KR101627770B1 - 천마 추출물을 포함하는 통증 완화 또는 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천마 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천마 추출물은 다양한 만성통증의 완화, 억제 및 치료에 유용한 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 이용될 수 있다.

Description

천마 추출물을 포함하는 통증 완화 또는 치료제{pain alleviating and treating agent containing a Gastrodiae Rhizoma extract}

본 발명은 천마 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천마 추출물은 다양한 만성통증의 완화, 억제 및 치료에 유용한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

인간이 느끼는 통증은 크게 급성통증(Acute pain)과 만성통증(chronic pain)으로 구분할 수 있다. 국제통증연구학회에 따르면 통증은 "실제적 또는 잠재적 조직 손상을 동반한 불쾌한 감각적이고 정서적 경험"이라 정의하고, 이 통증 증상을 특징과 기간으로 분류하면 급성과 만성통증으로 나눌 수 있다.

급성통증은 질병이나 외상에 의한 조직 손상으로 인해 발생하는 침해성 자극에 의해 발생하는 통증으로, 출산 통증, 수술 후 통증, 조직손상 후 통증 등이 있으며, 일반적으로 3 내지 6개월 이내 소실되며, 여러 약물(마약성 진통제, 비스테로이드성 소염진통제)에 의해 효과적으로 치료가 된다.

만성통증은 여러 불분명한 원인에 의해 신경손상과 이에 따른 신경계의 변화에 의해 유발되며, 원인이 된 질환이나 손상의 치유기간보다 길게 지속이 되며, 통증부위의 경계가 불분명하며, 지속적으로 무디고 깊은 통증을 보이며, 6개월 이상 지속되며, 마약성 진통제나 비스테로이드성 소염진통제의 효과가 제한적이다.

예를 들어, 편두통, 류마티스성통증, 당뇨병성통증, 및 암성 통증이 있으며, 이러한 통증은 환자의 삶의 질을 급격히 떨어뜨리고, 우울증 등을 수반할 수 있다. 마약성 진통제는 중등도의 효과가 있으나, 그 부작용이 강해 지속적으로 사용하기가 어려우며, 비스테로이드성 소염제는 효과가 미약하다. 현재 임상적으로 삼환계항우울제(Tricyclic antidepressant)나 항경련제(anti-epileptic drug)를 사용하고 있으나, 효과가 미약하다고 알려져 있으며, 따라서 새로운 약물의 개발이 요구된다.

이와 같이 급성통증과 만성통증은 그 발생 기전이 다를 뿐만 아니라, 여러 약물에 대한 감수성도 다른 완전히 다른 질병이라 할 수 있다.

만성통증 질환 중 암에 의한 통증(cancer pain)은 종양(tumor) 자체에 의한 통증, 뼈에 전이된 암종에 의한 통증(bone pain), 그리고 치료와 관련된 처치 즉 항암제에 의한 통증으로 나눌 수 있다.

신경 손상이나 신경계의 이상반응으로 인해 나타나는 신경원성 통증(neuropathic pain)은 여러 가지 증상을 나타낸다. 즉, 외부의 자극이 없이도 자발적으로 발생하는 자발성 통증(spontaneous pain), 통상적으로 통증을 유발하는 자극에 대해 더 심한 통증을 느끼는 통각과민(hyperalgesia), 또한 정상에서 통증을 유발하지 않는 약한 자극에 대해서도 심한 통증을 일으키는 이질통(allodynia)등의 증상이 나타난다. 아울러 이런 신경원성 통증은 당뇨병성 통증, 대상포진 후 통증, 신경손상 후 통증, 척수손상 후 통증 등에서도 관찰이 된다.

최근 연구의 진전으로 통증 유발 기전이 밝혀지고 있다. 통증의 전달과정은 말초에 가해진 유해한 자극은 일차 구심성 섬유를 통해서 척수의 배면후각세포에 전달되고, 이는 척수시상로를 통해 시상으로 가고, 그 후 대뇌피질에서 인지를 하게 된다. 이 과정에서 말초감작(peripheral sensitization)과 중추감작(central sensitization)이 관여한다.

급성통증은 주로 말초감작이 관여된다. 말초감작은 조직이 손상된 부위와 그 주변에서 신경과 염증반응 등에 의해 유발된다. 즉, 조직 손상 부위에서 분비된 프로스타글란딘(prostaglandin), 브라디키닌(bradykinin), 칼륨이온(K⁺)등은 피부에 있는 일차 구심성 섬유의 신경말단의 침해수용체(nociceptor)를 자극하거나 손상부위를 민감하게 한다.

또한, 신경축삭(axon) 반사에 의해 손상 부위에 분비된 substance P는 혈관 확장과 비만세포(mast cell)의 탈과립을 유도하여 히스타민(histamine)과 세로토닌(serotonin)을 분비한다. 이런 물질들은 말초신경을 감작시켜 통증을 유발하게 된다. 이 과정은 주로 비스테로이드성 소염제에 의해 효과적으로 치료가 되고 있다.

반면에, 만성통증은 주로 중추감작이 관여된다. 중추감작은 척수후각의 신경세포의 과민반응으로, 조직손상 시 일차 구심성 섬유에 의해 전달된 통증 정도보다 훨씬 증폭된 신호를 만들게 된다. 즉, 일차신경에 의한 자극이 척수 후각세포를 지속적으로 자극하여 통증반응 부위를 확장하며, 반응기간을 연장시키게 된다. 이를 통해 통각과민, 이질통, 자발통이 나타난다. 이 과정은 급성통증에 효과적인 비스테로이드성 소염제에 의해 억제되지 않으며, 현재는 주로 항우울약, 항경련제, 마약성 진통제 등을 투여하고 있으나, 그 효과가 최대 중등도이다.

결론적으로 만성통증은 질환이나 조직 손상의 경고 신호로서 생체 방어 기전인 급성통증의 기전과 다를 뿐만 아니라, 여러 약물에 대한 감수성도 다른 완전히 상이한 질병이라 할 수 있다.

미국의 경우 2008년에 140만 명이 암으로 진단받았고 거의 1,000만 명이 암에 의한 통증으로 고통을 받고 있다. 신경원성통증을 유발하는 항암제는 taxanes (paclitaxel, docetaxel), vinca alkaloid (vincristine, vinblastine), 및 platinum 제제(cisplatin)등이 있으며, 이에 의한 통증은 발생하면 치료가 어렵고 약물사용을 중단하더라도 몇 주 내지 몇 개월간 통증이 지속되며, 때로는 몇 년간 지속하는 경우도 있다.

이 약물들 중 Paclitaxel(PAC, Taxol®)은 taxanes의 한 종류로 유방암, 자궁경부암, 난소암, 비소세포성폐암, 및 Kaposi 육종(Vyas and Kadow, Prog. Med. Chem. 32: 289-337, 1995; Wall and Wani, Cancer Res. 55: 753-760, 1995)에 널리 사용되는 항암제이다. 이 약제는 세포의 미세관(microtubule)의 β-tubulin에 부착하여 미세관을 안정화시키고 중합(polymerization)을 촉진하여 항암작용을 나타낸다(Carlier and Pantaloni, Biochem. 22: 4814-4822, 1983).

또한, PAC는 항암작용뿐만 아니라 말초신경의 신경병도 유발하는데, 팔과 다리의 저림이나 감각 저하 같은 비교적 가벼운 증상부터 불에 덴 것 같은 통증까지 다양한 신경병성통증을 호소한다 (Dougherty et al.,Pain 109: 132-142, 2004). PAC를 체표면적 1 m2당 200 mg 이상을 사용하면 55%의 환자에서 신경병성통증이 나타낸다 (Cata et al., Neuroscience 138: 329-338, 2006; Potter & Higginson, Lung Cancer 43: 247-257, 2004; Lipton et al., Neurology 39: 368-373, 1989). 다른 항암제(cisplatin, vincristine)와 병용 투여하거나 당뇨병 같은 말초신경병변을 유발하는 질환을 동반하는 경우 신경병성통증의 발생빈도가 증가하고 통증의 정도가 심해진다.

PAC에 의한 신경병성통증(Paclitaxel induced neuropathic pain, PINP)의 기전은 불분명하지만 밝혀진 것은 다음과 같다. PAC가 축삭의 미세관에 부착하여 축삭의 전도를 방해하고 신경손상을 유발할 수 있다고 한다(Tanner et al., J. Comp. Neurol. 395: 481-492, 1998). PAC는 뇌혈류장벽을 통과하지 못하며 후근신경절 (dorsal root ganglion)에 고농도로 축적될 수 있다 (Cavaletti et al., Neurotoxicology 21: 389-393, 2000). PINP가 있는 환자에게 신경전도 검사를 하니 Aβ 신경의 기능은 많이 감소하고, Aδ 신경은 약간 감소한 반면, C섬유 신경은 기능이 감소하지 않았다 (Dougherty et al., 109: 132-142, 2004). 흰쥐에 PAC을 투여하면 척수 후각의 wide dynamic range neuron의 자발 반응이 증가하고 침해자극이나 열성자극에 대한 후방전이 증가하며, 피부의 전기 자극에 대한 wind-up이 증가한다고 한다 (Cata et al., Neuroscience 138: 329-338, 2006).

PINP는 용량-한정 부작용으로 임상에서 사용되는 대부분의 약제들이 효과가 없거나 아주 고용량에서 효과를 나타낸다. 동물실험에서 비스테로이드성 항염증약물은 효과가 없거나 미미하며, 아편 유사제들도 아주 고용량에서만 효과를 나타낸다. Gabapentin과 나트륨 채널 차단제인 Mexiletine같은 약물은 반복투여를 한 경우에 약간의 효과를 나타낸다 (Xiao et al., Neuroscience 144: 714-720, 2007). 그러므로 이들 질환에 대한 새로운 치료제개발이 신속히 요구되고 있다.

현재 임상에서 널리 사용되는 진통제인 아스피린이나 타이레놀, 이부프로펜등의 비스테로이드성 진통제는 이들 만성통증에 효력이 없다. 그러므로 현재 임상에서는 이들 만성통증을 조절할 목적으로 gabapentin이 유일하게 사용되고 있다. 물론 마약성 진통제를 사용할 수도 있으나, 널리 알려져 있는 의존성과 부작용으로 인해 새롭고 강한 활성을 보이는 신약물의 개발이 시급히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 만성통증 완화, 억제 또는 치료제를 개발하기 위해, 만성통증에 효력을 보일 가능성이 있는 50종 이상의 생약 및 민간약들을 대상으로 스크리닝하였으며, 이중 천마(Gastrodiae Rhizoma)의 만성통증 억제 활성이 우수한 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 천마의 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천마 추출물은 천마의 용매 조추출물, 이의 용매 분획물, 또는 칼럼 분획물을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 천마의 추출물의 만성통증의 완화, 억제 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 만성통증 완화, 억제, 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 만성통증의 완화, 억제 또는 치료용도에 사용하는 천마 추출물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 목적은 천마 추출물로부터 분리된 단일 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 만성통증의 완화, 억제 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 천마 추출물로부터 분리된 단일 화합물을 투여하여 만성통증 완화, 억제, 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 천마 추출물로부터 분리된 단일 화합물의 만성통증의 완화, 억제 또는 치료의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 천마의 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천마 추출물은 천마의 용매 추출물, 이의 용매 분획물, 또는 칼럼 분획물을 포함하며, 천마 추출물은 만성통증, 완화, 억제 및 치료 활성을 나타낸다.

본 발명자들은 현저하게 상승된 만성통증 완화 활성을 갖는 천마 추출물의 특정 분획을 확인하고, 활성물질을 단리하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다

천마(天麻, Gastrodiae Rhizoma)는 천마(Gastrodia elata Blume, 난초과(Orchidaceae))의 덩이줄기를 말하는 것으로서, 전통적으로, 두통, 간질, 뇌졸중, 현기증 같은 뇌질환뿐만 아니라 당뇨병, 디스크, 암, 위궤양, 간경화증 등 광범위한 질환에 효력을 가지는 것으로 알려져 있다. 천마는 민간에서 고혈압치료제 및 두통의 치료제로 널리 사용되어 왔고 동의보감에도 같은 용도(현훈, 고혈압, 두통)로 사용한다고 기록되어 있다.

최근의 보고에 의하면, 천마의 에탄올 추출물은 급성통증의 모델인 mouse acetic acid-induced writhing test에서 억제능을 보였고, 또한 그의 성분들인 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 4-하이드록시벤질 알코올(4-hydroxybenzyl alcohol), 벤질 알코올(benzyl alcohol), 비스(4-하이드록시페닐)메탄(bis(4-hydroxyphenyl)methane), 바닐릴 알코올(vanillyl alcohol), 바닐린(vanillin)도 억제능을 보였다 (Ahn et al., J. Ethnopharmacol. 110, 476-482, 2007; Lee et al., Arch. Pharm. Res. 29, 849-858, 2006). 천마가 혼합된 알코올 추출물의 복합물에 대한 연구에서는, 높은 용량의 실험 시에 acetic acid-induced writhing test 및 열에 의한 통증인 hot plate 법에서 효과를 보인다고 언급하고 있다. 그러나 이들 문헌은 아세트산 유도 급성통증 또는 hot plate에 의한 급성통증에 관한 효과만을 입증하고 있을 뿐이다.

천마의 추출물 또는 분획물들이 신경변증성 통증(neuropathic pain), 암통증(cancer pain) 및 당뇨병성통증(diabetic pain) 등의 만성통증에 대한 효능이 있다고 언급한 과학적인 또는 약물학적인 연구결과는 알려져 있지 아니하며, 이는 이들 만성통증이 위에서 기술한 급성통증과는 그 기전과 양상이 완전히 다른 통증이기 때문이다.

최근 gastrodin(4-hydroxybenzyl alcohol 4-β-glucopyranoside)이라는 물질이 복강 내 투여에 의해 흰쥐의 당뇨병성통증에 대하여 저해능을 보인다고 보고되었다 (Sun et al., Plos One 7: e39647, 2012). 이물질은 Galeola faberi (Lee등, Yao Xue Xue Bao 28, 766, 1993) 또는 천마의 성분 중의 하나이다.

그러나 이러한 선행문헌은 천마 추출물의 만성통증에 대한 개시가 없을 뿐만 아니라 본 발명에 따른 용매분획물 및 칼럼 분획과 단리된 활성성분에 관한 기재가 없다.

본 발명은 천마의 추출물을 함유하는 만성통증 억제 활성을 갖는 추출물에 관한 것으로서, 상기 '추출물'은 용매 조추출물 또는 특정 용매 가용 추출물 (용매 분획물) 및 용매 조추출물 또는 용매 분획물을 칼럼정제방법으로 처리하여 얻은 칼럼 분획물을 포함하며, 상기 천마 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.

본 발명에 따른 천마 추출물은 천마의 천마(天麻, Gastrodiae Rhizoma)는 천마(Gastrodia elata Blume, 난초과(Orchidaceae))의 덩이줄기를 말하는 것으로서, 천마의 뿌리, 줄기, 및 잎을 모두 사용할 수 있다.

상기 천마 추출물은 천마의 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 물, 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세트산에틸, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 및 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다. 천마의 조추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10 내지 99%(v/v), 20 내지 99%(v/v), 바람직하게는 30 내지 99%(v/v), 보다 바람직하게는 약 30 내지 95%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 바람직하게는 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, n-프로판올 수용액, 및 n-부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 천마 추출물을 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매분획물일 수 있으며, 예를 들면 상기 용매 조추출물에 헥산, 아세트산에틸, 디클로로메탄, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다. 예를 들면, 상기 천마 추출물을 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 헥산, 아세트산에틸, 디클로로메탄, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 천마의 용매 분획물은 상기 용매 조추출물, 바람직하게는 하기 용매 분획물을 포함할 수 있다.

1) 천마의 용매 조추출물을 순차적으로 헥산; 아세트산에틸; 및 디클로로메탄 및 부탄올의 혼합물로 얻은 분획물,

2) 천마의 용매 조추출물에 순차적으로 헥산 및 아세트산에틸을 첨가하여 얻은 아세트산에틸 분획물 I,

3) 천마의 용매 조추출물에 순차적으로 헥산 및 부탄올을 첨가하여 얻은 부탄옥 분획물 I,

4) 천마의 용매 조추출물에 아세트산에틸을 첨가하여 얻은 아세트산에틸 분획물 II, 및

5) 천마의 용매 조추출물에 부탄올을 첨가하여 얻은 부탄올 분획물 II.

특히, 천마의 알코올 수용액 추출물, 아세트산에틸 및 n-부탄올 분획물은 파크릴탁셀에 의해 유발된 신경원통증 쥐 모델에서 강력한 진통작용을 보였고, 이 효력은 대조약물인 가바펜틴(gabapentin)보다 월등한 강력한 진통효능을 보임을 확인하였다. 따라서 본 발명은 천마 추출물 중에 만성통증 억제 약리학적 활성 효과가 가장 우수한 천마의 추출물을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 만성통증 억제 활성을 갖는 천마의 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 천마 추출물은 천마의 잎, 줄기 및 뿌리로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 물, 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세트산에틸, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 및 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 천마 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 천마를 절단하고 물로 세척하여 협착물을 제거하고 건조시킨 후, 상기 천마의 중량에 대하여 약 5 내지 20 부피배, 바람직하게는 7 내지 15 부피배의 추출용매로 환류 추출한다. 추출 후 여과하여 여과액을 모은다. 추출 온도는 특별한 제한은 없지만 40 내지 110℃, 바람직하게는 55 내지 90℃인 것이 좋다.

추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 일예에서, 추출공정을 2회 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매, 약 5 내지 15 부피배, 바람직하게는 8 내지 12 부피배로 환류 추출한다. 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 여과액과 합쳐서 감압농축을 하여 천마 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.

상기 천마 추출물 제조 시에 사용되는 용매의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음의 정제단계에서 사용되는 용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있으므로, 용매의 사용량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.

이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질 하게 현탁시킨 후 동결건조하여 분말상태의 천마 추출물로서 제조될 수 있다.

본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기와 같은 천마 추출물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화,억제 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 천마 추출물은 천마의 용매 조추출물, 용매 분획물 및 칼럼 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다. 또한 상기 천마 추출물은 바람직하게는 화학식 1 내지 6의 화합물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 0.01 내지 30 중량%, 0.1 내지 30 중량%, 또는 1 내지 30중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 천마 추출물로부터 분리한 단일 화합물인 하기 화학식 1 내지 6의 화합물을 유효성분으로 포함하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

4-Hydroxybenzaldehyde

[화학식 2]

5-(hydroxymethyl)-furfual

[화학식 3]

1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)-ethanone

[화학식 4]

(4, 4'-dihydroxydiphenyl)methane

[화학식 5]

5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde

[화학식 6]

5-Hydroxymethyl-2-furoic acid

상기 만성통증은 신경변증성통증, 암통증, 당뇨병성통증 등 일수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 만성통증은 신경변증성통증이다.

본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 또는 0.1 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 40 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 혼합 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 생약 추출물 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 생약 추출물 함유 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.

본 발명의 생약 추출물 함유 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다. 본 발명의 혼합 추출물 함유 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기와 같은 천마 추출물을 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 건강 기능성 식품을 제공한다. 상기 건강 기능성 식품은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등일 수 있다.

상기 건강 기능성 식품에 함유된 유효성분으로서의 생약 추출물의 함량은 식품의 형태, 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

특히, 본 발명의 생약 조성물을 인체에 투여하는 경우 천연추출물의 일반적 특성에 비추어 볼 때 다른 합성 의약품에 비해 부작용의 염려가 없을 것으로 사료되며, 실제로 규격화된 생약 조성물에 대한 독성 시험 결과 생체에 아무런 영향이 없는 것으로 판명되었다.

본 발명은 천마 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 천마 추출물은 만성통증 억제 활성 등에서 우수한 효과를 나타내는바, 다양한 만성통증의 완화, 억제 및 치료에 유용한 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 3의 천마의 100% 에탄올 추출물(a-4)과 gabapentin의 만성통증 억제 효과를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 4의 천마 추출물의 아세트산에틸 분획물(c-2)의 만성통증 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 실시예 5의 천마 추출물로부터 단리된 화합물(com-1: 4-Hydroxybenzaldehyde, com-2: 5-(hydroxymethyl)-furfual, com-3: 1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)-ethanone)의 각각의 만성통증 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 천마 추출물의 제조

천마는 춘천의 대광약업사 및 서울의 (주)동의한방제약에서 구입하였고, 약재의 동정은 강원대학교 권용수 교수에 의해 이루어졌다.

1.1.용매 조추출물의 제조

천마 뿌리 각 100g을 다음의 방법으로 각 용매 1 L를 넣고 상온에서 2회 추출하였으며, 총 3일이 소요되었다. 추출 후 진공건조하였고, 건조 후의 얻은 추출물의 분말 양을 표 1에 표시하였다.

시료번호	사용용매	추출물 분말의 양
a-1	100% 물	4.1 g
a-2	30% 에탄올	26.2 g
a-3	70% 에탄올	17.7 g
a-4	100% 에탄올	2.9 g
a-5	70% 메탄올	18.0 g
a-6	100% 메탄올	8.1 g
a-7	70% n-프로판올	14.6 g
a-8	100% n-프로판올	0.6 g
a-9	70% n-부탄올	16.1 g
a-10	100% n-부탄올	2.3 g
b-1	n-헥산	0.1 g
b-2	에테르(ether)	0.1 g
b-3	아세트산에틸(ethyl acetate)	0.4 g
b-4	클로로폼(chloroform)	0.1 g
b-5	디클로로메탄(dichloromethane)	0.1 g
b-6	벤젠	0.1 g
b-7	아세트산에틸 (50%) + 벤젠 (50%)	0.4 g

1-2. 용매 분획물(1)의 제조

천마 10,000 g을 40 L의 90% 에탄올로 80℃에서 4시간씩 환류(reflux)를 3번씩하여 추출하고 진공건조하였다(870 g). 그 후, 4 L의 물에 녹인 후 다음의 용매로 순차적으로 분획한 후 진공건조하였다.

즉, 90% 에탄올 수용액의 조추출물을 순차적으로 n-헥산을 혼합하여 n-헥산분획물(c-1)을 획득하고, 남은 물분획물에 아세트산에틸을 혼합하여 아세트산에틸 분획물(c-2)을 획득하고, 다시 남은 물분획물에 디클로로메탄(50%) 및 n-부탄올 (50%)의 혼합용매로 얻어진 분획물(c-3)을 획득하고, 나머지 물 잔류물(water residue, c-4)으로 하였으며, 각각 용매 분획물의 건조분말의 양을 [표 2]에 기재하였다.

시료번호	사용용매	추출물 분말의 양
c-1	n-헥산	38.8 g
c-2	아세트산에틸	37.6 g
c-3	디클로로메탄 (50%) + n-부탄올 (50%)	30.3 g
c-4	물 잔류(water residue)	725.2 g

1-3. 용매 분획물(2)의 제조

천마 1,000 g을 70% 에탄올로 80℃에서 4시간씩 3번 추출하고 진공건조하였다 (388.8 g). 그 후, 1 L의 물에 녹인 후 n-헥산으로 분획하여 n-헥산 분획층을 버리고, 남은 극성용매층을 아세트산에틸로 분획하여 진공건조하여 건조분획물(30.6 g)을 얻었으며, 시료 d로 명명하였다.

1-4. 용매 분획물(3)의 제조

천마 1,000 g을 70% 에탄올로 80℃에서 4시간씩 3번 추출하고 진공건조하였다(362.2 g). 그 후, 1 L의 물에 녹인 후 n-헥산으로 분획하여 n-헥산 분획층을 버리고, 남은 극성용매층을 n-부탄올로 분획하여 진공건조하여 건조분획물(92.3 g)을 얻었으며, 시료 e로 명명하였다.

1-5. 용매 분획물(4)의 제조

천마 10,000 g을 35 L의 80% 에탄올로 80℃에서 4시간씩 3번씩 추출하고 진공건조하였다(960 g). 이 중 100 g을 1 L의 물에 녹인 후 아세트산에틸로 분획하고 진공건조하여 건조분획물 (18.8 g)을 얻었고 시료 f-1이라 명명하였다.

또한, 에탄올 추출물 800 g을 3 L의 물에 녹인 후 n-부탄올로 분획하여 진공건조하여 건조분획물 (233 g)을 얻었으며, 시료 f-2로 명명하였다.

실시예 2: 만성통증의 동물모델의 확립: Paclitaxel - induced neuropathic pain ( PINP )

실험동물은 Sprague-Dawley계 젊은 수컷 흰쥐(175-500g, Harlan Sprague-Dawley)를 사용하며, 12시간 간격으로 명암이 조절되는 우리에서 사육하며 물과 음식은 자유롭게 섭취하게 한다. 모든 동물은 도착 후 7일간의 적응기간을 거친 후 이상이 없는 것을 확인하고 실험하였다.

PAC(Taxol®, Sigma, St.Louis, MO, USA)는 DMSO에 50 mg/ml의 농도로 녹여 -80℃의 냉동고에 보관한다. 용액을 사용하기 전에 동량의 Tween 80 용액을 섞은 후 멸균 생리적 식염수를 넣어 농도가 2 mg/ml가 되게 한다. 체중 kg당 2 mg의 PAC를 흰쥐의 복강 내에 4회에 걸쳐 투여하였다 (0, 2, 4, 6 일, 총용량 8 mg/kg). 대조군으로 PAC이 없는 용매(4% DMSO and 4% Tween 80 in saline) 만을 투여한다.

그 후, 뒷발의 기계적 자극에 대한 감수성은 von Frey (VF) 필라멘트에 대한 50% 반응역치를 up-down method(Dixon, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20. 441, 1980; Chaplan et al., J. Neurosci. Methods 53, 55, 1994)를 이용하여 측정하였다. 흰쥐를 바닥에 철망이 깔린 플라스틱 우리(8.5 X 28 X 10 cm)에 넣고 15분간 적응시킨 뒤 VF 필라멘트를 뒷발의 가장 예민한 곳인 발바닥이나 3번째와 4번째 발가락 사이에 3 내지 4초간 수직으로 자극하여 쥐가 신속한 회피반응을 보이거나, 필라멘트를 떼면서 즉시 움찔하거나 발바닥을 핥으면 양성반응을 보인 것으로 간주한다.

총 8개의 VF 필라멘트를 사용한다(필라멘트 강도 3.65, 3.87, 4.10, 4.31, 4.52, 4.74, 4.92, 5.16이며 0.45, 0.76, 1.26, 2.04, 3.31, 5.50, 8.32, 14.45 gram에 해당). 시작은 4.31 필라멘트로 하고 양성반응을 보이면 강도가 약한 필라멘트를, 음성반응을 보이면 강도가 센 필라멘트를 사용하여 여섯 번의 검사를 하여 반응을 기록한다. 이 반응들을 이용하여 50% 역치를 계산한다 (50% 역치 = 10(X+kd)/104, 상기 X는 마지막에 적용한 필라멘트의 log단위이고, 상기 k는 양성/음성 반응 패턴 표에서 나타낸 값이며, 상기 d는 자극간의 차이의 평균값 (=0.22)을 의미함). 그래프에 기계적 자극에 대한 역치를 그램 값으로 표시한다. 통증의 측정은 시행하는 사람에 따라서 차이가 크므로 반드시 맹검(blind)을 유지하였다.

이와 함께, 시험약물의 진정작용 유발 여부를 측정하기 위해 투여 후 각 시간 별로 쥐의 자세와 반사를 기준으로 하여 판단하였다 (Devor and Zalkind, Pain 94, 101, 2001; Kim et al., Pain 111, 116, 2004).

자세를 통한 5가지 분류:

0 - 일상적인 자세와 양육, 털손질;

1- 적당한 무긴장증과 운동성 실종, 체중지탱은 하지만 움직이지 않음;

2 - 체중 지탱은 하지만 극심한 운동성 실종;

3 - 체중 지탱 불가인 근육 긴장 유지 및 약간 목적 지향 움직임 가능;

4 - 무긴장증 및 운동 시도가 없는 무움직임.

바로잡기반사를 통한 5가지 분류:

0 - 랫드를 옆으로 세우면 제세를 바로 세우기 위해 저항하며, 바로 빠르고 강력하게 자세를 바로 잡음;

1 - 렛드를 옆으로 세우면 자세를 중등도로 저항하며, 빠르게 그러나 약하게 자세를 바로 잡음;

2 - 렛드를 옆으로 세우면 저항하지 못하며, 자세를 바로 세우기 노력하여 최종적으로 자세를 바로 세움;

3 - 제세를 바로 세우지 못함;

4 - 움직이지 못함.

모든 실험에서 통증을 측정한 직후 즉시 투여하여 물질의 진정 작용을 측정함

실시예 3: 천마 추출물들의 만성통증 억제력의 검정

Paclitaxel 반복 복강주사 (2 mg/kg, 0, 2, 4, 6일; 총 8mg/kg)는 실험쥐의 통증역치 (50% mechanical threshold)를 정상치(통증역치 18.7 grams, 6 내지 8일)에서 서서히 감소시켜서 12 내지 14일에 0.8 grams까지 감소시켜서 통각과민(hyperalgesia)와 이질통(allodynia)를 일으키며, 이를 적어도 2달 반 이상 유지하였다(Kim et al., 2010). 통증역치 값은 임상환자의 통증 정도와 비교하면 로그 스케일(log scale)에 비례하여 나타나므로 도표의 y 축은 로그 스케일로 표시하였다.

실시예 1-1의 천마의 조추출물을 각 200 mg/kg으로 단회 경구투여 후에 통증의 감소 활성을 비교하였고 그 결과는 [표 3]에 나타내었다.

이 중 가장 강한 활성을 보인 100% 에탄올 추출물(a-4)은 경구투여 후 1, 1.5, 2, 및 3 시간 후에 역치 값을 각각 6.1, 10.5, 5.9, 3.3 grams으로 용매투여군에 비해 통계학적으로 유의적으로 증가시켜 통증을 감소시켰다 (도 2).

대조약물인 gabapentin을 100 mg/kg(진정작용이 없는 최대 용량) 경구투여 후 0.5, 1, 1.5, 2, 및 3 시간 후에 역치 값은 용매투여군에 비해 유의적으로 변화시키지 못하였다 (도 2). 1일 2회 반복 경구 투여 시 3일 후 역치를 최대 3.7 grams까지 유의적으로 증가시켜 진통작용을 보였다.

Treatment	투여량 (mg/kg)	최대 y 역치
대조군 (비처리)	-	1.5
Gabapentin	100 (단히투여)	1.6
a-1	200 (단회투여)	1.6
a-2	200 (단회투여)	1.4
a-3	200 (단회투여)	7.1*
a-4	200 (단회투여)	10.5*
a-5	200 (단회투여)	5,4*
a-6	200 (단회투여)	7.2*
a-7	200 (단회투여)	5.3*
a-8	200 (단회투여)	6.3*
a-9	200 (단회투여)	5.0*
a-10	200 (단회투여)	5.2*
b-1	100 (단회투여)	1.5
b-2	100 (단회투여)	1.8
b-3	100 (단회투여)	7.7*
b-4	100 (단회투여)	6.2*
b-5	100 (단회투여)	5.3*
b-6	100 (단회투여)	5.5*
b-7	100 (단회투여)	5.8*

n = 3 내지 6, *: P < 0.05, 대조군과 유의한 차이

이 결과는 천마의 수용성 알코올 추출물이 단회 투여에도 강력한 활성을 보인다는 것을 밝히는 발견이고, 이 중 에탄올 추출물의 활성이 가장 높게 나타났다. 반면 gabapentin의 활성은 미약하였다.

실시예 4: 천마 분획물들의 만성통증 억제력의 검정

실시예 1-2 내지 1-5에서 얻어진 천마의 분획물을 각 100 mg/kg으로 단회 경구투여 후에 통증의 감소 활성을 비교하였고 그 결과를 [표 4]에 나타내었다. 이 중 가장 강한 활성을 보인 아세트산에틸 추출물 (c-2, 100 mg/kg)은 경구투여 후 0.5, 1, 1.5, 2, 및 3 시간 후 역치값이 각각 3.4, 4.8, 9.5, 8.2, 3.2 grams으로, 용매투여군에 비해 유의적으로 증가한 강력한 진통작용을 나타내었다 (도 3).

Treatment	투여량(mg/kg)	최대 Y 역치
대조군 (비처리)	-	1.1
c-1	100 (단회투여)	1.4
c-2	100 (단회투여)	9.5*
c-3	100 (단회투여)	4.3*
c-4	100 (단회투여)	1.1
d	100 (단회투여)	8.1*
e	100 (단회투여)	6.2*
f-1	100 (단회투여)	9.1*
f-2	100 (단회투여)	8.0*

n = 3 내지 6, *: P < 0.05, 대조군과 유의한 차이

상기 표에서 나타난 바와 같이, 천마 추출물의 분획물은 진통작용을 보였으며, 특히 아세트산에틸 분획물(c-2, d, f-1) 및 n-부탄올 분획물(e, f-2)은 적은 용량에서도 가장 강력한 만성통증 억제 활성을 보였다.

또한, 만약 진정작용이 유발되면 동물은 움직임이 없고 누워있는 상태로 거의 마취상태와 비슷하므로, 환자에게 진정작용이 유발되면 잠에 취해 누워있는 상태로 일상적인 활동이 불가능하다. 따라서 만성통증환자에 대해 진정작용이 없이 진통효과를 보이는 것이 중요한바, 본원 발명의 천마의 에탄올 추출물(a-4)과 아세트산에틸 추출물(c-2)은 투여 용량에서 움직임과 반사 정도에서 "0"을 보여 진정작용을 보이지 않았다. 따라서 추출물의 역치 증가는 진통작용으로 사료되었으며, 대조약물인 gabapentin도 투여용량에서 진정작용을 보이지 않았다.

실시예 5: 활성 물질의 분리 및 구조결정

실시예 4의 활성 검정 결과에 따라, 실시예 1-2에서 얻어진 시료 c-2 아세트산에틸 분획물로부터 실리카겔 컬럼을 이용하여 물질을 분리하였다. 구체적으로, 아세트산에틸 분획물로부터 활성물질을 분리하기 위하여 EtOAc 가용성 분획 37 g을 실리카겔 컬럼 (500g, Merck, 63-200㎛, 7 x 50 cm)에 넣고 n-헥산 : EtOAc (3 : 2)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 7개의 분획을 각각 얻었다.

분획 3(2.5 g)을 다시 실리카겔 컬럼(200 g, Merck, 63-200㎛, 5 x 50 cm)에 걸어 n-헥산 : EtOAc (3 : 1)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 소분획 각각 얻었다. 소분획 3-2 (0.3g)을 다시 실리카겔 컬럼 (30g, Merck, 40-63 ㎛, 3 x 20 cm)에 걸어 CHCl₃ : MeOH (34:1)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 1 (215 ㎎, 4-hydroxybenzaldehyde)를 얻었다. 소분획 3-4 (1.1g)를 다시 실리카겔 컬럼 (150g, Merck, 40-63 ㎛, 3 x 50 cm)에 넣고 CHCl₃ : MeOH (34:1)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 소분획 3-4-1부터 3-4-4까지 4개의 분획을 얻었다. 이 중 소분획 3-4-2 (0.15g)을 ODS 컬럼 (30g, YMC-Gel ODS-A, s-150㎛, 3 x 20 cm)에 넣고 MeOH : H₂O (50:50)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 3 (95 ㎎, 1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)-ethanone)을 얻었으며, 소분획 3-4-3 (0.7 g)을 ODS 컬럼 (70g, YMC-Gel ODS-A, s-150㎛, 3 x 50 cm)에 넣고 MeOH : H₂O (50:50)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 4(184 ㎎, 4,4'-dihydroxydiphenyl-methane)를 얻었다.

분획 4(3.5 g)를 실리카겔 컬럼 (200g, Merck, 63-200㎛, 5 x 50 cm)에 넣고 CHCl₃ : MeOH (34:1)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 소분획 4-1부터 4-5까지 5개의 소분획으로 나누었다. 소분획 4-4 (1.6g)을 ODS 컬럼(70g, YMC-Gel ODS-A, s-150㎛, 3 x 50 cm)에 넣고 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 화합물 5 (125 ㎎, 5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde)를 얻었다.

분획 5 (9.8 g)를 실리카겔 컬럼 (300g, Merck, 63-200㎛, 7 x 50 cm)에 넣고 n-헥산 : EtOAc (3 : 2)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 5개의 소분획으로 나누고 소분획 5-3 (2.5g)을 실리카겔 컬럼 (150g, Merck, 40-63 ㎛, 5 x 50 cm)에 넣고 n-헥산 : EtOAc (3 : 1)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 반복 실시하여 화합물 2 (980 ㎎, 5-(hydroxymethyl)-furfural)를 얻었다.

분획 6 (7.3 g)을 ODS flash 컬럼 (130g, RediSep®, Teledyne Isco)에 넣고 MeOH : H₂O (30:70)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 6-1부터 6-5까지 5개의 소분획으로 나누었다. 소분획 6-2 (0.8g)을 ODS flash 컬럼 (130g, RediSep®, Teledyne Isco)에 넣고 MeOH : H₂O (10:90)을 용매로 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 6-2-1부터 6-2-6까지 6개의 소분획으로 나누었다. 이 중 소분획 6-2-2 (0.4g)을 sephadex LH20 컬럼 (30g, 3x50cm)에 넣고 MeOH : H₂O (40:60)을 용매로 정제하여 화합물 6 (130 ㎎, 5-hydroxymethyl-2-furoic acid)를 얻었다.

이들의 구조는 다음의 기기분석치와 기존 보고된 문헌치를 비교하여 결정하였고 (화합물 1: Xiao등, China Journal of Chinese Materia Medica, 27, 35-36, 2002; 화합물 2: Shen and Mu, Planta Medica, 56, 472-474, 1990; 화합물 3: Lee등, Planta Medica, 73, 1287-1291, 2007; 화합물 4: Taniguchi 등, Chem. Pharm. Bull., 29, 55-62, 1981, Fisher등, Magnetic resonance in chemistry, 40, 747-751, 2002; 화합물 5: Lee등, Planta Medica, 73, 1287-1291, 2007; 화합물 6: Yang등, Pharmaceutical Biology, 48, 589-594, 2010).

상기 실시예에서 단리된 화합물 각각의 구조식을 하기에 구체적으로 기재하였다.

화합물 1 (4-Hydroxybenzaldehyde)

[화학식 1]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD, ppm)

9.76 (1H, s, CHO), 7.77(2H, d, J=8.8Hz, H-2, H-6), 6.91(2H, d, J=8.8Hz, H-3, H-5)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

192.84 (CHO), 165.20(C-4), 135.45(C-2, C-6), 130.95(C-1), 116.89(C-3, C-5)

화합물 2 (5-(hydroxymethyl)-furfual)

[화학식 2]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD, ppm)

9.53 (1H, s, CHO), 7.20(1H, d, J=3.6Hz, H-3), 6.49(1H, d, J=3.6Hz, H-4), 4.68(2H, s, CH₂OH)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

177.82 (CHO), 161.01(C-5), 152.23(C-2), 123.30(C-3), 110.02(C-4), 57.43(CH₂OH)

화합물 3 (1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)-ethanone)

[화학식 3]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD,ppm)

7.76 (1H, d, J=1.0Hz, H-5), 7.38 (1H, d, J=3.6Hz, H-3), 7.12 (2H, d, J=8.4Hz, H-2', H-6'), 6.76 (2H, d, J=8.4Hz, H-3', H-5'), 6.61 (1H, dd, J=3.4, 1.0Hz, H-4), 3.94 (2H, s, 7-CH₂)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

187.98 (C-6, C=O), 156.10(C-4'), 152.08(C-2), 147.47(C-5), 130.24(C-2', C-6'), 125.03(C-1'), 118.75(C-3), 115.04(C-3', C-5'), 112.21(C-4), 33.23(C-7,CH₂)

화합물 4 (4, 4'-dihydroxydiphenyl)methane

[화학식 4]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD, ppm)

7.08 (4H, d, J=8.5Hz, H-2, H-6/H-2', H-6'), 6.71 (4H, d, J=8.5Hz, H-3, H-5/H-3', H-5'), 3.51 (2H, s, CH₂)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

156.95 (C-4/C-4'), 130.53 (C-2, C-6/C-2', C-6'), 129.87 (C-1/C-1', 115.42 (C-3, C-5/C-3', C-5'), 34.77 (CH₂)

화합물 5 (5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde)

[화학식 5]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD, ppm)

9.50 (1H, s, CHO), 7.32 (1H, d, J= 3.7Hz, H-3), 7.15 (2H, d, J=8.4Hz, H-2', H-6'), 6.76 (2H, d, J=8.4Hz, H-3', H-5'), 6.56 (1H, d, J= 3.7Hz, H-4), 4.48 (2H, s, 7-CH₂OH), 4.43(2H, s, 7'-CH₂OH)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

178.22 (C-6), 158.81 (C-5), 157.05 (C-4'), 152.70 (C-2), 129.64 (C-2', C-6'), 128.27 (C-1'), 123.17 (C-3), 114.85 (C-3', C-5'), 111.37 (C-4), 72.21 (C-7'), 63.09 (C-7)

화합물 6 (5-Hydroxymethyl-2-furoic acid)

[화학식 6]

¹H-NMR (600MHz, CD₃OD, ppm)

7.15 (1H, d, J=3.4Hz, H-3), 6.45 (1H, d, J=3.4Hz, H-4), 4.56 (2H, s, CH₂OH)

¹³C-NMR (150MHz, CD₃OD, ppm)

160.42 (C=O), 159.29(C-2), 144.34(C-5), 118.54(C-3), 108.81(C-4), 56.13(CH₂OH)

실시예 6: 천마 추출물 중 성분 함량 분석

실시예 5의 5-(hydroxymethyl)-furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, Bis(4-hydroxyphenyl)methane, 1-furan-2-yl-2(4-hydroxyphenyl)-ethanone, 5-hydroxymethyl-2-furoic acid, 5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde 이 천마 추출물 및 분획물에 함유되어 있음을 확인하였고, 실시예 4에서 강력한 만성통증 억제 활성을 보인 아세트산에틸 분획물 (c-2, d, f-1) 및 n-부탄올 분획물(e, f-2)에 대해 성분 함량을 HPLC를 이용하여 다음과 같이 이화학적 분석 시험을 진행하였다.

고속액체크로마토그래피는 워터스 얼라이언스 2695 모델로 피디에이(PDA)를 이용하여 측정하였다. 컬럼은 워터스 시메터리 C18(Waters Symmetry C18 250 X 4.6 mm, 5 ㎛)를 사용하였고, 시료 온도는 25℃, 컬럼온도는 40℃를 유지하였다. 시료농도는 10mg/ml로 제조하여 10ul를 주입하였으며, 유속은 1.0 mL/min으로 분석하였다. 또한 표준물질은 5-(hydroxymethyl)-furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, Bis(4-hydroxyphenyl)methane은 상용화된 것을 구입하여 사용하였으며, 1-furan-2-yl-2(4-hydroxyphenyl)-ethanone, 5-hydroxymethyl-2-furoic acid, 5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde는 천마로부터 분리, 정제하여 사용하였다. 이동상은 Ammonium Formate 6.5 g을 물 1 L에 넣어 녹인 후 Formic acid로 pH 4.5±0.05로 맞춘 액과 메탄올을 95:5로 혼합한 액(용액A)과 메탄올(용매B) 의 gradient 조건으로 0~10분(A:B=94:6~94:6), 10~30분(A:B=94:6~60:40), 30~40분(A:B=60:40~60:40), 40~50분(A:B=60:40~10:90), 50~55분(A:B=10:90~10:90), 55~56분(A:B=10:90~94:6), 56~65분(A:B=94:6~94:6)으로 분석하였다. 그 결과는 다음의 [표 5]에 나타내었으며, 추줄물 중의 활성성분 함량의 계산은 각각의 표준물질에 대한 면적비를 중량백분율로 나타내었으며, 즉 분석대상 추출물 총중량에 대해 대상 단일 화합물의 중량을 퍼센트로 표시한 중량%이다.

	성분별 함량 (중량%)
	4-hydroxybenzaldehyde	5-(hydroxymethyl)-furfural	1-furan-2-yl-2(4-hydroxyphenyl)-ethanone	Bis(4-hydroxyphenyl)methane	5-hydroxymethyl-2-furoic acid
c-2	0.18	0.16	0.02	0.02	0.02
d	0.16	0.13	0.01	0.01	0.01
f-1	0.17	0.14	0.03	0.01	0.02
e	0.15	0.15	0.01	0.02	0.01
f-2	0.16	0.16	0.02	0.02	0.02

실시예 7: 단리물질들의 만성통증 억제력의 검정

실시예 3 및 4의 결과, 가장 활성이 높은 분획 c-2로부터 활성물질을 찾기 위하여, 실시예 2의 방법으로 얻은 단리물질들의 활성을 검정하기 위해, 랫드에 PAC을 주사한 후 통증이 완전히 우발된 25일에 시험물질을 각각 30 mg/kg 또는 100 mg/kg을 경구투여하였고, 그 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4시간에 통증역치를 측정하였다. 그 결과는 다음의 [표 6] 및 [도 3]에 나타내었다.

treatment	투여량 (mg/kg)	최대 Y 역치
대조군 (비처리)	-	1.1
gabapentin	100 (단회투여)	1.6
5-hydroxymethyl)-furfural	100 (단회투여)	3.8*
4-hydroxybenzaldehyde	30 (단회투여)	3.6*
Bis(4-hydroxyphenyl)methane	30 (단회투여)	4.4*
1-furan-2-yl-2(4-hydroxyphenyl)-ethanone	100 (단회투여)	3.6*
5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde	100 (단회투여)	1.3
5-hydroxymethyl-2-furoic acid	100 (단회투여)	3.0*

n = 6, *: P < 0.05, 대조군과 유의한 차이

상기 표에서 나타난 바와 같이, 단리된 물질인 5-(hydroxymethyl)-furfural, 4-hydroxybenzaldehyde, Bis(4-hydroxyphenyl)methane, 1-furan-2-yl-2(4-hydroxyphenyl)-ethanone, 5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde, 5-hydroxymethyl-2-furoic acid가 비처리 대조군에 비해 유의적으로 역치값을 증가시켜 강력한 진통작용을 나타내어, 만성통증에 대한 억제력을 보였기에 이들이 활성물질이라는 것을 확인하였다.

실시예 8. 급성독성의 검정

급성독성을 검정하기 위하여, 시료 a-4, 시료 c-2, 시료 e를 대상으로 하였다. 암, 수의 ICR mice (6주령, 나라바이오택 구입, SPF)에 a-4와 c-2를 각각 500 mg/kg, 1 g/kg, 2 g/kg으로 경구투여하고 일주일 간 관찰하였으나, 이상행동을 하거나, 죽은 개체는 없었다. 그러므로 이들 조성물들은 안전하게 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

상기 실시예의 결과, 천마의 수용성 알코올 추출물, 아세트산에틸 및 n-부탄올 분획물은 paclitaxel에 의해 유발된 신경원통증 쥐 모델에서 강력한 진통작용을 보였고, 이 효력은 대조약물인 gabapentin보다 월등한 강력한 진통효능을 보임을 발견하였다.

특히 상기 단리된 화합물을 주성분으로 함유한 분획은 강력한 만성통증치료제로 사용할 수 있다. 이들 결과는 최초의 발명으로써, 만성통증치료제로의 활성의 강력함은 현재까지의 치료제에 비해 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

Claims (18)

1. 5-(하이드록시메틸)-푸르푸랄 (5-(hydroxymethyl)-furfural), 4-하이드록시벤즈알데하이드 (4-hydroxybenzaldehyde), 비스(4-하이드록시페닐)메탄 (Bis(4-hydroxyphenyl)methane), 1-퓨란-2-일-2-(4-하이드록시페닐)에탄온 (1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)- ethanone), 5-(4-하이드록시벤질옥시메틸)-퓨란-2-카르발데히드 (5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde), 및 5-하이드록시메틸-2-푸로산 (5-hydroxymethyl-2-furoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 천마(Gastrodia elata)의 추출물을 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 천마에 물, 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세트산에틸, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 및 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 천마 조추출물인, 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 추출물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 천마 조추출물인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 천마에 물, 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세트산에틸, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 및 벤젠으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하여 얻어진 천마 조추출물을,
   헥산, 아세트산에틸, 디클로로메탄 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 이용한 용매 분획물인, 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 용매 분획물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물에 순차적으로 헥산, 아세트산에틸, 클로로메탄 및 부탄올로 용매분획하여 얻어지는, 아세트산에틸 분획물, 클로로메탄 분획물, 부탄올 분획물, 또는 클로로메탄과 부탄올의 혼합용매 분획물인, 조성물.
6. 제4항에 있어서, 상기 용매 분획물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물에 순차적으로 헥산 및 아세트산에틸로 용매분획하여 얻어지는 아세트산에틸 분획물인 조성물.
7. 제4항에 있어서, 상기 용매 분획물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물에 순차적으로 헥산 및 부탄올로 용매분획하여 얻어지는 부탄올 분획물인 조성물.
8. 제4항에 있어서, 상기 용매 분획물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물에 아세트산에틸로 용매분획하여 얻어지는 아세트산에틸 분획물인 조성물.
9. 제4항에 있어서, 상기 용매 분획물은 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물에 부탄올로 용매분획하여 얻어지는 부탄올 분획물인 조성물.
10. 삭제
11. 제1항에 있어서, 상기 천마 추출물은 5-(하이드록시메틸)-푸르푸랄(5-(hydroxymethyl)-furfural). 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 비스(4-하이드록시페닐)메탄(Bis(4-hydroxyphenyl)methane), 1-퓨란-2-일-2-(4-하이드록시페닐)에탄온(1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)- ethanone), 5-(4-하이드록시벤질옥시메틸)-퓨란-2-카르발데히드(5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde), 및 5-하이드록시메틸-2-푸로산(5-hydroxymethyl-2-furoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 0.01 내지 10 중량%로 포함하는 것인 조성물.
12. 5-(하이드록시메틸)-푸르푸랄(5-(hydroxymethyl)-furfural). 4-하이드록시벤즈알데하이드(4-hydroxybenzaldehyde), 비스(4-하이드록시페닐)메탄(Bis(4-hydroxyphenyl)methane), 1-퓨란-2-일-2-(4-하이드록시페닐)에탄온(1-furan-2-yl-2-(4-hydroxyphenyl)-ethanone), 5-(4-하이드록시벤질옥시메틸)-퓨란-2-카르발데히드(5-(4-hydroxybenzyloxymethyl)-furan-2-carbaldehyde), 및 5-하이드록시메틸-2-푸로산(5-hydroxymethyl-2-furoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 유효성분은 전체 조성물 기준으로 0.1 내지 99.9% (w/w) 포함된 것인, 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
14. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만성통증은 신경변증성통증, 암통증, 당뇨병성통증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
15. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제, 또는 멸균 주사용액으로 제형화된 것인, 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
16. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 1일 투여량은 유효성분 함량 기준으로 0.1 내지 500mg/kg인, 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 조성물.
17. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 만성통증 완화 또는 억제용 식품 조성물.
18. 제1항 내지 제9항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 함유하는 만성통증 완화, 억제 또는 치료용 약학 조성물.

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