KR20240075097A - 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물 - Google Patents
한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 복합 추출물은 고지방식이 마우스 모델에서 뛰어난 항비만 효과와 간질환의 개선 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한약재인 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물에 관한 것이다.
비만은 고칼로리 식이에 대한 신체 활동성 감소로 발생하는 가장 일반적인 대사성 질환이다. 비만에 대한 유병률은 2016년 전체 성인의 13%를 차지했고, 2025년에는 전 세계 성인의 20%를 차지할 것으로 예상된다. 특히 비만은 비알코올성 간질환(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD), 제 2형 당뇨병(Type 2 Diabetes mellitus, T2D), 고지혈증, 만성신부전 등의 합병증 발생과 밀접한 관계가 있다. NAFLD 환자의 23%는 T2D를 동반하고, T2D환자의 56%는 NAFLD를 동반한다. 이는 NAFLD 치료의 중요성을 나타내지만, 현재 안전하고 유효한 치료약은 없는 실정이다.
비만은 지방 조직의 지질 축적 능력을 초과하는 고칼로리 식이로 지질 합성 증가와 산화 및 분해 능력 감소를 동반하는 지질대사 장애를 유발한다. 지질대사 장애는 인슐린 저항성과 혈당 농도 증가를 유발하며, 이는 간, 이자, 골격근에서 대사 이상과 염증 반응을 촉진시킨다. 이 때 발생하는 산화스트레스는 세포손상과 염증반응을 유발한다. 이로 인해 유도된 세포손상은 인슐린 저항성과 혈당 농도 증가를 더욱 악화시켜 비만 관련 대사성 질환(NAFLD, T2D, 고지혈증, 만성신부전 등)을 동시에 유발한다. 따라서, 지질대사 이상은 비만 관련 대사성 질환을 유발하기 때문에 이에 대한 궁극적인 치료방법이 필요하다. 현재까지 NAFLD의 치료 물질로 메트포민, PPAR-γ 작용제, 비타민E 등이 연구되었지만, 이러한 물질들은 체중 증가, 혈당 증가와 같은 부작용이 있어 큰 효과를 보지 못했다.
한편, 간질환은 만성간염에서 간경변증에 이르기까지 종류와 심한 정도가 다양하고, 증상도 전혀 없는 경우에서부터 심한 경우에 이르기까지 다양하다. 특히 간질환 환자들은 피로감 및 위약감, 식욕감퇴 및 구역, 소화불량, 상복부 불편감, 가려움증 같은 증상들을 나타낼 수 있다. 간질환의 종류는 A, B, C, D, E형 같은 바이러스감염과 알코올성 간질환, 비알코올성 지방간질환, 간염, 독성간염, 자가 면역 간질환, 유전 및 대사질환이 있다.
당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하가 포함된 복합 추출물은 염증, 신경 조절 효과가 알려져 있지만, 간보호 효능 및 지질 대사 개선 효능은 보고된 바가 없다. 따라서, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하의 한약재 복합 추출물이 항비만 또는 간질환 예방 효과를 확인하여 비만 또는 간질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명은 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명은 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 바와 같은 기술적 과제를 달성하기 위해서, 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 체중 감량 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 간 보호 및 항지질 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 간 비대 및 지방증을 억제하는 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 간 조직의 항산화 및 항염증 효능을 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 지질 대사 개선효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 지질 축적 억제 효능을 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 한약재 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 한약재 복합 추출물은 고지방식이 마우스 모델에서 뛰어난 항비만 효과 및 간질환 개선 효과를 가진다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 실험 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델에 본 발명의 한약재 복합 추출물을 경구투여하여 8주간 체중변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 최초에서 최종 투여까지의 총 체중 변화량을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 일일 총 에너지 및 지방 에너지 섭취량에 대한 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 간 세포 및 지질 축적에 대한 조직병리학적 변화를 HE 및 Oil red O 염색을 통해 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 간 조직에서 염증, 산화스트레스, 사포사멸에 대한 효능을 면역조직화학적 염색을 통해 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델에 본 발명의 한약재 복합 추출물을 경구투여하여 8주간 체중변화를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 최초에서 최종 투여까지의 총 체중 변화량을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 일일 총 에너지 및 지방 에너지 섭취량에 대한 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 간 세포 및 지질 축적에 대한 조직병리학적 변화를 HE 및 Oil red O 염색을 통해 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 고지방식이 마우스 모델의 간 조직에서 염증, 산화스트레스, 사포사멸에 대한 효능을 면역조직화학적 염색을 통해 나타낸 도이다.
본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "당귀(Angelicae Gigantis Radix)"는 변비 및 탈모에 효능이 있다고 하며, 혈관을 확장시켜 혈류량을 증강시켜서 혈액 순환에 좋다고 알려져 있다. 다만, 따뜻한 성질이 있어서 몸이 뜨거운 사람은 복용시 주의를 요하며, 만성설사를 하거나 대변이 묽은 사람에게 좋지 않다.
본 발명에서 사용되는 용어, "조구등(Uncariae Ramulus cum Uncus)"은 꼭두서니과의 한 종이며, 조등(釣藤)이라고도 한다. 중국이 원산지이며, 혈압 상승을 억제하는 카테킨이 포함되어 있어 약재로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "천궁(Cnidii Rhizoma)"은 진정·진통·강장 등에 효능이 있어 두통·빈혈증·부인병 등을 치료하는데 쓴다.
본 발명에서 사용되는 용어, "백출(Atractylodis Rhizoma Alba)"은 비위의 기능이 허약해서 소식, 권태감이 생기고 얼굴빛이 황색이며 대변을 묽게 보거나 설사에 좋으며 수분이 정체되어 전신이 붓고 소화가 되지 않을 때 수분 배설을 돕는다.
본 발명에서 사용되는 용어, "복령(Poria Sclerotium)"은 소변을 못보고 배와 전신의 부종, 담음으로 해수, 구토, 설사가 있을 때 및 신경과민에 의한 건망증, 유정에 쓰며 심장부종에도 사용한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "시호(Bupleuri Radix)"는 뿌리를 약재로 이용하며, 일반 발열성 질환에 해열작용이 있으므로 감기·인플루엔자·급성기관지염 등에 해열·소염제로 이용된다. 또한, 만성간염의 협통·소화불량·메스꺼움·복통 등을 치료하며, 정신적 장애로 인한 월경통·하복통에 진정·진통효과가 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "감초(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)"는 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있다. 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용, 항염작용이 있으며 소화성궤양을 억제한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "진피(Fraxini Cortex)"는 기가 뭉친 것을 풀어주고 비장의 기능을 강화하여 복부창만, 트림, 구토, 메스꺼움, 소화불량, 헛배가 부르고 나른한 증상, 대변이 묽은 증상을 치료한다. 해수, 가래를 없애주며 이뇨작용을 한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "반하(Pinelliae Tuber)"는 습담을 치료하므로 가래, 해수, 천식에 쓰이며 담으로 인한 두통, 어지럼증, 가슴답답증, 그득한 증상, 구토, 인후통, 등 부위에 난 종기, 유방염, 임신구토 등에 사용한다.
본 발명에 있어서, "비만"은 지방 조직의 지질 축적 능력을 초과하는 고칼로리 식이로 지질 합성 증가와 산화 및 분해 능력 감소를 동반하는 지질대사 장애를 유발한다.
본 발명에 있어서, "간질환"은 만성간염에서 간경변증에 이르기까지 종류와 심한 정도가 다양하고, 대표적인 원인은 간염 바이러스이며, 그 외에 알코올, 약물, 대사성 질환 등이 있다.
따라서, 본 발명은 위의 한약재인 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환 개선효과를 확인하여 발명을 완성하였다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 건강기능식품/약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올 (methanol), 에탄올 (ethanol), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 부탄올 (butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤 (acetone), 에테르 (ether), 벤젠 (benzene), 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 메틸렌클로라이드 (methylene chloride), 헥산 (hexane) 및 시클로헥산 (cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법, 초임계추출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피 (thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
일 측면에서, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만, 간질환 예방, 항산화, 항염증, 지질 대사 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 "건강기능식품 조성물"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 조추출물의 경우 경구투여, 정제된 제제는 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하는 바, 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예 사료를 본 발명에 따른 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%으로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식 발효 사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 종래 사료에 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 사료에 첨가되는 성분의 일예로서 곡류분말, 고기분말, 및 두류 등을 포함할 수 있다. 상기에서 곡류분말은 쌀가루, 밀가루, 보리가루, 및 옥수수가루 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기에서 고기분말은 닭고기, 소고기, 돼지고기, 및 타조고기 중에서 선택된 어느 하나 이상을 분말화한 고기분말을 사용할 수 있다. 상기에서 두류는 대두, 강낭콩, 완두콩, 및 검정콩 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 상기에서 언급한 종래 사료에 첨가되는 성분인 곡류분말, 고기분말, 및 두류 이외에도 사료의 영양성을 증대시키기 위해 영양제, 및 무기물 중에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가할 수 있으며, 사료 품질의 저하를 막기 위해 항곰팡이제, 항산화제, 항응고제, 유화제, 및 결착제 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<준비예 1>
본 발명에서 사용된 한약재인 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하는 대원약업사(대구)로부터 구입하여 사용하였다. 반하 1.67, 백출 1.33, 복령 1.33, 당귀 1.0, 조구등 1.0, 천궁 1.0, 진피 1.0, 시호 0.67, 감초 0.5의 비율로 혼합한 복합 한약재 50g당 1L의 증류수 비율로 열수 추출하여 최종적으로 동결건조하여 실험을 진행하였으며, 약재의 복합 추출물은 차광상태에서 4℃로 냉장 보관 하였다.
또한, 실험에서 양성대조군으로 사용된 실리마린은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 상기 실리마린은 증류수에 용해시켜 20mg/mL로 차광상태에서 4℃로 냉장 보관하였다.
<준비예 2> 동물실험 준비
본 발명의 모든 동물 실험은 대구한의대 동물실험 윤리위원회의 심의 동의하에 실시하였다.
도 1에 실험의 과정을 도식화하여 나타내었다. 6주령 수컷 SPF/VAF C57BL/6 mice(새론바이오, 경기도 의왕)은 케이지에 5마리씩 무작위로 배치하고, 20 내지 25℃, 습도 40 내지 45%에서 주야 주기가 12시간으로 조절된 동물실험실에서 2주간 순화기간을 거쳤다(-3wk). 사료 섭취와 음수는 자유식이로 공급하였다. 2주 후, 하루 동안 절식하고 다음날 체중을 측정하였다. 실험군은 비슷한 체중을 가진 그룹으로, 군당 8마리씩 5개 군으로 나누었다.
1주 동안 1개 군은 정상식이(12.4 kcal% fat 포함, 3.85 kcal/gram 열량; Purina Feed, 경기도 성남)를 공급하였고, 나머지 4개 군은 고지방식이(60.0 kcal% fat 포함, 5.24 kcal/gram 열량; #D12492, Research Diet, New Brunswick, NJ, USA)를 공급하였다(-1wk). 고지방식이군은 체중 측정 후 비슷한 평균 체중을 가진 4개의 군으로 분리하였다.
총 5개 군의 모델 마우스에 존대(zonde)를 이용하여 증류수, 실리마린(SIL), 한약재 복합 추출물(UG)을 매일 1회씩 경구투여하였다. 실리마린 투여용량은 8주간 고지방식이 마우스 모델에서 유효농도로 사용된 선행연구를 기반으로 설정하였고, 한약재 복합 추출물 용량은 일반 성인 체중 60kg 기준, 1회 3g을 기준으로 설정하였다. 최초 투여와 최종 투여 전날에 15시간 절식하여 체중 변화에 대한 식이 영향을 최소화하였고, 8주간 매일 체중 측정을 실시하였다. 본 발명 5개의 실험군을 하기 표 1에 나타내었다.
실험군 | 1일 1회 투여량 |
NFD | 증류수(10mL/kg) 투여(정상 대조군) |
HFD | 증류수(10mL/kg) 투여(고지방식이 음성 대조군) |
SIL | 실리마린(200mg/kg) 투여(고지방식이 양성 대조군) |
UG-H | 한약재 복합 추출물(500mg/kg) 투여(고용량 투여군) |
UG-H | 한약재 복합 추출물(250mg/kg) 투여(저용량 투여군) |
<실시예 1> 체중변화 확인
도 2에서 보듯이, 8주간 경구투여에 따른 체중변화를 확인하였다. 일일 체중 변화에 대한 반복측정 분산분석을 통해 군과 측정일 사이의 상호작용을 확인하였다. 정상 대조군인 NFD군에 비하여 다른 모든 군은 체중증가를 보인 반면, 5~8주의 UG-H군과 UG-L군의 체중증가율과 6~8주의 SIL군의 체중증가율은 음성대조군인 HFD군의 체중증가율에 비해 낮았다. 이에 따라, 본 발명 한약재 복합 추출물의 경구투여에 의한 고지방 식이 유도 체중 증가에 대한 항비만 효과를 확인하였다.
또한 도 3에서 보듯이, 최초 투여에서 최종 투여까지의 총 체중 변화량을 확인하였다. 모델 마우스의 체중은 NFD군에 비해 나머지 군에서 증가하였지만, 음성대조군인 HFD군의 체중증가량에 비하여 SIL군은 28.6%, UG-H군은 30.3%, UG-L군은 30.1% 감소함을 확인하여 유의미한 결과를 도출하였다.
<실시예 2> 1일 사료 식이에 따른 에너지 섭취량 분석
경구투여 7주차에 각 모델 마우스를 개별 케이지에 배치하여 15시간 동안 절식한 후, 100g의 식이를 공급하여 24시간 동안 사료 섭취량(g)을 측정하였다. 섭취량에 따른 정상식이와 고지방식이에 포함된 지방 및 열량을 계산하였다.
도 4에서 보듯이, 모델 마우스의 일일 총 에너지 및 지방 에너지 섭취량에 대한 변화를 확인하였다. 모든 군 사이에서 1일간 총 에너지 섭취에 대한 큰 차이는 발견되지 않았다. 또한 지방 에너지 섭취량은 NFD군에 비해 다른 군에서 증가하는 추세를 보였지만 HFD군과 SIL군, UG-H군 및 UG-L군은 큰 차이가 없었다. 이는 한약재 복합 추출물의 체중 감소 효과는 섭취 중추 억제에 의한 효과를 배제할 수 있다는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 혈액 생화학적 분석(간손상 및 지질 대사 이상 측정)
최종 투여 후, 아이소플루레인(isoflurane)으로 흡입 마취하여 모델 마우스의 혈액을 채취하였다. 10000 × g에서 10분간 원심분리를 통해 혈청을 분리하였다. 혈청 AST(aspartate aminotransferase), ALT(alanine aminotransferase), 알부민(albumin), 글루코스(glucose), 트리글리세리드(triglyceride), 총콜레스테롤(total cholesterol), LDL-콜레스테롤(low-density lipoprotein-cholesterol), 및 HDL-콜레스테롤(high-density lipoprotein-cholesterol)의 함량은 BECKMAN COULTER AU680을 사용하여 측정하였다.
간 손상(AST, ALT, albumin, glucose)과 지질 대사 이상(triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol)에 대한 혈청 내 생화학적 분석을 실시하였다(표 2).
NFD | HFD | SIL | UG-H | UG-L | |
AST (U/L) | 54.63±5.93 | 85.00±14.14 | 55.75±7.17 | 55.71±12.30 | 53.13±2.80 |
ALT (U/L) | 20.88±2.47 | 39.63±12.81 | 21.63±3.54 | 18.00±2.68 | 17.00±4.47 |
ALB (mg/dl) | 3.44±0.09 | 2.83±0.15 | 3.09±0.10 | 3.05±0.05 | 2.93±0.05 |
GLU (mg/L) | 11.66±1.83 | 18.16±1.94 | 10.69±3.57 | 11.37±4.51 | 9.14±3.13 |
TG (mg/L) | 5.54±0.89 | 9.89±1.72 | 5.88±0.72 | 4.85±0.80 | 4.85±0.48 |
T-CHO (mg/L) | 10.38±0.45 | 16.21±1.34 | 13.58±0.82 | 12.87±1.18 | 12.46±0.85 |
HDL (mg/L) | 7.89±0.32 | 10.05±0.65 | 8.85±0.42 | 8.66±0.43 | 8.80±0.28 |
LDL (mg/dl) | 8.25±0.71 | 12.88±0.99 | 9.88±0.83 | 9.83±0.98 | 9.38±0.74 |
혈청 내 albumin을 제외한 나머지의 함량은 NFD에 비해 음성대조군인 HFD에서 증가하였고, HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 감소하였다. 혈청 내 albumin의 함량은 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 증가하였다. 알부민의 농도는 간 손상, 신장질환, 영양실조, 염증 및 쇼크의 상황에서 감소하기 때문에 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 알부민의 농도가 증가함을 확인하였고, 이를 통해 한약재 복합 추출물의 간 보호 효과와 항지질 효과를 확인하였다.
<실시예 4> 간 및 지방 중량 변화 확인
최종 투여 후, 이산화탄소를 사용하여 모델 마우스를 안락사시켜 간과 백색지방이 풍부한 고환 주위의 지방을 채취하여 중량을 측정하였다.
8주간 투여 이후 간 및 지방의 절대적 중량 변화를 분석하였다(표 3).
NFD(g) | HFD(g) | SIL(g) | UG-H(g) | UG-L(g) | |
간 | 0.95±0.05 | 1.13±0.10 | 0.95±0.06 | 0.93±0.07 | 0.92±0.09 |
지방 | 4.26±0.16 | 3.19±0.10 | 2.92±0.11 | 2.89±0.17 | 2.93±0.18 |
NFD군에 비해 음성대조군인 HFD군의 간의 절대적 중량은 증가하였지만, 이를 제외한 나머지 간 및 지방의 절대적 중량은 유사하거나 감소하였다. 또한, 음성대조군인 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군은 간 및 지방의 절대적 중량은 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한, 8주간 투여 이후 간 및 지방의 모델 마우스 체중에 따른 상대적 중량 변화를 분석하였다(표 4).
NFD(%) | HFD(%) | SIL(%) | UG-H(%) | UG-L(%) | |
간 | 0.39±0.09 | 1.8±0.27 | 1.17±0.26 | 1.10±0.37 | 1.13±0.22 |
지방 | 1.43±0.16 | 5.36±0.58 | 3.73±0.67 | 3.41±1.02 | 3.66±0.60 |
NFD군에 비해 NFD군을 제외한 모든 군의 간 및 지방의 상대적 중량은 증가하였고, 음성대조군인 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군의 간 및 지방의 상대적 중량은 감소하였다.
이를 통해 한약재 복합 추출물의 투여가 간 비대와 지방증 억제에 기여한다는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 간 조직에서 항산화 및 항염증 효능 분석
간 조직의 항산화 및 항염증 효능 측정을 위해 간 조직을 10% phosphate-buffered saline(PBS)를 이용하여 유제를 만들고, 초음파로 10초간 완전 파쇄하였다. 간 조직 유제는 10분동안 1,600 × g, 4°C에서 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 상청액 내의 항산화 효능 지질 산화 대사 물질인 malondialdehyde(MDA: Cayman, Ann arbor, MI, USA), 항산화 인자 glutathione(GSH, Mybiosource, San Diego, CA, USA), 항산화 효소 superoxide dismutase(SOD: Cayman, Ann arbor, MI, USA)와 catalase(Cayman, Ann arbor, MI, USA)를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 또한, 항염증 효능은 tumor necrosis factor(TNF)α와 interleukin(IL)1β를 kit(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.
모든 검사는 synergy H1 microplate reader(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 측정한 후 조직 단백질 함량으로 정량하였다(표 5). TNFα와 IL1β는 Dunnett T3를 통해서 분석하였고, 다른 인자는 Tukey HSD test를 통해서 사후 분석하였다.
NFD | HFD | SIL | UG-H | UG-L | |
MDA
(μM/mg) |
1.05±0.13 | 1.71±0.24 | 0.75±0.30 | 0.96±0.30 | 1.16±0.23 |
GSH
(μmold/mg) |
47.12±6.62 | 36.54±3.37 | 53.16±6.31 | 57.65±12.34 | 50.26±4.28 |
SOD
(U/mg) |
0.16±0.06 | 0.08±0.05 | 0.48±0.02 | 0.36±0.04 | 0.30±0.04 |
Catalase
(nmol/mg) |
199.85±24.97 | 160.09±17.21 | 209.28±22.1 | 220.69±24.56 | 215.59±21.6 |
TNFα
(pg/mg) |
2.61±0.34 | 5.30±0.52 | 3.50±0.21 | 3.83±0.13 | 4.03±0.21 |
IL1β
(pg/mg) |
4.69±0.28 | 11.35±2.41 | 4.24±0.81 | 4.97±1.18 | 4.25±0.66 |
간 조직에서 지질 대사 물질인 MDA의 함량은 NFD군에 비해 HFD군에서 증가하였지만 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 감소하였다.
항산화인자인 GSH의 함량은 NFD군에 비해 HFD군에서 감소하였지만, NFD군과 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 증가하였다.
항산화 효소인 SOD와 catalase의 활성은 NFD군에 비하여 HFD군에서 감소하였지만, NFD군과 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 증가하였다.
간 조직에서 염증매개물질인 TNFα는 NFD군에 비해 NFD군을 제외한 모든 군에서 증가하였다. 간 조직 IL1β의 함량은 NFD군에 비해 HFD군에서 증가하였지만, 다른 군에서는 큰 차이가 없었다. 반면, TNFα와 IL1β의 함량은 HFD군에 비해 SIL군, UG-H군 및 UG-L군에서 감소하였다.
이를 통해, 실리마린과 유사한 한약재 복합 추출물은 고지방식이 유도 NAFLD모델에서 간 조직 항산화 효능과 항염증 효능을 가진다는 것을 확인하였다.
<실시예 6> 간 조직에서 지질 대사 및 항산화 관련 유전자 변화량 분석
지질 대사 개선 효능은 qRT-PCR을 수행하여 분석하였다. Trizol 용액을 이용하여 간 조직에서 total RNA를 추출하고, Take3 microplate of synergy H1 microplate reader(Agilent)를 이용하여 함량을 측정하였다. RNA 수준은 Agilent RNA 6000 pico Kit(Agilent Technologies)와 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies, CA, United States)을 이용하여 측정하였다. RNA는 ReverTra AceTM qPCR RT master mix(Toyobo, Osaka, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성되고, programing CFX connect real-time PCR detection system(Bio-Rad)을 이용하여 40 cycles에서 진행되었다.
ACC1, AMPK, ACOX, C/EBPα, CPT-1, FAS, SREBP-1c, PPARα, PPARγ에 대한 primer를 표 6에 나타내었다.
타겟 유전자 | 염기서열(5’ - 3’) |
Acetyl-CoA carboxylase (ACC)1 | Forward: GCCATTGGTATTGGGGCTTAC |
Reverse: CCCGACCAAGGACTTTGTTG | |
5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) | Forward: ACGAACTCGAGGAGCACAAG |
Reverse: TGCCTGACTCTGGGTCGTTA | |
Acyl-coenzyme A oxidase (ACOX) | Forward: GAATCAGGGCACCACTGCTCA |
Reverse: CCTCGAAGATGAGTTCCGTG | |
CCAAT-enhancer-binding protein (C/EBP)α | Forward: GCAAAGCCAAGAAGTCGGTG |
Reverse: TCTCCACGTTGCGTTGTTTG | |
Carnitine palmitoyltransferase (CPT)1 | Forward: TGCATACCAAAGTGGACCCC |
Reverse: ACGCCACTCACGATGTTCTT | |
Fatty acid synthase (FAS) | Forward: ATTCAGCCCGTTGGAGTGAT |
Reverse: CCTGCAATTTCCGTTTGGCT | |
Sterol regulatory element-binding protein (SREBP)-1c | Forward: GATGTGCGAACTGGACACAG |
Reverse: CATAGGGGGCGTCAAACAG | |
Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)α | Forward: TGCCTTCCCTGTGAACTGAC |
Reverse: CCATGTTGGATGGATGTGGC | |
PPARγ | Forward: ACGCGGAAGAAGAGACCTGG |
Reverse: AGTGTGACTTCTCCTCAGCC | |
Glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Forward: TGTGAACGGATTTGGCCGTA |
Reverse: ACTGTGCCGTTGAATTTGCC |
AMPK는 지질 합성에 관련된 유전자인 ACC, FAS를 억제하고, 지방산 산화를 촉진한다. C/EBPα, SREBP-1c, PPARγ는 지질의 흡수 및 지방 합성을 촉진하고, ACOX는 지질 생합성을 촉진한다. PPARα와 CPT1은 지질 산화를 촉진하는 조절 유전자이고, NRF2는 항산화 효소 발현을 조절하는 핵심 전사인자이다. ACC1, AMPK, ACOX, C/EBPα, CPT-1, FAS, SREBP-1c, PPARα, PPARγ에 대한 primer(표 6)를 사용하여 CFX Maestro software(Bio-Rad)로 간 조직에서 지질 대사 및 항산화 관련 유전자의 발현량을 측정하고, GAPDH로 정량화하였다(표 7).
NFD | HFD | SIL | UG-H | UG-L | |
AMPK | 1.00±0.20 | 0.65±0.09 | 0.91±0.25 | 1.02±0.22 | 0.98±0.35 |
ACC1 | 1.00±0.18 | 1.56±0.33 | 1.42±0.28 | 1.45±0.51 | 1.53±0.21 |
C/EBPα | 1.00±0.18 | 1.63±0.28 | 1.68±0.54 | 0.79±0.43 | 1.11±0.36 |
FAS | 1.00±0.31 | 2.23±0.98 | 1.75±0.83 | 1.02±0.22 | 0.71±0.25 |
PPARα | 1.00±0.21 | 0.60±0.10 | 0.82±0.22 | 1.40±0.30 | 1.41±0.24 |
PPARγ | 1.00±0.27 | 2.08±0.26 | 3.43±0.60 | 1.45±0.28 | 1.67±0.58 |
SREBP1c | 1.00±0.32 | 1.52±0.25 | 1.02±0.18 | 0.91±0.54 | 1.01±0.35 |
ACOX | 1.00±0.16 | 1.96±0.29 | 1.44±0.25 | 1.51±0.20 | 1.20±0.31 |
CPT1 | 1.00±0.12 | 0.66±0.14 | 0.97±0.18 | 1.24±0.23 | 1.31±0.17 |
NRF2 | 1.00±0.18 | 0.57±0.12 | 1.03±0.29 | 0.98±0.14 | 1.06±0.19 |
AMPK 발현량은 NFD군에 비하여 HFD군에서 감소하였다. AMPK는 지질 합성에 관련된 유전자를 억제하기 때문에 AMPK 발현량의 감소에 따라 지질 합성에 관련된 유전자인 ACC1, FAS, ACOX 발현량은 증가하였다. AMPK 발현량이 HFD군에 비해 SIL군 및 UG군에서 증가함에 따라 ACC1, FAS, ACOX 발현량은 감소하였다.
지질의 흡수와 지방 합성을 촉진하는 C/EBPα, SREBP-1c, PPARγ의 발현량은 NFD군에 비해 HFD군에서 증가하였다. HFD군에 비해 C/EBPα, SREBP-1c, PPARγ의 발현량은 UG군에서는 모두 감소하였지만, SIL군에서는 SREBP-1c의 발현량만 감소하였다.
지질 산화를 촉진하는 조절 유전자인 PPARα, CPT1의 발현량은 NFD군에 비하여 HFD군에서 감소하였고, HFD군에 비해 SIL군, UG군에서 증가하였다.
항산화 효소 발현을 조절하는 핵심 전사인자인 NRF2의 발현량은 NFD군에 비해 HFD군에서 감소하였지만, HFD군에 비해 SIL군, UG군에서 증가하였다.
한약재 복합 추출물의 지질 대사와 항산화 기전을 통해 항비만 및 NAFLD의 치료에 효과가 있다는 것을 확인하였고, 한약재 복합 추출물이 양성 대조군인 실리마린보다 지질 대사 개선에 더 우수한 바를 확인하였다.
<실시예 7> 간 조직에서 조직병리학적 변화 및 지질 축적
간의 조직병리학적 검사를 위해 간 조직을 10% neutral buffered formalin에 고정하여 파라핀 블록을 제작하였다. 4㎛의 두께의 연속 절편을 제작하여 탈파라핀화 및 함수 과정을 거쳐 hematoxylin and eosin(HE)으로 염색하였다. 염색한 간 조직은 간 세포 직경과 지방 세포 축적 정도를 현미경으로 분석하였다. 간 조직의 일부는 30% sucrose에 탈수 시킨 후, 10㎛의 두께의 연속 동결절편으로 제작하였다. 동결절편은 Oil red O 염색으로 지방 조직을 염색하여 간 조직에서 염색된 영역의 비율을 분석하였다.
도 5에서 보듯이, 모델 마우스의 간 세포 및 지질 축적에 대한 조직병리학적 변화를 HE 및 Oil red O 염색을 통해 나타내었다. 도 5의 scale bar는 50㎛을 의미한다.
HE 염색한 간 조직의 간 세포 직경과 지방 세포 축적 정도를 현미경으로 분석하였다. HFD군은 NFD군에 비해 간 세포 비대와 지방세포 축적이 되었으나, SIL군과 UG군에서 축적이 완화된 것을 확인하였다. 또한, 간 세포의 크기는 NFD군에 비해 HFD군에서 1.3배 증가하였지만, HFD군에 비해 SIL군에서 19.5%, UG-H군에서 27.7%, UG-L군에서 23.3% 감소한 것을 확인하였다.
Oil red O 염색으로 지방 조직을 염색하여 간 조직에서 염색된 영역의 비율을 분석하였다. 염색된 지방 간 조직의 비율은 NFD군에 비해 HFD군에서 4.3배 증가하였으나, HFD군에 비해 SIL군에서 54.0%, UG-H군에서 72.4%, UG-L군에서 69.5% 감소한 것을 확인하였다. 특히, 지방 간의 비율은 NFD군과 UG-H군이 유사하였고, UG-H군은 양성대조군인 SIL군에 비해 감소하였다.
이를 통해, 한약재 복합 추출물의 경구투여에 의한 조직병리학적 간 보호 효과를 확인하였다. 또한, 한약재 복합 추출물이 양성 대조군인 실리마린보다 지질 축적 억제 효능에서 더 우수한 것을 확인하였다.
<실시예 8> 간 조직에서 항산화, 항염증, 항세포사멸 관련 면역조직화학적 변화
면역조직 화학 염색법을 통해 항산화, 항염증, 항세포사멸 효능과 관련된 마커를 검사하였다. 간 조직을 30% sucrose에 탈수 시킨 후, 10㎛의 두께의 연속 동결절편을 제작하였다. 동결절편을 3% H2O2를 함유한 메탄올에 20분 동안 고정시킨 후, 5% fetal bovine serum을 함유한 TBS blocking solution에 1시간 동안 반응시켜 비특이 단백질 발현량을 억제하였다. 동결절편을 rabbit 1차 항체와 4℃에서 반응시켰다.
Rabbit 1차 항체로는 anti-TNFα(#ab66579, Abcam, Cambridge, MA, USA, a dilution of 1:30,000), IL1β(#ab205924, Abcam, a dilution of 1:6,000), anti-nitrotyrosine(NT; #A-21285, Invitrogen, a dilution of 1:1,000), anti-4-hydroxynonenal(4-HNE; #Bs-6313R, Bioss Antibodies, Woburn, MA USA, a dilution of 1:1,500), and anti-caspase-3(CAS; #9662, Cell Signaling, Danvers, MA, USA, a dilution of 1:2,000)를 사용하였다.
반응시킨 다음 날, 물에 씻은 후 goat anti-rabbit EnVision+ System-HRP Labelled Polymer(#K4001, DAKO, Carpinteria, CA, USA)에 1시간 반응시켜 물에 씻었다. 면역화학반응은 iaminobenzidine-tetrahydrochloride(DAB)에 3분간 반응시켜 물에 씻은 후, hematoxylin으로 대조 염색하였다. Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling(TUNEL) 염색은 kit(#ab206386, Abcam)를 이용하여 실시하였다. 세포 면적의 20% 이상이 염색이 되었을 경우, 면역 염색 양성이고, 간 조직에서 100개의 간 세포 중 염색성을 보이는 세포 수의 비율(%)을 측정하였다.
모든 검사는 NIS-Elements BR Analysis software(Nikon Instruments Inc., Nikon, Melville, NY)를 이용하여 실시하였다.
도 6에서 보듯이, 간 조직에서 염증매개인자(TNFα, IL1β), 지질 산화 관련 산화스트레스(4-HNE, NT), 세포사멸(CAS, TUNEL)에 대한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 도 6의 scale bar는 50㎛을 의미한다.
표 8에서 보듯이, 염색성을 보이는 세포수의 비율은 NFD군에 비해 HFD군에서 증가하였으나, HFD군에 비해 SIL군, UG군에서 감소한 것을 확인하였다.
NFD | HFD | SIL | UG-H | UG-L | |
Hepatocytes(μm) | 29.85±2.26 | 40.07±2.32 | 32.24±1.28 | 28.96±2.32 | 30.75±2.62 |
Steatosis(%) | 16.90±3.06 | 73.04±6.60 | 33.57±6.70 | 20.17±1.79 | 22.31±2.90 |
Immunopositive cells(%) for | |||||
TNFα | 7.31±2.33 | 22.83±4.19 | 14.35±2.35 | 17.06±1.33 | 16.02±2.53 |
IL1β | 13.78±3.58 | 26.93±3.30 | 14.39±4.04 | 13.11±2.99 | 15.26±3.01 |
NT | 5.30±2.55 | 18.45±4.02 | 9.10±2.20 | 6.17±2.96 | 6.22±1.88 |
4-HNE | 4.44±1.73 | 17.95±3.56 | 6.82±4.36 | 4.16±2.05 | 5.39±2.49 |
CAS | 4.54±1.87 | 18.47±3.98 | 5.73±3.61 | 4.16±2.05 | 5.39±2.49 |
TUNEL | 14.42±2.63 | 31.35±5.51 | 18.25±5.24 | 20.20±3.74 | 18.35±7.61 |
혈액 생화학적 분석의 간보호 효과와 항지질 효과 분석과 간 조직의 항산화 및 항염증 효능 분석과 결과가 일치하여 조직병리학적으로 항염증, 항지질산화, 항세포사멸 효능에 대한 결과를 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (9)
- 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 체중 감량 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 간 보호 및 항지질 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 간 비대 및 지방증을 억제하는 효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 간 조직의 항산화 및 항염증 효능을 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 지질 대사 개선효과를 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 지질 축적 억제 효능을 가지는 것인, 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 당귀, 조구등, 천궁, 백출, 복령, 시호, 감초, 진피 및 반하로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 간질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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