KR20020082421A - βｉｇｈ３ 단백질의 정량방법 및 이를 이용한 진단킷트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 βig-h3 단백질의 정량방법 및 이를 이용한 진단킷트에 관한 것으로서, 구체적으로 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질 및 그의 항체를 항원-항체 반응 방법에 사용하여 피검시료 체액 중에 포함된 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 방법 및 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질 및 그의 항체를 포함하는 신장 질환, 간 질환 및 류마티스 질환 등의 진단킷트에 관한 것이다. 본 발명의 βig-h3 정량방법 및 진단킷트는 신장 질환, 간 질환 및 류마티스 질환을 비롯한 각종 질환의 손상정도 및 진행정도를 조기에 예민하게 반영하는 효과적인 검사 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 βig-h3 단백질의 정량방법 및 이를 이용한 진단킷트에 관한 것으로서, 구체적으로 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질 및 그의 항체를 항원-항체 반응에 사용하여 피검시료 체액 중에 포함된 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 방법 및 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질 및 그의 항체를 포함하는 신장 질환, 간 질환 및 류마티스 질환 등의 진단킷트에 관한 것이다.
βig-h3은 인간의 흑색소 세포종 세포(human melanoma cells), 포유동물의 상피세포(mammary ephithelial cells), 각질형성세포(keratinocytes) 및 허파 섬유아세포(lung fibroblasts) 등을 포함하는 여러 종류의 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)이다. 상기 TGF-β(transforming growth factor-β)는 여러 종류의 세포들의 성장과 분화에 관여하는 물질로 포유류에서는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 세 가지 종류가 존재하고, 성장조절, 면역반응의 조절, 골생성의 자극, 연골특이적 분자(cartilage specific macromolecule)의 유도, 창상치유 촉진 등의 여러 가지 복잡한 기능을 한다고 알려져 있다(Bennett, N.T. et al.,Am. J. Surg.1993, 165, 728). 이러한 TGF-β는 창상치유시기의 상피세포에서 발현되는데, 이는 재상피화 동안 각질형성세포(keratinocyte)내의 인테그린(integrin) 분자의 발현을 자극하기 위한 것으로 보여진다. TGF-β발현에 관한 최근 연구에서 TGF-β mRNA가 정상 피부의 상피나 급성 및 만성 창상에서 재생되는 상피층에서 발현되고, TGF-β1 mRNA는 정상 피부와 만성 창상에서는 발현되지 않으나 급성 창상에서 재생되는 상피층에서 발현되며, TGF-β2 mRNA는 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다(Schmid, P. et al.,J. Pathol.,1993, 171, 191). 아직까지 상기 기작에 대한 정설이 확립된 것은 아니지만 TGF-β가 재상피화에 큰 역할을 할 것으로 예측된다.
상기한 TGF-β의 관련 유전자로 알려진 βig-h3는 스토니어 등에 의해 처음 동정된 유전자로, TGF-β1을 처리한 인간의 허파 선암종(lung adenocarcinoma) 세포주인 A549 세포주에서 cDNA 라이브러리 스크리닝(differential screening) 자료의 선별 중 동정되었으며, TGF-β1으로 처리한 후 2 일만에 20 배 이상의 증가를 보이는 것으로 보고되었다(Stonier, J, et al.,DNA cell Biol.,1992, 11, 511). DNA 서열분석에 의하여 βig-h3 단백질은 아미노 말단 분비 서열(amino-terminal secretory sequence)과 몇 가지 인테그린에 대한 리간드 식별(ligand recognition)이 가능한 카르복시 말단(carboxy-terminal) Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 가진서열번호 1로 기재되는 683개의 아미노산으로 구성되어 있음이 밝혀졌다.
βig-h3는 RGD 모티프와 함께 상동성을 지닌 4개의 내부 반복도메인(internal repeated domain)을 포함하는데, 이들은 포유류, 곤충, 성게(sea urchin), 식물, 효모 및 세균을 포함하는 여러 종의 분비 단백질 또는 막 단백질에서 매우 보존적인 서열로서 발견된다. 상기 보존적 서열을 포함하는 단백질들에는 페리오스틴(periostin), 파스시클린 Ⅰ(fasciclin Ⅰ), 성게 HLC-2, 알갈-CAM(algal-CAM) 및 마이코박테리움 MPB70(mycobacterium MPB70) 등이 포함된다. (Kawamoto, T. et al.,Biochem. Biophys. Acta.,1998, 1395, 288). 이러한 단백질들에서 보존적으로 발견되는 상동성 도메인(이하 "파스-1(fas-1)도메인"이라 약칭함)은 110 내지 140개의 아미노산으로 구성되며 약 10개의 아미노산으로 구성된 매우 보존적인 두 개의 가지(H1 및 H2)를 포함하고 있다. 상기 단백질들 중 βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 4개의 파스-1 도메인을 가지며, HLC-2는 2개, MPB70은 오직 한 개의 파스-1 도메인을 가지고 있다. 상기 단백질들의 생물학적 기능이 정확하게 밝혀진 것은 아니지만, 이들 중 몇몇이 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)로서 세포 부착(attachment)과 탈착(detachment)을 매개하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, βig-h3, 페리오스틴 및 파스시클린 Ⅰ은 각각 섬유아세포, 골아세포 및 신경세포의 부착을 매개하는 것으로 보고되었으며, 알갈-CAM은 조류 볼복스(Vovolx)의 배(embryos)에 존재하는 세포 부착 분자임이 밝혀졌다(LeBaron, R. G., et al.,J. Invest. Dermatol., 104, 844, 1995; Horiuchi, K. et al.,J. Bone Miner. Res.,1999, 14, 1239; Huber, O. et al.,EMBO J.,1994, 13, 4212).
정제된 βig-h3 단백질은 피부 섬유아세포의 부착과 확산을 촉진시키는 한편 무혈청배지에서 A549, HeLa 및 WI-38 세포의 부착을 저해한다. 특히, βig-h3은 종양세포의 성장, 콜로니 형성 및 출현을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 실예로 차이니즈 햄스터의 난소 세포(Chinase hamster ovary cells)에 βig-h3 발현벡터를 전이(transfection)시킨 누드 마우스에서 상기 세포들의 종양 형성능이 현저하게 감소된다는 것이 미국특허 제5,599,788호 및 제5,714,588호에 개시되어 있다. 또한, 빠르고 효과적인 상처 치유를 위하여 유효한 양의 βig-h3을 상처와 접촉시킴으로써 세포, 특히 섬유아세포가 상처부위에 퍼지고 점착하는 것을 촉진시킬 수 있는 방법이 상기 특허들에 개시되어 있다. 따라서, βig-h3는 여러 세포에서 TGF-β에 의해 고도로 유도되는 세포 부착 분자로서 세포 성장(cell growth), 세포 분화(cell differention), 창상 치유(wound healing), 형태 형성(morphogenesis) 및 세포 부착(cell adhesion)에 있어 매우 중요한 역할을 담당한다.
상기와 같이 βig-h3는 의학적으로 여러 가지 유용성이 기대되는 물질이면서도 생체내에서 극소량밖에 채취할 수 없어 안정적인 공급이 곤란한 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 유전자 재조합에 의하여 진핵생물 세포계에서 발현시켜 제조하는 방법이 개발되었으나, 진핵생물 세포계에서 발현시키는 경우 βig-h3를 만들어내는 세포는 만들지 않는 세포보다 세포의 성장이 훨씬 느리므로 충분한 양의 세포수를 확보하기 어렵다. 따라서 본 발명자들은 대장균을 숙주로 하여 βig-h3 단백질의 전체 및 그 일부 도메인을 포함하는 재조합 단백질을 대량발현시키는 정제 방법을 확립하고, 재조합 단백질이 세포 부착 및 확산을 지지하는 것을 확인하여 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2000-25664호).
한편, 세포 부착 분자로서 βig-h3의 세포 부착 활성은 인간의 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)에서 최초로 보고된 후 연골아세포(chondrocytes), 복막 섬유아세포(peritoneal fibroblasts) 및 인간의 MRC5 섬유아세포 등에서도 보고되었다. 이러한 βig-h3의 세포 부착 활성은 초기에는 βig-h3의 카르복실-말단에 존재하는 RGD 모티프에 의해 매개되는 것으로 여겨졌으나, RGD 모티프가 연골아세포의 분산을 촉진하는데 필요하지 않으며 카르복실-말단 프로쎄싱(carboxyl-terminus processing)에 의해 RGD 모티프가 결실된 성숙한 형태의 βig-h3이 세포 부착을 억제할 수 있음이 보고되면서 RGD 모티프가 βig-h3의 세포 부착 활성을 매개하는데 필수불가결한 요소가 아님이 확인되었다. 또한, 최근의 연구 결과에서 βig-h3는 인테그린 α1β1을 통해 섬유아세포의 분산을 증가시키는 반면 βig-h3의 RGD 모티프는 βig-h3-매개성 세포 분산에 요구되지 않으며, βig-h3가 독자적으로 인테그린 α1β1과 작용하여 세포의 유착과 확장을 촉진시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다(Ohno, S., et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1451, 196). 또한, βig-h3 내 보존적 H1 및 H2 펩타이드 역시 βig-h3-매개성 세포 부착에 효과적인 영향을 미치지 못하는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 βig-h3의 세포 부착 활성을 위한 필수적인 아미노산이 H1 및 H2 지역이 아닌 다른 곳에 존재함을 의미하며, βig-h3의 반복 파스-1 도메인 뿐만 아니라 다른 단백질들의 파스-1 도메인들과의상동성을 비교한 컴퓨터 분석 결과 역시 H1 및 H2 이외에도 여러 개의 매우 보존적인 아미노산이 존재하여 이들이 세포 부착 활성에 관여할 수 있음을 제시하였다.
따라서, 본 발명자들은 세포 부착 및 탈착 활성에 관여하는 보존적 모티프를 밝히고 이를 포함하는 펩타이드를 제조하고자 연구한 결과, 세포 부착 분자로서 알려진 βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인을 이용하여 기능적 세포 수용체로서 α3β1 인테그린과 결합하여 세포 부착 및 탈착 활성을 매개하는 펩타이드 NKDIL 및 EPDIM 및 그의 유도체를 제조하고, βig-h3의 제 2 및 제 4 도메인 내 H2 지역 근처에 위치하는 두 개의 매우 보존적 아미노산인 아스파르트산(aspartic acid, Asp) 및 이소루이신(isoleucine, Ile)이 세포 부착 및 탈착 활성을 위한 필수적인 아미노산으로 작용함을 밝혀 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2000-25665호).
한편, 지금까지 βig-h3는 인간에 있어서의 몇몇 종양과의 관련성 외에는 βig-h3가 직접적으로 다른 질환과 관련이 있다는 보고는 없는 실정이고, 특히 βig-h3 단백질의 발현과 신장질환, 간질환 및 류마티스의 발병과의 직접적인 관계에 대해서는 전혀 알려져 있지 않으며 체액에서 βig-h3 단백질의 양을 측정하여 질환과 연결할 수 있을 가능성에 대해 전혀 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 βig-h3 또는 βig-h3의 4번째 파스-1 도메인을 여러 개 연결하여 재조합한 단백질을 βig-h3 측정시의 표준단백질로 사용하는 βig-h3의 정량방법 및 이를 이용하여 βig-h3를 정량하는 진단킷트를 개발하고 상기 방법을 이용하여 신장질환, 간질환 및 류마티스를 비롯한 여러 질환을 조기에 예민하게 진단하고 치료에 대한 반응정도 예후 판정을 할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질을 사용한 βig-h3 단백질의 정량방법 및 상기 정량방법을 이용한 진단킷트를 제공하는 것이다.
도 1은 βig-h3 재조합 단백질의 구조를 나타내는 모식도이고,
I, II, III 및 IV : 각 도메인(domain),
▨ 및 ▩ : 염기 서열이 보존된 영역
A ; βig-h3, B ; 인간 βig-h3, C ; 마우스 βig-h3
도 2는 βig-h3의 IV 도메인(domain)의 반복에 의해 재조합된 βig-h3 D-IV 단백질들의 기하학적 구조를 나타내는 개략도이고,
A ; βig-h3, B ; βig-h3 D-IV(1x), C ; βig-h3 D-IV(2x),
D ; βig-h3 D-IV(3x), E ; βig-h3 D-IV(4x)
도 3은 분리된 βig-h3 재조합 단백질의 전기영동(electrophoresis) 사진이고,
1 ; 인간 βig-h3, 2 ; 마우스 βig-h3
도 4는 βig-h3 D-IV(1x, 2x, 3x, 4x) 단백질들을 전기영동법으로 확인한 사진이고,
1 ; βig-h3 D-IV(1x), 2 ; βig-h3 D-IV(2x),
3 ; βig-h3 D-IV(3x), 4 ; βig-h3 D-IV(4x)
도 5는 일차 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(western blot)으로 인간 βig-h3와 마우스 βig-h3를 확인한 결과를 보여주는 전기영동 사진이고,
1 ; 인간 βig-h3, 2 ; 마우스 βig-h3
도 6은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)의 원리를 보여주는 개략도이고,
도 7은 일차항체의 정량적 비율을 나타낸 그래프이고,
◆ ; 1 : 200, ■ ; 1 : 400, ▲ ; 1 : 800,
× ; 1 : 1600, ※ ; 1 : 2000, ● ; 1 : 3200
도 8은 이차항체의 정량적 비율을 나타낸 그래프이고,
A ; 1:1600으로 일차항체 고정,
B ; 1:2000으로 일차항체 고정,
◆ ; 1:1000으로 이차항체 희석,
■ ; 1:2000으로 이차항체 희석,
● ; 1:3000으로 이차항체 희석
도 9는 인간 βig-h3 단백질의 코팅 농도를 나타낸 그래프이고,
◆ ; 0.5 ㎍/㎖, ■ ; 1.0 ㎍/㎖
도 10은 교차실험을 통하여 인간 βig-h3 단백질과 마우스 βig-h3 단백질을 표준단백질로 사용할 수 있음을 보여주는 그래프이고,
◆ ; 인간 βig-h3 단백질 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 인간 βig-h3 항체1:2000, 이차항체 1:2000,
■ ; 인간 βig-h3 단백질 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 마우스 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000,
▲ ; 마우스 βig-h3 단백질 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 인간 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000,
× ; 마우스 βig-h3 단백질 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 마우스 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000
도 11은 교차실험을 통하여 재조합 βig-h3 D-IV(1x) 단백질과 재조합 βig-h3 D-IV(4x) 단백질을 표준단백질로 사용할 수 있음을 보여주는 그래프이고,
A의 ◆ ; βig-h3 D-IV(1x) 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 인간 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000,
A의 ■ ; βig-h3 D-IV(4x) 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 인간 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000,
B의 ◆ ; βig-h3 D-IV(1x) 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 마우스 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000,
B의 ■ ; βig-h3 D-IV(4x) 코팅 농도 0.5 ㎍/㎖, 일차 항 마우스 βig-h3 항체 1:2000, 이차항체 1:2000
도 12는 신장조직 내에서 βig-h3의 발현 양상을 보여주는 면역조직화학적 염색 사진이고,
A의 ▶ ; S3 근위 세관 세포(proximal tubular cell)의 기저막에서의 발현양상,
B의 ▶ ; 사구체의 보우만낭(Bowman's capsule)의 기저막에서의 발현 양상
B의 → ; 피질 후 상지 세포(cortical thick ascending limb cell)의 기저막에서의 발현양상
도 13은 당뇨병 유발 래트의 소변에서 βig-h3를 측정한 결과를 보여주는 그래프이고,
■ ; 대조군,
□ ; 스트렙토조토신(streptozotocin)을 투여하여 당뇨병을 유발한 래트
도 14는도 13의 당뇨병 유발 래트의 소변에서 βig-h3를 측정한 결과를 각 개체별로 나타낸 그래프이고,
도 15는 신장 이식 후 정상인 경우(normal), 이식 받은 신장의 크기가 작은 경우(Nephron underdose), 만성거부(chronic rejection), 신우염의 재발(Recurrent GN) 및 사이클로스포린 독성(CyA toxicity)이 나타난 경우를 분류하여 소변의 βig-h3 단백질의 농도를 측정한 그래프이고,
도 16은 신장이식 수술후 국소성분절성사구체경화증(focal segmental glomerulosclerosis (FSGS))이 재발하여 혈장교환술(plasmapheresis)치료를 받는 환자의 날짜에 따른 βig-h3 단백질의 농도를 측정한 그래프이고,
도 17은 살아있는 사람의 신장(Living donor)이나 사망한 사람의 신장(Cadaver donor), 이식한 신장의 크기가 작아서 신기능이 충분하지 않은 경우(Underdose) 또는 거부(Rejection) 환자의 소변에서 신장이식 전후의 βig-h3단백질의 농도를 측정한 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 βig-h3 단백질을 정량하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 βig-h3 단백질의 정량방법을 이용한 신장 질환, 간질환 및 류마티스 질환의 진단킷트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 βig-h3의 정량방법은
1) βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질을 제조하는 단계(단계 1);
2) 상기 단계 1의 단백질에 대한 항체를 제조하는 단계(단계 2); 및
3) 상기 단계 1의 단백질 및 단계 2의 항체를 항원-항체 반응을 이용한 정량방법에 사용하여 피검시료 중에 포함된 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 단계(단계 3)로 구성된다.
상기 단계 1에서 βig-h3 단백질은서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 인간 βig-h3 단백질 또는서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 마우스 βig-h3 단백질이다. 인간과 마우스의 βig-h3 단백질 구성요소는도 1에 나타내었으며,도 1에서 해칭된 칸과 크로스 해칭된 칸은 반복되는 파스-1 도메인인 I, II, III, IV의 매우 보존된 서열을 나타내며 빈칸은 RGD 모티프를 나타낸다.
βig-h3 단백질은 4개의 파스-1 도메인을 갖고 있는데, 상기 단계 1의 βig-h3의 파스-1 도메인은 βig-h3 단백질의 1번째 내지 4번째 파스-1 도메인 중에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 도메인을 사용할 수 있고, 4번째 파스-1 도메인이 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 4번째 파스-1 도메인은 단독으로 또는 여러개 반복연결한 재조합 단백질로 사용될 수 있으며, 1 ~ 10개 연결한 것이 바람직하며, 1 ~ 4개 연결한 재조합 단백질을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 βig-h3의 4번째 도메인을 1개, 2개, 3개 또는 4개 연결하여 재조합한 단백질을 사용한 경우를 예시하였다.
본 발명에서는 βig-h3의 아미노산 서열 중 502부터 632까지의 제 4 파스-1 도메인을 각각 1개 내지 4개 포함하는 각각서열번호 7,서열번호 8,서열번호 9및서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 제조하였으며, 이를 각각 "βig-h3 D-IV(1x)", "βig-h3 D-IV(2x)", "βig-h3 D-IV(3x)" 및 "βig-h3 D-IV(4x)"라 명명하였다(도 4참조).
본 발명의 표준단백질을 제조함에 있어서 발현벡터와 형질전환은 통상의 방법으로 행해질 수 있다.
상기 단계 2의 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 항체는 상기 단계 1의 단백질 또는 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 일차항체를 제조하였다. 상기 일차항체의 제조는 통상적인 방법으로 행해질 수 있으며, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있다.
상기 단계 3의 피검시료 중에 포함된 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 것은 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 정량분석방법이 사용될 수 있으며, 면역블럿팅(Current Protocols in Molecular Biology, vol 2, chapter 10.8; David et al.,Cells(a Laboratory manual), vol 1, chapter 73), 면역침전법(Current Protocols in Molecular Biology, vol 2, chapter 10.16;Cells(a Laboratory manual), vol 1, chapter 72), ELISA 방법(Current Protocols in Molecular Biology, vol 2, chapter 11.2; ELISATheory and Practice, John R. Crowther; The ELISA Guidebook, John R. Crowther), RIA(Radioimmuno assay)(Nuklearmedizin 1986 Aug ;25(4):125-127, Tumor markers as target substances in the radioimmunologic detection of malignancies. von Kleist S; Mariani G.Ann Oncol1999 ;10 Suppl 4:37-40), 단백질칩(Daniel Figeyset.al, Electrophoresis2001, 22, 208-216; Albala JS.Expert Rev Mol Diagn2001 Jul;1 (2):145-152), 래피드 어세이(rapid assay)(Kasahara Y and Ashihara Y,Clinica Chimica Acta267 (1997), 87-102; 대한민국 특허출원 2000-46639) 또는 마이크로어레이(microarray)(Vivian G. cheunget al, Nature genetics1999, 21, 15-19; Robert J. Lipshutzet al,Nature genetics1999, 21, 20-24; Christine Debouck and Peter N. Goodfellow,Nature genetics1999, 21, 48-50;DNA Microarrays, M. Schena)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법을 사용하는 것이 바람직하고, ELISA 방법을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, ELISA 방법과 더불어 공지의 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하여 대량으로 시료를 분석할 수 있 수 있으며, 소변에서는 간편한 형태의 자가 진단법으로 개발될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 위에 열거된 여러 방법 중 ELISA를 이용하여 경쟁법(competition assay)으로 상기 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 것은
1) βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질을 기질에 코팅시키는 단계(단계 1);
2) 상기 단계 1의 단백질에 대한 항체를 피검시료와 반응시키는 단계(단계 2);
3) 단계 1의 코딩된 단백질에 단계 2의 반응물을 첨가하여 반응시킨 후 세척하는 단계(단계 3); 및
4) 단계 3의 반응물에 2차 항체를 첨가하여 반응시키고 흡광도를 측정하는 단계(단계 4)를 포함한다.
상기 단계 1의 기질은 통상적으로 사용되는 모든 기질을 사용할 수 있고, 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 플레이트(예; 96 웰 플레이트), 폴리스티렌 (Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 단계 4의 2차 항체에는 효소, 형광물질, 발광물질, 방사선 물질 또는 금속킬레이트를 표지하여 사용한다. 표지 물질은 통상적으로 사용되는 모든 것을 사용할 수 있고, 발색효소는 과산화효소(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(Alkaline Phosphatase), β-D-갈락토시다제, 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 누클리아제, 서양고추냉이 과산화효소, 카탈라제, 아세틸콜린 에스터라제 등을 사용하는 것이 바람직하며, 형광물질은 이소티오시아네이트(fluorescein isothiochanate), 피코빌린(phycobilin) 단백질, 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 피키시아닌(phycocyanin), 오르토프탈릭 알데히드(orthophthalic aldehyde)등을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 발색효소 또는 형광물질 외에 2차 항체를 표지할 물질로는 이소루미놀(isolumino), 루시게닌(lucigenin), 루미놀(luminol), 방향족 아크리딘에스테르(acridiniumester), 이미다졸, 아크리딘 염, 루시페린(luciferin), 루시퍼라제(luciferase), 아쿠오린(aequorin) 등의 발광물질 또는125I,127I,131I,14C,3H,32P,35S 등의 방사선 물질 뿐만 아니라 면역학적 측정법에 사용될 수 있으면 특히 한정하지 않는다. 또한 항체에 바이오틴, 디니트로페닐, 피리독실 또는 플루오레자민과 같은 저분자 헵텐을 사용할 수 있다.
또한, 단계 4에서 발색효소를 사용할 경우 이의 활성을 측정하기 위하여, 발색기질을 사용하며, 발색기질은 2차 항체에 결합된 발색효소에 대하여 발색할 수 있는 모든 물질을 사용할 수 있고, 4CN(4-chloro-1-naphtol), DAB(Diaminobenzidine), AEC(Aminoethyl carbazole), ABTS[2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-Phenylenediamine) 및 TMB(Tetramethyl Benzidine)등을 사용할 수 있다.
상기 단계 2의 피검시료는 βig-h3와 관련된 질환을 앓는 환자이고, 모든 종류의 체액이 피검재료가 될 수 있고, 신장 질환, 간 질환 또는 류마티스 환자의 소변, 혈액 또는 활막액인 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 βig-h3 단백질의 정량방법이 정확하게 βig-h3 단백질을 정량하는지 확인하기 위하여, 마우스 βig-h3 또는 βig-h3의 4번째 파스-1 도메인을 하나 이상 포함하는 재조합 단백질을 표준단백질로 사용하여 측정하였고, 이를 인간 βig-h3를 표준단백질로 사용한 경우와 비교하였다.
본 발명의 βig-h3의 정량방법에 있어서 인간 βig-h3 단백질의 최적 코팅농도 및 항체의 정량적 비율을 결정한 결과, 일차 항 인간 βig-h3 항체의 정량적 비율은 1:1600과 1:2000일 때 그래프가 직선을 이루게 되므로 상기 비율이 가장 적당함을 확인하였고(도 7참조), 이차항체의 정량적 비율은 1:2000의 비율일 때 그래프가 직선을 이루게 되므로 상기 비율이 가장 적당한 비율임을 확인하였으며(도 8참조), 인간 βig-h3 단백질은 1.0 ㎍/㎖과 0.5 ㎍/㎖ 두 가지 경우 모두 그래프가 직선을 나타내어 정량적 범위로 적당하였지만 1.0 ㎍/㎖보다 0.5 ㎍/㎖이 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2)값이 1에 가까운 형태로 나타나서 코팅 농도는 0.5 ㎍/㎖일 때 가장 적당함을 확인하였다(도 9참조).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 인간 βig-h3 표준단백질의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖로 하고 일차 항 인간 βig-h3 항체 및 이차항체의 희석 비율은 각각 1:2000으로 하는 것이 최적의 조건임을 확인하였다.
본 발명자들은 인간 βig-h3의 경우와 동일한 방법으로 마우스 βig-h3, 재조합 βig-h3 D-IV(1x), ig-h3 D-IV(2x), ig-h3 D-IV(3x) 및 βig-h3 D-IV(4x)를 사용하여 단백질의 농도, 일차항체 및 이차항체의 정량적 비율을 결정하였다. 구체적으로, 각 단백질의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖로 하고, 일차 항 인간 βig-h3 항체 및 이차항체는 1:2000으로 하여 정량적 실험을 하였으며, 또한 일차 항 마우스 βig-h3 항체 및 이차항체는 1:2000으로 하여 정량적 실험을 하였다.
그 결과, 모든 경우에 있어서 그래프가 직선을 형성하였고, 측정범위 역시11 ng/㎖에서 900 ng/㎖로 서로 비슷함을 확인하였다(도 11및도 12참조).
상기의 결과로부터, 표준단백질은 인간 βig-h3, 마우스 βig-h3, 재조합 βig-h3 D-IV(1x), ig-h3 D-IV(2x), ig-h3 D-IV(3x) 및 βig-h3 D-IV(4x) 중 어느 것을 사용해도 무방하며, 일차항체의 경우도 교차작용이 있으므로 항 인간 βig-h3 항체나 항 마우스 βig-h3 항체 중 어느 것을 사용해도 됨을 확인하였다.
본 발명에 있어서 표준단백질의 코팅농도는 0.1 내지 2.0 ㎍/㎖의 범위인 것이 바람직하며 0.5 내지 1.0 ㎍/㎖인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 일차항체 및 이차항체의 비율은 1:400 내지 1:3200인 것이 바람직하며, 1:2000인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 신장 질환, 간 질환 또는 류마티스 질환을 앓고 있는 검체의 체액에서 βig-h3 단백질 양의 측정을 통한 여러 질환의 진단킷트를 제공한다.
본 발명의 진단킷트에는 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질과 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 항체를 포함한다. 또한, 상기에 추가적으로 완충용액, 2차 항체, 세척액, 반응정지액 또는 발색기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 진단킷트는 신장 질환, 간 질환 및 류마티스 질환을 비롯한 모든 체액에서 βig-h3 단백질의 측정을 통하여 여러가지 질환을 진단할 수 있다.
신장 질환의 병리기전에 중요한 역할을 하는 TGF-β에 의해 βig-h3의 발현이 강력하게 유도된다는 점에 착안하여 신장 질환과 βig-h3 발현과의 상관관계를 원리로 하여 βig-h3를 정량하여 신장 질환을 진단한다. 이를 확인하기 위하여 신장 질환을 일으키는 대표적인 질환인 당뇨병 환자를 상대로 소변에서의 βig-h3를 측정하여 보면, 마이크로알부미누리아(microalbuminuria)를 포함하는 당뇨병성 신장 질환자의 소변 βig-h3의 농도는 정상인에 비해 5배 이상의 높은 수치를 보였으며 임상적으로 당뇨병성 신장 질환을 나타내지 않는 환자에서도 βig-h3의 농도가 증가하였다. 당뇨병성 신장 질환을 가진 환자의 소변 βig-h3는 대부분의 환자에서 정상보다 높은 수치를 보였으며 임상적으로 신장질환이 없는 환자의 일부분도 높은 수치를 나타내었다. 상기의 결과로 볼 때 소변 βig-h3는 신장의 손상정도를 잘 반영한다고 할 수 있으며 특히 임상적으로 신장 질환을 나타내지 않는 당뇨병 환자의 일부에서도 높은 수치를 보이는 것은 이들 환자가 임상적으로 드러나는 뚜렷한 신장기능 장애는 없지만 어느 정도 신장의 손상을 입고 있다는 것을 의미한다. 따라서, 소변의 βig-h3 측정은 신장의 손상을 조기에 반영하는 감도가 높은 진단적 의의를 가지며, 기존의 신장기능을 반영하는 어떤 검사보다도 조기에 신장의 손상을 반영할 수 있음을 확인하였다.
또한, 소변에서의 βig-h3 농도가 당뇨병 환자의 신장 손상을 조기에 반영하는지를 확인하기 위하여, 당뇨병 유발 동물 모델에서 βig-h3 농도를 측정하여 보면, 당뇨병 유발 전보다 5일이 결과한 후에 βig-h3 농도가 약 4배 정도 증가하였다(도 13참조). 당뇨병이 유발된 후 각 개체에서의 βig-h3 농도 변화를 살펴보면 모든 개체가 당뇨병 유발 후에 소변 βig-h3 농도가 현저하게 증가함을 알 수있었다(도 14참조). 당뇨병 유발 5일에는 혈중 요소(urea)와 크레아틴 수치는 정상이며 신장의 조직소견도 뚜렷한 이상을 나타내지 않는다. 따라서, 5일째 소변에서 βig-h3 수치가 현저하게 증가한다는 것은 기존의 검사법으로는 찾아낼 수 없는 신장의 미세한 손상을 조기에 반영할 수 있다는 것을 시사한다.
또한, 본 발명에서는 신장이식 수술 전과 후의 환자의 소변으로부터 βig-h3의 농도를 측정하여 신장손상과 βig-h3 농도와의 상관관계를 확인하고자 하여 보면, 신장이식 수술 전 높은 수치의 βig-h3 농도가 수술이 성공적으로 된 환자의 경우에 있어서 서서히 떨어지는 것을 보였고, 수술 후에 신장 기능이 회복되지 않은 5번 환자의 경우에는 계속 높은 수치를 유지하였다(표 2참조). 상기 결과로부터 본 발명의 βig-h3의 농도가 신장의 손상을 예민하게 반영함을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 신부전증 환자의 소변을 채취하여 βig-h3의 농도를 측정한 결과, 모든 환자에서 정상보다 현저히 높은 βig-h3 농도 수치를 보임을 확인하여 보면, 소변에서의 βig-h3 농도는 신장의 손상을 조기에 예민하게 반영하며 신장의 손상을 주는 여러 경우에서 진단적으로 대단히 중요한 의미를 가짐을 확인하였다(표 3참조).
만성간염환자가 간경화로 진행하고 있는가를 판정하는 것은 임상적으로 대단히 중요하지만 현재까지는 그러한 진단법이 없는 실정이다. 간경화의 진행에 가장 중요한 인자는 TGF-β이므로 TGF-β에 의해 발현이 유도되는 βig-h3가 간경화가 진행됨에 따라 혈중에서 그 농도가 증가할 가능성이 있으며 이는 간경화의 진행정도를 반영할 수 있다. 실제로 간염환자의 간조직의 면역조직검사에서 βig-h3가 간경화의 정도가 심할수록 많이 발현됨을 확인하였다. 이에, 본 발명에서는 만성간염환자를 조직검사 결과를 기준으로 등급(grade)과 단계(stage)로 나누어 혈중 βig-h3 농도와의 상관관계를 확인하여 보면, 만성간염환자는 정상보다 혈중 βig-h3 농도가 높음을 확인하였으며, 낮은 등급과 단계에서의 βig-h3 농도가 높은 등급과 단계에서의 βig-h3 농도보다 높은 것을 확인하였다(표 5참조). 등급 3과 단계 3은 간경화로 상당히 진행된 상태로서 이미 간경화의 활동성이 정점을 지난 상태라고 할 수 있으며, 반면에 단계 1과 2 및 등급 1과 2는 현재 염증반응이 활발히 진행하고 있는 활동성 상태라고 할 수 있다. 따라서, 혈중 βig-h3의 농도는 간경화의 활동성 상태를 반영하며, 동일한 환자에서 정기적으로 혈중 βig-h3 농도를 측정함으로써 환자의 간경화로의 진행 상황을 관찰할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 퇴행성 관절염(osteoarthritis)과 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 환자의 활막액에서 βig-h3의 농도를 측정하여 보면, 류마티스성 관절염 환자의 활막액에서 약 2 배 정도의 높은 βig-h3 농도를 나타내었으며, 상기 결과로부터 활막액에서의 βig-h3 농도가 퇴행성 관절염과 류마티스성 관절염의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(표 6참조).
따라서, 본 발명의 βig-h3 단백질을 정량하는 진단킷트는 신장 질환, 간 질환 및 류마티스 질환을 조기에 예민하게 진단할 수 있고, 상기 질환의 진단, 손상정동 및 진행 정도를 반영하기 때문에 효과적인 검사 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 표준단백질 및 1차 항체의 제조
<1-1> 인간 βig-h3 및 마우스 βig-h3의 분리
본 발명자들은 인간과 마우스의 βig-h3 단백질을 제조하였다. 각 단백질 구성요소의 개략도를도 1에 나타내었으며,도 1에서 해칭된 칸과 크로스 해칭된 칸은 반복되는 도메인인 I, II, III, IV의 매우 보존된 서열을 나타내며, RGD 모티브는 빈칸으로 나타내었다.
본 발명자들은 pBluescript SK(-) 벡터에 클로닝된서열번호 2로 기재되는 염기 서열을 가지는 βig-h3 cDNA(pBS βig-h3)(인간 피부의 유두종 세포 cDNA로부터 클로닝하여 얻음)를NdeI과BglII 제한효소로 절단하여 블런트 말단(blunt end)을 가지는 DNA 단편을 제조하였고, 상기 단편을 pET-29β벡터(Novagen사에서 구입)의EcoRV와EcoRI 부위에 서브클로닝하였다. βig-h3의 69 아미노산에서 653 아미노산에 해당하는서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 분리하였고 이를 인간 βig-h3라 명명하였다.
다음으로 본 발명자들은 βig-h3 cDNA에BamHI과XhoI부위를 만들어 상기와 동일한 방법으로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 23 아미노산에서 641 아미노산에 해당하는 염기서열을 갖는서열번호 4로 기재되는 DNA 단편을 제조하였고, 상기 단편을 pET-29β벡터의BamHI과XhoI 부위에 삽입하여 발현시킨서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 분리하였으며, 이를 마우스 βig-h3라 명명하였다.
본 발명자들은 상기 인간 βig-h3 단백질 및 마우스 βig-h3 단백질을 발현시키기 위하여,E.coliBL21(DE3)을 숙주로 사용하여 형질전환시켰고, 형질전환 균주들을 595 nm 에서의 광학농도(OD)가 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37℃, 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamicine)을 포함한 LB 배지에서 배양하였다. 배양과정에서 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-(-)thiogalactopyranoside)로 37℃에서 3시간 동안 βig-h3 단백질을 유도하여 발현시켰다.
βig-h3를 발현시킨 후 대장균 침전물(pellet)을 50 mM 트리스염산(Tris-HCl, pH 8.0), 100 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1% 트리톤(Triton) X-100, 1 mM 페닐메탄-설포닐 플루오라이드(phenylmethane sulfonyl fluoride, 이하 “PMSF”라 함) 및 0.5 mM DTT로 구성된 세포 용해 완충용액(cell lysis buffer)에 다시 현탁시킨 후 초음파처리를 하여 세포를 파쇄하였으며, 이 과정을 5 회 반복하였다.
상기의 용액을 원심분리하여 βig-h3이 포함된 불용성 함유체(inclusion bodies)를 0.5 M 염화나트륨, 5 mM 이미다졸(imidazol) 및 8 M 요소(urea)를 포함하는 20 mM 트리스염산(Tris-HCl) 완충용액에 용해시킨 후, Ni-NTA 레진(Qiagen)을 사용하여 단백질을 정제하였다. 50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충용액에서 고농도부터 저농도까지의 요소(urea)로 단백질을 차례대로 투석하여 정제하였고 SDS-PAGE로 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 인간 βig-h3 및 마우스 βig-h3 단백질이 분리됨을 확인하였다(도 2).
<1-2> βig-h3 D-IV(1x) 및 βig-h3 D-IV(4x)의 제조 및 분리
본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 인간 βig-h3의 498부터 637까지의 제 4 도메인을 코딩하는서열번호 6로 기재되는 DNA 단편을 PCR을 수행하여 증폭한 후 pET-29β벡터에 클로닝한 제 4 도메인의 발현 벡터를 제조하였고, 이를 "βig-h3 D-IV"라 명명하였다.
다음으로, 제 4 도메인에 해당하는 염기서열을 PCR로 합성하여 클레나우(Klenow) 단편으로 3' 말단 부분을 평활화시킨 후, 상기에서 제조한 네 번째 도메인을 포함하는 발현벡터 pβig-h3 D-IV의EcoRV 부위에 삽입하였고 이를 pβig-h3 D-IV(2x)라 명명하였다. pβig-h3 D-IV(2x)의 삽입절편을EcoRV와XhoI으로 잘라낸 후, 상기와 동일한 방법으로 Klenow 단편으로 3' 말단 부분을 평활화시킨 후, pβig-h3 D-IV 및 pβig-h3 D-IV(2x)의EcoRV 부위로 각각 삽입하였고, 이를 pβig-h3 D-IV(3x) 및 pβig-h3 D-IV(4x)로 명명하였다(도 3). Ni-NTA 레진(Qiagen)을 사용하여 발현되는 단백질을 정제하기 위하여 상기 DNA 단편의 카르복식 말단에 6 개의 히스티딘(histidine) 잔기를 연결시켜 His-표지(His-tag)를 만들었다.
상기 발현 벡터를 대장균 BS21(DE3)에 형질전환시킨 후 대장균 형질전환체를 50 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 배지에서 배양하였다. 상기 대장균 형질전환체를 1 mM Tris-HCL(pH 8.0), 100 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF 및 0.5 mM DTT를 포함하는 세포용해 완충용액에 현탁시킨 후 초음파처리를 하여 세포를 파쇄하였다. 상기 과정을 5회 반복한 후 원심분리로 상등액을 분리하였고 이 상등액을 Ni-NTA 레진이 충진된 컬럼을 사용하여 정제한 후 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 제 4 도메인을 포함하는 각각서열번호 7내지서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 βig-h3 D-IV(1x), βig-h3 D-IV(2x), βig-h3 D-IV(3x) 및 βig-h3 D-IV(4x) 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 4).
<1-3> 일차 항체의 제조 및 분리
상기 실시예 <1-1>에서 분리한 인간 βig-h3 및 마우스 βig-h3 단백질을 항원으로 사용하여 토끼의 등에 피하주사하여 항체를 제조하였다. 처음 주사는 200 ㎍의 단백질을 완전 프레운드 면역증강제(complete Freund's adjuvant)와 혼합하여 주사하였고 그 다음의 4번에 걸친 주사는 100 ㎍의 단백질을 불완전 프레운드 면역증강제(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 3주 간격으로 주사하였다. 혈청은 채혈 후 실온에서 2시간 정도 방치한 후 10,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 일차항체를 포함하는 상등액을 취하였고, -20℃ 냉동고에 보관하여 사용하였다(도 5).
<실시예 2> 인간 βig-h3 단백질의 코팅농도 및 항체의 정량적 비율 결정
<2-1> 1차 항체의 정량적 비율 결정
인간 βig-h3 단백질에 대한 일차항체의 정량적 비율을 구하기 위하여 인간 βig-h3를 0.5 ㎍/㎖의 코팅완충용액(20 mM carbonate-bicarbonate 용액, pH 9.6, 0.02% sodium azide)에 희석한 후, 96-웰 플레이트에 200 ㎕씩 넣고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 일차 항 인간 βig-h3 항체의 농도를 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:2000 및 1:3200으로 희석완충용액(살린-인산 완충용액/트윈 80)에 희석한 후, 1:5000으로 고정시킨 이차항체를 첨가하여 상온에서 1시간 반 동안 반응시켰다. 반응 후 기질용액(o-페닐렌디아민을 메탄올에 10 mg/ml로 녹여 증류수에 1:100으로 희석하고 30% 과산화수소 10 ㎕를 첨가하여 혼합)을 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 50 ㎕의 8 N 황산용액으로 반응을 중지시키고 바로 ELISA 분석(O.D 492 nm)을 실시하였다.
그 결과, 일차 항 인간 βig-h3 항체의 정량적 비율은 1:1600과 1:2000일 때 그래프가 직선을 이루게 되므로 상기 비율이 가장 적당함을 확인하였다(도 7).
<2-2> 2차 항체의 정량적 비율 결정
이차항체의 정량적 비율을 구하기 위하여 인간 βig-h3 단백질을 0.5 ㎍/㎖농도로 코팅하고, 일차 항 인간 βig-h3 항체를 1:1600과 1:2000으로 희석하여 고정시킨 후 이차항체의 농도를 각각 1:1000, 1:2000 및 1:3000으로 희석하여 ELISA 분석을 실시하였다.
그 결과, 1:2000의 비율일 때 그래프가 직선을 이루게 되므로 상기 비율이 가장 적당한 비율임을 확인하였다(도 8).
<2-3> 인간 βig-h3 단백질의 코팅 농도 결정
본 발명자들은 인간 βig-h3 단백질의 코팅 농도를 결정하기 위하여 일차 항 인간 βig-h3 항체를 1:2000, 이차항체를 1:2000으로 희석하였고, 인간 βig-h3 단백질의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖ 및 1.0 ㎍/㎖로 하여 ELISA 분석을 실시하였다.
그 결과 1.0 ㎍/㎖과 0.5 ㎍/㎖ 두 가지 경우 모두 그래프가 직선을 나타내어 정량적 범위로 적당하였지만 1.0 ㎍/㎖보다 0.5 ㎍/㎖이 피어슨의 곱 모멘트 상관 계수(R2)값이 1에 가까운 형태로 나타나서, 코팅 농도는 0.5 ㎍/㎖일 때 가장 적당함을 확인하였다(도 9).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 인간 βig-h3 표준단백질의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖로 하고 일차 항 인간 βig-h3 항체 및 이차항체의 희석 비율은 각각1:2000으로 하여 정량적 실험을 수행하였다.
상기 결과를 바탕으로 하기수학식 1로 표시되는 로바드(Robard, 1971)의 공식에 의해 로그 변환(log transformation)시킨 결과, 11 ng/㎖에서 900 ng/㎖까지 직선을 형성하여 상기 범위가 측정가능범위임을 확인하였고, 상기 반응 조건이 10 ng/㎖까지 측정할 수 있는 감도를 가지고 있음을 확인하였다(도 10).
상기에서 b는 항원이 들어 있지 않는 웰의 흡광도에 대한 각 농도에서의 퍼센트 값을 나타낸다.
<실시예 3> 교차실험을 통한 마우스 βig-h3,
재조합 βig-h3 D-IV(1x) 및 βig-h3 D-IV(4x) 단백질의 정량적 범위측정
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 마우스 βig-h3, 재조합 βig-h3 D-IV(1x) 및 βig-h3 D-IV(4x)를 사용하여 단백질의 농도, 일차항체 및 이차항체의 정량적 비율을 결정하였다. 구체적으로, 각 단백질의 코팅 농도를 0.5 ㎍/㎖로 하고, 일차 항 인간 βig-h3 항체 및 이차항체는 1:2000으로 하여 정량적 실험을 하였으며, 또한 일차 항 마우스 βig-h3 항체 및 이차항체는 1:2000으로 하여 정량적실험을 하였다.
그 결과, 모든 경우에 있어서 그래프가 직선을 형성하였고, 측정범위 역시 11 ng/㎖에서 900 ng/㎖로 서로 비슷함을 확인하였다(도 11및도 12).
상기의 결과로부터, 표준단백질은 인간 βig-h3, 마우스 βig-h3, 재조합 βig-h3 D-IV(1x) 및 βig-h3 D-IV(4x) 중 어느 것을 사용해도 무방하며, 일차항체의 경우도 교차작용이 있으므로 항 인간 βig-h3 항체나 항 마우스 βig-h3 항체 중 어느 것을 사용해도 됨을 확인하였다.
<실시예 4> 신장 질환과 βig-h3 발현과의 상관관계
<4-1> 당뇨병 환자에서의 βig-h3 측정
본 발명자들은 신장 질환의 병리기전에 중요한 역학을 하는 TGF-β에 의해 βig-h3의 발현이 강력하게 유도된다는 점에 착안하여 신장 질환과 βig-h3 발현과의 상관관계를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 본 발명자들은 먼저 신장 질환을 일으키는 대표적인 질환인 당뇨병 환자를 상대로 소변에서의 βig-h3를 측정하였다. 구체적으로 당뇨병 환자의 소변 110 ㎕와 일차항체(1:1000) 110 ㎕를 둥근 플레이트에 첨가하여 37℃에서 1시간 반 동안 배양한 후, 그 중 200 ㎕를 다시 βig-h3로 미리 코팅된 플레이트에 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킨다. 반응 후, 이차항체-기질 반응중지액으로 반응을 중지시켜 ELISA 분석(O.D 492 nm)을 수행하였다.
| 대상군 | βig-h3(ng/㎖) |
| 정상 | 31.0 (n=93, ±8.6) |
| Type II DM | 101.9 (n=51, ±17.1) |
| Type II DM + microalbuminuria | 127.4 (n=30, ±27.7) |
| Type II DM + overt proteinuria | 105.4 (n=19, ±14.9) |
| Type II DM + CRF | 153.6 (n=93, ±28.1) |
그 결과, 마이크로알부미누리아(microalbuminuria)를 포함하는 당뇨병성 신장 질환자의 소변 βig-h3의 농도는 정상인에 비해 5 배 정도의 높은 수치를 보였으며 임상적으로 당뇨병성 신장 질환을 나타내지 않는 환자에서도 βig-h3의 농도가 증가하였다. 당뇨병성 신장 질환을 가진 환자의 소변 βig-h3는 대부분의 환자에서 정상보다 높은 수치를 보였으며 임상적으로 신장질환이 없는 환자의 일부분도 높은 수치를 나타내었다. 상기의 결과로 볼 때 소변 βig-h3는 신장의 손상정도를 잘 반영한다고 할 수 있으며 특히 임상적으로 신장 질환을 나타내지 않는 당뇨병 환자의 일부에서도 높은 수치를 보이는 것은 이들 환자가 임상적으로 드러나는 뚜렷한 신장기능 장애는 없지만 어느 정도 신장의 손상을 입고 있다는 것을 의미한다. 따라서, 소변의 βig-h3 측정은 신장의 손상을 조기에 반영하는 감도가 높은 진단적 의의를 가지며, 기존의 신장기능을 반영하는 어떤 검사보다도 조기에 신장의 손상을 반영할 수 있음을 확인하였다.
<4-2> 당뇨병 유발 동물 모델에서의 βig-h3 측정
본 발명자들은 소변에서의 βig-h3 농도가 당뇨병 환자의 신장 손상을 조기에 반영하는지를 확인하기 위하여, 당뇨병 유발 동물 모델에서 βig-h3 농도를 측정하였다.
SD 래트(Sprague-Dawley rat)에 당뇨병 유발 약물인 스트렙토조토신(streptozotosin)을 60 ㎎/㎏ 농도로 복강 내에 주사하여 당뇨병을 유발하였고, 혈당을 측정하여 당뇨병이 유발된 것을 확인하였으며, 5일째의 소변을 24시간 동안 채취하여 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 βig-h3 농도를 측정하였다.
그 결과, 당뇨병 유발 전의 βig-h3 농도는 56.9 ±6.4 ng/크레아틴 mg 이었으나 당뇨병 유발 후 5일째의 평균치는 230.4 ±131.8 ng/크레아틴 mg 으로써 βig-h3 농도가 약 4배 정도 증가하였다(도 13). 당뇨병이 유발된 후 각 개체에서의 βig-h3 농도 변화를 살펴보면 모든 개체가 당뇨병 유발 후에 소변 βig-h3 농도가 현저하게 증가함을 알 수 있었다(도 14). 당뇨병 유발 5일에는 혈중 요소(urea)와 크레아틴 수치는 정상이며 신장의 조직소견도 뚜렷한 이상을 나타내지 않는다. 따라서, 5일째 소변에서 βig-h3 수치가 현저하게 증가한다는 것은 기존의 검사법으로는 찾아낼 수 없는 신장의 미세한 손상을 조기에 반영할 수 있다는 것을 시사한다.
<4-3> 신장이식(kidney transplantation) 수술환자에서의 βig-h3 측정
본 발명자들은 신장이식 수술 전과 후의 환자의 소변으로부터 βig-h3의 농도를 측정하여 신장손상과 βig-h3 농도와의 상관관계를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 신장이식 수술 전과 후의 환자에서 βig-h3 농도를 측정하였고, 그 결과를표 2에 나타내었다.
| 일 환자 | -6 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 수술성공 |
| 1 | 376.9 | 199.2 | 105.6 | 59.1 | 67.6 | 84.5 | 63.1 | 61.2 | 39.7 | 9.9 | Ｏ | |||
| 2 | 149.2 | 147.3 | 133.5 | 159.5 | 148.3 | 147.3 | 96.0 | 74.0 | 40.7 | 20.3 | 27.9 | 26.4 | Ｏ | |
| 3 | 107.8 | 95.8 | 101.4 | 102.3 | 102.2 | 106.1 | 106.6 | 125.5 | 83.5 | 49.4 | 36.5 | 33.3 | 23.2 | Ｏ |
| 4 | 298.8 | 208.1 | 140.5 | 169.9 | 188.4 | 76.3 | 24.4 | Ｏ | ||||||
| 5 | 188.6 | 160.7 | 469.3 | 290.9 | 494.7 | 324.4 | - | Ｘ |
그 결과, 신장이식 수술 전 높은 수치의 βig-h3 농도가 수술이 성공적으로된 환자의 경우에 있어서 서서히 떨어지는 것을 보였고, 수술 후에 신장 기능이 회복되지 않은 5번 환자의 경우에는 계속 높은 수치를 유지하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 βig-h3의 농도가 신장의 손상을 예민하게 반영함을 알 수 있다.
<4-4> 신부전증 환자에서의 βig-h3 측정
본 발명자들은 신부전증 환자의 소변을 채취하여 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 βig-h3의 농도를 측정한 결과, 모든 환자에서 정상보다 현저히 높은 βig-h3 농도 수치를 보임을 확인하였다(표 3).
| 대상군 | βig-h3 (ng/㎎) |
| 정상 | 31.0 (n=93, ±8.6) |
| 만성신부전증 | 335.4 (n=9, ±56.0) |
<4-5> 신장질환 관련 환자에서의 βig-h3 측정
본 발명자들은 βig-h3가 신장과 관련된 질환을 앓는 환자에서 정상과 다르게 발현되는지 알아보기 위하여, 신장이식 후 정상인 경우, 이식 받은 신장의 크기가 작은 경우, 만성 거부, 신우염의 재발 및 사이클로스포린 독성이 나타난 경우로 분류하여 상기 환자의 소변으로부터 βig-h3의 농도를 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 측정하였다.
그 결과, 신장 이식 후 정상적인 신장 기능을 보이는 환자의 평균치는 39.4 ng/크레아틴 ㎎ 인 반면 만성거부, 신우염의 재발 및 사이클로스포린 독성이 있는 환자에서는 βig-h3의 농도가 현저히 증가하여 각각 140.8, 175.4 및 90.9 ng/크레아틴 ㎎을 나타내었다(도 15,표 4).
| βig-h3 | 신장이식 후 정상 (n=47) | 이식받은 신장크기 작은 경우(n=16) | 만성거부(n=15) | 신우염 재발(n=6) | 사이클로스포린 독성(n=6) |
| 평균 | 39.4±18.2 | 54.7±23.0 | 140.8±81.1 | 175.4±65.8 | 90.9±22.4 |
| 최저 | 9.4 | 17.9 | 48.8 | 83.2 | 64.6 |
| 최대 | 84.7 | 100.0 | 374.4 | 249.8 | 119.4 |
또한, 본 발명자들은 신장이식후 재발에 의해 βig-h3 농도가 증가한 것이 치료에 반응함에 따라 다시 감소하는 가를 알아보았다. 신장 이식 후 신우염(국소분절사구체경화증)이 재발하여 혈장교환술을 받은 환자의 소변 βig-h3 농도는 점차 감소되는 것으로 나타났는데, 이는 치료에 반응함에따라 소변의 βig-h3의 농도가 감소하는 것을 알 수 있는 것으로 치료반응의 지표로서 가능성을 나타내는 것이다(도 16).
<4-6> 신장이식 후 βig-h3 농도에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 신장이식 수술 후에 소변 βig-h3의 농도가 어떻게 변하는지 알아보기 위하여, 신장수술 직후 매일 소변에서 βig-h3의 농도를 측정하였다.
그 결과, 살아있는 사람의 신장이나 뇌사한 사람의 신장을 이식 받아 성공적으로 이식이 된 경우 소변 βig-h3의 농도가 수술 후 서서히 감소하여 살아있는 사람의 신장을 이식 받은 경우는 4에서 5일 사이에 정상값으로 돌아오며 뇌사한 사람의 신장이식인 경우 6에서 7일 사이에 정상값이 되었다(도 17).
또한, 이식한 신장의 크기가 작아서 이식된 신장은 정상이지만 신기능이 충분하지 않은 경우는 혈중 크레아틴 값은 여전히 높은 반면 소변 βig-h3의 농도는정상으로 돌아왔다. 이는 이식된 신장이 작아서 환자의 노폐물을 충분히 다 걸러내지는 못하지만 신장 자체는 정상임을 의미하고 따라서 신장의 손상을 반영하는 βig-h3의 농도는 정상으로 돌아왔다는 것을 의미한다(도 17). 반면 신장이식이 실패한 경우 소변 βig-h3 농도의 변동이 심하게 나타나는 경향을 보여주었다.
이상의 결과들로 볼 때 소변 βig-h3 농도의 측정은 신장의 손상정도를 잘 반영하여 신장 질환 이상의 조기 진단과 신장질환의 진행과 치료 효과 판정의 좋은 지표로서 사용될 수 있다.
상기의 결과로부터, 소변에서의 βig-h3 농도는 신장의 손상을 조기에 예민하게 반영하며 신장의 손상을 주는 여러 경우에서 진단적으로 대단히 중요한 의미를 가짐을 확인하였다.
<실시예 5> 간 질환과 βig-h3 발현과의 상관관계
만성간염환자가 간경화로 진행하고 있는가를 판정하는 것은 임상적으로 대단히 중요하지만 현재까지는 그러한 진단법이 없는 실정이다. 간경화의 진행에 가장 중요한 인자는 TGF-β이므로 TGF-β에 의해 발현이 유도되는 βig-h3가 간경화가 진행됨에 따라 혈중에서 그 농도가 증가할 가능성이 있으며 이는 간경화의 진행정도를 반영할 수 있다. 실제로 간염환자의 간조직의 면역조직검사에서 βig-h3가 간경화의 정도가 심할수록 많이 발현된다고 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 만성간염환자를 조직검사 결과를 기준으로 등급(grade)과 단계(stage)로 나누어 혈중 βig-h3 농도와의 상관관계를 확인하였다.
만성간염환자의 혈액을 채혈하여 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 βig-h3의 농도를 측정하였으며, 그 결과를 하기표 5에 나타내었다.
| 등급 | βig-h3 (ng/㎎) | 단계 | βig-h3 (ng/㎎) |
| 0(정상) | 146.2 (n=172, ±28.5) | 0(정상) | 146.2 (n=172, ±28.5) |
| 1 | 196.6 (n=16, ±30.6) | 1 | 193.4 (n=20, ±30.2) |
| 2 | 190.0 (n=43, ±72.8) | 2 | 192.2 (n=36, ±79.1) |
| 3 | 167.5 (n=7, ±21.9) | 3 | 172.5 (n=10, ±21.9) |
그 결과, 만성간염환자는 정상보다 혈중 βig-h3 농도가 높음을 확인하였으며, 낮은 등급과 단계(1 및 2)에서의 βig-h3 농도가 높은 등급과 단계(3)에서의 βig-h3 농도보다 높은 것을 확인하였다. 등급 3과 단계 3은 간경화로 상당히 진행된 상태로서 이미 간경화의 활동성이 정점을 지난 상태라고 할 수 있으며, 반면에 단계 1과 2 및 등급 1과 2는 현재 염증반응이 활발히 진행하고 있는 활동성 상태라고 할 수 있다. 따라서, 혈중 βig-h3의 농도는 간경화의 활동성 상태를 반영하며, 동일한 환자에서 정기적으로 혈중 βig-h3 농도를 측정함으로써 환자의 간경화로의 진행 상황을 관찰할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 6> 류마티스 관절염 환자와 βig-h3 발현과의 상관관계
본 발명자들은 퇴행성 관절염(osteoarthritis)과 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 환자의 활막액에서 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 βig-h3의 농도를 측정하였다(표 6).
| βig-h3 (ng/㎎) | |
| 퇴행성관절염 | 11.0 (n=29, ±0.3) |
| 류마티스성관절염 | 21.0 (n=20, ±2.5) |
그 결과, 류마티스성 관절염 환자의 활막액에서 약 2 배 정도의 높은 βig-h3 농도를 나타내었으며, 상기 결과로부터 활막액에서의 βig-h3 농도가 퇴행성 관절염과 류마티스성 관절염의 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 βig-h3 측정법은 인간 βig-h3, 마우스 βig-h3, βig-h3 D-IV(1x) 또는 βig-h3 D-IV(4x)를 표준단백질로 사용하므로 비용이 저렴하고 다양한 체액에서 βig-h3의 농도를 정확하게 진단할 수 있으며, 검체에서의 βig-h3 농도는 TGF-β와 관련되는 의학적 증상들인 여러 가지 신장 질환, 간질환 및 류마티스 질환을 조기에 예민하게 반영하므로 상기 질환의 진단, 손상 정도 및 진행 정도를 반영하는 효과적인 검사 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (12)
1) βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질을 제조하는 단계(단계 1);
2) 상기 단계 1의 단백질에 대한 항체를 제조하는 단계(단계 2); 및
3) 상기 단계 1의 단백질 및 단계 2의 항체를 항원-항체 반응을 이용한 정량방법에 사용하여 피검시료 중에 포함된 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 단계(단계 3)를 포함하는 βig-h3의 정량방법.
제 1항에 있어서, 상기 항원-항체 반응을 이용한 정량방법은 면역블럿팅, 면역침전법, ELISA 방법, RIA(Radioimmuno assay), 단백질칩, 래피드 어세이(rapid assay) 및 마이크로어레이(microarray)로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3의 βig-h3 단백질의 양을 측정하는 것은
1) βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질을 기질에 코팅시키는 단계(단계 1);
2) 상기 단계 1의 단백질에 대한 항체를 피검시료와 반응시키는 단계(단계2);
3) 단계 1의 흡착된 단백질에 단계 2의 반응물을 첨가하여 반응시킨 후 세척하는 단계(단계 3); 및
4) 단계 3의 반응물에 2차 항체를 첨가하여 반응시키고 흡광도를 측정하는 단계(단계 4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 정량방법.
제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 βig-h3 단백질은서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인간 βig-h3 단백질 또는서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 βig-h3 단백질인 것을 특징으로 하는 정량방법.
제 1항 내지 제 3항에 있어서, 상기 βig-h3의 파스-1 도메인은 βig-h3 단백질의 4번째 파스-1 도메인을 1개 또는 2개 내지 10개를 반복하여 연결한 것을 특징으로 하는 정량방법.
제 5항에 있어서, 상기 βig-h3의 파스-1 도메인은서열번호 7,서열번호 8,서열번호 9및서열번호 10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 정량방법.
제 1항에 있어서, 상기 피검시료는 신장 질환, 간 질환 또는 류마티스 환자의 소변, 혈액 또는 활막액을 포함하는 인체의 모든 체액인 것을 특징으로 하는 정량방법.
βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 재조합 단백질 및 βig-h3 단백질 또는 βig-h3의 파스-1 도메인에 대한 항체를 포함하는 신장 질환, 간 질환 또는 류마티스 질환에 대한 진단킷트.
제 8항에 있어서, 완충용액, 2차 항체, 세척액, 반응정지액 또는 발색기질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단킷트.
제 8항에 있어서, 상기 βig-h3 단백질은서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인간 βig-h3 단백질 또는서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 마우스 βig-h3 단백질인 것을 특징으로 하는 진단킷트.
제 8항에 있어서, 상기 βig-h3의 파스-1 도메인은 βig-h3 단백질의 4번째 파스-1 도메인을 1개 또는 2개 내지 10개를 반복하여 연결한 것을 특징으로 하는 진단킷트.
제 11항에 있어서, 상기 βig-h3의 파스-1 도메인은서열번호 7,서열번호 8,서열번호 9및서열번호 10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단킷트.
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