticorpo.

10. Microrganismo transgênico não animal ou não vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7.

11. Microrganismo transgênico não animal ou não vegetal, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o microrganismo transgênico não animal ou não vegetal é: uma escherichia coli abrigando a referida sequência nucleotídica, ou um adenovírus recombinante ou um vírus adeno-associado recombinante transportando a referida sequência de nucleótidos.

12. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7.

13. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo, definida em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o transgênico não animal ou microrganismo não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou a cassete de expressão definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usada na preparação de um medicamento.

14. Anticorpo ou fragmento do mesmo, definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o não animal transgênico ou microrganismo não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou a cassete de expressão definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usada como medicamento.

15. Uso do anticorpo ou fragmento do mesmo, definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o não- transgênico microrganismo animal ou não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou o cassete de expressão definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usado na preparação de um medicamento para prevenir e/ou tratar artrite reumatóide, uveíte autoimune, doença de Crohn, psoríase em placas, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa ou artrite idiopática juvenil.

16. Anticorpo ou fragmento do mesmo, definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o não animal transgênico ou microrganismo não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou o cassete de expressão definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usada em um método de prevenção e/ou tratamento de artrite reumatóide, uveíte autoimune, doença de Crohn, psoríase em placas, artrite psoriática, espondilite anquilosante, colite ulcerativa ou artrite idiopática juvenil.

17. Uso in vitro do anticorpo ou fragmento do mesmo, definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o não transgênico não - microrganismo animal ou não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou o cassete de expressão definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usado para neutralizar o fator de necrose tumoral humano-α.

18. Uso in vitro do anticorpo ou fragmento do mesmo, definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, ou a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o não transgênico não - microorganismo animal ou não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, ou o cassete de expressão definido na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser usado para detectar qualitativa ou quantitativamente o fator de necrose tumoral humano-α.

19. Composição farmacêutica, que compreende material auxiliar e ingredientes ativos, caracterizado pelo fato de que os ingredientes ativos incluem pelo menos um dos seguintes materiais: o anticorpo ou fragmento do mesmo definido em qualquer uma das reivindicações 1-4, a sequência nucleotídica definida em qualquer uma das reivindicações 5-7, o vetor recombinante definido na reivindicação 8 ou 9, o microrganismo transgênico não animal ou não vegetal definido na reivindicação 10 ou 11, e o material genético definido na reivindicação 12; e o material auxiliar é um veículo farmaceuticamente aceitável.