KR20130088783A

KR20130088783A - 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20130088783A
Application number: KR1020130009419A
Authority: KR
Inventors: 김선영; 김선희; 최진용
Original assignee: 주식회사 바이로메드
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2013-08-08
Also published as: WO2013115534A1

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 위령선(Clematidis Radix) 추출물 또는 오가피(Acanthopanax) 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 다발성 경화증의 마비증상을 완화시키고, 수초 파괴 또는 신경 염증과 관련된 사이토카인의 생체 내 조절을 통해 다발성 경화증을 억제하는데 우수한 작용을 한다. 또한, 본 발명의 조성물은 이미 생체 안전성이 입증된 위령선 및 오가피 추출물을 유효성분으로 이용하기 때문에 인체에 매우 안전하다.

Description

다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Multiple Sclerosis}

본 발명은 다발성 경화증의 예방, 개선 또는 치료를 위한 생약 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 위령선 또는 오가피 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 개선용 조성물에 관한 것이다.

다발성 경화증은 중추신경계의 탈수초성 질환(demyelinating disease; 신경세포의 축삭을 둘러싸고 있는 절연물질인 수초가 탈락되는 질병) 중 가장 흔한 유형이며, 주로 젊은 연령층에서 발생하는 만성 염증성 질환이다. 수초(myelin sheath)란 신경세포의 축삭(axon)을 둘러싸고 있는 절연물질이며, 수초가 벗겨져 탈락될 경우 신경신호의 전도에 이상이 생기고, 해당 신경세포가 죽게 된다. 임상적으로 재발과 완화를 반복하는 질환이며, 초기에는 재발한 후 장애 없이 증상이 호전되지만 시간이 지나고 재발이 반복되면 완전히 호전되지 않고 장애가 남는다. 발병 초기에 치료를 시작하면 자연적으로 치유될 때보다 좋은 결과를 얻을 수 있다.

다발성 경화증의 원인은 아직 밝혀지지 않았지만, 유전적 요인이 있는 환자에게서 주위 환경에 의해 일어나는 자가면역반응이 다발성 경화증의 발병에 주요하게 작용하는 것으로 추정된다. 유전적 요인이 있다는 것은 질병이 유전됨을 의미하는 것이 아니라, 어떤 유전적 인자가 그 질병의 감수성을 결정짓는다는 것을 말한다. 질병의 감수성을 결정하는 데는 하나의 우성유전자가 아닌 여러 개의 유전자가 관여할 것이라고 생각되고 있다.

다발성 경화증은 주로 뇌실 주위의 백색질 및 척수 등에 염증 세포가 침투하여 발생한다. 이러한 중추신경계의 염증세포 침윤(침투)는 자가면역체계의 이상에 의해 생기는 것으로 생각된다. 특히 염증성 T 세포에 의해 중추신경계 내에서 미세아교세포나 대식세포, 성상세포 등이 활성화되면 TNF-α나 IL-1β와 같은 염증성 분자들의 발현이 증가하여 희소돌기아교세포의 세포사멸과 탈수초화를 촉진시킨다고 알려져 있다. 또한 이 자극에 의해 생산된 기질 분해 효소 (MMPs)들은 혈액뇌장벽 (blood brain barrier)의 분해를 촉진시켜 다발성 경화증의 증세를 악화시킨다고 보고되었다.

다발성 경화증의 치료는 크게 급성기 치료와 장기적인 질병완화 치료, 그리고 증상완화 치료로 나눌 수 있다. 급성기에는 일반적으로 고용량 스테로이드의 정맥주사 요법을 사용한다. 스테로이드는 급성기에 증상을 완화시키고 회복 기간을 줄여주지만, 장기적으로 투여할 경우에는 다양한 부작용이 나타날 수 있으므로 사용에 주의를 요한다. 여러 가지 원인에 의해 질병완화 치료를 하기 어려운 환자들은 저용량 스테로이드 유지 요법을 사용하기도 한다.

대표적인 질병완화 치료제로는 인터페론(beta-interferon)과 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate)가 있다. 이들은 재발완화형 다발성 경화증에서 재발하는 횟수를 줄이고, 재발 시에 나타나는 증상을 완화하는 효과를 가지고 있다. 그러나 이차진행형으로 전환된 환자에서는 뚜렷한 효과가 나타나지 않기 때문에 이 경우에는 환자의 장애를 예방하기 위한 조기 치료가 가장 중요하다. 다발성 경화증으로 인해 나타나는 여러 증상과 신경학적 장애를 줄여주기 위한 증상완화 치료도 시행한다.

상기와 같이 다발성 경화증을 치료하기 위한 여러 약제들이 개발되어 있으나, 현재까지 개발된 약제들은 재발율이 높으며, 재발을 확실하게 방지하는 방법은 없는 상황이다. 또한, 상기 약제들의 경우 여러 차례 피하 투여할 필요가 있고, 발열·피하 궤양 등의 부작용이 문제가 되며, 환자 순응도 측면에서도 환자에게 큰 부담이 되기 때문에, 경구 투여 가능한 약제의 개발이 절실한 상황이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 부작용이 없으면서 경구투여 가능한 조성물로서 다발성 경화증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였고, 이러한 물질을 가능한 천연물에서 얻으려 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 위령선 및 오가피 추출물을 포함하는 조성물이 다발성 경화증의 억제에 효과적이라는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다발성 경화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유효성분으로서 약제학적 유효량의 위령선(Clematidis Radix) 추출물 또는 오가피(Acanthopanax) 추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 위령선(Clematidis Radix) 추출물 또는 오가피(Acanthopanax) 추출물을 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 위령선 및 오가피 추출물을 포함한다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 위령선 및 오가피 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미하며, 본 발명의 목적을 달성하는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 제시하는 유효성분인 위령선 및 오가피는 각각 다음과 같은 특성과 구체적인 작용을 가지고 있다:

위령선(威靈仙, Radix Clematidis)은 미나리 아재비과(Ranunculaceae)에 속하는 다년생 낙엽성 식물인 으아리(Clematis mandshurica MAXIM., Clematis mandshurica RUPR.), 외대 으아리(Clematis brachyura MAXIM.), 참으아리(Clematis paniculata THUNB.), 철선련(Clematis florida THUNB.) 큰꽃으아리(Clematis patens MORREN.) 및 동속 근연식물의 뿌리 및 뿌리줄기를 건조한 것으로, 중국에서는 위령선(C. chinensis OSBECK.)와 좁은 입사위 질빵(C. hexapetala PALL.)을 함께 기원으로 한다. 알려진 약리작용으로는 진통작용, 항말라리아 작용, 항균작용, 유산작용, 담즙분비 촉진작용, 평활근 이완작용, 항이뇨작용, 강심 및 혈압강하작용 등이 있다고 알려져 있다(Chinese Materia Medica, Chemistry, Pharmacology and Application, You-Ping Zhu, 1998). 하지만, 위령선이 다발성 경화증에 효과가 있다는 보고는 없는 상태이다.

오가피(五加皮, Acanthopanax)는 오갈피라고도 불리며 아칸토파낙스 센티코서스(Acanthopanaxsenticosus), 아칸토파낙스 세실리슬로루스(Acanthopanax sessiliflorus), 아칸토파낙스 그라실리스틸루스(Acanthopanax gracilistylus), 아칸토파낙스 키사넨시스(Acanthopanax chiisanensis), 아칸토파낙스 코레아눔(Acanthopanax koreanum), 아칸토파낙스 루피네르브(Acanthopanax rufinerve), 아칸토파낙스 세울렌스(Acanthopanax seoulense) 또는 아칸토파낙스 시에볼디아눔(Acanthopanax sieboldianum)을 포함한다. 식물 분류학적으로 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 낙엽 관목이며, 동속 식물의 뿌리껍질은 약용으로 이용되고 있다. 오가피에 함유된 리그난(lignan) 계통의 아칸토시드(acanthoside) B 및 D(eleutheroside E)는 강장, 당질 및 지방대사, 알코올 해독, 식욕 증진, 혈액 순환, 보온, 변비 개선 및 지방간에 유효하며, 아칸토시드 A와 C는 골수 조절, 백혈구 증가(면역, 저항력 향상), 알러지성 질환 개선, 암 치료 후 빠른 회복에 효과가 있다고 알려져 있다(육창수, 약학회지, 40(3), pp251-261, 1996). 하지만, 오가피가 다발성 경화증에 효과가 있다는 보고는 없는 상태이다.

일 예에 따르면, 본 발명의 조성물에 추가되는 위령선 추출물의 함량은 전체 추출물 중량에 대하여 1-99 중량%로 포함될 수 있다.

다른 일 예에 따르면, 오가피 추출물은 위령선 추출물 1 중량부에 대하여 0.5 내지 2 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 위령선 및 오가피 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 얻은 추출, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 추출도 본 발명의 위령선 및 오가피 추출물에 포함된다.

본 발명의 위령선 및 오가피 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 육계 및 천마 추출물을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 육계 및 천마에 대해 자세히 살펴보면 다음과 같다:

육계(肉桂, Cinnamon)는 육계나무(Cinnamomum loueirii NEES) 또는 계피나무(C. cassia PRESL, Cinnamomum aromaticum Nees .)의 간피(幹皮) 또는 지피(枝皮)이다. 계피나무의 껍질에는 정유(cassa oil) 1 내지 2%가 함유되어 있고 그 중요성분은 계피(桂皮) 알데히드(aldehyde)로 75 내지 90%, 또 소량의 계피 알코올 초산(醋酸) 에스테르(ester), 페닐프로파놀(phenylpropanol) 초산 에스테르 등이다. 또한 점액, 탄닌(tannin)등이 함유되어 있다. 육계는 중추신경계에 작용하고, 하압작용, 주혈흡충병(住血吸蟲病)의 예방작용 또한 계피유에는 강한 항균작용이 있다고 알려져 있다(정보섭, 신민교저, 향약대사전, 영림사, pp453-455, 1998).

천마(天麻, Gastrodia)는 난초과(Orchidaceae)의 천마(Gastrodia elata BLUME)의 근경 외피를 제거하고 쪄서 건조한 것을 일컫는 말로, 예로부터 두통의 요약으로 분류되어 두통, 어지러움 등의 치료에 사용되어 왔다(상용약용식물도감, 박종희·이정규 공저, 신일상사, pp424-425, 2000 ; 중약본초학, 보건신문사, pp602-604, 1998). 천마는 또한 귀독우(鬼督郵), 독요지(獨搖芝), 신초(神草), 이모(離母), 적전(赤箭), 적전지(赤箭芝), 정풍초(定風草), 합리초(合離草), 명천마(明天麻), 수양우(水洋芋) 라고도 한다. 상기 천마(Gastrodia)는 가스트로디아 엘라타(Gastrodiaelata),가스트로디아 아프리카나(Gastrodia Africana),가스트로디아 아펜디큘라타(Gastrodia appendiculata), 가스트로디아 아우툼날리스(Gastrodia autumnalis), 가스트로디아 컨퓨즈(Gastrodia confuse), 가스트로디아 플라필라벨라(Gastrodia flavilabella), 가스트로디아 폰티날리스(Gastrodia fontinalis), 가스트로디아 그라실리스(Gastrodia gracillis), 가스트로디아 히에마일스(Gastrodia hiemails), 가스트로디아 자바니카(Gastrodia javanica), 가스트로디아 페이차티데니아나(Gastrodia peichatieniana), 가스트로디아 푸빌라비아타(Gastrodia pubilabiata), 가스트로디아 세사모이데스(Gastrodia sesamoides), 및 가스트로디아 테아나(Gastrodia theana)를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 추가적으로 포함되는 육계 및 천마 추출물은 당업자가 원하는 목적에 따라 그 함량을 자유롭게 조절하여 사용할 수 있다.

일 예에 따르면, 본 발명의 조성물에 추가되는 육계 추출물은 위령선 추출물 1 중량부에 대하여 0.2 내지 2 중량부로 포함될 수 있으며, 천마 추출물은 위령선 추출물 1 중량부에 대하여 0.2 내지 1 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 면역세포의 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)의 발현을 억제하거나 또는 염증 매개자(mediator)인 일산화질소(nitric oxide)의 생성을 억제함으로써 항염증 활성을 나타낸다. 상기 면역세포는 대식세포(macrophase) 또는 임파구(lymphocyte)이며, 상기 임파구는 CD4+ 임파구이다.

한편, 상기 염증성 사이토카인은 예컨대, IL-1β, IL-17, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2, TGF- β1, TNF-α 또는 인터페론-감마 등 공지된 다양한 사이토카인을 포함한다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β 또는 IL-17이다. 특히, 본 발명의 조성물은 IL-17 프로모터 활성을 조절하는 전사인자로 알려진 RORα의 RNA 발현을 억제함으로써 항염증 활성을 나타낸다. 즉, 본 발명의 조성물은 대식세포에서 염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현을 억제하고 염증 매개자인 일산화질소의 생성을 억제하며, CD4+ 임파구 세포에서 RORα의 발현을 억제함으로써 IL-17 프로모터 활성을 감쇠시켜 항염증 활성을 나타낸다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-1000 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로도 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 위령선 및 오가피 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 위령선 및 오가피 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 위령선 및 오가피 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 천연물로서 인체에 부작용이 거의 없기 때문에, 다발성 경화증 개선에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 위령선 또는 오가피 추출물을 포함하는 다발성 경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물은 경구 투여가 가능하여 인체 내 효과적인 전달이 가능하며, 인체에 부작용이 거의 없다.

도 1은 본 발명의 실시예 1과 2의 복합생약 조성물인 MC-2 및 MC-4를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 2는 자가면역 뇌척수염 마우스 모델의 실험 과정 및 생약조성물을 처리하여 마비 증상 및 신경 염증 완화 효과를 조사하는 실험을 나타낸 모식도이고,
도 3a-3d는 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 실시예 1과 2의 복합생약 조성물을 투여시에 대조군과 비교하여 생약 조성물의 마비 증상 완화 효과를 조사한 그래프이고,
도 4는 자가면역 뇌척수염 마우스 모델에서 얻은 비장세포를 MOG로 재자극 하였을 때 생산되는 IL-17 사이토카인에 대한 억제 효과를 나타내는 그래프이고,
도 5는 마우스 대식 세포주에서 MC-2의 항염증 효과를 조사하는 세포 실험을 나타낸 모식도이고,
도 6a 및 6b는 마우스 대식세포주(mouse macrophage)인 Raw264.7 세포에서 MC-2에 의한 염증성 사이토카인 IL-1β와 염증성 매개체 NO(nitric oxide)의 생산 억제 효과를 나타낸 그래프이고, 도 6c는 마우스 대식세포주 인 Raw264.7 세포에서 MC-4, MC-4-1, MC-4-2 및 MC-4-3에 의한 염증성 사이토카인 TNF-α 생산 억제 효과를 나타낸 그래프이며,
도 7은 마우스 CD4+ 임파구 세포에서 MC-2에 의한 염증성 사이토카인 IL-17의 생산 억제 효과를 나타낸 그래프이고,
도 8은 마우스 EL4 임파구 세포주에서 MC-2에 의한 IL-17의 생산 억제를 나타낸 그래프이며,
도 9는 마우스 EL4 임파구 세포주에서 MC-2에 의한 IL-17과 전사인자인 RORα의 RNA 발현 억제를 나타낸 것이고,
도 10은 마우스 EL4 임파구 세포주에서 MC-2에 의한 IL-17의 프로모터 활성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 11 및 도 12는 각각 인간 연골세포주에서 MC-4, MC-4-1, MC-4-2 및 MC-4-3에 의한 단백질 분해 효소의 전구체인 pro-MMP-1 및 pro-MMP-13의 생산 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 냉침 추출법에 의한 극성 용매 가용 추출물의 제조(MC-2)

경동시장 (한국)에서 구입하고 경희대학교 한약학실로부터 검증을 받은 건조 상태의 위령선(Clematis chinensis)과 오가피(Acanthopannax senticosus)를 각각 60 g 씩 동량으로 혼합한 다음 이 혼합 생약재에 1.2 ℓ의 25% 에탄올을 가해 상온(약 23℃)에서 3일간 교반추출한 후, 여액을 8 ㎛ 필터로 여과하여 40-60℃로 생약추출물을 감압 농축한 다음에 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 16 g을 얻어 이를 시료로 사용하였다(도 1).

실시예 2. 냉침 추출법에 의한 극성 용매 가용 추출물의 제조(MC-4)

경동시장(한국)에서 구입하고 경희대학교 한약학실로부터 검증을 받은 건조 상태의 위령선과 오가피를 각각 48 g 씩 동량으로 혼합하고 육계(Cinnamomum aromaticum) 및 천마(Gastrodia elata)를 12 g 씩 혼합한 다음 이 혼합 생약재에 1.2 ℓ의 25% 에탄올을 가해 상온(약 23℃)에서 3일간 교반추출한 후, 여액을 8 ㎛ 필터로 여과하여 40-60℃로 생약추출물을 감압 농축한 다음에 동결 건조시켜 생약조성물 분말 엑스 17 g을 얻어 이를 시료로 사용하였다(도 1).

실시예 3. 냉침 추출법에 의한 극성 용매 가용 추출물의 제조(MC-4-1)

위령선과 천마를 각각 23.16 g씩, 오가피 및 육계를 36.84 g씩 혼합한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 추출하여 생약조성물 분말 엑스 17 g을 얻어 이를 시료로 사용하였다.

실시예 4. 냉침 추출법에 의한 극성 용매 가용 추출물의 제조(MC-4-2)

위령선 대신에 속단을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3과 동일하게 추출하여 생약조성물 분말 엑스 17 g을 얻어 이를 시료로 사용하였다.

실시예 5. 냉침 추출법에 의한 극성 용매 가용 추출물의 제조(MC-4-3)

위령선 대신에 속단을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 추출하여 생약조성물 분말 엑스 17 g을 얻어 이를 시료로 사용하였다.

실험예 1. 자가면역 뇌척수염 마우스 모델을 이용한 다발성 경화증 억제 효과 실험

상기 실시예 1 및 실시예 2에서 얻은 추출물들의 다발성 경화증 억제 효과를 알아보기 위하여 하기 문헌의 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 마우스 모델 실험을 응용하여 실험을 실시하였다 [Stromnes, I. M. and J. M. Goverman (2006)., Nature Protocols 1(4): 1810-1819].

1. 자가면역 뇌척수염 마우스 모델의 제조

자가면역 뇌척수염 마우스 모델은 인간의 다발성 경화증과 유사한 특징을 지닌 대표적인 모델로서 하기와 같이 제조하였다. C57BL/6 마우스(수컷, 7주령, 오리엔트 바이오, 한국)에 졸레틸(Zoletil; Virbac, 프랑스)과 럼푼(Rompun; 바이엘코리아, 한국)을 근육주사하여 마취시켰다. 200 ㎍의 MOG(myeloid oligodendrocyte glycoprotein; Sigma, 미국)를 500 ㎍의 H37Ra(Sigma, 미국)가 들어있는 완전 프로인트 어쥬반트(complete Freund adjuvant)와 함께 1:1로 잘 섞은 후 양 겨드랑이와 양 허벅지에 50 ㎕씩 총 200 ㎕를 피하 주사 하였다. Day 0와 day 2에 400 ng의 PTX(pertussis toxin)을 100 ㎕의 PBS에 녹여 복강 주사하였다. 정상 마우스에는 동일한 양의 생리식염수를 각각 주사하였다. 면역 유도한 day 0부터 임상 점수(clinical score)를 측정하였다(도 2).

2. 다발성 경화증 억제 효과 실험

자가면역 뇌척수염 마우스 모델을 이용하여 본 발명의 복합생약 조성물 MC-2와 MC-4의 다발성 경화증 억제 효과를 임상 증상과 사이토카인 발현량을 측정하여 확인하였다.

2-1. 실험 방법

MOG 면역 유도 14일 전부터 매일 경구 투여용 위장 삽입관을 이용하여 실시예 1의 생약조성물 MC-2와 실시예 2의 생약조성물 MC-4를 각각 300 ㎎/㎏/day의 용량으로 100 ㎕ 부피로 경구투여 하였다. 대조군에는 음용수만 100 ㎕ 씩 경구투여 하였으며, 정상 마우스에도 역시 음용수를 100 ㎕ 투여하였다. 기존에 보고된 방법을 따라(Stromnes et al., 2006), Day 0에 정상 군을 제외한 모든 그룹의 마우스는 MOG로 면역 유도 하였다. 다발성 경화증의 증상은 마비의 정도를 점수화 하여 임상 점수(clinical score)로 측정한다. 임상 점수는 하기와 같은 기준으로 측정하였다. 0: 무증상, 0.5: 꼬리의 부분적인 마비, 1: 꼬리의 완전한 마비, 2: 보행이상 및 뒷다리의 부분적인 마비, 2.5: 한쪽 뒷발의 완전한 마비, 3: 양쪽 뒷발의 완전한 마비, 3.5: 양쪽 뒷발의 완전한 마비 및 앞 발의 약화, 4: 양쪽 앞 발의 완전한 마비, 5: 빈사 상태 또는 죽음. 일반적으로 day 10 ± 1 정도에 처음 증상이 나타난다.

사이토카인 발현은 희생시킨 마우스에서 비장세포를 분리하여 측정하였다. 비장 세포는 40 ㎛ 나일론 셀스테이너(nylon cell strainer, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 물리적인 분리 방법으로 분리하였다. RPMI-1640 배양액에 200 U/㎖의 페니실린 G, 150 U/㎖의 스트렙토마이신, 10% FBS를 첨가하여 배양하였다. 분리된 비장 세포를 24 웰 세포 배양판에 5 x 10⁶cells/㎖/웰로 분주한 다음 20 ㎍/㎖의 MOG를 포함하는 배양액에서 3일간 배양하였다. 배양 후 상등액을 취하여 마우스 IL-17 ELISA 키트(R&D systems, Mineapolis, MN)로 설명서의 방법에 따라 측정하였다. 450 ㎚의 흡광도를 ELISA 리더(Tecan Sunrise, Tecan, Switzerland)로 측정하였으며, 표준 곡선의 최저 농도는 10.9 pg/㎖이다.

2-2. 실험 결과

본 발명의 복합생약조성물의 자가면역 뇌척수염 마우스 모델을 이용한 다발성 경화증 억제 효과를 마비 증상의 육안적 소견 및 분자생물학적 소견 결과를 이용하여 확인하였다.

마우스의 마비 정도를 조사한 결과, MC-2 및 MC-4 투여군이 대조군에 비해 마비 정도가 현저히 낮게 나타났다. 즉, 대조군에서는 면역 유도 후 11일 째부터 증상이 나타나기 시작하여, 13일째에 평균 임상 점수가 2.9로 가장 심했다가 서서히 완화되는 양상을 보인 반면, MC-2를 투여한 경우 발병을 3일간 지연시켰으며, 11-14일과 31, 32일 째에 임상 점수가 대조군에 비해서 통계적으로 의미 있게 차이가 나타났다(도 3a). MC-4를 투여한 경우 면역 후 28일 째까지 큰 차이를 보이지 않다가 29일 째부터 증상히 급격하게 완화되어 30일부터 32일 째에 임상 점수가 대조군과 비교하여 유의미하게 차이가 나타났다(도 3b).

또한, 매일 매일의 임상 점수를 합산한 누적 점수를 분석하였을 경우에도 MC-2와 MC-4 투여군에서는 대조군과 비교하여 그 점수가 현저하게 낮았으며 MC-2의 경우 17일 째부터 MC-4의 경우 30일 째부터 대조군에 비하여 통계적으로 유의미하게 차이가 나타났다(도 3c 및 도 3d).

또한, 마우스의 비장 세포를 분리하여 항원인 MOG로 재자극하여 생산되는 IL-17의 발현양을 측정한 결과 MC-2 및 MC-4 투여군은 대조군에 비해 IL-17 수치를 절반 이하로 감소하였다(도 4).

이상의 결과들을 종합할 때, 복합 생약 조성물을 꾸준히 매일같이 경구투여하게 되면, 다발성 경화증을 유도시킨 마우스의 마비 증상이 완화되고, 수초 파괴와 신경 염증과 관련된 사이토카인의 생체내 조절을 통해 다발성 경화증의 진행을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 마우스 대식세포주에서의 항염증 작용

2.1. MC -2에 의한 IL -1β 및 NO 의 생성 억제

상기 실시예 1에서 제조된 복합생약 조성물인 MC-2의 다발성 경화증 억제 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

마우스 대식 세포주인 Raw264.7 세포에 1 ㎍/㎖(IL-1β의 경우) 또는 100 ng/㎖(NO의 경우)의 리포폴리사카라이드(LPS; Sigma, 미국) 자극과 함께 다양한 농도의 MC-2을 처리한 다음 48 시간(IL-1β의 경우) 또는 24 시간(NO의 경우) 후에 상등액을 얻어 ELISA 또는 그리스 시험(Griess assay)을 통해 각각의 생산량을 조사하였고 IC₅₀값을 구하였다(도 5).

실험 결과, 본 발명의 MC-2는 다발성 경화증에서의 염증 반응에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인인 IL-1β와 염증성 매개체인 NO의 생산을 농도에 비례하여 유의미하게 억제함을 확인할 수 있었으며 이때의 IL-1β와 NO에 대한 IC₅₀ 값은 각각 0.11 ㎎/㎖과 0.04 ㎎/㎖로 나타났다(도 6a 및 도 6b).

2.2. MC -4, MC -4-1, MC -4-2 및 MC -4-3에 의한 TNF -α의 발현 억제

복합생약 조성물 MC-4, MC-4-1, MC-4-2 및 MC-4-3의 항염증 효과를 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

마우스 대식 세포주인 Raw264.7 세포에 100 ng/㎖의 리포폴리사카라이드(LPS; Sigma, 미국) 자극과 함께 다양한 농도의 복합생약 조성물을 처리한 다음 24 시간 후에 상등액을 얻어 ELISA를 통해 TNF-α의 생산량을 조사하였다

실험 결과, 네 가지 복합생약 조성물 모두 농도에 비례하여 TNF-α의 발현을 억제하였고, 본 발명의 MC-4는 MC-4-1, MC-4-2 및 MC-4-3에 비하여 모든 농도에서TNF-α의 발현을 더 많이 억제하였다 (도 6c).

실험예 3. 마우스 CD4 + 임파구 세포에서의 IL -17 억제 작용

복합생약 조성물 MC-2와 MC-4가 염증성 사이토카인 IL-17에 대하여 억제 효과를 나타내는지 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. C57BL/6 마우스로부터 비장(spleen)을 얻어 CD4+ 분리 키트(Invitrogen)를 사용하여 CD4+ 임파구를 분리하였다. CD4+ 임파구에 Th17 분화자극(항-CD3 항체, 항-CD28 항체, TGFβ, IL-6)과 함께 MC-2 또는 MC-4를 농도별로 처리한 다음 3일 후에 상등액을 얻어 ELISA를 이용하여 IL-17의 양을 측정하였다.

실험 결과, 본 발명의 MC-2와 MC-4는 다발성 경화증에서의 염증 반응에 밀접하게 관여하는 것으로 알려진 염증성 사이토카인인 IL-17의 생산을 농도에 비례하여 유의하게 억제함을 확인할 수 있었으며 MC-2의 억제 활성이 MC-4에 비하여 더 우수한 것으로 나타났다(도 7).

실험예 4. EL4 마우스 임파구 세포주에서의 IL -17 억제 활성 및 작용 기전

복합생약 조성물 MC-2의 염증성 사이토카인 IL-17에 대한 억제활성이 어떠한 기전을 통하여 나타나는지 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다. EL4 마우스 임파구 세포주를 자극하기 위하여 파라메톡시암페타민(paramethoxyamphetamine, PMA)과 이오노마이신(ionomycin)을 사용하였다. 먼저, PMA(10 ng/ml) 및 이오노마이신(200 ng/ml) 자극과 함께 MC-2를 여러 가지 농도로 처리한 다음 24시간 후에 상등액을 얻어 ELISA를 이용하여 IL-17의 양을 측정하였다. 실험 결과, EL4 세포에서도 MC-2가 IL-17의 생산을 농도에 비례하여 유의하게 억제함을 확인하였다(도 8).

MC-2가 IL-17의 발현을 억제하는 것이 RNA 수준에서 조절되는지 조사하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행하였다. EL4 세포에 PMA와 이오노마이신 자극과 함께 400 μg/ml의 MC-2를 처리한 다음 24시간 후에 전체 RNA를 얻어 노던 블럿을 수행한 결과, PMA+이오노마이신에 의하여 크게 증가한 IL-17 RNA의 발현이 MC-2에 의해 유의하게 억제되었다. 또한 MC-2는 IL-17의 프로모터에 결합하여 IL-17의 발현을 조절하는 것으로 알려진 RORα의 RNA 발현 또한 억제하였다. 상기 결과를 볼 때 MC-2는 RORα의 발현을 억제하여 IL-17의 발현을 조절하는 것으로 생각된다(도 9).

MC-2가 실제로 IL-17의 프로모터 활성을 조절하는지 조사하기 위하여 프로모터 어세이를 수행하였다. 2 kb 길이의 IL-17 프로모터를 루시퍼라아제 유전자 앞에 삽입한 플라스미드(pGL4.10-mIL17)를 EL4 세포에 전기천공법(electroporation)을 통해 전달한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후 PMA+이오노마이신 자극과 함께 MC-2를 농도별로 처리하고 24시간 후에 세포를 얻어 루시퍼라아제 어세이를 수행하였다. 실험 결과, MC-2는 PMA 및 이오노마이신에 의해 증가한 루시퍼라아제의 활성을 농도-의존적으로 감소시켰다(도 10). 이상의 결과를 종합해 볼 때 MC-2는 IL-17의 발현에 관여하는 전사인자의 발현을 조절하여 IL-17의 발현을 전사 수준에서 억제하는 것으로 판단된다.

실험예 5. 인간 연골 세포주에서의 기질 단백질 분해 효소 발현 억제 작용

복합생약 조성물 MC-4, MC-4-1, MC-4-2 및 MC-4-3가 다발성 경화증의 병리에서 혈액뇌장벽의 분해에 중요하게 작용하는 기질 단백질 분해 효소 (pro-MMP-1, pro-MMP13)의 발현에 어떤 영향을 주는지 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

인간 연골세포주인 SW1353 세포에 10 ng/㎖의 IL-1β 자극과 함께 다양한 농도의 생약 복합 조성물을 처리한 다음 3일 후에 상등액을 얻어 ELISA를 통해 pro-MMP-1과 pro-MMP13의 생산량을 조사하였다.

실험 결과, 본 발명의 MC-4와 MC-4-1는 pro-MMP-1과 pro-MMP-13의 발현을 농도에 비례하여 억제하였으며, pro-MMP-13의 경우 MC-4가 MC-4-1에 비하여 동일 농도에서 그 발현을 더 많이 억제하였다. 반면, MC-4-2, MC-4-3는 pro-MMP-1의 발현에는 큰 영향을 미치지 않았으며, pro-MMP-13 은 생약 조성물의 농도가 증가함에 따라 그 발현이 더 많이 증가하였다 (도 11 및 도 12).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 유효성분으로서 약제학적 유효량의 위령선(ClematidisRadix) 추출물, 오가피(Acanthopanax) 추출물 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 위령선 추출물 1 중량부에 대하여 상기 오가피 추출물 0.5 내지 2 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 육계(Cinnamon) 추출물, 천마(Gastrodia) 추출물 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 위령선 추출물 1 중량부에 대하여 상기 육계 추출물 0.2 내지 2 중량부 또는 상기 천마 추출물 0.2 내지 1 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine)의 발현을 억제함으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β 또는 IL-17인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 IL-17의 전사인자인 RORα의 발현을 억제함으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 일산화질소(nitric oxide)의 생성을 억제함으로써 항염증 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
위령선(Clematidis Radix ) 추출물, 오가피(Acanthopanax) 추출물 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출물을 유효성분으로 포함하는 다발성 경화증(Multiple Sclerosis) 예방 또는 개선용 식품 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 육계(Cinnamon) 추출물, 천마(Gastrodia) 추출물 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.