KR101643783B1 - 막성 신장병증에 대한 진단법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특발성 막성 신장병증 (MN)의 면역검정, 시약, 치료법, 및 진단 및 예후 평가 방법에 관한 것이다. 면역검정은 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)에 대해 반응성인 혈청 자가항체에 대한 효소-결합 면역흡착 분석법 및 혼탁 면역검정을 포함한다. 치료 방법은 자가항체를 격리하기 위한 가용성 PLA2R 또는 단편의 흡착 또는 투여에 의한 자가항체의 제거를 포함한다.

Description

막성 신장병증에 대한 진단법{DIAGNOSTICS FOR MEMBRANOUS NEPHROPATHY}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2008년 7월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 61/081,786을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 청구하며, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.

정부 지원

본 발명은 <National Institute of Health>가 수여한 계약 번호 DK067658 및 DK30932 하의 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정한 권리가 있다.

배경기술

부종 및 소변 내의 다량의 단백질을 특징으로 하는 신장 증후군은 막성 신장병증 (MN), 국소성 분절성 사구체경화증, 미세 변화 질환, 당뇨병성 신장병증, 막증식성 사구체신염, 뿐만 아니라 기타 원인들이 포함되는 다수의 잠재적인 원인이 있는 비교적 통상적인 신장 장애이다. 신장 용태의 징후 및 증상 중 일부를 경감시키는 비-특이적 치료법들이 있지만, 근원적인 질환에 관한 구체적인 지식이 명확한 치료를 안내하는데 일반적으로 필요하다. 신장 증후군 환자가 외래 환자로서 또는 병원에서 최초로 평가되는 경우, 혈청학에 의해 검출가능한 잠재적인 원인을 찾기 위해 일반적으로 의사가 일련의 혈액 테스트를 지시한다 (예를 들어, 소변 침전물 내의 전형적인 발견물의 환경에서의 항-핵 항체 (ANA) 및/또는 항-이중 가닥 DNA 항체의 존재는 루푸스 신장염을 시사할 것이다). MN을 확인하기 위한 혈청학적 테스트가 현재 없고, 다수의 기관에서의 하룻밤 동안의 입원을 필요로 하는 침습성 절차이고 대형 내출혈에 의해 복잡해 수 있는 신장 생검에 진단이 배타적으로 의존한다. MN은 다수의 2차 요인, 예컨대 전신 홍반 루푸스, B형 간염 또는 매독에 의해 야기될 수 있고, 이러한 원인을 찾기 위해 혈액 테스트가 일상적으로 수행된다 (각각 ANA, 항-B형 간염 항원, 신속 혈장 리에이진(reagin) (RPR)). 그러나, 미국에서, MN은 기원이 더욱 종종 원발성이거나, 또는 특발성이고, 상기 언급된 바와 같이 이러한 형태에 대한 혈액 테스트가 현재 존재하지 않는다. 따라서, MN의 근원적인 원인을 확인하고, MN을 진단하고 치료에 대한 응답을 추적하기 위한 단순하고 비-침습적인 테스트를 개발할 필요가 있다.

발명의 개요

본 발명의 실시양태들은, 특발성 막성 신장병증 (MN)의 근원적인 원인이 신장 사구체에서 발현되는 M형 포스포리파제(phospholipase) A2 수용체 (PLA2R)에 대한 자가항체의 존재라는 발견을 기초로 한다. 이러한 자가항체는 주로 IgG4 서브클래스(subclass)의 항체이다. 또한, IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스의 항-PLA2R 자가항체 또한 존재하였다. 특발성 MN에 걸린 개체들의 혈청에는 검출가능한 양의 이같은 자가항체가 있다. 자가항체의 존재가 MN과 관련되고, PLA2R이 이러한 자가항체에 대한 표적이라는 것을 앎으로써 특발성 MN을 진단하기 위한 간단한 혈청학적 면역검정의 개발이 가능해졌다. 이러한 항-PLA2R 자가항체 검출은 현재의 신장 조직 생검 방법과 비교하여 신속하고, 정확하고, 비용 면에서 효과적이고, 안전하며, 비-침습성인 특발성 MN 진단 방법을 제공한다.

따라서, 한 실시양태에서, PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재를 검출하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계를 포함하는, 대상에서 MN을 진단하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정에 의해 항체가 검출될 수 있다. 대상의 샘플, 예를 들어, 혈청에서 항체가 발견된다. 대상은 인간이고, MN은 특발성이다. 진단 방법 전에, 신장 생검이 수행되지 않는다. 건강한 개체는 통상적인 ELISA 또는 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 항-PLA2R 자가항체가 최소이거나 검출가능하지 않다. 특발성 MN에 걸린 개체에는 유의한 양의 검출가능한 양의 항-PLA2R 자가항체가 있고, 본원에 기술된 바와 같은 통상적인 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의한 건강한 비-MN 개체로부터의 양 또는 건강한 비-MN 개체들의 집단에 대해 수득된 수준보다 10％ 이상 더 많은 항-PLA2R 자가항체가 검출되었다. 또한, 자가항체의 수준이 질환 용태의 임상 특색, 예를 들어 단백뇨 및 신장 증후군에 상응한다. 효과적인 치료 후의 완화 상태인 환자는 통상적인 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 항-PLA2R 자가항체가 최소이거나 검출가능하지 않다. 예를 들어, 검출가능하지 않은 양의 항-PLA2R 자가항체는, 인간 혈청이 1:100으로 희석되고 본원에 기술된 블롯 분석법에서 사용되는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된 웨스턴 블롯 분석에서 가시적인 밴드가 관찰되지 않는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 실시예 1에 기재된 통상적인 ELISA 또는 웨스턴 블롯에서 결정된 바와 같은 건강한 비-MN 개체에서의 항-PLA2R 자가항체의 양 또는 건강한 비-MN 개체들의 집단에서의 평균량이 배경 수준, 기준 수준 또는 대조군 수준으로 간주될 수 있다. 건강한 비-MN 개체들로부터 수집된 혈청 샘플을 1:100으로 희석하고, 웨스턴 블롯 분석법에서 사용한다. 가시적인 밴드의 강도를 밀도측정법에 의해 정량한다. 밀도측정법 강도를 고정량의 항원 PLA2R과 반응하는 항-PLA2R 항체의 일련의 범위의 공지된 역가로 검정할 수 있다. 예를 들어, 블롯 상에서, 공지된 항체 역가의 범위는 0 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 1.5 ㎍/㎖, 2.0 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 3.0 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 7.5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 및 15 ㎍/㎖일 수 있고, PLA2R의 고정량은 0.5 ㎍일 수 있다. 인간 샘플의 밀도측정법 강도를 검정 곡선과 비교함으로써, 샘플 내의 항-PLA2R의 역가를 추정할 수 있다. 개체들의 집단에 대해 수집된 데이터에 대해, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 계산한다. 이상적으로는, 집단에는 약 25명, 바람직하게는 이를 초과하는 건강한 비-MN 개체가 있다. 통계, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 컴퓨터 시스템 및 데이터 저장 매체에 업로딩(uploading)한다. 항-PLA2R 자가항체가 이러한 평균량보다 10％ 이상 더 많은 환자는, 특히 환자가 질환의 임상적인 유의한 특색, 예를 들어 단백뇨 및 신장 증후군을 또한 나타낸다면, MN에 걸렸을 것이다.

한 실시양태에서, 샘플 내의 자가항체는 포유류 조직으로부터 추출된 PLA2R 또는 재조합 포유류 PLA2R, 예를 들어 인간 또는 돼지 PLA2R에 대해 반응성이다. 대상으로부터의 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플이다.

한 실시양태에서, 혈청학적 면역검정, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석법 또는 혼탁 면역검정에 의해 자가항체가 검출된다.

한 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계; (b) 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및 (c) 2개의 시점의 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 감소는 치료가 효과적임을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 막성 신장병증에 대해 치료되고 있는 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 감소는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율이다. 항체-단백질 복합체가 형성되고 복합체가 검출되는 면역검정에 의해 항체 수준이 검출될 수 있다. 대상의 샘플, 예를 들어, 혈청에서 항체가 발견된다. 한 실시양태에서, 치료는 면역억제 치료이다. 한 실시양태에서, 더 나중 시점, 예를 들어 제2 시점의 항체 수준은 제1 시점과 비교하여 95-100％ 이상 더 낮고, 이는 면역검정의 검출 한계 미만인 것으로 간주되며, 그러면 대상이 MN에 대해 완화 상태이다. 한 실시양태에서, 웨스턴 블롯의 검출 한계 미만은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 분석법이 수행될 경우 가시적인 밴드가 존재하지 않는 때이다.

한 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계; 및 (b) 적어도 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계를 포함하며, 이때 제2 시점의 항체 수준이 검출 한계 미만으로 감소되는 때는 자발적인 완화가 있음을 지시하는 것인, 막성 신장병증에 대한 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 감소는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율이다. 본원에서 논의된 바와 같이, 이같은 감소는 선행 기록에 비해 환자가 점점 양호해지고 있음을 지시한다. 검출 한계 미만은 항체 수준이 제1 시점에 비해 95-100％ 이상으로 감소되는 때이다. 한 실시양태에서, 웨스턴 블롯의 검출 한계 미만은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 분석법이 수행될 경우 가시적인 밴드가 존재하지 않는 때이다.

한 실시양태에서, 대상이 MN에 대해 치료되고 있고, 제2 시점의 항체 수준이 면역검정의 검출 한계 미만이면, 대상이 MN에 대해 완화 상태인 것으로 간주된다.

한 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계; (b) 적어도 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및 (c) 제1 시점과 제2 시점의 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 더 나중의 시점의 항체 수준의 증가는 막성 신장병증의 재발이 있음을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 막성 신장병증에 대한 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 증가는 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 500％ 이상, 1000％ 이상, 또는 이를 초과하는 값이고, 10-1000％ 사이의 모든 백분율을 포함한다.

한 실시양태에서, 대상에서의 샘플로부터 PLA2R에 대해 반응성인 항체를 제거하는 단계를 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 면역흡착에 의해 혈액으로부터 항체가 제거된다. 항체의 제거 후 샘플이 대상 내로 다시 복귀된다.

한 실시양태에서, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증의 치료 방법이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, PLA2R 또는 이의 단편을 포함하는, 특발성 막성 신장병증의 치료를 위한 조성물이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대상에서의 막성 신장병증의 치료를 위한, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R을 발현할 수 있는 핵산 분자 예컨대 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도가 본원에서 제공된다.

또 다른 실시양태에서, 대상에서의 막성 신장병증의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도가 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 치료 또는 흡착에 적절한 단편은 PLA2R의 CTLD 또는 CRD 4, 5, 6을 포함하는 단편이다.

한 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계; 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계; 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 표지되고 샘플로부터의 항체에 대해 반응성인 검출 항체를 첨가하는 단계; 임의의 결합되지 않은 표지된 검출 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 및 표지를 검출가능한 신호로 전환시키며, 이때 검출가능한 신호의 존재는 대상에서의 MN 가능성을 지시하는 것인 단계를 포함하는 면역검정이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계; 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계; 항체-단백질 복합체의 형성으로부터 초래되는 광 산란 강도를 측정하며, 이때 대조군 광 산란 강도의 10％ 이상의 광 산란 강도는 대상에서의 MN 또는 MN 재발의 가능성을 지시하는 것인 단계를 포함하는 면역검정이 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 대조군 광 산란 강도는 대상으로부터의 샘플의 부재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도이다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 광 산란 강도는 건강한 비-MN 대상으로부터의 샘플의 존재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도이다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 광 산란 강도는 건강한 비-MN 대상들의 집단에 대해 수득된 평균 광 산란 강도이다. 이같은 대상은 본원에 기술된 바와 같은 질환의 어떠한 임상 특색도 지니지 않는다. 증가는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율이다. 한 실시양태에서, 탁도계에서 광 산란 강도가 측정된다.

한 실시양태에서, MN은 특발성이다. 또 다른 실시양태에서, 대상은 인간이고, 샘플은 혈액 샘플이다. 또 다른 실시양태에서는, 대상에 대해 신장 생검이 수행되지 않는다.

한 실시양태에서, PLA2R은 포유류 PLA2R, 인간 또는 돼지 PLA2R 단백질이다. 한 실시양태에서, PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편은 고체 지지체 상에 침착 또는 고정된다. 또 다른 실시양태에서, 기지량의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체에 침착되거나 또는 커플링된다. 또 다른 실시양태에서, 지지체는 딥스틱(dipstick), 테스트 스트립(strip), 라텍스 비드(bead), 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식일 수 있다.

한 실시양태에서, 항-PLA2R 자가항체는 IgG 서브클래스인 IgG1-4의 항체이다. 한 실시양태에서, 효소, 형광 화합물 또는 금속이 있는 표지, 또는 화학발광 화합물이 있는 표지에 공유결합으로 연결시킴으로써 검출 항체가 표지된다. 또 다른 실시양태에서, 검출 항체는 대상에 대해 특이적으로 반응성이고, 예를 들어, 대사이 인간인 경우, 검출 항체는 인간에 대해 특이적이다.

한 실시양태에서, 검출가능한 신호가 증가되는 양의 기지량의 PLA2R 또는 단편의 면역검정으로부터 유래된 적정 곡선으로부터의 검출가능한 신호들의 셋트에 비교된다.

한 실시양태에서, 일정 기간에 걸쳐 수득된 대상으로부터의 복수의 샘플에 대해 면역검정이 수행된다. 2년 이상의 기간 동안 2개월 또는 3개월 마다 복수의 샘플이 수득된다. 각각의 면역검정의 검출가능한 신호 또는 광 산란 강도가 선행 시점으로부터 수득된 샘플의 검출가능한 신호 또는 광 산란 강도에 비교되고, 이때 검출 신호 또는 광 산란 강도의 5％ 이상의 감소는 대상에서의 MN의 효과적인 치료를 지시한다. 감소는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율이다.

한 실시양태에서, 적어도 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 및 PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 침착되는 하나 이상의 고체 지지체를 포함하는, 대상으로부터의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 확인하기 위한 기구가 본원에서 제공된다. 고체 지지체 상에 침착되는 PLA2R 단백질 또는 이의 단편은 그 지지체 상에 고정되고, 고체 지지체는 딥스틱, 테스트 스트립, 라텍스 비드, 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식이다.

한 실시양태에서, 상기 기구는 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체를 기구가 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 기구는 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정을 수행한다. 한 실시양태에서, 면역검정은 혈청학적 면역검정이다. 또 다른 실시양태에서, 면역검정은 혼탁 면역검정이다.

한 실시양태에서, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체가 대상에서의 막성 신장병증의 가능성을 지시하는 것인, 대상에서의 MN의 진단을 용이하게 하기 위한 본원에 기술된 기구의 용도가 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 기구를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체; 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 및/또는 탁도계 큐벳을 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 지시하는 면역검정으로부터의 검출가능한 신호를 포함하는 자가항체 정보를 측정하는 측정 모듈; 측정 모듈로부터 출력된 데이터를 저장하도록 설정된 저장 모듈; 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 검색된 콘텐츠(content)를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및 검색된 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 검색된 콘텐츠에서, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈을 포함하는 시스템이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대한 자가항체 정보를 수신 및 출력하도록 설정되고, 이때 자가항체 정보가 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 수준을 측정하는 결정 모듈; 결정 모듈로부터의 출력 정보를 저장하도록 설정된 저장 모듈; 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 자가항체가 없으면 대상이 완화 상태이거나 또는 선행 기록에 비해 10％ 이상의 감소가 있으면 MN에 대한 치료가 대상에서 효과적인 것인 출력 모듈을 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증 (MN)의 예후 평가를 용이하게 하는 시스템이 본원에서 제공된다. 감소는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율이다. 한 실시양태에서, 기준 또는 대조군 데이터는 동일한 대상으로부터의 이전 데이터를 포함하며, 이때 이전 데이터는 본원에 기술된 임의의 통상적인 ELISA 또는 혼탁 면역검정 또는 당업계에 공지된 것들에 의해 검출가능한 것인, 검출가능한 양의 자가 항체를 지시하였다. 한 실시양태에서, 기준 또는 대조군 데이터는 특발성 MN 환자들의 집단으로부터 수득된 항-PLA2R 자가항체의 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 포함한다. 이러한 특발성 MN 개체들로부터 수집된 혈청을 1:100으로 희석하여 웨스턴 블롯 분석법에서 사용한다. 가시적인 밴드의 강도를 밀도측정법에 의해 정량하고, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 계산한다. 이상적으로는, 집단에는 약 25명, 바람직하게는 이를 초과하는 특발성 MN 개체가 있다. 통계, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 컴퓨터 시스템 및 데이터 저장 매체에 업로딩할 수 있다.

한 실시양태에서, PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대한 면역검정으로부터의 신호 수준을 나타내는 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 데이터를 함유하는 데이터 저장 모듈; 데이터 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하는 비교 모듈; 및 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터에 비해 10％ 이상의 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈을 포함하는 컴퓨터 판독가능 저장 매체가 본원에서 제공된다. 검출가능한 양은 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％, 200％, 300％ 또는 1000％ (10-1000％ 사이의 모든 백분율 포함)이다.

한 실시양태에서, 대조군 데이터는 0.5 ㎍의 천연 PLA2R과 면역-반응하도록 1× PBS로 1:100 희석된 인간 혈청을 사용하여 수득된 검출 신호인 건강한 비-MN 개체들의 집단으로부터의 데이터를 포함하며, 이때 양고추냉이 과산화효소 항-인간 IgG 항체가 표지된 검출 항체이고, 검출 신호는 화학발광이다.

도면의 간단한 설명
도 1a는 웨스턴 블롯에 의해 특발성 막성 신장병증 (MN) 환자들로부터의 혈청이 200 kDa 사구체 항원을 특이적으로 인식한다는 것을 나타낸다. 패널 (상부)은 특발성 MN 환자들로부터의 5가지 상이한 혈청 (레인 MN1-5) 또는 또 다른 단백뇨성 용태 (DN, 당뇨병성 신장병증; FS, 국소성 분절성 사구체경화증) 환자로부터의 5가지 혈청과 블롯팅된 인간 사구체 단백질을 나타낸다.
도 1b는 다양한 혈청과 200 kDa 항원의 반응성의 특이성의 그래프식 설명을 나타낸다. 특발성 MN 환자로부터의 혈청의 57％가 사구체 항원과 반응하는 반면, 8명의 2차 MN 환자, 19명의 질환 대조군 (기타 신장 용태 또는 자가면역 질환), 또는 23명의 정상 대조군으로부터는 반응성 혈청이 없다.
도 1c는 다양한 혈청과 200 kDa (185 kDa) 항원의 반응성의 특이성의 그래프식 설명을 나타낸다. 여러 지역으로부터의 특발성 MN 환자로부터의 혈청의 72-82％가 사구체 항원과 반응하는 반면, 12명의 2차 MN 환자, 25명의 질환 대조군 (기타 신장 용태 또는 자가면역 질환), 또는 32명의 정상 대조군으로부터는 반응성 혈청이 없다.
도 2a는 인간 사구체 내의 200 kDa 항원이 M형 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)임을 나타낸다. PNGase F로 처리되거나 PNGase F 없이 처리되고, 반응성 MN 혈청 또는 PLA2R에 대해 생성된 폴리클로날 항체로 웨스턴 블롯팅된 인간 사구체 단백질 및 재조합 PLA2R이 제시된다.
도 2b는 인간 MN 혈청이 PLA2R을 면역침전 (IP)시킬 수 있음을 실연한다. MN 환자로부터의 3개의 반응성 혈청 및 3개의 비-반응성 혈청, 뿐만 아니라 3개의 대조군 혈청이 인간 사구체 단백질들의 혼합물로부터 표적 항원을 면역침전시키는데 사용되었다. 그후, 면역침전물을 PLA2R에 대한 항체 (상부), 뿐만 아니라 전체 인간 IgG (하부 패널)로 웨스턴 블롯팅하였다.
도 2c는 반응성 MN 혈청에 의해 확인된 사구체 당단백질이 인간 PLA2R임을 나타낸다. 전체 인간 혈청이 사구체 단백질을 면역침전 (IP)시키는데 사용되었고, 그후 IP를 전기영동하고, M형 PLA2R에 대해 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅하였다. 처음 5개의 레인은 WB (도 1에서와 같이)에 의해 양성인 것으로 알려진 혈청과의 IP를 나타낸다. 6번째 레인은 음성인 것으로 알려진 MN 환자로부터의 혈청과의 IP를 나타낸다. 레인 7 및 8은 정상 자원자로부터의 혈청과의 IP를 나타내고, 마지막 레인에서는, 아가로스 비드에 대한 사구체 단백질의 비-특이적 결합을 배제하도록 인간 혈청이 IP로부터 생략되었다.
도 3a는 PLA2R 상의 에피토프가 환원에 대해 민감성이고, IgG4 우세 응답을 유발한다는 것을 나타낸다.
도 3b 및 3c는 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체들의 IgG 서브클래스 특이성을 나타낸다.
도 4a는 MN 샘플로부터 용출된 IgG에서만 천연 및 재조합 PLA2R이 확인되었음을 나타낸다.
도 4b는 MN3 생검 샘플로부터 용출된 IgG가 PLA2R에 상응하는 밴드만 인식하였음을 나타낸다.
도 5a는 환자 혈청 내의 항-PLA2R 항체의 존재가 질환 활성과 상관된다는 것을 나타낸다. 완화가 시작된 단일 MN 환자로부터 일련의 혈청을 수집하였다. 상부의 그래프는 소변 단백질 수준의 감소 (다이아몬드) 및 혈청 알부민의 증가 (원)를 나타낸다.
도 5b는 상부 패널의 WB가 200 및 150 kDa의 천연 및 탈글리코실화 PLA2R에 대한 반응성이 도 5a와 동일한 환자로부터의 초기 샘플에만 존재한다는 것을 나타낸다는 것을 나타낸다. 98 kDa 밴드의 비-특이적 검출에 의해 등가의 로딩(loading)이 제시된다. 혈청 샘플 내의 전체 IgG가 하부 패널에 제시되고, 이는 환자가 MN으로부터 완화되기 시작함에 따른 IgG의 약간의 증가를 실연한다.
도 6a는 PLA2R에 대한 혈청 반응성이 특발성 MN 환자 A에서 질환 활성에 상응한다는 것을 나타낸다. 그래프는 치료 시 소변 내 단백질이 감소하는 것, 및 웨스턴 블롯에서 치료 개시 후 항-PLA2 항체가 동반되어 소멸되는 것을 나타낸다.
도 6b는 PLA2R에 대한 혈청 반응성이 특발성 MN 환자 B에서 질환 활성에 상응한다는 것을 나타낸다. 그래프는 소변 내 단백질 감소와 웨스턴 블롯에서의 치료 개시 전 및 후의 항-PLA2 항체의 소멸 간의 상관관계를 나타낸다.
도 7은 역-샌드위치 ELISA (RS-ELISA) 및 간접 ELISA를 나타내는 개략도를 나타낸다.
도 8a (평면도) 및 8b (측면도)는 유체 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 존재 및/또는 수준을 결정하기 위한 테스트 스트립의 개략도를 나타낸다.
도 9는 도 8에 제시된 테스트 스트립을 사용하여 수득된 결과의 해석을 나타내는 개략도를 나타낸다.
도 10은 표준 PLA2R 곡선을 포함하는 ELISA 플레이트 분석법의 개략도를 나타낸다.
도 11은 고정된 양의 표준 PLA2R 단백질을 이용하는 변형된 ELISA 플레이트 분석법의 개략도를 나타낸다.
도 12는 MN 진단을 위한 예시적인 시스템을 나타내는 블록 선도이다.
도 13은 본원에 기술된 시스템과 함께 사용하기 위한 컴퓨터 판독가능 저장 매체 상의 명령어들의 예시적인 세트이다.

발명의 상세한 설명

달리 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 명세서가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 지닌다. 신장 질환, 신장학 및 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를 [The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, Merck Research Laboratories, 2006] (ISBN 0-911910-18-2); [Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994] (ISBN 0-632-02182-9); 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995] (ISBN 1-56081-569-8); [The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149), Crowther J. R. (2000)]; [Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays, Jeffrey Travis, 1979], [Scientific Newsletters; Immunology, Werner Luttmann, Elsevier, 2006]에서 확인할 수 있다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의를 [Benjamin Lewin, Genes IX, Jones & Bartlett Publishing, 2007] (ISBN-13: 9780763740634); [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994] (ISBN 0-632-02182-9); 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995] (ISBN 1-56081-569-8)에서 확인할 수 있다.

달리 언급되지 않는 한, 예를 들어 [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1989)]; [Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986)]; 또는 [Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)], [Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel, et al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)], [Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.)], [Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)], [Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Ian Freshney, Wiley-Liss, 5th edition (2005)], [Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol 57, Jennie P. Mather and David Barnes (eds), Academic Press, 1st edition, 1998)] (모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 표준 절차를 사용하여 본 발명을 수행하였다.

본 발명이 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약 등에 한정되지 않고, 따라서 변할 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 술어는 단지 특정 실시양태들을 기술하려는 목적이고, 청구항에 의해서만 규정되는 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다.

조작 실시예, 또는 달리 지시되는 경우를 제외하고는, 본원에서 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 함께 사용되는 경우 용어 "약"은 ±1％를 의미할 수 있다.

단수형 관사 ("a", "an", 및 "the")는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 명확하게 문맥적으로 다르게 지시되지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 명세서의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법 및 물질이 하기에 기술된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 <exempli gratia>로부터 유래되고, 비-제한적인 예를 지시하도록 본원에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.

확인된 모든 특허 및 기타 간행물은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 이같은 간행물에 기술된 방법론들을 예를 들어 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 명확하게 참고로 포함된다. 이러한 간행물들은 본 출원의 출원일 전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 종래 발명에 의해 또는 임의의 또 다른 이유로 발명가들이 이같은 개시내용을 선행할 권리가 없는 것으로 허가하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 이러한 문서들의 내용에 관한 설명 또는 날짜에 관한 모든 언급은 출원인에게 입수가능한 정보를 기초로 하고, 이러한 문서들의 내용 또는 날짜의 정확함에 관한 어떠한 허가도 구성하지 않는다.

용어 정의

용어 "단편"은 아미노산 잔기 서열이 본원에 기술되어 있는 폴리펩티드의 서열보다 짧은 아미노산 잔기 서열을 지니는 임의의 대상 폴리펩티드를 지칭한다. PLA2R의 단편은 짧아진 또는 말단이 절단된 PLA2R 단백질이다. 폴리펩티드에 N-말단 또는 C-말단 말단절단이 있고/있거나 또한 내부 결실이 있을 수 있다. 단편의 예는 PLA2R의 CTLD 또는 CRD 4, 5, 6을 포함하는 단편이다. 한 실시양태에서, 단편은 인간 PLA2R (서열 2)의 아미노산 잔기 1-1392인 PLA2R의 외부 도메인을 포함한다. 1-1392의 더 짧은 부분들이 단편으로 간주된다.

본원에서 사용된 용어 "제약 조성물"은 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 화학물질 및 화합물의 제약상 허용가능한 담체와 조합된 활성 작용제를 지칭한다. 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 조직 배양 배지를 제외한다.

본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 PLA2R에의 결합에 대해 이용가능한 가용성 자가항체의 양을 감소시킬 수 있는 활성 작용제의 양을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "치료하다 또는 치료"는 막성 신장병증과 관련된 의학적 용태들과 관련된 하나 이상의 유해 효과 또는 증상을 감소시키거나 경감시키는 것을 지칭한다. 이는 PLA2R 단백질에 대한 자가항체의 양을 감소시키는 것, PLA2R에 대한 자가항체의 생산을 감소시키거나, 억제하거나 정지시키는 것, 면역계의 억제, 및 자가항체가 신장 사구체에 결합되는 경우에 자가항체의 활성과 관련된 염증 및 분해/손상을 감소시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "대상"에는, 비제한적으로, 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비, 또는 붉은털 원숭이가 포함된다. 한 실시양태에서, 대상은 포유동물이다. 또 다른 실시양태에서, 대상은 인간이다.

본원에서 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 제시된 규정된 요소들에 더하여 또 다른 요소들이 또한 존재할 수 있음을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한보다는 포함(inclusion)을 지시한다.

본원에서 사용된 용어 "특발성 MN"은 본 발명의 발견 이전의 B형 간염 또는 루푸스와 같은 임의의 공지된 2차 병인에 의해 야기되지 않는 MN을 기술하도록 현재 사용된다. 본 발명의 발견을 기초로, "특발성 MN"은 PLA2R-관련 MN, 또는 현재 특발성 MN으로 칭해지고 항-PLA2R 항체와 관련된 것에 대한 임의의 또 다른 추후의 호칭을 지칭한다.

PLA2R 내의 도메인들에 관한 용어 C형 렉틴 ("CTLD") 또는 탄수화물-인식 도메인 ("CRD")은 상호교환가능하게 사용된다.

본 발명의 실시양태들은 MN 환자의 혈청이 사구체에서 발견되는 M형 PLA2R에 대해 반응성인 항체를 함유한다는 발견을 기초로 한다. 특발성 막성 신장병증 (MN)은 사구체를 표적화하는 자가면역 질환인 것으로 간주되지만, 주요 표적 항원은 여전히 정의하기가 어렵다. 본 발명가들은 MN 환자들로부터의 혈청을 웨스턴 블롯 (WB)에 의해 인간 사구체 단백질들에 대한 반응성에 대해 스크리닝하였고, 통상적으로 검출된 200 kDa 당단백질을 발견하였다. 그후, 본 발명가들은 이러한 200 kDa 당단백질을 확인하기 위해 부분 정제 및 질량 분광법적 분석을 진행하였다. 이는 M형 PLA2R이다. 가용성 아이소형(isoform) 및 막-결합형 아이소형의 PLA2R1 (180 kDa)이 발견된다. 생체 내에서, PLA2R은 신장에서 발현된다. 사구체 추출물로부터의 이러한 천연 PLA2R이 추가로 특성화되었고, 현재 단백질 젤 상에서 약 185 kDa인 것으로 결정된다. 본원에 기술된 방법에서의 탈글리코실화 시, 이는 약 145 kDa이다.

본 발명가들은 WB에 의해 MN 환자의 약 70-82％에 재조합 PLA2R (rPLA2R)과 반응성인 항체가 있었음을 발견하였고, 인간 혈청은 정상인의 사구체의 추출물로부터 천연 단백질을 면역침전 (IP)시킬 수 있다. 정상 자원자 및 신장증 대조군으로부터의 대조군 혈청, 뿐만 아니라 WB에 의해 기존에 비-반응성인 MN 환자로부터의 혈청에서는 rPLA2R가 확인되지 않거나 천연 단백질이 면역침전되지 않는다. 환자의 혈청 내의 반응성 면역글로불린의 대부분은 특발성 MN에서의 사구체 침착물에서 우세한 서브클래스인 IgG4이다. 본 발명가들은, 인간 신장의 냉동절편 상에서의 면역형광에 의해 검출된 바와 같이, PLA2R이 발세포 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 또한, PLA2R 및 IgG4 양쪽 모두가 MN 환자로부터의 생검 검사물 상에서 질환의 특징인 상피하 침착물에 전형적인 미세 과립 패턴으로 공동-국소화된다. 이론에 한정되기를 원치 않으면서, PLA2R에 대한 환자의 혈청 내의 자가항체는 신장 사구체 내의 PLA2R에 결합하여, 신장에 대한 구조적 손상을 야기하고, 신장 기능을 손상시킨다. 이론에 한정되기를 원치 않으면서, PLA2R에 대한 자가항체의 결합은 발세포에 대한 준치사 손상을 야기하고, 대량 단백뇨를 유도한다. 이제 특발성 MN 항체의 주요 표적이 PLA2R으로 확인됨에 따라, 이는 순환 자가항체를 측정하도록 디자인된 면역검정으로 질환을 더 초기에 덜 침습적으로 검출하는 것을 허용할 것이고, 또한 치료에 대한 응답을 모니터링하는 수단에 이를 것이다. 또한, IgG1, IgG2, 및 IgG3 서브클래스의 PLA2R 자가항체가 또한 검출되었다. 본 발명가들은 자가항체가 포유류 PLA2R, 예컨대 인간, 토끼, 및 돼지 PLA2R에 대해 반응성이라는 것을 또한 발견하였다.

부종 및 소변 내의 다량의 단백질을 특징으로 하는 신장 증후군은 막성 신장병증 (MN), 국소성 분절성 사구체경화증, 미세 변화 질환, 당뇨병성 신장병증, 막증식성 사구체신염, 뿐만 아니라 기타 원인들이 포함되는 다수의 잠재적인 원인이 있는 비교적 통상적인 신장 장애이다. 신장 용태의 징후 및 증상 중 일부를 경감시키는 비-특이적 치료법들이 있지만, 근원적인 질환에 관한 구체적인 지식이 명확한 치료를 안내하는데 일반적으로 필요하다. 신장 증후군 환자가 외래 환자로서 또는 병원에서 최초로 평가되는 경우, 혈청학에 의해 검출가능한 잠재적인 원인을 찾기 위해 일반적으로 의사가 일련의 혈액 테스트를 지시한다 (예를 들어, 소변 침전물 내의 전형적인 발견물의 환경에서의 항-핵 항체 (ANA) 및/또는 항-이중 가닥 DNA 항체의 존재는 루푸스 신장염을 시사할 것이다). MN을 확인하기 위한 혈청학적 테스트가 현재 없고, 다수의 기관에서의 하룻밤 동안의 입원을 필요로 하는 침습성 절차이고 대형 내출혈에 의해 복잡해 수 있는 신장 생검에 진단이 배타적으로 의존한다. MN은 다수의 2차 요인, 예컨대 전신 홍반 루푸스, B형 간염 또는 매독에 의해 야기될 수 있고, 이러한 원인을 찾기 위해 혈액 테스트가 일상적으로 수행된다 (각각 ANA, 항-B형 간염 항원, 신속 혈장 리에이진 (RPR)). 그러나, 미국에서, MN은 기원이 더욱 종종 원발성이거나, 또는 특발성이고, 상기 언급된 바와 같이 이러한 형태에 대한 혈액 테스트가 현재 존재하지 않는데, 이는 이러한 자가면역 질환에서 표적화되는 항체가 현재 시점까지 확인되지 않았기 때문이다.

성인 신장 증후군의 빈번한 원인인 막성 신장병증은 오랫동안 탐구된 표적 항원을 알지 못함에도 불구하고 자가면역 질환인 것으로 널리 생각된다. MN에 대한 자가면역 기초에 대한 지원의 대부분은 하이만 신장염 (HN: Heymann nephritis)의 래트 모델 (병리학적 수준에서 인간 질환과 실질적으로 동일함)에 대한 수십년의 연구로부터 유래된다. HN에서, 표적 항원은 신장에서 단백질의 반(semi)-선택적 흡수를 담당하는 LDL 수용체 패밀리에 속하는 분자인 메갈린이다. 이는 래트에서는 발세포 상에 존재하지만, 인간에서는 그렇지 않고, 순환 항체가 원위치에서 이러한 단백질에 결합하여, 사구체 기저막 내로 항체-항원 복합체가 박리되도록 하여, HN 및 MN 양쪽 모두에 특징적인 상피하 침착물에 이르는 것으로 나타났다.

대조군인 건강한 개체들 및 비-MN 신장병증 환자들로부터의 혈청은 MN 환자의 혈청과 달리 PLA2R과 반응하는 자가항체를 함유하지 않거나 이러한 항체가 매우 낮은 양 또는 검출가능하지 않은 양으로 있기 때문에, PLA2R 항체의 존재의 검출이 MN에 대한 진단 도구로서 사용될 수 있다. 간단한 혈액 샘플을 사용하여 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 테스트하고 이를 검출할 수 있다. 이같은 방법은 침습성 기술인 현재의 신장 조직 생검 진단 방법보다 고도로 유리할 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, 포스포리파제 A2 수용체에 대해 반응성인 항체의 존재를 검출하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계를 포함하는, 대상에서 막성 신장병증을 진단하는 방법이 본원에서 제공된다. 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정에 의해 항체가 검출될 수 있다. 면역검정은 혈청학적 면역검정 또는 혼탁 면역검정일 수 있다. 대상은 포유동물, 예컨대 개, 고양이, 또는 인간이다. MN에 걸리지 않은 또는 MN과 관련된 증상, 예를 들어 소변 내의 단백질이 없는 건강한 대상에서는 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)에 대한 자가항체가 검출가능하지 않다. PLA2R에 대해 반응성인 항체가 MN에 걸린 것으로 추측되는, 예를 들어, 소변 내에 단백질이 있는 대상에서 검출되는 경우, 항-PLA2R 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸을 가능성을 지시한다. 예를 들어, 검출가능하지 않은 양의 항-PLA2R 자가항체는 인간 혈청이 1:100으로 희석되어 본원에 기술된 블롯 분석법에서 사용되는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행된 웨스턴 블롯 분석에서 가시적인 밴드가 관찰되지 않는 것을 의미한다. 매우 낮은 양의 항-PLA2R 자가항체에 관하여, 이러한 낮은 양은 건강한 비-MN 대상들의 집단에서 발견되는 평균량이다. 용어 "대상들", "개체들" 또는 "환자들"은 상호교환가능하게 사용된다. 실시예 1에 기재된 통상적인 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 결정된, 건강한 비-MN 개체 또는 건강한 비-MN 개체들의 집단에서의 항-PLA2R 자가항체의 양이 배경 수준, 기준 수준 또는 대조군 수준으로 간주될 수 있다. 건강한 비-MN 개체들로부터 수집된 혈청을 1:100으로 희석하여, 웨스턴 블롯 분석법에서 사용한다. 가시적인 밴드의 강도를 밀도측정법에 의해 정량하고, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 계산한다. 이상적으로는, 집단에는 약 25명, 바람직하게는 이를 초과하는 건강한 비-MN 개체가 있다. 통계, 평균값 및 1-차수의 표준 편차를 컴퓨터 시스템 및 데이터 저장 매체에 업로딩한다. 항-PLA2R 자가항체가 이러한 평균량보다 10％ 이상 더 많은 환자는, 특히 환자가 질환의 임상적인 특색, 예를 들어 단백뇨 및 신장 증후군을 또한 나타낸다면, MN에 걸렸을 것이다.

한 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계; 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계; 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 표지되고 샘플로부터의 항체에 대해 반응성인 검출 항체를 첨가하는 단계; 임의의 결합되지 않은 표지된 검출 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 및 표지를 검출가능한 신호로 전환시키며, 이때 검출가능한 신호의 존재는 대상에서의 MN 가능성을 지시하는 것인 단계를 포함하는 면역검정이 본원에서 제공된다.

일부 실시양태에서, 효소, 형광 화합물 또는 금속이 있는 표지, 또는 화학발광 화합물이 있는 표지에 공유결합으로 연결시킴으로써 검출 항체가 표지된다. 예를 들어, 검출 항체가 카탈라제(catalase)로 표지될 수 있고, 요오드화칼륨, 과산화수소 및 티오황산나트륨을 포함하는 비색 기질 조성물이 전환에서 사용된다; 효소는 알코올 탈수소효소일 수 있고, 알코올, pH 지시물 및 pH 완충제를 포함하는 비색 기질 조성물이 전환에서 사용되며, 이때 pH 지시물은 중성 적색이고, pH 완충제는 글리신-수산화나트륨이다; 또한 효소가 하이포잔틴 산화효소일 수 있으며, 잔틴, 테트라졸륨 염 및 4,5-디하이드록시-1,3-벤젠 디설폰산을 포함하는 비색 기질 조성물이 전환에서 사용된다.

한 실시양태에서, 검출 항체는 대상의 종에 대해서만 특이적으로 반응성이다. 예를 들어, 인간이면, 검출 항체는 항-인간 항체이다. 대상이 말이면, 검출 항체는 항-말 항체이다. 대상이 개이면, 검출 항체는 항-개 항체이다.

한 실시양태에서, 검출가능한 신호가 증가되는 양의 기지량의 PLA2R 또는 단편의 면역검정으로부터 유래된 적정 곡선으로부터의 검출가능한 신호들의 셋트에 비교된다.

또 다른 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계; 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계; 항체-단백질 복합체의 형성으로부터 초래되는 광 산란 강도를 측정하며, 이때 대조군 광 산란 강도의 10％ 이상의 광 산란 강도는 대상에서의 MN 또는 MN 재발의 가능성을 지시하는 것인 단계를 포함하는 면역검정이 본원에서 제공된다. 대조군 광 산란 강도는 샘플의 부재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도이다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 광 산란 강도는 건강한 비-MN 대상으로부터의 샘플의 존재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도이다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 광 산란 강도는 건강한 비-MN 대상들의 집단에 대해 수득된 평균 광 산란 강도이다. 한 실시양태에서, 탁도계에서 광 산란 강도가 측정된다. 증가는 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 500％ 이상, 1000％ 이상, 또는 이를 초과하는 값 (10-1000％ 사이의 모든 백분율 포함)이다.

한 실시양태에서, 대상에서의 MN은 특발성이고, 신장 생검이 대상에서 수행되지 않는다. 한 실시양태에서, 대상은 인간이고, 대상으로부터의 샘플은 혈액 샘플, 예를 들어 혈청 또는 혈장이다.

한 실시양태에서, PLA2R은 포유류 PLA2R, 예컨대 인간 또는 돼지 PLA2R이다.

한 실시양태에서, 항-PLA2R 항체는 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체이다.

한 실시양태에서, 면역검정은 혈청학적 면역검정이다.

일부 실시양태에서, PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편은 고체 지지체 상에 침착되거나, 또는 지지체 상에 단백질을 고정하도록 커플링될 수 있다. 지지체는 딥스틱, 테스트 스트립, 라텍스 비드, 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식일 수 있다. 한 실시양태에서, 기지량의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체에 침착되거나 커플링된다. 단백질의 범위는 0.1 ng - 1 ㎎ 사이이다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 면역검정은 일정 기간에 걸쳐 수득된 대상으로부터의 복수의 샘플에 대해 수행된다. 한 실시양태에서, 복수의 샘플은 2년 이상의 기간 동안 2개월 또는 3개월 마다 수득된다. 예를 들어, 용태의 진행 및 면역억제 치료의 유효성을 모니터링하기 위해 3개월 마다 MN으로 진단된 환자로부터 혈액 샘플을 수집한다. 각각의 혈액 샘플의 면역검정 결과를 기록하고, 샘플 날짜를 적는다. 각각의 혈액 샘플의 면역검정 결과를 3개월 전에 취해진 이전의 혈액 샘플에 대해 수득된 결과와 비교한다. 이를 면역억제 치료를 시작하기 전의 초기 진단 동안 수득된 결과와 또한 비교할 수 있다.

한 실시양태에서, 각각의 면역검정의 검출가능한 신호 또는 광 산란 강도를 선행 시점으로부터 수득된 샘플의 검출가능한 신호 또는 광 산란 강도와 비교하며, 이때 검출가능한 신호 또는 광 산란 강도의 5％ 이상, 10％ 이상 또는 이를 초과하는 감소 (20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율의 감소 포함)는 대상에서의 MN의 효과적인 치료를 지시한다. 선행 시점은 바로 연속적인 선행 시점, 또는 더 빠른 시점, 예를 들어, 6개월 전 또는 면역억제 치료를 시작하기 전의 초기 진단 동안 수득된 것일 수 있다.

한 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 대상으로부터의 샘플에서 결정하는 단계; (b) 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 동일한 대상으로부터의 샘플에서 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및 (c) 2개의 시점에 대해 수득된 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 감소는 치료가 효과적임을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 막성 신장병증에 대해 치료되고 있는 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정에 의해 항체 수준이 검출될 수 있다. 처음에는 대상이 MN으로 진단되었고, PLA2R에 대한 자가항체가 검출가능한 양으로 있었다. 치료 시, 예를 들어, 면역억제 요법으로의 치료 시, 시간이 지남에 따라, PLA2R에 대한 검출가능한 자가항체의 양이 감소된다. 이상적인 경우에, 자가항체의 양이 본원에 기술된 검출 방법의 검출가능한 수준 미만으로 떨어져야 하고, 대상은 이러한 장애에 대해 완화 상태인 것으로 간주된다. 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 감소는 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 혈청 내의 PLA2R에 대한 자가항체의 역가에서의 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 100％ 및 10-100％ 사이의 모든 백분율의 하락이다. 검출 한계 미만은 항체 수준이 대상이 처음에 MN으로 진단되고 치료가 수행되지 않은 제1 시점에 비교하여 95-100％ 이상으로 감소되는 경우이다. 사용된 분석법은 대상으로부터 여러 시점에 수집된 샘플 모두에 대해 동일하다. 자가항체의 감소되는 역가는 대상에서 치료가 효과적임을 지시한다.

다른 실시양태에서, 제1 시점에 비교하여 제2 시점에 항체 수준이 감소되지 않는다. 대신에, 증가 또는 안정적인 수준의 항체가 있을 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 시점에 비교하여 제2 시점에 항체 수준이 증가되고, 제1 시점에 검출가능한 자가항체가 없다. 이는 환자가 재발하였고, MN이 다시 발생하였음을 지시한다.

한 실시양태에서, 제1 시점에 비교하여 제2 시점에 항체 수준이 증가되고, 제1 시점에 검출가능한 자가항체가 있다. 이는 질환의 악화 및/또는 효능이 있는 치료의 결여를 지시한다. 증가는 30％ 이상, 50％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 500％ 이상, 1000％ 이상, 또는 이를 초과하는 값이고, 10-1000％ 사이의 모든 백분율을 포함한다.

한 실시양태에서, 통계적 분산 분석에서 제2 시점 및 제1 시점에 검출가능한 자가항체가 필적하게 유사한 경우인 항체의 안정적인 수준은 제1 시점으로부터의 자가항체 수준으로부터의 약 1％, 2％, 3％, 4％, 5％ 및 1％-5％ 사이의 모든 백분율의 편차이다. 안정적인 수준의 항체는 치료 기간이 불충분했거나 (즉, 임상적으로 지시된다면 지속되어야 함), 또는 치료가 비효과적인, 안정적인 질환을 지시한다.

본원에서 사용된, PLA2R에 대한 "자가항체" 및 "항체"라는 용어들은 상호교환가능하게 사용된다.

다른 실시양태에서, 면역검정은 [Binder SR., Lupus. 2006, 15:412-21]에 기술된 바와 같이 천연 또는 재조합 PLA2R 단백질로 코팅된 비드를 포함한다. 독특한 신원이 확립되도록 염색되는 폴리스티렌 비드가 통상적으로 사용된다. 유동 세포측정법에서 검출이 수행된다. 다중 기술을 사용하는 자가항체 검출. 또 다른 유형의 비드-기반 면역검정들, 예를 들어 레이저 비드 면역검정 및 관련된 자기 비드 분석법 ([Fritzler, Marvin J; Fritzler, Mark L, Expert Opinion on Medical Diagnostics, 2009, pp. 3: 81-89])이 당업계에 주지되어 있다.

또 다른 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 대상으로부터의 샘플에서 결정하는 단계; 및 (b) 후속 시점, 즉 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 동일한 대상으로부터의 샘플에서 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계를 포함하고, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점에 PLA2R에 대한 검출가능한 자가항체가 없는 것은 대상이 MN에 대해 완화 상태에 있음을 지시하는 것인, 막성 신장병증에 대한 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정에 의해 항체 수준이 검출될 수 있다. 검출 한계는 항체 수준이 제1 시점의 수준에 비교하여 95-100％ 이상으로 감소되는 경우이다.

추가적인 실시양태에서, (a) 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 대상으로부터의 샘플에서 결정하는 단계; (b) 후속 시점, 즉 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 동일한 대상으로부터의 샘플에서 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및 (c) 2개의 시점의 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 5％ 이상의 증가는 MN의 재발이 있음을 지시하는 것인 단계를 포함하는, 막성 신장병증에 대한 대상에서의 예후 평가 방법이 본원에서 제공된다. 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정에 의해 항체 수준이 검출될 수 있다. 증가는 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 500％ 이상, 1000％ 이상, 또는 이를 초과하는 값이고, 10-1000％ 사이의 모든 백분율을 포함한다.

한 실시양태에서, 대상은 MN에 대해 성공적으로 치료되었고, 혈액 순환 내에 PLA2R에 대한 검출가능한 자가항체가 없으며, 현재 MN에 대한 어떠한 치료도 받고 있지 않다. 이러한 대상에서, 제1 시점에는 검출가능한 자가항체가 없다. 대상은 이전에 MN으로 진단되었고, PLA2R에 대한 검출가능한 양의 자가항체가 있다. 치료 시, 예를 들어, 면역억제 요법으로의 치료 시, 시간이 지남에 따라, PLA2R에 대한 자가항체의 양이 본원에 기술된 검출 방법의 검출가능한 수준 미만으로 하락하고, 대상은 MN에 대해 완화 상태이다. PLA2R에 대한 검출가능한 양의 자가항체의 재출현, 및 시간이 지남에 따라 자가항체가 점진적으로 증가하는 것은 MN이 대상에서 다시 발생하였음을 지시한다.

또 다른 실시양태에서, 대상은 현재 MN에 대해 치료 중이고, 대상의 혈액 순환 내에 검출가능한 PLA2R에 대한 자가항체가 있다. 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 증가는 질환 상태가 악화되고 있고 현재 요법의 치료가 질환을 느리게 하는데/정지시키는데 효과적이지 않음을 지시한다.

또 다른 실시양태에서, 대상은 현재 MN에 대해 치료 중이고, 대상의 혈액 순환 내에 검출가능한 PLA2R에 대한 자가항체가 있으며, 제1 시점 및 제2 시점의 자가항체 수준이 통계적 분산 분석에서 필적하게 유사하다. 이는 치료 동안 대상에게 일정 수준의 자가항체가 있음을 지시하여, 치료 기간이 불충분하였음 (즉, 임상적으로 지시된다면 지속되어야 함) 또는 치료가 비효과적임을 지시한다.

한 실시양태에서, MN은 특발성이다. MN에 걸린 것으로 추측되는 대상은 MN의 일반적인 원인, 예를 들어, 전신 홍반 루푸스, B형 간염, 및 매독에 대해 음성으로 테스트되었다. 숙련의는, 제거 과정에 의해, MN에 대한 모든 가능한 원인을 제외시킬 것이다. 남는 것은 애매한 또는 미지의 원인, 예컨대 가능하게는 PLA2R에 대한 자가-면역 자가항체로부터의 임시적인 MN 진단이다. 이제 본원에 기술된 비-침습성 진단 방법이 확정을 위해 이같은 대상에게 적용될 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 MN 진단 방법은 MN에 대한 모든 가능한 원인을 제외시키기 위한 일상적인 스크리닝을 받지 않았으면서 MN의 증상들을 나타내는 환자에게 적용된다. 본원에 기술된 방법은 진단 목적을 위해 단백뇨와 같은 MN의 증상들을 나타내는 환자에게 수행되는 일상적인 테스트 셋트의 일부분일 수 있다. 테스트는 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정, 예를 들어 혈청학적 면역학적 분석법일 수 있다. 이같은 환자들은 MN의 확정 진단을 위한 생검을 받지 않았다. 유사하게, 본원에 기술된 방법은 생검 또는 혈청학적 테스트에 의해 MN에 걸린 것으로 이미 알려져 있고 MN에 대해 치료 중인 환자에 대해 수행되는 일상적인 혈청학적 면역학적 테스트 셋트의 일부분일 수 있다. 이러한 방법은 면역억제 요법 효능의 모니터링 및 환자에서의 예후 평가에 유용하다.

한 실시양태에서, 대상은 포유동물이다. 또 다른 실시양태에서, 대상은 인간이다. 본원에 기술된 방법은 신장이 있고, PLA2R을 발현하며, 항체를 포함하는 면역계가 있는 임의의 포유동물에게 적용가능한 것으로 생각된다.

한 실시양태에서, MN에 걸린 것으로 추측되고 있는 환자는 MN의 확정 진단을 위한 신장 생검을 받지 않았다.

본 발명가들은 MN 환자의 혈청 내의 항체가 포유류 PLA2R 예컨대 인간, 토끼 및 PLA2R에 대해 면역학적으로 반응성이라는 것을 발견하였다. 따라서, 본원에 기술된 방법이 인간 포스포리파제 A2 수용체 또는 돼지 PLA2R에 대해 반응성인 항체를 검출하는 단계를 포함하는 것이 본원에 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "~에 대해 반응성", "~에 반응한다" 또는 "~와 반응성"은 인간 또는 돼지 PLA2R을 인식하고 이러한 PLA2R에 결합하는 항체를 지칭한다. 인식 및 결합은 생화학 및 면역학에 의해 잘 특성화되는 표준 항체-항원 상호작용이다.

한 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플은 혈액 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 전혈, 혈청, 또는 혈장이다.

한 실시양태에서, 항체는 IgG4 서브클래스의 항체이다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R 자가항체는 서브클래스 IgG3 및 IgG1의 항체이다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R 자가항체는 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체이다.

한 실시양태에서, MN에 대한 치료는 면역억제 요법, 예를 들어, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 아자티오프린, 인플릭시맵, 오말리주맵, 다클리주맵, 아달리무맵, 에쿨리주맵, 에팔리주맵, 나탈리주맵, 오말리주맵 및 라파마이신이다. 추가적인 실시양태에서, MN에 대한 면역억제 치료는 사이클로포스파미드, 클로람부실 및 리툭시맵을 추가적으로 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 위해, PLA2R에 대한 자가항체의 검출이 혈청학적 면역검정 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의해 수행된다. 표준 프로토콜을 사용하여 ELISA 및 당업계에 공지되어 있는 기타 면역검정이 일반적으로 생성되며, 이때 주요 변동은 표적 항원 또는 포획 항원이다. 본원에 기술된 방법을 위해, 항원은 인간 PLA2R, 돼지 PLA2R, 또는 이들의 단편이다. 포유류 또는 곤충 세포주에서 발현되는 재조합 전장 PLA2R을 정제하여 포획 항원으로 사용할 수 있다. 이러한 단백질은 세포주에서 유래되는 다른 단백질들로부터의 정제를 용이하게 하도록 N- 또는 C-말단 FLAG 태그(tag)와 함께 발현될 수 있다. ELISA 플레이트가 일정 농도의 PLA2R 또는 단편으로 코팅될 것이다. 플레이트를 소 카세인 또는 혈청 알부민 또는 기타 차단제로 차단하여, 샘플의 비-특이적 결합을 방지할 수 있다. 테스트될 인간 혈청을 표준 희석물 (1:40, 1:80, 1:160 등)로 웰에 첨가한 후, 일상적으로 세정할 수 있다. 결합된 IgG를 2차 항-인간 IgG 항체로 검출할 수 있다. 일련의 세정 후, 비색 기질을 모든 웰에 첨가하고, 발색시킬 수 있다. ELISA 플레이트를 미량역가 플레이트 판독기 상에서 판독할 수 있다. 양성 또는 음성인 것으로 알려진 MN 혈청 샘플, 뿐만 아니라 정상인 자원자로부터의 혈청을 사용하여, 양성 테스트 결과를 구성할 범위를 규정하기 위해 적합한 절단값 역가를 확립하는 것이 가능하다. MN에 걸리지 않은 또는 MN와 관련된 증상, 예를 들어, 소변 내의 단백질이 없는 건강한 대상에서는 PLA2R에 대한 자가항체가 검출가능하지 않다. PLA2R에 대해 반응성인 항체가 MN에 걸린 것으로 추측되는, 예를 들어, 소변 내에 단백질이 있는 대상에서 검출되는 경우, 항-PLA2R 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸을 가능성을 지시한다.

한 실시양태에서, ELISA가 면역학적으로 활성인 MN, 즉 PLA2R에 대한 자가항체가 있는 활성 MN에 대한 간단한 혈청학적 분석법을 제공할 수 있다. 이러한 간단한 혈청학적 분석법이 강한 단백뇨가 있는 환자에서 또 다른 광범위하게 사용되는 진단성 혈액 테스트 또는 다른 면에서 정보를 제공하는 혈액 테스트, 예컨대 항-핵 항체, 항-B형 간염 및 C형 간염 항체, 및 보체 C3 및 C4 수준과 함께 처방될 수 있다. 이러한 분석법에서 양성으로 테스트된 환자의 경우, 생검을 정당화할 수 있는 다른 전형적이지 않은 특색들이 존재하지 않는 한, 치료를 안내하도록 신장 생검이 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 음성으로 테스트되고 설명되지 않는 단백뇨가 여전히 있는 환자에서는, 신장 생검이 여전히 지시된다. 기술된 바와 같은 면역검정은 하룻밤 동안의 입원을 종종 필요로 하는 신장 생검보다 상당히 저렴할 수 있다. 또한 이는 환자 및 의사 양쪽 모두에게 훨씬 더 편리할 수 있다.

사구체에서의 구조적 변화로 인해, 면역학적 질환이 끝난 후에도 단백뇨가 MN 환자에서 (일시적으로 또는 영구적으로) 지속될 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 단백질 배설 수준에만 의존하면 필요한 것보다 훨씬 더 길게 독성 면역억제 약물로 환자를 치료하게 될 수 있다. 따라서, 기술된 ELISA로 자가항체의 소멸을 모니터링하는 것은 면역억제 요법은 정지되어야 하지만 항-단백뇨 요법 (예를 들어, 안지오텐신-전환 효소 억제제)은 계속되어야 할 때 막성 신장병증의 치료에서의 전이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

한 실시양태에서, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 가용성 PLA2R 또는 이의 단편을 제공함으로써, 이러한 가용성 단백질이 유인(decoy) 항원으로서 기능할 수 있고, 자가항체를 신장 사구체 내의 PLA2R로부터 자가항체를 격리할 수 있어, 신장에 대한 잠재적인 손상을 감소시킨다. PLA2R은 인간 또는 돼지 PLA2R일 수 있다. 한 실시양태에서, 혈청으로부터의 PLA2R에 대한 자가항체의 치료 또는 흡착에 적절한 단편은 PLA2R의 CTLD 또는 CRD 4, 5, 6을 포함하는 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 인간 또는 돼지 PLA2R의 세포외 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 단편은 서열 5 또는 서열 5의 더 작은 일부분, 예컨대 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 (10-95％ 사이의 모든 백분율 포함)이다. MN의 치료에서 사용될 수 있는 서열 5의 서열로부터 유래된 아미노산 잔기 10-50개 사이의 펩티드가 또한 고려된다. 한 실시양태에서, 여러 펩티드들의 칵테일이 치료에 사용된다. 고려되는 펩티드들은 더 긴 혈청 반감기를 위한 또 다른 단백질, 나란히 연결된 펩티드 또는 원형 펩티드와 융합될 수 있다.

한 실시양태에서, 막성 신장병증은 특발성이다. 대상은 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 양성으로 테스트되었다. 한 실시양태에서, 자가항체는 인간 PLA2R 또는 돼지 PLA2R에 대해 반응성이다.

또 다른 실시양태에서, 대상에서의 샘플로부터 PLA2R에 대해 반응성인 항체를 제거하는 단계를 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 항원으로서의 PLA2R 또는 이의 단편과의 면역흡착에 의해 혈액으로부터 항체를 제거하고, 항체의 제거 후 대상 내로 샘플을 돌려보낸다. 흡착에 적절한 단편은 PLA2R의 CTLD 또는 CRD 4, 5, 6을 포함하는 단편이다. 인간 PLA2R 수용체 1 아이소형 1 전구체 (진뱅크(GENBANK)™ 접속 번호 NP_031392.3, 서열 2)에 대해, 적절한 단편은 PLA2R의 CRD 4, 5, 6으로 구성된 아미노산 잔기 650개 내지 1100개일 수 있다.

한 실시양태에서, 대상에서의 막성 신장병증의 치료를 위한 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도가 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대상에서의 막성 신장병증의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도가 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 샘플은 혈액이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 혈청 또는 혈장이다. 한 실시양태에서, 대상은 인간이고, 막성 신장병증은 특발성이다. 자가항체는 인간 PLA2R 또는 돼지 PLA2R 수용체에 대해 반응성이다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG4 서브클래스의 항체이다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R 자가항체는 서브클래스 IgG3, IgG2, 및 IgG1의 항체이다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R 자가항체는 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체이다. PLA2R에 대한 자가항체의 면역흡착은 순환 자가항체의 양을 감소시키는 것을 돕고, 이에 의해 신장에 대한 잠재적인 손상을 감소시킨다. 이러한 치료는 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 존재의 면역학적 확증 후 및 임의의 면역억제 요법의 개시 전에 초기에 적용될 수 있다. 이는 면역억제 요법이 면역계 및 대상에서의 자가항체의 생산에 대한 효과를 지닐 수 있기 전에 이러한 초기 동안에 특히 유용하다.

한 실시양태에서, PLA2R에 대한 자가항체의 면역흡착은 혈액, 혈청 또는 혈장을 고정된 PLA2R 상에 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 재조합 인간 또는 돼지 PLA2R 또는 단편이 당업계에 공지된 불활성 무균성 매트릭스, 예컨대 세파로스 상에 고정될 수 있다. PLA2R에 대한 자가항체는 고정된 PLA2R 또는 단편에 결합하여, 매트릭스에 간접적으로 결합되어 남을 것이다. 그후, 혈액, 혈청 또는 혈장을 수집한다. 이렇게 생성된 혈액, 혈청 또는 혈장은 검출가능한 PLA2R에 대한 자가항체가 없거나, PLA2R에 대한 자가항체가 감소되어야 한다. 면역흡착 절차는 무균성 조건 하에 수행되어야 한다. 이제 PLA2R에 대한 자가항체가 고갈된 수집된 혈액, 혈청 또는 혈장을 환자 내로 다시 수혈할 수 있다.

기구, 키트 , 컴퓨터 시스템 및 컴퓨터 데이터 저장

한 실시양태에서, 적어도 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 및 PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 침착되는 하나 이상의 고체 지지체를 포함하는, 대상으로부터의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 확인하기 위한 기구가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 고체 지지체 상에 침착되는 PLA2R 단백질 또는 이의 단편은 지지체 상에 고정된다. 한 실시양태에서, PLA2R 단백질은 인간 또는 돼지 PLA2R 단백질이다. 한 실시양태에서, 고체 지지체는 딥스틱, 테스트 스트립, 라텍스 비드, 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식이다.

한 실시양태에서, 대상은 인간이고, 신장 생검이 대상에서 수행되지 않는다. 한 실시양태에서, 대상으로부터의 샘플은 혈액 샘플이다.

다른 실시양태에서, 본원에 기술된 기구 또는 키트는 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체; 또는 탁도계 큐벳을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정, 예컨대 혈청학적 면역검정 또는 혼탁 면역검정이 이러한 기구에서 수행된다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 기구는 대상에서의 막성 신장병증의 진단을 용이하게 하며, 이때 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체는 대상에서의 막성 신경병증의 가능성을 지시한다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 기구, 및 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 키트는 탁도계 큐벳을 포함한다.

니트로셀룰로스 막, 나일론 막, 고체 유기 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 또는 미국 특허 5,550,375에 기술된 바와 같은 적층된 딥스틱이 포함되지만 이에 한정되지 않는 임의의 고체 지지체를 사용할 수 있다. "딥 스틱" 또는 테스트 스트립 및 기타 고체 지지체의 사용은 다수의 항원에 대한 면역검정의 정황에서 당업계에 기술되어 있다. 3개의 미국 특허 (미국 특허 번호 4,444,880 (H. Tom); 미국 특허 번호 4,305,924 (R. N. Piasio); 및 미국 특허 번호 4,135,884 (J. T. Shen))에 면역화학적 분석법을 통해 가용성 항원을 검출하기 위한 "딥 스틱" 기술의 용도가 기술되어 있다. 이러한 3개의 특허의 장치 및 방법에 "딥 스틱" 상의 고체 표면에 고정된 제1 성분이 "딥 스틱" 상에 고정된 성분에 결합하는 가용성 항원을 함유하는 용액에 노출된 후, 스틱 상의 성분-항원 복합체를 검출하는 것이 광범위하게 기술되어 있다. 당업자는 이러한 "딥 스틱" 기술을 본 발명을 위해 쉽게 개조할 수 있다. 본원에 기술된 발명에서, 항원 PLA2R이 지지체 상에 침착되고, 자가항체가 검출된다.

키트의 예로는 ELISA 분석법 키트, 및 테스트 스트립 및 딥스틱을 포함하는 키트가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. ELISA 키트에서, 과량의 PLA2R 항원이 고체 지지체 상에 고정된다. 미지량의 PLA2R에 대한 자가항체를 함유하는 샘플이 고정된 PLA2R에 첨가되어, 단백질과 항체로 구성된 복합체의 형성이 초래된다. 자가항체에 대해 또한 특이적인 표지된 제2 항체에 의해 복합체가 검출된다. 검출된 표지의 양이 샘플 내에 존재하는 자가항체의 양의 척도이다 (실시예 3 참조).

본원에 기술된 키트의 일부 실시양태에서, 키트는 테스트 스트립 또는 딥스틱을 포함한다.

본원에 기술된 키트의 일부 실시양태에서, 표지된 항체는 효소 표지, 형광 표지, 비오틴 표지 또는 방사성 동위원소 표지에 의해 검출가능하게 표지된다. 또 다른 표지에는 콜로이드성 금 및 라텍스 비드가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 라텍스 비드는 또한 유색일 수 있다. 항체의 표지 방법은, 예를 들어, ["Colloidal Gold. Principles. Methods and Applications", Hayat MA (ed.) (1989-91). Vols 1-3, Academic press, London]; ["Techniques in Immunocytochemistry", Bullock GR and Petrusz P (eds) (1982-90) Vols 1, 2, 3, and 4, Academic Press, London]; ["Principles of Biological Microtechnique", Baker JR (1970), Methuen, London]; [Lillie RD (1965), Histopathologic Technique and practical Histochemistry, 3rd ed, McGraw Hill, New York]; [Berryman MA, et al. (1992), J. Histochem Cytochem 40, 6, 845-857] (모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.

전형적인 콜로이드성 금 표지 기술에서, 고정된 항체에 의해 항원이 포획된 막의 측면 또는 횡류 유동에 의해 또는 용액 내의 적색 강도의 관찰에 의해 관찰되는 경우, 축적된 금 표지의 독특한 적색은 용액 내의 나노그램 양 미만의 양의 단백질을 검출하기 위한 매우 민감한 방법을 제공한다. 콜로이드성 금 접합체는 선택된 단백질 또는 거대분자 (예컨대 항체 또는 항체-기반 모이어티(moiety))로 코팅된 금 입자의 현탁액으로 구성된다. 금 입자는 1-250 nm의 임의의 선택된 크기로 제작될 수 있다. 이러한 금 프로브 검출 시스템은, 특이적 표적과 함께, 예컨대 조직 절편에서 인큐베이션되는 경우, 금 입자 자체의 가시성을 통해 표적을 드러낼 것이다. 육안 검출을 위해, 금 입자는 금 솔(sol)의 축적된 적색을 통해 고체 상 예컨대 블롯팅 막 상의 고정된 항원을 또한 드러낼 것이다. 이러한 금 침전물을 은으로 강화하는 것이 검출의 추가적인 감도를 또한 제공한다. 표지를 위한 콜로이드성 금 시약의 공급원은 스파이-마크(SPI-MARK)™ (항체로 코팅된 200 nm 크기의 유색 라텍스 비드인 폴리스티렌 라텍스 비드), 시그마 알드리치(SIGMA ALDRICH)®, 모레큘라 프로브(Molecular Probes), 방스 래버러토리 인코포레이티드(Bangs Laboratory Inc.), 및 애질런트 테크놀러지(AGILENT® Technologies)로부터 입수가능하다.

본원에 기술된 키트의 다른 실시양태에서, 표지된 항체들 중 하나 이상은 효소로 표지된 항체를 포함한다. 고체 지지체 (예를 들어 미량역가 플레이트 웰) 상의 고정된 PLA2R에 결합되어 포획되는 항-PLA2R가 항-항체, 예를 들어 항-인간 IgG에 접합된 효소에 대한 발색 기질을 첨가함으로써 확인되고, 발색이 광학 기구 예컨대 ELISA 플레이트 판독기에 의해 검출된다.

또 다른 검출 시스템, 예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 시스템을 또한 사용할 수 있다. 스트렙타비딘-과산화효소 접합체 및 발색 기질을 사용하여 정량한다. 이같은 스트렙타비딘 과산화효소 검출 키트가 예를 들어 DAKO (Carpinteria, CA)로부터 시판된다.

별법적으로, 검출 항체 및 PLA2R이 면역검정에서 사용하기 위한 다수의 형광 화합물 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 유로퓸, 루시퍼 옐로우, 로다민 B 이소티오시아네이트 ([Wood, P., Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press, New York, pages 365-392 (1991)]) 중 임의의 것으로 표지될 수 있다. 항체-항원 복합체의 분리를 위한 공지된 기술과 함께, 이러한 형광단이 자가항체의 수준을 정량하는데 사용될 수 있다. 항체 또는 PLA2R이 이소루미놀 또는 아크리디늄 에스테르로 표지될 수 있는 화학발광 면역검정 ([Krodel, E. et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Current Status, John Wiley and Sons Inc. New York, pp 107-110 (1991)]; [Weeks, I. et al., Clin. Chem., 29:1480-1483 (1983)])에 동일하게 적용된다. 또 다른 기술은 검출 항체가 방사성 동위원소 예컨대 ¹²⁵I로 표지된 후에 사용될 수 있는 방사성면역검정 ([Kashyap, M. L. et al., J. Clin. Invest., 60:171-180 (1977)])이다. 이러한 면역검정들 중 일부는 형광 면역검정을 위한 IMX™ (Abbott (Irving, Tex.)) 및 화학발광 면역검정을 위한 시바 코닝(Ciba Corning) ACS 180™ (Ciba Corning (Medfield, Mass.))과 같은 적합한 기기를 사용함으로써 쉽게 자동화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키트는 기지량의 PLA2R 또는 이의 단편의 표준물을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키트는 항-PLA2R 항체 수준의 기준치를 추가로 포함한다. 기준치는 건강한 비-MN 인간들의 집단으로부터의 샘플 내의 항-PLA2R 항체의 평균 수준이다. 기준치는 수치로서, 또는 pg/㎖-㎍/㎖로 제시되는 항-PLA2R 항체의 기지량 또는 역가의 표준물로서 제공될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키트는 샘플 수집을 위한 하나 이상의 샘플 수집 용기를 추가로 포함한다. 수집 기구 및 용기에는 주사기, 랜싯, BD VACUTAINER® 혈액 수집 튜브가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 키트는 키트의 사용 및 결과 해석을 위한 설명서를 추가로 포함한다. 예를 들어, 도 9에 제시된 차트는 결과의 해석을 나타낸다.

예를 들어, 전형적인 ELISA-기반 키트 분석법은 혈청을 함유하는 샘플을 미량역가 플레이트 웰 내로, 바람직하게는 이중 또는 삼중으로 (도 11에서와 같이), 분배하는 단계를 수반할 것이다. 웰은 고정된 PLA2R로 코팅된다. 또한, 키트 내에 제공된 고정된 양의 표준 항-IgG를 미량역가 플레이트 내의 기준 웰 내로 키트의 설명서에 따라, 또한 바람직하게는 이중 또는 삼중으로, 또한 분배한다. 표준 항-IgG의 이러한 고정된 양은 건강한 대상들 내에 일반적으로 존재하는 항-PLA2R 자가항체의 기준치의 2배 이상에 상응한다. 항-PLA2R 자가항체의 기준치보다 2배 더 낮은 값에 상응하는 제2의 고정된 양의 표준 항-IgG가 기준 웰의 또 다른 셋트에 첨가될 수 있다. 이어서, 항-PLA2R 자가항체에 대해 특이적인 표지된 검출 항체, 예를 들어 항-IgG 항체를 샘플 웰 및 기준 웰 양쪽 모두에 첨가한다. 이는 항-PLA2R 자가항체가 PLA2R와 항-IgG 항체 사이에 샌드위치되는 "샌드위치" ELISA 분석법이다. 검출되는 표지의 양은 웰 내에 존재하는 항-PLA2R 자가항체의 양의 척도이기 때문에, 다양한 웰에서 검출된 표지의 양은 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 수준을 건강한 대상 내에 일반적으로 존재하는 항-PLA2R 자가항체의 기준치와 비교하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 표지가 유색 라텍스 비드인 경우, 기준 웰에 비교하여 샘플 웰에서 색 강도가 더 큰 것은 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 수준이 건강한 대상 내에 일반적으로 존재하는 항-PLA2R 자가항체의 기준치의 2배보다 더 높다는 것을 지시한다. 반면에, 샘플 웰의 색 강도가 기준 웰에 비교하여 더 낮으면, 이는 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 수준이 건강한 대상 내에 일반적으로 존재하는 항-PLA2R 자가항체의 기준치보다 2배 이상 더 낮다는 것을 지시한다.

본 발명의 실시양태는 대상에서의 MN을 진단하거나, 대상의 MN이 발달될 위험을 평가하거나, 또는 MN에 걸린 대상의 치료 효능을 모니터링하기 위한 벙법을 수행하기 위한 시스템 (및 컴퓨터 시스템을 실행시키기 위한 컴퓨터 판독가능 매체)을 또한 제공한다.

한 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 지시하는 면역검정으로부터의 검출가능한 신호를 포함하는 자가항체 정보를 측정하는 측정 모듈; 측정 모듈로부터 출력된 데이터를 저장하도록 설정된 저장 모듈; 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 검색된 콘텐츠를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및 검색된 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 검색된 콘텐츠에서, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈을 포함하는 시스템이 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대한 자가항체 정보를 수신 및 출력하도록 설정되며, 이때 자가항체 정보가 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 수준을 측정하는 결정 모듈; 결정 모듈로부터의 출력 정보를 저장하도록 설정된 저장 모듈; 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 자가항체가 없으면 대상이 완화 상태이거나 또는 선행 기록에 비해 10％ 이상의 감소가 있으면 MN에 대한 치료가 대상에서 효과적인 것인 출력 모듈을 포함하는, 대상에서의 막성 신장병증 (MN)의 예후 평가를 용이하게 하는 시스템이 본원에서 제공된다.

일부 실시양태에서, 대조군 데이터는 동일한 대상으로부터의 이전 데이터를 포함하며, 이때 이전 데이터는 검출가능한 양의 자가 항체를 지시하였다.

한 실시양태에서, PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대한 면역검정으로부터의 신호 수준을 나타내는 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 데이터를 함유하는 데이터 저장 모듈; 데이터 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하는 비교 모듈; 및 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터에 비해 10％ 이상의 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈을 포함하는 컴퓨터 판독가능 저장 매체가 본원에서 제공된다.

한 실시양태에서, 대조군 데이터는 0.5 ㎍의 천연 PLA2R과 면역-반응하도록 1× PBS로 1:100 희석된 건강한 비-MN 개체들로부터의 인간 혈청을 사용하여 수득된 검출 신호인 건강한 비-MN 개체들의 집단으로부터의 데이터를 포함하며, 이때 양고추냉이 과산화효소 항-인간 IgG 항체가 표지된 검출 항체이고, 검출 신호는 화학발광이다.

컴퓨터 판독가능 매체 상에 기록된 컴퓨터 실행가능 명령어에 의해 규정되고, 실행되는 경우 컴퓨터가 방법 단계들을 수행하도록 하는 기능 모듈들을 통해 본 발명의 실시양태들이 기술될 수 있다. 모듈들은 명확성을 위해 기능에 의해 분리된다. 그러나, 모듈/시스템이 불연속적인 코드 블록에 상응할 필요는 없고, 다양한 매체 상에 저장되고 다양한 시점에 실행되는 다양한 코드 부분의 실행에 의해 기술된 기능들이 수행될 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 모듈들이 또 다른 기능을 수행할 수 있고, 따라서 모듈들이 임의의 특정 기능 또는 기능 세트를 지니는 것으로 한정되지 않음을 이해하여야 한다.

컴퓨터 판독가능 저장 매체 #30은 컴퓨터가 액세스(access)할 수 있는 임의의 이용가능한 유형 매체일 수 있다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체에는 정보 예컨대 컴퓨터 판독가능 명령어, 데이터 구조, 프로그램 모듈 또는 기타 데이터의 저장을 위한 임의의 방법 또는 기술에서 시행되는 휘발성 및 비-휘발성, 분리형(removable) 및 비-분리형 유형 매체가 포함된다. 컴퓨터 판독가능 저장 매체는 RAM (랜덤(random) 액세스 메모리), ROM (읽기 전용 메모리), EPROM (소거 및 프로그래밍이 가능한 읽기 전용 메모리), EEPROM (전기적으로 소거가 가능하고 프로그래밍이 가능한 읽기 전용 메모리), 플래시 메모리 또는 기타 메모리 기술, CD-ROM (컴팩트 디스크 읽기 전용 메모리), DVD (디지털 다기능 디스크) 또는 기타 광학 저장 매체, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 매체 또는 기타 자기 저장 매체, 기타 유형의 휘발성 및 비-휘발성 메모리, 및 원하는 정보를 저장하도록 사용될 수 있고 컴퓨터가 액세스할 수 있는 임의의 기타 유형 매체를 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 상기의 것들의 임의의 적합한 조합을 포함한다.

하나 이상의 컴퓨터 판독가능 매체 상에 수록된 컴퓨터 판독가능 데이터가, 예를 들어, 컴퓨터에 의해 실행된 결과로서 본원에 기술된 기능들 중 하나 이상 및/또는 이의 다양한 실시양태, 변형 및 조합을 수행하도록 컴퓨터에게 명령하는 하나 이상의 프로그램의 일부로서, 명령어를 정의할 수 있다. 이같은 명령어는 다수의 프로그래밍 언어, 예를 들어, 자바(Java), J#, 비쥬얼 베이직(Visual Basic), C, C#, C++, 포트란(Fortran), 파스칼(Pascal), 에펠(Eiffel), 베이직(Basic), 코볼(COBOL) 어셈블리 언어 등, 또는 이들의 다양한 조합 중 임의의 것으로 작성될 수 있다. 이같은 명령어가 수록되는 컴퓨터-판독가능 매체는 본원에 기술된 컴퓨터 판독가능 저장 매체 또는 시스템 중 하나의 성분들 중 하나 이상에 존재할 수 있거나, 이같은 성분들 중 하나 이상에 걸쳐서 분포될 수 있다.

컴퓨터 판독가능 매체는 매체 상에 저장된 명령어가 본원에서 논의된 본 발명의 측면들을 실행하기 위해 임의의 컴퓨터 리소스 상에 로딩될 수 있도록 이동식(transportable)일 수 있다. 또한, 상기 기술된, 컴퓨터 판독가능 매체 상에 저장된 명령어가 호스트 컴퓨터 상에서 실행되는 애플리케이션 프로그램의 일부로서 수록되는 명령어에 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 그보다는, 본 발명의 측면등을 실행하도록 컴퓨터를 프로그래밍하는데 사용될 수 있는 임의 유형의 컴퓨터 코드 (예를 들어, 소프트웨어 또는 마이크로코드)로서 명령어가 수록될 수 있다. 컴퓨터 실행가능 명령어는 적절한 컴퓨터 언어 또는 여러 언어들의 조합으로 작성될 수 있다. 기본적인 전산 생물학 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, [Setubal and Meidanis et al., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997)]; [Salzberg, Searles, Kasif, (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998)]; [Rashidi and Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000)] 및 [Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2nd ed., 2001)]에 기술되어 있다.

본 발명의 특정 실시양태의 기능 모듈은, 최소한, 측정 모듈 #40, 저장 모듈 #30, 비교 모듈 #80, 및 출력 모듈 #110을 포함한다. 기능 모듈들은 하나의 컴퓨터 또는 다중 컴퓨터 상에서, 또는 하나의 컴퓨터 네트워트 또는 다중 컴퓨터 네트워크를 사용함으로써 실행될 수 있다. 측정 모듈에는 컴퓨터 판독가능 형태의 발현 정보를 예를 들어 제공하는 컴퓨터 판독가능 명령어가 있다.

측정 모듈 #40은 항-PLA2R 자가항체의 발현 수준을 나타내는 신호를 검출하기 위한 임의의 시스템을 포함할 수 있다. 이같은 시스템은 DNA 마이크로어레이(microarray), RNA 발현 어레이, 임의의 ELISA 검출 시스템 및/또는 임의의 웨스턴 블롯팅 검출 시스템을 포함할 수 있다.

결정 시스템에서 결정된 정보가 저장 모듈 #30에서 판독될 수 있다. 본원에서 사용된 "저장 모듈"은 데이터 또는 정보를 저장하도록 설정 또는 개조된 임의의 적절한 컴퓨팅 또는 프로세싱 장치 또는 기타 기구를 포함하도록 의도된다. 본 발명과 함께 사용하기에 적절한 전자 장치의 예로는 독립형(stand-alone) 컴퓨팅 장치, 데이터 통신 네트워크 (근거리 네트워크 (LAN), 원거리 네트워크 (WAN), 인터넷, 인트라넷, 및 엑스트라넷 포함), 및 로컬(local) 및 분산 컴퓨터 프로세싱 시스템이 포함된다. 저장 모듈은 자기 저장 매체, 예컨대 플로피 디스크, 하드 디스크 저장 매체, 자기 테이프, 광학 저장 매체 예컨대 CD-ROM, DVD, 전자 저장 매체 예컨대 RAM, ROM, EPROM, EEPROM 등, 일반적인 하드 디스크 및 이러한 카테고리들의 하이브리드 예컨대 자기/광학 저장 매체를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 발현 수준 또는 단백질 수준 정보가 저장 모듈 상에 기록되기 위해 저장 모듈이 개조 또는 설정된다. 이같은 정보는 전자적으로, 예를 들어, 인터넷을 통해, 디스크 상에서, USB (유니버설 시리얼 버스(universal serial bus))를 통해, 또는 임의의 또 다른 적절한 통신 방식을 통해 전달 및 판독될 수 있는 디지털 형태로 제공될 수 있다.

본원에서 사용된 "저장된"은 저장 모듈 상에 정보를 코딩하는 공정을 지칭한다. 당업자는 발현 수준 정보를 포함하는 제품이 생성되도록 공지된 매체 상에 정보를 기록하기 위한 현재 공지된 방법들 중 임의의 것을 쉽게 개조할 수 있다.

한 실시양태에서, 비교 모듈에 의해 판독될 저장 모듈 상에 저장된 기준 데이터는, 예를 들어, 비-MN 대상들의 집단으로부터 수득된 발현 데이터, MN 대상들의 집단으로부터 수득된 발현 데이터 또는 측정 모듈 #40을 사용하여 선행 시점에 동일한 대상으로부터 수득된 발현 데이터이다.

"비교 모듈" #80은 측정 모듈에서 결정된 발현 데이터를 기준 샘플 및/또는 저장된 기준 데이터와 비교하기 위한 비교 작업을 위해 다양한 이용가능한 소프트웨어 프로그램 및 양식을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 엔트리(entry)로부터의 정보를 하나 이상의 기준 데이터 패턴과 비교하기 위해 패턴 인식 기술을 사용하도록 비교 모듈이 설정된다. 패턴들을 비교하기 위한 기존의 시판되거나 자유롭게 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 비교 모듈이 설정될 수 있고, 수행되는 특정 데이터 비교에 대해 비교 모듈이 최적화될 수 있다. 비교 모듈 은 자가항체의 표준화된 발현 수준, 개체 내의 MN의 존재/부재, 개체에서의 치료 효능, 및/또는 개체의 치료 방법에 관한 컴퓨터 판독가능 정보를 제공한다.

비교 모듈, 또는 임의의 본 발명의 기타 모듈은 관련된 데이터베이스 관리 시스템, 월드 와이드 웹(World Wide Web) 애플리케이션, 및 월드 와이드 웹 서버가 실행되는 운영 시스템 (예를 들어, UNIX)을 포함할 수 있다. 월드 와이드 웹 애플리케이션은 데이터베이스 언어 명령문 (예를 들어, 구조화 질의 언어 (SQL: Structured Query Language) 명령문)의 생성에 필요한 실행가능 코드를 포함한다. 일반적으로, 실행가능 코드는 내장형(embedded) SQL 명령문을 포함할 것이다. 또한, 월드 와이드 웹 애플리케이션은 서버를 포함하는 다양한 소프트웨어 본체, 뿐만 아니라 사용자 요청에 서비스하기 위해 액세스되어야 하는 다양한 외부 및 내부 데이터베이스에 대한 주소 및 포인터를 함유하는 설정 파일을 포함할 수 있다. 또한 설정 파일은 서버 리소스에 대한 요청을 적합한 하드웨어로 지시하는데, 이는 서버가 2개 이상의 분리된 컴퓨터에 배분되어야 한다면 필요할 수 있다. 한 실시양태에서, 월드 와이드 웹 서버는 TCP/IP 프로토콜을 지지한다. 이와 같은 근거리 네트워크는 종종 "인트라넷"으로 지칭된다. 이같은 인트라넷의 장점은 월드 와이드 웹 (예를 들어, 진뱅크(GenBank) 또는 스위스 프로(Swiss Pro) 월드 와이드 웹 사이트) 상에 있는 공공 도메인 데이터베이스와의 용이한 통신을 허용한다는 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 특정 실시양태에서, 사용자는 웹 브라우저 및 웹 서버가 제공하는 HTML 인터페이스를 사용하여 인터넷 데이터베이스 상에 있는 데이터에 직접적으로 (예를 들어, 하이퍼텍스트(Hypertext) 링크(link)를 통해) 액세스할 수 있다.

비교 모듈은 미리 정해진 기준 또는 사용자에 의해 정의되는 기준에 의해 컴퓨터 판독가능 형태로 프로세싱될 수 있는 컴퓨터 판독가능 비교 결과를 제공하여, 비교 결과를 부분적으로 기초로 하는 컨텐츠를 제공하고, 이는 출력 모듈 #110을 사용하여 사용자가 요청하는 대로 저장 및 출력될 수 있다.

비교 결과를 기초로 하는 컨텐츠는 개체에서의 MN의 존재/부재 또는 MN이 발달되는 것에 대한 대상의 평가된 위험을 나타내는 기준값에 비교된 발현 값일 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 비교 결과를 기초로 하는 컨텐츠가 컴퓨터 모니터 #120 상에 디스플레이된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 비교 결과를 기초로 하는 컨텐츠가 인쇄가능 매체 #130, #140을 통해 디스플레이된다. 디스플레이 모듈은 컴퓨터 판독가능 정보를 컴퓨터로부터 수신하여 사용자에게 디스플레이하도록 설정된 임의의 적절한 기구일 수 있다. 비-제한적인 예로는, 예를 들어, 일반 목적의 컴퓨터 예컨대 인텔(Intel) 펜티엄형 프로세서, 모토롤라(Motorola) 파워PC, 선(Sun) 울트라SPARC, 휴렛-팩커드(Hewlett-Packard) PA-RISC 프로세서, 어드밴스드 마이크로 디바이시스 (Advanced Micro Devices: AMD (Sunnyvale, California))로부터의 다양한 프로세서 중 임의의 프로세서, 또는 임의의 기타 유형의 프로세서를 기초로 하는 컴퓨터, 시각적 디스플레이 기구 예컨대 평판 디스플레이, 브라운관 등, 뿐만 아니라 다양한 유형의 컴퓨터 프린터가 포함된다.

한 실시양태에서, 비교 결과를 기초로 하는 컨텐츠의 디스플레이를 위한 사용자 인터페이스를 제공하기 위해 월드 와이드 웹 브라우저가 사용된다. 본 발명의 또 다른 모듈이 웹 브라우저 인터페이스가 있도록 개조될 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 웹 브라우저를 통해, 사용자가 비교 모듈로부터 데이터를 검색하기 위한 요청을 구축할 수 있다. 따라서, 전형적으로 사용자는 그래프식 사용자 인터페이스에서 통상적으로 사용되는 버튼, 풀-다운(pull down) 메뉴, 스크롤 바(scroll bar) 등과 같은 사용자 인터페이스 요소를 포인팅하여 클릭할 것이다.

따라서 본 발명은 MN을 진단하거나 또는 개체에서의 MN의 치료 예후를 평가하기 위한 방법을 수행하기 위한 시스템 (및 컴퓨터 시스템을 실행시키기 위한 컴퓨터 판독가능 매체)를 제공한다.

본원에 기술된 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체는 개체 내의 항-PLA2R 자가항체를 검출하기 위한 본 발명의 예시적인 실시양태에 불과하고, 본 발명의 범주를 한정하도록 의도되지 않는다. 본원에 기술된 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체의 변형이 가능하고, 본 발명의 범주 내에 속하도록 의도된다.

기계의 모듈들, 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 사용되는 것들은 수많은 구성을 취할 수 있다. 예를 들어, 기능이 단일 기계 상에서 제공될 수 있거나, 또는 다중 기계에 걸쳐 분포될 수 있다.

샘플 수집 및 제조

당업자에게 주지된 방법에 의해 샘플 수집을 수행할 수 있다.

예를 들어, 숙련된 의료인이 환자의 혈액을 항-응고제 예컨대 시트레이트 및 EDTA 내로 직접 채취할 수 있다. 3500×G에서 2분 동안의 냉동 원심분리에 의해 전혈이 혈장 부분, 세포, 및 혈소판 부분으로 분리될 수 있다. 원심분리 후, 상등액이 혈장이다.

별법적으로, 혈청을 전혈로부터 수집할 수 있다. 단단한 플라스틱 또는 유리 튜브 내에 혈액을 수집한다: 부드러운 플라스틱에서는 혈액이 응고되지 않을 것이다. 6 ㎖의 혈청을 위해 15 ㎖의 전혈을 채취한다. 전혈을 혈병이 형성될 때까지 30분 내지 2시간 동안 실온에서 정치시킨다. 유리 막대 또는 나무 도포기 막대를 사용하여 용기의 측면으로부터 조심스럽게 혈병을 분리하고, 하룻밤 동안 4℃에서 방치한다. 그후, 혈청을 따라 내고/내거나, 원심분리하고/하거나, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혈청을 깨끗한 튜브 내로 제거한다. 2000-3000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 혈청을 청정화한다. 혈청을 -20℃ 또는 -80℃에서 보관한 후, PLA2R에 대한 자가항체에 대한 분석을 수행한다. 수집 튜브를 사용하여 혈청을 수득하는 것의 상세한 설명을 미국 특허 번호 3,837,376에서 확인할 수 있고, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 혈액 수집 튜브를 BD 다이어그노스틱 시스템즈(BD Diagnostic Systems), 그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One) 및 켄달 컴패니(Kendall Company)로부터 또한 구입할 수 있다.

PLA2R 항체의 검출

혈액, 혈청 또는 혈장 내의 인간 또는 돼지 PLA2R에 대한 자가항체를 임의의 당업계에 공지된 방법에 의해 검출할 수 있다. 바람직하게는, ELISA에 의해 검출되며, 이때 이러한 검출 방법은 자가항체와 PLA2R 단백질 또는 이의 단편의 결합이 수반되는 면역화학적 방법이다. 그후, 항체-단백질 복합체의 형성을 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 검출한다.

ELISA, 효소 면역검정 또는 EIA로 또한 칭해지는 효소-결합 면역흡착 분석법은 샘플 내의 항체 또는 항원의 존재를 검출하기 위해 면역학에서 주로 사용되는 생화학 기술이다. ELISA는 의학 및 식물 병리학에서 진단 도구로서, 뿐만 아니라 다양한 산업에서 품질 제어 검사로서 사용되어 왔다. 본원에 기술된 방법을 위해, ELISA에서, 기지량의 항원 (PLA2R 또는 이의 단편)을 표면에 고정한 후, PLA2R에 대한 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 샘플, 예를 들어 혈액, 혈청 또는 혈장을 표면 상에 적셔서, 고정된 항원에 자가항체가 결합할 수 있도록 한다. 표면을 세정하여 임의의 결합되지 않은 단백질을 제거하고, 검출 항체를 표면에 적용한다. 검출 항체는 대상으로부터의 항체에 대해 특이적이다. 예를 들어, 대상이 인간이면, 검출 항체는 항-인간 IgG 항체이어야 한다. 대상이 개이면, 검출 항체는 항-개 IgG 항체이어야 한다. 이러한 검출 항체는 효소에 연결되고, 최종 단계에서, 효소가 일부 검출가능한 신호로 전환시킬 수 있는 기질이 첨가된다. 예를 들어, 형광 ELISA의 경우, 빛이 샘플 상에 비춰지면, 샘플 내의 항체의 양을 측정할 수 있도록 임의의 항원/항체 복합체가 형광을 낼 것이다. 이는 간접적인 효소-결합 면역흡착 분석법이다. 간접 ELISA의 개략도가 도 7에서 제시된다.

하기는 간접적인 효소-결합 면역흡착 분석법을 설정 및 수행하기 위한 일반적인 표준 프로토콜이다. 96웰 미량역가 플레이트 (팔콘 프로-바인드어세이(Falcon Pro-Bindassay) 플레이트 3915; Becton Dickinson (Paramus, N.J.))를 사용하여, 웰 당 100 ㎕의 정제된 PLA2R (PBS 내의 3 ㎍/㎖)과 함께 하룻밤 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 테스트 웰을 항원 (PLA2R 또는 이의 단편)으로 코팅하며, 이때 대조군 웰에서는 PBS가 항원을 대신한다. 플레이트를 PBS-트윈(Tween)으로 3회 세정한 후, 250 ㎕의 PBS 내의 2％ BSA를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS-트윈으로 3회 세정하고, PBS-트윈-BSA에서 1:100 희석된 테스트 혈청 및 대조군 혈청 (1개의 고-양성 혈청 검사물, 2개의 음성 혈청 검사물, 및 1개의 약-양성 혈청 검사물)과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션한다; 각각의 혈청 검사물을 항원-코팅 웰, 뿐만 아니라 항원 대조군 웰에서 3중으로 테스트한다. 그후, PBS-트윈-BSA에서 1:2,000 희석된, 웰 당 100 ㎕의 양고추냉이 과산화효소와 접합된 염소 항-인간 IgG (Bio-Rad (Richmond, Calif.))와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 플레이트를 PLA2R에 대한 인간 자가항체 IgG의 존재에 대해 분석한다 (적합한 대조군과 함께). PBS-트윈에서 3회 세정한 후, 기질 용액 (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드; Sigma)를 각각의 웰에 첨가한다. 그후, 플레이트를 실온에서 30분 동안 암실에서 인큐베이션하고, 2N 황산을 첨가함으로써 반응을 종결시킨다. 490 nm에서의 광학 강도 (OD₄₉₀)를 마이크로플레이트 ELISA 판독기에서 측정한다. 각각의 혈청 검사물에 대해, 평균 OD₄₉₀ 기록을 테스트 웰 및 항원 대조군 웰에 대해 계산하고, 후자를 전자로부터 차감하여 알짜(net) ELISA 값을 수득한다.

ELISA를 수행하는 것은 특정 항원에 대한 특이성이 있는 하나 이상의 항체를 수반한다. 비-특이적으로 (표면에의 흡착을 통해) 또는 특이적으로 ("샌드위치" ELISA에서, 동일한 항원에 대해 특이적인 또 다른 항체에 의한 포획을 통해), 기지량의 항원 (PLA2R)이 고체 지지체 (일반적으로 폴리스티렌 미량역가 플레이트) 상에 고정된다. 항원이 고정된 후, 검출 항체가 첨가되어, 항원과의 복합체를 형성한다. 검출 항체는 효소에 공유결합으로 연결될 수 있거나, 또는 바이오-접합을 통해 효소에 연결된 2차 항체에 의해 자신이 검출될 수 있다. 각각의 단계 사이에, 전형적으로 플레이트를 순한 세제 용액으로 세정하여, 특이적으로 결합되지 않은 임의의 단백질 또는 항체를 제거한다. 최종 세정 단계 후, 효소 기질을 첨가함으로써 기판을 발색시켜, 샘플 내의 항원의 양을 지시하는 가시적인 신호가 생기게 한다. 구식 ELISA는 발색 기질을 사용하지만, 신식 분석법은 감도가 훨씬 더 높은 형광 기질을 사용한다.

또 다른 실시양태에서, 경쟁적 ELISA가 사용된다. 대상으로부터 유래되지 않은 정제된 항-PLA2R 항체를 다중 웰의 고체 상 상에 코팅한다. 코팅된 웰에 혈청 샘플, 재조합 PLA2R (항원) 또는 이의 단편 및 항-PLA2R 항체 (접합됨)로 표지된 양고추냉이 과산화효소를 첨가하고, 경쟁적 조합이 형성된다. 인큐베이션 후, PLA2R에 대한 자가항체 수준 함량이 샘플 내에서 높으면, PLA2R-자가항체-HRP로 표지된 항-PLA2R의 복합체가 형성될 것이다. 웰을 세정하면 복합체가 제거될 것이고, 웰 내의 양고추냉이 과산화효소-접합 항체의 국소화를 위해 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 발색 기질과 함께 인큐베이션한다. 이어서, 색 변화가 없거나 거의 없을 것이다. 혈청 샘플 내에 PLAR2에 대한 자가항체가 없으면, 더 많은 색 변화가 있을 것이다. 이같은 경쟁적 ELSA 테스트는 특이적이고, 민감하며, 재현가능하고, 작업하기가 용이하다.

한 실시양태에서, 관심 항체 (본원에 기술된 방법에서는, PLA2R에 대한 자가항체)가 1개의 항원은 표면 상에 고정되고 제2 항원은 가용성이고 태그가 부착되는 항원들 (PLA2R)에 의해 샌드위치되는 역-샌드위치 (RS) ELISA가 사용된다 ([Miyazawa H,. et. al, J Allergy Clin Immunol. 1988; 82:407-413]). 이러한 방법은 이중-항원 샌드위치 방법으로 또한 공지되어 있다. RS ELISA의 개략도가 도 7에서 제시된다.

하기는 RS-ELISA를 설정 및 수행하기 위한 일반적인 표준 프로토콜이다. 0.5 M NaCl-0.1％ NaN₃-0.05 M 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 PLA2R (0.3 ㎍/㎖) 또는 PLA2R (0.9 ㎍/㎖) + 소 혈청 알부민 (BSA; 25 ㎍/㎖)을 0.1 ㎖ 양으로 맥시소프(Maxisorp) 마이크로플레이트 (Nalge Nunc (Copenhagen, Denmark))의 웰에 첨가한다. 항원 고정을 위해 플레이트를 하룻밤 동안 4℃에서 인큐베이션한다. 웰을 세정한 후, FBS-PBST (10％ [v/v] 소 태아 혈청 [FBS], 0.1％ NaN₃-포스페이트 완충 염수 [PBS]-0.05％ 트윈 20 [PBST])로 1:4, 1:40, 및 1:400 희석된 테스트 혈청을 첨가하고, 플레이트를 60분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 기준 혈청의 3배 계단 희석물 7개를 사용한다. 또 한번의 세정 후, FBS-PBST 내의 비오틴화 PLA2R 또는 PLA2R (0.05 ㎍/㎖)을 웰에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 반응이 일어나도록 한다. 웰을 다시 세정하고, 스트렙타비딘-접합 β-d-갈락토시다제 (GIBCO BRL, Life Technologies Inc. (Rockville, Md.); 1％ BSA를 함유하는 PBST 내에 1:50,000 희석됨)를 첨가하고, 플레이트를 60분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 또 한번의 세정 후, 0.1 M NaCl-1 mM MgCl₂-0.1％ BSA-0.1％ NaN₃-0.01 M 인산나트륨 (pH 7.0) 내의 0.2 mM 4-메틸움벨리페릴-β-d-갈락토시드 (Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.))를 첨가한다. 웰을 테이프로 밀봉하고, 플레이트를 37℃ 물에 60분 동안 함침시킨다. 마지막으로, 0.1 ㎖의 0.1 M 글리신-NaOH (pH 10.2)를 각각의 웰에 첨가하여 효소 반응을 정지시킨다. 각각의 웰 내의 형광 단위 (FU)를 플루오로스캔(Fluoroskan) II 장치 (Flow Laboratories (Rockville, Md.))로 측정한다. ㎖ 당 항체 단위가 공지되어 있는 기준 혈청의 적정 곡선으로부터 테스트 혈청의 항체 농도를 계산한다.

한 바람직한 실시양태에서, 검출 항체가 항체를 효소에 연결시킴으로써 검출가능하게 표지된다. 차례로, 이러한 효소는, 자신의 기질에 노출되는 경우, 검출될 수 있는, 예를 들어, 분광광도측정, 형광측정 또는 가시적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학 모이어티를 생산하는 방식으로 기질과 반응할 것이다. 본 발명의 항체를 검출가능하게 표지하는데 사용될 수 있는 효소에는 말레이트 탈수소효소, 스타필로코쿠스(staphylococcal) 뉴클레아제(nuclease), 델타-V-스테로이드 아이소머라제(isomerase), 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 아이소머라제, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 아스파라기나제(asparaginase), 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라제(catalase), 글루코스-VI-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제(glucoamylase) 및 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

다른 실시양태에서, 검출 항체는 형광 화합물이 있는 표지이다. 형광 표지된 항체가 적합한 파장의 빛에 노출되면, 형광으로 인해 이의 존재를 검출할 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 표지 화합물은 CY 염료, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리트린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레사민이다.

형광 방출 금속 예컨대 152Eu, 또는 란탄 계열의 기타 금속을 사용하여 검출 항체가 또한 검출가능하게 표지될 수 있다. 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)와 같은 금속 킬레이팅 기를 사용하여 이러한 금속을 항체에 부착시킬 수 있다.

화학발광 화합물에 커플링시킴으로써 검출 항체가 또한 검출가능하게 표지될 수 있다. 그후, 화학 반응 과정 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 화학발광-항체의 존재를 결정한다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 루시페린, 이소루미놀, 테로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 염이다.

당업자에게 주지되어 있는 또 다른 여러 형태의 ELISA가 있다. ELISA에 대한 당업계에 공지되어 있는 표준 기술이 ["Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980]; [Campbell et al., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964]; 및 [Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22:895-904]에 기술되어 있다.

다른 기술이 샘플 내의 PLA2R 자가항체를 검출하는데 사용될 수 있다. 한 이같은 기술은 웨스턴 블롯팅 ([Towbin et at., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)])이고, 또 다른 기술은 웨스턴 블롯의 개조물인 도트(dot) 블롯이다. 웨스턴 블롯에서, PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 세제 및 열로 해리될 수 있고, SDS-PAGE 젤 상에 러닝된 후, 고체 지지체, 예컨대 니트로셀룰로스 필터에 옮겨질 수 있다. 필터를 PLA2R에 대한 자가항체를 함유하는 것으로 추측되는 샘플로 세정한다. 그후, 필터를 세정하여, 결합되지 않은 단백질 및 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 그후, 검출가능하게 표지된 효소-결합 2차 항체를 사용하여, 테스트된 샘플 내의 자가항체를 검출하고 이의 양을 평가할 수 있다. 검출가능한 표지로부터의 신호의 강도는 존재하는 효소의 양에 상응하고, 따라서 PLA2R에 대한 자가항체의 양에 상응한다. 예를 들어 밀도 측정법에 의해, 수준을 정량할 수 있다.

또 다른 면역학적 분석법은 혼탁 면역검정이다. 혼탁 면역검정은 당업자에게 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4730922, 4268171, 4401387, 4408880, 4889815, 4690906, 4784947, 및 516223 (모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은 방법에 따라 수행될 수 있다.

PLA2R에 대한 항체의 양성 대조군으로서, 기지량의 항-PLA2R 항체를 사용할 수 있다. 몇몇 예를 들면 인비트로젠 인코포레이티드(INVITROGEN Inc.), 밀리포어(MILLIPORE), 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH), R&D 시스템즈(R&D Systems), ABCAM 및 월드 안티바디 게이트웨이(World's Antibody Gateway) (150개를 초과하는 항체 회사에 대한 무료 검색 엔진) 및 진텍스토(GeneTexto)와 같은 시판원으로부터 항-PLA2R 항체를 수득할 수 있다. 항체는 폴리클로날(polyclonal) 또는 모노클로날(monoclonal) 항체일 수 있다. 별법적으로, 당업자에 의해 인간 PLA2R 단백질 (진뱅크™ 접속 번호 NP_001007268; 서열 1 및 NP_031392.3, 서열 2) 또는 이의 단편에 대해 항체가 생성될 수 있다. 항체의 생산 방법이 PCT 공개 WO 97/40072 또는 미국 출원 번호 2002/0182702에 개시되어 있고, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 포유동물에서 항체 생산을 유발하기 위한 면역화 방법, 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리도마의 생성, 및 항체의 정제를 ["Current Protocols in Immunology" (CPI) (John Wiley and Sons, Inc.)] 및 [Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow and David Lane editors, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988)] (양쪽 모두 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술된 것에 의해 수행할 수 있다.

PLA2R에 대한 자가항체의 검출은 면역검정 신호가 PLA2R 또는 이의 단편에 대한 항체의 부재 하의 또는 관련되지 않은 비-PLA2R 결합 항체의 존재 하의 대조군 면역검정 신호보다 10％ 이상 높을 때 양성으로 간주된다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 면역검정 신호는 건강한 비-MN 대상의 혈청으로 수득된 신호이고, 이러한 대상은 질환의 임상 특색이 없다. 또 다른 실시양태에서, 대조군 면역검정 신호는 건강한 비-MN 대상들의 집단에 대해 수득된 평균값이다. 집단은 25명 이상, 바람직하게는 이를 초과하는 건강한 비-MN 대상들이다. 증가는 5％ 이상, 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 50％ 이상, 100％ 이상, 200％ 이상, 300％ 이상, 500％ 이상, 1000％ 이상, 또는 이를 초과하는 값이고, 10-1000％ 사이의 모든 백분율을 포함한다.

한 실시양태에서, 자가항체의 검출은 항체를 코딩하는 mRNA를 확인하고 이의 상승된 양을 검출하는 것을 포함한다. 다수의 mRNA 검출, 확인 및 결정 방법이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 노던(Northern) 블롯 및 RT-PCR이 있다. 한 실시양태에서, 정량적 실시간 PCR에 의해 mRNA를 결정할 수 있다. 실시간 PCR은 mRNA 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 증폭 기술이다. (예를 들어, [Gibson et al., Genome Research 6:995-1001, 1996]; [Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996] 참조). 실시간 PCR은 증폭 동안의 PCR 생성물 축적 수준을 평가한다. 이러한 기술은 다중 샘플 내의 mRNA 수준의 정량적인 평가를 허용한다. mRNA 수준을 위해, mRNA를 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플로부터 추출하고, 표준 기술을 사용하여 cDNA를 제조한다. 예를 들어, 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer/Applied Biosystems) (Foster City, Calif.)의 7700 프리즘(Prism) 기기를 사용하여, 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 매칭(matching) 프라이머 및 형광 프로브를, 예를 들어, 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈 (Foster City, Calif.)가 제공하는 프라이머 발현 프로그램을 사용하여, 관심 유전자에 대해 디자인할 수 있다. 먼저 당업자가 프라이머 및 프로브의 최적 농도를 결정할 수 있고, 대조군 (예를 들어, 베타-액틴) 프라이머 및 프로브를, 예를 들어, 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템즈 (Foster City, Calif.)로부터, 상업적으로 수득할 수 있다. 샘플 내의 특이적 관심 핵산의 양을 정량하기 위해, 대조군을 사용하여 표준 곡선이 생성된다. 분석법에서 사용된 관심 핵산의 최초의 농도와 관련되는, 실시간 PCR에서 결정된 Ct 값을 사용하여 표준 곡선이 생성될 수 있다. 관심 유전자의 10-106개의 카피 범위인 표준 희석물이 일반적으로 충분하다. 또한, 대조군 서열로부터 표준 곡선이 생성된다. 이는 비교 목적을 위한 대조군의 양에 대한 조직 샘플 내의 관심 핵산의 초기 함량의 표준화를 허용한다.

TaqMan 프로브를 사용하는 정량적 실시간 PCR 방법이 당업계에 주지되어 있다. 정량적 실시간 PCR을 위한 상세한 프로토콜이, 예를 들어, RNA에 대해서는 [Gibson et al., 1996, Genome Res., 10:995-1001]에서, DNA에 대해서는 [Heid et al., 1996, Genome Res., 10:986-994]에서 제공된다.

TaqMan-기반 분석법은 5' 형광 염료 및 3' 켄칭제(quenching agent)를 함유하는 형광발생성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 이러한 프로브는 PCR 생성물에 혼성화하지만, 3' 말단의 차단제로 인해 자체가 확장될 수 없다. PCR 생성물이 후속 사이클에서 증폭되면, 중합효소, 예를 들어, AmpliTaq의 5' 뉴클레아제 활성이 TaqMan 프로브의 절단을 초래한다. 이러한 절단은 5' 형광 염료와 3' 켄칭제를 분리함으로써, 증폭의 함수로서 형광 증가를 초래한다 (예를 들어, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 월드 와이드 웹 참조).

또 다른 실시양태에서, RNA 제제가 변성 아가로스 젤 상에 러닝되고, 적절한 지지체, 예컨대 활성화된 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 또는 유리 또는 나일론 막으로 옮겨지는 노던 블롯팅에 의해 RNA 전사물의 검출이 달성될 수 있다. 그후, 표지된 (예를 들어, 방사성 표지된) cDNA 또는 RNA가 제제에 혼성화되고, 세정되고, 자가방사선술과 같은 방법에 의해 분석된다.

또 다른 실시양태에서, 공지된 증폭 방법을 사용하여 RNA 전사물의 검출이 추가로 달성될 수 있다. 예를 들어, mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 것 (RT-PCR); 또는 미국 특허 번호 5,322,770에 기술된 바와 같이 양쪽 단계에 단일 효소를 사용하는 것, 또는 [R. L. Marshall, et al., PCR Methods and Applications 4: 80-84 (1994)]에 기술된 바와 같이 mRNA를 cDNA로 역전사시킨 후 대칭성 갭 리가제(ligase) 연쇄 반응 (RT-AGLCR)을 수행하는 것은 본 발명의 범주 내에 속한다. 효소 mRNA 전사물을 검출하기 위한 한 적절한 방법이 그 전문이 본원에 포함된 참조문헌 [Pabic et. al. Hepatology, 37(5): 1056-1066, 2003]에 기술되어 있다.

다른 실시양태에서, [PNAS USA 87: 1874-1878 (1990)]에 기술되어 있고 [Nature 350: 91-92 (1991)]에 또한 기술되어 있는 소위 "NASBA" 또는 "3SR" 기술; 공개된 유럽 특허 출원 (EPA) 번호 4544610에 기술된 바와 같은 Q-베타 증폭; [G. T. Walker et al., Clin. Chem. 42: 9-13 (1996)] 및 유럽 특허 출원 번호 684315에 기술된 바와 같은 가닥 치환 증폭; 및 PCT 공보 WO 9322461에 기술된 바와 같은 표적 매개 증폭을 포함하지만 이에 한정되지 않는 또 다른 공지된 증폭 방법으로 RNA 전사물의 검출을 달성할 수 있다.

혈액 샘플 내의 PLA2R에 대한 자가항체의 RNA 전사물의 검출을 위해 원위치 혼성화 가시화를 사용하는 것이 본원에 기술된 방법에 포함된다. 원위치 혼성화에서, 방사성으로 표지된 안티센스(antisense) RNA 프로브를 혈소판의 얇은 도말표본(smear)과 혼성화시킨 후, 혈소판의 도말표본을 세정하고, RNase로 절단하고, 자가방사선술을 위한 감광성 에멀션에 노출시킨다. 샘플을 헤마톡실린으로 염색하여 샘플의 조직학적 조성을 나타낼 수 있고, 적절한 광 필터로의 암시야 영상화는 발색된 에멀션을 나타낸다. 비-방사성 표지 예컨대 디곡시제닌이 또한 사용될 수 있다.

별법적으로, mRNA 발현을 DNA 어레이, 칩 또는 마이크로어레이 상에서 검출할 수 있다. PLA2R에 대한 자가항체의 RNA 전사물에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 칩 상에 고정한 후, 칩을 환자로부터 수득된 혈소판 샘플의 표지된 핵산과 혼성화시킨다. PLA2R에 대한 자가항체의 RNA 전사물을 함유하는 샘플로 양성 혼성화 신호가 수득된다. DNA 어레이의 제조 방법 및 이의 용도가 당업계에 주지되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,618,6796; 6,379,897; 6,664,377; 6,451,536; 548,257; 미국 20030157485 및 [Schena et al. 1995 Science 20:467-470]; [Gerhold et al. 1999 Trends in Biochem. Sci. 24, 168-173]; 및 [Lennon et al. 2000 Drug discovery Today 5: 59-65]를 참조하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다.) 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE: Serial Analysis of Gene Expression)이 또한 수행될 수 있다 (예를 들어 미국 특허 출원 20030215858 참조).

mRNA 수준을 모니터링하기 위해, 예를 들어, mRNA를 테스트할 혈액 샘플로부터 추출하고, 역전사시키고, 형광-표지된 cDNA 프로브를 생성시킨다. 그후, cDNA에 혼성화할 수 있는 마이크로어레이를 표지된 cDNA 프로브로 프로빙하고, 슬라이드를 스캐닝하고, 형광 강도를 측정한다. 이러한 강도는 혼성화 강도 및 발현 수준과 상관된다. cDNA는 PLA2R에 대한 자가항체의 RNA 전사물, 특히 항체의 가변 영역에서의 전사물에 상응한다.

"정량적" 증폭 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 정량적 PCR은 기지량의 대조군 서열을 동일한 프라이머를 사용하여 동시에 공동-증폭시키는 것을 수반한다. 이는 PCR 반응을 검정하는데 사용될 수 있는 내부 표준을 제공한다. 정량적 PCR에 대한 상세한 프로토콜이, 예를 들어, [Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.]에서 제공된다.

재조합 PLA2R 단백질 및 PLA2R 발현 벡터

당업계에 주지된 분자적 방법에 의해 재조합 PLA2R 단백질 및 이의 단편이 또한 합성 및 정제될 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질이 박테리아, 포유동물, 곤충, 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다.

PCR 클로닝을 위한 주형으로서 PLA2R의 mRNA를 사용하여, 통상적인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 PLA2R을 코딩하는 핵산을 클로닝할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 PLA2R의 mRNA 주형은 진뱅크 접속 번호 NM_001007267, 서열 3 및 NM_007366.3, 서열 4이다. 이상적으로는, 증폭된 핵산의 클로닝 벡터 또는 기타 벡터 내로의 결찰을 용이하게 하기 위해, 제한 효소 소화 인식 부위가 PCR 프라이머의 센스 및 안티센스 가닥의 말단에서 디자인되어야 한다. 별법적으로, 3'-A 오버행(overhang)이 당업계에 주지된 TA-클로닝의 목적으로 포함될 수 있다. 3'A 오버행이 있는 이같은 코딩 핵산은 인비트로젠(Invitrogen)의 토포아이소머라제(topoisomerase)-보조 TA 벡터 예컨대 pCR®-TOPO, pCR®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO®, 및 pENTR/SD/D-TOPO® 내로 쉽게 결찰될 수 있다. 일반적인 목적의 클로닝 벡터 예컨대 pUC19, pBR322, pBLUESCRIPT 벡터 (STRATAGENE Inc.) 또는 pCR TOPO® (Invitrogen Inc.) 내로 코딩 핵산이 클로닝될 수 있다. 그후, PLA2R을 코딩하는 핵산을 보유하는 생성된 재조합 벡터를 포유류 세포주, 곤충 세포주, 효모, 박테리아 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택된 숙주 세포를 사용하는 다양한 단백질 발현 시스템에서의 PLA2R 융합 단백질의 합성을 위해 단백질 발현 벡터 또는 바이러스 벡터 내로 서브클로닝할 수 있다. 더 큰 융합 단백질, 예를 들어 His-PLA2R 또는 티오레독신-PLA2R로부터의 PLA2R의 유리를 용이하게 하기 위해 프로테아제 절단 부위가 또한 디자인되어 핵산 내에 포함될 수 있다. 프로테아제 절단 부위의 예로는 엔테로키나제(enterokinase), 카이모트립신 및 트롬빈의 절단 부위가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

PCR에 의해 증폭된 코딩 핵산을 인비트로젠의 토포아이소머라제-보조 TA 벡터 예컨대 pCR®-TOPO, pCR®-Blunt II-TOPO, pENTR/D-TOPO®, 및 pENTR/SD/D-TOPO®에서의 TOPO® 클로닝 방법을 사용하여 벡터 내로 클로닝할 수 있다. pENTR/D-TOPO® 및 pENTR/SD/D-TOPO® 양쪽 모두는 DNA 서열이 5'→3' 방향으로 게이트웨이(GATEWAY)® 발현 벡터 내로 클로닝되도록 하는 지향성 TOPO 진입 벡터이다. 5'→3' 방향의 지향성 클로닝은 프로모터가 핵산의 5' ATG 개시 코돈의 상류에 있어 프로모터-구동 단백질 발현을 가능하게 하도록 DNA 서열이 단백질 발현 벡터 내로 단일 방향으로 삽입되는 것을 용이하게 한다. PLA2R 코딩 핵산을 보유하는 재조합 벡터는 일반적인 클로닝 이. 콜라이 세포 예컨대 XL1Blue, SURE (STRATAGENE) 및 TOP-10 세포 (INVITROGEN) 내로 형질감염되어 증식될 수 있다.

이종 단백질 발현 시스템으로부터 생산되는 재조합 단백질의 발현 및 정제를 위해 이용가능한 여러 발현 벡터들을 제조할 수 있다. 포유류, 곤충, 효모, 박테리아 또는 식물 세포로부터 예를 들어 선택된 숙주 세포를 사용하는 이종 단백질 발현 시스템이 당업자에게 주지되어 있다. 발현 벡터에는 각각의 숙주 세포에서의 효율적인 유전자 전사 및 번역을 위한 필요한 5' 상류 및 3' 하류 조절 요소 예컨대 프로모터 서열, 리보솜 인식 및 결합 TATA 박스, 및 3' UTR AAUAAA (서열 6) 전사 종결 서열이 있어야 한다. 발현 벡터에는 6X-히스티딘 (서열 7), V5, 티오레독신, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(transferase), c-Myc, VSV-G, HSV, FLAG, 말토스 결합 펩티드, 금속-결합 펩티드, HA 및 "분비" 신호 (꿀벌 멜리틴, α-인자, PHO, Bip)와 같은 추가적인 서열이 있을 수 있고, 이들은 발현된 재조합 단백질 내로 혼입된다. 또한, 추가적인 서열이 필요하지 않은 후에 이를 효소에 의해 제거하는 것을 용이하게 하기 위해 이러한 서열 뒤에 혼입된 효소 소화 부위가 있을 수 있다. 이러한 추가적인 서열은 재조합 단백질 발현의 검출, 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 정제, 재조합 단백질의 숙주 세포질에서의 용해도 강화, 특히 소형 단백질 단편에 대한 더욱 양호한 단백질 발현, 및/또는 발현된 재조합 단백질의 배양 배지, 원핵생물 박테리아의 원형질막공간, 또는 효모 세포의 스페로플라스트(spheroplast)로의 분비에 유용하다. 재조합 단백질의 발현은 숙주 세포에서 구성적일 수 있거나, 또는, 예를 들어, 황산구리, 당 예컨대 갈락토스, 메탄올, 메틸아민, 티아민, 테트라사이클린, 배큘로바이러스로의 감염, 및 (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드) IPTG, 락토스의 안정적인 합성 유사체로, 유도될 수 있다.

일부 실시양태에서, 다양한 발현 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아, 예컨대 이. 콜라이, 효모, 포유동물, 곤충 및 식물 세포 예컨대 클라미도모나스(Chlamydomonas)에서, 또는 심지어 무세포 발현 시스템으로부터 재조합 PLA2R이 발현될 수 있다. 클로닝 벡터로부터, 핵산이 포유류, 곤충, 효모, 박테리아 또는 식물 세포 또는 무세포 발현 시스템 예컨대 토끼 망상적혈구 발현 시스템에서의 단백질의 발현에 적합한 재조합 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. PCR 클로닝, 제한 소화에 이은 결찰, 또는 게이트웨이(Gateway)® LR 및 BP CLONASE™ 효소 혼합물을 사용하는 람다 파지-기반 부위-특이적 재조합과 같은 재조합 반응에 의해 서브클로닝이 달성될 수 있다. 서브클로닝은 핵산의 5' ATG 개시 코돈이 발현 벡터 내의 프로모터의 하류에 있도록 단일방향성이어야 한다. 별법적으로, 코딩 핵산이 pENTR/D-TOPO®, pENTR/SD/D-TOPO® (지향성 진입 벡터), 또는 임의의 인비트로젠의 게이트웨이® 테크놀러지 pENTR (진입) 벡터 내로 클로닝되는 경우, 코딩 핵산이 하나의 단일 재조합 반응에서 포유류 세포, 이. 콜라이, 곤충 및 효모 각각에서의 단백질 발현을 위해 다양한 게이트웨이® 발현 벡터 (목적) 내로 전달될 수 있다. 일부 게이트웨이® 목적 벡터는 배큘로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 및 렌티바이러스의 구축을 위해 디자인되고, 이들은 이들 각각의 숙주 세포의 감염 시 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 이종 발현을 허용한다. 유전자를 목적 벡터 내로 전달하는 것은 제조사의 설명서에 따라 단지 2개의 단계로 달성된다. 이. 콜라이, 곤충 세포, 포유류 세포, 및 효모에서의 단백질 발현을 위한 게이트웨이® 발현 벡터가 있다. 이. 콜라이에서의 형질전환 및 선별 후, 발현 벡터는 적합한 숙주에서의 발현에 사용될 준비가 되어 있다.

다른 발현 벡터 및 숙주 세포의 예는 이. 콜라이 숙주 세포 예컨대 BL21, BL21(DE3) 및 AD494(DE3)pLysS, 로제타(Rosetta) (DE3), 및 오리가미(Origami) (DE3) (NOVAGEN)에서의 단백질 발현을 위한 pET 벡터 (NOVAGEN), pGEX 벡터 (Amersham Pharmacia), 및 pMAL 벡터 (New England labs. Inc.); 포유류 세포주 예컨대 CHO, COS, HEK-293, 저캇(Jurkat), 및 MCF-7에서의 발현을 위한 강력한 CMV 프로모터-기반 pcDNA3.1 (INVITROGEN) 및 pCIneo 벡터 (Promega); 포유류 세포에서의 아데노바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 복제 불능(incompetent) 아데노바이러스 벡터 pADENO X, pAd5F35, pLP-ADENO-X-CMV (CLONTECH), pAd/CMV/V5-DEST, pAd-DEST 벡터 (INVITROGEN); 포유류 세포에서의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 RETRO-X™ 시스템 (Clontech)과 함께 사용하기 위한 pLNCX2, pLXSN, 및 pLAPSN 레트로바이러스 벡터; 포유류 세포에서의 렌티바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™, 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ (INVITROGEN); 포유류 세포에서의 아데노-관련 바이러스-매개 유전자 전달 및 발현을 위한 아데노바이러스-관련 바이러스 발현 벡터 예컨대 pAAV-MCS, pAAV-IRES-hrGFP, 및 pAAV-RC 벡터 (Stratagene); 스포도페라 프루지페르다(Spodopera frugiperda) 9 (Sf9) 및 Sf11 곤충 세포주에서의 발현을 위한 BACpak6 배큘로바이러스 (CLONTECH) 및 pFASTBAC™ HT (INVITROGEN); 드로소필라 쉬네이데르(Drosophila Schneider) S2 세포에서의 발현을 위한 pMT/BiP/V5-His (INVITROGEN); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현을 위한 피치아(Pichia) 발현 벡터 pPICZα, pPICZ, pFLDα 및 pFLD (Invitrogen), 및 피치아 메타놀리카(P. methanolica)에서의 발현을 위한 벡터 pMETα 및 pMET; 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한 pYES2/GS 및 pYD1 (INVITROGEN) 벡터이다. 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)에서의 이종 단백질의 대규모 발현에서의 최근의 진전이 [Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33] 및 [Fuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5]에 기술되어 있다. 외래 이종 코딩 서열이 핵, 엽록체 및 미토콘드리아의 게놈 내로 상동 재조합에 의해 삽입된다. 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 저항성을 부여하는 다기능 엽록체 선택 마커 아미노글리코시드 아데닐 트랜스퍼라제 (aadA)를 보유하는 엽록체 발현 벡터 p64가 엽록체에서 외래 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 생체탄도(biolistic) 유전자 총 방법이 벡터를 조류 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 엽록체 내로의 진입 시, 외래 DNA가 유전자 총 입자로부터 방출되고, 상동 재조합을 통해 엽록체 게놈 내로 통합된다.

여러 숙주 세포에서의 재조합 단백질 발현은 구성적일 수 있거나, 또는 황산구리, 당 예컨대 갈락토스, 메탄올, 메틸아민, 티아민, 테트라사이클린, 또는 IPTG와 같은 유도제로 유도될 수 있다. 단백질이 숙주 세포에서 발현된 후, 발현된 단백질을 정제를 위해 유리하도록 숙주 세포가 용해된다. 다양한 숙주 세포의 용해 방법이 ["Sample Preparation-Tools for Protein Research" EMD Bioscience] 및 [Current Protocols in Protein Sciences (CPPS)]에 기술되어 있다. 바람직한 정제 방법은 히스티딘 태그가 부착된 재조합 단백질에 대해 니켈, 코발트 또는 아연 친화성 수지를 사용하는 이온-금속 친화성 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피이다. 히스티딘 태그가 부착된 재조합 단백질의 정제 방법이 TALON® 코발트 수지를 사용하는 CLONTECH에 의해, 그리고 pET 시스템 안내서 (제10판)에서 NOVAGEN에 의해 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 정제 전략은 면역-친화성 크로마토그래피에 의한 것이고, 예를 들어, 항-myc 항체가 접합된 수지가 myc 태그가 부착된 재조합 펩티드를 친화성 정제하는데 사용될 수 있다. 세린 프로테아제 예컨대 트롬빈 및 엔테로키나제로의 효소 소화가 재조합 단백질을 히스티딘 또는 myc 태그로부터 절단하고 방출시켜, 재조합 단백질은 친화성 수지로부터 방출시키는 한편 히스티딘 태그 및 myc 태그는 친화성 수지에 부착된 상태로 남는다.

무세포 발현 시스템이 또한 고려된다. 전통적인 세포-기반 발현 방법에 비해 무세포 발현 시스템은 단백질 폴딩(folding)에 유리하게 하는 반응 조건의 용이한 변형, 생성물 독성에 대한 감소된 민감도, 및 감소된 반응 부피 및 공정 시간으로 인한 대량의 단백질 생산 또는 신속한 발현 스크리닝과 같은 고-처리량 전략에 대한 적절성이 포함되는 여러 장점을 제공한다. 무세포 발현 시스템은 플라스미드 또는 선형 DNA를 사용할 수 있다. 또한, 반응 혼합물 1 ㎖ 당 단백질 1 ㎎을 초과하는 수율에서 번역 효율에서의 개선이 초래되었다. 고수율로 단백질을 생산할 수 있는 무세포 번역 시스템의 예가 [Spirin AS. et. al., Science 242:1162 (1988)]에 기술되어 있다. 이러한 방법은 아미노산, 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 및 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 함유하는 피딩(feeding) 완충제를 반응 혼합물 전반에 지속적으로 유동시키는 디자인, 및 번역된 폴리펩티드 생성물의 지속적인 제거를 사용한다. 이러한 시스템은 지속적인 무세포 피딩 완충제를 제공하도록 이. 콜라이 용해물을 사용한다. 이러한 지속적인 유동 시스템은 원핵생물 발현 벡터 및 진핵생물 발현 벡터 양쪽 모두와 상용성이다. 예를 들어, 통합 막 단백질 EmrE 다중약물 전달체의 대규모 무세포 생산이 [Chang G. el. al., Science 310:1950-3 (2005)]에 기술되어 있다.

또 다른 시판되는 무세포 발현 시스템에는 튜브 반응 양식으로 ㎎ 양까지의 활성 재조합 단백질을 생산하도록 효율적이고 커플링된 전사 및 번역 반응을 위해 이. 콜라이-기반 시험관내 시스템을 이용하는 <EXPRESSWAY™ Cell-Free Expression Systems> (Invitrogen); 이. 콜라이 기반 시험관내 시스템을 또한 사용하는 <Rapid Translation System> (RTS) (Roche Applied Science); 및 토끼 망상적혈구-기반 시험관내 시스템을 사용하는 <TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems> (Promega)이 포함된다.

포유동물, 예를 들어 돼지 또는 토끼로부터 정제된 포유류 PLA2R이 본원에 기술된 방법에 포함된다. 한 실시양태에서, 천연 (비-재조합) 포유류 PLA2R이 신장으로부터 체외(ex vivo) 정제된다. 천연 단백질 정제 방법이 당업자에게 주지되어 있다.

치료/예방 조성물 및 투여

한 실시양태에서, 본 발명은 PLA2R 또는 이의 단편 및 제약상 허용가능한 비히클(vehicle)을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 전장 PLA2R 및 다양한 크기의 단편과 제약상 허용가능한 비히클의 조합물일 수 있다. 단편의 예는 PLA2R의 CTLD 또는 CRD 4, 5, 6을 포함하는 단편 또는 PLA2R의 세포외 도메인의 기타 단편이다. 제약 조성물은 PLA2R에 대한 자가항체의 존재를 특징으로 하는 MN의 치료에 사용된다.

한 실시양태에서, 용어 "제약상 허용가능한"은 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관이 허가하였거나 미국 약전 또는 또 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 이와 함께 투여되는 희석제, 애주번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이같은 제약 담체는 무균성 액체, 예컨대 물 및 오일 (석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등 포함)일 수 있다. 제약 조성물이 정맥내 투여되는 경우, 물이 바람직한 담체이다. 특히 주사용 용액에 대해, 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로 사용될 수 있다. 적절한 제약 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 젤, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 원한다면, 조성물이 미량의 습윤화 또는 유화 작용제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세리드와 함께 조성물이 좌약으로 제형될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적절한 제약 담체의 예가 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed. (Mack Publishing Co., 1990)]에 기술되어 있다. 한 실시양태에서, 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산; 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌; 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 및 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨이 포함되는 또 다른 성분들이 제약 제형에 첨가될 수 있다.

한 실시양태에서, 인간에게의 정맥내 투여용으로 개조된 제약 조성물로서 일상적인 절차에 따라 조성물이 제형된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균성 등장성 수성 완충제 내의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위한 리그노케인과 같은 국소 마취제 및 가용화제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 따로따로, 또는 단위 투여량 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어, 활성 작용제의 양을 지시하는 앰풀 또는 작은 봉지(sachette)와 같은 밀봉 밀폐 용기 내의 건식 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 제약 등급의 무균성 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 이를 디스펜싱(dispensing)할 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 무균수 또는 염수의 앰풀이 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 제약상 허용가능한 염에는, 몇몇 예를 들면, 음이온으로 형성된 것들 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것들, 및 양이온으로 형성된 것들 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 수산화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인으로부터 유래된 것들이 포함된다.

다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜, 미세입자 및 마이크로캡슐 내의 캡슐화가 당업계에 공지되어 있고, PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 투여하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, [Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)] 참조). 조성물은 소포, 특히 리포솜에서 전달될 수 있다 ([Langer, Science, 249:1527-1533 (1990)]; [Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler, eds. (Liss, New York 1989), pp. 353-365]; [Lopez-Berestein, 동일 문헌, pp. 317-327] 참조; 일반적으로, 동일 문헌을 참조한다). 도입 방법에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 또 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 제약 조성물을 뇌실내 및 경막내 주사가 포함되는 임의의 적절한 경로에 의해 중추 신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다; 뇌실내 카테터 (저장소, 예컨대 옴카나(Omcana) 저장소에 예를 들어 부착됨)에 의해 뇌실내 주사가 용이해질 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제가 있는 제형을 사용함으로써, 폐 투여가 또한 사용될 수 있다

한 실시양태에서, 치료적 투여에 사용될 제약 제형은 무균성이어야 한다. 무균성은 무균성 여과막 (예를 들어, 0.2 ㎛ 막)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 제약 제형의 pH는 전형적으로 약 6 내지 8이어야 한다.

한 실시양태에서, 조성물이 제어 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, 펌프가 사용될 수 있다 ([Langer, 상기 문헌]; [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery, 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574 (1989)] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다 ([Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise, eds. (CRC Press, Boca Raton, Fla. 1974)]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball, eds. (Wiley, New York 1984)]; [Ranger and Peppas, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23:61 (1983)] 참조; [Levy et al., Science, 228:190 (1985)]; [During et al., Ann. Neurol., 25:35 1 (1989)]; [Howard et al., J. Neurosurg., 7 1:105 (1989)]를 또한 참조). 또 다른 제어 방출 시스템들이 [Langer, Science, 249:1527-1533 (1990)]의 리뷰에 논의되어 있다. 서방성 조성물의 예를 위해, 미국 특허 번호 3,773,919, EP 58,481A, 미국 특허 번호 3,887,699, EP 158,277A, 캐나다 특허 번호 1176565, [U. Sidman et al., Biopolymers 22:547 (1983)] 및 [R. Langer et al., Chem. Tech. 12:98 (1982)]을 참조한다.

제형에서 사용될 정확한 용량은 투여 경로 및 MN의 중증도 및 혈청 내의 PLA2R에 대한 자가항체의 역가에 또한 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-응답 곡선으로부터 유효 용량이 외삽에 의해 추정될 수 있다.

환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 환자 체중 1 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎이다. 바람직하게는, 환자에게 투여되는 투여량은 환자 체중 1 ㎏ 당 0.1 ㎎ 내지 20 ㎎ 사이, 더욱 바람직하게는 환자 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎ 내지 10 ㎎이다. 유전자 요법을 위해, 바이러스 벡터는 환자 당 적용 당 바이러스 벡터 1×10⁶개 내지 10¹⁴개의 범위 내여야 한다.

또한, 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 시험관내 또는 생체내 분석법이 임의적으로 사용될 수 있다. 사용될 정확한 용량은 투여 경로, 및 치료될 용태의 심각한 정도에 또한 좌우될 것이고, 예를 들어 공개된 임상 연구를 고려하여 의사의 판단 및 각각의 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 적절한 유효 투여량은 약 4시간 마다 약 10 ㎍ 내지 약 5 g의 범위이고, 전형적으로는 4시간 마다 약 500 ㎎ 이하이다. 한 실시양태에서, 유효 투여량은 4시간 마다 약 0.01 ㎎, 0.5 ㎎, 약 1 ㎎, 약 50 ㎎, 약 100 ㎎, 약 200 ㎎, 약 300 ㎎, 약 400 ㎎, 약 500 ㎎, 약 600 ㎎, 약 700 ㎎, 약 800 ㎎, 약 900 ㎎, 약 1 g, 약 1.2 g, 약 1.4 g, 약 1.6 g, 약 1.8 g, 약 2.0 g, 약 2.2 g, 약 2.4 g, 약 2.6 g, 약 2.8 g, 약 3.0 g, 약 3.2 g, 약 3.4 g, 약 3.6 g, 약 3.8 g, 약 4.0 g, 약 4.2 g, 약 4.4 g, 약 4.6 g, 약 4.8 g, 또는 약 5.0 g이다. 약 2시간 마다, 약 6시간 마다, 약 8시간 마다, 약 12시간 마다, 약 24시간 마다, 약 36시간 마다, 약 48시간 마다, 약 72시간 마다, 약 일주일 마다, 약 2주 마다, 약 3주 마다, 약 1개월 마다, 및 약 2개월 마다가 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 기간에 걸쳐 등가의 투여량이 투여될 수 있다. 본원에 기술된 유효 투여량은 투여되는 총량을 지칭한다. PLA2R 단백질, 이의 단편, 또는 발현 벡터 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 1번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 본원에서의 목적을 위해, PLA2R 단백질, 이의 단편, 또는 발현 벡터 및/또는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 "치료 유효량"은 대상으로부터의 샘플 내의 PLA2R에 대한 자가항체의 양을 감소시키는데 효과적인 양이다. 양 감소는 치료 시작 전에 혈청 내에 존재하는 자가항체의 양에 비교하여 자가항체의 10％ 이상 감소이다.

한 실시양태에서, PLA2R 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 아자티오프린, 인플릭시맵, 오말리주맵, 다클리주맵, 아달리무맵, 에쿨리주맵, 에팔리주맵, 나탈리주맵 및 오말리주맵을 포함하지만 이에 한정되지 않는 면역억제 요법과 조합되어 투여된다. 또 다른 실시양태에서, PLA2R 또는 이의 단편을 포함하는 조성물이 면역억제 요법 및 시클로포스파미드, 클로람부실 및/또는 리툭시맵과 조합되어 투여된다.

유전자 요법

한 실시양태에서, PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 당업자에게 공지된 여러 유전자 요법 기술 중 임의의 하나에 의해 개체에게 투여된다. 일반적으로, 유전자 요법은 포유류 대상 내에서의 표적 세포의 직접적인 형질전환 (생체내 유전자 요법), 또는 시험관 내에서의 세포의 형질전환에 이어서 형질전환된 세포를 포유류 대상 내로 이식하는 것 (생체외 유전자 요법)에 의해 달성될 수 있다. 조직 특이적 조절 요소 하의 PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 보유하는 바이러스 벡터가 개체에게 투여된다. 조직 특이적 조절 요소는 PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 표적 세포, 예를 들어, 근육에서 발현되도록 한다.

유전자 요법의 원리가 [Oldham, R. K., Principles of Biotherapy, Raven Press, N.Y., 1987], 및 유사한 교본에 개시되어 있다. 유전자 요법을 위한 방법 및 용도의 개시가 [Boggs, S. S., Int. J. Cell Clon. 8:80-96 (1990)]; [Karson, E. M., Biol. Reprod. 42:39-49 (1990)]; [Ledley, F. D., Biotechnology, A Comprehensive Treatise, volume 7B, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, pp 399-458 (1989)]에서 제공되고, 이러한 참고문헌 모두는 본원에 참고로 포함된다.

PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산이 유전자 요법에서 동물 (특히, 인간이 포함되는 포유동물)의 체세포 내로 도입될 수 있다. 가장 바람직하게는, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터가 이러한 목적을 위한 전달 비히클로서 사용된다. 유전자 요법 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 또는 렌티바이러스의 형태일 수 있다.

레트로바이러스 벡터는 통상적인 전달 방식이고, 이러한 정황에서, 벡터로 감염된 세포에서 바이러스 단백질이 제조되지 않도록 모든 바이러스 유전자가 제거 또는 변경된 레트로바이러스이다. 모든 바이러스 단백질을 생산하지만 감염성 바이러스는 생산하지 않는 레트로바이러스 "패키징(packaging)" 세포를 사용함으로써 바이러스 복제 기능이 제공된다.

패키징 세포 내로 레트로바이러스 벡터 DNA가 도입되면, 벡터 RNA를 보유하고 표적 세포를 감염시킬 수 있는 비리온(virion)의 생산이 초래되지만, 감염 후 추가적인 바이러스 확산은 일어나지 않게 된다. 이러한 프로세스를 바이러스가 계속 복제 및 확산되는 천연 바이러스 감염과 구별하기 위해, 감염보다는 형질도입이라는 용어가 종종 사용된다.

한 실시양태에서, 본원에 기술된 MN을 치료하는 방법은 분열 포유류 세포 및 비-분열 포유류 세포에서의 PLA2R 단백질 또는 이의 단편의 전달 및 발현을 위한 재조합 렌티바이러스를 제공한다. HIV-1을 기초로 하는 렌티바이러스가 몰로니(Moloney) 백혈병 바이러스 (MoMLV)를 기초로 하는 레트로바이러스 시스템보다 더 넓은 범위의 숙주 내로 효과적으로 형질도입될 수 있다. pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ 또는 pLenti 벡터를 ViraPower™ 렌티바이러스 발현 시스템 (Invitrogen)과 함께 사용하여 재조합 렌티바이러스의 제조를 달성할 수 있다.

유전 장애 및 다양한 유형의 암에 대한 유전자 요법을 위한 렌티바이러스 벡터 사용의 예가 개시된 참고문헌들은 본원에 참고로 포함된다 ([Klein, C. and Baum, C. (2004). Hematol. J., 5, 103-111]; [Zufferey, R et. al. (1997). Nat. Biotechnol., 15, 871-875]; [Morizono, K. et. al. (2005). Nat.Med., 11, 346-352]; [Di Domenico, C. et. al. (2005), Hum.Gene Ther., 16, 81-90]; [Kim, E. Y., et. al., (2004). Biochem. Biophys. Res. Comm., 318, 381-390]).

비-레트로바이러스 벡터가 유전자 요법에서 또한 사용되었다. 한 이같은 대안은 아데노바이러스이다 ([Rosenfeld, M. A., et al., Cell 68:143155 (1992)]; [Jaffe, H. A. et al., Nature Genetics 1:372-378 (1992)]; [Lemarchand, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486 (1992)]). 아데노바이러스 벡터의 주요 장점은 대형 DNA 절편을 보유할 가능성 (36 Kb 게놈), 매우 높은 역가 (10¹¹/㎖), 비-복제 세포를 감염시키는 능력, 및 원위치, 특히 폐에서 조직을 감염시키는 것에 대한 적절성이다. 지금까지의 이러한 벡터의 가장 놀라운 용도는 코튼 래트(cotton rat)에서 기도 상피에 대한 기관내 점적주입에 의해 인간 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절인자 (CFTR) 유전자를 전달하는 것이다 ([Rosenfeld, M. A., et al., Cell 63:143-155 (1992)]). 유사하게, 헤르페스 바이러스가 인간 유전자 요법에 유용한 것으로 또한 판명될 수 있다 ([Wolfe, J. H. et al., Nature Genetics 1:379-384 (1992)]). 물론, 임의의 또 다른 적절한 바이러스 벡터가 본 발명으로의 유전자 요법에 사용될 수 있다.

미국 특허 번호 6,531,456은 재조합 AAV 비리온을 사용하여 고형 종양 세포 내로 유전자를 성공적으로 전달하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 미국 특허 번호 6,531,456에 기술된 방법은, 예를 들어, 종양내 주사에 의해, 종양 세포 덩어리 내로 재조합 AAV 비리온을 직접적으로 생체내 주입하게 한다. 상기 발명은 재조합 AAV 비리온을 사용하는 제2 유전자의 동시 전달을 또한 제공하며, 이때 제2 유전자는 형질도입된 세포 내에서 발현될 때 보조적인 치료 효과를 제공할 수 있다. 미국 특허 번호 6,531,456은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

유전자 요법에 사용되는 비리온은 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 비리온일 수 있다. 재조합 바이러스는 유전자 발현 연구 및 치료 용도를 위한 다기능 시스템을 제공한다.

관심 DNA를 포함하는 상기 기술된 재조합 AAV 비리온을 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 방법은 (1) AAV 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (2) AAV 벡터에서 빠진 AAV 헬퍼(helper) 기능을 보완하도록 숙주 세포에서 발현될 수 있는 AAV 코딩 영역을 포함하는 AAV 헬퍼 구축물을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; (3) 숙주 세포에서의 효율적인 재조합 AAV ("rAAV") 비리온 생산을 지지할 수 있는 보조 기능을 제공하는 하나 이상의 헬퍼 바이러스 및/또는 보조 기능 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 (4) 숙주 세포를 배양하여 rAAV 비리온을 생산하는 단계를 일반적으로 포함한다. 표준 형질감염 기술을 사용하여, 동시에 또는 연속적으로 숙주 세포 내로 AAV 벡터, AAV 헬퍼 구축물 및 헬퍼 바이러스 또는 보조 기능 벡터(들)를 도입할 수 있다. rAAV 벡터를 사용하여, 다수의 상이한 인간 및 비-인간 세포주 또는 조직이 포함되는 광범위한 숙주 세포 내로 유전자를 전달할 수 있다. AAV는 비-병원성이고 면역 응답을 유발하지 않기 때문에, 다수의 임상전 연구에서 우수한 안전성 프로파일이 보고되었다. rAAV는 광범위한 세포 유형 내로 형질도입될 수 있고, 형질도입은 활성 숙주 세포 분열에 의존적이지 않다. > 10⁸개의 바이러스 입자/㎖의 높은 역가가 상등액에서 쉽게 수득되고, 추가적인 농축으로 10¹¹-10¹²개의 바이러스 입자/㎖이 수득된다. 트랜스진(transgene)이 숙주 게놈 내로 통합되어, 발현이 장기적이고 안정적이다.

재조합 아데노바이러스의 생성을 위한 간소화된 시스템이 [He TC. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998]에서 제시된다. 먼저 관심 유전자를 셔틀(shuttle) 벡터, 예를 들어 pAdTrack-CMV 내로 클로닝한다. 생성된 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) Pme I으로 소화시켜 선형화하고, 이어서 이. 콜라이 BJ5183 세포 내로 아데노바이러스 골격 플라스미드, 예를 들어 스트라타진(Stratagene)의 <AdEasy™ Adenoviral Vector System>의 pAdEasy-1과 함께 공동-형질전환시킨다. 재조합 아데노바이러스 벡터를 카나마이신 저항성에 대해 선별하고, 재조합을 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해 확인한다. 마지막으로, 선형화된 재조합 플라스미드를 아데노바이러스 패키징 세포주, 예를 들어 HEK 293 세포 (E1으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포) 또는 911 (E1으로 형질전환된 인간 배아 망막 세포) ([Human Gene Therapy 7:215-222, 1996]) 내로 형질감염시킨다. 재조합 아데노바이러스가 HEK 293 세포 내에서 생성된다.

AAV-2 이외의 별법적인 AAV 혈청형 ([Davidson et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(7)3428-32]; [Passini et al. (2003), J. Virol. 77(12):7034-40])의 사용이 상이한 세포 친화성(tropism) 및 증가된 형질도입 능력을 나타냈다. 뇌암과 관련하여, 뇌 내로의 신규 주사 기술, 구체적으로는 운반 강화 전달 (CED (convection enhanced delivery); [Bobo et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(6):2076-80]; [Nguyen et al. (2001), Neuroreport 12(9):1961-4])의 개발이 넓은 면적의 뇌에 AAV 벡터를 형질도입하는 능력을 현저하게 강화하였다,

패키징 세포주의 3-플라스미드 공동-형질감염에 의해 AAV 벡터가 대규모로 제조된다: 준-전면성장(subconfluent) 293 세포의 50×150 ㎜ 플레이트 내로의 siRNA hnRNPLL 핵산 분자 또는 hnRNPLL에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 DNA 코딩 서열을 보유하는 AAV 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV RC 벡터, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 pDF6. 세포를 형질감염 3일 후 수확하고, 3회의 동결-해동 사이클 또는 초음파처리에 의해 바이러스를 방출시킨다.

그후, AAV 벡터를 벡터의 혈청형에 따라 2가지 상이한 방법으로 정제한다. AAV2 벡터는 헤파린에 대한 이의 친화력을 기초로 하는 단일 단계 중력-흐름 칼럼 정제 방법에 의해 정제한다 ([Auricchio, A., et. al., 2001, Human Gene therapy 12;71-6]; [Summerford, C. and R. Samulski, 1998, J. Virol. 72:1438-45]; [Summerford, C. and R. Samulski, 1999, Nat. Med. 5: 587-88]). AAV2/1 및 AAV2/5 벡터는 현재 3회의 순차적인 CsCl 구배에 의해 정제된다.

본원에 기술된 방법에서 사용되는 제약 조성물은 생체내 유전자 요법을 통해 전신 전달될 수 있다. 기계적 수단 (예를 들어, 표적 세포 내로의 핵산의 직접적인 주입 또는 입자 포격), 재조합 바이러스, 리포솜, 및 수용체-매개 세포내이입 (RME)이 포함되는 다양한 방법들이 생체내 형질전환을 달성하기 위해 개발되었다 (리뷰를 위해, [Chang et al. 1994 Gastroenterol. 106:1076-84]; [Morsy et al. 1993 JAMA 270:2338-45]; 및 [Ledley 1992 J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 14:328-37] 참조).

인간에서 사용하기 위한 또 다른 유전자 전달 방법은 원위치에서 인간 세포에게 직접적으로 리포솜 내의 플라스미드 DNA를 전달하는 것이다 ([Nabel, E. G., et al., Science 249:1285-1288 (1990)]). 플라스미드 DNA는 인간 유전자 요법에서의 사용을 위해 원심분리하기 쉬워야 하는데, 이는 레트로바이러스 벡터와는 달리 플라스미드 DNA가 균질하게 정제될 수 있기 때문이다. 리포솜-매개 DNA 전달에 더하여, 여러 또 다른 물리적 DNA 전달 방법, 예컨대 플라스미드 DNA를 단백질에 접합시킴으로써 DNA를 세포 상의 수용체에 표적화하는 것이 인간 유전자 요법에서 전망을 나타냈다 ([Wu, G. Y., et al., J. Biol. Chem. 266:14338-14342 (1991)]; [Curiel, D. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850-8854 (1991)]).

유전자 요법 바이러스에 대해, 투여량은 적용 당 10⁶개 내지 10¹⁴개의 입자 범위이다. 별법적으로, 생체탄도 유전자 총 전달 방법이 사용될 수 있다. 유전자 총은 원래 식물 형질전환을 위해 디자인된, 세포에 유전자 정보를 주입하기 위한 기구이다. 탑재물(payload)은 플라스미드 DNA로 코팅된 중금속의 원소 입자이다. 이러한 기술은 종종 생체탄도법(biolistics)으로 간단하게 지칭된다. 생체탄도법 기술을 사용하는 또 다른 기기는 PDS-1000/He 입자 전달 시스템이다. 단백질, 발현 벡터, 및/또는 유전자 요법 바이러스가 미세한 금 입자 상에 코팅될 수 있고, 이러한 코팅된 입자가 혈관종 및 흑색종과 같은 생물학적 조직 내로 고압 하에 "발사"된다. 유전자 총을 기반으로 하는 방법의 예가 소의 DNA-기반 예방접종에 대해 [Loehr B. I. et. al. J. Virol. 2000, 74:6077-86]에서 기술되어 있다.

본 발명은 하기의 알파벳순 단락들 중 임의의 것에 의해 정의될 수 있다:

[A] 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)에 대해 반응성인 항체의 존재를 검출하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계를 포함하는, 대상에서 막성 신장병증 (MN)을 진단하는 방법.

[B] 단락 [A]에 있어서, MN이 특발성인 방법.

[C] 단락 [A]에 있어서, 대상이 인간인 방법.

[D] 단락 [A] 내지 [C] 중 어느 하나에 있어서, 신장 생검이 수행되지 않는 방법.

[E] 단락 [A]에 있어서, PLA2R이 포유류 PLA2R인 방법.

[F] 단락 [A]에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.

[G] 단락 [A]에 있어서, 항체가 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체인 방법.

[H] 단락 [A] 내지 [G] 중 어느 하나에 있어서, 검출이 혈청학적 면역검정에 의해 수행되는 방법.

[I] a. 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계;

b. 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및

c. 2개의 시점의 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 감소는 치료가 효과적임을 지시하는 것인 단계

를 포함하는, MN에 대해 치료되고 있는 대상에서의 예후 평가 방법.

[J] a. 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계; 및

b. 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계

를 포함하며, 이때 제2 시점의 항체 수준이 검출 한계 미만으로 감소되는 때는 완화가 있음을 지시하는 것인, MN에 대한 대상에서의 예후 평가 방법.

[K] a. 제1 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 항체가 대상으로부터의 샘플에서 발견되는 것인 단계;

b. 제2 시점에 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 수준을 결정하며, 이때 제2 시점이 제1 시점 이후인 단계; 및

c. 2개의 시점의 항체 수준을 비교하며, 이때 제1 시점에 비교하여 제2 시점의 항체 수준의 증가는 막성 신장병증의 재발이 있음을 지시하는 것인 단계

를 포함하는, MN에 대한 대상에서의 예후 평가 방법.

[L] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, MN이 특발성인 방법.

[M] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, 대상이 인간인 방법.

[N] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, 신장 생검이 수행되지 않는 방법.

[O] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, PLA2R이 포유류 PLA2R인 방법.

[P] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.

[Q] 단락 [I] 내지 [K] 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체인 방법.

[R] 단락 [L]-[Q] 중 어느 하나에 있어서, 검출이 혈청학적 면역검정에 의해 수행되는 방법.

[S] 단락 [I]에 있어서, 치료가 면역억제 치료인 방법.

[T] 생체 외에서 대상에서의 샘플로부터 PLA2R에 대해 반응성인 항체를 제거하는 단계를 포함하는, 대상에서의 MN의 치료 방법.

[U] 단락 [T]에 있어서, 대상이 인간인 방법.

[V] 단락 [T]에 있어서, MN이 특발성인 방법.

[W] 단락 [T]에 있어서, 포스포리파제 A2 수용체가 포유류 PLA2R인 방법.

[X] 단락 [T]에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 방법.

[Y] 단락 [T]에 있어서, 항체가 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체인 방법.

[Z] 단락 [T]에 있어서, 항체가 면역흡착에 의해 혈액으로부터 제거되는 방법.

[AA] 단락 [T]에 있어서, 항체의 제거 후 샘플이 대상 내로 다시 복귀되는 방법.

[BB] 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서의 MN의 치료 방법.

[CC] 단락 [BB]에 있어서, MN이 특발성인 방법.

[DD] 단락 [BB]에 있어서, 대상이 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 양성으로 테스트된 방법.

[EE] 단락 [BB]에 있어서, 포스포리파제 A2 수용체가 포유류 PLA2R인 방법.

[FF] PLA2R 또는 이의 단편을 포함하는, 특발성 MN의 치료를 위한 조성물.

[GG] 대상에서의 MN의 치료를 위한, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도.

[HH] 대상에서의 MN의 치료를 위한 의약의 제조에서의, 유효량의 PLA2R 또는 이의 단편 또는 PLA2R 또는 이의 단편을 발현하는 벡터의 용도.

[II] 단락 [GG] 또는 [HH]에 있어서, MN이 특발성인 용도.

[JJ] 단락 [GG] 또는 [HH]에 있어서, 대상이 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 양성으로 테스트된 용도.

[KK] 단락 [GG] 또는 [HH]에 있어서, 포스포리파제 A2 수용체가 포유류 PLA2R인 용도.

[LL] a. 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계;

b. 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계;

c. 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계;

d. 표지되고 샘플로부터의 항체에 대해 반응성인 검출 항체를 첨가하는 단계;

e. 임의의 결합되지 않은 표지된 검출 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 및

f. 표지를 검출가능한 신호로 전환시키며, 이때 검출가능한 신호의 존재는 대상에서의 MN 가능성을 지시하는 것인 단계

를 포함하는 면역검정.

[MM] 단락 [LL]에 있어서, MN이 특발성인 면역검정.

[NN] 단락 [LL] 또는 [MM]에 있어서, 대상이 인간인 면역검정.

[OO] 단락 [LL] 내지 [NN] 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 면역검정.

[PP] 단락 [LL] 내지 [OO] 중 어느 하나에 있어서, 신장 생검이 대상에서 수행되지 않는 면역검정.

[QQ] 단락 [LL] 내지 [PP] 중 어느 하나에 있어서, PLA2R이 포유류 PLA2R인 면역검정.

[RR] 단락 [LL] 내지 [QQ] 중 어느 하나에 있어서, 항체가 IgG 서브클래스 IgG1-4의 항체인 면역검정.

[SS] 단락 [LL] 내지 [RR] 중 어느 하나에 있어서, PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체 상에 침착 또는 고정되는 면역검정.

[TT] 단락 [LL] 내지 [SS] 중 어느 하나에 있어서, 기지량의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체에 침착되거나 또는 커플링된 면역검정.

[UU] 단락 [SS] 또는 [TT]에 있어서, 지지체가 딥스틱, 테스트 스트립, 라텍스 비드, 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식인 면역검정.

[VV] 단락 [LL] 내지 [UU] 중 어느 하나에 있어서, 효소, 형광 화합물 또는 금속이 있는 표지, 또는 화학발광 화합물이 있는 표지에 공유결합으로 연결시킴으로써 검출 항체가 표지되는 면역검정.

[WW] 단락 [LL] 내지 [VV] 중 어느 하나에 있어서, 검출 항체가 대상에 대해 특이적으로 반응성인 면역검정.

[XX] 단락 [LL] 내지 [WW] 중 어느 하나에 있어서, 검출가능한 신호가 증가되는 양의 기지량의 PLA2R 또는 단편의 면역검정으로부터 유래된 적정 곡선으로부터의 검출가능한 신호들의 셋트에 비교되는 면역검정.

[YY] 단락 [LL] 내지 [XX] 중 어느 하나에 있어서, 일정 기간에 걸쳐 수득된 대상으로부터의 복수의 샘플에 대해 수행되는 면역검정.

[ZZ] 단락 [YY]에 있어서, 복수의 샘플이 2년 이상의 기간 동안 2개월 또는 3개월 마다 수득되는 면역검정.

[AAA] 단락 [ZZ]에 있어서, 각각의 면역검정의 검출가능한 신호가 연속적인 선행 시점으로부터 수득된 샘플의 검출가능한 신호에 비교되며, 이때 검출가능한 신호의 10％ 감소는 대상에서의 MN의 효과적인 치료를 지시하는 것인 면역검정.

[BBB] a. 대상으로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계;

b. 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계;

c. 항체-단백질 복합체의 형성으로부터 초래되는 광 산란 강도를 측정하며, 이때 대조군 광 산란 강도의 10％ 이상의 광 산란 강도는 대상에서의 MN 또는 MN 재발의 가능성을 지시하는 것인 단계

를 포함하는 면역검정.

[CCC] 단락 [BBB]에 있어서, PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체 상에 고정되는 면역검정.

[DDD] 단락 [CCC]에 있어서, 고체 지지체가 라텍스 비드 또는 미세구체인 면역검정.

[EEE] 단락 [BBB] 내지 [DDD] 중 어느 하나에 있어서, 대조군 광 산란 강도가 샘플의 부재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도인 면역검정.

[FFF] 단락 [BBB] 내지 [EEE] 중 어느 하나에 있어서, 광 산란 강도가 탁도계에서 측정되는 면역검정.

[GGG] 단락 [BBB] 내지 [FFF] 중 어느 하나에 있어서, 일정 기간에 걸쳐 수득된 대상으로부터의 복수의 샘플에 대해 수행되는 면역검정.

[HHH] 단락 [GGG]에 있어서, 복수의 샘플이 2년 이상의 기간 동안 2개월 또는 3개월 마다 수득되는 면역검정.

[III] 단락 [HHH]에 있어서, 각각의 면역검정의 광 산란 강도가 연속적인 선행 시점으로부터 수득된 샘플의 광 산란 강도에 비교되며, 이때 광 산란 강도의 10％ 감소는 대상에서의 MN의 효과적인 치료를 지시하는 것인 면역검정.

[JJJ] a. 적어도 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 및

b. PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 침착되는 하나 이상의 고체 지지체

를 포함하는, 대상으로부터의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 확인하기 위한 기구.

[KKK] 단락 [JJJ]에 있어서, 고체 지지체 상에 침착되는 PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 그 지지체 상에 고정되는 기구.

[LLL] 단락 [JJJ]에 있어서, 고체 지지체가 딥스틱, 테스트 스트립, 라텍스 비드, 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식인 기구.

[MMM] 단락 [JJJ]에 있어서, 대상이 인간인 기구.

[NNN] 단락 [JJJ]에 있어서, 신장 생검이 대상에서 수행되지 않는 기구.

[OOO] 단락 [JJJ]에 있어서, 대상으로부터의 샘플이 혈액 샘플인 기구.

[PPP] 단락 [JJJ]에 있어서, PLA2R 단백질이 인간 또는 돼지 PLA2R 단백질인 기구.

[QQQ] 단락 [JJJ]에 있어서, 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 기구.

[RRR] 단락 [JJJ]에 있어서, 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체를 추가로 포함하는 기구.

[SSS] 단락 [JJJ]에 있어서, 기구가 항체-단백질 복합체가 형성되는 면역검정을 수행하는 기구.

[TTT] 단락 [SSS]에 있어서, 면역검정이 혈청학적 면역검정인 기구.

[UUU] 단락 [SSS]에 있어서, 면역검정이 혼탁 면역검정인 기구.

[VVV] PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체가 대상에서의 막성 신장병증의 가능성을 지시하는 것인, 대상에서의 막성 신장병증의 진단을 용이하게 하기 위한 단락 [JJJ] 내지 [SSS] 중 어느 하나의 기구의 용도.

[WWW] 단락 [JJJ]의 기구, 및 대상의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체를 포함하는 키트.

[XXX] 단락 [JJJ]의 기구, 및 검출가능한 신호를 생산하는 제2의 표지된 PLA2R 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 키트.

[YYY] 단락 [JJJ]의 기구, 및 탁도계 큐벳을 포함하는 키트.

[ZZZ] a. 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 지시하는 면역검정으로부터의 검출가능한 신호를 포함하는 자가항체 정보를 측정하는 측정 모듈;

b. 측정 모듈로부터 출력된 데이터를 저장하도록 설정된 저장 모듈;

c. 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 검색된 콘텐츠를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및

d. 검색된 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 검색된 콘텐츠에서, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈

을 포함하는 시스템.

[AAAA] 단락 [ZZZ]에 있어서, 대조군 데이터가 건강한 비-MN 개체들의 집단으로부터의 데이터를 포함하는 시스템.

[BBBB] a. 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대한 자가항체 정보를 수신 및 출력하도록 설정되며, 이때 자가항체 정보가 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 수준을 측정하는 결정 모듈;

b. 결정 모듈로부터의 출력 정보를 저장하도록 설정된 저장 모듈;

c. 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및

d. 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 자가항체가 없으면 대상이 완화 상태이거나 또는 선행 기록에 비해 10％ 이상의 감소가 있으면 MN에 대한 치료가 대상에서 효과적인 것인 출력 모듈

을 포함하는, 대상에서의 MN의 예후 평가를 용이하게 하는 시스템.

[CCCC] 단락 [BBBB]에 있어서, 대조군 데이터가 동일한 대상으로부터의 이전 데이터를 포함하며, 이때 이전 데이터가 검출가능한 양의 자가 항체를 지시한 컴퓨터 시스템.

[DDDD] a. PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대한 면역검정으로부터의 신호 수준을 나타내는 대상으로부터 수득된 샘플로부터의 데이터를 함유하는 데이터 저장 모듈;

b. 데이터 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하는 비교 모듈; 및

c. 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 기준 데이터 및/또는 대조군 데이터에 비해 10％ 이상의, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 대상이 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈

을 포함하는 컴퓨터 판독가능 저장 매체.

[EEEE] 단락 [DDDD]에 있어서, 대조군 데이터가 건강한 비-MN 개체들의 집단으로부터의 데이터를 포함하는 시스템.

제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 하기의 실시예에 의해 본 발명이 추가로 설명된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌의 내용, 뿐만 아니라 도면 및 표는 본원에 참고로 포함된다.

실시예

재료 및 방법

인간 혈청

보스톤 유니버시티(Boston University)의 임상 연구 위원회(Institutional Review Board)의 허가 하에, 본 발명가들은 막성 신장병증 환자, 기타 사구체 또는 자가면역 장애 환자, 및 정상 자원자로부터의 코드화된 혈청 샘플을 수집하고 저장하였다. 특발성 MN에 걸린 것으로 분류된 환자들은 전통적인 2차 특색, 예컨대 양성 항-핵 항체 (ANA), 항-이중 가닥 DNA 항체, 또는 B형 간염 혈청학의 부재 하에 생검으로 증명된 MN에 걸려 있었다. 이런 군의 추가적인 분류가 추가 정보 섹션에서 논의된다.

인간 신장 조직

본 발명가들은 <New England Organ Bank>로부터 이식에 적절하지 않고 연구용으로 기증된 인간 신장을 수득하였다. 잘게 다져진 신장 피질로부터 금속 체 (ref)에 여과함으로써 사구체를 수집하고, 세제-함유 RIPA 완충제 (Boston BioProducts (Boston, MA))에 재현탁시켜 추출하였다. <Immobilized Protein G Plus> (Thermo Fisher)와의 인큐베이션을 통해 이러한 제제로부터 오염성 IgG를 제거하였다. 본 발명가들은 지시된 경우 N-연결 당 잔기를 사구체 단백질로부터 제거하기 위해 펩티드 N-글리코시다제 F (PNGase F; New England Biolabs)를 환원제의 부재 하에 사용하였다. 사구체 당단백질을 부분적으로 정제하기 위해, 본 발명가들은 인간 사구체 추출물을 밀 배아 응집소 (WGA) 아가로스 비드 칼럼 (Vector Laboratories) 상에 통과시키고, 결합된 당단백질을 500 mM N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc)으로 추출하였다. 천연 및 200 kDa PNGase F-탈글리코실화 항원 양쪽 모두가 칼럼에 결합하는 것으로 확인되었다.

웨스턴 블롯 프로토콜

인간 사구체 추출물 또는 세포-발현 인간 PLA2R을 표준 프로토콜에 따라 비-환원 조건 하에 전기영동하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 전형적으로 1:100 내지 1:250의 1차 항체로서의 인간 혈청, 및 1:40,000의 양고추냉이 과산화효소-접합 당나귀 항-인간 IgG 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch)로 면역블롯팅하였다. 이러한 실험에 사용된 PLA2R 항체는 정제된 전장 토끼 PLA2 수용체에 대해 생성된 폴리클로날 기니피그 항체이다. 이는 환원 및 비-환원 젤 전기영동 조건 양쪽 모두 하에서 인간 단백질을 인식한다 ([Granata, F., et al. 1995, J. Immunol. 174: 464-74]; [G. Lambeau, personal communication]). 본 발명가들은 4가지 IgG 서브클래스에 대한 양 항체를 더 바인딩 사이트(The Binding Site)에서 구입하였고, 이들을 제조사가 권장하는 희석도로 사용하였다.

질량 분광법 분석 및 데이터 해석

관심이 있는 젤 영역을 잘라 내어, 기존에 [Powell, 2003 Mol Cell Biol 23:5376-5387]에 기술된 대로 젤내(in-gel) 트립신 소화를 수행하였다. 생성된 펩티드를 액체 크로마토그래피 (LC)와 직렬(tandem) 질량 분광법 (MS/MS)이 커플링된 기존에 기술된 방법 ([Powell, 2004, Mol Cell Biol 24:7249-7259])의 변형된 버젼으로 분석하였다. 수득된 MS 데이터를 SEQUEST 알고리즘을 사용하여 NCBI RefSeq 인간 데이터베이스를 검색하는데 사용하였고, 시퀘스트소서러(SequestSorcerer)™ (Sage-N Research (San Jose, CA))로 데이터를 분석하였다. 각각의 확인된 단백질의 풍부도(enrichment) 또는 상대 존재비를 단백질에 매칭되는 스펙트럼 카운트의 개수를 이의 예상 분자량에 의해 표준화함으로써 결정하였다. 이러한 값은 단백질 존재비 인자 (PAF: Protein Abundance Factor)로 명명되었다 ([Powell, 2004, Mol Cell Biol 24:7249-7259]).

면역조직학

최적 절단 온도(Optimal Cutting Temperature) 용액 (TissueTek) 내의 인간 신장의 신선한 절편을 동결시키고, 냉동절단기(cryotome)로 4 ㎛ 절편을 절단하였다. 헬무트 렌케(Helmut Rennke) 박사 (Boston, MA)로부터의 5개의 MN 신장 생검물로부터 일련의 동결 절편들을 수득하였다. 절편을 고정하고, 메탄올:아세톤으로 투과성이게 하고, TBS 내의 10％ 소 혈청 알부민으로 차단하였다. PLA2R을 검출하기 위해, 1:400의 기니 피그 항-토끼 PLA2R 및 1:500의 Cy3-접합 당나귀 항-기니 피그 IgG (Jackson ImmunoResearch)를 사용하였다. 염색의 특이성을 실연하기 위해, 폴리클로날 항체를 4번째 내지 6번째 렉틴-결합 도메인을 함유하는 토끼 PLA2R의 단편으로 예비-청정화(pre-clearing)하였다. 이는 PLA2R에 대한 면역형광 신호를 현저히 격감시켰다.

모든 사례에서 신장 생검에 의해 막성 신장병증의 진단이 확증되었다. 특발성 MN으로 분류된 개체들에는 항-핵 항체 또는 항-이중 가닥 DNA에 대한 양성, B형 간염 항원혈증, 또는 상피하 이외의 장소에서의 신장 생검 상에서의 전자 밀도가 높은 침착물이 포함되는 2차 특색의 증거가 없었다. 본 발명가들은 불가해한 악성 종양을 2차 MN의 잠재적인 원인으로서 배제하려고 시도하지 않았다. 생검에 의해 (2 FSGS; 1 DN; 1 헤노흐-쇤라인(Henoch-Shonlein) 자색반), 또는 임상 특색에 의해 또 다른 사구체 장애들이 진단되었다. 여기에는 점진적으로 진행성인 단백뇨, 분할(split) 소변 수집물에 의해 증명되는 기립성 단백뇨가 있는 오래 계속된 MN이 포함되었다. 추가적인 자가면역 또는 류머티스성 용태가 있는 환자는 유의한 단백뇨가 없는 전신 홍반 루푸스, 피부근육염, 공피증/혼합형 결합 조직 중복 질환, 및 수포성 유사천포창을 포함하였다.

IgG에 대한 크기 유사성을 고려하여, 본 발명가들은 먼저 IgG를 막성 신경병증 혈청에서 류머티스 인자-유사 활성이 있었을 수 있는 것의 표적으로서 제외하였다. 사구체 추출물을 단백질 G-연결 아가로스 비드로 처리하여, 사구체 추출물 내에 변함없이 존재한 오염성 IgG를 제거하였다. 역으로, IgG와 반응성인 임의의 혈청 인자를 예비-흡착하도록 어피-젤(Affi-Gel) 10 비드에 공유결합으로 연결된 열로 응집된 IgG와 함께 MN 혈청을 인큐베이션하였다. 이러한 방식으로 처리된 혈청 샘플은 출발 혈청이 그러했듯이 200 kDa 항원과 동일한 반응성을 나타냈다 (데이터는 제시되지 않음). 추가적으로, 본 발명가들은 장기간의 저분자량 (6％) 아가로스 젤 러닝에서 IgG와 MN-Ag 사이의 이동에서의 미세한 차이를 나타낼 수 있었고, PNGase F로 처리했을 때 IgG의 크기에서의 두드러진 이동이 주목되지 않았다. 표적 항원이 면역글로불린이 아니라는 본 발명가들의 확신에도 불구하고, 인간 IgG에 대한 크기 유사성 및 항원을 검출하기 위해 비-환원 조건 하의 젤 러닝을 필요로 하는 것은 여러 접근법에도 불구하고 MN-Ag의 면역침전을 거의 불가능하게 만들었다. 따라서, 본 발명가들은 생화학적 정제 기술을 사용하여 막성 신장병증에서의 이러한 추정 표적 항원 (MN-Ag)을 확인하는 업무에 접근하였다.

결과

MN 혈청이 200 KDA 사구체 단백질과 반응한다

인간 막성 신장병증 내의 표적 항원의 확인에 대한 본 발명가들의 접근법은 MN 환자의 혈청 내의 자가항체로 인간 사구체 단백질의 표준 웨스턴 블롯팅에 의해 후보 밴드가 확인될 것이라는 가정을 기초로 하였다. 본 발명가들이 우연히 비-환원 조건 하에 단백질들을 전기영동했을 때까지 일관적으로 확인된 밴드가 검출되지 않았고, 이때 더욱 표준적인 환원 조건을 사용하여 기존에 음성이었던 여러 혈청에 의해 약 200 kDa의 두드러진 밴드가 검출되었다. 특발성 MN 환자들로부터의 또 다른 은행에 저장된 혈청 및 새롭게 수집된 혈청의 테스트는 이같은 환자들의 50％ 초과에서 유사한 반응성을 나타냈다. 도 1a에서, 5개의 MN 혈청 모두 약 200 kDa의 밴드를 인지하는 반면, 신장 대조군 환자로부터의 혈청은 그렇지 않다. 도 1a의 하부 패널에서, 이러한 5개의 반응성 MN 혈청이 천연 및 탈글리코실화 (PNGase F +) 사구체 단백질이 번갈아 있는 웨스턴 블롯팅 레인에 사용된다. 5개의 MN 혈청 모두 200 kDa 천연 항원 및 약 150 kDa의 탈글리코실화 단백질과 동일하게 반응한다. 인상적으로, 정상 자원자 (n= 23), 당뇨병성 신장병증 FSGS과 같은 신장 용태에 걸린 환자 (n= 13), 또는 또 다른 자가면역성 류머티스성 장애가 있는 환자 (n= 6)로부터의 혈청이 동일한 조건 하에 분석되었을 때 이러한 항원에 대해 모두 비-반응성이었다. MN 환자의 추가적인 분석은 2차 MN의 8개의 사례 (6개의 루푸스-관련 및 2개의 B형 간염-관련)가 200 kDa 항원에 대해 반응성이었음을 나타냈다. 펩티드 N-글리코시다제 (PNGase) F로 N-연결 탄수화물 사슬을 제거하면 이러한 항원의 이동성이 약 150 kDa으로 유의하게 이동하였고, 이는 항원이 많이 글리코실화됨을 가리킨다. 처음에 천연 200 kDa 밴드와 반응성인 모든 혈청에서 더 작은 탈글리코실화 밴드가 또한 확인되었다 (도 1a).

특발성 막성 신장병증에 대한 항-PLA2R 자가항체 양성 반응성의 특이성을 확인하기 위해, 본 발명가들은 웨스턴 블롯팅에 의해 PLA2R에 대한 항체에 대해 테스트되는 대상으로부터의 샘플의 개수를 증가시켰다. 대조군을 n= 32으로, 당뇨병성 신장병증 FSGS과 같은 신장 용태가 또 다른 신장 용태가 있는 환자 (n= 25)를 또한 증가시켰다. 보스톤 (MA, USA)에서의 특발성 MN 대상의 수의 증가에 더하여, 로체스터(Rochester) (MN, USA)의 메이요 클리닉(Mayo Clinic), 스웨덴의 룬트 대학교(University of Lund) 및 네덜란드의 대학으로부터 샘플을 받아 테스트하였다. 질환 대조군으로서의 2차 MN, 기타 자가면역 및 신장 질환 환자 및 정상 대상으로부터의 대조군 샘플의 수를 또한 증가시켰다. 특발성 MN 환자의 약 72-82％가 항-PLA2R 항체에 대해 양성으로 테스트된 반면, 정상 또는 질환 대조군 또는 2차 형태의 MN에 걸린 환자는 양성이지 않았다 (도 1c).

상당한 글리코실화의 증거를 고려하여, 본 발명가들은 다양한 렉틴 칼럼에 결합하는 항원의 능력을 테스트하였고, 항원이 천연 형태 및 N-탈글리코실화 형태 양쪽 모두에서 밀 배아 응집소 (WGA)에 결합하였음을 발견하였다. 양쪽 형태의 결합은 항원성을 유지하기 위해 필요한 비-환원 조건 하에 PNGaseF에 접근하기 어려운 잔류 N-연결 탄수화물을 반영할 수 있다. 천연 및 탈글리코실화 인간 사구체 단백질을 WGA로부터 용출시키고 전기영동하였다; WB 상의 200 및 150 kDa 항원 밴드에 상응하는 2개의 젤 영역을 잘라내어, 젤내 트립신 소화시키고, 질량 분광법에 의해 분석하였다. 추정 표적 항원에 상응하는 펩티드 서열이 양쪽 샘플에서 확인될 것이라는 가정 하에, 추정 MN 항원에 대한 후보물의 목록을 생성시켰다 (표 1 참조). 이용가능한 항체 및/또는 재조합 단백질을 사용하여, 본 발명가들은 이러한 후보 항원을 평가하였고, M형 포스포리파제 A2 수용체에 대한 항체로 인간 사구체 내의 유사한 크기의 단백질을 확인했을 때 가능한 매치를 우연히 발견하였다 (도 2a).

포스포리파제 A2 수용체가 MN 내의 표적 항원이다

MN 혈청 및 항-PLA2R 양쪽 모두 사구체 추출물의 WB (웨스턴 블롯)에서 동일한 밴드를 인식한다 (도 2a). 재조합 단백질이 천연 사구체 단백질보다 약간 더 낮은 위치로 이동하지만, PNGase F로의 탈글리코실화는 양쪽 모두를 동일한 위치로 이동하게 한다. MN 혈청과 블롯팅된, 세포에서 발현된 재조합 인간 PLA2R (rPLA2R)에서는 인간 사구체로부터의 상응하는 신호보다 약간 더 작은 WB 상에서의 뚜렷한 밴드가 산출되었다. 그러나, 양쪽 샘플이 탈글리코실화되었을 때, 이들은 동일한 위치로 이동하였다 (도 2a). 이는 천연 단백질과 재조합 형태 사이의 전체적인 글리코실화에서의 작은 차이를 시사한다. 중요하게, PLA2R에 대한 단일특이적 폴리클로날 항체로의 동일한 샘플들의 WB가 동일한 패턴을 드러냈다. 본 발명가들은 그후 인간 사구체로부터의 200 kDa 당단백질과 반응성인 모든 MN 샘플이 rPLA2R을 또한 인식한다는 것을 확증하여, 본 발명가들이 연구 중이었던 인간 사구체로부터의 200 kDa 밴드가 실제로 PLA2R임을 확증하였다.

WB에 의해 200 kDa MN-Ag와 반응성인 인간 혈청은 인간 사구체 추출물로부터의 PLA2R을 면역침전 (IP)시킬 수 있다 (도 2b). 3개의 반응성 MN 혈청 모두가 인간 및 돼지 사구체 단백질 추출물로부터 PLA2R을 면역침전시킬 수 있는 반면, 대조군은 그렇지 않았다. 감지할 수 있는 양의 출발 IgG가 모든 경우에 존재하였다; 이러한 양이 레인 2에서 더 낮은데, 이는 이러한 환자가 특히 신장성이었기 때문이다. 3개의 비-반응성 혈청 중 2개 및 3개 모두의 신장 대조군 혈청은 동일한 조건 하에 PLA2R을 면역침전시키지 않았다. 흥미롭게, 처음에 WB에 의해 비-반응성인 것으로 발견된 혈청 중 하나로, 희미한 밴드가 IP에 의해 검출되었다 (재현에서는 가시적이지 않음). 이러한 혈청을 1:25 희석으로 다시 분석했을 때, WB에 의해 rPLA2R을 확인하는 것으로 발견되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이는 처음에 항-PLA2R 자가항체가 없는 것으로 생각된 또 다른 MN 환자가, 그보다는, 본 발명가들의 초기 WB 분석법 (전형적으로 스크리닝이 1:100 혈청 희석으로 수행됨)에 의해 쉽게 검출가능하지 않은 낮은 수준의 역가를 지닐 수 있음을 시사할 수 있다.

또한, 도 2c는 반응성 MN 혈청에 의해 확인된 사구체 당단백질이 인간 PLA2R임을 나타낸다. 전체 인간 혈청이 사구체 단백질을 면역침전 (IP)시키는데 사용되었고, 그후 IP를 전기영동하고, M형 포스포리파제 A2 수용체에 대해 특이적인 항체로 웨스턴 블롯팅하였다. 처음 5개의 레인은 WB (도 1에서와 같이)에 의해 양성인 것으로 알려진 혈청과의 IP를 나타낸다. 6번째 레인은 음성인 것으로 알려진 MN 환자로부터의 혈청과의 IP를 나타낸다. 레인 7 및 8은 정상 자원자로부터의 혈청과의 IP를 나타내고, 마지막 레인에서는, 아가로스 비드에 대한 사구체 단백질의 비-특이적 결합을 배제하도록 인간 혈청이 IP로부터 생략되었다.

재조합 PLA2R는 천연 사구체 단백질이 그러하듯이 환원-민감성 에피토프를 공유한다 (도 3a). 등량의 인간 사구체 추출물 (HGE)이 환원 및 비-환원 조건 하에 전기영동된 WB에서, 재조합 PLA2R이 유사하게 처리되었다. WB를 반응성 MN 혈청 또는 폴리클로날 항-PLA2R 항체로 수행하였고, 적합한 2차 항체로 검출하였다. MN 혈청 및 폴리클로날 항-PLA2R 양쪽 모두에 대해, 비-환원 상태의 천연 또는 재조합 PLA2R에 대한 반응성이 주목되었다. 그러나, 항-PLA2R은 환원된 형태의 항원을 인식하는 한편, MN 혈청은 환원된 천연 또는 재조합 단백질을 검출하는데 실패하였다. 단일특이적 항-PLA2R 항혈청 및 MN 혈청 양쪽 모두에서 비-환원 조건 조건 하의 WB에 의해 재조합 및 천연 사구체 PLA2R이 강력하게 검출되었다. 환원 조건 하에 러닝되는 경우 폴리클로날 항체는 여전히 양쪽 형태 모두를 검출하지만 (비록 덜 강하긴 하지만), MN 혈청은 어느 형태와도 반응하는데 실패하였다.

PLA2R, 인간 사구체 단백질, 재조합 PLA2R, 및 이. 콜라이로부터의 항원에 대해 반응성인 자가항체의 IgG 클래스를 단일 반응성 MN 혈청에 이어서 IgG 서브클래스에 대해 특이적인 항체로 블롯팅하였다. 천연 또는 PLA2R와 반응한 우세한 서브클래스는 IgG4인 반면, 대조군으로서 포함된 70 kDa 이. 콜라이 단백질에 대해서는 IgG2였다. 이러한 특정 혈청 내의 IgG 서브클래스의 상대적인 양을 희석된 전체 혈청의 서브클래스-특이적 항체로의 WB에 의해 평가하였다. IgG2 형태는 이의 변성 형태에서 잘 검출되지 않지만, 70 kDa 이. 콜라이 단백질에의 결합에 의해 검출되는 바와 같이 명확하게 존재하였다. 특발성 MN 환자의 사구체에서 면역형광 현미경법에 의해 검출된 IgG 항체가 IgG4 서브클래스의 항체임이 잘 확립되어 있다. 여기에서, 본 발명가들은 PLA2R과 반응한 특발성 MN 환자의 혈청 내의 IgG 항체가 또한 IgG4 서브클래스의 항체임을 발견하였다. 본 발명가들은 특발성 MN으로 진단된 환자 6명으로부터의 추가적인 혈청에서 이러한 관찰을 추가로 확증하였다. 인간 사구체 추출물 (HE)을 먼저 6명의 특발성 MN 환자로부터의 혈청 샘플 (MN1 내지 MN6)로, 이어서 각각의 인간 IgG 서브클래스 (1 내지 4)에 대해 특이적인 양 항체로 블롯팅하고, 과산화효소-접합 항-양 IgG 항체로 검출하였다. 천연 항원과 반응한 우세한 IgG 서브클래스는 IgG4였고, 이때 IgG1, IgG2, 및 IgG3에 대해 다양한 양의 반응성이 나타났다. HGE 대신 재조합 PLA2R을 사용하여 동일한 결과가 수득되었다 (데이터는 제시되지 않음). IgG4 서브클래스의 우세와 함께, 막성 신장병증에서의 면역글로불린 응답은 전형적으로 Th2 응답이다 ([Kuroki, 2005, Kidney Int 68:302-310]). 인간 사구체 단백질 또는 rPLA2R이 적합하게 반응성인 MN 환자 혈청과 면역블롯팅되었을 때, WB에 의해 검출된 우세한 서브클래스는 IgG4인 한편 (도 3b), 관련되지 않은 박테리아 항원에 대해서는 IgG2였다.

포스포리파제 A2 수용체의 사구체 국소화

인간 MN에 대한 제안된 병리메커니즘은 자가항체가 발세포 상에 존재하는 항원에 원위치에서 결합한다는 것이다. PLA2R이 가용성 형태로 기술되었기 때문에, 먼저 본 발명가들은 순환 항체-PLA2R 복합체가 GBM 내에 포획되어 있다는 가능성을 무시하였다. 렉틴 결합에 의한 강화 후에도, MN 혈청 또는 대조군 혈청에 검출가능한 PLA2R이 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 어느 한쪽 군으로부터의 혈청 샘플 내의 IgG의 폴리에틸렌 글리콜 6000으로의 침전 또는 단백질 G 면역침전을 통해 PLA2R-IgG의 순환 면역 복합체를 검출할 수 없었다. 반대로, 단일특이적 항-PLA2R 항체로의 면역형광에 의해 발세포 상의 PLA2R의 존재를 검출할 수 있었다. 정상인의 신장 피질의 동결 절편을 사구체 기저막 (GBM)을 표지하기 위한 항-아그린에 이어지는 FITC-접합 항-토끼 2차 항체, 항-PLA2R에 이어지는 CY3-접합 항-기니 피그 2차 항체로 공동-염색하였다 (데이터는 제시되지 않음). 본 발명가들은 PLA2R 신호가 명확하게 GBM에 대해 외부에 존재하고, 발세포의 세포체 및 돌기에 국소화된다는 것을 발견하였다. 항체를 CRD 도메인 4-6을 함유하는 PLA2R의 재조합 단편으로 예비-청정화하였을 때, 이러한 염색이 두드러지게 감소하였다 (데이터는 제시되지 않음). 염색 패턴은 과립형이었고, 세포체로부터 바닥 발 돌기로 확장되었다. 냉동절편을 PLA2R 및 아그린 (사구체 기저막 (GBM)의 성분)에 대한 항체로의 이중 면역형광에 의해 염색했을 때, GBM에 바로 인접하여, 그리고 GBM에 대해 외부에서 발세포 신호가 명확하게 나타났다. CTLD 4, 5 및 6을 함유하는 재조합 PLA2R 단편과 항체의 예비-인큐베이션에 의해 사구체 및 발세포 PLA2R 염색의 대부분이 차단될 수 있었다.

이어서, 본 발명가들은 사구체에서의 항-PLA2R IgG4의 국소화를 연구하였다. PLA2R은 과립형 패턴으로 막성 신장병증 생검 검사물 내에 존재하였고, IgG4와 공동-국소화되었다. MN으로 진단된 환자로부터의 생검 검사물의 동결 절편은 PLA2R 및 IgG4가 말초혈관벽 및 GBM에 잘 공동-국소화됨을 드러냈다 (데이터는 제시되지 않음). 동일한 환자의 일련의 절편을 동일한 방식으로 염색하였지만, 항-양 2차 항체가 기니 피그 또는 당나귀 IgG를 검출하거나 또는 Cy3 채널로부터의 유출물이 이전에 나타난 신호를 야기할 가능성을 배제하기 위해 항-IgG4 항체를 생략하였다. 발세포와 달리, 정상인의 신장 조직 내의 혈관사이 세포는 PLA2R에 대한 염색을 나타내지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

래트 하이만 신장염 모델에서의 연구는 수용체-항체 복합체의 "캐핑(capping) 및 쉐딩(shedding)"이 GBM 내로 상피하 침착됨을 시사하였고, 본 발명가들은 인간 MN에서의 PLA2R의 경우에 동일하게 사실일 것으로 예상하였다. PLA2R은 MN 환자로부터 수득된 신장 생검 검사물로부터의 냉동절편의 면역형광 시 GBM의 내층을 이루는 미세 과립형 패턴으로 존재하였다. 이는 재조합 PLA2R의 차단 단편으로 차단될 수 있었다. 염색 강도는 4개의 환자 샘플 간에 다양했지만, 모두 PLA2R에 대해 동일한 과립형 패턴을 나타냈다 (데이터는 제시되지 않음). 흥미롭게, 정상 사구체 절편에서 강했던 발세포 세포체의 PLA2R 염색이 MN 생검 샘플에서 크게 약화되었다. 또한, GBM 염색 패턴이 이중 면역형광에서의 IgG4의 패턴과 밀접하게 매칭되었다.

면역형광 현미경검사법은 항-PLA2R 및 IgG4가 특발성 MN 환자의 사구체에서 공동-국소화되지만 루푸스-관련 MN에서는 그렇지 않음을 나타냈다. 막성 신장병증 환자로부터의 사구체 내의 IgG가 PLA2R과 반응성이었음을 확증하기 위해, 본 발명가들은 생검 검사물로부터 IgG를 용출하였고, 이를 천연 및 재조합 PLA2R과의 웨스턴 블롯팅에서 사용하였다. IgG가 특발성 막성 신장병증 환자로부터의 4개의 생검 샘플, 루푸스 막성 신장병증 환자로부터의 1개, 및 IgA 신장병증 환자로부터의 2개로부터 성공적으로 용출되었다. 특발성 막성 신장병증 환자로부터의 샘플로부터 용출된 IgG는 재조합 PLA2R에 대해 양성인 인간 사구체 추출물 및 세포 용해물에서 적합한 크기의 PLA2R 밴드를 특이적으로 검출하였지만 (도 4a 및 4b), 면역 복합체 사구체 질환 환자로부터의 3개의 샘플로부터 용출된 IgG는 그렇지 않았다. 특발성 MN (MN), 루푸스 MN (LMN), 또는 IgA 신장병증 (IgAN) 환자로부터의 생검 코어(core)로부터 IgG를 용출하였다. 이러한 용출된 IgG를 사용하여 인간 사구체 추출물 (HGE) 또는 재조합 PLA2R (rPLA2R)을 면역블롯팅하였다.

질환 활성과의 관련

가능한 경우에 일련의 혈청 샘플을 수득하여, 치료 또는 자발적인 완화 또는 별법적으로 재발이 이루어진 여러 개체에서의 반응성에서의 변화를 시험하였다. PLA2R에 대한 자가항체의 존재는, 일반적으로, 소변 단백질 및 혈청 알부민에 의해 측정된 임상적으로 유의한 질환 활성에 필적하였다 (도 5 및 6). 중요하게, 단백뇨의 소멸 전에 항-PLA2R 항체의 감퇴 또는 소멸을 볼 수 있었다. 이는 면역 침착물의 소거 및 발세포 구조 및 기능성 틈새 격막의 회복에 필요한 시간을 고려하여 이해할 수 있다.

본 발명가들은 치료-유도 완화 전 및 후에 추가적인 환자들을 연구하였다. 치료 전에 항-PLA2R에 대해 양성인 환자가 면역억제 치료로 완화가 유도된 후 음성이 되었음을 발견하였다 (도 6a 및 b). 그래프 내의 흑색 사각형은 소변 단백질 배설을 나타낸다. 시클로포스파미드 및 프레드니손으로의 치료를 시작한 후, 소변 단백질 배설이 감소하였고, 웨스턴 블롯에 나타난 바와 같이 PLA2R에 대한 반응성이 소멸되었다. 리툭시맵 및 전신 ACTH로 치료된 환자에서 유사한 결과가 발견되었다.

이러한 발견은 MN의 진단을 위해서, 뿐만 아니라 치료 동안 또는 자발적 완화를 기다리는 동안 질환 활성을 모니터링하는 것을 위해서, PLA2R에 대한 면역검정을 사용하는 것의 유용성을 지지한다.

결론적으로, 본 발명가들은 자가면역 사구체 질환인 특발성 막성 신장병증에서 주요 표적 항원으로서 M형 포스포리파제 A2 수용체를 확인하였다. 이러한 단백질은 정상인의 발세포 상에 존재하고, 50％를 초과하는 MN 환자가 이러한 단백질과 반응성인 항체를 보유한다. 또한, 이러한 단백질은 환자의 생검 검사물 내의 면역 침착물 내에 존재한다. PLA2R에 대한 항체의 수준이 질환 활성과 상관되는 것으로 보이고, MN의 초기 진단 및 치료하면서 또는 자발적 완화를 기다리는 동안 질환 활성을 추적하는 것을 위한 유용한 방법인 것으로 증명될 수 있다.

본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원, 뿐만 아니라 도면 및 표를 포함하는 모든 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다. 어떠한 참고문헌도 종래 기술을 구성하는 것으로 인정되지 않는다. 참고문헌의 논의는 이의 저자가 주장하는 바를 진술하고, 출원인은 인용된 문서들의 정확성 및 적절성에 이의를 제기할 권리를 갖는다. 다수의 종래 기술 간행물이 본원에서 언급되었지만, 이같은 언급은 임의의 이러한 문서가 당업계, 미국 또는 임의의 기타 국가의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것이 아님이 명확하게 이해될 것이다.

실시예 2

본원에 기술된 항-PLA2R 자가항체의 수준을 도 8-9에 도해된 바와 같은 테스트 스트립을 사용하여 또한 결정할 수 있다. 테스트 스트립에서, 막을 3개의 분리된 영역으로 나누었다: 막의 한쪽 끝부분의 샘플 (S) 위치, 막의 중간에 위치하는 테스트 (T) 위치, 및 막의 반대쪽 끝부분에서 발견되는 대조군 (C) 위치 (도 8a). S에는 과량의 탈수 PLA2R이 위치한다. PLA2R이 가시화 목적을 위해 콜로이드성 금 비드 또는 라텍스 비드에 접합될 수 있다. T에는, 막 상에 고정된 과량의 항-IgG가 있다. C에는, 또 다른 고정된 항-PLA2R 항체가 있다 (도 8a).

S 위치의 과량의 탈수된 PLA2R은 샘플 (예를 들어, 혈청)이 S에 적용될 때, 항-PLA2R 항체 및 PLA2R 복합체가 형성되고, 유리 PLA2R이 위치 C의 고정된 항-PLA2R에 결합하는데 여전히 이용가능하도록 하는 것이다.

S 위치는 혈청 샘플이 적용되는 장소이다. 화살촉은 혈청이 막에 적용될 때 막 상에서 샘플 혈청이 넘지 말아야 하는 한계를 묘사한다. 혈청 내의 물이 PLA2R을 다시 수화시킨다. PLA2R에 대한 자가항체가 다시 수화된 PLA2R와 복합체를 형성할 때 항체-단백질 복합체가 생산된다. 항체-단백질 복합체 및 복합체를 형성하지 않은 PLA2R의 혼합물이 모세관 현상에 의해 위치 S에서 위치 T 및 C를 향해 이동한다.

T 위치에 도달하면, 항체-단백질 복합체가 고정된 항-IgG 항체에 결합하여 T 위치에 고정될 것이다. 콜로이드성 금 또는 라텍스 비드로 표지된 항체-단백질 복합체의 국소 농도가 T 위치에서의 유색 선으로서 가시적에게 될 것이다 (도 9, 중간). 샘플 내의 자가항체의 양이 많을수록, T에서의 가시적인 밴드가 넓을 것이다. T 위치에서 영역이 여전히 투명하면, 이는 항-PLA2R 자가항체가 없음을 의미한다 (도 9, 좌측). C 위치에서, 표지된 유리 PLA2R이 고정된 항-PLA2R 항체에 결합하여 포획될 것이다. 차례로 이는 C 위치에서의 콜로이드성 금 또는 라텍스 비드로 표지된 PLA2R의 농축을 초래하고, C 위치에서 유색 선으로 가시적이게 될 것이다. C 위치 결과는 테스트 물질 내에 기능적 PLA2R가 있다는 테스트 대조군으로서의 구실을 하고, 항상 존재하여야 한다 (도 9, 우측).

테스트 스트립은 딥스틱 테스트 스트립의 형태로 디자인될 수 있다 (도 8b). 딥스틱 테스트 스트립으로서, 스트립을 S 위치 끝부분에서 혈청 샘플 내로 담그고, 이때 샘플 수준은 한계를 넘지 않는다. 그후, 막 표면을 위로 향하게 하면서 편평한 표면 상에 스트립을 수평으로 눕힌다. 정해진 양의 시간을 항체 재수화, 모세관 현상 및 항체 결합 반응이 일어나도록 제공한다. 정해진 시간 말기에, C 위치에 가시적인 밴드가 있어야 하고, 항-PLA2R 자가항체의 수준에 따라, T 위치에 가시적인 밴드가 있거나 없을 수 있다 (도 9).

실시예 3

본원에 기술된 항-PLA2R 자가항체의 수준을 도 10에 기술된 바와 같이 ELISA 분석법을 사용하여 결정할 수 있다. ELISA 분석법은 대상으로부터 수득된 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 양을 결정하기 위해 표준 적정 분석법 및 샘플 분석법을 수행하는 것을 포함한다. 제시된 바와 같이, ELISA 분석법 미량역가 플레이트는 증가되는 양의 IgG 단백질을 위한 2개의 이중 기준 행으로 구성된다. 0-50 ng/㎖ 또는 pg/㎖ 범위의 표준량의 IgG 단백질을 기준 행 내에 놓아, 인간 IgG에 대한 표준 곡선을 생성시킨다. 과량의 PLA2R을 플레이트의 샘플 웰 내에 고정시킨다. 혈청 샘플을 샘플 웰 내에 놓는다. 이어서, 양고추냉이 과산화효소로 표지된 항-인간 IgG 항체를 웰에 첨가한다. 웰 내의 혼합물을 실온에서 90분 동안 인큐베이션하고, 액체를 따라낸다. 웰을 탈이온수로 5회 세정한다. 그후, 분취량의 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 (TMB) 시약을 각각의 웰에 첨가한다. 혼합물을 10초 동안 부드럽게 혼합하고, 실온 (18-25℃)에서 20분 동안 인큐베이션한다. 1N HCl을 첨가하여 효소 반응을 종결시킨다. 모든 청색이 완전히 황색으로 변할 때까지 부드럽게 교반한다. 색 부산물의 양을 이의 흡광도를 450 nm에서 미량역가 웰 판독기로 판독함으로써 결정한다. A₄₅₀은 웰 내의 인간 IgG 항체의 양에 상응한다. 샘플 웰로부터 수득된 A₄₅₀ 및 기준 웰로부터 수득된 표준 곡선으로부터 테스트 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 양을 추정할 수 있다.

별법적인 실시양태에서, 도 11에 제시된 바와 같은 변형된 ELISA 분석법을 사용할 수 있다. 도 10에 제시된 바와 같이, 기준 행 및 샘플 웰을 표지한다 (도 11). 과량의 PLA2R을 플레이트의 웰 내에 고정한다. 고정량의 IgG를 이중 기준 웰 내에 놓는다. 이러한 고정된 양은 건강한 비-MN 대상의 혈청에서 발견되는 항-PLA2R 자가항체의 평균량에 상응하는 기준 값이다. 샘플 (혈청)을 또한 이중 샘플 웰 내에 놓는다. 분석법 플레이트를 본원에 기술된 바와 같이 프로세싱한다. 혈청 샘플 내의 항-PLA2R 자가항체의 양에서의 증가 또는 감소가 있는지 여부를 결정하기 위해, 샘플 웰로부터 수득된 A₄₅₀을 상응하는 기준 행에 대해 수득된 A₄₅₀과 비교한다.

SEQUENCE LISTING <110> BOSTON MEDICAL CENTER CORPORATION LE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> DIAGNOSTICS FOR MEMBRANOUS NEPHROPATHY <130> 701586-062701-PCT <140> PCT/US2009/051110 <141> 2009-07-20 <150> 61/081,786 <151> 2008-07-18 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1324 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Cys Ala Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu 20 25 30 Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu 35 40 45 Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys 50 55 60 Lys Gln Ala Asn Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly 65 70 75 80 Leu Phe Asn Ile Gly Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala 85 90 95 Pro Glu Gln Pro Leu Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser 100 105 110 Leu Arg Trp Arg Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr 115 120 125 Ser Val Gln Val Ala His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr 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cgtgaatgga tatgcaaaat cccaagagat gtgaaaccca agattccgtt ctggtaccag 2640 tacgatgtac cctggctctt ttatcaggat gcagaatacc tttttcatac ctttgcctca 2700 gaatggttga actttgagtt tgtctgtagc tggctgcaca gtgatcttct cacaattcat 2760 tctgcacatg agcaagaatt catccacagc aaaataaaag cgctatcaaa gtatggtgca 2820 agttggtgga ttggacttca agaagaaaga gccaatgatg aatttcgctg gagagatgga 2880 acaccagtga tataccagaa ctgggacaca ggaagagaaa gaactgtgaa taatcagagc 2940 cagagatgtg gctttatttc ttctataaca ggactctggg gtagtgaaga gtgttcagtt 3000 tctatgccta gtatctgtaa gcgaaaaaag gtttggctca tagagaaaaa gaaagataca 3060 ccaaaacaac atggaacgtg tcccaaagga tggctatatt ttaactataa gtgccttctg 3120 ctgaatatcc ccaaagaccc aagcagttgg aagaactgga cgcatgctca acatttctgt 3180 gctgaagaag gggggaccct ggtcgccatt gaaagtgagg tggagcaagc tttcattact 3240 atgaatcttt ttggccagac caccagtgtg tggataggtt tacaaaatga tgattatgaa 3300 acatggctaa atggaaagcc tgtggtatat tctaactggt ctccatttga tataataaat 3360 attccaagtc acaataccac tgaagttcag aaacacattc ctctctgtgc cttactctca 3420 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ttccagtata accatcagtg gcatcatgaa 780 tgtacccgtg aaggtcggga agatgactta ctgtggtgtg ccacgacaag ccgttatgaa 840 agagatgaaa agtggggatt ttgccctgat cccacctctg cagaagtagg ttgtgatact 900 atttgggaga aggacctcaa ttcacacatt tgctaccagt tcaacctgct ttcatctctc 960 tcttggagtg aggcacattc ttcatgccag atgcaaggag gtacgctgtt aagtattaca 1020 gatgaaactg aagaaaattt cataagggag cacatgagca gtaaaacagt ggaggtgtgg 1080 atgggcctca atcagctgga tgaacacgct ggctggcagt ggtctgatgg aacgccgctc 1140 aactatctga attggagccc agaggtaaat tttgagccat ttgttgaaga tcactgtgga 1200 acatttagtt catttatgcc aagtgcctgg aggagtcggg attgtgagtc caccttgcca 1260 tatatatgta aaaaatatct aaaccacatt gatcatgaaa tagttgaaaa agatgcgtgg 1320 aaatattatg ctacccactg tgagcctggc tggaatccct acaatcgtaa ttgctacaaa 1380 cttcagaaag aagaaaagac ctggcatgag gctctgcgtt cttgtcaggc tgataacagt 1440 gcattaatag acataacctc attagcagag gtggagtttc ttgtaaccct ccttggagat 1500 gaaaatgcat cagaaacatg gattggtttg agcagcaata aaattccagt ttcctttgaa 1560 tggtctaatg actcttcagt catctttact aattggcaca cacttgagcc ccacattttt 1620 ccaaatagaa gccagctgtg tgtctcagca gagcagtctg agggacactg gaaagtcaaa 1680 aattgtgaag aaagactttt ttacatttgt aaaaaagcag gccatgtcct ctctgatgct 1740 gaatcaggat gtcaagaggg atgggagaga catggtggat tctgttacaa aattgacaca 1800 gtccttcgaa gctttgacca agcttccagc ggttattact gtcctcctgc acttgtaacc 1860 attacaaaca ggtttgaaca ggcttttatt accagtttga tcagtagtgt ggtaaaaatg 1920 aaggacagtt atttttggat agctcttcag gaccaaaatg atacgggaga atacacttgg 1980 aagccagtag ggcagaaacc cgagccggtg cagtacacac actggaacac acaccagccg 2040 cgctacagtg gtggctgtgt tgccatgcga ggaaggcatc cacttggtcg ctgggaagtg 2100 aagcactgtc ggcactttaa ggcaatgtcc ttgtgcaagc agccagttga aaatcaggaa 2160 aaagcagagt atgaagagag atggcccttt cacccctgct atttggactg ggagtcagag 2220 cctggtctgg ccagttgctt caaggtattt catagtgaaa aagttctgat gaaaagaaca 2280 tggagagaag ctgaagcatt ttgcgaagaa tttggagctc atcttgcaag ctttgcccat 2340 attgaggaag agaattttgt gaatgagctc ttacattcaa aatttaattg gacagaagaa 2400 aggcagttct ggattggatt taataaaaga aacccactga 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tacaaaatga tgattatgaa 3300 acatggctaa atggaaagcc tgtggtatat tctaactggt ctccatttga tataataaat 3360 attccaagtc acaataccac tgaagttcag aaacacattc ctctctgtgc cttactctca 3420 agtaatccta attttcattt cactggaaaa tggtattttg aagactgtgg aaaggaaggc 3480 tatgggtttg tttgtgaaaa aatgcaagat acttctggac acggtgtaaa tacatctgat 3540 atgtatccaa tgcccaatac cttagaatat ggaaacagaa cttacaaaat aattaatgca 3600 aatatgactt ggtatgcagc aataaaaacc tgcctgatgc acaaagcaca actggtcagc 3660 atcacagacc agtatcacca gtccttcctc actgttgtcc tcaaccggct aggatatgcc 3720 cactggattg gactgttcac cacagataat ggtcttaatt ttgactggtc tgatggcacc 3780 aaatcttctt tcactttttg gaaagatgag gagtcctccc tccttggtga ctgcgttttt 3840 gccgacagca acggacgctg gcatagcaca gcctgcgagt catttctgca aggtgccatt 3900 tgtcatgtgc cacctgaaac aagacaatct gaacacccag agttgtgctc agaaacatct 3960 attccctgga taaaatttaa aagtaattgc tacagttttt ctacagtcct agacagtatg 4020 agttttgagg ctgctcatga attttgcaaa aaggaaggtt ctaatctttt aacaatcaag 4080 gatgaggctg aaaatgcatt tctcctagaa gagctgtttg cttttggttc ttctgtccag 4140 atggtttggt tgaatgctca atttgatggt aacaatgaaa ccataaagtg gtttgatgga 4200 actcccacag accagtcaaa ctggggcatt cggaagccag acacagacta cttcaagccc 4260 catcattgtg ttgccttgag gatccctgaa ggattatggc agctatcccc gtgtcaagaa 4320 aaaaaaggct ttatatgtaa aatggaggca gatattcaca ctgcagaggc gctgccagaa 4380 aaaggaccaa gtcacagcat cattcctctt gcggttgtac tgacactgat agtcattgtg 4440 gccatttgca cactttcctt ctgcatatac aagcataacg gtggcttctt caggagactt 4500 gcagggtttc ggaatcctta ctatcctgca accaacttta gtacagtata tttagaagaa 4560 aatattctca tttctgatct tgagaagagt gaccaataat aatgaggtca gagaatgcca 4620 cagacaccag ggtaagtaaa gaagactaaa caggagtctc atctgtcttt ccctttacag 4680 cacagatgcc attagaatgt gaattgggtc actattttaa ttattcttga agtgattact 4740 ggttttgaat cttaaccaaa tcagatgggt tttgatttat tcatttccct aaactgtgat 4800 ccattcttaa aaggggtaaa ttatgcattg gttatttttc agaaagacaa gaactattaa 4860 aagaaactcc ctattg 4876 <210> 5 <211> 1395 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Leu Ser Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Arg Gly Cys Ala Glu Gly Val Ala Ala Ala Leu Thr Pro Glu Arg Leu 20 25 30 Leu Glu Trp Gln Asp Lys Gly Ile Phe Val Ile Gln Ser Glu Ser Leu 35 40 45 Lys Lys Cys Ile Gln Ala Gly Lys Ser Val Leu Thr Leu Glu Asn Cys 50 55 60 Lys Gln Ala Asn Lys His Met Leu Trp Lys Trp Val Ser Asn His Gly 65 70 75 80 Leu Phe Asn Ile Gly Gly Ser Gly Cys Leu Gly Leu Asn Phe Ser Ala 85 90 95 Pro Glu Gln Pro Leu Ser Leu Tyr Glu Cys Asp Ser Thr Leu Val Ser 100 105 110 Leu Arg Trp Arg Cys Asn Arg Lys Met Ile Thr Gly Pro Leu Gln Tyr 115 120 125 Ser Val Gln Val Ala His Asp Asn Thr Val Val Ala Ser Arg Lys Tyr 130 135 140 Ile His Lys Trp Ile Ser Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ile Cys Glu 145 150 155 160 Tyr Leu His Lys Asp Leu His Thr Ile Lys Gly Asn Thr His Gly Met 165 170 175 Pro Cys Met Phe Pro Phe Gln Tyr Asn His Gln Trp His His Glu Cys 180 185 190 Thr Arg Glu Gly Arg Glu Asp Asp Leu Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser 195 200 205 Arg Tyr Glu Arg Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Pro Thr Ser 210 215 220 Ala Glu Val Gly Cys Asp Thr Ile Trp Glu Lys Asp Leu Asn Ser His 225 230 235 240 Ile Cys Tyr Gln Phe Asn Leu Leu Ser Ser Leu Ser Trp Ser Glu Ala 245 250 255 His Ser Ser Cys Gln Met Gln Gly Gly Thr Leu Leu Ser Ile Thr Asp 260 265 270 Glu Thr Glu Glu Asn Phe Ile Arg Glu His Met Ser Ser Lys Thr Val 275 280 285 Glu Val Trp Met Gly Leu Asn Gln Leu Asp Glu His Ala Gly Trp Gln 290 295 300 Trp Ser Asp Gly Thr Pro Leu Asn Tyr Leu Asn Trp Ser Pro Glu Val 305 310 315 320 Asn Phe Glu Pro Phe Val Glu Asp His Cys Gly Thr Phe Ser Ser Phe 325 330 335 Met Pro Ser Ala Trp Arg Ser Arg Asp Cys Glu Ser Thr Leu Pro Tyr 340 345 350 Ile Cys Lys Lys Tyr Leu Asn His Ile Asp His Glu Ile Val Glu Lys 355 360 365 Asp Ala Trp Lys Tyr Tyr Ala Thr His Cys Glu Pro Gly Trp Asn Pro 370 375 380 Tyr Asn Arg Asn Cys Tyr Lys Leu Gln Lys Glu Glu Lys Thr Trp His 385 390 395 400 Glu Ala Leu Arg Ser Cys Gln Ala Asp Asn Ser Ala Leu Ile Asp Ile 405 410 415 Thr Ser Leu Ala Glu Val Glu Phe Leu Val Thr Leu Leu Gly Asp Glu 420 425 430 Asn Ala Ser Glu Thr Trp Ile Gly Leu Ser Ser Asn Lys Ile Pro Val 435 440 445 Ser Phe Glu Trp Ser Asn Asp Ser Ser Val Ile Phe Thr Asn Trp His 450 455 460 Thr Leu Glu Pro His Ile Phe Pro Asn Arg Ser Gln Leu Cys Val Ser 465 470 475 480 Ala Glu Gln Ser Glu Gly His Trp Lys Val Lys Asn Cys Glu Glu Arg 485 490 495 Leu Phe Tyr Ile Cys Lys Lys Ala Gly His Val Leu Ser Asp Ala Glu 500 505 510 Ser Gly Cys Gln Glu Gly Trp Glu Arg His Gly Gly Phe Cys Tyr Lys 515 520 525 Ile Asp Thr Val Leu Arg Ser Phe Asp Gln Ala Ser Ser Gly Tyr Tyr 530 535 540 Cys Pro Pro Ala Leu Val Thr Ile Thr Asn Arg Phe Glu Gln Ala Phe 545 550 555 560 Ile Thr Ser Leu Ile Ser Ser Val Val Lys Met Lys Asp Ser Tyr Phe 565 570 575 Trp Ile Ala Leu Gln Asp Gln Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Thr Trp Lys 580 585 590 Pro Val Gly Gln Lys Pro Glu Pro Val Gln Tyr Thr His Trp Asn Thr 595 600 605 His Gln Pro Arg Tyr Ser Gly Gly Cys Val Ala Met Arg Gly Arg His 610 615 620 Pro Leu Gly Arg Trp Glu Val Lys His Cys Arg His Phe Lys Ala Met 625 630 635 640 Ser Leu Cys Lys Gln Pro Val Glu Asn Gln Glu Lys Ala Glu Tyr Glu 645 650 655 Glu Arg Trp Pro Phe His Pro Cys Tyr Leu Asp Trp Glu Ser Glu Pro 660 665 670 Gly Leu Ala Ser Cys Phe Lys Val Phe His Ser Glu Lys Val Leu Met 675 680 685 Lys Arg Thr Trp Arg Glu Ala Glu Ala Phe Cys Glu Glu Phe Gly Ala 690 695 700 His Leu Ala Ser Phe Ala His Ile Glu Glu Glu Asn Phe Val Asn Glu 705 710 715 720 Leu Leu His Ser Lys Phe Asn Trp Thr Glu Glu Arg Gln Phe Trp Ile 725 730 735 Gly Phe Asn Lys Arg Asn Pro Leu Asn Ala Gly Ser Trp Glu Trp Ser 740 745 750 Asp Arg Thr Pro Val Val Ser Ser Phe Leu Asp Asn Thr Tyr Phe Gly 755 760 765 Glu Asp Ala Arg Asn Cys Ala Val Tyr Lys Ala Asn Lys Thr Leu Leu 770 775 780 Pro Leu His Cys Gly Ser Lys Arg Glu Trp Ile Cys Lys Ile Pro Arg 785 790 795 800 Asp Val Lys Pro Lys Ile Pro Phe Trp Tyr Gln Tyr Asp Val Pro Trp 805 810 815 Leu Phe Tyr Gln Asp Ala Glu Tyr Leu Phe His Thr Phe Ala Ser Glu 820 825 830 Trp Leu Asn Phe Glu Phe Val Cys Ser Trp Leu His Ser Asp Leu Leu 835 840 845 Thr Ile His Ser Ala His Glu Gln Glu Phe Ile His Ser Lys Ile Lys 850 855 860 Ala Leu Ser Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Trp Ile Gly Leu Gln Glu Glu 865 870 875 880 Arg Ala Asn Asp Glu Phe Arg Trp Arg Asp Gly Thr Pro Val Ile Tyr 885 890 895 Gln Asn Trp Asp Thr Gly Arg Glu Arg Thr Val Asn Asn Gln Ser Gln 900 905 910 Arg Cys Gly Phe Ile Ser Ser Ile Thr Gly Leu Trp Gly Ser Glu Glu 915 920 925 Cys Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Cys Lys Arg Lys Lys Val Trp Leu 930 935 940 Ile Glu Lys Lys Lys Asp Thr Pro Lys Gln His Gly Thr Cys Pro Lys 945 950 955 960 Gly Trp Leu Tyr Phe Asn Tyr Lys Cys Leu Leu Leu Asn Ile Pro Lys 965 970 975 Asp Pro Ser Ser Trp Lys Asn Trp Thr His Ala Gln His Phe Cys Ala 980 985 990 Glu Glu Gly Gly Thr Leu Val Ala Ile Glu Ser Glu Val Glu Gln Ala 995 1000 1005 Phe Ile Thr Met Asn Leu Phe Gly Gln Thr Thr Ser Val Trp Ile 1010 1015 1020 Gly Leu Gln Asn Asp Asp Tyr Glu Thr Trp Leu Asn Gly Lys Pro 1025 1030 1035 Val Val Tyr Ser Asn Trp Ser Pro Phe Asp Ile Ile Asn Ile Pro 1040 1045 1050 Ser His Asn Thr Thr Glu Val Gln Lys His Ile Pro Leu Cys Ala 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Ser Asn Pro Asn Phe His Phe Thr Gly Lys Trp Tyr 1070 1075 1080 Phe Glu Asp Cys Gly Lys Glu Gly Tyr Gly Phe Val Cys Glu Lys 1085 1090 1095 Met Gln Asp Thr Ser Gly His Gly Val Asn Thr Ser Asp Met Tyr 1100 1105 1110 Pro Met Pro Asn Thr Leu Glu Tyr Gly Asn Arg Thr Tyr Lys Ile 1115 1120 1125 Ile Asn Ala Asn Met Thr Trp Tyr Ala Ala Ile Lys Thr Cys Leu 1130 1135 1140 Met His Lys Ala Gln Leu Val Ser Ile Thr Asp Gln Tyr His Gln 1145 1150 1155 Ser Phe Leu Thr Val Val Leu Asn Arg Leu Gly Tyr Ala His Trp 1160 1165 1170 Ile Gly Leu Phe Thr Thr Asp Asn Gly Leu Asn Phe Asp Trp Ser 1175 1180 1185 Asp Gly Thr Lys Ser Ser Phe Thr Phe Trp Lys Asp Glu Glu Ser 1190 1195 1200 Ser Leu Leu Gly Asp Cys Val Phe Ala Asp Ser Asn Gly Arg Trp 1205 1210 1215 His Ser Thr Ala Cys Glu Ser Phe Leu Gln Gly Ala Ile Cys His 1220 1225 1230 Val Pro Pro Glu Thr Arg Gln Ser Glu His Pro Glu Leu Cys Ser 1235 1240 1245 Glu Thr Ser Ile 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Sequence: Synthetic 6xHis tag" <400> 7 His His His His His His 1 5

Claims (83)

1. a. 상이한 시점에서 환자로부터 수득된 2개 이상의 생물학적 샘플에서 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)에 대해 반응성인 항체의 수준을 측정하며, 이때 상이한 시점은 제1 시점 및 제2 시점이며, 제2 시점은 제1 시점 이후이며, 환자는 막성 신장병증 (MN)에 대해 치료받고 있는 것인 단계; 및
   b. 2개 이상의 생물학적 샘플에서의 항체의 수준을 비교하며, 이때 제1 시점과 비교하여 제2 시점에서의 항체 수준의 감소는 치료가 효과적임을 지시하며, 제1 시점과 비교하여 제2 시점에서의 항체 수준의 증가는 치료가 효과적이지 않음을 지시하는 것인 단계
   를 포함하는 분석법.
2. a. 막성 신장병증 (MN)의 증상이 존재하는 환자로부터 수득된 생물학적 샘플에서 포스포리파제 A2 수용체 (PLA2R)에 대해 반응성인 항체의 수준을 측정하는 단계; 및
   b. 생물학적 샘플에서의 항체의 수준을 대조군 데이터와 비교하는 단계
   를 포함하는 분석법.
3. 제1항에 있어서, 제2 시점이 치료를 시작한지 적어도 2개월 후인 분석법.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, MN이 특발성인 분석법.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플인 분석법.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서,
   a. 환자로부터의 샘플을 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편과 접촉시키는 단계;
   b. 샘플 내에 존재하는 항체와 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단편 사이의 항체-단백질 복합체를 형성시키는 단계;
   c. 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계;
   d. 표지되고 샘플로부터의 항체에 대해 반응성인 검출 항체를 첨가하는 단계;
   e. 임의의 결합되지 않은 표지된 검출 항체를 제거하기 위해 세정하는 단계; 및
   f. 표지를 검출가능한 신호로 전환시키며, 이때 검출가능한 신호의 존재는 환자에서의 MN의 가능성을 지시하는 것인 단계
   를 포함하는 단계에 의해 PLA2R 항체의 수준을 측정하는 분석법.
7. 제6항에 있어서, PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편이 고체 지지체 상에 침착 또는 고정되는 것인 분석법.
8. 제7항에 있어서, 지지체가 딥스틱(dipstick), 테스트 스트립(strip), 라텍스 비드(bead), 미세구체 또는 다중-웰 플레이트의 양식인 분석법.
9. 제8항에 있어서, 효소, 형광 화합물 또는 금속이 있는 표지, 또는 화학발광 화합물이 있는 표지에 공유결합으로 연결시킴으로써 검출 항체가 표지되는 것인 분석법.
10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 샘플과 PLA2R 또는 이의 PLA2R 단백질 단편과의 반응에 의해 형성된 항체-단백질 복합체의 형성으로부터 초래되는 광 산란 강도를 측정하여 PLA2R 항체의 수준을 수득하며, 이때 대조군 광 산란 강도보다 10％ 이상 높은 광 산란 강도는 환자에서의 MN 또는 MN 재발의 가능성을 지시하며, 대조군 광 산란 강도는 샘플의 부재 하의 PLA2R 또는 PLA2R 단백질 단편의 광 산란 강도인 분석법.
11. a. 적어도 PLA2R 단백질 또는 이의 단편; 및
    b. PLA2R 단백질 또는 이의 단편이 침착되는 하나 이상의 고체 지지체
    를 포함하는, 환자로부터의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 확인하기 위한 기구.
12. 제11항에 있어서, 환자의 샘플 내의 PLA2R에 대해 반응성인 항체에 대해 특이적이고, 검출가능한 신호를 생산하는 검출 항체를 추가로 포함하는 기구.
13. 제11항에 있어서, 항체-단백질 복합체가 형성되는 분석을 수행하는 기구.
14. 제13항에 있어서, 분석이 혈청학적 면역검정인 기구.
15. 제13항에 있어서, 분석이 혼탁 면역검정인 기구.
16. a. 환자로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대해 반응성인 항체의 존재 또는 수준을 지시하는 면역검정으로부터의 검출가능한 신호를 포함하는 자가항체 정보를 측정하는 측정 모듈;
    b. 측정 모듈로부터 출력된 데이터를 저장하도록 설정된 저장 모듈;
    c. 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 기준 및/또는 대조군 데이터와 비교하고, 검색된 콘텐츠(content)를 제공하도록 개조된 비교 모듈; 및
    d. 검색된 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 검색된 콘텐츠에서, PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 항체의 존재는 환자가 MN에 걸렸거나 MN이 재발하였음을 지시하는 것인 출력 모듈
    을 포함하는 시스템.
17. 제16항에 있어서, 대조군 데이터가 건강한 비-MN 개체들의 집단으로부터의 데이터를 포함하는 것인 시스템.
18. a. 환자로부터 수득된 샘플로부터의 PLA2R에 대한 자가항체 정보를 수신 및 출력하도록 설정되며, 이때 자가항체 정보가 PLA2R에 대해 반응성인 자가항체의 수준을 측정하는 것인 결정 모듈;
    b. 결정 모듈로부터의 출력 정보를 저장하도록 설정된 저장 모듈;
    c. 저장 모듈 상에 저장된 데이터를 대조군 데이터와 비교하고, 비교 콘텐츠를 제공하도록 개조되며, 이때 대조군 데이터는 동일한 환자로부터의 검출가능한 양의 자가항체를 지시하는 이전 데이터를 포함하는 것인 비교 모듈; 및
    d. 비교 콘텐츠를 사용자에게 디스플레이하기 위한 것이며, 이때 PLA2R에 대해 반응성인 검출가능한 양의 자가항체가 없으면 환자가 완화 상태이거나 또는 선행 기록에 비해 10％ 이상의 감소가 있으면 MN에 대한 치료가 환자에서 효과적인 것인 출력 모듈
    을 포함하는, 환자에서의 MN의 예후 평가를 용이하게 하는 시스템.
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